PT89702B - Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem - Google Patents
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Description
A presente invenção refere-se a no- ί vos enzimas proteolíticos com propriedades melhoradas para uso <
em detergentes. Estas propriedades abrangem uma maior capacidade i ~ \para a remoção de sujidade em detergentes para lavagem de roupa,i juma maior estabilidade em detergentes para lavagem de roupa du- ; ίrante o armazenamento e uma maior estabilidade das espumas obtidas com os detergentes.
Fundamento da Invenção
Tem sido amplamente documentado o uso de aditivos enzimáticos, em particular de enzimas proteolíticos, em composições detergentes de modo a permitir a remoção de suji’ί dades de natureza proteica. Veja-se por exemplo os registos de patente europeus (EP-A-) 0220921 e 0232269, as patentes U.S. N9s' ! 4,480,307 e Re 30,602 e o artigo Production of Microbial Enzymes, Microbial Technology, vol 1 (1979) 281-311, Academic Press.
As composições detergentes podem ter ia forma de um pó, de um liquido ou de uma pasta. Contêm um ou :mais compostos aniónicos, não iónicos, catiónicos, zuiteriõnicos ou anfotéricos como material detergente activo. Estes compostos encontram-se descritos em Surface Active Agents, vol. II de Schwartz, Perry e Berch, Interscience Publishers (1958). Alem ,disso, podem ainda conter agentes complexantes, compostos estabi. íjlizadores, fragrâncias e em alguns casos agentes oxidantes nor- j malmente designados por branqueadores. As composições detergen- > ítes aplicam-se na limpeza de superfícies duras, limpeza de sani->
' t !
Itãrios, lavagem de louça (automática ou manual) e lavagem de rouI iipa. '
I Os detergentes para lavagem de roupa idividem-se geralmente em dois tipos principais, líquidos e pós. 1 jOs detergentes líquidos para lavagem de roupa possuem uma eleva(da concentração de tensioactivos, pH neutro a moderadamente alcal jlino e não contêm geralmente agentes branqueadores. Os detergen-; j.tes em pó têm principalmente uma elevada alcalinidade (pH da es- j jipuma 9-11) , contêm agentes complexantes como tripolifosfato de ,1 sódio e, conforme os hábitos de lavagem dos países onde são co- I ímercializados, podem ou não conter agentes branqueadores.
Os enzimas correntemente usados em (composições detergentes adicionam-se em suspensão liquidas, em 1 'sole ou na forma de granulado. Por exemplo, em detergentes em pó ios enzimas proteolíticos encontram-se normalmente presentes numa;
' | R ' !; forma encapsulada tal como prills (p.ex. de Maxatase ou Maxa-i L R RR lícal ) ou granulados (p.ex. de Savinase e Alcalase ). Os produ|tos Maxatase e Maxacal são comercializados por International Bio p-Synthetics B.V. (Rijswijk, Holanda), Savinase e Alcalase por
/NOVO Industri A/S (Bagsvaerd, Dinamarca). Em detergentes líquiI dos para lavagem de roupa os enzimas encontram-se presentes prin: cipalmente em solução.
/ Os enzimas proteolíticos são geralJmente difíceis de combinar com composições detergentes. Devem Lser estáveis e activos durante a aplicação, por exemplo na remoIção de nódoas de natureza proteica dos tecidos durante a lavagem' ! a temperaturas de cerca de 109 C até mais de 609 C. Além disso, devem ser estáveis por períodos de tempo longos durante a armaze | nagem do produto detergente. Consequentemente, os enzimas devem ser estáveis e funcionais na presença de agentes complexantes, ί l itensioactivos, em meio fortemente alcalino, em alguns casos na {presença de branqueadores e a temperaturas elevadas. Como não jexistem nem detergentes para lavagem de roupa universais nem con | dições de lavagem universais (pH, temperatura, concentração de í espuma, dureza da água) que sejam usados em todo o mundo, as ca-: practerísticas desejadas para os enzimas podem variar conforme o | (tipo de detergente em que se emprega e das condições de lavagem.' j As condições que governam a estabili.) (idade dos enzimas em detergentes em pó não são geralmente óptimas. ;Por exemplo, durante o armazenamento de preparações de enzimas j ~ I em detergentes em po, apesar da aparente separação física do en-( (zima e da matriz detergente por encapsulação do enzima, os agen-’ ; ί ι tes oxidantes do detergente afectam a protease e reduzem a sua ( jactividade. Uma outra causa de instabilidade do enzima em deter-( 1’gentes em pó durante o armazenamento ê a autodigestão, especial(lmente em condições de humidade relativa elevadas. i | Alêmdisso, os agentes oxidantes mui-(
Itas vezes presentes em detergentes em pó são um obstáculo impor — ~ — 1 ' tante a eficiente remoção de sujidade durante a aplicação em la(vagem de roupa devido à fixação de impurezas proteicas aos tecidos. Além disso, estes agentes oxidantes e outros componentes dos jdetergentes, como os agentes complexantes, reduzem a eficiência j!da protease na remoção da sujidade durante o processo de lavagem..
Em detergentes líquidos verificou-se( j que um problema importante ê a rápida inactivação dos enzimas, (especíalmente a temperaturas elevadas. Como os enzimas se encon3 tram em solução no detergente, esta inactivaçao ocorre logo no I /detergente durante as condições normais de armazenamento e reduz1 ί, ij consideravelmente a actividade dos enzimas antes de se chegar a j.! utilizar o produto. Em particular, os tensioactivos aniõnicos, I j tais como os sulfatos de alquilo, em combinação com água e outro^ [componentes, tendem a desnaturar irreversivelmente o enzima e a j ftornã-lo inactivo ou susceptível à degradação proteolitica.
! i !i Encontram-se soluções parciais para j íos problemas de estabilidade dos enzimas em detergentes líquidos) em adaptações da formulação de detergentes líquidos, tais como o! uso de agentes estabilizadores para reduzir a inactivaçao dos eni 'jzimas. Veja-se EP-A-0126505 e EP-A-0199405, patente U.S. n°. j4,318,818 e registo de patente U.K. n9. 2178055A. 1 j Outra tentativa para conseguir a es-1 |, i
Ltabilidade dos enzimas em detergentes líquidos encontra-se desi crita na EP-A-0238216, em que se procede ã separação física entre as moléculas de enzima e a matriz detergente líquida hostil i 'por meio da tecnologia de formulação. Em detergentes em pó têm hsido propostos encapsulados alternativos; veja-se p.ex. EP-A;[oi7O36O. ;
No que se referiu anteriormente resu mem-se as condições necessárias para o funcionamento óptimo dos enzimas de detergentes proteolíticos, bem como as limitações dos enzimas normalmente disponíveis para utilização em composições I detergentes. Apesar dos esforços para garantir a estabilidade do j enzima em composições detergentes, ainda se verifica uma substan jjlcial perda de actividade nas condições normais de armazenamento j e utilização. !
~ i
A identificação e isolamento de no- 1
I ~ 1 vos enzimas para determinadas aplicações pretendidas, tais como j o uso em detergentes, pode levar-se a cabo de várias maneiras. j |Um processo ê a selecção de organismos ou microorganismos que I ί ' possuam a actividade enzimatica desejada, isolando e purificando! o enzima a partir do (micro)organismo ou de uma camada sobrenadante de cultura do referido (micro)organismo, determinando as suas propriedades bioquímicas e verificando se essas propriedajdes bioquímicas correspondem às necessidades da aplicação. Se o enzima identificado não se puder obter a partir do organismo na-j tural que o produz, podem usar-se técnicas de DNA recombinante para isolar o gene que codifica o enzima, expressar o gene em ou tros organismos, isolar e purificar o enzima expresso e testar se ele é adequado à aplicação em vista.
Uma outra maneira de obter novos enzimas para uma determinada aplicação é a modificação de enzimas existentes. Tal pode conseguir-se inter alia por métodos de modi_ ficação química (vide I. Svendsen, Carlsberg Res. Commun. 44 (1976), 237-291). Em geral estes métodos são demasiado pouco específicos pois modificam todos os resíduos acessíveis com cadeias 'laterais comuns, ou dependem da presença de aminoácidos adequados a modificar, e são muitas vezes incapazes de modificar amino ácidos difíceis de alcançar, a não ser que a molécula de enzima seja desdobrada. Por isso, pensa-se que o método de modificação do enzima por meio de mutagêrese do gene codificante seja superior .
A mutagêrese pode ef'ectuar-se de modo aleatório ou de modo dirigido. A mutagenese aleatória, por tratamento de um microorganismo total com um mutagénico químico ou com uma radiação mutagenizante pode dar evidentemente origem a enzimas modificados. Neste caso deve dispôr-se de regras de se lecção apertadas para identificar os mutantes extremamente raros que possuem as propriedades desejadas. Pode obter-se uma maior probabilidade de isolamento de enzimas mutantes por mutagenese aleatória, apôs clonagem do gene codificante, mutagenizando-o in vitro ou in vivo e expressando o enzima codificado por reclonagem do gene mutacionado numa'célula hospedeira adequada. Também neste caso ê necessário dispor de regras de selecção biológica adequadas para seleccionar os enzimas mutantes desejados; vide registo de patente internacional WO 87/05050. Estes processos de selecção biológicos não seleccionam especificamente enzimas adequados para aplicação em detergentes.
O método mais específico para obter enzimas modificados é por mutagenese dirigida, permitindo a sub£> tituição especifica de um ou mais aminoácidos por qualquer outro aminoãcido pretendido. A EP-A-0130756 exemplifica o uso desta técnica para gerar genes de protease rautantes que se podem exprij mir para obter enzimas proteoliticos modificados. !
Recentemente, demonstrou-se o poten-J ;ciai da mutagênese dirigida por oligonucleõtidos, através do uso de oligonucleoótidos mutagénicos sintetizados de modo a conterem misturas de bases em várias posições dentro de uma determinada sequência. Isto permite introduzir várias mutações diferentes nu ma região especifica de uma sequência de DNA usando uma única preparação de oligonucleõtidos sintéticos, como exemplificado j por Hui et al. , EMBO J. 3. (1984) 623-629; Matteucci et al. , NuclÍ ΙAcids Res. 11 (1983) 3113-3121; Murphy et al., Nucl. Acids Res.
:11 (1983) 7695-7700; Wells et al., Gene 34_ (1985) 315-323; Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 710-714 e ; F.M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Greene Publishers Association e Wiley, InterScience, 1987.
! Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244 ! (1969) 5333-5338, tinha já descoberto que a metionina na posição í221 da subtilisina de Carlsberg se pode oxidar por meio de H2°2 ja sulfóxido de metionina o que conduz a uma diminuição drástica i
Ide actividade.
i
Em consequência de ambos os métodos de mutagênese, aleatória e dirigida, para a geração de enzimas modificados, isolaram-se e caracterizaram-se mutantes derivados da serina protease do Bacillus amyloliguefaciens, também chamados subtilisina BPN’ . Na WO 87/05050 descreve-se também um mu tante subtilisina BPN' com uma maior estabilidade térmica. Na EP-A-0130756 refere-se que a mutagênese dirigida da metionina na posição 222 na subtilisina BPN' por todos os 19 aminoácidos possíveis, usando o método designado por mutagênese de cassete, pode conduzir a enzimas resistentes ã oxidação por Η2Ο2· No ulti. mo caso, contudo, a maior parte dos mutantes apresentavam uma baixa actividade proteolítica. Osmelhores mutantes encontrados foram ο M222A e o M222S, que tinham actividades específicas de 53% e 35%, respectivamente, comparados com a subtilisina BPN' na tiva; vide Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521.
