JP4082451B2 - 液相ペプチド合成装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸を特定の順序でペプチド結合してなるペプチドの合成装置に関し、特に、相溶状態と相分離状態とが温度で可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に利用してペプチドの量産を可能にする液相ペプチド合成装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学、薬学、生物学など広範囲の分野においてペプチドの合成技術の重要性はいうまでもない。アミノ酸を特定の順序でペプチド結合させたペプチドは、抗原−抗体相互作用の研究、臨床診断に利用するペプチド抗原の研究、種々の遺伝子研究などきわめて多くの研究にかかわる。免疫でも感染源でもタンパク質の活性はたかだかアミノ酸５個から１０個が結合したペプチドで決まる。したがって、その部分の合成は非常に重要であり研究用として多くの需要がある。
【０００３】
もちろんアミノ酸１０個以上結合したペプチドも重要である。合成可能とされるペプチドの結合数（残基数）の限界は５０程度であり、このアミノ酸結合数の限界を超えたペプチドの合成技術も望まれている。
【０００４】
研究の成果として、特定のタンパクやペプチドの薬効が検証されれば、化学合成ワクチン等の医薬品向けペプチドの大量需要が発生する。よって、商用規模の大量の需要に対応できるペプチド量産技術が強く望まれている。
【０００５】
化学的にアミノ酸を連結していくペプチド合成法は化学合成法と呼ばれ、本発明の装置のプロセスはこれに含まれる。これ以外にも、目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを調製して宿主細胞等に発現させる遺伝子組換え法がある。しかしこれは手間がかかりコスト高で量産には向かない。
【０００６】
その理由は、遺伝子組換え法で５０アミノ酸（残基）以上のペプチドを合成するには、まずそのアミノ酸をコードする１５０ヌクレオチド以上のＤＮＡを人工合成しなければならないからである。しかも、この方法ではＤ体のアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸誘導体を含むペプチドは合成できない。ここで、アミノ酸誘導体を含むペプチドとは、ペプチドのアミノ酸残基に任意化合物が結合したものである。
【０００７】
また、まず短い部分ペプチド（セグメント）を合成してから、それらを側鎖保護基が付いた状態でカップリングさせるセグメント縮合法がある。しかし、この方法も複数の工程を必要とする上、各セグメントのＣ末端アミノ酸がGly、 Proなど特定のアミノ酸でなければならず、セグメント設計上の制約がある。
【０００８】
量産をねらって反応の自由度が大きく、反応選択性が小さい化学合成法（従来の液相法）をもちいた場合には、アミノ基とカルボキシル基とがとり違えられ結合したり、アミノ酸自体の異性体が間違って結合したりしてしまう。さらに、反応後に多量の試薬、触媒、反応補助剤、副生成物などが残留する。そのため合成反応を行った後、クロマトグラフィなどによって目的とする生成物を分離精製するプロセスを必要とするが、目的とするペプチドの収率が極めて悪いことが多い。そのため、一般の液相法（反応選択性が小さい従来の液相法）はほとんど用いられていない。
【０００９】
反応選択性を向上させ副生成物の発生を抑えるため、固体表面に化学的にアミノ酸を連結していく、固相合成法が現在のペプチド合成の主流となっている。この固相ペプチド合成法（Solid Phase Peptide Synthesis法）は、メリフイールド（Merrifield）により開発された。
【００１０】
固相ペプチド合成法を図１〜図２で説明する。固相ペプチド合成では、合成すべきペプチドのカルボキシル基側末端（C末端）のアミノ酸を、不溶性の微小樹脂（レジンなど）ビーズの表面に化学的に結合させる。この微小樹脂ビーズは固体であり、アミノ酸を担持しつつ結合していくので、「固体担体」と呼ばれる。図１〜図２の９が、固体担体である。
【００１１】
固体担体に結合されたC末端アミノ酸のアミノ基側末端（N末端）に、さらに結合すべきアミノ酸を用意する。この結合すべきアミノ酸では、N末端を不活性化、C末端を活性化する処理を行う。この操作を結合前処理と呼ぶことにする。不活性化は、N末端にFmoc (9-flourenylmethloxycarbonyl) あるいはt-Boc (tert-butyloxycarbonyl) あるいはＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）などの反応保護基を結合させる。
【００１２】
図１〜図２の１２が、結合すべきアミノ酸に結合前処理をした化合物である。１２の「X」は、C末端の活性化基である。このようにして、N末端の反応をブロックしてC末端のみ反応させるのである。
【００１３】
固体担体に結合されたアミノ酸のN末端にも保護基が結合されているので、この保護基を図中の１０の操作で除去する。それに続いて、その活性化されたN末端にC末端を活性化した１２をペプチド結合させる反応操作１１を行う。ペプチド合成反応温度は、アミノ酸が変性しない５０℃程度の比較的低温であり、反応促進剤の添加など公知の方法を適用して行う。その反応後、未反応アミノ酸を洗浄除去する。
【００１４】
図１では、合成すべきペプチドのC末端から二つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２）がペプチド結合された部分ができあがる。それに続く図２では、三つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）がペプチド結合された部分ができあがる。こういった操作を繰り返して合成すべきペプチドを得る。
【００１５】
ペプチド結合が完了したら、C末端を固体担体から開裂させ、必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。この工程は、クリーベイジ（cleavage）と呼ばれる。
【００１６】
このようにアミノ酸を１種ずつ添加結合することで、反応の自由度、選択性をきわめて小さくし、所望のアミノ酸を所望の順序でペプチド結合させ、所望のペプチドを合成する。固相ペプチド合成では、不溶性の微小樹脂ビーズをアミノ酸系物質の「担体」として用いることに特徴がある。（ここで「アミノ酸系物質」とは、単独のアミノ酸あるいはアミノ酸残基、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドを含む。）固体担体の素材としてはガラス、シリカ、合成樹脂などが知られているが、合成樹脂が最も普通に使用されている。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、固相ペプチド合成も欠点がある。固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、液相反応に比べると反応が起こりにくい。すなわち、固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり、その巨大分子のごく小さな反応部にアミノ酸を結合させる必要があるが、それが確率的に起こりにくい。そのため高価なアミノ酸反応試薬１２を大量に供給しなければならない。通常反応量の１００倍程度を供給する。その結果として反応に関与できない反応試薬が大量に発生し無駄になる。
【００１８】
しかも、ｎ番目のアミノ酸の未反応部には次の結合工程で、ｎ＋１番目のアミノ酸がｎ番目として結合してしまうので所望のペプチドではない不純物となってしまう。こういった未反応が、個々の結合反応で５％しか発生しないとしても、５０アミノ酸（残基）のペプチドを合成すると、最終的な収率はたったの７．７％となってしまう（０．９５の５０乗）。３０アミノ酸（残基）でも２１.５％である（０．９５の３０乗）。
【００１９】
このように、固相ペプチド合成では個々のペプチド結合の未反応を極力減らすべく、前記のように反応試薬を大量に使用せざるを得ないというコスト面での問題、および反応時間を十二分に長く取らざるを得ない、といった生産効率上の問題があった。
【００２０】
この他にも固相ペプチド合成では、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができない、固体担体が微小とはいえ数ミクロンの大きさがあるため反応槽をスケールアップすると、巨大なものになってしまう、固相担体が高価で再利用ができない（使い捨て）といった問題があった。
【００２１】
本発明は、上記のような従来のペプチド合成装置の問題を解決すべく、相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に用いたペプチド合成装置を提供するものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、本案発明者による特願2001-254109「相溶性−多相有機溶媒システム」を利用した液相ペプチド合成装置であって、より具体的には、本案発明者による特願2001-385493「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示された方法を実現する装置である。
【００２３】
＜液相ペプチド合成法の溶媒セット＞ まず、相溶性−多相有機溶媒システムを説明し、次にそれを用いた液相ペプチド合成法を説明する。図３が相溶性−多相有機溶媒システムを構成する具体的な溶媒の組み合わせの実験写真である。
【００２４】
特願2001-254109「相溶性−多相有機溶媒システム」にて、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒のセット（組み合わせ）が開示されている。ここで第一の溶媒と第二の溶媒のそれぞれは、複数の溶媒の混合溶媒でもよい。
【００２５】
図３は第一の溶媒と第二の溶媒を混合した例であり、下層の第二の溶媒に染色剤を混合して可視化してある。これらの溶媒の組み合わせ（以下溶媒セットと記載する）にて、２５℃では相分離状態（図３ａ）、これを４５℃に加熱すると相溶状態（図３ｂ）となる。これを冷却すると相分離状態に戻る。図３のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは時間を追って撮影したものを順に並べたもので、ｃ、ｄは４５℃から２５℃に冷却される中間状態である。この実験の溶媒セットは、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆変化することがわかる。
【００２６】
液相ペプチド合成に好適な溶媒セットは、特願2001-385493「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示されているように、一方の溶媒または混合溶媒（第一の溶媒）を構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなる。
【００２７】
第一の溶媒は、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などで、中でも好ましいものが、シクロアルカン系の化合物であり、特に好適なものとして「シクロヘキサン」を挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連していると推測できる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点もあり、最終工程である回収工程でもメリットがありこの面からも好ましい。回収工程はあとで説明する。
【００２８】
一方、第一の溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒（第二の溶媒）を構成する有機溶媒は、基本的には高極性有機溶媒である。好ましいものとしては、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものである。
【００２９】
第二の溶媒は、さらに具体的には、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が1、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、またハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下である。
【００３０】
上記の第一の溶媒と第二の溶媒との溶媒セットは、図３のように温度により、可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態（相溶状態）と複数相に分離した分離溶媒系の状態（相分離状態）とを可逆的に取り得る。
【００３１】
＜相溶化温度＞ 第一の溶媒あるいは第二の溶媒の構成を変えることによって、相溶状態と相分離状態が切り替わる温度も自在に変えることができる。たとえば、図１８が第一の溶媒であるシクロヘキサン（CH）と第二の溶媒であるニトロアルカン混合溶媒（NA）の構成と相溶化温度の変化の説明図である。パラメータとしてCHとNAの容積比を１：５、２：５、１：１、５：１とし、それぞれのNAを構成しているニトロメタン（NM）とニトロエタン（NE）の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３２】
また、図１９は第一の溶媒であるシクロヘキサン（CH）と第二の溶媒を１：１の等容積（それぞれ５０容積％）と固定して、第二の溶媒を、ニトロメタン（NM）とニトロエタン（NE）の混合溶媒、または、アセトニトリル（AN）とプロピオニトリル（PN）の混合溶媒、または、ジメチルホルムアミド（DMF）とジメチルアセトアミド（DMA）の混合溶媒として、第二の溶媒の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３３】
図１８、図１９より、２０℃から６０℃の温度で相溶化温度が、第一・第二の溶媒構成で変化することがわかる。換言すれば、第一の溶媒と第二の溶媒のセットにおいて、第一・第二の溶媒構成を変える手段をもつことによって、両溶媒の相溶化温度を変えることができる。つまり相溶化状態での化学反応を温度が低いレベルでも可能になしうる。
【００３４】
第一・第二の溶媒構成は、第一の溶媒と第二の溶媒の混合比でもよいし、混合溶媒である第一の溶媒あるいは第二の溶媒をなす混合溶媒要素の混合比でもよい。構成変化手段は、第一の溶媒と第二の溶媒の供給混合に際して、前記構成を変化させるべく、第一の溶媒あるいは第二の溶媒の供給量を加減調整したり、新たに混合溶媒要素を付加したりすればよい。
【００３５】
上記のように相溶化温度が変えられることを加味し、混合前の第一・第二溶媒の供給量は、それらに溶解されるアミノ酸、アミノ酸系物質で行うペプチド合成の温度をどうするかを考慮し図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。当然のことながら反応のための温度制御の温度も図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。
【００３６】
＜液体担体＞ さて、特願2001-385493（液相ペプチド合成法）において上記の溶媒セットを用いてアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法を提案しているが、この合成法にて溶媒セットと共に重要なものは、固相ペプチド合成の固体担体に相当する「液体の担体」である。
【００３７】
これは、特願2001-254109（溶媒システム）において、「第一の溶媒あるいは第二の溶媒いずれか一方のみ溶解する反応に関与する化学成分」と記載したものに相当する。
【００３８】
すなわち、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体の担体である。機能について固体担体と等価であるので、本明細書ではこれを「液体担体」と呼称する。この液体担体について説明する。
【００３９】
従来技術の固相表面反応を液相の反応に置換すれば、従来問題であった反応性の悪さ（固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり反応部位に接近しにくい）を改善できる。さらに、前述の相分離する溶媒セットをうまく使えば、得られた反応生成物の分離が極めて容易に実現できる。このように画期的な利点をもつ液相ペプチド合成法の実現には、固相ペプチド合成の固体担体に相当する液体の担体が必要で、発明者はこれを見出した。その液体担体は以下の機能を必要とする。
【００４０】
すなわち、液体担体はペプチドの形成を開始するアミノ酸との結合部を有すること、アミノ酸を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持できること、さらにアミノ酸と結合した化合物および合成中のペプチド鎖を担持した化合物が、第一の溶媒に溶解されること、である。
【００４１】
これら機能を持つ液体担体の候補化合物は、親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するものであることを特徴とする下記の一般式Ａ（化１）で表される芳香族炭化水素環または炭素数１０以上の炭化水素基を基本骨格化合物である。
【００４２】
【化１】
【００４３】
一般式Ａ（化１）において、Ｌ１は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線とも結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団である。
【００４４】
一般式Ａ（化１）において、点線はＨとの結合または前記Ｌ１と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団の結合であり、ＸはＯ、Ｓ、Ｎ、エステル基、スルフィド基またはイミノ基であり、Ｒは、シクロアルカン系の溶剤への溶解性を高めるＯ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基である。また、ｎは１〜５の整数である。
【００４５】
一般式Ａ（化１）は、より具体的には、下記の一般式群Ｂ（化２）から選択される。一般式群Ｂ（化２）において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａ（化１）と同じ。Ｑは、単結合または炭化水素基であり、Ｒ２はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ３およびＲ４は、一般式Ｃ（化３）の基である。また、一般式Ｃ（化３）のＲ５は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。
