JP2515975B2 - 抗腫瘍作用を有するポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍作用を有する新規ポリペプチド，その
製法及び該ポリペプチドをコードするDAN等に関する。

マクロファージが産生する生理活性物質として、癌細
胞を壊死させる因子が見い出され、このような細胞傷害
活性を有する物質をTumor necrosis factor（TNF）と名
付けた［Carswell,E.A.ら、Proc.Nat.Acad.Sci.,LSA.7
2,3666（1975）］。その後、各種動物由来のTNFに関す
る研究が行なわれてきたが、特にヒトTNFについては大
量生産が困難であるため、物質としての実体の究明には
至らなかった。

本発明者等は遺伝子組み換え技術を応用したヒトTNF
の大量生産を目的として研究を重ね、ヒトTNFをコード
するcDNAのクローン化に成功すると共に、ヒトTNFの大
量生産及び単離に成功し、これらの発明につき特許出願
している（特開昭60−185799,特開昭60−232097,特願昭
59−172307等）。

その後、相次いでヒトTNFをコードする遺伝子のクロ
ーニング及び大腸菌における生産に関する研究成果が報
告されている［Pennica,D.et al.,Nature,312,724（198
4）;Shirai,T.,et al.,Nature313,803（1985）;Wang,A.
M.,et al.,Science,228,149（1985）］。

本発明者等の一連の研究過程において、ヒトTNFは遺
伝子上にその前駆体としてコードされていることが明ら
かになり、その前駆体のＣ末端側の155残基のアミノ酸
配列からなるポリペプチドが成熟（mature）ヒトTNFで
あることをウサギTNFとのアミノ酸配列における相同性
に基づき明らかにした。

更に研究を重ね、成熟ヒトTNFのＣ末端側150残基以下
のアミノ酸配列よりなるポリペプチドが優れた抗腫瘍活
性を有することを見い出すに至った。又、その前駆体部
分の一部を含む成熟ヒトTNFポリペプチドのアミノ酸配
列についてポップとウッズの方法［Proc.Nat.Acad.Sci.
USA,78,3824（1981）］に従って、その親水性及び疎水
性アミノ酸配列領域分布を解析した結果、第１図に示す
通り、数ケ所の親水性領域が認められる。これら親水性
領域は水溶液中では分子の外面に位置していると考えら
れ、これらの領域又は特定の領域が腫瘍（癌）細胞に対
する抗腫瘍作用の発現に深く関連しているものと予想さ
れる。成熟ヒトTNFのＣ末端側150残基のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドが強い抗腫瘍活性を示すことから、
第１図において「Ａ」で示した親水性領域のアミノ酸配
列が抗腫瘍活性の発現に必ずしも必須ではないことが示
唆されると共に、抗腫瘍活性の発現には後記146残基の
アミノ酸配列〔Ｉ〕が大きく関与しているものと考えら
れるに至った。

更に、成熟ヒトTNFのＣ末端のLeuのみを酵素処理（カ
ルボキシペプチダーゼＡによる処理）して遊離除去させ
た場合には、抗腫瘍活性が顕著に低下若しくは殆んど消
失することから、Ｃ末端のLeuは抗腫瘍活性発現に必須
であると考えられる。

本発明は、上記の様な新たな知見に基づき完成された
ものである。

本発明は、150以下のアミノ酸残基からなるポリペプ
チドであって、そのＣ末端側のアミノ酸配列が下記のア
ミノ酸配列からなるポリペプチド又はその誘導体に関す
る。

Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 〔Ｉ〕 本発明に係るポリペプチドとしては、上記式〔Ｉ〕で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他、その
Ｎ末端に、Pro−Ser−Asp−Lys−,Ser−Asp−Lys−,Asp
−Lys−又は−Lys−が結合してなるポリペプチド或いは
該ポリペプチドのＮ末端にMet−が結合したポリペプチ
ドが具体的に挙げられる。

本発明のポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチド
の鎖上の側鎖官能基、Ｎ末端にアミノ基又はＣ末端のカ
ルボキシル基を利用して形成される誘導体を意味し、例
えばカルボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル
類，第一或いは第二アミンとの酸アミド類，アミノ基の
Ｎ−アシル誘導体又はヒドロキシル基のＯ−アシル誘導
体，側鎖酸アミド基の脱アミド体，更には該ポリペプチ
ドのカルボキシル基又はアミノ基等とで形成される塩、
例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，アルギニ
ン，カフェイン，プロカイン，塩酸，グルコン酸等との
塩が挙げられる。