Trabalhos anteriores sobre a geração de proteases modificadas mostraram que se podem obter mutantes
| de subtilisina BPN1 com diferentes propriedades de estabilidade í I e diferentes propriedades cinéticas; vide literatura acima refe-!
rida e outras referências, por exemplo Rao et al., Nature 328 I (1987) 551-554, Bryan et al., Proteins 1 (1986) 326-334, Cunnin-i Jgham e Wells, Protein Engineering .1 (1987) 319-325, Russell et ! al. , J. Mol. Biol. 193 (1987) 803-819, Katze Kossiakoff, J. Biol! Jchem. 261 (1986) 15480-15485, e os artigos de revisão de Shaw, j j Biochem. J. 246 (1987) 1-17 e Gait et al., Protein Engineering li |(1987) 267-274. Contudo, nenhuma destas referências levou à proj duçao industrial de enzimas proteoliticos com maior capacidade 'de lavagem e melhor estabilidade em detergentes para lavagem de roupa. Nenhuma destas proteases modificadas se revelara de inte, resse comercial nem superior aos enzimas detergentes presentemen ! te usados em condições de aplicação relevantes.
SUMÃRIO DA INVENÇÃO
I
Num dos seus aspectos, a presente in j venção refere-se a novos enzimas proteõliticos mutantes, obtidos j por expressão de genes que os codificam, possuindo sequências de [aminoácidos que diferem pelo menos em um aminoácido dos enzimas [ nativos correspondentes. Estes enzimas mutantes..apresentam pro[priedades melhoradas para aplicação em detergentes, especialmenI [te em detergentes para lavagem de roupa. Um modo de concretização preferencial da invenção é constituído por mutantes da PB92 serina protease.
Um dos outros aspectos da invenção irefere-se a novos detergentes enzimãticos, contendo um produto Jenzimãtico proteolítico que contêm pelo menos um dos novos enzimas proteolíticos mutantes referidos.
Um outro aspecto desta invenção refe ί _ ire-se a um sistema teste, que possibilita uma selecção eficiente dos enzimas proteolíticos mutantes com propriedades melhoradas para aplicação em detergentes para lavagem de roupa de entre vá!rios outros enzimas. Tais enzimas preparam-se por expressão de genes de protease mutagenizados.
j: Estes e outros aspectos da invenção ;
I ' ij serão desenvolvidos na descrição detalhada que se segue. j ! BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS ' i I j,' A Figura IA mostra a construção do ;
lvector de mutação que contêm o gene de protease PB9 2. ;
j A Figura 1B mostra esquematicamente >
jo processo de mutação utilizado.
! A Figura IC mostra a construção de [um vector de expressão contendo um gene de protease PB92 mutante, j As Figuras 2A, 2B e 3 mostram a capa ji cidade de lavagem em função da actividade proteolitica específi-j [ca de vários mutantes de protease PB92 em diferentes condições | de lavagem.
í!
I A Figura 4 apresenta a sequência de nucleõtidos do gene de protease PB92 e a sequência de aminoãcidos do enzima precursor codificado.
i
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO , _ - ι j A expressão tendo propriedades me- j ;lhoradas usada nesta especificação em relação a enzimas proteo )líticos mutantes designa enzimas proteoliticos com melhor capacidade de lavagem ou melhor estabilidade com a mesma capacidade de lavagem, em relação à protease nativa correspondente.
í · ..
i 0 termo capacidade de lavagem dos
I enzimas proteoliticos mutantes define-se nesta especificação como a contribuição de um enzima proteolítico mutante na lavagem de roupa para além do efeito da composição detergente sem enzima em condições de lavagem relevantes.
O termo condições de lavagem relevantes usa-se para caracterizar as condições, em particular a temperatura de lavagem, o tempo, as condições mecânicas, a concentração de espuma, o tipo de detergente e a dureza da ãgua, efectivamente usadas no mercado de detergentes domésticos.
i| O termo capacidade de lavagem melhoí rada usa-se para indicar que se obtém um melhor resultado final· (na remoção de sujidade em condições de lavagem relevantes ou I ilque é necessário menos enzima proteolltico mutante, numa base j j| ponderai, para obter o mesmo resultado final em relação ao enzi-í
H ma nativo correspondente.
termo mesma capacidade de lavagem?
I usa-se para indicar que a capacidade de lavagem de um enzima pro! teolltico mutante, numa base ponderai, ê pelo menos 80% em rela-!
ção ã protease nativa correspondente em condições de lavagem re ilevantes.
; I
O termo maior estabilidade usa-se j |para indicar uma melhor estabilidade dos enzimas proteollticos jmutantes em detergentes para lavagem de roupa durante o armazena! Jmento e/ou a sua estabilidade na espuma, que inclui estabilidade ί em relação a agentes oxidantes, agentes complexantes, autõlise, tensioactivos e meio altamente alcalino, comparado com o enzima nativo correspondente.
As propriedades bioquímicas determi| nadas em condições laboratoriais bem definidas não são parâmetros ι
ifiaveis para prever a capacidade de uma determinada protease detergente nas condições de aplicação especificas pretendidas. Es-j tes parâmetros incluem dados cinético.-; medidos em substratos bem definidos, tais como proteinas como a caseína, dimetilcaselna e hemoglobina, ou substratos oligopeptrdicos substituídos como
I sAAPFpNA (succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenilalanil-para -nitroanilida). Hâ aparentemente outras características das proteases que determinam a sua eficiência na lavagem de roupa.
A presente invenção baseia-se na des coberta de que embora se disponham de métodos para a introdução de alterações de aminoãcidos em proteinas, que podem alterar apre ciavelmente as suas características bioquímicas, a previsão do efeito das mutações especificas nas condições reais de aplicação ê ainda muito pobre ou mesmo impossível.
De acordo com a presente invenção, descobriu-se então um método, após investigação e experimentação exaustivas, que combina a preparação de proteases mutantes com
um processo eficiente de selecção da capacidade destas proteases iÉ surpreendente que se possa seieccionar eficientemente um largo número de enzimas, deste modo, para aplicação.
sistema teste de acordo com a injvenção baseia-se na remoção de sujidades sensíveis à protease de amostras numa máquina de lavar ou num tergotõmetro em condições de lavagem relevantes simuladas. As amostras (swatches) adequa das para teste são, por exemplo, as amostras EMPA disponíveis no mercado (EidgenÕssische Material Prúfungs und Versuch Anstalt, 'St. Gallen, Suiça), sujas artificialmente com impurezas proteina ceas. As sujidades relevantes para teste são sangue, relva, chocolate e outras sujidades proteinãceas.
Além disso, podem controlar-se neste sistema teste outros factores relevantes, como a composição do detergente, a concentração, de espuma, a dureza da ãgua, a mecâni ca da lavagem, o tempo, o pH e a temperatura, simulando as condi^ ções típicas para aplicação doméstica dos detergentes comerciais
A capacidade de lavagem das proteases pode medir-se convenientemente pela sua capacidade para remo !ver certas sujidades representativas em condiçoes de teste aproipriadas. Esta capacidade pode determinar-se convenientemente por meio de medidas de reflectância nos tecidos testados, após lavagem com e sem enzimas, num launderómetro ou num tergotõmetro. A aplicação laboratorial do sistema teste de acordo com a invenção é representativa para a aplicação doméstica quando efectuada com enzimas proteolíticos modificados por meio de nutagênese de DNA.
Deste modo, a invenção permite o ensaio de grandes quantidades de enzimas diferentes e a selecção dos enzimas que sejam particularmente adequados para um tipo específico de aplicação do detergente. Deste modo, podem facilmente seleccionar-se enzimas feitos por medida para condições de aplicação específicas.
Algumas proteases de serina bactéria nas designam-se como subtilisinas. As subtilisinas compreendem as serina proteases do Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens (subtilisina BPN’ ) e Bacillus licheniformis (subtilisi_ na de Carlsberg). Veja-se o artigo de revisão de Markland e jSmith (1971) em The Enzymes (Boyer, ed.) vol. 3, 561-608, Acaidemic Press, New York. As estirpes de Bacillus tais como as estirpes de Bacillus alcalofílicas produzem outras proteases. Exern.
:pios desta última categoria são as serina proteases de Maxacal, jtambém designadas por protease PB92 (do Bacillus nov. spec. PB92) e de Savinase, acima mencionadas. A Figura 4 mostra a sequência jde aminoácidos da protease PB92. A protease madura ê constituída por 269 aminoácidos representando um peso molecular de cerca de j27000 D e possui um ponto iso-eléctrico numa zona altamente alca: lina. A actividade em substrato proteico da protease PB92 expri-: ime-se em unidades Delft alcalinas (ADU). A actividade em ADU de-!
I termina-se de acordo com o método descrito no registo de patente britânico n9. 1,353,317, exceptuando o pH que se variou de 8,5 'para 10,0. A protease PB92 purificada tem uma actividade de j21000 ADU por mg. A frequência (k , ) medida em caseína ê 90 I _ Cdt sec
A actividade específica das prepara-J ções purificadas de subtilisina de Carlsberg (Delange e Smith, !
í ;J. Biol. Chem. 243 (1968) 2184), e de 10000 ADU/mg e a da subti-] lisina BPN' (Matsubara et al., J. Biol. Chem. 240 (1965) 1125) éj de 7000 ADU/mg. Para além dos parâmetros acima mencionados tais j como a actividade específica e a frequência (k ), a protease ; PB92 distingue-se das proteases como a subtilisina de Carlsberg,ί a subtilisina BPN' e outras proteases formuladas em detergentes ] (por exemplo Maxatase and Alcalase) por ter uma carga positiva ] elevada, que se pode visualizar por electroforese de gel da pro-i teína nativa como descrito a seguir na parte experimental 4. i i
Uma vez que a protease PB92 ê activaj na remoção de sujidade a valores de pH alcalinos, utiliza-se cori rentemente como aditivo de detergentes, em conjunto com outros ! ingredientes do detergente tais como tensioactivos e agentes oxij dantes. Estes últimos usam-se principalmente na forma de pós. A i protease PB92 possui uma elevada capacidade de remoção de sujidai de comparada com outras proteases, como as subtilisinas acima j mencionadas. Isto significa que é necessário menos protease PB92| í
para obter os mesmos resultados de lavagem. !