【００４６】
【化２】
【００４７】
【化３】
【００４８】
前に説明した第一の溶媒は、分離状態において、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解するが、液体担体と結合していないアミノ酸（ペプチド結合させるべきアミノ酸）は溶解しない（難溶である）。ここで、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドである。
【００４９】
また逆に、第二の溶媒は、分離状態において、アミノ酸（ペプチド結合させるアミノ酸）を溶解するが、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解しない（難溶である）特性を持っている。
【００５０】
液体担体の好適な具体例を図４の１に示す。１は、前記の一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ１８Ｈ３７−であり、ＸがOであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ２であり、Ｒ２がＯＨである。名称は、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕である。この液体担体１は、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する。
【００５１】
本案は１に限定されることはないが以下、この液体担体具体例１を用いて、本案装置のプロセスである液相ペプチド合成法を説明する。図４から図６は、固相ペプチド合成法の固体担体９を液体担体１に置換した本案液相ペプチド合成の説明図である。図４から図６は、図１、図２に対応している。図４の２は、液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分である。
【００５２】
図４は、N末端を保護され、C末端を活性化された（活性化基Xを結合された）Ｒ１残基アミノ酸１２のC末端を、液体担体１に結合する反応（図４中の８）を示す反応フロー図である。ここで、液体担体１は、第一の溶媒（A）に１が溶解された第一溶媒溶液（A１）という溶液の状態であり、Ｒ１残基アミノ酸１２は、あらかじめ第二の溶媒（B）に溶解され、第二溶媒溶液（B１２）として準備される。（A、B、A１、B１２という標記は図４から図６には記載されていないが、これらは後に説明される図１０から図１４に対応している）
【００５３】
前記第一の溶媒（A）に１が溶解された第一溶媒溶液（A１）と、Ｒ１残基アミノ酸１２が第二の溶媒（B）に溶解された第二溶媒溶液（B１２）とが混合される。第二溶媒溶液（B１２）は多少過剰に投入されるのが好ましい。その理由は、相対的に第一溶媒溶液が多いとすべてのペプチド反応が生じても、未反応の末端をもつ担体が残留するからである。これは固相合成法と同様であるが、固相合成法のように必要量の１００倍も過剰に投入する必要はない。
【００５４】
両溶液混合後、それらが相溶状態となる温度に加熱される。すると、液体担体１の末端はアミノ酸と結合する水酸基であるので、Ｒ１残基アミノ酸C末端とペプチド結合反応（図４中の８）して１ａｆとなる。この１ａｆも、相溶化状態の両溶媒に溶けている。
【００５５】
ペプチド反応後、固相合成では未反応アミノ酸等との分離のために洗浄除去などを行っていたが、本発明では、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却すればよい。このことで、１ａｆは分離された第一の溶媒（A）に溶解されたA１ａｆとして、第二溶媒溶液から分離される。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。
【００５６】
排除される第二溶媒溶液中には、過剰に投入したため未反応で残留したＲ１残基アミノ酸、および反応副生物などが溶解している。この分離操作は、従来と比較にならない単純操作であり、かつ不純物の混入もきわめて少ない。したがってクロマトグラフィ等による精製工程も省略が可能である。
【００５７】
分離状態にある第一・第二溶媒溶液にて、第二溶媒溶液を排除するのであるが、この排除操作で第一溶媒溶液だけが残留することが重要である。したがって歩留まりは悪くなるが、第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。残留した第一溶媒溶液には、１にＲ１残基アミノ酸C末端が結合した１ａｆが溶解している（A１ａｆ）。
【００５８】
次の工程である図５では、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのアミノ末端を保護しているFｍocを除去して活性化（図５中の１０）する。図４同様に、N末端を保護したＲ２残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液B１２として準備し、これら第一溶媒溶液A１ａと第二溶媒溶液B１２とを混合する。同様に第二溶媒溶液B１２は過剰に混合されるのが好ましい。
【００５９】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ａと、Ｒ２残基アミノ酸C末端をペプチド結合させる（図５中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆができる。
【００６０】
上記ペプチド反応後、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却し、１ｂｆを分離された第一溶媒溶液に溶解されたA１ｂｆとし、第二溶媒溶液から分離する。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。同様に第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。
【００６１】
次の工程である図６も同様に、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１bｆのアミノ末端を保護しているFｍocを除去して活性化（図６中の１０）する。同様に、N末端を保護したＲ３残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液B１２として準備し、これら第一溶媒溶液A１ｂと第二溶媒溶液B１２とを混合する。
【００６２】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ｂと、Ｒ３残基アミノ酸C末端をペプチド結合させる（図６中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基ペプチドが結合した物質１cｆができる。以下同様の操作でペプチドを伸長させていく。
【００６３】
このように一連のペプチド結合を行い、それが完了したら、ペプチドC末端を液体担体から必要に応じて開裂し、同じく必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。このクリーベイジ（cleavage）工程は固相合成と同様である。すなわち、液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存してもよい。開裂後のペプチドN末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【００６４】
固相合成との大きな相違は、溶媒に溶解された溶液での反応であるので、ペプチド合成の個々のペプチド結合での未反応がきわめて少ないことである。したがって、多少は過剰に加えるものの、固相合成のように１００倍といった大量の反応試薬を過剰に投入しなくともよい。液相反応なので当然反応時間も短縮される。
【００６５】
また、溶媒を染料等で着色するなどして、目的の反応の進行を色によって確認することもできる。さらにまた、反応槽などからなる後述の装置のスケールアップも通常の液相プロセス同様に容易に可能となる。
【００６６】
Ｒ１をバリン（Val）、Ｒ２をグリシン（Gly）、Ｒ３をフェニルアラニン（Phe）とした図４から図６のペプチド液相合成を実施した結果、収率は９５％、９７％、９９％であった。（図２０参照）収率１００％とならないのは、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質が、第二の溶媒に全く溶解しないと言うのではないためである。（難溶性であるためである。）
【００６７】
＜液相ペプチド合成装置＞ 本案の装置を説明する。本案装置は、以上説明した液相ペプチド合成を行う装置である。すなわち、第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせ、および第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体担体を用いて、該液体担体に合成すべきペプチド鎖のアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成装置である。
【００６８】
本案の液相ペプチド合成装置の第一例を図７に示す。本案の液相ペプチド合成装置は、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した、第二溶媒溶液を供給する手段（図７の５）に連結され、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した、第一溶媒溶液と、供給された第二溶媒溶液とを混合する混合槽（図７の３）と、前記混合槽の温度を、混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度、または混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御する混合槽の温度制御手段（図７の６）と、前記混合槽の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段（図７の２０）と、該手段によって得られる界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定量に基づいて混合槽から第二溶媒溶液を排除する手段（図７の７）とを有する。
【００６９】
ここで、アミノ酸とは、アミノ酸残基に任意化合物が結合したアミノ酸誘導物質を含むものであり、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドであり、結合前処理とは、合成すべきペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基側末端を不活性化、カルボキシル基側を活性化する処理である。
【００７０】
合成工程の初期にて、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）によって、あらかじめ液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液を混合槽３に供給する。あるいは、液体担体、第一の溶媒をそれぞれ個別に供給して混合槽３で溶解してもよい。説明の簡単のため、液体担体を１とし、第一の溶媒をA、第一の溶媒に液体担体を溶解した第一溶媒溶液をＡ１と記載する。
【００７１】
第二の溶媒をBと記載し、N末端に保護基Fｍocなどを結合した結合前処理後のアミノ酸を１２と記載し、１２をBに溶解した、第二溶媒溶液をB１２と記載する。合成工程の初期に、混合槽３に供給されたＡ１にB１２が供給され混合される。
【００７２】
混合槽３には、温度制御手段６が配備されている。これは公知の加熱ヒータや湯浴や高温ガスによる加熱装置、ぺルチェ素子や冷浴や低温ガスによる冷却装置を任意に採用すればよい。なお図７にて、Ａ0は任意物質を溶解した第一溶媒溶液を示す。Ａ0には、Ａ１、Ａ１a、Ａ１af、Ａ１b、Ａ１bf、Ａ１c、Ａ１cf が例として含まれる。これらの意味は符号の説明の項を参照のこと。
【００７３】
混合槽３へB１２を供給する手段５が、３に連結されており、これはB１２の準備槽４からB１２を移送する流路（配管）５ａ、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプ５ｂなどで構成されている。図７に示すように複数の準備槽を配備し、結合前処理後の異なったアミノ酸を第二の溶媒Bに溶解させ、あらかじめ準備しておくと便利である。
【００７４】
すなわち、図７のごとく複数のB１２の準備槽４から、逐次合成すべき結合前処理後のアミノ酸が選択的に混合槽３へ供給される構成が好適である。
【００７５】
混合槽３に前記第二溶媒溶液B１２とが供給され、Ａ１（Ａ0）と混合され、温度制御手段６にて、相溶状態にする。その制御温度は、混合槽３に初期供給された第一溶媒溶液の供給量および溶液成分、第二溶媒溶液B１２の供給量および溶液成分に基づいて決める。具体的には、第一第二の溶媒溶液の種類（溶媒の種類、混同比、溶媒に溶解された液体担体やアミノ酸系物質の種類）および供給手段による供給量が既知であるので、それらと図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で決められる。
【００７６】
また第一第二の溶媒溶液の供給量自体も、あらかじめ図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で調整し、合成反応の温度を適切なものにすることも制御設計上可能である。
【００７７】
すなわち、混合槽の温度制御手段が、混合槽の第一溶媒溶液の量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて温度を制御するのが好適であり、かつ第二溶媒溶液を供給する手段の供給量が、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて決定されるのが好適である。溶液供給量の制御については図２３を用いて後で説明する。
【００７８】
ここで、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【００７９】
相溶状態でペプチド合成反応が行われる。この反応の終了は、たとえば溶媒の着色などによる反応マーカで確認することもできる。もちろん、供給量と反応時間のデータをあらかじめ採取しておき、反応時間で反応終了を判定してもよい。その判定後、相溶化温度より低温である任意の温度に冷却して相分離状態とする。
【００８０】
相分離状態で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する。界面の位置がわかれば、既知である混合槽の形状、容量にて、第二溶媒溶液の量の判定は容易である。よって界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定する。
【００８１】
前記第二溶媒溶液の判定量に基づいて、混合槽３より第二溶媒溶液を排除手段７で排除する。この排除の量は、第二溶媒溶液が完全に排除されるように、前記判定された第二溶媒溶液量よりも多少多めが好適である。図７の７ａは７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなどである。
【００８２】
第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０は、たとえば図８のように混合槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）２０ａ、２０ａのセンサーヘッド２０ｂとからなるものであって、センサーヘッド電極間の導電率など溶液の電気特性を検出し、その相違で界面を検出するもの等を採用すればよい。なお、２０ｃは２０ａの内部電気配線である。
【００８３】
図９は、図中に第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０を別の例とした本案装置の第二例（温度制御手段６は省略した）である。図９中の２０ｅは、光（放射エネルギー）発生器であり、２０ｆは、光（放射エネルギー）受信器である。この受信器で溶液の光学特性、エネルギー透過特性を検知し、その相違で界面を検出する。
【００８４】
界面検知を容易とするために、一方の溶媒に染料を添加して着色するなどすれば上記の光学的界面検知手段は有効であろう。なお図９中、混合槽３の部分のＢ０は、反応後の第二溶媒溶液で未反応の１２、その他の副産物も第二の溶媒に溶解しているのでＢ０（任意物質を溶解した第二溶媒溶液）と記載した。
【００８５】
図１０から図１４が、初期工程の後の本案装置でのペプチド合成工程の説明図である。これらは図４から図６の反応フロー図に対応している。すなわち、図４にて液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合させるまでが図１０の（a）（b）（c）である。図１０（c）では、温度制御手段６は相溶化温度に制御されている（６ａ）。
【００８６】
図１１は次工程であり、温度制御手段６を相分離温度として（６ｂ）、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１１（e））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１１（ｆ））。ついで図１２にて、液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質にＲ２残基アミノ酸を結合させる（図１２の（g）（h）（i））。図５の活性化反応１０は省略されている。
【００８７】
以下同様に、図１３は、温度制御手段６を６ｂとして第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１３（k））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１３（ｌ））。ついで図１４にて、液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質にＲ３残基アミノ酸を結合させる（図１４の（m）（n）（o））。図６の活性化反応１０は、混合槽内で行われるが省略されている。
【００８８】