本発明のポリペプチドは、会合体として存在し得る場
合もあり、このような会合体も本発明のポリペプチドに
包含される。

本発明はまた、上記本発明のポリペプチドをコードす
るDNAにも関する。

本発明に係るDNAの具体例としては、次の塩基配列 （５′）−CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG CTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG−（３′） 〔II〕 を有するDANの他、その５′末端に、 CCGAGTGACAAG−,AGTGACAAG−,GACAAG−又はAAG− が結合した塩基配列を有するDNA及びそれらの５′末端
に更に開始コドンATG及び／又は３′末端に終止コドン
が結合した塩基配列を有するDNA及び縮重（degenerativ
e）コドンを含む該DNA誘導体が挙げられる。

上記発明以外の本発明は、以下の記述から明らかであ
ろう。

本発明に係るDNA及びポリペプチド並びにその誘導体
は以下の様にして作製或いは製造することができる。

ヒトTNFの前駆体或いは成熟ヒトTNFをコードするDNA
は、例えば後記参考例に示した方法で作製することがで
きる。

（１） このDNAを適当な制限酵素で切断し、これと必
要に応じ、常法により合成したDNAアダプターとを結合
することにより本発明のポリペプチドをコードするDNA
断片を含むDNA,例えば、第１表に示したアミノ酸番号84
〜233番，アミノ酸番号85〜233番，アミノ酸番号86〜23
3番，アミノ酸番号87〜233番，アミノ酸番号88〜233番
に対応する塩基配列を含むDNAを作製することができ
る。また、本発明のポリペプチドをコードするDNA断片
は、全合成することも可能である。更に詳しくは、本発
明のポリペプチドそれ自体をコードする塩基配列を有す
るDNAの５′末端に開始コドンATGを、かつ３′末端には
終止コドンを有するDNA断片を作製し、これを適当なプ
ロモーター及びSD配列に続いて結合させ、ついでベクタ
ーに組み込む。このようにして本発明のポリペプチド生
産用の形質発現ベクターを得ることができる。プロモー
ターとしては、例えばlac，trp，tac，phoS，phoA,PL,S
V40初期プロモーター等が挙げられる。SD配列から開始
コドン間の配列としては公知のものを利用するか或いは
好ましくは下記塩基配列からなる配列が利用される。

AAGGAGGTTATCGATTATG又は AAGGAGGTTTAATATTATG ベクターとしては、形質転換させる宿主中で増殖する
ものはすべて用いられ、例えば、プラスミド（pBR322
等），ファージ（λファージ誘導体等），ウイルス（SV
40等），ランナウェイ プラスミドが挙げられる。

（２） この本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベ
クターを適当な宿主に、例えば大腸菌にコーエンらの方
法［Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69,2110（1972）］によ
り、導入することにより形質転換体を得ることができ
る、 （３） ついでこの形質転換体をそれに応じた適当な培
養条件下で培養することにより、目的とするポリペプチ
ド或いはそのＮ末端にMetが結合したポリペプチドを産
生させることができる。この培養物を例えば、リゾチー
ム消化と凍結融解や超音波破砕，フレンチプレス等によ
り破壊したのち、遠心分離又は濾過することにより本発
明のポリペプチド含有抽出液を得ることができる。

（４） この抽出液を蛋白質の一般的な精製法（限外濾
過，透析，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過，
電気泳動，アフィニティクロマトグラフィー等）に従い
精精することにより、目的とする本発明のポリペプチド
を得ることができる。

（５） 本発明のポリペプチドの誘導体は、上記のよう
にして得られたポリペプチドを用いて、これに脂肪族ア
ルコールを作用させ該ポリペプチドのエステル体を、カ
ルボン酸の反応性誘導体を作用させ該ポリペプチドのＮ
−アシル又はＯ−アシル体を、第１アミン又は第２アミ
ンを作用させ該ポリペプチドのアミド体を、酸アミドを
水解して脱アミド体を、それぞれ形成せしめることがで
きる。これらの反応は常法に従い行なわれる。更には、
本発明のポリペプチドに有機酸，無機酸又は塩基を常法
に従い作用させることにより本発明のポリペプチド塩を
形成せしめることができる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を
用いることにする。

Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グルシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA sscDNA 単鎖cDNA dscDNA 二重鎖cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA poly（Ａ）mRNA ポリアデニル酸含有伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 オリゴ（dT） オリゴデオキシチミジル酸 ポリ（Ａ） ポリアデニル酸 dC デオキシシチジル酸 dG デオキシグアニル酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 kbp キロ塩基対 bp 塩基対 SDS ドデシル硫酸ナトリウム MW 分子量 Ｓ配列 シャイン−ダルガーノ配列 TPA ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。

実施例１ ポリペプチド［TNF（150）］の製造 （１） 参考例１の（８）項で得た組み換え体プラスミ
ドpHTNF13から、制限酵素Pst Iによりクローン化DNAを
切り出し、更に非翻訳領域の一部を制限酵素EcoR Iで分
解除去し、約1.1kbpの断片を得た。これをプラスミドpB
R322のPst I−EcoR I断片（約3.6kbp）に組み込むこと
により再クローニングし、この組み換え体プラスミドを
pHTP113と名づけた。

このプラスミドpHTP113に制限酵素Ava IとSal Iを作
用させ３種のDNA断片（それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2.
6kbp）に切断した。これらのDNA断片のうち、ヒトTNFを
コードする領域の大部分とプラスミドpBR322のテトラサ
イクリン耐性遺伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を
分離精製した。この断片に、常法により合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT₄DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。ここに得られたDNA断片
を、以下DNA断片（イ）という。

一方、trpプロモーターベクターpDR720［Gene20,231
（1982）;P−Ｌバイオケミカルズ社より購入］に制限酵
素EcoR IとHpa Iを作用させ、trpプロモーター領域の一
部を含むDNA断片（35bp）を切り出した。このDNA断片の
塩基配列は次式に示す通りである。

これに、常法により合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT₄DNAリ
カーゼを用いて結合させた。これに得られたDNA断片
を、以下trpプロモーター断片という。

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoR IとSal I
を作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を切り出し
た。これに、先に調製したDNA断片（イ）とtrpプロモー
ター断片をT₄DNAリガーゼを用いて結合させることによ
り、第１表のアミノ酸番号84〜233番に相当する150残基
のアミノ酸よりなるポリペプチド［TNF（150）］生産用
の形質発現プラミドを構築した。この形質発現プラスミ
ドをpHTR55と名づけた（第２図参照）。

（２） このプラスミド（pHTR55）を参考例１の（６）
項に記載した方法に準じてE.coli HB101に導入し、形質
転換体を得た。形質転換体の選択はテトラサイクリン
（12.5μg/ml）耐性で行った。

この形質転換体をテトラサイクリン（12.5μg/ml）を
含むLBブロス（組成:1当り、トリプトン10g,酵母エキ
ス5g,NaCl10g;pH7.5）に一夜培養し、この培養液を10倍
量の改良M9培地（組成:0.7％Na₂HPO₄・12H₂O,0.3％KH₂P
O₄,0.05％NaCl,0.1％NH₄Cl,2mg/ビタミンB₁,0.45％カ
ザミノ酸,1mM MgSO₄,0.1mM CaCl₂,0.5％ブドウ糖）に接
種し、37℃で１時間培養し、次いでインドールアクリル
酸を最終濃度20μg/mlになるように加え、更に24時間培
養を継続したのち、遠心分離により菌体を集めた。菌体
を培地容量を1/10容量の0.1％リゾチームと30mM NaClを
含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁させ０℃
で30分間静置した。更にドライアイス／エタノール浴で
の凍結と37℃での融解を繰り返した後、遠心分離により
菌体残渣を除いた上清抽出液を得た。この抽出液につい
て、下記方法に従い抗腫瘍活性を測定した結果、３×10
³単位/ml値を示した。