A sensibilidade ã oxidação é um in11
!conveniente importante da protease PB92 e de todas as outras serina proteases conhecidas usadas para aplicação em detergentes í j (vide também Stauffer et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 5333‘-5338; Estell et al., J. Biol. Chem. 263 (1985) 6518-6521). A ;oxidação da protease PB92 quer por 9uer Por Peracidos gera-!
dos pelo sistema activador, contendo tetrahidrato de perborato e! jTAED, dá origem a um enzima com uma actividade específica de 50%^ e 10%, respectivamente, em ADU/mg, comparado com a protease PB92! jnão oxidada (vide parte experimental 7 e exemplo 1).
método de acordo com a presente in venção ê extremamente adequado para a preparação, screening e ' •selecção dos enzimas proteoliticos mutantes derivados das serina’
I ~ 1
Iproteases naturais de origem bacterianas. Esses mutantes sao, i ,por exemplo, os codificados por um gene derivado de um gene natij
Ivo de uma estirpe de Bacillus alcalofílica e, de preferência, i _ :PB92. Também são adequados os mutantes derivados de Savinase, uma serina protease de Bacillus alcalofílica. O método pode ainda ί usar-se com vantagem para a selecção de proteases modificadas dej !rivadas de proteases que não sejam a serina protease de estirpes! jde Bacillus alcalofílicas PB92. Por exemplo, conhecem-se os genes que codificam as serina proteases de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens e Bacillus licheni formis, podendo usar' ; ,. j j-se como substratos para mutagénese. É evidente que se pode uti-!
jlizar tanto mutagénese dirigida por oligonucleótidos como mutagê i ~ .
nese aleatória regional, ou qualquer outro método adequado, para gerar eficientemente mutações no gene de protease. j método de selecção de enzimas proteolíticos mutantes, de acordo com a presente invenção (que inclui a preparação e o screening) compreende os seguintes pas- j ί sos: mutagenização de um gene clonado que codifica um enzima pro' teolítico de interesse ou um seu fragmento; isolamento do gene : ou genes de protease mutante obtidos; introdução do gene ou ge- j nes de protease mutante referidos, de preferência num vector ade, jquado, numa estirpe hospedeira adequada para expressão e produ- | ção; recuperação da protease mutante produzida; e identificação das proteases mutantes, que tenham propriedades melhoradas para aplicação em detergentes.
} Estirpes hospedeiras adequadas para a produção de proteases mutantes incluem microorganismos trans- : jformáveis nos quais se pode levar a cabo a expressão da protease. JEspecificamente, são adequadas as estirpes hospedeiras da mesma !
espécie ou género daquelas de que a protease deriva, tais como uma estirpe de Bacillus, de preferência uma estirpe de Bacillus j alcalofilica e muito preferencialmente Bacillus nov. spec. PB92 ; ! ou um mutante desta que tenha substancialmente as mesmas propriei jdades. As estirpes B. subtilis, B. Licheniformis e B. amyloligue’ j: faciens encontram-se também entre as estirpes preferidas. Outras: i estirpes hospedeiras adequadas e preferidas são aquelas que são :
I ;
j substancialmente incapazes de produzir enzimas proteolíticos ex-j tracelulares antes da transformação com um gene mutante. São de j interesse particular as estirpes hospedeiras de Bacillus defici-i entes em protease, tais como o derivado de Bacillus nov. spec. i
QPB92 deficiente em protease. A expressão das proteases obtêm-se ίusando sinais de expressão que funcionem no organismo hospedeiro seleccionado. Os sinais de expressão são sequências de DNA que !
; ~ ~ ‘ ί 'regulam a transcripção e a translacção de genes de protease. Os : vectores apropriados são capazes de replicar com um numero de có ppias suficientemente elevado na estirpe hospedeira escolhida ou , permitem uma manutenção estável do gene de protease na estirpe 1 Jihospedeira por integração cromossomal.
J Os enzimas proteolíticos mutantes de acordo com a invenção preparam-se por cultura, em condições de i jfermentação apropriadas, de uma estirpe hospedeira transformada j
Ι, contendo o gene ou genes proteolíticos mutantes desejados, seguin j!do de recuperação dos enzimas produzidos. j j* De preferência, as proteases a expri!
!
ímir segregam-se no meio de cultura, o que facilita a sua recupe-i ; ração, ou no caso de estirpes hospedeiras bacterianas gram nega-i ! tivas no espaço periplãsmico. Para a secreção emprega-se uma se-í Λ I quencia de sinal aminoterminal adequada, de preferência a sequên cia de sinal codificada pelo gene original se este for funcional na estirpe hospedeira escolhida.
ί De acordo com um dos aspectos desta invenção podem desenvolver-se testes de capacidade de lavagem
iadequados que sejam representativos para todas as condições de (lavagem doméstica que existam no mercado. Por exemplo, desenvolveu-se um teste adequado para o exigente mercado europeu de de( tergentes em pó, em que se usam detergentes em põ que podem conjter ou não agentes branqueadores a concentrações de espuma de . 1-10 g de detergente/1 a 10-209GH (dureza alemã) a temperaturas entre 25-809 C. Mais especificamente, usou-se um detergente em ipõ contendo TAED e perborato a uma concentração de 4,7 ou 10 g de detergente/1 a 159GH a 409 C.
í
Referem-se também testes representaj (tivos para lavagem com detergentes líquidos. Estes detergentes usam-se normalmente a concentrações de espuma de 1,5-5 g de deItergente/1 a 5-159GH a temperaturas entre 15 e 409 C. Mais espe(cificamente, usaram-se composições de detergente liquido sem (branqueador a uma concentração de 1,5 g de detergente/1, 59GH a (259 C e 409 C, correspondentes às condições de detergente líqui-:
; do nos Estados Unidos, e a uma concentração de 5 g de detergeni _ ~ · i ;te/l, 159GH e 409 C, correspondentes ãs condiçoes de detergente ; liquido europeias.
J Podem desenvolver-se testes de capapcidade adequados para outras condições do mercado. Amostras tes(te sujas com impurezas sensíveis às proteases, em particular amos (tras sujas com sangue, relva, chocolate e outras sujidades pro(teicas, mais especificamente amostras teste EMPA 116 e 117, têm isido utilizadas em testes de capacidade de lavagem representativos.
! As propriedades das proteases deterIgentes naturalmente ocorrentes ou naturalmente mutacionadas pojdem ser aumentadas por introdução de uma grande variedade de mutações no enzima. Para a maior parte dos casos, as mutações sejrão substituições, quer conservativas quer não conservativas, po !dendo contudo encontrar-se também eliminações e inserções.
| No caso das substituições conservati/ jvas pode utilizar-se a tabela seguinte: ,
Alifãticos neutros não polares G, A, P L, I, V polares C, M, S, T
N, Q carregados aniõnicos D, E catiõnicos K, R
Aromáticos
F, H, W, Y em que qualquer aminoâcido pode ser substituído por qualquer outro aminoâcido da mesma categoria, particularmente da mesma linha. Além disso, os aminoácidos polares N, Q podem substituir ou ser substituídos pelos aminoácidos carregados. Para os objectiivos da presente invenção são de interesse particular as substituições que conduzem a um aumento do caracter aniõnico da protea; se, particularmente em locais não envolvidos directamente no ceni
Jtro activo. ( ί Regiões de interesse particular para (mutação são os aminoácidos situados a uma distância de até 4 1 ( jda molécula inibidora Eglin C, quando Eglin C se encontra ligada hao centro activo. j | A numeração seguinte baseia-se na 'protease PB92, mas as considerações são relevantes para outras j I serina proteases com uma estrutura substancialmente homóloga, em' particular para aquelas que tenham uma homologia superior a cer-i Ica de 70%, mais especialmente com uma homologia superior a 90%. | (Estas posições são 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216, es-j ίtando a maior parte destas posições disponíveis para interacção ! jdirecta com um substrato proteico. Normalmente não se substituem as posições 32, 62, 153 e 215 uma vez que as mutações nestas pojsições tendem a degradar a capacidade de lavagem.
! As posições para substituição de in15
iteresse particular são 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, /150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 e 213-216. Em algumas poJsições haverá a tendência de substituir um aminoácido instável, í _ ’por exemplo metionina, por um aminoácido mais estável em relação, j'à oxidação, por exemplo treonina, mantendo contudo a conformação I geral e o volume do aminoácido nessa posição. Noutras situações,!
' verificou-se que substituindo o aminoácido natural por quase ί
qualquer outro aminoácido se podem obter melhores resultados, em ί ~ ; particular quando se substituem os aminoácidos hidroxilados S, T ,ípor um aminoácido polar ou não polar ou mesmo por um aminoácido ι
I : ! aromático.
As substituições com interesse parti j cular, são as seguintes: j
ÍG116 I, V, L l·
HS126 qualquer aminoácido i j P127 qualquer aminoácido
I j I
S128 qualquer aminoácido j jS160 alifático aniónico ou neutro ou R í
ÍA166 carregado, em particular aniónico ' 'M169 alifático neutro, de preferência não polar :|M212 aniónico í ljM216 polar alifático, em particular S, T, N, Q. . í] !
i Surpreendentemente, enquanto que mu_i tas das mutações conduzem a uma diminuição da actividade especi-j ι
fica da protease com substratos comuns, a capacidade de lavagem : jj mantém-se ou aumenta em relação â do enzima natural e, em muitos j lj casos, verifica-se uma maior estabilidade na armazenagem.
jí j
I A capacidade de lavagem de algumas :
! íjdas proteases mutantes de PB92, quando expressa como o valor injverso da quantidade relativa de enzima necessária para obter o j mesmo efeito das proteases nativas x 100%, aumenta em mais de í | 120%, em alguns casos mesmo em mais de 180%. ι j De acordo com um outro aspecto desta j invenção referem-se proteases mutantes de PB92 que apresentam • :uma maior estabilidade no armazenamento numa composição detergen . ι te em pó contendo agente branqueador do que a da protease PB92
nativa, mantendo contudo a mesma capacidade de lavagem. Exemplos; •destes mutantes são o M216S e o M216Q e os mutantes que tenham pelo menos uma destas mutações para além de mutações em outros locais.
De acordo ainda com um outro aspecto; da invenção, descobriu-se surpreendentemente que numa composição; detergente líquida para lavagem de roupa (não contendo agentes oxidantes), as proteases mutantes de PB92 M216S, M216Q, S160D e N212D mantêm a sua actividade melhor do que a protease PB92. Des' tes mutantes, o M216S e o M216Q mantiveram a sua capacidade de lavagem e o S160D e o N212D melhoraram-na. A melhoria da estabilidade no armazenamento no detergente líquido testado ê mais pro nunciada para os mutantes S160D e M216Q.
Ê também possível combinar várias mu tações que aumentem a estabilidade de uma protease em composições detergentes. Podem combinar-se várias mutações, que influen ciem positivamente a capacidade de lavagem das mesmas proteases, num único gene de protease mutante, possibilitando assim eventualmente a produção de outras proteases melhoradas, por exemplo ^S126M, P127A, S128G, S160D7 e /0116V, S126N, P127S, S128A, S160D/. Podem preparar-se novos mutantes de protease combinados as propriedades de boa capacidade de lavagem de, por exemplo, N212D e S160D com as propriedades de estabilidade de, por exemplo, M216S e M216Q. 0 mutante /S160D, M216S/7 por exemplo, apresenta uma melhor capacidade de lavagem e uma maior estabilidade no armazenamento.
Podem também preparar-se mutantes úteis combinando quaisquer mutações ou conjuntos de mutações des; critos nesta especificação. Além disso, é possível combinar as mutações úteis aqui descritas com mutações noutras posições, que podem ou não causar uma mudança substancial nas propriedades do enzima.