図１５は、本案の液相ペプチド合成装置の第三例であって、これは前例の混合槽３は混合と反応専用とし、これに加えて分離専用の分離槽１７を設けた例である。これらはそれぞれ相溶温度、相分離温度に制御されている。すなわち、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御された混合槽３と、混合槽内で相溶状態となった第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送手段１６を介して、該混合槽と連結され、移送された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に温度制御された分離槽１７と、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段（図１５では省略）と、前記第二溶媒溶液の量に基づいて分離槽から第二溶媒溶液を排除する手段１８とを有する。
【００８９】
混合と反応専用の混合槽には、第一の溶媒に、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解した、第一溶媒溶液（Ａ０）を供給する手段、および第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液（Ｂ１２）を供給する手段が連結されている。
【００９０】
図１５の構成では、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された第一溶媒溶液（Ａ０）が、再度混合槽３に戻って供給される。すなわち、混合槽３に供給される第一溶媒溶液が、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液である。つまり、混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段が、分離槽１７の残留第一溶媒溶液を混合槽に移送する移送手段である。
【００９１】
図１５の構成は、より正確には図２１に示すように、Ａ１を混合槽に供給する手段が配備されている。また、図２１に示すようにN末端の保護基であるFｍoc等を除去して活性化する操作（工程）１０をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段１０ａが付帯配備されている。図２１にて、前述の混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段は、この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されている。この太点線ルートで分離槽１７の残留第一溶媒溶液が混合槽に移送される。
【００９２】
もちろん、第一例、第二例のように末端活性化反応１０を、混合槽３内、または分離槽１７内で行なってもよい。図１５中の１６ａは、１６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどであり、図中の１８は、第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段で、１８ａは、１８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどである。
【００９３】
図１５のように上方に混合槽、下方に分離槽を配備すれば、１６による第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送は容易である。混合槽で相溶化された第一・第二溶媒溶液が重力で落下して、分離槽に移送され、そこで相分離温度となって分離する。分離状態で、判定手段１８にて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定に基づいて第二溶媒溶液（Ｂ０）を排除する。
【００９４】
混合槽、分離槽の制御温度は、第一例第二例と同様に、混合槽に供給される第一溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９５】
また、第一溶媒溶液を供給する手段の供給量、および第二溶媒溶液を供給する手段の供給量自体も、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９６】
ここでも前に説明した通り、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分であって、これらで図１８、図１９等のデータを参照する。
【００９７】
第二溶媒溶液の量を判定して排除する手段１８では、前に説明した分離槽内の界面検出手段（図１５では省略）による第一・第二溶媒溶液界面の検出に基づいて量を判定して排除操作をすればよい。この説明は略す。
【００９８】
一方図１７は、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する別の手段を説明する図である。すなわち、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽３に供給される第一溶媒（Ａ0）および第二溶媒溶液（B１２）のそれぞれ供給量およびそれぞれ溶液成分と、相溶状態の混合槽３の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段１９を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである。
【００９９】
ここでも、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および
第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【０１００】
これら反応条件と反応前化合物の条件が既知であるので結合反応が予測できる。つまり、分離槽１７のペプチド結合反応は、３に供給される溶液の成分と量、および反応活性化試薬など既知の反応条件情報から予測が可能である。理論的な予測が困難でも、同じ条件で実験データをあらかじめ採取しておいて、実験データから外挿内挿するなどの方法でも可能である。その場合には実験データをテーブル化して推定手段１９に記憶させて引用すればよい。
【０１０１】
推定には、図１７に示すように分離槽の温度、混合槽から分離槽に移送される相溶状態の溶液量を入力して用いてもよい。このようにして分離槽１７での反応を推定し、その推定に基づいてペプチド反応による第一・第二溶媒溶液の量の変化を推定し、センサーレスで分離された分離槽の第二溶媒溶液の量を１８で判定するものである。もちろん前記の界面検知手段等のセンサーと組み合わせて、より精度の高い量の判定を行ってもよい。
【０１０２】
判定された量に基づいて、たとえば流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど（１８ａ）で流量を計測しながら分離槽１７から第二溶媒溶液を排除する。流量センサーなどの流量制御系の図示は略した。
【０１０３】
図１７で説明した第二溶媒溶液の量を判定する手段は、分離槽をもたない混合槽のみである本案第一例（図７）、第二例（図９）でも適用が可能である。すなわち、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽の第一・第二溶媒溶液の量および溶液成分と、相溶状態の混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定すればよい。
【０１０４】
図１６は、本案の液相ペプチド合成装置の第四例であって、工程を連続化した量産向けの装置である。図１６にて１６，１８は省略した。このような構成であれば、複数の別種のペプチドを連続して流れ作業的に合成できる。すなわち、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変えてアミノ酸を結合させればよい。
【０１０５】
図１６の構成の特徴は、混合槽と、該混合槽と連結された分離槽とからなる、複数組の混合槽・分離槽の組み合わせを有し、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に供給される第一溶媒溶液が、他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液となっていることである。
【０１０６】
図１６にて、N末端の保護基を除去して活性化する操作（工程）１０をなす末端活性化手段１０ａが図示されている。この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されているルートが、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に第一溶媒溶液を供給する手段であって、これが他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽の残留第一溶媒溶液をひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に移送する移送手段である。
【０１０７】
図１６の第四例にて、それぞれの混合槽に供給される第二溶媒溶液Ｂ１２の種類を固定する。すなわち、合成すべきアミノ酸の種類を固定した混合槽・分離槽、たとえば、バリン結合用混合槽・分離槽、グルタミン酸結合用混合槽・分離槽、フェニルアラニン結合用混合槽・分離槽・・・などを近接して配列配備する。そして、合成すべきペプチドのアミノ酸結合順に応じて、分離槽から混合槽に移送する移送手段の連結が自在に切り替えできる装置構成としてもよい。
【０１０８】
すなわち、図１６にて１０ａを介して分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示される部分の配管系にて、切り替え弁などを配備して、分離槽で出た第一溶媒溶液が次に結合されるアミノ酸結合用の混合槽に移送されるよう切り替え自在とする構成である。
【０１０９】
こういった切り替えを実施すると切り替え前の残留物による不純物混入が懸念されるが、図１６中１０ａの末端活性化手段に不純物浄化の工程をおこなう手段を追加配備すれば問題解決できる。これは配管系を固定し、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変える前述の構成でも同様である。
【０１１０】
図２２は、本案の液相ペプチド合成装置の第五例であり、２組の混合槽・分離槽の組み合わせ構成の例である。このように２組、３組（例示略）・・・などと複数組を組み合わせておけば、ペプチドの回収工程操作や混合槽・分離槽の不純物除去、洗浄操作を行いやすい。第五例の説明は第三例、第四例と同様であるので略す。
【０１１１】
＜溶液供給量の制御＞図２３は、図１８、図１９等の相溶化温度のデータに基づいて混合槽への溶液量を制御することの説明図である。図１８、図１９に示したような溶液成分とその混合比率によって相溶化温度が変化するデータが図２３の３０にデータベースとして記憶されている。この３０は、B１２、Ａ１xの成分（溶媒A、溶媒Bの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報３５を入力し、データベースの相溶化温度変化データを参照して最適な溶液比、溶液量を決定する。
【０１１２】
３０は第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段３１に最適な溶液比、溶液量を出力し、３１はB１２の供給量の制御手段（流量制御装置）３３、Ａ１xの供給量の制御手段（流量制御装置）３４へ制御指令を出力する。
【０１１３】
溶液比の最適化に際して、必要に応じて第一の溶媒のみ、あるいは第二の溶媒のみを付加的に追加供給すれば溶液比、溶液量の制御自由度が増し、好適である。したがって、第一・第二の溶媒の準備槽Ａtank・Ｂtankと、第一・第二の溶媒Ａ・Ｂを混合槽に供給する手段と、付加追加量の制御手段（流量制御装置）３２を配備し、３１の制御指令が３２に出力されるような構成とすればよい。
【０１１４】
この付加追加は、本装置の第一例から第五例いずれも適用が可能である。すなわち、混合槽あるいは分離槽に連結して、第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を供給する第一・第二溶媒の付加供給手段を配備し、この付加供給手段で溶媒を単独で付加的に混合槽に追加供給して溶媒比率を調整制御すればよい。これによって相溶化温度を変えることができる。
【０１１５】
＜追補＞排除手段７は、ここまで主として図示した混合槽あるいは分離槽の下方から溶液沈殿部を流出させる方式以外、混合槽あるいは分離槽の上方から溶液吸引手段で溶液上澄み部を吸い出す方式で排除する装置、混合槽あるいは分離槽の任意の部位から溶液を部分抽出する機能をもつその他の公知の溶液抽出装置を適用してもよい。
【０１１６】
また、ここまで説明したように、第二溶媒溶液を排除し、残留する第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成する装置構成とは逆に、第一溶媒溶液を逐次抽出して、その第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成していく構成を部分的に採用してもよい。
【０１１７】
合成したペプチドを回収する最終工程は、シクロヘキサンを第一溶媒に用いた場合、その融点が６．５℃であるので、それ以下に冷却して固体として分離し、その後加熱し、シクロヘキサンを蒸発除去することにより液体担体に結合したペプチドを回収する。
【０１１８】
液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存すればよい。開裂後のペプチドN末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【０１１９】
【実施例】
ペプチド合成実施例のフローを図２０に示す。図２０における具体的操作を以下実施例１に説明する。また、他の実施例を実施例２から実施例４に示す。以下の実施例では、液体担体を〔ＳＣ〕と一部略記する。これら実施例では、末端活性化反応１０は、混合槽で行なった。また、本案装置を構成する混合槽３、分離槽１７、準備槽４、温度制御手段６等の記載は省略した。実施例中のろ過、攪拌、濃縮乾固等を行なう、ろ過装置、攪拌装置、ロータリーエバポレーターなどは本案の装置構成に適宜付帯、付加すればよい。このような公知の装置を連結した構成とすることは容易である。
【０１２０】
実施例１
液体担体〔ＳＣ〕−バリン（Ｖａｌ）−グリシン（Ｇｌｙ）−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）−Fmoc 〔（ＳＣ）−Val−Gly−Phe−Fmoc〕 〕の液相合成。液体担体〔ＳＣ〕として、前記の（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕を用いる。
【０１２１】
工程１）
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１７０ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、さらにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１２５ｍｇを添加する。本溶液を室温にて１５分間撹拌した後、ろ過する。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、得られた残渣をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍＬ に溶解する。続いて液体担体〔ＳＣ〕を溶解したシクロヘキサン溶液（液体担体５０ｍｇ／３ｍＬ）３MlをＤＭＦ溶液に添加する。それにDMAP4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）６．５ｍｇを添加し、反応溶液を５０℃に加温し、３０分反応を行う。このときシクロヘキサン層とＤＭＦ層に分離していた溶液系は均一溶液系になる。
【０１２２】
反応終了後、反応溶液を室温に戻し、反応溶液を再び二相に分離させる。下層のDMF相を分離、除去し、１０％ジエチルアミン／DMF溶液を３ｍＬ添加し、５０℃で２０分間攪拌する。反応液を冷却し、シクロヘキサン層を分離する。このシクロヘキサン層には液体担体結合バリン−ＮＨ２(〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２) が回収される。（収率９５％）
【０１２３】
工程２）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−グリシン−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２４】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ）を分離する。Fmoc基は同溶液にジエチルアミンを添加することにより、脱離し〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ を得る。（収率９７％）
【０１２５】
工程３）
つぎに、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−フェニルアラニ−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後工程２）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２６】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成された。（収率９９％）
【０１２７】
構造確認
〔ＳＣ〕シクロヘキサン液体担体；（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）；５．５４（２Ｈ、ｓ）、４．５８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、３．９６（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９６（３Ｈ、ｓ）、１．８２−１．７０（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．４１（６Ｈ、ｍ）、１．３８−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．８８（９Ｈ，６，８Ｈｚ）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００Ｈｚ）；（１００ＭＨｚ δ：１５３．２，１３７．４，１３６．０，１０５．２、７３．４、６９．１、６５．７、３２．０、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２６．２、２２．８、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）、Ｃ６１Ｈ１１６Ｏ４に対する計算値 〔Ｍ＋Ｎａ〕＋ ９３５、実験値９３５.
