JP4044143B2 - ズブチラーゼ変異体及び組成物 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、洗剤組成物を配合することにおいて、及び洗剤において改良された洗浄性能を示すことにおいて有用な新規変異体プロテアーゼ酵素又は酵素変異体；前記酵素を含む洗浄及び洗剤組成物；適切な宿主細胞又は生物中に挿入される場合、前記酵素の発現をコードする突然変異誘発された遺伝子；並びにそれにより形質転換され、そして前記酵素変異体を発現することができる宿主細胞に関する。
発明の背景
洗剤産業においては、酵素は、30年以上もの間、洗浄配合物に付与されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び他の酵素、又はそれらの混合物を包含する。商業的に最とも重要な酵素はプロテアーゼである。
多数の商業的に使用されるプロテアーゼは、天然に存在する野生型プロテアーゼのタンパク質操作された変異体、たとえばDURAZYM^▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, RELASE^▲Ｒ▼（Novo Nordisk A/S）, MAXAPEM^▲Ｒ▼（Gist-Brocades N.V.）, PURAFECT^▲Ｒ▼（Genencor International, Inc.）である。
さらに、多くのプロテアーゼ変異体が次のような文献において記載されている：EP 130756（GENENTECH）（アメリカ再発行特許第34,606号（GENENCOR）に対応する）；EP 214435（HENKEL）; WO 87／04461（AMGEN）；WO 87／05050（GENEX）；EP 260105（GENENCOR）；Thomas, Russell, and Fersht（1985）Nature 318: 375-376; Thomas, Russell, and Fersht（1987）J.Mol.Biol. 193: 803-813; Russel and Fersht, Nature 328: 496-500（1987）; WO 88／08028（Genex）; WO 88／08033（Amgen）; WO 95／27049（SOLVAY S.A.）; WO 95／30011（PROCTER & GAMBLE COMPANY）; WO 95／30010（PROCTER & GAMBLE COMPANY）; WO 95／29979（PROCTER & GAMBLE COMPANY）; アメリカ特許第5,543,302号（SOLVAY S.A.）; EP 251446（GENENCOR）; WO 89／06279（NOVO NORDISK A/S）; WO 91／00345（NOVO NORDISK A/S）; EP 525 610 A1（SOLVAY）;及びWO 94／02618（GIST-BROCADES N.V.）。
しかしながら、多くの有用なプロテアーゼ変異体が記載されて来たにもかかわらず、多くの産業使用のための新規の改良されたプロテアーゼ変異体の必要性がまだ存在する。
従って、本発明の目的は、特に洗剤産業への使用のための、改良されたタンパク操作されたプロテアーゼ変異体を提供することである。
発明の要約
最近、改良された洗浄性能を有するズブチラーゼ変異体が、親ズブチラーゼの疎水性ドメインに又はその付近に位置する１又は複数のアミノ酸残基を、元の残基よりもより疎水性のアミノ酸残基により置換することによって得られることが同定されており、ここで前記疎水性ドメインは、BLS309の残基I165, Y167, Y171に対応する残基を含んで成り、そしてその付近の前記残基はBLS309の残基E136, G159, S164, R170, A194及びG195に対応する残基を含んで成る（WO 96／34946）。
この情報に基づいて、本発明者は、SAVINASE^▲Ｒ▼のY167及びR170の多くの可能な組合せを集中的に研究しており、そして驚くほどに高められた改良された洗浄性能を有する多くの変異体を同定した。
さらなる詳細のためには、本明細書における実施例を参照のこと（下記を参照のこと）。
従って、本発明は、その第１の観点においては、位置167及び170の両方に修飾を含んで成る、洗剤における改良された洗浄性能を有するズブチラーゼプロテアーゼ変異体に関する。
第２の観点においては、本発明は、下記（BASBPN番号付けにおける）から成る群から選択された少なくとも１つの修飾を含んで成る、洗剤における改良された洗浄性能を有するズブチラーゼ酵素変異体に関する：
167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋170｛Ｑ、又はＮ｝
167P
167P＋170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋170｛Ｑ、又はＮ｝
167P＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋170｛Ｅ、又はＤ｝
167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋170｛Ｒ，Ｋ、又はＨ｝
167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
170H
167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝。
上記命名法、たとえば“167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝”変異体は、マトリックス命名法であり、ここで用語“167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝”は次の変異体を包含する：
167G＋170G，167G＋170A，167G＋170S，167G＋170T，
167A＋170G，167A＋170A，167A＋170S，167A＋170T，
167S＋170G，167S＋170A，167S＋170S，167S＋170T，
167T＋170G，167T＋170A，167T＋170S、又は167T＋170T。
本明細書におけるズブチラーゼ変異体の命名法に関するさらなる詳細のためには、本明細書における“定義”の項を参照のこと（下記を参照のこと）。
第３の観点において、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列に関する。
第４の観点において、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列を含んで成る発現ベクターに関する。
第５の観点において、本発明は、第４の観点の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞に関する。
さらなる観点において、本発明は、第４の観点の発現ベクターを適切な微生物宿主中に挿入し、所望のズブチラーゼ酵素を発現するために前記宿主を培養し、そして前記酵素生成物を回収することによる、本発明のズブチリシン酵素の製造に関する。
さらに、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体を含んで成る組成物に関する。
最後に、本発明は、多くの産業関連使用、特に洗浄組成物及び変異体酵素を含んで成る洗浄組成物、特に変異体ズブチリシン酵素を含んで成る洗剤組成物への使用のためへの変異体酵素の使用に関する。
定 義
本発明をさらに詳細に論じる前、次の用語がまず定義されるであろう。
アミノ酸の命名法
Ａ＝Aｌa＝アラニン
Ｖ＝Val＝バリン
Ｌ＝Leu＝ロイシン
Ｉ＝Ile＝イソロイシン
Ｐ＝Pro＝プロリン
Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン
Ｗ＝Trp＝トリプトファン
Ｍ＝Met＝メチオニン
Ｇ＝Gly＝グリシン
Ｓ＝Ser＝セリン
Ｔ＝Thr＝トレオニン
Ｃ＝Cys＝システイン
Ｙ＝Tyr＝チロシン
Ｎ＝Asn＝アスパラギン
Ｑ＝Gln＝グルタミン
Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸
Ｅ＝Glu＝グルタミン酸
Ｋ＝Lys＝リジン
Ｒ＝Arg＝アルギニン
Ｈ＝His＝ヒスチジン
Ｘ＝Xaa＝いづれかのアミノ酸
核酸の命名法
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン（DNAにおいてのみ）
Ｕ＝ウラシル（RNAにおいてのみ）
変異体の命名法
本発明に従って製造され、又は設計される種々の酵素変異体を説明する場合、次の命名法が参照の容易さのために適応されて来た：
元のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸。
これによれば、位置195におけるグルタミン酸によるグリシンの置換は次のように示される：
Gly195Glu又はG195E；
同じ位置でのグリシンの欠失は次の通りであり：
Gly195^*又はG195^*；そして
追加のアミノ酸残基、たとえばリジンの挿入は次の通りである：
Gly195GlyLys又はG195GK。
番号付けのために使用される配列との比較における欠失が示される場合、位置36におけるアスパラギン酸の挿入に関して、そのような位置における挿入は次のように示される：
^*36Asp又は^*36D。
複数の突然変異は、次のように＋により分離され：
Arg170Tyr＋Gly195Glu又はR170Y＋G195E、
ここでそれらは、それぞれチロシン及びグルタミン酸によりアルギニン及びグリシンを置換する、位置170及び195における突然変異を示す。
元のアミノ酸がいづれのアミノ酸でもよい場合、位置及び置換されるアミノ酸のみが、たとえば170Serとして言及される。
この命名法は、相同ズブチラーゼにおいて本発明に従っての修飾に特に関連して適切である（下記を参照のこと）。従って、170Serは、たとえばBASBPNにおけるLys170Ser修飾及びBLSSAVIにおけるArg170Ser修飾の両者を包含する。前記例に関しては、図１を参照のこと。
置換されるアミノ酸がいづれのアミノ酸でもよい場合、元のアミノ酸及び位置のみが、たとえばArg170として言及される。
元のアミノ酸及び置換されるアミノ酸の両者がいづれのアミノ酸でもよい場合、その位置は、たとえば170として言及される。
元のアミノ酸及び／又は置換されるアミノ酸が１個以上であるがすべてではないアミノ酸である場合、選択されるアミノ酸は、“｛｝”により囲まれ、たとえば
Arg170｛Gｌy，Ala，Ser、又はThr｝は、変異体：Arg170Gly，Arg170Ala，Arg170Ser、又はArg170Thrを包含し；又はたとえばTyr167｛Gly，Ala，Ser、又はThr｝＋Arg170｛Gly，Ala，Ser、又はThr｝は、下記変異体を包含する：
Tyr167Gly＋Arg170Gly，Tyr167Gly＋Arg170Ala，Tyr167Gly＋Arg170Ser，Tyr167Gly＋Arg170Thr，Tyr167Ala＋Arg170Gly，Tyr167Ala＋Arg170Ala，Tyr167Ala＋Arg170Ser，Tyr167Ala＋Arg170Thr，Tyr167Ser＋Arg170Gly，Tyr167Ser＋Arg170Ala，Tyr167Ser＋Arg170Ser，Tyr167Ser＋Arg170Thr，Tyr167Thr＋Arg170Gly，Tyr167Thr＋Arg170Ala，Tyr167Thr＋Arg170Ser、又はTyr167Thr＋Arg170Thr。
この命名法は、本発明の好ましいズブチラーゼ変異体の保存性アミノ酸修飾に関して特に適切である。
たとえば、好ましい変異体Tyr167Ala＋Arg170Serの保存性アミノ酸修飾は、小さなアミノ酸をもう１つの小さなアミノ酸に置換する、Tyr167｛Gly，Ala，Ser、又はThr｝＋Arg170｛Gly，Ala，Ser、又はThr｝である。さらなる詳細については、“発明の詳細な記載”の項を参照のこと。
プロテアーゼ
タンパク質基質中のアミド架橋を切断する酵素は、プロテアーゼ又は（交換可能的には）ペプチダーゼとして分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H.Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3を参照のこと）。
アミノ酸位置／残基の番号付け
特にことわらない限り、本明細書において使用されるアミノ酸番号付けは、ズブチラーゼBPN′（BASBPN）配列の番号付けに対応する。BPN′配列のさらなる説明に関しては、Siezenなど．，Protein Engng. 4（1991）719-737及び図１を参照のこと。
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位に必須セリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973“Principles of Biochemistry,”Fifth Editigon, McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272）。
細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトンの分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それら単純な末端エステルを加水分解し、そして活性において、やはりセリンプロテアーゼである真核キモトリプシンに類似している。サブグループを包含する一層狭い用語、アルカリプロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの高い最適pH9.0〜11.0を反映している（総説とは、Priest（1977）Bacteriological Rev. 41: 711-753を参照のこと）。
ズブチラーゼ
セリンプロテアーゼのサブグループ、すなわち仮りに命名されたズブチラーゼは、Siezenなど., Protein Engng. 4（1991）719-737により提案されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼとして前に言及されたセリンプロテアーゼの40以上のアミノ酸配列の相同性分析により定義される。ズブチリシンは、グラム−陽性細菌又は真菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまで定義されており、そしてSiezenなどによれば、現在、ズブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のサブチラーゼが同定されており、そして多くのズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。そのようなズブチラーゼ及びそれらのアミノ酸配列のより詳細な記載に関しては、Siezenなど．及び本明細書における図１を参照のこと。
ズブチラーゼの１つのサブグループ、I-S1は、“従来の”ズブチリシン、たとえばズブチリジン168、ズブチリシンBPN′、ズブチリシンCarlsberg（ALCALASE^▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、及びズブチリシンDYを包含する。
ズブチラーゼI-S2の追加のサブグループは、Siezenなど．（前記）により認識されている。サブグループI-S2プロテアーゼは、より高いアルカリズブチリシンとして記載されており、そして酵素、たとえばズブチリシンPB92（MAXACAL^▲Ｒ▼, Gist-Brocades NV）、ズブチリシン309（SAVINASE^▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、ズブチリシン147（ESPERASE^▲Ｒ▼, NOVO NORDISK A/S）、及びアルカリエラスターゼYaBを包含する。
“SAVINASE ^▲Ｒ▼ ”
SAVINASE^▲Ｒ▼は、NOVO NORDISK A/Sにより市販されている。それは、B.Lentusからのズブチリシン309であり、そしてN87Sを有することにおいてのみ、BABP92と異なる（図１を参照のこと）。
親ズブチラーゼ
用語“親ズブチラーゼ”とは、Siezenなど．（Protein Engineering 4: 719-737（1991））に従って定義されたズブチラーゼである。さらなる詳細のためには、すぐ上記の“ズブチラーゼ”の説明を参照のこと。親ズブチラーゼはまた、天然源から単離されたズブチラーゼでもあり得、ここで続く修飾が、ズブチラーゼの特徴を保持しながら、行なわれている。他方では、用語“親ズブチラーゼ”は、“野生型ズブチラーゼ”と呼ばれ得る。
ズブチラーゼ変異体の修飾
本明細書に記載されるようなズブチラーゼ変異体の修飾に関して使用される用語“修飾”とは、化学的修飾及び遺伝子操作を包含するよう定義される。前記修飾は、注目のアミノ酸における又はそのようなアミノ酸での置換、欠失及び／又は挿入による。
ズブチラーゼ変異体
本発明の情況において、用語ズブチラーゼ変異体又は突然変異誘発されたズブチラーゼとは、元の遺伝子又は親遺伝子を有し、そして対応する親酵素を生成する親微生物に由来する変異体遺伝子を発現する生物により生成されたズブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は、前記突然変異誘発されたズブチラーゼプロテアーゼが、適切な宿主において発現される場合に生成される前記変異体遺伝子を生成するために突然変異誘発されている。
相同ズブチラーゼ配列
SAVINASE^▲Ｒ▼ズブチラーゼの特定のアミノ酸残基が、本発明のズブチラーゼ変異体を得るために、本明細書における修飾のために同定される。
しかしながら、本発明は、この特定のズブチラーゼの修飾に限定されず、SAVINASE^▲Ｒ▼の構造に対して相同の一次構造を有する他の親（野生型）ズブチラーゼに拡張される。
本発明の範囲内の他の相同ズブチラーゼを同定するためには、前もって整合（alignment）されたズブチラーゼの群に対する前記ズブチラーゼの整合が、前の整合を一定に維持して実施される。ズブチラーゼにおける18個の高度に保存された残基に対する比較が実施される。前記18個の高度に保存された残基は表Ｉに示される（前記保存された残基に関するさらなる詳細のためには、Siezenなど．を参照のこと）。