Os modos de concretização preferenc_i ais da presente invenção são os seguintes mutantes da protease PB92: /M216S/; /M216Q/; /N212D/; /S160D/; /S160G, N212D/; /S160D, M216Q7; /S160D, M216S/; /M66D, M169I/; /G116V, S126V, P127E, S128K/; /G116V, S126G, P127Q, S128I/; /GllôV, S126L, P127N,
:S128V/; /G116V, S126L, P127Q, S128A7; /G116V, S126V, Ρ127Μ/;
L/G116V, S126H, Ρ127Υ7; /G116V, S126R, P127S, S128P/; /G116V, [S126F, P127Q7; /G116V, S126F, P127L, S128T/; /S126M, Ρ127Α, S128G7; I /S126M, Ρ127Α, S128G, S160D/; e /G116V, S126N, P127S, S128A, |si60D/.
Para ilustrar o significado dos méto [dos utilizados nesta invenção para obter novas proteases adequai __ · das para aplicaçao em detergentes para lavagem de roupa, i.e.
, usando testes representativos de aplicação em lavandaria como primeiro critério de selecção, compararam-se os resultados dos testes de capacidade de lavagem de proteases mutantes de PB92 j com parâmetros bioquímicos determinados em geral na investigação[ jbioquímica e enzimológica de proteínas. Estes resultados permiptem concluir que não hã qualquer relação entre os parâmetros que, ! determinam a afinidade para determinados substratos e a cinética! Jda reacção proteolítica e a capacidade de lavagem (ver Tabela 1 j'do exemplo 1) . í
Deste modo, ê também evidentemente !
í possível combinar dois ou mais mutantes com propriedades diferen;
ítes num produto enzimãtico ou no mesmo processo de lavagem. Tal í ;
jcombinação pode ou não ter um efeito sinergístico. !
A invenção refere-se também ao uso de um ou mais enzimas proteolíticos mutantes, como definido ante riormente, numa composição detergente ou num processo de lavagem.:
| Finalmente, serã evidente que, por , [meio de eliminações ou inserções de aminoácidos na cadeia poli- í peptídica da protease, quer criados artificialmente por mutagênej se quer ocorrendo naturalmente em proteases homólogas â protease' 'PB92, poderã ocorrer uma variação na numeração dos aminoácidos. [ [Contudo, deve entender-se que as posições homólogas ãs posições : dos aminoãcidos da protease PB92 estarão ainda no âmbito desta invenção.
Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção sem a limitarem.
PARTE EXPERIMENTAL
Materiais e métodos ι
Construção de mutantes de protease PB92 j A construção básica da qual se parte ; para o trabalho de mutagênese, designa-se por pM58 e encontra-se
Jdescrita em pormenor na EP-A-0283075.
l ι A estratégica seguida compreende três i
I fases:
[a. Construção do vector de mutagênese M13M1 |b. Processo de mutação i c. Construção de pM58&Eco e subclonagem do fragmento de DNA muta H do neste vector.
ΐ. 1.a. Construção do vector de mutagênese M13M1 j' Digeriu-se a construção básica pM58 , com os enzimas de restrição Hpal e Bali. Purificou-se o fragmento de 1400 bp (pares de bases) contendo o gene de protease PB92 [
| em agarose de baixo ponto de fusão (Maniatis, Molecular Cloning,
I I iA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).
I J j Digeriu-se o vector M13MP11 (Messing iet al., Nucl. Acido Res. % (1981) 303-321) con Smal . Ligou-se o !fragmento de DNA de 1400 bp em questão com este vector e transJfectou-se para E. coli JM101 de acordo com os processos descriÍjtos por Cohen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 , (1972) 2110ji —2114.
ί . - _ !
j! Apos propagaçao de fogos em E. coli
JjMlOl, isolou-se o ssDNA (DNA de cadeia simples)(Heidecker et al., ÍjGene 10 , (1980) 69-73), testou-se a inserção e a sua orientação j por sequenciação de DNA usando o método descrito por Sanger, PRoc.
ÍNatl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463. ;
! i | Obteve-se o vector adequado para a j íjmutagênese e designou-se por M13M1. O processo acima descrito re ( ipresenta-se esquematicamente na Figura IA. !
1.b. Processos de mutação
Efectuou-se a mutagênese no M13M1 usando ssDNA deste vector e dsDNA de M13mpl9 (Messing et al., Nucleic Acids Res. 9_, (1988) 303-321), tendo-se digerido o último vector com os enzimas de restrição EcoRI e HindIII, seguido ipor purificação do fragmento maior em agarose de baixo ponto de fusão.
Efectuou-se a mutagênese como descrig to por Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12, (1984) 9441-9456 com a modificação de se ter usado E. coli JM105 em vez de E. coli WK30-3 para seleccionar os mutantes.
I comprimento dos oligonucleótidos ' utilizados para criar as mutações específicas era de 22 nucleóti.
dos. A mutação especifica local usada para criar várias mutações ao mesmo tempo numa sequência de DNA específica, efectuou-se usan ^do uma preparação de oligonucleótidos com um comprimento de 40 inucleótidos com os quatro nucleõtidos incorporados aleatoriamen-i 11 ~ _ i í'te nas posiçoes correspondentes ao aminoacido, ou aminoácidos, al ι; ι
Ímutacionar. i
Após a mutagênese testaram-se os mu— ~ i tantes potenciais em relaçao a presença da mutaçao pretendida, < |'por análise de sequência usando o método dideoxi de Sanger, vide acima. Sequenciou-se o passo completo de cadeia simples (ver Fi-ι ; ~ _ í •gura 1B) para testar a ausência de mutações secundarias. O proces !so apresenta-se esquematicamente na Figura 1B. !
O processo descrito ê útil para ge•rar fragmentos de DNA com mutações na região 3’ do gene de protease (aminoácidos 154-269).
ι í Ê evidente, para os especialistas nes: ta matéria, que para gerar fragmentos de DNA com mutações na região 5' do gene de protease num vector de Bacillus, se podem usar enzimas de restrição alternativos, podendo construir-se genes de proteases de PB92 modificados, de modo analogo ao método ι
da Figura ΙΑ. l
ί’ 1.c. Construção de pM58t>Eco e subclonagem de fragmentos de DNA
I, contendo as mutações neste vector (Fig. IC) j Para construir pM58$Eco, digeriu-se
JpM58 com o enzima de restrição EcoRI e ligou-se com ligase T4 em [meio diluído. Usou-se a mistura de ligação para transformar B. jsubtilis 1-A40 (Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio) de acordo jj com o método de Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746. I Colocaram-se as células da mistura
I de transformação em microplacas contendo 20 ^ag/ml de neomicina, jcomo descrito no exemplo 1 da EP-A-0283075. !
Isolou-se o DNA plasmídeo dos transformantes de acordo com o método descrito por Birnboim e Doly, jNucleic Acids Res. 7. (1979) 1513-1523 e caracterizou-se por anã-í | lise com enzimas de restrição. Isolou-se desta forma o pM58ÓEco : ; (ver Figura IC).
Para produzir o enzima mutante, subclonaram-se os fragmentos de DNA de M13M1 contendo as mutações i jídesejadas, gerados como descrito na secção l.b., no pM58É>Eco. Di' geriu-se o dsDNA de M13M1(acima descrito) com EcoRI e ligou-se na posição EcoRI do pM58&Eco. Usou-se a mistura de ligação para ;
jtransformar B. subtillis DB104, Doi, J. Bacteriol. (1984) 160,
Í442-444, usando o método de Spizizen et al., vide acima.
' Colocaram-se as células da mistura ide transformação em microplacas contendo 20 pg/ml de neomicina el j|0,4% de caseína (EP-A-028307 5) . Isolou-se o DNA dos transforman- ? I'tes produtores de protease, de acordo com o método descrito por ι [Birnboim e Doly (vide acima) e caracterizou-se por análise com í|enzimas de restrição. |
2. Produção de proteases mutantes í
Os transformantes de DB104 que se de terminaram como portadores do vector com o gene de protease mutaí [do, inocularam-se em 10 ml de Tryptone Soya Broth (TSB) contenj Ido 20 pg/ml de neomicina e incubaram-se durante 24 horas a 379C.[ Inocularam-se amostras desta cultura (0,1 ml) em balões de agitaj ção de 500 ml contendo 100 ml de meio de produção de protease:
| 12,5 g/1 de extracto de levedura (Difco) , 0,97g/l de CaC^.êí^O, (2,25 g/1 de MgCl^ôI^O, 20 mg/1 de MnSO4.4H2O, 1 mg/1 de CoCl^· p.óH^O, 0,5 g/1 de citrato, 0,5 ml/1 de antiespumante 5693, 6% ! peso/volume de maltose, 0,2 M de tampão fosfato a pH 6,8 e 20 j^ig/ml de neomicina.
{ Após incubação durante 65 horas sob arejamento constante, testou-se a actividade da protease das cul ;turas usando dimetilcaseína como substrato usando o método desJcrito por Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. Para | produzir maiores quantidades representativas de PB92 nativo e de jproteases de PB92 mutantes, promoveu-se também o crescimento des (tas estirpes a 379 C em fermentadores arejados de 10 1 de volume, l·ou mais, usando essencialmente o mesmo meio de produção usado j nos frascos agitadores.
! Os caldos obtidos usaram-se para a ι purificação das proteases. ί
I \3. Purificação e concentração da protease PB92 nativa e dos j i seus mutantes !
I Ϊ ι As proteases de PB92 mutantes e natij [vas, produzidas por Bacillus subtilis DB104 em frascos agitado’|res ou em fermentadores de 10 1, purificaram-se por cromatogra- , ___ -n na de permuta catiõnica usando discos ou cassetes de Zeta-Prep*' {(tipo PS, LKB). Centrifugou-se o caldo de cultura (3000xg, 10 ímin) e diluiu-se o sobrenadante 10 vezes com tampão de fosfato j *de sódio 10 mM a pH 5,5 e colocou-se em seguida no permutador ca jtiónico. Após lavagem com vários volumes (em relação ao enchimenj jto) de tampão de fosfato, eluiu-se a protease incluindo NaCl 0,4, |M no tampão de fosfato. Reuniram-se as fracções que revelaram ac: 'tividade de protease e concentraram-se por ultrafiltração usando juma célula Amicon com agitação equipada com um filtro PM-10. Reduziu-se a concentração de NaCl a aproximadamente 50 mM diluindo{ e concentrando a solução de protease com tampão de fosfato, após : ιo que se armazenou a -809 C com uma concentração de proteína en-j tre 1 e 10 mg/ml.
Alternativamente, para a recuperação ί de mutantes de protease PB92 á partir de caldos de cultura, em i
[fermentações de grande escala, adicionou-se CaCl2 (1% peso/peso)j ) e acetona (30% peso/peso). Após filtração para remover a massa !
celular, precipitou-se a protease a partir do filtrado obtido, ! por adição de 0,2-2% (peso/peso) de CaSO4.2H2O e por adição pos.· terior de acetona até uma concentração final superior a 60% (pe-j Iso/peso). Separou-se o precipitado por filtração e lavou-se com ;
í ) acetona seguido de secagem, obtendo-se o enzima bruto em po (CEP).
! . : i |,4. Técnicas analíticas de determinação da pureza das proteases j | purificadas
I ' ι As proteases consideraram-se puras quando se obteve apenas uma banda ou um pico por electroforese pou electroforese de gel de alta perfomance (HPLC), respectivamen!
j te.