【０１２８】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ；（ＣＤＣｌ３）δ７．７６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．６０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｄｔ、J=２．６、７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、４．３８（２Ｈ、ｍ）、４．２９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．９４（６Ｈ、ｍ）、２．１９（１Ｈ、ｍ）、１，７８（４Ｈ、ｍ）、１．７３（２Ｈ、ｍ）、１．４５（８Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、δ１７２．０、１５６．２、１５３．２、１４３．８、１４１．３、１３８．４、１３０．２、１２８、３、１２７．７、１２７．１、１２５，１、１２０．０、１０７．１、７３．４、６９．２、６７．４、６７．１、５９．０、４７．２、３２．０、３１．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２．７、１４１；ＴＯＦ−ＭＳ（ＰＯＳ）ＭＦ、Ｃ８１Ｈ１３５ＮＯ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２５７、実験値１２５７
【０１２９】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２
1H−ＮＭＲ（４００ δ: ６．５４（２Ｈ、ｓ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、J＝１２．１Ｈｚ）、５０３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１ Ｈｚ）、２．０７−２．０１（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７７（４Ｈ、ｍ）、１．７６−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、
０．８９−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ、１７５．４、１５３．２、１３８．３、１３０．７、１０７．１、７３．４、６９．２、６６．８、５９．９、３２．２、３２．０、３０．９、２９．８、２９．７、２９．６、２９．４、２６．１、２２．７、１９．３、１７．１、１４．１；ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６６Ｈ１２５ＮＯ５〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０３４、実験値１０３４
【０１３０】
〔SC〕−Val−Gly−Fmoc
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ）、７．５９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、６．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４ Ｈｚ）、５．４４−５．３７（１Ｈ、ｂｒ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６２（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．８ Ｈｚ）、４．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．２４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、３．９６−３．９２（８Ｈ、ｍ）、２．２１−２．１６（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７０（２Ｈ、ｍ）、１．４８−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９１（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７１．５、１６８．７、１５６．５、１５３．１、１４３．６、１４１．２、１３８．３、１３０．０、１２７．７、１２７．０、１２５．０、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、５７．１、４７．１、３２．０、３１．４、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２，８、１９．０、１７．７、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ８３Ｈ１３８Ｎ２Ｏ８〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１３１４、実験値１３１４
【０１３１】
〔SC〕−Val−Gly−NH2
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２ Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３９（２Ｈ、ｓ）、２．２４−２．１８（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４４（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．９０−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨＺ）δ：１７２．６、１７１．８、１５３．１、１３０．３、１２５．５、１０６．９、７３．４、６９．２、６７．２、５６．６、４４．８、３２．０、３１．３、３０．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６８Ｈ１２８Ｎ２Ｏ６〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０９１、実験値１０９１
【０１３２】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−Fmoc
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７ Ｈｚ）、７．５３−７．４９（２Ｈ、ｍ）、７．３９（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．３、２２ Ｈｚ）、７．３０−７．２７（４Ｈ、ｍ）、７．２５−７．２１（１Ｈ、ｍ）、７．２０−７．１５（２Ｈ、ｂｒ）、６．７６−６．６９（１Ｈ、ｂｒ）、６．６０−６．５５（１Ｈ、ｂｒ）、６．５０（２Ｈ、ｓ）、５．４０−５．３４（１Ｈ、ｂｒ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．５６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．４６−４．３０（２Ｈ、ｍ）、４．１７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．１０−４．０３（１Ｈ、ｍ）、３．９２（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．８３−３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．１８−３．１１（１Ｈ、ｍ）、３．１０−３．０２（１Ｈ、ｍ）、２．２０−２．１３（１Ｈ、ｍ）、１，７９−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１，４８−１，４１（６Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒｍ）、０．９１−０．８５（１５Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７１．５、１７１．３、１６８．３、１５６．０、１５３，１、１４３．６、１４１．２、１３８．２、１３６．２、１３０．１、１２９．１、１２８．８、１２７．７、１２７．１、１２７．０、１２５．０、１２４．９、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、６７．１、５７．３、４７．２、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．０、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ９２Ｈ１４７Ｎ３Ｏ９〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１４６１、実験値１４６１
【０１３３】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−NH2
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．９９−７．９３（１Ｈ、ｍ）、７．３５−７．３０（２Ｈ、ｍ）、７．２７−７．２１（３Ｈ、ｍ）、６．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．５８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、minor）、４．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、major）、３．９８−３．９１（７Ｈ、ｍ）、３．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０ Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、３，９ Ｈｚ）、２．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、１０．０ Ｈｚ）、２，２４−２．１５（１Ｈ、ｍ）、１．８２−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．３９（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８ Ｈｚ）、０．９０−０．８５（１２Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７５．２、１７１．５、１６８．９、１５３．１、１５１．４、１３７．７、１２９．２、１２８．８、１２６．９、１２５．５、１０７．０、７３．５、６９．２、６７．５、５７．２、５６．５、４３．４、４０．９、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．７、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ７７Ｈ１３７Ｎ３Ｏ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２３９、実験値１２３９
【０１３４】
実施例２
〔SC〕−バリン−フェニルアラニン−Fmoc（〔SC〕―Val―Phe―Fmoc）の液相合成
Fmoc−Phe ６３ｍｇ、HOBt ６３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Phe／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３５】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Phe−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３６】
実施例３
〔SC〕−バリン−プロリン−Fmoc（〔SC〕―Val―Pro―Fmoc）の液相合成
Fmoc−Pro５３ｍｇ、HOBt ５７ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF２ｍＬに溶解し、150分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Pro−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後、実施例１の１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３７】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Pro−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３８】
実施例4
液体担体−バリン−アラニン−Fmoc（〔SC〕−Ｖａｌ−Ａｌａ−Fmoc）の液相合成
Fmoc−Ala ５０ｍｇ、HOBt５３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（2 ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３９】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Ala−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１４０】
【発明の効果】
従来の固相反応ペプチド合成装置では、固相にアミノ酸結合基が存在するためアミノ酸との反応性が悪く、反応する量の１００倍といった大過剰量のアミノ酸を反応系に供給しなければならないという問題があった。これに対して本発明の液相ペプチド合成装置では、合成反応が相溶状態の均一溶液系で進行するため、反応効率が極めて高く、担体に結合したペプチド末端に対して、外部から添加して反応させるためのアミノ酸分子の量は過剰量必要としない。同様に液相のため反応も早く、固相合成とは比較にならない短時間で合成が進む。
【０１４１】
また本装置では、合成途中のペプチドの活性化された末端での未反応がきわめて少ないので、未反応が原因の誤結合による所望ペプチド以外の不純物ペプチドの発生が少ない。よって、従来必須であったクロマトグラフィ等による精製工程が省略可能であるし、限界とされているペプチドの結合数（残基数）５０程度以上のペプチドの実用的な合成が可能となる。
【０１４２】
さらにまた、固相ペプチド合成では困難であった目的の反応が進行チェックも、溶媒を染料等で着色するなどで可能である。本装置のスケールアップも通常の液相プロセス装置と同様に容易であるので、望まれていたペプチドの安価な量産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固相ペプチド合成のフロー説明図（その１）
【図２】固相ペプチド合成のフロー説明図（その２）
【図３】温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の実験例：下層の第二の溶媒に染色剤を混合したものの写真
【図４】液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図５】液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのFｍocを除去活性化し、Ｒ２残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図６】液体担体１とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのFｍocを除去活性化し、Ｒ３残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図７】本案の液相ペプチド合成装置の第一例
【図８】液体導電率センサーヘッド
【図９】本案の液相ペプチド合成装置の第二例（温度制御手段６は省略した）
【図１０】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その１）
【図１１】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その２）
【図１２】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その３）
【図１３】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その４）
【図１４】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その５）
【図１５】本案の液相ペプチド合成装置の第三例：分離槽１７を設けた例
【図１６】本案の液相ペプチド合成装置の第四例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図１７】合成層でのペプチド結合反応の前後の条件から排除量を推定する原理の説明図
【図１８】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その１）
【図１９】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その２）
【図２０】本案の液相ペプチド合成装置を用いた液相ペプチド合成の実施例の説明図
【図２１】本案の液相ペプチド合成装置の第三例補足説明図
【図２２】本案の液相ペプチド合成装置の第五例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図２３】溶液供給量の制御の説明図
【符号の説明】
１ 液体担体の例
１ａ 液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質
１ａｆ １ａのＲ１残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
１ｂ 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質
１ｂｆ １ｂのＲ２残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
１ｃ 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸の結合物質
１ｃｆ １ｃのＲ３残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
２ 液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分
３ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とを混合する混合槽
４ 第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液B１２の準備槽
５ 第二溶媒溶液B１２を混合槽３に供給する手段
５ａ ５の一部で、第二溶媒溶液の移送流路（配管）
５ｂ ５の一部で、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプなど
６ 合成槽３の温度制御手段
６ａ 第一・第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御（加熱）中である温度制御手段
６ｂ 第一・第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御（冷却）中である温度制御手段
７ 第二溶媒溶液の量を２０より得られる界面位置から判定して混合槽３から排除する手段
７ａ ７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなど
８ 液相担体にＲ１残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocを結合したＲ１残基アミノ酸を結合する反応
９ 固相担体（レジンなどの樹脂）