前記整合性を維持するために必要な挿入及び欠失を許容する整合の後、適切な相同残基が同定される。次に、前記相同残基が本発明に従って修飾され得る。
BLOSUM30タンパク質重量マトリックスを用いる、10.0のGAPオープン・ペナルティー及び0.1のGAPエクステンション・ペナルティーを有するCLUSTALW（バージョン1.5、1995年４月）コンピューター整合プログラム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J.（1994）Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680）を用いて、前もって整合されたズブチラーゼの群に対する与えられたズブチラーゼの整合が、プログラムにおけるProfile alignmentsオプションを用いて達成される。本発明の範囲内に存在する与えられたズブチラーゼのためには、好ましくは、18個の高度に保存された残基の100％が保存されるべきである。しかしながら、18個の残基のうち17個以上又は17個に等しいか、又は前記保存された残基の16個ほどの残基の整合もまた、相同残基を同定するために適切である。ズブチラーゼにおける、触媒トライアド（triad）Asp32／His64／Ser221の保存が維持されるべきである。
前に定義された整合性は図１に示されており、ここで18個の高度に保存された残基に対するこの整合における個々のズブチラーゼの％同一性もまた示されている。
さらに、本発明の範囲内の相同親（野生型）ズブチラーゼを同定するための前記工程においては、上記18個の保存された残基は、前記相同親ズブチラーゼの親（野生型）一次配列に関する。換言すれば、親ズブチラーゼが上記18個の保存された残基のいづれかにおいて修飾されている場合、元の親ズブチラーゼ及び上記18個の保存された残基のいづれかにおいて修飾される前記親ズブチラーゼの可能な変異体の両者が本発明の範囲内の相同ズブチラーゼであるか否かを決定するのは、前記18個の保存された残基における元の親（野生型）配列である。
この説明に基づけば、本発明に従って修飾され得る、適切な相同ズブチラーゼ及び対応する相同残基を当業者が同定することは、日常のことである。これを例示するために、下記表IIは、相同ズブチラーゼ及び本発明に従って修飾されるべき対応する適切な残基の限定されたリストを示す。

他の相同ズブチラーゼを包含する類似の又はより大きな表が当業者により容易に生成され得ることは、明確である。
洗浄性能
たとえば洗浄の間、清浄されるべき目的物上に存在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素の能力がしばしば、その洗浄能力、洗浄力、活剤性又は洗浄性能として言及される。この出願を通して、用語、洗浄性能とは、この性質を包含するために使用されるであろう。
単離されたDNA配列
用語“単離された”とは、DNA配列分子に適用される場合、そのDNA配列がその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って、他の異質の又は不所望のコード配列を含まず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃDNA及びゲノムクローンを包含する分子である。本発明の単離されたDNA分子は、もともと関連していた他の遺伝子を有しないが、しかし天然に存在する5′及び3′未翻訳領域、たとえばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明白であろう（たとえば、Dynan and Tijan, Nature 316：774-78, 1985を参照のこと）。用語“単離されたDNA配列”は、他方では、“クローン化されたDNA配列”と呼ばれ得る。
単離されたタンパク質
タンパク質に適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその生来の環境以外の条件下で見出されることを示す。好ましい形において、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。高度に精製された形で、すなわちSDS-PAGEにより測定される場合、40％以上の純度、60％以上の純度、80％以上の純度、より好ましくは95％以上の純度、及びさらにより好ましくは、99％以上の純度でタンパク質を提供することが好ましい。
用語“単離されたタンパク質”は、他方では、“精製されたタンパク質”とも呼ばれ得る。
相同不純物
用語“相同不純物”とは、本発明のポリペプチドがもともとそこから得られる相同細胞に起因するいづれかの不純物（たとえば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
〜から得られる
用語“〜から得られる”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、特定源により、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されるポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを意味する。
基 質
プロテアーゼのための基質に関連して使用される用語“基質”とは、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受けやすい少なくとも１つのペプチド結合で含む化合物を含んで成るものとして、その広範な形で解釈されるべきである。
生成物
プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物に関連して使用される用語“生成物”とは、ズブチラーゼプロテアーゼによる加水分解反応の生成物を包含するものとして本発明において解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応において、基質であり得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ズブチラーゼにおける18個の高度に保存された残基に整合される、多くの相同ズブチラーゼの整合性を示す。18個の高度に保存された残基は太字で強調される。JP170を除くすべての示されるズブチラーゼは、前記保存された残基において100％の同一性を有する。JP170は、保存された残基G146において、“Ｇ”の代わりに“Ｎ”を有する。
発明の詳細な記載
改良された洗浄性能を有するズブチラーゼ変異体：
本発明の多くのズブチラーゼ変異体が本発明において試験され、そして洗剤における改良された洗浄−性能を示す（本明細書における実施例を参照のこと（下記参照のこと））。
従って、本発明の態様は、本発明の第２の観点のズブチラーゼ酵素変異体に関し、ここで修飾は下記から成る群から選択される（BASBPN番号付けにおける）：
167A＋170S,
167A＋170L,
167A＋170N
167P
167P＋170L
167V＋170T
167I＋170T
167V＋170Q
167S＋170Q
167T＋170N
167A＋170A
167T＋170L
167T＋170A
167P＋170S
167I＋170L
167F＋170T
167F＋170E
167F＋170H
167F＋170T
167F＋170L
167L
170H
167S。
本発明者は、その親（野生型）一次配列において、元の野生型アミノ酸としてY167及びR170を含んで成る、BLS309（SAVINASE^▲Ｒ▼）における改良された洗浄性能変異体を同定した（図１を参照のこと）。
従って、本発明のさらなる態様は、本発明の第２観点のズブチラーゼ酵素変異体に関し、ここで修飾は下記から成る群から選択され（BASBPN番号付けにおける）：
Y167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋R170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
Y167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋R170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
Y167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝＋R170｛Ｑ、又はＮ｝
Y167P
Y167P＋R170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
Y167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋R170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
Y167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋R170｛Ｑ、又はＮ｝
Y167P＋R170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
Y167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝＋R170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
Y167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋R170｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝
Y167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋R170｛Ｅ、又はＤ｝
Y167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋R170｛Ｒ，Ｋ、又はＨ｝
Y167｛Ｆ，Ｗ又はＹ｝＋R170｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
Y167｛Ｌ，Ｉ、又はＶ｝
R170H
Y167｛Ｇ，Ａ，Ｓ、又はＴ｝；
あるいはより好ましくは、上記態様のズブチラーゼ酵素変異体に関し、ここで修飾は下記から成る群から選択される（BASBPN番号付けにおける）：
Y167A＋R170S
Y167A＋R170L
Y167A＋R170N
Y167P
Y167P＋R170L
Y167V＋R170T
Y167I＋R170T
Y167V＋R170Q
Y167S＋R170Q
Y167T＋R170N
Y167A＋R170A
Y167T
Y167T＋R170A
Y167P＋R170S
Y167I＋R170L
Y167F＋R170T
Y167F＋R170E
Y167F＋R170H
Y167F＋R170T
Y167F＋R170L
Y167L
R170H
Y167S。
類似する保存性アミノ酸への１つのアミノ酸の置換が、酵素の特徴においてマイナーな変化を付与するに過ぎないことは、当業界において良く知られている。
下記表IIIは、保存性アミノ酸の群を列挙する。