ι j; A electrof orese de gel de poliacrilí amida (PAGE) na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS) efectu ou-se de acordo com o método de Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685. A desnaturação das amostras de proteina por SDS a 1009 C, jcontudo, deve ser precedida pela inactivação da actividade da 1protease de modo a impedir a autodegradação. Isto pode fazer-se por incubação com fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)(1 mM, j 30 minutos, temperatura ambiente), ou por precipitação com ãcido tricloroacético (TCA, 8%, 30 minutos, em gelo). 0 PAGE nativo j efectuou-se a pH 7,45 (tampão gel constituido por histidina (Hisj 20 mM e ãcido 3-/N-morfolinq7propanosulfónico (MDPS) 50 mM em gel de poliacrilamida a 5%)(razão de acrilamida: bisacrilamida [20:1). As amostras de proteina colocaram-se no topo de placas de ίgel e procedeu-se à electroforese em direcção ao cátodo. Utilij zou-se o mesmo tampão His/MOPS como tampão de electroforese, mas ! a pH 6,3. Após a electroforese (1,5-2 horas a 350V), ensopou-se í l o gel em ãcido acético a 8% para fixar as proteínas ao gel e rej[ velou-se em seguida com Coomassi e Brilhiant Blue R250 de acor jido com os processos habituais.
I No teste de pureza por HPLC utilizou
-se uma coluna de permuta catiónica (MonoS-Pharmacia Fine Chemicals) e uma coluna de filtração de gel (TSK 2000 SW-LKB). EluiuI -se a primeira com um tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 5,5 ! obtendo-se a eluição da proteína ligada por um gradiante linear ; de fosfato de sódio 10-300 mM a pH 5,5. A coluna de filtração de gel eluiu-se com acetato de sódio 0,25 M a pH 5,5.
1;5. Determinação da concentração de protease p Para a determinação da concentração de proteína numa solução de protease purificada, procedeu-se a
i) medidas de extinção a 280 nm usando o coeficiente de extinção calculado (f ) , e ii) titulação de centros activos.
O coeficiente de extinção a 280 nm calculou-se a partir do número de moléculas de triptofano (£ =
-1 -1 -1-1 M = 5600 M .cm ) e de tirosina (£ 1330 M .cm ) por molécula de enzima. Para a protease PB92 o valor de £ foi de 26100 M — 1 Μ i s,cm (3 unidades Trp, 7 unidades Tyr) equivalente a E ° medido í a 280 nm = 9,7 (M = 26729 Da). No caso dos mutantes com números de unidades Try e Tyr diferentes, fizeram-se as correcções neces sãrias.
Efectuou-se uma estimativa do número de moléculas de enzima activas por meio de uma titulação dos cen tros activos. Uma vez que o método tradicionalmente usado do N-transcinamoilimidazole (M.L. Bender et al., J. Am. Ciem. Soc. ι 66 (1966) 5890-5931) provou não funcionar satisfatoriamente para a protease PB92, desenvolveu-se um método que usava PMSF em vez do composto acima referido. Neste método, misturava-se uma solução de protease com concentração calculada (a partir da absorpçãò a 280 nm) com 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 e 1,25 equivalentes de PMSF, respectivamente, e deixava-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente em fosfato de sódio 10 mM, a pH 6,5. A concentração de enzima não pode ser inferior a 50/juM.
A actividade residual mediu-se espec. trofotometricamente usando succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenilalanilparanitroanilida (sAAPFpNA) como substrato (vide abaixo). A pureza (e consequentemente a concentração) de PMSF de terminou-se por espectroscopia de NMR e fizeram-se soluções stodk1 em isopropanol. Verificou-se que o resultado da titulação de cen tros activos estava de acordo com os resultados do teste de pure
za por HPLC. j
I ; :
í6. Determinação dos parâmetros cinéticos das proteases nativa e mutantes
1,9. Mediu-se a actividade em substra 'jtos proteicos (caseína) a pH 10,0 como descrito na especificação: de patente britânica 1,353,317 (expressa em ADU = unidades alcalinas Delft) . ;
29. 0 número de frequência usando ca seina como substrato mediu-se num aparelho de pH. A câmara de re acção do aparelho de pH (Radiometer, Copenhaga) continha 10 ml de KCl 0,1 M com 50 mg de caseína (Hammerstein, Merck). Os pro! tões, libertados apôs hidrólise da caseína pela protease PB92, j I titularam-se com NaOH 10 mM mantendo o pH a 10,0 (a 409 C e sob i corrente de azoto gasoso).
39. A actividade dos péptidos sintéticos mediu-se usando sAAPFpNA. A paranitroanilida (PNA) amarela formada mediu-se espectrofotometricamente a 410 nm: = 8480 iM \ cm 1, (E. G. Delmar et al., Anal. Biochem. 94 (1979) 316- i ,1-320) com uma espectrofotõmetro UVOKON 860 (KONTRON) equipado j com um permutador de célula de 6 posições termostatizado. Os parâmetros cinéticos cat e obtiveram-se a partir das medições de velocidade inicial a várias concentrações de substrato (para a protease PB92 de 0,1 a 6,0 nM) ajustando os resultados a uma função hiperbólica usando regressão não linear com o método itejrativo da secante multivariâvel. Calculou-se a constante de espe jcificidade As medições efectuaram-se a 259 C num volume :final de 1 ml contendo 0,1 M TRIS-HCl+0,1 M NaCl, a pH 8,6. Foi j Inecessário utilizar cloreto de sódio uma vez que na sua ausência.
a protease PB92 apresentava curvas Lineweaver-Burk não lineares/ (o que poderia ser causado por inibição do substrato. Dissolveu- j -se primeiro o substrato em DMSO a uma concentração de 200 mM e , jdiluiu-se subsequentemente com 0,1M TRIS-HC1 a pH 8,6 para se ob| ter uma solução stock 20 mM (determinada espectrofotometricamente a 315 nm; fc = 14000 M \cm ^). Não se fizeram correcções para as variações de concentração do DMSO(0,05 - 3,0%, volume/vo lume).
' 7. Oxidação das proteases PB92 ;
π j j Testou-se a sensibilidade das protea
Ηses PB92 em relação ã oxidação por H2O2, de acordo com o método j [descrito por Estell et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 6518-6521,' ! exceptuando o seguinte: .
j i) usou-se H2O2 20 nM em vez de 100 mM, e J jii) usou-se perborato de sódio 20 mM combinado com TAED 10 ml co
I. mo oxidante adicional. ι ' i
I | 8. Teste de capacidade de lavagem ί
Testaram-se mutantes de protease '
JPB92 num teste de lavagem especialmente desenvolvido, usando tei' - ~ ’ eidos de algodão e poliester/algodão sujos com leite, sangue e '
Jtinta (5,0 x 5,0 cm, fornecidos por EMPA, St. Gallen, Suíça e de signados pelos números 116 e 117).
| Os testes de lavagem efectuaram-se 'num Launderómetro Atlas LEF-FC, equipado com recipientes de teste em aço inoxidável contendo cada um uma composição detergente definida para além da protease a testar (mutantes de protease PB92 ou protease PB92). Salvo indicação em contrário os testes jefectuaram-se durante 30 minutos à temperatura desejada. Após a 1 jlavagem, secaram-se as amostras ao ar e mediu-se a reflectância dos tecidos testados a 680 nm com um fotómetro Photovolt (modelo! 577) equipado com um filtro verde. Os dados de ref lectância medi. Idos nas amostras teste lavadas com detergentes contendo os resjpectivos mutantes de protease PB92 comparam-se com os dados de
Ijref lectância de uma série de' experiências idênticas com detergen· |tes contendo protease PB92. Os valores de capacidade de lavagem ! das proteases mutantes calcularam-se dividindo a quantidade de /proteína da protease PB92 (mg) pela quantidade de proteína da ί !protease mutante (mg) que foi necessária para obter a mesma re- ! iflectância x 100%. ΐ [ j j
EXEMPLO 1
I | A. Determinou-se a capacidade de la26
vagem de vários mutantes de protease PB92 em detergentes em pó europeus, de acordo com o método abaixo descrito.
i
Em recipientes teste de ácido inoxi-j dãvel, contendo cada um uma determinada quantidade de detergente^ em pó IEC, dissolvido em 250 ml de ãgua de 159 GH, colocaram-se ί duas amostras de algodão e de poliéster/algodão. A composição do i! detergente em pó IEC era a seguinte: i
| Componente | % ponderai |
| Alquilbenzenosulfonato de sódio, linear | 6,4 |
| (comprimento médio da cadeia alquílica Cll,5) | |
| Álcool gordo etoxilado (14 EO) | 2,3 |
| Sabão de sódio | 2,8 |
| -Tripolifosfato de sódio (STPP) | 35,0 |
| Silicato de sódio | 6,0 |
| í Silicato de magnésio | 1,5 |
| ,Carboximetilcelulose | 1,0 |
| Sulfato de sódio | 16,8 |
| Tetrahidrato de perborato de sódio | 18,5 |
| ' TAED | 1,5 |
| jOutros + água | até 100 |
| j Adicionou-se a cada | recipiente um mu |
Itante seleccionado de protease PB92 purificado numa concentração lí variando entre o e 1,74 mg de protease (purificada) por litro de!
I I
Ij saponãria. Utilizou-se um recipiente para testar do mesmo modo a j'protease PB92, para comparação. Os testes efectuaram-se a 409 C.
Os resultados apresentam-se na Tabela 1.
TABELA 1
Propriedades da protease PB92 e de alguns dos seus mutantes
<o co
TABELA 1 (continuação)
tu
Ό ra
Ο Ti •rt
0· > O -P +J
O ra <
| u | • | |
| ω | O | |
| t—ι | ira o | |
| iO | •P | |
| CT | β •P | |
| E | 4-1 | |
| 1) d) | dJ Ό | |
| P | b | |
| β | O | |
| qj tn | cr | |
| b | ·. | |
| o | olP | |
| P | O | |
| 0) | O | |
| raJ | 1—1 | |
| o | dJ | |
| Ό C | T) | |
| QJ | ra | |
| P | o | |
| C | •P | |
| o | 44 | |
| o | vP | |
| cr | O | |
| cr | QJ | |
| H | cr | |
| ω | ra d) | |
| § | dJ TJ | |
| tu | ra | |
| ra | Ti | |
| 1 | Ή | |
| 3 | > | |
| *rt | P | |
| Ό | P | 3J |
| dJ | O | Q |
| E | ra | < |
| E | ra | o |
| d) | E | -d |
| tn | 3 | 0 |
| ra | P | |
| > | £ | iQJ |
| ra | 53 | E |
| (—1 | P | O |
| QJ | CM | i—J |
| Ti | <Ti | QJ |
| CQ | cr | |
| QJ | cr | |
| Ti | ra | |
| ra | qj | Ό |
| Ό | ra | ra |
| -P | ra | 3 |
| O | QJ | Ή |
| ra | p | E |
| cr | 0 | b |
| ra | b | QJ |
| O | cr | P d) |
| < | Ti | |
| -K |
+
Condições do teste: substrato: s-A-A-P-F-pNA; tampao: 0,1 M TrisHCl; pH 0,1 M NaCl; 25? C.