１０ N末端の保護基であるFｍoc等を除去して活性化する操作
１０ａ １０の操作（工程）をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段
１１ 活性化されたN末端部分に１２をペプチド結合反応させる操作
１２ N末端に保護基Fｍocなどを結合した結合前処理後のアミノ酸
１６ 混合槽内で相溶状態となった第一・第二溶媒溶液の移送手段
１６ａ １６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１７ 第一・第二溶媒溶液を相分離状態とする分離槽
１８ 第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段
１８ａ １８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１９ 混合槽の反応を推定する手段
２０ 第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段
２０ａ 合成槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）
２０ｂ ２０ａのセンサーヘッドの例で、２０ａの先端に配設された電気特性測定電極
２０ｃ ２０ａの内部電気配線
２０ｅ 光（放射エネルギー）発生器
２０ｆ 光（放射エネルギー）受信器
３０ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率を決定する手段
３１ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段
３２ 第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を付加追加する量の制御手段（流量制御装置）
３３ B１２の供給量の制御手段（流量制御装置）
３４ Ａ１xの供給量の制御手段（流量制御装置）
３５ B１２、Ａ１xの成分（溶媒A、溶媒Bの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報
Ａ 第一の溶媒
Ａ0 任意物質を溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ 液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１a 液体担体とＲ１残基アミノ酸との結合物質（1ａ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１af 1ａに保護基を結合した物質（1ａｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１b 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸との結合物質（1ｂ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１bf 1ｂに保護基を結合した物質（1ｂｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１c 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖の結合物質（1ｃ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１cf 1ｃに保護基を結合した物質（1ｃｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１x 液体担体と任意アミノ酸系物質との結合物質（1x）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１xf 1xに保護基を結合した物質（1xｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａtank 第一の溶媒の準備槽
Ｂ 第二の溶媒
Ｂ0 任意物質を溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２ １２を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
Ｂtank 第二の溶媒の準備槽
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 図面上の記載であってＲ１、Ｒ２、Ｒ３と同じ
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 合成すべきペプチド鎖を構成するアミノ酸残基
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸を特定の順序でペプチド結合してなるペプチドの合成装置に関し、特に、相溶状態と相分離状態とが温度で可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に利用してペプチドの量産を可能にする液相ペプチド合成装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学、薬学、生物学など広範囲の分野においてペプチドの合成技術の重要性はいうまでもない。アミノ酸を特定の順序でペプチド結合させたペプチドは、抗原−抗体相互作用の研究、臨床診断に利用するペプチド抗原の研究、種々の遺伝子研究などきわめて多くの研究にかかわる。免疫でも感染源でもタンパク質の活性はたかだかアミノ酸５個から１０個が結合したペプチドで決まる。したがって、その部分の合成は非常に重要であり研究用として多くの需要がある。
【０００３】
もちろんアミノ酸１０個以上結合したペプチドも重要である。合成可能とされるペプチドの結合数（残基数）の限界は５０程度であり、このアミノ酸結合数の限界を超えたペプチドの合成技術も望まれている。
【０００４】
研究の成果として、特定のタンパクやペプチドの薬効が検証されれば、化学合成ワクチン等の医薬品向けペプチドの大量需要が発生する。よって、商用規模の大量の需要に対応できるペプチド量産技術が強く望まれている。
【０００５】
化学的にアミノ酸を連結していくペプチド合成法は化学合成法と呼ばれ、本発明の装置のプロセスはこれに含まれる。これ以外にも、目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを調製して宿主細胞等に発現させる遺伝子組換え法がある。しかしこれは手間がかかりコスト高で量産には向かない。
【０００６】
その理由は、遺伝子組換え法で５０アミノ酸（残基）以上のペプチドを合成するには、まずそのアミノ酸をコードする１５０ヌクレオチド以上のＤＮＡを人工合成しなければならないからである。しかも、この方法ではＤ体のアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸誘導体を含むペプチドは合成できない。ここで、アミノ酸誘導体を含むペプチドとは、ペプチドのアミノ酸残基に任意化合物が結合したものである。
【０００７】
また、まず短い部分ペプチド（セグメント）を合成してから、それらを側鎖保護基が付いた状態でカップリングさせるセグメント縮合法がある。しかし、この方法も複数の工程を必要とする上、各セグメントのＣ末端アミノ酸がGly、 Proなど特定のアミノ酸でなければならず、セグメント設計上の制約がある。
【０００８】
量産をねらって反応の自由度が大きく、反応選択性が小さい化学合成法（従来の液相法）をもちいた場合には、アミノ基とカルボキシル基とがとり違えられ結合したり、アミノ酸自体の異性体が間違って結合したりしてしまう。さらに、反応後に多量の試薬、触媒、反応補助剤、副生成物などが残留する。そのため合成反応を行った後、クロマトグラフィなどによって目的とする生成物を分離精製するプロセスを必要とするが、目的とするペプチドの収率が極めて悪いことが多い。そのため、一般の液相法（反応選択性が小さい従来の液相法）はほとんど用いられていない。
【０００９】
反応選択性を向上させ副生成物の発生を抑えるため、固体表面に化学的にアミノ酸を連結していく、固相合成法が現在のペプチド合成の主流となっている。この固相ペプチド合成法（Solid Phase Peptide Synthesis法）は、メリフイールド（Merrifield）により開発された。
【００１０】
固相ペプチド合成法を図１〜図２で説明する。固相ペプチド合成では、合成すべきペプチドのカルボキシル基側末端（C末端）のアミノ酸を、不溶性の微小樹脂（レジンなど）ビーズの表面に化学的に結合させる。この微小樹脂ビーズは固体であり、アミノ酸を担持しつつ結合していくので、「固体担体」と呼ばれる。図１〜図２の９が、固体担体である。
【００１１】
固体担体に結合されたC末端アミノ酸のアミノ基側末端（N末端）に、さらに結合すべきアミノ酸を用意する。この結合すべきアミノ酸では、N末端を不活性化、C末端を活性化する処理を行う。この操作を結合前処理と呼ぶことにする。不活性化は、N末端にFmoc (9-flourenylmethloxycarbonyl) あるいはt-Boc (tert-butyloxycarbonyl) あるいはＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）などの反応保護基を結合させる。
【００１２】
図１〜図２の１２が、結合すべきアミノ酸に結合前処理をした化合物である。１２の「X」は、C末端の活性化基である。このようにして、N末端の反応をブロックしてC末端のみ反応させるのである。
【００１３】
固体担体に結合されたアミノ酸のN末端にも保護基が結合されているので、この保護基を図中の１０の操作で除去する。それに続いて、その活性化されたN末端にC末端を活性化した１２をペプチド結合させる反応操作１１を行う。ペプチド合成反応温度は、アミノ酸が変性しない５０℃程度の比較的低温であり、反応促進剤の添加など公知の方法を適用して行う。その反応後、未反応アミノ酸を洗浄除去する。
【００１４】
図１では、合成すべきペプチドのC末端から二つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２）がペプチド結合された部分ができあがる。それに続く図２では、三つのアミノ酸（残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）がペプチド結合された部分ができあがる。こういった操作を繰り返して合成すべきペプチドを得る。
【００１５】
ペプチド結合が完了したら、C末端を固体担体から開裂させ、必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。この工程は、クリーベイジ（cleavage）と呼ばれる。
【００１６】
このようにアミノ酸を１種ずつ添加結合することで、反応の自由度、選択性をきわめて小さくし、所望のアミノ酸を所望の順序でペプチド結合させ、所望のペプチドを合成する。固相ペプチド合成では、不溶性の微小樹脂ビーズをアミノ酸系物質の「担体」として用いることに特徴がある。（ここで「アミノ酸系物質」とは、単独のアミノ酸あるいはアミノ酸残基、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドを含む。）固体担体の素材としてはガラス、シリカ、合成樹脂などが知られているが、合成樹脂が最も普通に使用されている。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、固相ペプチド合成も欠点がある。固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、液相反応に比べると反応が起こりにくい。すなわち、固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり、その巨大分子のごく小さな反応部にアミノ酸を結合させる必要があるが、それが確率的に起こりにくい。そのため高価なアミノ酸反応試薬１２を大量に供給しなければならない。通常反応量の１００倍程度を供給する。その結果として反応に関与できない反応試薬が大量に発生し無駄になる。
【００１８】
しかも、ｎ番目のアミノ酸の未反応部には次の結合工程で、ｎ＋１番目のアミノ酸がｎ番目として結合してしまうので所望のペプチドではない不純物となってしまう。こういった未反応が、個々の結合反応で５％しか発生しないとしても、５０アミノ酸（残基）のペプチドを合成すると、最終的な収率はたったの７．７％となってしまう（０．９５の５０乗）。３０アミノ酸（残基）でも２１.５％である（０．９５の３０乗）。
【００１９】
このように、固相ペプチド合成では個々のペプチド結合の未反応を極力減らすべく、前記のように反応試薬を大量に使用せざるを得ないというコスト面での問題、および反応時間を十二分に長く取らざるを得ない、といった生産効率上の問題があった。
【００２０】
この他にも固相ペプチド合成では、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができない、固体担体が微小とはいえ数ミクロンの大きさがあるため反応槽をスケールアップすると、巨大なものになってしまう、固相担体が高価で再利用ができない（使い捨て）といった問題があった。
【００２１】
本発明は、上記のような従来のペプチド合成装置の問題を解決すべく、相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に用いたペプチド合成装置を提供するものである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、本案発明者による特願2001-254109「相溶性−多相有機溶媒システム」を利用した液相ペプチド合成装置であって、より具体的には、本案発明者による特願2001-385493「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示された方法を実現する装置である。
【００２３】
＜液相ペプチド合成法の溶媒セット＞ まず、相溶性−多相有機溶媒システムを説明し、次にそれを用いた液相ペプチド合成法を説明する。図３が相溶性−多相有機溶媒システムを構成する具体的な溶媒の組み合わせの実験写真である。
【００２４】
特願2001-254109「相溶性−多相有機溶媒システム」にて、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒のセット（組み合わせ）が開示されている。ここで第一の溶媒と第二の溶媒のそれぞれは、複数の溶媒の混合溶媒でもよい。
【００２５】
図３は第一の溶媒と第二の溶媒を混合した例であり、下層の第二の溶媒に染色剤を混合して可視化してある。これらの溶媒の組み合わせ（以下溶媒セットと記載する）にて、２５℃では相分離状態（図３ａ）、これを４５℃に加熱すると相溶状態（図３ｂ）となる。これを冷却すると相分離状態に戻る。図３のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅは時間を追って撮影したものを順に並べたもので、ｃ、ｄは４５℃から２５℃に冷却される中間状態である。この実験の溶媒セットは、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆変化することがわかる。
【００２６】
液相ペプチド合成に好適な溶媒セットは、特願2001-385493「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示されているように、一方の溶媒または混合溶媒（第一の溶媒）を構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなる。
【００２７】
第一の溶媒は、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などで、中でも好ましいものが、シクロアルカン系の化合物であり、特に好適なものとして「シクロヘキサン」を挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連していると推測できる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点もあり、最終工程である回収工程でもメリットがありこの面からも好ましい。回収工程はあとで説明する。
【００２８】
一方、第一の溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒（第二の溶媒）を構成する有機溶媒は、基本的には高極性有機溶媒である。好ましいものとしては、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものである。
【００２９】
第二の溶媒は、さらに具体的には、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が1、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、またハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下である。
【００３０】
上記の第一の溶媒と第二の溶媒との溶媒セットは、図３のように温度により、可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態（相溶状態）と複数相に分離した分離溶媒系の状態（相分離状態）とを可逆的に取り得る。
【００３１】
＜相溶化温度＞ 第一の溶媒あるいは第二の溶媒の構成を変えることによって、相溶状態と相分離状態が切り替わる温度も自在に変えることができる。たとえば、図１８が第一の溶媒であるシクロヘキサン（CH）と第二の溶媒であるニトロアルカン混合溶媒（NA）の構成と相溶化温度の変化の説明図である。パラメータとしてCHとNAの容積比を１：５、２：５、１：１、５：１とし、それぞれのNAを構成しているニトロメタン（NM）とニトロエタン（NE）の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３２】
また、図１９は第一の溶媒であるシクロヘキサン（CH）と第二の溶媒を１：１の等容積（それぞれ５０容積％）と固定して、第二の溶媒を、ニトロメタン（NM）とニトロエタン（NE）の混合溶媒、または、アセトニトリル（AN）とプロピオニトリル（PN）の混合溶媒、または、ジメチルホルムアミド（DMF）とジメチルアセトアミド（DMA）の混合溶媒として、第二の溶媒の容積混合比を横軸、溶媒温度を縦軸として、両溶媒を混合した際の相溶化温度データをプロットした。
【００３３】
図１８、図１９より、２０℃から６０℃の温度で相溶化温度が、第一・第二の溶媒構成で変化することがわかる。換言すれば、第一の溶媒と第二の溶媒のセットにおいて、第一・第二の溶媒構成を変える手段をもつことによって、両溶媒の相溶化温度を変えることができる。つまり相溶化状態での化学反応を温度が低いレベルでも可能になしうる。
【００３４】
第一・第二の溶媒構成は、第一の溶媒と第二の溶媒の混合比でもよいし、混合溶媒である第一の溶媒あるいは第二の溶媒をなす混合溶媒要素の混合比でもよい。構成変化手段は、第一の溶媒と第二の溶媒の供給混合に際して、前記構成を変化させるべく、第一の溶媒あるいは第二の溶媒の供給量を加減調整したり、新たに混合溶媒要素を付加したりすればよい。
【００３５】
上記のように相溶化温度が変えられることを加味し、混合前の第一・第二溶媒の供給量は、それらに溶解されるアミノ酸、アミノ酸系物質で行うペプチド合成の温度をどうするかを考慮し図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。当然のことながら反応のための温度制御の温度も図１８、図１９のようなデータに基づいて決定するとよい。
【００３６】
＜液体担体＞ さて、特願2001-385493（液相ペプチド合成法）において上記の溶媒セットを用いてアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法を提案しているが、この合成法にて溶媒セットと共に重要なものは、固相ペプチド合成の固体担体に相当する「液体の担体」である。
【００３７】
これは、特願2001-254109（溶媒システム）において、「第一の溶媒あるいは第二の溶媒いずれか一方のみ溶解する反応に関与する化学成分」と記載したものに相当する。