従って、ズブチラーゼ変異体、たとえば167A＋170S，167G＋170S，167S＋170S、及び167T＋170Sは、類似する洗浄−性能改良性を有するであろう。
さらに、ズブチラーゼ変異体、たとえばY167G＋R170S, Y167S＋R170S及びY167T＋R170Sは、変異体Y167A＋R170Sと類似する洗浄−性能を有するであろう。たとえば、前記Y167A＋R170S変異体の特定の洗浄性能試験のためには、本明細書における実施例を参照のこと。
前記開示物及び特に、本明細書における種々の例示されるズブチラーゼ変異体に基づいて、本発明のズブチラーゼ変異体のすべての観点及び態様に従って、改良された洗浄−性能を有するズブチラーゼ変異体を得るために、特に前記例示された変異体のさらなる適切な保存性修飾を当業者が同定することは、日常の仕事である。
本発明の態様において、興味あるズブチラーゼは、サブグループI-S1及びI-S2に属するものである。
サブグループI-S1に関しては、好ましい親ズブチラーゼは、ABSS168, BASBPN, BSSDY、及びBLSCAR、又はサブグループI-S1の特徴を保持するそれらの機能的変異体を含んで成る群から選択される。
サブグループI-S2に関しては、好ましい親ズブチラーゼは、BLS147, BLS309, BAPB92, TVTHER及びBYSYAB、又はサブグループI-S2の特徴を保持するそれらの機能的変異体から成る群から選択される。
特に前記親ズブチラーゼは、BLS309（SAVINASE^▲Ｒ▼NOVO NORDISK A/S）である。
本発明はまた、親酵素のアミノ酸配列に対するいづれか他の修飾と組合して、上記で言及された位置におけるいづれか１又は複数の修飾を含んで成る。特に、酵素に改良された性質を付与することが当業界において知られている他の修飾との組合せが考えられる。従来技術は、種々の改良された性質を有する多くのズブチラーゼ変異体を記載し、そしてそれらの多くは、本明細書における“発明の背景”のセクションに言及されている（上記参照のこと）。それらの文献は、本発明のズブチラーゼ変異体と都合良く組合され得るズブチラーゼ変異体を同定するための参照として本明細書に開示される。
そのような組合せは、位置：222（酸化安定性を改良する）、218（熱安定性を改良する）、酵素を安定にするCa−結合部位、たとえば位置76における置換、及び従来技術から明らかな多くの他のものを含んで成る。
さらなる態様においては、本発明のズブチラーゼ変異体は、下記位置のいづれかにおける１又は複数の修飾と都合良く組合され得る：27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
特に次のBLS309及びBAPB92変異体が、組合せのために適切であると思われる：K27R, ^*36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L及びT274A。
さらに、上記で言及されたいづれか１又は複数の修飾と組合せて、変異体S101G＋V104N, S87N＋S101G＋V104N, K27R＋V104Y＋N123S＋T274A、又はN76D＋V104A、あるいはそれらの突然変異の他の組合せ（V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A）のいづれかから成る変異体が改良された性質を示す。
本発明の主要観点のさらなるズブチラーゼ変異体は、好ましくは、位置129, 131, 133及び194のいづれかにおける１又は複数の修飾、好ましくは129K, 131H, 133P, 133D及び194P修飾、そして最とも好ましくは、P129K, P131H, A133P, A133D及びA194P修飾と組合される。それらの修飾のいづれかが、本発明のズブチラーゼ変異体のより高い発現レベルを提供する。より一層の詳細のためには、本明細書における実施例を参照のこと（下記参照のこと）。
従って、本発明のさらなる態様は、本発明の変異体に関し、ここで前記修飾は、下記から成る群から選択される：
Y167A＋R170S＋A194P
Y167A＋R170L＋A194P
Y167A＋R170N＋A194P
Y167A＋R170S＋P129K
Y167A＋R170L＋P129K
Y167A＋R170N＋P129K
Y167A＋R170S＋P131H
Y167A＋R170L＋P131H
Y167A＋R170N＋P131H
Y167A＋R170S＋A133P
Y167A＋R170L＋A133P
Y167A＋R170N＋A133P
Y167A＋R170S＋A133D
Y167A＋R170L＋A133D
Y167A＋R170N＋A133D。
ズブチラーゼ遺伝子における突然変異の生成
本発明のズブチラーゼのクローニング、及び遺伝子（たとえばズブチラーゼ遺伝子）中への突然変異の導入のための多くの方法は、当業界において良く知られている。
一般的に、遺伝子のクローニング、及び前記遺伝子中への突然変異（ランダム及び／又は特定部位）の導入のための標的の方法が、本発明のズブチラーゼ変異体を得るために使用され得る。適切な技法のさらなる記載のためには、本明細書における実施例（下記参照のこと）、並びに（Sambrookなど．（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. など．（eds.）“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. （eds.）“Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990）; 及びWO 96/34946号を参照のこと。
発現ベクター
本発明の酵素をコードするDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得るいづれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、一部で、又はその全体で宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
ベクターは好ましくは、本発明の酵素をコードするDNA配列が、DNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターはプラスミドもしくはウイルスDNAに由来し、又は両要素を含むことができる。用語、“作用可能に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的に関係して機能するよう配列されることを示し、たとえば転写はプロモーターで開始し、そして酵素をコードするDNA配列を通して進行する。
プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種であるかいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
細菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、バシルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトース生成アミラーゼ遺伝子、バシルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子、バシルス・アミロリケニファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子、バシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）アルカリ プロテアーゼ遺伝子、又はバシルス・プミラス（Bacillus pumilus）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはファージλＰ_R又はＰ_Lプロモーター、あるいはＥ．コリlac, trp又はtacプロモーターを包含する。
本発明の酵素をコードするDNA配列はまた、必要なら、適切なターミネーターに作用可能に連結され得る。
本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含むことができる。
ベクターはまた、選択マーカー、たとえばその生成物が宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、又は抗生物質、たとえばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン又は同様のものに対する耐性、又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むことができる。
本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に方向づけするためには、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列に正しく読取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は通常、酵素をコードするDNA配列の５′側に位置する。分泌シグナル配列は、酵素と通常会合される配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであり得る。
それぞれ、本発明の酵素、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をコードするDNA配列を連結し、又は適切なPCR増幅スキムによりそれらの配列をアセンブルし、そして複製又は組込みのために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者（たとえば、Sambrookなど．，前記）に良く知られている。
宿主細胞
宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA配列は、問題の宿主に対して同種性（homologous）か又は異種（heterologous）のいづれかであり得る。宿主細胞に対して同種性である場合、すなわち宿主細胞により自然に生成される場合、それは典型的には、もう１つのプロモーター配列に、又は適用できるなら、その天然の環境においてではなく他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作用可能に連結されるであろう。用語“同種性”とは、問題の宿主生物にとって生来の酵素をコードするDNA配列の包含を意図する。用語“異種性”とは、天然において宿主細胞により発現されないDNA配列の包含を意図する。従って、前記DNA配列は、他の生物からであり得、又はそれは合成配列であり得る。
本発明のDNA構造体又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を生成することができるいづれかの細胞であり、そして細菌、酵母、真菌類及び高等真核細胞を包含する。
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる細菌宿主細胞の例は、グラム−陽性細菌、たとえばバシルスの株、たとえば、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケニファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．メガセリウムもしくはＢ．スリンギエンシス、又はストレプトミセス（Streptomyces）の株、たとえばＳ．リビダンス（S. lividans）又はＳ．ムリナス（S. murinus）、あるいはグラム−陰性細菌、たとえばＥ．コリ（E. coli）である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによりもたらされ得る（Sambrookなど．，前記を参照のこと）。
細菌、たとえばＥ．コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は細胞質に、典型的には不溶性顆粒（封入体としても知られている）として保持され得、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞が溶解され、そして顆粒が回収され、そして変性され、その後、酵素が変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、酵素が、ペリプラズム空間の内容物を放出するために、たとえば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊し、そして酵素を回収することによって、ペリプラズム空間から回収され得る。
グラム陽性細菌、たとえばバシルス又はストレプトミセス株において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持され得、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられ得る。後者の場合、酵素は下記のようにして培地から回収され得る。
ズブチラーゼの製造方法
本発明は、本発明に従って、単離された酵素を製造するための方法を提供し、ここで酵素をコードするDNA配列により形質転換された適切な宿主細胞が酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そしてその得られる酵素が培養物から回収される。
酵素をコードするDNA配列を含んで成る発現ベクターが異種宿主細胞を形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換え体生成を可能にすることができる。
それにより、相同不純物を有さないことを特徴とする高度に精製されたズブチラーゼ組成物を製造することが可能である。
この場合、相同不純物とは、本発明の酵素が始め得られる同種性細胞に起因するいづれかの不純物（たとえば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適切ないづれかの従来の培地であり得る。発現されたズブチラーゼは便利には、培養培地中に分泌され得、そしてそれから、培養培地から細胞を遠心分離又は濾過により分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質成分を沈殿せしめ、続いて、クロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法を用いることを包含する良く知られた方法により回収され得る。
本発明のズブチラーゼ変異体の使用
本発明のズブチラーゼプロテアーゼ変異体は、多くの産業用途のために、特に洗剤産業内で使用され得る。
さらに、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物にも関する。
好ましい産業用途及び対応する好ましい酵素組成物の要約が下記に説明される。
この要約は、いづれにせよ、本発明のズブチラーゼ変異体の適切な用途の完全な列挙であることを意図するものではない。本発明のズブチラーゼ変異体は、プロテアーゼ、特にズブチラーゼの使用を包含することが当業界において知られている他の産業用途においても使用され得る。
変異体酵素を含んで成る洗剤組成物：
本発明は、洗浄及び洗剤組成物及び変異体ズブチリシン酵素を含んで成るそのような組成物への本発明の変異体酵素の使用を包含する。そのような洗浄及び洗剤組成物は、当業界において十分に記載されており、そして適切な洗浄及び洗剤組成物のさらなる説明のためには、WO 96／34946; WO 97／07202; WO 95／30011を参照のこと。
さらに、本発明の多くのズブチラーゼ変異体についての洗浄性能改良点を示す、本明細書における実施例も参照のこと。
洗剤の開示及び例：
界面活性剤系
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性及び／又はアニオン性、及び／又はカチオン性、及び／又は両性、及び／又は両性イオン性、及び／又は半極性界面活性剤から選択され得る。
界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素成分と適合できるように配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は、最とも好ましくは、それがそれらの組成物におけるいづれかの酵素の安定性を促進し、又は少なくとも低下せしめないような手段で配合される。
本発明に従って使用されるべき好ましい系は、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
アルキルフェノールの酸化ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレン縮合物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切であり、そして酸性ポリエチレン縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分れ鎖形状に約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を有するアルキルフェノールと酸化アルキレンとの縮合生成物を包含する。好ましい態様においては、エチレンオキサイドは、アルキルフェノール１モル当たり約１〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルのエチレンオキサイドに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporationにより市販されるIgepal^TMCO-630; 及びRohm & Haas Companyにより市販されるTriton^TMX-45, X-114, X-100及びX-102を包含する。それらの界面活性剤は、アルキルフェノールアルコキシレート（たとえばアルキルフェノールエトキシレート）として通常言及される。
約１〜約25モルのエチレンオキサイドと第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分れ鎖、第１又は第２のいづれかであり得、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約10モルのエチレンオキサイドと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルのエチレンオキサイド及び最とも好ましくは２〜５モルのエチレンオキサイドが前記縮合生成物に存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、Tergitol^TM15-S-9（Ｃ₁₁−Ｃ₁₅の直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Tergitol^TM24-L-6NMW（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄第一アルコールと狭い分子量分布を有する６モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）（両者ともUnion Carbide Corporationにより市販されている）; Neodol^TM45-9（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol^TM23-3（Ｃ₁₂−Ｃ₁₃直鎖状アルコールと3.0モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol^TM45-7（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅直鎖状アルコールと７モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol^TM45-5（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅直鎖状アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）（Shell Chemical Companyにより市販されている）; Kyro^TMEOB（Ｃ₁₃−Ｃ₁₅アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）（Procter & Gamble Companyにより市販されている）；及びGenapol LA 050（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）（Hoechstにより市販されている）を包含する。それらの生成物におけるHLBの好ましい範囲は、８〜11及び最とも好ましくは８〜10である。
約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第4,565,647号に開示される号アルキルポリサッカライド、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最とも好ましくは約1.3〜約2.7のサッカライド単位を含む親水性基を有するポリサッカライド、たとえばポリグリコシドは、本発明の界面活性剤システム中の非イオン性界面活性剤としても有用である。５又は６個の炭素原子を含むいづれかの還元サッカライド、たとえばグルコース、ガラクトースが使用され得、そしてガラクトシル成分はグルコシル成分と置換され得る（任意には、疎水性基は、２−，３−，４−、等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドに対立するものとして、グルコース又はガラクトースを付与する）。追加のサッカリド単位の１つの位置と、前のサッカライド単位上の２−，３−，４−、及び／又は６−位置との間にサッカライド間結合が存在することができる。
好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
R²O（C_nH_2nO）_t（グリコシル）_x
〔式中、Ｒ²は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物から成る群から選択され、ここで前記アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてｘは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約10、最とも好ましくは約1.3〜約2.7である〕を有する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコシド（１−位置での結合）が形成される。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と、前のグリコシル単位の２−，３−，４−、及び／又は６−位置、好ましくは、有力的には２−位置との間に結合され得る。
プロピレンオキサイドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性塩基とエチレンオキサイドとの縮合生成物はまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系として使用するためにも適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶解性を高める傾向があり、そして生成物の液体性質が、ポリオキシエチレン含有率が、約40モルまでのエチレンオキサイドとの縮合に対応する、縮合生成物の合計重量の約50％である点まで保持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されるPluronic^TM界面活性剤を包含する。
プロピレンオキサイド及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物とエチレンオキサイドとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤システム中の非イオン性界面活性剤として使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰のプロピレンオキサイドの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,000の分子量を有する程度までエチレンオキサイドにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFにより市販されているTetronic^TM化合物を包含する。
アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一及び第２脂肪族アルコールと約１〜約25モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物、アルキルポリサッカリド、及びそれらの混合物は、本発明の界面活性剤システム中の非イオン性界面活性剤として使用するために好ましい。３〜15個のエトキシ基を有するＣ₈〜Ｃ₁₈アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するＣ₈〜Ｃ₁₈アルコールエトキシレート（好ましくは平均Ｃ₁₀）、及びそれらの混合物が、最とも好ましい。
ひじょうに好ましい非イオン性界面活性剤は、下記式：