B. Repetiu-se ο teste de capacidade ' i; de lavagem a 259 C com o mesmo detergente contendo alguns dos mu i ;
tantes da protease PB92. Usou-se mais uma vez a protease PB92 co' jmo referência. As restantes condições foram iguais ãs descritas acima. Os resultados apresentam-se na Tabela 2. ;
! TABELA 2 l
(Capacidade de lavagem de mutantes da protease PB92 a 259 C em de [tergente em põ contendo STPP, relativa à da protease PB92 (%) ί
| Protease | Capacidade de lavagem (%) Concentração de detergente na saporãria | ||
| 4 g/l | 7 g/l | ||
| M216S | 90 | 80 | |
| M216Q | 95 | 80 | |
| N212D | 250 | 135 | |
| S160D | 185 | 120 |
jj C. Determinou-se também a capacidade
Lde lavagem das proteases num detergente em põ europeu contendo jí branqueador não fosfato, num Launderõmetro a 259 C e a 409 C. J íjUsou-se ainda protease PB92 como referência. As restantes condi-!
Ijções do teste foram iguais às acima indicadas. Os resultados apre q 1 sentam-se na Tabela 3. j •:Jr v-j- V
TABELA 3
Capacidade de lavagem de mutantes da protease PB92 a 259 C e a 409 C, num detergente em pó europeu contendo branqueador não fos fato, em relação ã da protease PB92 (%)
| Protease | Capacidade de lavagem (%) Concentração do detergente na saponãria | |||
| 4 g/1 7 g/1 temperatura 259C | 4 g/1 temperatu | 7 g/1 ra 409C | ||
| M216S | 80 | 8 5 | 100 | 90 |
| M216Q | 80 | 80 | 120 | 100 |
| N212D | 170 | 105 | 200 | 75 |
| S160D | 170 | 105 | 230 | 165 |
EXEMPLO 2
Testou-se o mutante M2Í6S da protea-l se PB92 em relação ã sua estabilidade no armazenamento, no deter gente em pó IEC descrito no Exemplo 1. A estabilidade no armazenamento testou-se em padrões climáticos de 309 C e 80% de humidaj j de relativa (RH). Para esta experiência, encapsulou-se a protea-j se do seguinte modo:
i Efectuou-se uma mistura contendo (em· í!
í] peso/peso) : 2% de protease purificada, 50% de álcool C^^-C^g eto xilado, não iónico, com 50-80 unidades E.O., 5% de TiO-, 3-10% i - 2 !
Ide CaSO^.2H2O e Na^O^ atê 100%. Aqueceu-se a mistura a 65-909C : e arrefeceu-se atê á temperatura ambiente. A mistura solidificada obtida pulverizou-se em seguida. Peneiraram-se as partículas de 0,5 a 1 mm de diâmetro e usaram-se para testes de armazenamen to de detergentes.
! Armazenaram-se 3,5 g de detergente ' t
em pó IEC, contendo o mutante M216S com uma concentração de 6140; i ADU/g de detergente, em ampolas de 18 ml. Para comparação, arma-i zenou-se protease PB92 nas mesmas condições. Após 2, 4, 5 e 6 se manas mediu-se a actividade residual das proteases. Os resulta- j ί
dos apresentam-se na Tabela 4.
' TABELA 4 ! Actividade residual da protease PB92 e do seu mutante M216S após armazenamento (em semanas) a 309 C e a 80% RH, em detergentes em PÓ
| Protease | 0 W | Actividade residual (%) | |||
| 2 W | 4 W | 5 W | 6 W | ||
| Protease PB92 | 100 | 25 | 5 | 3 | 2 |
| M216S | 100 | 68 | 31 | 20 | 11 |
Nota: W representa S (= semanas)
EXEMPLO 3 ι
I ——
I
I ! Testou-se protease PB92 e vários muI ! tantes de protease PB92, em relação ã estabilidade no armazenamento, num detergente em pó. Nos testes de estabilidade de arma-! zenamento utilizaram-se as proteases numa forma encapsulada.
Os produtos de protease prepararam- ! -se misturando os componentes seguintes a 809C:
j . i i Componente % ponderai ί protease
PVP**
BHT***
Na2SO4 * AE =
AL* 50
TiO2 2 (CEP) 7
1,5 1 balanço álcool C]_4-Cig polietoxilado. Etoxilou-se o álcool com 50 a 80 grupos óxido de etileno (EO) ** PVP = polivinilpirrolidona K17 *** BHT = 2,6-bis(t-butil)-4-metiIfenol.
Encapsulou-se esta mistura essencial mente como descrito na especificação de patente britânica N9.
ί
1,603,640. Utilizou-se a fracção com um tamanho de partículas en i tre 0,3 e 0,8 mm para determinar a estabilidade no armazenamento das proteases. A protease encapsulada (140 mg) misturou-se com base ALL (6,4 g) e tetrahidrato de perborato de sódio (0,6 g).
, /ÃLL é uma marca comercial registada da Unilever N.V./. A base , ALL em pó utilizada não continha enzimas ou agentes branqueadores.
A mistura de enzima/detergente/tetra· hidrato de perborato de sódio incubou-se a 309C e 80% RH. Na Tabela 5 indica-se a actividade residual após armazenamento duran; te o período de tempo indicado.
TABELA 5 !
jActividade residual da protease PB92 e de alguns dos seus mutan-, I tes após armazenamento (em semanas) a 309 C e 80% RH, num deter-! gente em pó contendo branqueador ;
| í 1 | Protease | 0 W | Actividade residual (%) | ||
| 1 W | 3 W | 5 W | |||
| Protease PB92 | 100 | 51 | 25 | 15 | |
| M216Q | 100 | 94 | 84 | 52 | |
| 1 | M216S | 100 | 89 | 83 | 50 |
| S160D | 100 | 47 | 20 | 9 | |
| N212D | 100 | 59 | 31 | 19 |
Nota: W = S (semanas) | EXEMPLO 4 j
Encapsulou-se a protease PB92 e vájrios mutantes de protease PB92 de acordo com o método descrito ! no Exemplo 3. Neste exemplo, contudo, misturaram-se 70 mg de proj tease encapsulada, com tamanho de partícula entre 0,3 e 0,9 mm, com 3,2 g de ALL e 0,3 g de tetrahidrato de perborato de sódio. ; Armazenaram-se as amostras a 309 C em ampolas de 18 ml num exci- ; tador de vácuo. Aplicou-se vácuo (25 mm Hg) durante os três pri- meiros dias do período de armazenamento.
Aplicando vácuo, aumentou-se a velocidade de transporte de vapor de água, tendo o sistema atingido o seu equilíbrio a 80% RH mais depressa do que nos sistemas a que não se aplicou vácuo. O valor de RH de 80% estabeleceu-se por meio de uma solução saturada de brometo de potássio.
Na Tabela 6 apresentam-se as actividades residuais após o período de armazenagem indicado (em semanas) .
TABELA 6
Actividade residual da protease PB92 e de alguns dos seus mutanj tes após armazenagem a 30? C e 80% RH num detergente contendo ! branqueador
| i | Protease | Actividade residual (%) | |||
| 0 W | 1 w | 2 W | 3 W | ||
| protease PB92 | 100 | 27 | 22 | 14 | |
| M216Q | 100 | 63 | 53 | 44 | |
| M216S | 100 | 55 | 49 | 31 | |
| ί | S160D | 100 | 23 | 18 | 13 |
(W = S(semanas)
EXEMPLO 5 i
Preparou-se a seguinte composição de^ detergente líquido: ί ji Componente 'Acido alquilbenzeno sulfónico linear 1 Álcool polietoxilado C-^, 8 EO Acido laurico
Acido oleico Trietanolamina
1,2-propanodiol :Etanol
Citrato de sódio
Acido dietilenotriamina-pentaacêtico % ponderai
6 6
4
0,3
Formiato de cálcio /Formiato de sódio
Borax
NaOH, solução a 25%, peso/peso Agua
0,12 1
1,9 até pH 11,2 restante (balanço)
A esta composição adicionou-se protease PB92 e vários mutantes de protease PB92, numa quantidade tal que permitisse atingir uma concentração inicial de protease :de 0,13%, peso/peso.
A estabilidade da protease (em % de -actividade residual) determinou-se após armazenamento da composjg ! ção contendo a protease, a 379 C durante o número de dias indica do. Os resultados apresentam-se na Tabela 7.
H TABELA 7 í i
HActividade residual da protease PB92 e de alguns dos seus mutanI tes após armazenamento a 379 C numa composição detergente liquida j
| 1 | Protease | 0 d | Actividade residual | (%) 21 d | ||
| 5 d | 11 d | 15 d | ||||
| protease PB92 | 100 | 23 | 10 | 5 | 3 | |
| í | S160D | 100 | 57 | 30 | 14 | 8 |
| M216Q | 100 | 59 | 32 | 18 | 9 | |
| i | Μ216Ξ | 100 | 45 | 18 | 10 | 5 |
| i | N212D | 100 | 38 | 14 | 9 | 4 |
EXEMPLO 6
Formularam-se, do modo a seguir indicado, protease PB92 e alguns dos seus mutantes. Com cada uma das proteases efectuou-se uma mistura contendo as seguintes componentes:
| \ Componente | % ponderai |
| Amylogum CLS | 45 |
| Sacarose | 23 |
| Sorbitol | 17 |
| Glicerol | 4 |
| Óleo de parafina | 3 |
| NaH2PO4 | 0,5 |
| Protease (CEP) | 5,0 |
| PVP K17 | 1,5 |
| ! TiOn | 1 |
| 2 |
Prepararam-se granulados a partir ! j destas misturas, essencialmente de acordo com o processo descri-! ' to no Exemplo 5 da patente U.S. N9. 4,242,219, exceptuando o se-! guinte: 19 - a mistura descrita no exemplo referido substituiu- (
-se pela mistura acima indicada; 29 - utilizaram-se orifícios com um diâmetro de 0,7 mm em vez de 1,0 mm; 39 - não se revesti-!
i ram os grânulos.
Misturaram-se estes grânulos (140 ! mg) com base ALL (6,4 g) e tetrahidrato de perborato de sódio j ' (0,6 g) e colocaram-se em ampolasde 36 ml. j
A estabilidade da protease (em % de! actividade residual) determinou-se então após armazenagem das am polas a 309C e 80% RH durante o numero de semanas indicado. :
! Os resultados apresentam-se na Tabe;
la 8.
TABELA 8 [Actividade residual de granulados de protease PB92 e de alguns Η dos seus mutantes após armazenamento a 30? C e 80% RH num deteri gente
| Protease | 0 W | Actividade 1 W | residual 3 W | (%) 5 W |
| Protease PB92 | 100 | 45 | 29 | 17 |
| M216Q | 100 | 93 | 66 | 45 |
| M216S | 100 | 90 | 70 | 41 |
W = S (semanas) |
I
EXEMPLO 7 '
Prepararam-se produtos de extrusão de protease PB92 e de alguns dos seus mutantes e misturaram-se [ com o detergente e com o branqueador como descrito no Exemplo 3.J
A estabilidade no armazenamento des: tas amostras (em % de actividade residual) determinou-se a 309C | e 60/80% RH (em alternância a 60% RH durante 12 horas e a 80% RH[ i
durante 12 horas). Os resultados apresentam-se na Tabela 9. [ l
TABELA 9 íActividade residual de produtos de extrusao de protease PB92 e ide alguns dos seus mutantes após armazenamento a 309 C e 60/80% RH
| Protease | Actividade | residual (%) | ||||
| 0 W | 1 W 3 | W | 5 W | |||
| Protease PB92 | 100 | 70 | 34 | 15 | ||
| M216Q | 100 | 98 | 88 | 67 | ||
| M216S | 100 | 93 | 87 | 48 | ||
| S160D | 100 | 67 | 35 | 10 | ||
| N212D | 100 | 75 | 53 | 26 | ||
| EXEMPLO 8 | ||||||
| Prepararam | -se | grânulos contendo | pro | |||
| tease PB92 e alguns | dos seus mutantes e | misturaram-se com o de- |
tergente e com o branqueador como descrito no Exemplo 6. j ' A estabilidade no armazenamento de_s; jtas amostras (em % de actividade residual) determinou-se apôs inj 'cubação durante o período de tempo indicado, a 309 C e a um vaj í ilor de RH (humidade relativa) que manteve a 60% durante 12 horas'; e a 80% durante 12 horas, alternadamente. Os resultados apresen-! tam-se na Tabela 10.