【００３８】
すなわち、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体の担体である。機能について固体担体と等価であるので、本明細書ではこれを「液体担体」と呼称する。この液体担体について説明する。
【００３９】
従来技術の固相表面反応を液相の反応に置換すれば、従来問題であった反応性の悪さ（固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり反応部位に接近しにくい）を改善できる。さらに、前述の相分離する溶媒セットをうまく使えば、得られた反応生成物の分離が極めて容易に実現できる。このように画期的な利点をもつ液相ペプチド合成法の実現には、固相ペプチド合成の固体担体に相当する液体の担体が必要で、発明者はこれを見出した。その液体担体は以下の機能を必要とする。
【００４０】
すなわち、液体担体はペプチドの形成を開始するアミノ酸との結合部を有すること、アミノ酸を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持できること、さらにアミノ酸と結合した化合物および合成中のペプチド鎖を担持した化合物が、第一の溶媒に溶解されること、である。
【００４１】
これら機能を持つ液体担体の候補化合物は、親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するものであることを特徴とする下記の一般式Ａ（化１）で表される芳香族炭化水素環または炭素数１０以上の炭化水素基を基本骨格化合物である。
【００４２】
【化１】
一般式Ａ（化１）において、Ｌ１は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線とも結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団である。
【００４４】
一般式Ａ（化１）において、点線はＨとの結合または前記Ｌ１と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団の結合であり、ＸはＯ、Ｓ、Ｎ、エステル基、スルフィド基またはイミノ基であり、Ｒは、シクロアルカン系の溶剤への溶解性を高めるＯ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基である。また、ｎは１〜５の整数である。
【００４５】
一般式Ａ（化１）は、より具体的には、下記の一般式群Ｂ（化２）から選択される。一般式群Ｂ（化２）において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａ（化１）と同じ。Ｑは、単結合または炭化水素基であり、Ｒ２はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ３およびＲ４は、一般式Ｃ（化３）の基である。また、一般式Ｃ（化３）のＲ５は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。
【００４６】
【化２】
【化３】
前に説明した第一の溶媒は、分離状態において、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解するが、液体担体と結合していないアミノ酸（ペプチド結合させるべきアミノ酸）は溶解しない（難溶である）。ここで、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドである。
【００４９】
また逆に、第二の溶媒は、分離状態において、アミノ酸（ペプチド結合させるアミノ酸）を溶解するが、上記液体担体および液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解しない（難溶である）特性を持っている。
【００５０】
液体担体の好適な具体例を図４の１に示す。１は、前記の一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ１８Ｈ３７−であり、ＸがOであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ２であり、Ｒ２がＯＨである。名称は、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕である。この液体担体１は、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する。
【００５１】
本案は１に限定されることはないが以下、この液体担体具体例１を用いて、本案装置のプロセスである液相ペプチド合成法を説明する。図４から図６は、固相ペプチド合成法の固体担体９を液体担体１に置換した本案液相ペプチド合成の説明図である。図４から図６は、図１、図２に対応している。図４の２は、液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分である。
【００５２】
図４は、N末端を保護され、C末端を活性化された（活性化基Xを結合された）Ｒ１残基アミノ酸１２のC末端を、液体担体１に結合する反応（図４中の８）を示す反応フロー図である。ここで、液体担体１は、第一の溶媒（A）に１が溶解された第一溶媒溶液（A１）という溶液の状態であり、Ｒ１残基アミノ酸１２は、あらかじめ第二の溶媒（B）に溶解され、第二溶媒溶液（B１２）として準備される。（A、B、A１、B１２という標記は図４から図６には記載されていないが、これらは後に説明される図１０から図１４に対応している）
【００５３】
前記第一の溶媒（A）に１が溶解された第一溶媒溶液（A１）と、Ｒ１残基アミノ酸１２が第二の溶媒（B）に溶解された第二溶媒溶液（B１２）とが混合される。第二溶媒溶液（B１２）は多少過剰に投入されるのが好ましい。その理由は、相対的に第一溶媒溶液が多いとすべてのペプチド反応が生じても、未反応の末端をもつ担体が残留するからである。これは固相合成法と同様であるが、固相合成法のように必要量の１００倍も過剰に投入する必要はない。
【００５４】
両溶液混合後、それらが相溶状態となる温度に加熱される。すると、液体担体１の末端はアミノ酸と結合する水酸基であるので、Ｒ１残基アミノ酸C末端とペプチド結合反応（図４中の８）して１ａｆとなる。この１ａｆも、相溶化状態の両溶媒に溶けている。
【００５５】
ペプチド反応後、固相合成では未反応アミノ酸等との分離のために洗浄除去などを行っていたが、本発明では、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却すればよい。このことで、１ａｆは分離された第一の溶媒（A）に溶解されたA１ａｆとして、第二溶媒溶液から分離される。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。
【００５６】
排除される第二溶媒溶液中には、過剰に投入したため未反応で残留したＲ１残基アミノ酸、および反応副生物などが溶解している。この分離操作は、従来と比較にならない単純操作であり、かつ不純物の混入もきわめて少ない。したがってクロマトグラフィ等による精製工程も省略が可能である。
【００５７】
分離状態にある第一・第二溶媒溶液にて、第二溶媒溶液を排除するのであるが、この排除操作で第一溶媒溶液だけが残留することが重要である。したがって歩留まりは悪くなるが、第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。残留した第一溶媒溶液には、１にＲ１残基アミノ酸C末端が結合した１ａｆが溶解している（A１ａｆ）。
【００５８】
次の工程である図５では、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのアミノ末端を保護しているFｍocを除去して活性化（図５中の１０）する。図４同様に、N末端を保護したＲ２残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液B１２として準備し、これら第一溶媒溶液A１ａと第二溶媒溶液B１２とを混合する。同様に第二溶媒溶液B１２は過剰に混合されるのが好ましい。
【００５９】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ａと、Ｒ２残基アミノ酸C末端をペプチド結合させる（図５中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆができる。
【００６０】
上記ペプチド反応後、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却し、１ｂｆを分離された第一溶媒溶液に溶解されたA１ｂｆとし、第二溶媒溶液から分離する。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。同様に第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。
【００６１】
次の工程である図６も同様に、第一溶媒溶液中の液体担体１とＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１bｆのアミノ末端を保護しているFｍocを除去して活性化（図６中の１０）する。同様に、N末端を保護したＲ３残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液B１２として準備し、これら第一溶媒溶液A１ｂと第二溶媒溶液B１２とを混合する。
【００６２】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ｂと、Ｒ３残基アミノ酸C末端をペプチド結合させる（図６中の１１）。その結果、相溶化溶液中に液体担体１にＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基ペプチドが結合した物質１cｆができる。以下同様の操作でペプチドを伸長させていく。
【００６３】
このように一連のペプチド結合を行い、それが完了したら、ペプチドC末端を液体担体から必要に応じて開裂し、同じく必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。このクリーベイジ（cleavage）工程は固相合成と同様である。すなわち、液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存してもよい。開裂後のペプチドN末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【００６４】
固相合成との大きな相違は、溶媒に溶解された溶液での反応であるので、ペプチド合成の個々のペプチド結合での未反応がきわめて少ないことである。したがって、多少は過剰に加えるものの、固相合成のように１００倍といった大量の反応試薬を過剰に投入しなくともよい。液相反応なので当然反応時間も短縮される。
【００６５】
また、溶媒を染料等で着色するなどして、目的の反応の進行を色によって確認することもできる。さらにまた、反応槽などからなる後述の装置のスケールアップも通常の液相プロセス同様に容易に可能となる。
【００６６】
Ｒ１をバリン（Val）、Ｒ２をグリシン（Gly）、Ｒ３をフェニルアラニン（Phe）とした図４から図６のペプチド液相合成を実施した結果、収率は９５％、９７％、９９％であった。（図２０参照）収率１００％とならないのは、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質が、第二の溶媒に全く溶解しないと言うのではないためである。（難溶性であるためである。）
【００６７】
＜液相ペプチド合成装置＞ 本案の装置を説明する。本案装置は、以上説明した液相ペプチド合成を行う装置である。すなわち、第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせ、および第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体担体を用いて、該液体担体に合成すべきペプチド鎖のアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成装置である。
【００６８】
本案の液相ペプチド合成装置の第一例を図７に示す。本案の液相ペプチド合成装置は、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した、第二溶媒溶液を供給する手段（図７の５）に連結され、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した、第一溶媒溶液と、供給された第二溶媒溶液とを混合する混合槽（図７の３）と、前記混合槽の温度を、混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度、または混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御する混合槽の温度制御手段（図７の６）と、前記混合槽の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段（図７の２０）と、該手段によって得られる界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定量に基づいて混合槽から第二溶媒溶液を排除する手段（図７の７）とを有する。
【００６９】
ここで、アミノ酸とは、アミノ酸残基に任意化合物が結合したアミノ酸誘導物質を含むものであり、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドであり、結合前処理とは、合成すべきペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基側末端を不活性化、カルボキシル基側を活性化する処理である。
【００７０】
合成工程の初期にて、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図７では省略）によって、あらかじめ液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液を混合槽３に供給する。あるいは、液体担体、第一の溶媒をそれぞれ個別に供給して混合槽３で溶解してもよい。説明の簡単のため、液体担体を１とし、第一の溶媒をA、第一の溶媒に液体担体を溶解した第一溶媒溶液をＡ１と記載する。
【００７１】
第二の溶媒をBと記載し、N末端に保護基Fｍocなどを結合した結合前処理後のアミノ酸を１２と記載し、１２をBに溶解した、第二溶媒溶液をB１２と記載する。合成工程の初期に、混合槽３に供給されたＡ１にB１２が供給され混合される。
【００７２】
混合槽３には、温度制御手段６が配備されている。これは公知の加熱ヒータや湯浴や高温ガスによる加熱装置、ぺルチェ素子や冷浴や低温ガスによる冷却装置を任意に採用すればよい。なお図７にて、Ａ0は任意物質を溶解した第一溶媒溶液を示す。Ａ0には、Ａ１、Ａ１a、Ａ１af、Ａ１b、Ａ１bf、Ａ１c、Ａ１cf が例として含まれる。これらの意味は符号の説明の項を参照のこと。
【００７３】
混合槽３へB１２を供給する手段５が、３に連結されており、これはB１２の準備槽４からB１２を移送する流路（配管）５ａ、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプ５ｂなどで構成されている。図７に示すように複数の準備槽を配備し、結合前処理後の異なったアミノ酸を第二の溶媒Bに溶解させ、あらかじめ準備しておくと便利である。
【００７４】
すなわち、図７のごとく複数のB１２の準備槽４から、逐次合成すべき結合前処理後のアミノ酸が選択的に混合槽３へ供給される構成が好適である。
【００７５】
混合槽３に前記第二溶媒溶液B１２とが供給され、Ａ１（Ａ0）と混合され、温度制御手段６にて、相溶状態にする。その制御温度は、混合槽３に初期供給された第一溶媒溶液の供給量および溶液成分、第二溶媒溶液B１２の供給量および溶液成分に基づいて決める。具体的には、第一第二の溶媒溶液の種類（溶媒の種類、混同比、溶媒に溶解された液体担体やアミノ酸系物質の種類）および供給手段による供給量が既知であるので、それらと図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で決められる。
【００７６】
また第一第二の溶媒溶液の供給量自体も、あらかじめ図１８、図１９の相溶化温度のデータを照らし合わせた上で調整し、合成反応の温度を適切なものにすることも制御設計上可能である。
【００７７】
すなわち、混合槽の温度制御手段が、混合槽の第一溶媒溶液の量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて温度を制御するのが好適であり、かつ第二溶媒溶液を供給する手段の供給量が、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて決定されるのが好適である。溶液供給量の制御については図２３を用いて後で説明する。
【００７８】
ここで、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【００７９】
相溶状態でペプチド合成反応が行われる。この反応の終了は、たとえば溶媒の着色などによる反応マーカで確認することもできる。もちろん、供給量と反応時間のデータをあらかじめ採取しておき、反応時間で反応終了を判定してもよい。その判定後、相溶化温度より低温である任意の温度に冷却して相分離状態とする。
【００８０】
相分離状態で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する。界面の位置がわかれば、既知である混合槽の形状、容量にて、第二溶媒溶液の量の判定は容易である。よって界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定する。
【００８１】
前記第二溶媒溶液の判定量に基づいて、混合槽３より第二溶媒溶液を排除手段７で排除する。この排除の量は、第二溶媒溶液が完全に排除されるように、前記判定された第二溶媒溶液量よりも多少多めが好適である。図７の７ａは７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなどである。
【００８２】
第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０は、たとえば図８のように混合槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）２０ａ、２０ａのセンサーヘッド２０ｂとからなるものであって、センサーヘッド電極間の導電率など溶液の電気特性を検出し、その相違で界面を検出するもの等を採用すればよい。なお、２０ｃは２０ａの内部電気配線である。
【００８３】
図９は、図中に第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０を別の例とした本案装置の第二例（温度制御手段６は省略した）である。図９中の２０ｅは、光（放射エネルギー）発生器であり、２０ｆは、光（放射エネルギー）受信器である。この受信器で溶液の光学特性、エネルギー透過特性を検知し、その相違で界面を検出する。
【００８４】
界面検知を容易とするために、一方の溶媒に染料を添加して着色するなどすれば上記の光学的界面検知手段は有効であろう。なお図９中、混合槽３の部分のＢ０は、反応後の第二溶媒溶液で未反応の１２、その他の副産物も第二の溶媒に溶解しているのでＢ０（任意物質を溶解した第二溶媒溶液）と記載した。
【００８５】
図１０から図１４が、初期工程の後の本案装置でのペプチド合成工程の説明図である。これらは図４から図６の反応フロー図に対応している。すなわち、図４にて液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合させるまでが図１０の（a）（b）（c）である。図１０（c）では、温度制御手段６は相溶化温度に制御されている（６ａ）。
【００８６】