〔式中、Ｒ¹はＨであり、又はＲ¹はＣ_1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、Ｒ²はＣ_5-31ヒドロカルビルであり、そしてＺは直鎖状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有する前記ヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、又はそのアルコキシル化された誘導体である〕で表わされるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である。好ましくは、Ｒ¹はメチルであり、Ｒ²は直鎖Ｃ_11-15アルキル又はＣ_16-18アルキル、又はアルケニル鎖、たとえばココナッツアルキル、又はそれらの混合物であり、そしてＺは、還元性アミノ化反応において、還元糖、たとえばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから誘導される。
ひじょうに好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化スルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式RO（A）_mSO₃M（ここでＲは、Ｃ₁₀−Ｃ₂₄アルキル成分を有する置換されていないＣ₁₀−Ｃ₂₄アルキル又はヒドロキシアルキル基、好ましくはＣ₁₂−Ｃ₂₀アルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的には約0.5〜約６、より好ましくは約0.5〜約３であり、そしてＭはＨ、又はカチオン、たとえば金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム又は置換されたアンモニウムカチオンである）で表わされる水溶性塩又は酸である。アルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロポキシル化スルフェートは、本発明において企画される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物及び同様のものに由来するそれらのカチオンを包含する。典型的な界面活性剤は、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（1.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（1.0）M）、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（2.25）M）、及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（3.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（3.0）M）、並びにＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（4.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（4.0）M）（ここでＭは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される）である。
使用される適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルエステルスルホネート界面活性剤、たとえば“The Journal of the American Oil Chemists Society”, 52（1975）, pp.323-329に従って気体SO₃によりスルホネート化されるＣ₈−Ｃ₂₀カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルである。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から誘導されるような天然の脂肪界面活性剤を包含する。
特に、洗濯用途のための好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記構造式：

〔式中、Ｒ³はＣ₈−Ｃ₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、Ｒ⁴はＣ₁−Ｃ₆ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成するカチオンである〕で表わされるアルキルエステルスルホネート界面活性剤を包含する。適切な塩−形成カチオンは、金属、たとえばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、たとえばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、Ｒ³はＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであり、そしてＲ⁴はメチル、エチル又はイソプロピルである。Ｒ³がＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであるエステルスルホネートが特に好ましい。
他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO₃M〔式中、Ｒは好ましくはＣ₁₀−Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好ましくはＣ₁₀−Ｃ₂₀アルキル成分、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルを有するアルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨ又はカチオン、たとえばアルキル金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム又は置換されたアンモニウム（たとえばメチル−、ジメチル−、及びトリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物、及び同様のものに由来する第四アンモニウムカチオン）である〕で表わされる、水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、Ｃ₁₂−Ｃ₁₆のアルキル鎖は、低い洗浄温度（たとえば約50℃以下）のために好ましく、そしてＣ₁₆−Ｃ₁₈アルキル鎖は、高い洗浄温度（たとえば約50℃以上）のために好ましい。
洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物に含まれ得る。それらは、石鹸の塩（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、たとえばモノ−、ジ−及びトリエタノールアミン塩）、Ｃ₈−Ｃ₂₂一次又は二次アルカンスルホネート、Ｃ₈−Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属シトレートの熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化されたポリカルボン酸、Ｃ₈−Ｃ₂₄アルキルポリグリコールエーテルスルフェート（10モルまでのエチレンオキサイドを含む）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イソチオネート、たとえばアシルイソチオネート、Ｎ−アシルタルトレート、アルキルスクシネート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₁₂−Ｃ₁₈モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₆−Ｃ₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリサッカリドのスルフェート、たとえばアルキルポリグルコシドのスルフェート（下記に記載される非イオン性のスルフェート化されていない化合物）、枝分れされた一次アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、たとえば式RO（CH₂CH₂O）_k−CH₂COO-M⁺〔式中、ＲはＣ₉−Ｃ₂₂アルキルであり、ｋは１〜10の整数であり、そしてＭは可溶性塩形成カチオンである〕で表わされるカルボキシレートを包含する。樹脂酸及び水素添加された樹脂酸、たとえばロジン、水素添加されたロジン、及びタル油に存分在するか又はタル油に由来する樹脂酸及び水素添加された樹脂酸がまた適切である。
アルキルベンゼンスルホネートが、ひじょうに好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS）（ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”（Schwarts, Perry and BerchによるVol.Ｉ及びII）に記載される。種々のそのような界面活性剤がまた、アメリカ特許第3,929,678号（第23欄、第58行〜第29欄、第23行；引用により本明細書に組込まれる）に開示される。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
本発明の洗濯洗剤組成物はまた、本明細書にすでに記載された界面活性剤以外のカチオン性、両性、両性イオン性、及び半−極性界面活性剤も含むことができる。
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗浄界面活性剤は、１つの長鎖のヒドロカルビル基を有するものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、たとえばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲニド、及び下記式：
〔R²（OR³）_y〕〔R⁴（OR³）_y〕₂R⁵N+X^-
〔式中、Ｒ²は、アルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキルベンジル基であり、個々のＲ³は−CH₂CH₂−，−CH₂CH（CH₃）−，−CH₂CH（CH₂OH）−，−CH₂CH₂CH₂−及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のＲ⁴はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロキシアルキル、２つのＲ⁴基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、−CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH（ここでＲ⁶は約1000以下の分子量を有するヘキソース又はヘキソースポリマーである）、及び水素（ｙがゼロでない場合）から成る群から選択され；Ｒ⁵はＲ⁴と同じであり、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数又はＲ²＋Ｒ⁵は約18よりも多くなく；個々のｙは０〜約10であり；そしてｙ値の合計は０〜約15であり；そしてＸはいづれかの適合できるアニオンである〕を有するそれらの界面活性剤を包含する。
ひじょうに好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式：
R₁R₂R₃R₄N＋X^- （ｉ）
〔式中、Ｒ₁はＣ₈−Ｃ₁₆アルキルであり、Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄の個々は独立して、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロキシアルキル、ベンジル、及び（C₂H₄₀）_xH（ここでｘは２〜５の値を有する）であり、そしてＸはアニオンである〕を有する本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くても１つのＲ₂，Ｒ₃又はＲ₄はベンジルであるべきである。
Ｒ₁のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がココナッツ又はヤシ種の脂肪に由来する鎖長の混合物であるか、又はオレフィン構築又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される場合、Ｃ₁₂−Ｃ₁₅である。
R₂R₃及びＲ₄のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸはハロゲン化物、メトスルフェート、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
本発明における使用のための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は次のものである：
ココナッツトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
デシルトリエチルアンモニウムクロリド；
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
Ｃ_12-15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート；
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はブロミド；
ラウリルジメチル（エテノキシ）₄アンモニウムクロリド又はブロミド；
コリンエステル（式（ｉ）の化合物、ここでＲ₁は