TABELA 10
Actividade residual de granulados de protease PB92 e de alguns dos seus mutantes após armazenamento a 309C e a 60/80% RH
| Protease | Actividade | residual (%) 3 W | 5 W | |
| 0 W | 1 w | |||
| Protease PB92 | 100 | 54 | 39 | 28 |
| M216Q | 100 | 93 | 81 | 67 |
| M216S | 100 | 99 | 87 | 72 |
W - S (semanas) i EXEMPLO 9 ! Testou-se a protease PB92 e alguns dos seus mutantes em relação à estabilidade no armazenamento num detergente em pó contendo branqueador a 309 C e a 80% RH. Para esta experiência usaram-se as proteases em forma encapsulada. En capsulou-se cada protease do seguinte modo:
Efectuou-se uma mistura, a 809 C, (
com a seguinte composição:
Componente
Componente não iónico* tío2
Protease (CEP) % ponderai
Na2SO^ balanço * Componente não iónico = álcool polietoxilado C^-C^g (50-80 grupos EO)
Deixou-se arrefecer a mistura anterior atê ã temperatura ambiente. Pulverizou-se a mistura solidificada em pequenas partículas. Peneiraram-se as partículas de 0,3 a 0,8 mm e utilizaram-se para a experiência de armazenamento.
Para a experiência de armazenamento misturaram-se 140 mg de cada protease encapsulada com 6,4 g de base ALL para detergente em pó e 0,6 g de tetrahidrato de perbo39
íirato de sódio. 0 pó básico ALL não continha enzimas nem perbora-; í to de sódio. As misturas de base ALL/protease/tetrahidrato de {perborato de sódio incubaram-se a 309 C e a 80% RH. !
íj Após armazenamento durante 0, 1, 2 ;
j ou 4 semanas, determinou-se a estabilidade da protease, em ter- ! Jmos de % de actividade residual, para cada uma das proteases. Osí !;resultados apresentam-se na Tabela 11.
' TABELA 11 j i
(Actividade residual da protease PB92 e de alguns dos seus mutan-, tes após armazenagem a 309 C e 80% RH num detergente em põ coni {tendo branqusdor.
| Protease | 0 w | Actividade 1 W | residual 2 W | (%) 4 W |
| Protease PB92 | 100 | 61 | 36 | 12 |
| /S160D, M216Q/ | 100 | 78 | 58 | 35 |
| /S160D, M216S/ | 100 | 86 | 68 | 39 |
W = S (semanas) í {
I
EXEMPLO 10 j {[ Testaram-se mutantes da protease ! I |i PB92 num teste de lavagem, essencialmente nas mesmas condiçoes 1 ί,· descritas no Exemplo 1, exceptuando o facto de se ter adicionadoj í í
I0,375 g de detergente liquido, com a seguinte composição, a 250 j ml de ãgua de 59 GH no recipiente do Launderõmetro. (
J Componente
I Acido laurico Ácido oleico
Acido alquilbenzonosulfónico, linear, cio~c 3 Álcool polietoxilado C.^, θ EO Trietanolamina
1,2-propanodiol Etanol % ponderai
I até 100
Hidróxido de sódio, 45%, peso/peso Citrato de sódio ί Agua (pH da saponária 7,2)
Determinou-se a capacidade de lavagem das várias proteases neste detergente líquido, num launderómetro a 259 C durante 30 minutos. Após a lavagem, mediu-se a rei; flectância dos tecidos testados, como descrito no Exemplo 1. De( terminou-se a capacidade de lavagem das proteases mutantes como ί · (descrito no Exemplo 1. Os resultados apresentam-se na Tabela 12.
i í TABELA 12 : Capacidade de lavagem de mutantes da protease PB92 a 259C num de! tergente liquido i
| Protease | Capacidade de lavagem | Actividade em relação PB92 | especif ica â protease (%) | |
| 212D | + | 100 | ||
| 160D | + | 73 | ||
| S160G, N212D | + | 7 6 | ||
| M216S | 0 | 40 | ||
| M216Q | 0 | 37 |
0: 100% + 20% de capacidade de lavagem em relação ã pro ' tease PB92 (manutenção da capacidade de lavagem). !
+: >120% de capacidade de lavagem em relação ã protease ί
PB9 2 i
Z. 80% de capacidade de lavagem em relação ã protease \ PB92.
I i
I
Determinou-se a capacidade de lavagem das várias proteases nos detergentes líquidos disponíveis no mercado Tide , Wisk e Ariel . Os recipientes de ãcido inoxidá- ! vel continham 0,375 g de Tide em 250 ml de água de 59 GH, 0,375 gí de Wisk em 250 ml de água de 59 GH ou 1,25 g de Ariel em 250 ml
|;de ãgua de 15? GH, respectivamente. Determinou-se a capacidade jde lavagem a 25? C ou a 45? C. As restantes condições foram iguais ãs descritas no Exemplo 1. Os resultados apresentam-se na Tabela 13.
TABELA 13
Capacidade de lavagem de mutantes da protease PB92 nos detergenJ(tes Tide, Wisk e Ariel, a 25? C e 40? C.
| Protease | Tide | 2 5?C | Wisk 40?C | Ariel 40?C | |
| 25?C | 40?C | ||||
| N212D | + | + | + | + | 0 |
| S160D | + | + | + | + | + |
| M216Q | 0 | + | 0 | + | + |
| M216S | ND | 0 | 0 | 0 | 0 |
| S160Q | - | - | - | - | - |
| S160N | - | - | - | - | 0 |
| S160K | - | - | - | - | - |
| S160A | - | - | - | - | - |
| S160D, M216Q | + | + | + | + | + |
| S160D, M216S | 0 | - | + | + | 0 |
| M117L, M216Q | ND | - | ND | - | 0 |
| M117L, M216S | ND | - | ND | - | - |
í ND = nao determinado
O: 100 + 20% de capacidade de lavagem em relação ã protease PB92 +: 2-120% de capacidade de lavagem em relação â protease
PB9 2
-: <80% de capacidade de lavagem em relação ã protease
PB9 2
EXEMPLO 11
Determinou-se a capacidade de lavagem de mutantes da protease PB92 num teste estatístico numa máquina de lavar â escala real, de TNO, Delft, Holanda (Cleaning
I Techniques Research Institute) . Comparou-se a capacidade de lava.1 ii
H gem destes mutantes com a da protease PB92. I í; I l: Todas as proteases se dosearam num '
Jdetergente IEC com base no peso de proteina (0,007%, peso/peso).! ! I LCom base na actividade estas dosagens foram as seguintes: !
| protease PB92 M216S M216Q S160D N212D | 1460 ADU/g de detergente 679 ADU/g de detergente | |
| 479 ADU/g 1080 ADU/g 1455 ADU/g | de detergente de detergente de detergente | |
| Efectuaram- | -se 8 testes de lavagem |
com cada composição de protease detergente, a 40° C em máquinas j de lavar AEG Turnamat idênticas. Em cada máquina de lavar utili-í izaram-se 170 g de detergente. Durante os testes, os detergentes a investigar usaram-se de modo a que cada pê participasse no mes mo número de ciclos de lavagem em cada máquina.
Nos testes utilizou-se a água de ! abastecimento normal fornecida na cidade de Delft com as seguin-! Utes especificações médias:
alcalinidade (M) : 2,2 mmol/1 I dureza (H) : 1,6 mmol/1 | t
temperatura : 209 C.
I ^Remoção de sujidade e nódoas de tecidos teste í ί Em cada ciclo do teste lavaram-se I seis amostras de três tipos de sujidades EMPA em algodão (n9s j 111, 116 e 117), conjuntamente com a roupa suja. j | A remoção de sujidade e nódoas das j amostras artificialmente sujas, determinou-se quantitativamente fazendo incidir luz azul triestimulada perpendicularmente ã amos tra testada. Mediu-se a quantidade de luz re-emitida pela amostra num ângulo de 459. De acordo com a publicação IEC 456, tomou -se o valor de re-emissão do óxido de magnésio como 100. Quanto maior o valor de re-emissão, melhor o processo de lavagem para um determinado tipo de sujidade.
!Carga da máquina de lavar j j Encheram-se as máquinas de lavar ) p com uma carga de 4,75 kg, constituídas por amostras teste e por :
]roupa suja normal de uso domestico. A roupa doméstica era a sen . ! i^guinte:
J 6 toalhas de cozinha j j 4 peças de roupa interior ρ 4 lençóis j j 4 fronhas de almofada. i ! - ί
Quando necessário, adicionaram-se ! í lençóis e fronhas limpos para atingir a quantidade de carga ne|: cessaria.
P Para cada processo de lavagem selec hcionou-se cuidadosamente a roupa. Cada peça de roupa selecciona!da para uma das máquinas tinha a sua correspondente suja que se lavou numa das outras máquinas de lavar. Deste modo, garantiu-se a igualdade da carga de sujidade em cada processo.
jParâmetros do processo de lavagem programa 409 C água na lavagem principal 19 1 tempo ã temperatura mais elevada 1.5 min temperatura mais elevada 439 C tempo de lavagem 45 min entrada de água 7 1 temperatura após diluição da saporãria 309 C enxaguamento 17 1 passagens com cerca de 17 litros de ãgua fria cada
Os valores médios da re-emissão (V) e da razão (R) determinaram-se após 8 testes de lavagem. Os resultados de duas experiências independentes apresentam-se nas Ta belas 14A e 14B.
TABELA 14A
Remoção de sujidades artificiais
| 1 | Protease | Amostra EMPA n9. | Total | ||||
| 111 | 116 | 117 | |||||
| i | V R | V R | V R | V | R | ||
| Protease | PB92 | 49 1.00 | 44 1.00 | 56 1.00 | 149 | 1.00 | |
| M216S | 49 1.00 | 46 1.05 | 58 1.04 | 153 | 1.03 | ||
| TABELA 14B | |||||||
| Remoção de sujidades artificiais | |||||||
| Protease | Amostra EMPA n9. | ||||||
| 111 | 116 | 117 | Total | ||||
| V R | V R | V R | V | R | |||
| Protease | Pb92 | 41 1.00 | 35 1.00 | 46 1.00 | 123 | 1.00 | |
| M216S | 40 0.96 | 33 0.94 | 42 0.91 | 115 | 0.93 | ||
| M216Q | 42 1.01 | 35 0.99 | 43 0.94 | 120 | 0.98 |
Na Tabela 15, as razões (R) obtidas a partir de testes estatísticos em máquinas de lavar ã escala re al, foram divididas pela razão correspondente (R'), calculada a partir dos valores das capacidades de lavagem em relação ã protease PB92 obtidos no teste de lavagem no Launderómetro em idênticas condições (10 g/1 de IEC, amostras teste EMPA n9s 116 e 117, tempo de lavagem 30 minutos, temperatura 409 C).