図１１は次工程であり、温度制御手段６を相分離温度として（６ｂ）、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１１（e））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１１（ｆ））。ついで図１２にて、液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質にＲ２残基アミノ酸を結合させる（図１２の（g）（h）（i））。図５の活性化反応１０は省略されている。
【００８７】
以下同様に、図１３は、温度制御手段６を６ｂとして第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却され（図１３（k））、分離状態で第二溶媒溶液Ｂ０を排除する（図１３（ｌ））。ついで図１４にて、液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質にＲ３残基アミノ酸を結合させる（図１４の（m）（n）（o））。図６の活性化反応１０は、混合槽内で行われるが省略されている。
【００８８】
図１５は、本案の液相ペプチド合成装置の第三例であって、これは前例の混合槽３は混合と反応専用とし、これに加えて分離専用の分離槽１７を設けた例である。これらはそれぞれ相溶温度、相分離温度に制御されている。すなわち、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御された混合槽３と、混合槽内で相溶状態となった第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送手段１６を介して、該混合槽と連結され、移送された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に温度制御された分離槽１７と、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段（図１５では省略）と、前記第二溶媒溶液の量に基づいて分離槽から第二溶媒溶液を排除する手段１８とを有する。
【００８９】
混合と反応専用の混合槽には、第一の溶媒に、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解した、第一溶媒溶液（Ａ０）を供給する手段、および第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液（Ｂ１２）を供給する手段が連結されている。
【００９０】
図１５の構成では、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された第一溶媒溶液（Ａ０）が、再度混合槽３に戻って供給される。すなわち、混合槽３に供給される第一溶媒溶液が、分離槽１７で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液である。つまり、混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段が、分離槽１７の残留第一溶媒溶液を混合槽に移送する移送手段である。
【００９１】
図１５の構成は、より正確には図２１に示すように、Ａ１を混合槽に供給する手段が配備されている。また、図２１に示すようにN末端の保護基であるFｍoc等を除去して活性化する操作（工程）１０をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段１０ａが付帯配備されている。図２１にて、前述の混合槽３に第一溶媒溶液を供給する手段は、この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されている。この太点線ルートで分離槽１７の残留第一溶媒溶液が混合槽に移送される。
【００９２】
もちろん、第一例、第二例のように末端活性化反応１０を、混合槽３内、または分離槽１７内で行なってもよい。図１５中の１６ａは、１６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどであり、図中の１８は、第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段で、１８ａは、１８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなどである。
【００９３】
図１５のように上方に混合槽、下方に分離槽を配備すれば、１６による第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の移送は容易である。混合槽で相溶化された第一・第二溶媒溶液が重力で落下して、分離槽に移送され、そこで相分離温度となって分離する。分離状態で、判定手段１８にて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定に基づいて第二溶媒溶液（Ｂ０）を排除する。
【００９４】
混合槽、分離槽の制御温度は、第一例第二例と同様に、混合槽に供給される第一溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９５】
また、第一溶媒溶液を供給する手段の供給量、および第二溶媒溶液を供給する手段の供給量自体も、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて図１８、図１９のようなデータを参照して決定されるのが好適である。
【００９６】
ここでも前に説明した通り、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分であって、これらで図１８、図１９等のデータを参照する。
【００９７】
第二溶媒溶液の量を判定して排除する手段１８では、前に説明した分離槽内の界面検出手段（図１５では省略）による第一・第二溶媒溶液界面の検出に基づいて量を判定して排除操作をすればよい。この説明は略す。
【００９８】
一方図１７は、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する別の手段を説明する図である。すなわち、分離槽１７の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽３に供給される第一溶媒（Ａ0）および第二溶媒溶液（B１２）のそれぞれ供給量およびそれぞれ溶液成分と、相溶状態の混合槽３の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段１９を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである。
【００９９】
ここでも、第一溶媒溶液の溶液成分とは、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および
第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分とは、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である。
【０１００】
これら反応条件と反応前化合物の条件が既知であるので結合反応が予測できる。つまり、分離槽１７のペプチド結合反応は、３に供給される溶液の成分と量、および反応活性化試薬など既知の反応条件情報から予測が可能である。理論的な予測が困難でも、同じ条件で実験データをあらかじめ採取しておいて、実験データから外挿内挿するなどの方法でも可能である。その場合には実験データをテーブル化して推定手段１９に記憶させて引用すればよい。
【０１０１】
推定には、図１７に示すように分離槽の温度、混合槽から分離槽に移送される相溶状態の溶液量を入力して用いてもよい。このようにして分離槽１７での反応を推定し、その推定に基づいてペプチド反応による第一・第二溶媒溶液の量の変化を推定し、センサーレスで分離された分離槽の第二溶媒溶液の量を１８で判定するものである。もちろん前記の界面検知手段等のセンサーと組み合わせて、より精度の高い量の判定を行ってもよい。
【０１０２】
判定された量に基づいて、たとえば流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど（１８ａ）で流量を計測しながら分離槽１７から第二溶媒溶液を排除する。流量センサーなどの流量制御系の図示は略した。
【０１０３】
図１７で説明した第二溶媒溶液の量を判定する手段は、分離槽をもたない混合槽のみである本案第一例（図７）、第二例（図９）でも適用が可能である。すなわち、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽の第一・第二溶媒溶液の量および溶液成分と、相溶状態の混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定すればよい。
【０１０４】
図１６は、本案の液相ペプチド合成装置の第四例であって、工程を連続化した量産向けの装置である。図１６にて１６，１８は省略した。このような構成であれば、複数の別種のペプチドを連続して流れ作業的に合成できる。すなわち、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変えてアミノ酸を結合させればよい。
【０１０５】
図１６の構成の特徴は、混合槽と、該混合槽と連結された分離槽とからなる、複数組の混合槽・分離槽の組み合わせを有し、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に供給される第一溶媒溶液が、他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液となっていることである。
【０１０６】
図１６にて、N末端の保護基を除去して活性化する操作（工程）１０をなす末端活性化手段１０ａが図示されている。この末端活性化手段１０ａを介して、分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示されているルートが、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に第一溶媒溶液を供給する手段であって、これが他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽の残留第一溶媒溶液をひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に移送する移送手段である。
【０１０７】
図１６の第四例にて、それぞれの混合槽に供給される第二溶媒溶液Ｂ１２の種類を固定する。すなわち、合成すべきアミノ酸の種類を固定した混合槽・分離槽、たとえば、バリン結合用混合槽・分離槽、グルタミン酸結合用混合槽・分離槽、フェニルアラニン結合用混合槽・分離槽・・・などを近接して配列配備する。そして、合成すべきペプチドのアミノ酸結合順に応じて、分離槽から混合槽に移送する移送手段の連結が自在に切り替えできる装置構成としてもよい。
【０１０８】
すなわち、図１６にて１０ａを介して分離槽１７と混合槽３を結ぶ太点線で示される部分の配管系にて、切り替え弁などを配備して、分離槽で出た第一溶媒溶液が次に結合されるアミノ酸結合用の混合槽に移送されるよう切り替え自在とする構成である。
【０１０９】
こういった切り替えを実施すると切り替え前の残留物による不純物混入が懸念されるが、図１６中１０ａの末端活性化手段に不純物浄化の工程をおこなう手段を追加配備すれば問題解決できる。これは配管系を固定し、合成すべきアミノ酸に応じて図の上方から供給される第二溶媒溶液（Ｂ１２）の種類を逐次変える前述の構成でも同様である。
【０１１０】
図２２は、本案の液相ペプチド合成装置の第五例であり、２組の混合槽・分離槽の組み合わせ構成の例である。このように２組、３組（例示略）・・・などと複数組を組み合わせておけば、ペプチドの回収工程操作や混合槽・分離槽の不純物除去、洗浄操作を行いやすい。第五例の説明は第三例、第四例と同様であるので略す。
【０１１１】
＜溶液供給量の制御＞図２３は、図１８、図１９等の相溶化温度のデータに基づいて混合槽への溶液量を制御することの説明図である。図１８、図１９に示したような溶液成分とその混合比率によって相溶化温度が変化するデータが図２３の３０にデータベースとして記憶されている。この３０は、B１２、Ａ１xの成分（溶媒A、溶媒Bの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報３５を入力し、データベースの相溶化温度変化データを参照して最適な溶液比、溶液量を決定する。
【０１１２】
３０は第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段３１に最適な溶液比、溶液量を出力し、３１はB１２の供給量の制御手段（流量制御装置）３３、Ａ１xの供給量の制御手段（流量制御装置）３４へ制御指令を出力する。
【０１１３】
溶液比の最適化に際して、必要に応じて第一の溶媒のみ、あるいは第二の溶媒のみを付加的に追加供給すれば溶液比、溶液量の制御自由度が増し、好適である。したがって、第一・第二の溶媒の準備槽Ａtank・Ｂtankと、第一・第二の溶媒Ａ・Ｂを混合槽に供給する手段と、付加追加量の制御手段（流量制御装置）３２を配備し、３１の制御指令が３２に出力されるような構成とすればよい。
【０１１４】
この付加追加は、本装置の第一例から第五例いずれも適用が可能である。すなわち、混合槽あるいは分離槽に連結して、第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を供給する第一・第二溶媒の付加供給手段を配備し、この付加供給手段で溶媒を単独で付加的に混合槽に追加供給して溶媒比率を調整制御すればよい。これによって相溶化温度を変えることができる。
【０１１５】
＜追補＞排除手段７は、ここまで主として図示した混合槽あるいは分離槽の下方から溶液沈殿部を流出させる方式以外、混合槽あるいは分離槽の上方から溶液吸引手段で溶液上澄み部を吸い出す方式で排除する装置、混合槽あるいは分離槽の任意の部位から溶液を部分抽出する機能をもつその他の公知の溶液抽出装置を適用してもよい。
【０１１６】
また、ここまで説明したように、第二溶媒溶液を排除し、残留する第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成する装置構成とは逆に、第一溶媒溶液を逐次抽出して、その第一溶媒溶液に合成すべきペプチドを合成していく構成を部分的に採用してもよい。
【０１１７】
合成したペプチドを回収する最終工程は、シクロヘキサンを第一溶媒に用いた場合、その融点が６．５℃であるので、それ以下に冷却して固体として分離し、その後加熱し、シクロヘキサンを蒸発除去することにより液体担体に結合したペプチドを回収する。
【０１１８】
液体担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存すればよい。開裂後のペプチドN末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【０１１９】
【実施例】
ペプチド合成実施例のフローを図２０に示す。図２０における具体的操作を以下実施例１に説明する。また、他の実施例を実施例２から実施例４に示す。以下の実施例では、液体担体を〔ＳＣ〕と一部略記する。これら実施例では、末端活性化反応１０は、混合槽で行なった。また、本案装置を構成する混合槽３、分離槽１７、準備槽４、温度制御手段６等の記載は省略した。実施例中のろ過、攪拌、濃縮乾固等を行なう、ろ過装置、攪拌装置、ロータリーエバポレーターなどは本案の装置構成に適宜付帯、付加すればよい。このような公知の装置を連結した構成とすることは容易である。
【０１２０】
実施例１
液体担体〔ＳＣ〕−バリン（Ｖａｌ）−グリシン（Ｇｌｙ）−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）−Fmoc 〔（ＳＣ）−Val−Gly−Phe−Fmoc〕 〕の液相合成。液体担体〔ＳＣ〕として、前記の（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕を用いる。
【０１２１】
工程１）
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１７０ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、さらにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１２５ｍｇを添加する。本溶液を室温にて１５分間撹拌した後、ろ過する。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、得られた残渣をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍＬ に溶解する。続いて液体担体〔ＳＣ〕を溶解したシクロヘキサン溶液（液体担体５０ｍｇ／３ｍＬ）３MlをＤＭＦ溶液に添加する。それにDMAP4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）６．５ｍｇを添加し、反応溶液を５０℃に加温し、３０分反応を行う。このときシクロヘキサン層とＤＭＦ層に分離していた溶液系は均一溶液系になる。
【０１２２】
反応終了後、反応溶液を室温に戻し、反応溶液を再び二相に分離させる。下層のDMF相を分離、除去し、１０％ジエチルアミン／DMF溶液を３ｍＬ添加し、５０℃で２０分間攪拌する。反応液を冷却し、シクロヘキサン層を分離する。このシクロヘキサン層には液体担体結合バリン−ＮＨ２(〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２) が回収される。（収率９５％）
【０１２３】
工程２）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−グリシン−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２４】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ）を分離する。Fmoc基は同溶液にジエチルアミンを添加することにより、脱離し〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ を得る。（収率９７％）
【０１２５】
工程３）
つぎに、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−フェニルアラニ−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後工程２）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１２６】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成された。（収率９９％）
【０１２７】
構造確認
〔ＳＣ〕シクロヘキサン液体担体；（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）；５．５４（２Ｈ、ｓ）、４．５８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、３．９６（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９６（３Ｈ、ｓ）、１．８２−１．７０（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．４１（６Ｈ、ｍ）、１．３８−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．８８（９Ｈ，６，８Ｈｚ）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００Ｈｚ）；（１００ＭＨｚ δ：１５３．２，１３７．４，１３６．０，１０５．２、７３．４、６９．１、６５．７、３２．０、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２６．２、２２．８、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）、Ｃ６１Ｈ１１６Ｏ４に対する計算値 〔Ｍ＋Ｎａ〕＋ ９３５、実験値９３５.