アルキルであり、そしてR₂R₃R₄はメチルである）；
ジ−アルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕。
本発明において有用な他のカチオン性界面活性剤はまた、アメリカ特許第4,228,044号及びヨーロッパ特許000 224号にも記載されている。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25重量％、好ましくは約１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は脂肪族基が直鎖又は枝分れ鎖であり得る、複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得る。脂肪族置換基の１つは、少なくとも約８個の炭素原子、典型的には約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも１つはアニオン性水−溶解基、たとえばカルボキシ、スルホネート、スルフェートを含む。両性界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第3,929,678号（第19欄、第18〜35行）を参照のこと。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
両性イオン界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。両性イオン界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第3,929,678号（第19欄、第38行〜第22欄、第48行）を参照のこと。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン界面活性剤を含んで成る。
半−極性非イオン性界面活性剤は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分を含む水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィンオキシド；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子のアルキル及びヒドロキシアルキル成分から成る群から選択された成分を含む水溶性スルホキシドを含む非イオン性界面活性剤の特別なカテゴリーである。
半−極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：

〔式中、Ｒ³は約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；Ｒ⁴は約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；ｘは０〜約３であり；そして個々のＲ⁵は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個のエチレンオキサイド基を含むポリエチレンオキシドである〕を有する酸化アミン界面活性剤を含む。Ｒ⁵基は、環構造を形成するために、たとえば酸素又は窒素原子を通してお互いに対して結合され得る。
それらのアミンオキシド界面活性剤は特に、Ｃ₁₈アルキルジメチルアミンオキシド及びＣ₈−Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを包含する。
そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半−極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
ビルダー系
本発明の組成物は、さらにビルダー系を含むことができる。いづれかの従来のビルダー系、たとえばアルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、たとえばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、たとえばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が、本発明への使用のために適切である。明確な環境理由のためにはほとんど好ましくはないが、ホスフェートビルダーはまた、本発明においても使用され得る。
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、水和化された無機アルミノシリケート材料、より特別には、水和化された合成ゼオライト、たとえば水和化されたゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，HS又はMAPであり得る。
他の適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、たとえばSKS-6（Hoechst）である。SKS-6は、珪酸ナトリウム（Na₂Si₂O₅）から成る積層された結晶性シリケートである。
カルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第831,368号、第821,369号及び第821,370号に開示されるような乳酸及び、グリコール酸の塩、並びにそれらのエーテル誘導体を包含する。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸及びフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ特許第2,446,686号及び第2,446,487号、アメリカ特許第3,935,257号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第840,623号に記載されるスルフィニルカルボキシレートを包含する。３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは特に、水溶性シトレート、アコニトレート及びシトラコネート、並びにスクシネート誘導体、たとえばベルギー特許第1,379,241号に記載されるカルボキシメチルオキシスクシネート、及びオキシポリカルボキシレート材料、たとえばイギリス特許第1,387,447号に記載される２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,261,829号に開示されるオキシジスクシネート、１，１，２，２−エタンテトラカルボキシレート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、たとえばイギリス特許第1,398,421号及び第1,398,422号、及びアメリカ特許第3,936,448号に開示されるスルホスクシネート、及びイギリス特許第1,082,179号に記載されるスルホネート化された、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートがイギリス特許第1,439,000号に開示されている。
脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、シクロペンタン−シス；シス−シス−テトラカルボキシレート；シクロペンタジエニド；ペンタカルボキシレート；２，３，４，５−テトラヒドロフラン−シス；シス，シス−テトラカルボキシレート；２，５−テトラヒドロフラン−シス；ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート；１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート；及び多価アルコール、たとえばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体を包含する。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,425,343号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸、及びフタル酸誘導体を包含する。
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。
本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ、又は積層されたシリケート（SKS-6）、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を含む。
本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレート化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−二琥珀酸（EDDS）、又はそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDSのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na₂EDDS及びNa₄EDDSを包含する。EDDSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg₂EDDSを包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最とも好ましいものである。
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を包含する。
顆粒組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、たとえばアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、たとえば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート、及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
他の適切な水溶性有機塩は、ホモ又はコポリマー酸又はそれらの塩であり、ここでポリカルボン酸は２つよりも多くない炭素原子によりお互いから分離される少なくとも２つのカルボキシル基を含んで成る。
このタイプのポリマーは、GB-A-1,596,756に開示される。そのような塩の例は、MW 2000〜5000のポリアクリレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有する。
洗剤ビルダー塩は通常、組成物中に５〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、３％〜30％である。
酵 素
本発明の酵素調製物の他に、好ましい洗剤組成物は、清浄性能及争び／又は布保護の利点を付与する他の酵素を含んで成る。
そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（たとえばラッカーゼ）を包含する。
プロテアーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれか他のプロテアーゼが使用され得る。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシルスに由来するもの、たとえばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147及びズブチリシン168である（WO 89／06279号に記載される）。トリプシン様プロテアーゼの他は、トリプシン（たとえばブタ又はウシ起源の）及びWO 89／06270号に記載されるフザリウム（Husarium）プロテアーゼである。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Novo Nordisk A/S（デンマーク）により商標Alcalase, Savinase, Primase, Durazym、及びEsperaseとして市販されるもの、Genencor Internationalにより商標Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect及びPurafect OXPとして市販されるもの、及びSolray Enzymesにより商標Opticlean及びOptimaseとして市販されるものを包含する。プロテアーゼ酵素は、本発明の組成物中に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベルで、さらにより好ましくは、0.01〜0.2重量％のレベルで導入され得る。
リパーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのリパーゼが使用され得る。適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。
有用なリパーゼの例は、ヨーロッパ特許第258 068号及び第305 216号に記載のようなヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、ヨーロッパ特許第238 023号に記載のようなリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、ヨーロッパ特許第214 761号に記載のようなカンジダ（Candida）リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカ（C. antarctica）リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカリパーゼＡ又はＢ、ヨーロッパ特許第218 272号に記載のようなプスードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、たとえばＰ．アルカリゲネスP. alcaligenes及びＰ．プスードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ、ヨーロッパ特許第311 376号に記載のようなＰ．セパシア（P. cepacia）リパーゼ、イギリス特許第1,372,034号に開示されるようなＰ．スツツゼリ（P. stutzeri）リパーゼ、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バシルス リパーゼ、たとえばＢ．ズブチリスリパーゼ（Dartoisなど．，（1993）, Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（B. Stearothermophilus）リパーゼ（JP 64／744992号）及びＢ．プミラス（B. pumilus）リパーゼ（WO 91／16422号）を包含する。
さらに、次のような多くのクローン化されたリパーゼが有用である：Yamaguchiなど．，（1991）, Gene 103,61-67により記載されるペニシリウム カメムペルチ（Penicillium camembertii）リパーゼ、ゲオトリカム カンジダム（Geotricum candidum）リパーゼ（Schimada, Y.など．，（1989）, J.Biochem., 106; 383-388）、及び種々のリゾパス（Rhizopus）リパーゼ、たとえばＲ．デレマル（R. delemar）リパーゼ（Hass, M.J.など．，（1991）, Gene 109, 117-113）、Ｒ．ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Kugimiyaなど．，（1992）, Biosci.Biotech.Biochem. 56, 716-719）、及びＲ．オリザエ（R. oryzae）リパーゼ。
他のタイプの脂肪分解酵素、たとえばグチナーゼ、たとえばWO 88／09367号に記載のようなプスードモナス メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来するクチナーゼ、又はフサリウム ソラニpisi（Fusarium solani pisi）に由来するクチナーゼ（たとえばWO 90／09446号に記載される）もまた有用である。
特に適切なリパーゼは、リパーゼ、たとえばM1 Lipase^TM, Luma fast^TM及びLipomax^TM（Genencor）, Lipolase^TM及びLipolase Ultra^TM（Novo Nordisk A/S）及びLipase P“Amano”（Amano Pharmaceutical Co. Ltd.）である。
リパーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酸素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。
アミラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのアミラーゼ（α及び／又はβ）は、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。たとえば、アミラーゼは、イギリス特許第1,296,839号により詳細に記載されるＢ．リケニホルミスの特定株から得られるα−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM及びBAN^TM（Novo Nordisk A/Sから入手できる）、及びRapidase^TM及びMaxamyl P^TM（Genencorから入手できる）である。
アミラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル；より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで組込まれる。
セルラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのセルラーゼが使用され得る。適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から生成される菌類セルラーゼを開示するアメリカ特許第4,435,307号に開示される。特に適切なセルラーゼは、色彩保護の利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第0 495 257号に記載されるセルラーゼである。
市販のセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンスの株により生成されるCelluzyme^TM（Novo Nordisk A/S）及びKAC-500（B）^TM（Kao Corporation）を包含する。
セルラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はその源（たとえば過炭酸塩、過硼酸塩又は過硫酸塩）と組合して使用される。オキシダーゼ酵素は、酸素と組合して使用される。両タイプの酵素は、“溶液漂白”するために、すなわち染色された布から他の布への、前記布が洗浄液体において一緒に、好ましくは、たとえばWO 94／12621号及びWO 95／01426号に記載されるような増強剤と一緒に洗浄される場合、織物染色の移行を妨げるために使用される。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的書に修飾された変異体が包含される。
ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素は通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。
上記言及された酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物が、本明細書に包含される。
洗剤組成物に導入される、本発明の酵素又はいづれか他の酵素は通常、洗剤組成物に、前記組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。
漂白剤：本発明の洗剤組成物に含まれ得るさらなる任意の洗剤成分は、漂白剤、たとえば400〜800ミクロンの粒度を有するPB1, PB4及び過炭酸塩を包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤を包含することができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約25％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、たとえば粒状洗剤における任意の添加される成分である。
本発明に使用するための漂白剤成分は、酸素漂白剤及び当業界において知られている他のものを含む洗剤組成物のために有用な漂白剤のいづれかであり得る。
本発明のために適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
使用され得る１つのカテゴリーの酸素漂白剤は、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート六水和物、メタ−クロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第4,483,781号、アメリカ特許第740,446号、ヨーロッパ特許第0 133 354号及びアメリカ特許第4,412,934号に開示される。ひじょうに好ましい漂白剤は、また、アメリカ特許第4,634,551号に記載されるような６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸を包含する。