TABELA 15
Correlação entre o teste em máquina de lavar â escala real e o teste de lavagem em Launderõmetro
| Protesase | R/R' |
| Protease PB92 | 1.00* |
| M216S | 1.18 |
| M216Q | 1.10 |
| S160D | 1.02 |
| N212D | 0.98 |
* por definição
Os valores de R/R' para as protease I 'mutantes próximos de 1,0 indicam a correlação entre os testes de Imáquina à escala real e os testes de Launderõmetro.
j EXEMPLO 12
As Figuras 2A e 2B mostram a capacida de de lavagem em 4 g de IEC/1 de vários mutantes de protease PB92, de acordo com os testes descritos no Exemplo 1, em relação ã protease PB92 nativa, em função da sua actividade especifica, j
| Os núne | ros nc diagrama referem-se às | segu intes | proteases mutan |
| tes: 1 | Protease PB92 | 11 | M216P |
| 2 | M216A | 12 | M216T |
| 3 | M216C | 13 | M216W |
| 4 | M216S | 14 | M216I |
| 5 | M216L | 15 | M216G |
| 6 | M216E | 16 | M117L, H118D |
| 7 | M216K | 17 | M117L, M216Q |
| 8 | M216H | 18 | M117L, H118D, |
| 9 | M216N | 19 | M216Q M117L, M216S |
| 10 | M216Q | 20 | M117L, H118D, |
M216S
| 21 | M169S | 31 | S259K |
| 22 | Μ216Υ | 32 | W235R |
| 23 | Μ169Ι, M216S | 33 | H243R |
| 24 | Μ216-ΟΧ | 34 | H243R, S259K |
| 25 | N212S | 35 | D175N |
| 26 | N212D | 36 | Ε134Κ |
| 27 | S160G, N212D | 37 | W235R, S259K |
| 28 | L211Y | 38 | W235R, H243R |
| 29 | L211Y, N212S | 39 | S259K |
| 30 | A166D, Μ169Ι | 40 | Τ207Κ |
| 41 | S160N | 51 | S160I |
| 42 | S160G | 52 | S160G, M216S |
| 43 | S160P | 53 | S160G, M216Q |
| 44 | S160T | 54 | S160L |
| 45 | S160C | 55 | S160Y |
| 46 | S160Q | 56 | S160D, M216S |
| 47 | S160D | 57 | G116V, S126V |
| Ρ127Ε, S128K | |||
| 48 | S160K | 58 | G116V, S126L |
| Ρ127Ν, S128V | |||
| 49 | S160R | 59 | G116V, S126L |
| P127Q, S128A | |||
| 50 | S160A | 60 | G116V, S126V |
| Ρ127Μ |
| 61 | S126M, | Ρ127Α, | S128G | |
| 62 | G116V, | S126Y, | P127G, | S128L |
| 63 | G116V, | S126N, | Ρ127Η, | S128I |
| 64 | G116V, | S126H, | Ρ127Υ | |
| 65 | G116V, | S126R, | P127S, | S128P |
| 66 | G116V, | S126F, | P127Q | |
| 67 | G116V, | S126G, | P127Q, | S128I |
| 68 | G116V, | S126F, | P127L, | S128T |
| 69 | G116V, | S126Q, | P127D |
A Figura 3 mostra a capacidade de La-, vagem em 7 g de IEC/1 de vários mutantes de protease PB92, de j acordo com os testes descritos no Exemplo 1, em relação à proteai j se PB92 nativa, em função da sua actividade específica. Os nume! ros no diagrama referem-se às mesmas proteases mutantes que os , ι [! números das Figuras 2A e 2B.
j Todas as publicações (incluindo regisj 1 tos de patente) mencionadas nesta especificação mostram o nivel j [de conhecimento dos especialistas que fizeram esta invenção. Toί das as publicações se incluem como referência como se cada uma 1 [delas se indicasse especifica e individualmente para incluir coj mo referência.
' Embora a invenção que se acaba de des^ crever tenha sido apresentada em pormenor por meio de ilustra; ções e exemplos para facilitar a clareza da sua compreensão, se[rã evidente para o especialista na matéria que se poderão fazer j !Í várias alterações e modificações sem distorcer ou sair do espiri_ ;i to e do âmbito das reivindicações apresentadas.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES-1-Processo para a preparação de um enzij ma proteolítico, com propriedades melhoradas para utilização em detergentes, !caracterizado por tJse mutogenizar um gene clonado que codifique um enzima proteolí-j j tico adequado ou um fragmento deste; :! se isolar o gene ou genes de protease mutante obtidos; ;se introduzir este gene ou genes de protease mutante numa estir-j ;lpe hospedeira adequada para expressão e produção; | se recuperar a protease mutante obtida e se escolherem as protea: ses mutantes que revelem propriedades melhoradas para utilização ' em detergentes.' Processo para a preparaçao de um proIduto enzimãtico, contendo um enzima proteolítico mutante prepara jdo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se efectuar a expressão de um gene que codifique o referido enzima, contert do uma sequência de aminoácidos que difere pelo menos num amino-II ácido da sequência do enzima nativo, obtendo-se um enzima mutan-| te que revela propriedades melhoradas para utilização em detergentes.Processo para a preparaçao de um pro49 duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado Hpor o enzima proteolítico mutante possuir uma maior capacidade jde lavagem quando utilizado em detergentes para lavagem de roupa.- 4- Processo para a preparação de um pro-] duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado ' por o enzima proteolítico mutante apresentar uma maior estabilijdade durante o armazenamento de detergentes para lavagem de roupa, mantendo a sua capacidade de lavagem.Processo para a preparação de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o enzima proteolítico mutante apresentar uma elevada estabi-jI lidade no que respeita â resistência a agentes oxidantes.Processo para a preparaçao de um projlduto enzimãtico, de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5) caracterizado por o enzima proteolítico mutante ser derivado de j j uma protease de serina bacteriana produzida naturalmente.Processo para a preparação de um pro50 duto enzimãtico, de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 6, jcaracterizado por o gene ser derivado de um gene nativo de uma i estirpe de Bacillus alcalofílico.- 8- Processo para a preparação de um pro-1 duto enzimãtico, de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 6) caracterizado por o gene ser derivado de um gene nativo de uma ' estirpe seleccionada de entre o grupo constituído por B. subti- ! lis, B. licheniformis e B. amyloliquefaciens.Processo para a preparação de um projduto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado i ,por o gene nativo codificar para uma sequência de aminoãcidos | que apresente pelo menos uma homologia de 70% com a sequência de1 i j laminoãcidos da protease de serina PB92.- 10- Processo para a preparação de um pro-j duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado I por o gene nativo codificar essenciaimente para a seguinte sequência de aminoãcidos:H N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-E-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S51 i-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M- í '1-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-TI -A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.- 11- Processo para a preparação de um pro-l duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado[ por o gene nativo ser derivado de Bacillus nov. spec. PB92.Processo para a preparação de um enzi j[ma proteolítico mutante, de acordo com qualquer das reivindicasções 1 a 11, caracterizado por se seleccionar o mutante de entrei jo grupo de mutantes de protease de serina PB92, constituído por: j Í/M216S7; /M216Q7; /N212D/; ZSlôOD/; /S160Q, N212D7; /S160D, :[m216Q/; /S160D, M216S7; /A166D, M169I/; /G116V, S126V, P127E, | [S128K7; /G116V, S126G, P127Q, S128I/; ZG116V, S126L, P127N,I S128V7; /G116V, S126L, P127Q, S128A7? /G116V, S126V, P127IJ/;' 1 J/G116V, S126H, P127Y/; /G116V, S126R, P127S, S128P7; /G116V, i'jS126F, P127Q/; /G116V, S126F, P127L, S128T7; /S126M, P127A,I S128G/; /S126M, P127A, S128G, S160D7; e /G116V, S126N, P127S, [ S128A, S160D7Processo para a preparação de um enz_i • !jma proteolítico mutante, de acordo com qualquer das reivindica'Jções 1 a 12, caracterizado por se cultivar, em condições de fer52- mentação apropriadas, uma estirpe hospedeira transformada com um vector de expressão contendo um gene proteolitico mutante, e se j recuperar o enzima assim produzido. {- 14* Processo para a preparação de um produto enzimãtico, contendo um enzima proteolitico mutante prepara do de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, com melhores propriedades para aplicação em detergentes comparado com o enzima nativo, caracterizado por conter uma sequência de amino ácidos substancialmente idêntica ã sequência da PB92 protease e por conter uma mutação em pelo menos um dos aminoácidos 116, 126, 127, 128, 160, 166, 169, 212 e 216.- 15* Processo para a preparação de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida mutação ser no aminoacido 116, substituindo-se a glicina por um aminoacido alifático não polar de maior peso mole cular.- 16* Processo para a preparaçao de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mutação ser no aminoacido 126, substituindo-se a serina por qualquer outro aminoacido não hidroxilado; no aminoacido 127, .j substituindo-se este por qualquer outro aminoacido; e no aminoa. eido 126, substituindo-se este por qualquer outro aminoacido.i- 17- j Processo para a preparação de um proL duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado; Jpor a mutação ser no aminoãcido 216, substituindo-se a metionina' jpor qualquer outro aminoãcido contendo enxofre. iProcesso para a preparação de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado: [por a mutação ser no aminoãcido 160, substituindo-se este por ; glicina ou por um aminoãcido aniónico. í1 9- Processo para a preparação de um pro-! duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadol por a mutação ser no aminoãcido 166, substituindo-se este por umj aminoãcido aniónico. í- 20- Processo para a preparação de um pro-; - ~ i duto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, aracterizado por a mutação ser no aminoãcido 169, substituindo-se este por um aminoãcido alifãtico não polar.- 2154- 21- Processo para a preparação de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mutação ser no aminoácido 212, substituindo-se este por um aminoácido aniónico.- 22- Processo para a preparaçao de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mutação que é introduzida pelo menos uma vez, consistir na substituição de um aminoácido neutro por um aminoácido aniónico.- 23- Processo para a preparaçao de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a mutação que se verifica pelo menos uma vez, ser uma mutação no aminoácido 116, substituindo-se a glicina por valina, iso leucina ou leucina.- 24- Processo para a preparação de um produto enzimãtico, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o referido produto enzimãtico ter pelo menos uma mutação ad/ cional nos aminoácidos 126, 127 ou 128.j Processo para a preparação de uma comi j'posição detergente para lavagem de roupa, caracterizado por se i incorporar como ingrediente activo um ou mais produtos enzimáti-, , í jicos, quando preparados de acordo com qualquer das reivindicações janteriores, com veículos e/ou aditivos adequados.A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado como pedido de patente euroi peia em 11 de Fevereiro de 1988, sob o n9. 88200255.3. ί
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