【０１２８】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ；（ＣＤＣｌ３）δ７．７６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．６０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｄｔ、J=２．６、７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、４．３８（２Ｈ、ｍ）、４．２９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．９４（６Ｈ、ｍ）、２．１９（１Ｈ、ｍ）、１，７８（４Ｈ、ｍ）、１．７３（２Ｈ、ｍ）、１．４５（８Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）、δ１７２．０、１５６．２、１５３．２、１４３．８、１４１．３、１３８．４、１３０．２、１２８、３、１２７．７、１２７．１、１２５，１、１２０．０、１０７．１、７３．４、６９．２、６７．４、６７．１、５９．０、４７．２、３２．０、３１．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２．７、１４１；ＴＯＦ−ＭＳ（ＰＯＳ）ＭＦ、Ｃ８１Ｈ１３５ＮＯ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２５７、実験値１２５７
【０１２９】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ２
1H−ＮＭＲ（４００ δ: ６．５４（２Ｈ、ｓ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、J＝１２．１Ｈｚ）、５０３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１ Ｈｚ）、２．０７−２．０１（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７７（４Ｈ、ｍ）、１．７６−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、
０．８９−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ、１７５．４、１５３．２、１３８．３、１３０．７、１０７．１、７３．４、６９．２、６６．８、５９．９、３２．２、３２．０、３０．９、２９．８、２９．７、２９．６、２９．４、２６．１、２２．７、１９．３、１７．１、１４．１；ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６６Ｈ１２５ＮＯ５〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０３４、実験値１０３４
【０１３０】
〔SC〕−Val−Gly−Fmoc
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３ Ｈｚ）、７．５９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、６．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４ Ｈｚ）、５．４４−５．３７（１Ｈ、ｂｒ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６２（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．８ Ｈｚ）、４．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．２４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、３．９６−３．９２（８Ｈ、ｍ）、２．２１−２．１６（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７０（２Ｈ、ｍ）、１．４８−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９１（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７１．５、１６８．７、１５６．５、１５３．１、１４３．６、１４１．２、１３８．３、１３０．０、１２７．７、１２７．０、１２５．０、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、５７．１、４７．１、３２．０、３１．４、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２，８、１９．０、１７．７、１４．２、；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ８３Ｈ１３８Ｎ２Ｏ８〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１３１４、実験値１３１４
【０１３１】
〔SC〕−Val−Gly−NH2
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２ Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．６１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．１ Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．３９（２Ｈ、ｓ）、２．２４−２．１８（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４４（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、０．９０−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨＺ）δ：１７２．６、１７１．８、１５３．１、１３０．３、１２５．５、１０６．９、７３．４、６９．２、６７．２、５６．６、４４．８、３２．０、３１．３、３０．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ６８Ｈ１２８Ｎ２Ｏ６〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１０９１、実験値１０９１
【０１３２】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−Fmoc
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ）δ：７．７５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７ Ｈｚ）、７．５３−７．４９（２Ｈ、ｍ）、７．３９（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．３、２２ Ｈｚ）、７．３０−７．２７（４Ｈ、ｍ）、７．２５−７．２１（１Ｈ、ｍ）、７．２０−７．１５（２Ｈ、ｂｒ）、６．７６−６．６９（１Ｈ、ｂｒ）、６．６０−６．５５（１Ｈ、ｂｒ）、６．５０（２Ｈ、ｓ）、５．４０−５．３４（１Ｈ、ｂｒ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１ Ｈｚ）、４．５６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．４６−４．３０（２Ｈ、ｍ）、４．１７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０ Ｈｚ）、４．１０−４．０３（１Ｈ、ｍ）、３．９２（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６ Ｈｚ）、３．８３−３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．１８−３．１１（１Ｈ、ｍ）、３．１０−３．０２（１Ｈ、ｍ）、２．２０−２．１３（１Ｈ、ｍ）、１，７９−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１，４８−１，４１（６Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒｍ）、０．９１−０．８５（１５Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７１．５、１７１．３、１６８．３、１５６．０、１５３，１、１４３．６、１４１．２、１３８．２、１３６．２、１３０．１、１２９．１、１２８．８、１２７．７、１２７．１、１２７．０、１２５．０、１２４．９、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、６７．１、５７．３、４７．２、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．０、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ９２Ｈ１４７Ｎ３Ｏ９〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１４６１、実験値１４６１
【０１３３】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−NH2
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ）δ：７．９９−７．９３（１Ｈ、ｍ）、７．３５−７．３０（２Ｈ、ｍ）、７．２７−７．２１（３Ｈ、ｍ）、６．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８ Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．５８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８ Ｈｚ）、４．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、minor）、４．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９ Ｈｚ、major）、３．９８−３．９１（７Ｈ、ｍ）、３．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０ Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、３，９ Ｈｚ）、２．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、１０．０ Ｈｚ）、２，２４−２．１５（１Ｈ、ｍ）、１．８２−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．３９（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８ Ｈｚ）、０．９０−０．８５（１２Ｈ、ｍ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ）δ：１７５．２、１７１．５、１６８．９、１５３．１、１５１．４、１３７．７、１２９．２、１２８．８、１２６．９、１２５．５、１０７．０、７３．５、６９．２、６７．５、５７．２、５６．５、４３．４、４０．９、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．７、１４．２；ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ７７Ｈ１３７Ｎ３Ｏ７〔Ｍ＋Ｎａ〕＋に対する計算値１２３９、実験値１２３９
【０１３４】
実施例２
〔SC〕−バリン−フェニルアラニン−Fmoc（〔SC〕―Val―Phe―Fmoc）の液相合成
Fmoc−Phe ６３ｍｇ、HOBt ６３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Phe／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３５】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Phe−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３６】
実施例３
〔SC〕−バリン−プロリン−Fmoc（〔SC〕―Val―Pro―Fmoc）の液相合成
Fmoc−Pro５３ｍｇ、HOBt ５７ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF２ｍＬに溶解し、150分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Pro−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後、実施例１の１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（２ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３７】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Pro−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１３８】
実施例4
液体担体−バリン−アラニン−Fmoc（〔SC〕−Ｖａｌ−Ａｌａ−Fmoc）の液相合成
Fmoc−Ala ５０ｍｇ、HOBt５３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ２／シクロヘキサン溶液（2 ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。
【０１３９】
最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Ala−Fmoc）を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、液体担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【０１４０】
【発明の効果】
従来の固相反応ペプチド合成装置では、固相にアミノ酸結合基が存在するためアミノ酸との反応性が悪く、反応する量の１００倍といった大過剰量のアミノ酸を反応系に供給しなければならないという問題があった。これに対して本発明の液相ペプチド合成装置では、合成反応が相溶状態の均一溶液系で進行するため、反応効率が極めて高く、担体に結合したペプチド末端に対して、外部から添加して反応させるためのアミノ酸分子の量は過剰量必要としない。同様に液相のため反応も早く、固相合成とは比較にならない短時間で合成が進む。
【０１４１】
また本装置では、合成途中のペプチドの活性化された末端での未反応がきわめて少ないので、未反応が原因の誤結合による所望ペプチド以外の不純物ペプチドの発生が少ない。よって、従来必須であったクロマトグラフィ等による精製工程が省略可能であるし、限界とされているペプチドの結合数（残基数）５０程度以上のペプチドの実用的な合成が可能となる。
【０１４２】
さらにまた、固相ペプチド合成では困難であった目的の反応が進行チェックも、溶媒を染料等で着色するなどで可能である。本装置のスケールアップも通常の液相プロセス装置と同様に容易であるので、望まれていたペプチドの安価な量産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】固相ペプチド合成のフロー説明図（その１）
【図２】固相ペプチド合成のフロー説明図（その２）
【図３】温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の実験例：下層の第二の溶媒に染色剤を混合したものの写真
【図４】液体担体１にＲ１残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図５】液体担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのFｍocを除去活性化し、Ｒ２残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図６】液体担体１とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのFｍocを除去活性化し、Ｒ３残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図７】本案の液相ペプチド合成装置の第一例
【図８】液体導電率センサーヘッド
【図９】本案の液相ペプチド合成装置の第二例（温度制御手段６は省略した）
【図１０】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その１）
【図１１】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その２）
【図１２】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その３）
【図１３】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その４）
【図１４】本案装置によるペプチド合成工程の説明図（その５）
【図１５】本案の液相ペプチド合成装置の第三例：分離槽１７を設けた例
【図１６】本案の液相ペプチド合成装置の第四例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図１７】合成層でのペプチド結合反応の前後の条件から排除量を推定する原理の説明図
【図１８】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その１）
【図１９】第一の溶媒と第二の溶媒の構成と相溶化温度の変化の説明図（その２）
【図２０】本案の液相ペプチド合成装置を用いた液相ペプチド合成の実施例の説明図
【図２１】本案の液相ペプチド合成装置の第三例補足説明図
【図２２】本案の液相ペプチド合成装置の第五例：連続化装置（１６，１８は省略した）
【図２３】溶液供給量の制御の説明図
【符号の説明】
１ 液体担体の例
１ａ 液体担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質
１ａｆ １ａのＲ１残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
１ｂ 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質
１ｂｆ １ｂのＲ２残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
１ｃ 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸の結合物質
１ｃｆ １ｃのＲ３残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocが結合した物質
２ 液体担体とアミノ酸の結合物質における液相担体の部分
３ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とを混合する混合槽
４ 第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液B１２の準備槽
５ 第二溶媒溶液B１２を混合槽３に供給する手段
５ａ ５の一部で、第二溶媒溶液の移送流路（配管）
５ｂ ５の一部で、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプなど
６ 合成槽３の温度制御手段
６ａ 第一・第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御（加熱）中である温度制御手段
６ｂ 第一・第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御（冷却）中である温度制御手段
７ 第二溶媒溶液の量を２０より得られる界面位置から判定して混合槽３から排除する手段
７ａ ７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなど
８ 液相担体にＲ１残基アミノ酸のN末端に保護基Fｍocを結合したＲ１残基アミノ酸を結合する反応
９ 固相担体（レジンなどの樹脂）
１０ N末端の保護基であるFｍoc等を除去して活性化する操作
１０ａ １０の操作（工程）をなす反応槽・反応装置である末端活性化手段
１１ 活性化されたN末端部分に１２をペプチド結合反応させる操作
１２ N末端に保護基Fｍocなどを結合した結合前処理後のアミノ酸
１６ 混合槽内で相溶状態となった第一・第二溶媒溶液の移送手段
１６ａ １６の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１７ 第一・第二溶媒溶液を相分離状態とする分離槽
１８ 第二溶媒溶液の量を判定して分離槽１７から排除する手段
１８ａ １８の一部で、流路開閉手段（バルブ等）または移送ポンプなど
１９ 混合槽の反応を推定する手段
２０ 第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段
２０ａ 合成槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）
２０ｂ ２０ａのセンサーヘッドの例で、２０ａの先端に配設された電気特性測定電極
２０ｃ ２０ａの内部電気配線
２０ｅ 光（放射エネルギー）発生器
２０ｆ 光（放射エネルギー）受信器
３０ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率を決定する手段
３１ 第一溶媒溶液と第二溶媒溶液の量と比率の制御手段
３２ 第一の溶媒、あるいは第二の溶媒を付加追加する量の制御手段（流量制御装置）
３３ B１２の供給量の制御手段（流量制御装置）
３４ Ａ１xの供給量の制御手段（流量制御装置）
３５ B１２、Ａ１xの成分（溶媒A、溶媒Bの構成成分、１２、１ｘのアミノ酸系物質成分）情報
Ａ 第一の溶媒
Ａ0 任意物質を溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ 液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１a 液体担体とＲ１残基アミノ酸との結合物質（1ａ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１af 1ａに保護基を結合した物質（1ａｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１b 液体担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸との結合物質（1ｂ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１bf 1ｂに保護基を結合した物質（1ｂｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１c 液体担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖の結合物質（1ｃ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１cf 1ｃに保護基を結合した物質（1ｃｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１x 液体担体と任意アミノ酸系物質との結合物質（1x）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１xf 1xに保護基を結合した物質（1xｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａtank 第一の溶媒の準備槽
Ｂ 第二の溶媒
Ｂ0 任意物質を溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２ １２を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
Ｂtank 第二の溶媒の準備槽
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 図面上の記載であってＲ１、Ｒ２、Ｒ３と同じ
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 合成すべきペプチド鎖を構成するアミノ酸残基
Claims (15)
- 温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせ、および第一の溶媒に対し可溶性であり第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体担体を用いて、該液体担体に合成すべきペプチドのアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成装置であって、液体担体と第一の溶媒を供給する手段、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液を供給する手段に連結され、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液と供給された第二溶媒溶液とを混合する混合槽と、前記混合槽の温度を混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度または混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御する混合槽の温度制御手段と、前記混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段と、前記第二溶媒溶液の量に基づいて混合槽から第二溶媒溶液を排除する手段とを有することを特徴とした液相ペプチド合成装置
- 混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽において、相分離状態の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する手段を具備し、該手段によって得られる界面位置に基づいて混合槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである、請求項１の液相ペプチド合成装置
- 混合槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽の第一溶媒溶液の量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する推定手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、混合槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである、請求項１の液相ペプチド合成装置
- 第二溶媒溶液を供給する手段の供給量が、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて決定される請求項１の液相ペプチド合成装置
- 混合槽の温度制御手段が、混合槽の第一溶媒溶液の量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて温度を制御するものである、請求項１の液相ペプチド合成装置
- 第一溶媒溶液の溶液成分が、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分が、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である、請求項３から請求項５に記載された液相ペプチド合成装置
- 温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせ、および第一の溶媒に対し可溶性であり第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体担体を用いて、該液体担体に合成すべきペプチドのアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成装置であって、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液を供給する手段、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液を供給する手段に連結され、供給された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液を混合し、かつ、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度に制御された混合槽と、前記混合槽内の第一溶媒溶液と第二溶媒溶液を移送する手段を介して該混合槽と連結され、移送された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御された分離槽と、前記分離槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段と、前記第二溶媒溶液の量に基づいて分離槽から第二溶媒溶液を排除する手段とを有することを特徴とした液相ペプチド合成装置
- 分離槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、分離槽において、相分離状態の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する手段を具備し、該手段によって得られる界面位置に基づいて分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである、請求項７の液相ペプチド合成装置
- 分離槽の第二溶媒溶液の量を判定する手段が、混合槽に供給される第一溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、
混合槽の温度に基づいて、混合層の反応を推定する手段を有し、該推定手段による反応の推定に基づいて、分離槽の第二溶媒溶液の量を判定するものである、請求項７の液相ペプチド合成装置 - 第一溶媒溶液を供給する手段の供給量、および第二溶媒溶液を供給する手段の供給量が、第一溶媒溶液の溶液成分、および第二溶媒溶液の溶液成分に基づいて決定される請求項７の液相ペプチド合成装置
- 混合槽または分離槽の制御温度が、混合槽に供給される第一溶媒溶液の供給量および該溶液成分と、混合槽に供給される第二溶媒溶液の供給量および該溶液成分に基づいて決定される請求項７の液相ペプチド合成装置
- 第一溶媒溶液の溶液成分が、第一の溶媒を構成する溶媒の化学成分、および第一の溶媒に溶解された液体担体とアミノ酸系物質のそれぞれ化合物成分であり、第二溶媒溶液の溶液成分が、第二の溶媒を構成する溶媒の化合物成分、および第二の溶媒に溶解された結合前処理後のアミノ酸の化合物成分である、請求項９から請求項１１に記載された液相ペプチド合成装置
- 混合槽に供給される第一溶媒溶液が、分離槽で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液であって、混合槽に第一溶媒溶液を供給する手段が、分離槽の残留第一溶媒溶液を混合槽に移送する移送手段である、請求項７の液相ペプチド合成装置
- 混合槽と、該混合槽と連結された分離槽とからなる、複数組の混合槽・分離槽の組み合わせを有し、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に供給される第一溶媒溶液が、他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽で第二溶媒溶液を排除された後に残留した第一溶媒溶液であって、ひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に第一溶媒溶液を供給する手段が、他の混合槽・分離槽組み合わせの分離槽の残留第一溶媒溶液をひとつの混合槽・分離槽組み合わせの混合槽に移送する移送手段である、請求項７の液相ペプチド合成装置
- アミノ酸が、アミノ酸残基に任意化合物が結合したアミノ酸誘導物質を含むものであり、アミノ酸系物質が、単一のアミノ酸あるいはペプチドであり、結合前処理が、合成すべきペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基側末端を不活性化、カルボキシル基側末端を活性化する処理である、請求項１から請求項１４に記載された液相ペプチド合成装置
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