使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化物の例は、トリクロロイソシアヌル酸及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート、及びＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終製品の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。
過酸化水素開放剤は、漂白活性化剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS；アメリカ特許第4,412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホネート（ISONOBS；ヨーロッパ特許第120 591号に記載される）、又はペンタアセチルグルコース（PAG）（それらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果を導びく）と組合して使用され得る。さらに、漂白活性化剤Ｃ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、Ｃ９（６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート、及びＣ10（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート、又はそれらの混合物は、ひじょうに適切である。また適切な活性化剤は、たとえばヨーロッパ特許出願第91870207.7号に開示されるようなアシル化されたシトレートエステルである。
有用な漂白剤、たとえばペルオキシ酸、及び本発明の洗浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸素漂白化合物を含んで成る漂白システムがUSSN 08／136,626に記載されている。過酸化水素はまた、洗浄及び／又はすすぎ工程の開始で又はその間、過酸化水素を発生することができる酵素システム（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによっても存在することができる。そのような酵素システムは、ヨーロッパ特許出願第0 537 381号に開示される。
酸素漂白剤以外の漂白剤はまた当業界において知られており、そして本発明に使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、たとえばスルホン化された亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。酸素の存在下で、たとえば布を乾かすために日光につるすことによる日光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして結果的に、支持体が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第4,033,718号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約0.025〜約1.25重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。マンガン触媒は、“Efficient mangunese catalysts for low-temperature bleaching”, Nature 369, 1994, pp.637-639に記載される化合物の１つであり得る。
石鹸水の泡抑制剤：もう１つの任意の成分は、シリコーン、及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸水の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により示され、そしてシリカは通常、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される細かく分割された形で使用される。それらの材料は粒状物として導入され得、ここで石鹸水の泡抑制剤が水溶性又は水分散性の実質的に非界面活性の洗剤不浸透性のキャリヤーに、好都合には、開放できるように導入される。他方では、石鹸水の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用される。
好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、アメリカ特許第3,933,672号に開示される。他の特に有用な石鹸水の泡抑制剤は、ドイツ特許出願DTOS第2,646,126号に記載される、自己乳化性シリコーン石鹸水の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールコポリマーである、Dow Corningから市販されているDC-544である。特に好ましい石鹸水の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルカノールの混合物を含んで成る石鹸水の泡抑制剤システムである。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標Isofol 12Rとして市販されている２−ブチル−オクタノールである。
そのような石鹸水の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第0 593 841号に記載される。
特に好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649.8号に記載される。前記組成物は、非多孔性ヒュームドシリカ、たとえばAerosil^Rと組合して、シリコーン／シリカ混合物を含むことができる。
上記石鹸水の泡抑制剤は通常、組成物の0.001〜２重量％のレベル、好ましくは0.01〜１重量％のレベルで使用される。
他の成分：洗剤組成物に使用される他の成分、たとえば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、螢光増白剤、石磨剤、殺菌剤、曇り阻止剤、着色剤、及び／又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、ポリサッカリド及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第3,455,838号に記載されるような、置換されたジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは好ましくは、ロウ質のトウモロコシ、ロウ質のモロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Starchにより製造されるN-Lokを包含する。そのN-Lok封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。そのスターチは、一官能置換された基、たとえばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。
本発明において適切な再沈着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、たとえばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコポリマー性ポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ポリアクリレート、及びビルダーとして前で言及された無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸はコポリマーの少なくとも20モル％を構成する）を包含する。それらの材料は、通常、組成物の0.5〜10重量％のレベル、より好ましくは0.75〜８重量％のレベル、最とも好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。
好ましい螢光増白剤は、アニオン特性のものであり、その例は、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′−ジスルホネート、一ナトリウム４′，４″−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２′−ジスルホネート、二ナトリウム−４，４′−ビス（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホネート、ナトリウム−２−スチルビル−４″−（ナフト−１′，２′：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２″−スルホネート、及び４，４′−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に1000〜10000の分子量、より好ましくは2000〜8000の分子量及び最とも好ましくは約4000の分子量のものである。それらは、0.20〜５重量％のレベル、より好ましくは0.25〜2.5重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前に言及されたホモ−又はコポリマー性ホリカルボキシレート塩は、遷移金属不純物の存在下で粘土、タンパク質性及び酸化できる土壌に対する白色度維持、布への灰分沈着、及び洗浄性能を改良するために価値がある。
本発明の組成物において有用な土壌開放剤は便利には、テレフタル酸と種々の組合せでのエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第4,116,885号及び第4,711,730号、及びヨーロッパ特許第0 270 033号に開示される。ヨーロッパ特許第0 272 033号による特に好ましいポリマーは、下記式：
（CH₃（PEG）₄₃）_0.75（POH）_0.25〔T-PO〕_2.8（T-PEG）_0.4〕T（POH）_0.25（（PEG）₄₃CH₃）_0.75
〔式中、PEGは−（OC₂H₄）O−であり、POは（OC₃H₆0）であり、そしてＴは（POOC₆H₄CO）である〕を有する。
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーのような変性されたポリエステルがまたひじょうに有用であり、ここで末端基は主に、スルホベンゾエート、及び第二に、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目標は、“主に”スルホベンゾエートにより両末端でキャップされたポリマーを得ることであり、本発明においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどが、スルホベンゾエート基により末端キャップされるであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは、十分にキャップされず、そして従って、それらの末端基は、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、その理由から、“第二に”そのような種から成ることができる。
本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル酸、約16重量％の１，２−プロパンジオール、約10重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311 342号に詳細に記載されている。
軟化剤：布軟化剤はまた、本発明に従って洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は無機又は有機タイプのものであり得る。無機軟化剤は、GB-A-1 400898及びアメリカ特許第5,019,292号に開示されるスメクタイト粘土により例示される。有機軟化剤は、GB-A1 514 276及びヨーロッパ特許第0 011 340号に開示されるような水不溶性第三アミン、及びEP-B-0 026 528に開示されるようなモノＣ₁₂−Ｃ₁₄第四アンモニウム塩とのそれらの組合せ、並びにヨーロッパ特許第0 242 919号に開示されるようなジ−長鎖アミドを包含する。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0 299 575号及び第0 313 146号に開示されるような高分子量ポリエチレンオキシド材料を包含する。
スメクタイト粘土のレベルは通常、５〜15重量％、より好ましくは８〜12重量％の範囲で存在し、そしてその材料は、配合物の残りに乾燥混合された成分として添加される。布用有機軟化剤、たとえば水不溶性第三アミン又はジ−長鎖アミド材料は、0.5〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、ところが高分子量ポリエチレンオキシド材料及び水溶性カチオン性材料は0.1〜２重量％、通常0.15〜1.5重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し、いくつかの場合、組成物の他の固体成分上に、それらを乾燥混合された粒状物として添加し、又はそれらを溶融された液体として噴霧することがより便利である。
ポリマー染料−移行阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜２重量％、より好ましくは0.05〜１重量％のポリマー染料−移行阻害剤を含むことができる。前記ポリマー染料−移行阻害剤は通常、洗剤組成物により洗浄される布上への着色された布からの染料の移行を阻害するために洗剤組成物中に導入される。それらのポリマーは、染料が洗浄において他の製品に付着するようになる機会を有する前、染色された布から洗浄される不堅牢染料を複合体化し、又は吸収する能力を有する。
特に適切なポリマー染料−移行阻害剤は、ポリマーＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物である。
そのようなポリマーの添加はまた、本発明の酵素の性能を増強する。
本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状又は顆粒形で存在し得る。
非ダスチング粒質物は、たとえばアメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両者ともNovo Industri A/Sによる）に開示されるようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。ロウ質被覆材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキサイド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80個のエチレンオキサイド単位が存在するエトキシル化された脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム−形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。
本発明の粒状組成物はまた、“圧縮形”でも存在でき、すなわちそれらは従来の顆粒状洗剤よりも比較的高い密度、すなわち550〜950ｇ／ｌの密度を有することができ：そのような場合、本発明の粒状洗剤組成物は、従来の粒状洗剤に比較して、低い量の“無機充填剤塩”を含むだろうし；典型的な充填剤塩はスルフェート及びクロリドのアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリウムであり；“圧縮”洗剤は典型的には、10％よりも高くない充填剤塩を含んで成る。本発明の液体組成物はまた、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低い量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の水含有率は、洗剤組成物の30重量％以下、より好ましくは20重量％以下、最とも好ましくは10重量％以下である。
たとえば、本発明の組成物、手動及び機械用洗濯洗剤組成物、たとえば洗濯用添加組成物及び染色された布の前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作及び皿洗操作への使用のための組成物として配合され得る。
次の例は、本発明のために組成物を例示するものであって、本発明の範囲を必ずしも制限し、又は定義するものではない。
洗剤組成物においては、略された成分の識別は次の意味を有する：
LAS ：ナトリウム直鎖状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホネート
TAS ：ナトリウム牛脂アルキルスルホネート
XYAS：ナトリウムＣ_1X−Ｃ_1Yアルキルスルフェート
SS：式２−ブチルオクタン酸の二次石鹸界面活性剤
25EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ₁₂−Ｃ₁₅の主に直鎖状の第一アルコール
45EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ₁₄−Ｃ₁₅の主に直鎖状の第一アルコール
XYEZS：１モル当たり平均Ｚモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ_1X−Ｃ_1Yナトリウムアルキルスルフェート
非イオン性：BASF Gmbhにより商標Plurafax LF404として市販されている、平均3.8のエトキシル化の程度及び平均4.5のプロポキシル化の程度を有するＣ₁₃−Ｃ₁₅の混合されたエトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール
CFAA：Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルキルＮ−メチルグルカミド
TFAA：Ｃ₁₆−Ｃ₁₈アルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート：非晶性珪酸ナトウム（SiO₂：Na₂Oの比＝2.0）
NaSKS-6：式δ−Na₂Sｉ₂O₅の結晶性積層シリケート
カーボネート：無水炭酸ナトリウム
ホスフェート：ナトリウムトリポリホスフェート
MA／AA：約80,000の平均分子量を有する、マレイン酸／アクリル酸（１：４）コポリマー
ポリアクリレート：BASF Gmbhにより商標PA30として市販されている、8,000の平均分子量を有するポリアクリレートホモポリマー
ゼオライトＡ：１〜10μｍの範囲での一次粒度を有する、式Na₁₂（AlO₂SiO₂）₁₂・27H₂Oの水和化されたナトリウムアルミノシリケート
シトレート：クエン酸三ナトリウム・2H₂O
クエン酸（citric）：クエン酸
過硝酸塩：実験式NaBO₂・H₂Oを有する非晶性過硼酸ナトリウム・1H₂O漂白剤
PB4 ：非晶性過硝酸ナトリウム・4H₂O
過炭酸塩：実験式2Na₂CO₃・3H₂O₂を有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤
TAED：テトラアセチルエチレンジアミン
CMC ：ナトリウムカルボキシメチルセルロース
DETPMP：商標Dequest 2060としてMonsantoにより市販されているジエチレントリアミン五（メチレンホスホン酸）
PVP ：ポリビニルピロリドンポリマー
EDDS：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−二琥珀酸、ナトリウム塩の形での〔Ｓ，Ｓ〕異性体
洗濯水の泡抑制剤：50℃のMptの25％パラフィンワックス、17％疎水性シリカ、58％パラフィン油
粒状洗濯水の泡抑制剤：粒状形での12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％スターチ
スルフェート：非晶性硫酸ナトリウム
HMWPEO：高分子量ポリエチレンオキシド
TAE25 ：牛脂アルコールエトキシレート（25）
洗剤例Ｉ
本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：
ナトリウム線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホネート 6.5
硫酸ナトリウム 15.0
ゼオライトＡ 26.0
ナトリウムニトリロトリアセテート 5.0
本発明の酵素 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
硼酸 4.0
過硝酸塩 18.0
フェノールスルホネート 0.1
水／少量 100％まで
洗剤例II
本発明の布用圧縮粒状洗浄組成物（粒度800ｇ／ｌ）を次のようにして調製することができる：
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
ゼオライトＡ 17.0
NaSKS-6 12.0
クエン酸 3.0
カーボネート 7.0
MA／AA 5.0
CMC 0.4
本発明の酵素 0.1
TAED 6.0
過炭酸塩 22.0
EDDS 0.3
粒状石鹸水の泡抑制剤 3.5
水／少量 100％まで
洗剤例III
着色された布の洗濯において特に有用である本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製した：

洗剤例IV
“洗浄を通しての軟化”能力を提供する本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：

洗剤例Ｖ
本発明の重質液体布用洗浄組成物を次のようにして調製することができる：

革産業への用途：
本発明のズブチラーゼは、革産業への、特に外皮の除毛への使用のために使用され得る。
前記用途においては、本発明のズブチラーゼ変異体は好ましくは、他のプロテアーゼをさらに含んで成る酵素組成物に使用される。
適切な他のプロテアーゼのより詳細な記載のためには、洗剤組成物への使用のための適切な酵素に関するセクションを参照のこと（上記参照のこと）。
羊毛産業への用途：
本発明のズブチラーゼは、羊毛産業に、特に羊毛を含んで成る衣服の洗浄への使用のために使用され得る。
前記用途においては、本発明のズブチラーゼ変異体は好ましくは、他のプロテアーゼをさらに含んで成る酵素組成物に使用される。適切な他のプロテアーゼのより詳細な記載のためには、洗剤組成物への使用のための適切な酵素に関するセクションを参照のこと（上記参照のこと）。
本発明は次の例においてより詳細に記載されるが、それらの例は本発明の範囲を制限するものではない。
材料及び方法
株：
Ｂ．ズブチリスDN1885（Diderichsenなど., 1990）。
Ｂ．レンタス309及び147は、NCIBに寄託され、そして受託番号NCIB 10309及び10147を与えられた、バシラス レンタスの特定株であり、そして引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第3,723,250号に記載される。
Ｅ．コリMC1000（M.J.Casadaban and S.N.Cohen（1980）; J.Mol.Biol. 138: 179-207）を、従来の方法によりｒ^-，ｍ⁺にし、そしてそれはまた、アメリカ特許出願第039,298号にも記載される。
プラスミド：
pJS3：ズブチラーゼ309をコードする合成遺伝子を含む、Ｅ．コリ−Ｂ．ズブチリス シャトルベクター．（Jacob Schiodtなど., Proten and Peptide letters 3: 39-44（1996）により記載される）。
pSX222：Ｂ．ズブチリス発現ベクター（WO 96／34946号に記載される）。
一般的分子生物学法：
特にことわりない限り、DNA操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施した（Sambrookなど．（1989）Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ansubel, F.M. など. （eds.）“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M.（eds.）“Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990）。DNA操作のための酵素は、供給者の規格に従って使用された。
DNA操作のための酵素：
特にことわらない限り、DNA操作のためのすべての酵素、たとえば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は、New England Biolabs, Inc．から得られる。
タンパク質分解活性：
本発明において、タンパク質分解活性は、Kilo Novoプロテアーゼ単位（KNPU）で表わされる。その活性は、酵素標準

に対して相対的に決定され、その決定は、タンパク質分解酵素によりジメチルカゼイン（DMC）溶液を次の標準条件下で消化することに基づかれている：50℃、pH8.3、９分、９分の反応時間、３分の測定時間。フォルダーAF 220／１が、Novo Nordisk A/S, Denmarkの要求に基づいて利用でき、ここでそのフォルダーは引用により組込まれる。
GUは、標準条件下で、40℃での15分間のインキュベーションの間、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いて、１ｍモルのグリシンに等しい量のNH₂−基を生成するタンパク質分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。
酵素活性はまた、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith,L.A.，（1988）に記載される、可溶性基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラニトロフェノールとの反応に従って、PNAアッセイを用いても測定され得る。
発 酵：
ズブチラーゼ酵素の発酵は、100mlのBPX培養を含む500mlのバッフル三角フラスコにおいて30℃で５日間、回転振盪テーブル（300r.p.m.）上で行なわれた。結果的に、たとえば２ｌのブイヨンを製造するためには、20個の三角フラスコが同時に発酵された。
培 地：
BPX：組成（１ｌ当たり）：
ジャガイモスターチ 100ｇ
粉砕された大麦 50ｇ
ダイズ粉末 20ｇ
Na₂HPO₄・12H₂O 9ｇ
プルロニック 0.1ｇ
カゼイン酸ナトリウム 10ｇ
培地中のスターチが、α−アミラーゼにより液化され、そして培地が120℃で45分間、加熱することによって殺菌される。殺菌の後、培地のpHが、NaHCO₃を0.1Ｍまで添加することによって、９に調節される。
例
例１．酵素変異体の構成及び発現：
部位特定突然変異誘発：
ズブチラーゼ309部位特定変異体を、それぞれDengなど．（Anal.Biochem. 200: 81-88（1992））及びMarkvardsenなど．（BioTechniques 18（３）：371-372（1995））により記載される、“Unique site elimination（USE）”又は“Uracil-USE”技法により製造した。
鋳型フラスミドは、pJS3、又はズブチラーゼ309の変異体を含むその類似体であった。USE突然変異を、構造体R170L変異体に対して指図されたオリゴヌクレオチドと共にY167A変異体をコードする遺伝子を含むpJS3類似体に対して実施し、最終Y167A＋R170Lズブチラーゼ309変異体をもたらした。
次に、pJS3に構成されたズブチラーゼ309変異体を、制限酵素KpnＩ及びMluＩを用いて、Ｂ．ズブチリスpSX222発現プラスミド中にサブクローン化した。
局在化されたランダム突然変異誘発：
局在化されたランダム突然変異誘発を実施するために使用される全体の方策は、下記の通りであった：
突然変異誘発されるアミノ酸コドンに対応するヌクレオチドを除いて、突然変異誘発されるDNA配列の部分に対応する突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成した。
続いて、その得られる突然変異誘発プライマーを、適切な対抗するプライマーとのPCR反応に使用した。その得られるPCRフラグメントを精製し、そして消化し、そしてＥ．コリ−Ｂ．ズブチリスシャトルベクター中にクローン化した。
他方では、及び必要なら、その得られるPCRフラグメントを、消化及びシャトルベクター中への突然変異誘発された領域のクローニングを可能にするために第２の適切な対抗するプライマーと共に、プライマーとして第２のPCR反応に使用した。前記PCR反応を、通常の条件下で実施した。
この方策に続いて、局在化されたランダムライブラリーを、SAVINASEにおいて構成し、ここで位置Y167及びR170の両者が完全にランダム化された。
突然変異誘発されることが所望されるアミノ酸コドンでの第１及び第２塩基における４個の塩基（Ｎ）の個々の25％を有する１つのオリゴヌクレオチドを合成した。３個の停止コドンの２つの（TAA, TGA）を回避するために50％Ｇ／50％Ｃ（Ｓ）を有する第３ヌクレオチド（wobble塩基）を合成した。
突然変異誘発プライマー（５′−GTT TGG ATC AGT AGC TCC GAC TGC CAT TGC GTT CGC ATA SNN CGC CGG SNN GCT CAT TGA GCC−３′（アンチセンス））を、適切な対抗するプライマー（たとえば、５′−GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC−３′（センス））、及び鋳型としてのプラスミドpJS3とのPCR反応に使用した。この得られるPCR生成物を、制限酵素Asp718及びBclＩを用いることによって、pJS3シャトルベクター中にクローン化した。
次に、pJS3に構成された、局在化されたランダムライブラリーを、制限酵素KpnＩ及びMluＩを用いて、Ｂ．ズブチリスpSX222発現プラスミド中にサブクローン化した。
前記調製されたライブラリーは、ライブラリー当たり約100,000個の個々のクローンを含んだ。
ランダムに選択されたクローンを配列決定し、企画された突然変異を確かめた。
本発明のズブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含んで成るＢ．ズブチリスpSX222発現プラスミドを用いて、コンピテントＢ．ズブチリスを形質転換し、そして10μｇ／mlのクロラムフェニコール（CAM）を含む培地において、上記のようにして発酵した。
例２．酵素変異体の精製：
この方法は、ズブチリシン147酵素、ズブチリシン309酵素又はその変異体の２ｌ規模の発酵の精製に関する。
約1.6ｌの発酵ブイヨンを、１ｌのビーカーにおいて35分間、5000rpmで遠心分離した。上清液を10％酢酸を用いて、pHを6.5に調節し、そしてSeitz Supra S100フィルタープレート上で濾過した。
濾液を、Amicon S1Y10 UF遠心分離機を備え付けられたAmicon CHZA UFユニットを用いて、約400mlに濃縮した。UF濃縮物を、遠心分離し、そして濾過し、その後、pH7でBacitracin親和性カラム上で室温で吸収した。プロテアーゼを、室温でBacitracinカラムから、pH７に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.1Ｍの硝酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝溶液中、25％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムを用いて溶離した。
Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そしてpH6.5に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された750mlのSephadex G25カラム（５cmの直径）に適用した。
Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そしてpH6.5に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用した。
プロテアーゼを、２ｌの同じ緩衝液（ズブチリシン147の場合、０〜0.2Ｍの塩化ナトリウム）における０〜0.1Ｍの塩化ナトリウムの線状グラジエントを用いて溶離した。
最終精製段階においては、CM Sepharoseカラムからの、プロテアーゼ含有画分を組合し、そしてGR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc.からの）を備えたAmicon限外濾過セルにおいて濃縮した。
前記構成及び上記単離方法について例１の技法を用いることによって、次のズブチリシン309変異体を生成し、そして単離した：
Y167A＋R170S
Y167A＋R170L
Y167A＋R170N
Y167P
Y167P＋R170L
Y167V＋R170T
Y167I＋R170T
Y167V＋R170Q
Y167S＋R170Q
Y167T＋R170N
Y167A＋R170A
Y167T
Y167T＋R170A
Y167P＋R170S
Y167I＋R170L
Y167F＋R170T
Y167F＋R170E
Y167F＋R170H
Y167F＋R170T
Y167F＋R170L
Y167L
R170H
Y167S。
例３．酵素変異体を含んで成る洗剤組成物の洗浄性能：
次の例は、下記に示される条件下で行なわれた多くの洗浄試験からの結果を提供する：
実験条件：

洗浄に続いて、布を水道水に洗い流し、そして空気乾燥せしめた。
上記モデルの洗剤は、単純な洗剤配合物である。最とも特徴的な性質は、STPがビルダーとして使用され、そしてアニオン性テンシド（LAS）の含有率が相当に高いことである。さらに、pHを、粉末洗剤の正常な範囲内にある10.4に調節する。

水の硬度を、脱イオン水にCaCl₂及びMgCl₂を添加することによって調節する。洗剤溶液のpHを、酸の添加により、所望の値に調節する。
試験材料に対する規約反射率（Ｒ）の測定を、Elrepho 2000光度計を用いて460nmで行なった（UVを伴わないで）。アパーチュア：10mM
ＸnMでの洗浄性能を下記のようにして計算する：

表VIから見出され得るように、本発明のSAVINASE^▲Ｒ▼の変異体は、洗浄能力における改良点を示す。
類似する洗浄アッセイにおいて、次のSAVINASE^▲Ｒ▼の変異体が、変異体Y167I＋R170LとY167A＋R170Sとの間の範囲において洗浄性能値を示した：
Y167P
Y167P＋R170L
Y167V＋R170T
Y167I＋R170T
Y167V＋R170Q
Y167S＋R170Q
Y167T＋R170N
Y167A＋R170A
Y167T＋R170L
Y167T＋R170A
Y167P＋R170S。
例４．酵素変異体を含んで成る洗剤組成物の洗浄性能：
次の例は、下記に示される条件下で行なわれた多くの洗浄試験からの結果を提供する：
実験条件：

使用される洗剤は、単純モデルの配合物である。pHを、粉末洗剤の正常な範囲内にある10.5に調節する。モデル洗剤95の組成は次の通りである：
25％ STP（Na₅P₃O₁₀）
25％ Na₂S0₄
10％ Na₂SO₃
20％ LAS（Nansa 80S）
5.0％ 非イオン性テンシド（Dobanol 25-7）
5.0％ Na₂Si₂O₅
0.5％ カルボキシメチルセルロース（CMC）
9.5％ 水
水の硬度を、脱イオン水にCaCl₂及びMgCl₂（Ca²⁺：Mg²⁺＝２：１）を添加することによって調節した（また、Surfactonts in Consumer Product, - Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986を参照のこと）。洗剤溶液のpHを、HClの添加によりpH10.5に調節した。
試験材料に対する反射率（Ｒ）の測定を、Macbeth ColorEye 7000光度計（Macbeth, Division of Kollmorgen Instruments Corporation, Germany）を用いて、460nmで行なった。測定を、製造業者のプロトコールに従って行なった。
ズブチリシン309変異体の洗浄能力を、下記性能因子を計算することによって評価した：

本発明のズブチリシン309の変異体は、Savinase^▲Ｒ▼に比較して、すべて洗浄能力を改良した−Ｐ＞１。
変異体を、下記のように大文字により示される改良クラスに分ける：
クラスＡ：１＜Ｐ≦1.5
クラスＢ：1.5＜Ｐ≦２
クラスＣ：Ｐ＞２

例５．位置129，131，133及び／又は194における追加の修飾と組合された本発明の主要観点の変異体による比較発酵実験
Savinase^▲Ｒ▼の変異体Y167I＋R170L＋A194Pを、A194P置換を有さない変異体Y167I＋R170Lに、発酵実験において比較した。
両変異体を、pSX222発現ベクターバックグラウンドにクローン化し、そして10μｇ／mlのCAMを含む100mlのBPX培地において上記のようにして発酵せしめた。
５日間の発酵の後、1.5mlのBPX発酵培地を遠心分離し、そして上清液を、上記のようにしてタンパク質分解活性（KPNU）を測定するために使用した。
Y167I＋R170L＋A194P変異体を含む発酵培地は、Y167Ｉ＋R170L変異体を含む発酵培地に比較して、有意に高いレベルのタンパク質分解活性を有した。
両変異体は、同じ比活性を有する。
類似する結果が、変異体Y167A＋R170S＋A194P，Y167A＋R170L＋A194P及びY167A＋R170N＋A194Pにより、A194P突然変異を有さないそれらの対応する変異体に比較して、得られた。
さらに、類似する結果が、A133P，A133D，P129K及びP131H突然変異を有さないそれらの対応する変異体に比較して変異体A133P＋Y167A＋R170S，A133D＋Y167A＋R170S，P129K＋Y167A＋R170S及びP131H＋Y167A＋R170Sにより得られた。

Claims (11)

1. Ｂ．レンタス（Bacillus lentus）からのズブチリシン309の洗浄性能に比較して、洗剤中で改良された洗浄性能を有し、そして位置167及び170（BASBPN番号付けにおける）の両者に修飾を含んで成るズブチラーゼ309変異体の製造方法であって、
   ｉ）前記ズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列を含んで成る発現ベクターを構成し；
   ii）段階ｉ）の発現ベクターにより微生物宿主細胞を形質転換し；
   iii）段階ii）の宿主細胞を、前記変異体の発現及び分泌の助けとなる条件下で培養し；そして
   iv）前記変異体を回収することを含んで成り、
   前記修飾が、下記群（BASBPN番号付けにおける）：
   Y167A＋R170A,
   Y167A＋R170S,
   Y167A＋R170L,
   Y167A＋R170N,
   Y167S＋R170Q,
   Y167T＋R170N,
   Y167T＋R170A,
   Y167V＋R170T,
   Y167V＋R170Q,
   Y167P＋R170S,
   Y167P＋R170L,及び
   Y167I＋R170T
   から選択される、ことを特徴とする方法。
2. 前記変異体が、K27R、^*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、P129K、P131H、A133P、A133D、A194P、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L及びT274A（BASBPN番号付けにおける）から成る群から選択される変異を更に含む請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 前記修飾が、下記群：
   Y167A＋R170S＋A194P
   Y167A＋R170L＋A194P
   Y167A＋R170N＋A194P
   Y167A＋R170S＋P129K
   Y167A＋R170S＋P131H
   Y167A＋R170S＋A133P、及び
   Y167A＋R170S＋Al33D
   （BASBPN番号付けにおける）から選択される請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
4. 前記微生物宿主細胞が細菌である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか1項に記載の方法。
5. 前記細菌がバシラスである、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. 前記バシラスがバシラス・レンタスである、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 前記微生物宿主が真菌類又は酵母である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記真菌類が糸状菌である、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. 前記糸状菌がアスペルギラスである、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. 請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法により製造されるズブチラーゼ309変異体。
11. 洗濯及び／又は皿洗い洗剤への請求の範囲第10項に記載のズブチラーゼ309変異体の使用。

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