（抗腫瘍活性の評価法） 検体を順次培地で希釈した試料0.1mlとＬ−Ｍ細胞（A
TCC,CCL1.2）の１×10⁵個/mlの懸濁液0.1mlを96穴の組
織培養用マイクロプレート（フロー・ラボラトリー社
製）に加える。培地は1v/v％のウシ胎児血清を含むイー
グルのミニマム・エッセンシャル培地［ポール著“セル
アンド ティッシュカルチュア";“Cell and Tissue
Culture",E＆S Livingstone Ltd.（1970）参照］を用い
る。このマイクロプレートを５％の炭酸ガスを含む空気
中、37℃で48時間培養する。培養終了後、グルタルアル
デヒド20μを加え、生き残った細胞を固定する。固定
後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、0.05％メチレ
ンブルー溶液を0.1ml加え、固定された細胞を染色す
る。余分なメチレンブルーを洗い流し、乾燥後、固定さ
れた細胞に付着したメチレンブルーを0.36N塩酸で抽出
し、その665nmにおける吸光度をタイターテック・マル
チキャン（フロー・ラボラトリー社製）で測定する。こ
の吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞
の50％を殺すために必要な生理活性量を１単位/mlと定
義し、試料を加えない対照の吸光度の50％の値に相当す
る試料の希釈率を、グラフあるいは計算によって求め、
その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位/mlで表記
する）とする。

実施例２ ポリペプチド［TNF（150）］の製造 （１） 参考例１の（８）項で得た組み換え体プラスミ
ドpHTNF13に制限酵素Ava IとHind IIIを作用させ、得ら
れたDNA断片を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離し、約600bpのDNA断片を単離した。このDNA断
片に、常法により合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT₄DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。得られたDNA断片を、以下D
NA断片（ロ）という。

一方、プラスミドpCT−１［Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
1,5959（1984）］に制限酵素HpaＩとAat IIを作用させt
rpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDNA断片［こ
のDNA断片の３′末端から上流のtrpプロモーター領域の
塩基配列は、ベネットらの報告（J.Mol.Biol.,121113,1
978年）に示されている］を切り出し、これを上記のDNA
断片（ロ）にT₄DNAリガーゼを用いて結合させた。得ら
れたDNA断片を、以下DNA断片（ハ）という。

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素Ava IとPvu II
を作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動により分離した。このDNA断片の両端
をDNAポリメラーゼＩ（クレノー フラグメント）及びd
GTP,dATP,dCTP,dTTPを用い平滑末端とし、その両端をT₄
DNAリガーゼを用いて結合させた。このプラスミドベク
ターをpBRS6という。更に、このベクター（pBRS6）に制
限酵素Aat IIとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片
（約3.6kbp）を単離精製した。このDNA断片に先に調製
したDNA断片（ハ）をT₄DNAリガーゼを用いて結合させる
ことにより、第１表のアミノ酸番号84〜233番に相当す
る150残基のアミノ酸よりなるポリペプチド生産用の形
質発現プラスミドを構築した。この形質発現プラスミド
をpHTP361と名づけた（第３図参照）。

（２） この形質発現プラスミドpHTP361を用い、実施
例１の（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製
し、培養したのち菌体抽出液を得た。

この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定し
た結果、４×10⁶単位/mlであった。

（３） （２）項で得た菌体抽出液に２％SDS,10％２−
メルカプトエタノール及び10％グリセロールを含む0.12
5M Tris−HCl緩衝液（pH6.8）を加え、室温にて30分間
静置ののち、12.5％ポリアクリルアミドゲル（２×170
×170cm）に負荷し、175Vで３時間泳動させた。泳動終
了後、ポリアクリルアミドゲルを蒸留水にて洗ったのち
ゲルの一部を切り取りクマシー ブリリアント ブルー
で染色した。約16×10³ダルトンの位置に濃いポリペプ
チドのバンドを確認したのち、その位置に対応するゲル
を2mm巾で切り出し、細切したのち１％重炭酸アンモニ
ウム水溶液に浸し、４℃にて24時間撹拌してゲル中のポ
リペプチドを抽出した。この操作を繰り返し行ない、得
られた抽出液を集め、凍結乾燥により濃縮した。この最
終調製品を以下の分析実験に供した。

（ｉ） 分子量 本品の分子量をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動分析にて測定した。

電気泳動分析の諸条件は上記方法に準じた。分子量既
知の標準蛋白質としてホスフォリラーゼｂ（MW94,00
0），ウシ血清アルブミン（MW67,000），オボアルブミ
ン（MW43,000），炭酸脱水酵素（MW30,000），大豆トリ
プシン インヒビター（MW20,100）及びα−ラクトアル
ブミン（MW14,400）を用いた。

その結果、分子量は16,000±2,000ダルトンと求めら
れた。

形質発現プラスミドpHTP361に組み込まれたポリペプ
チドをコードするDNAから翻訳されるアミノ酸配列（第
１表のアミノ酸番号84〜233番に相当するアミノ酸配
列）に基づいて算出される分子量は16,579ダルトン（た
だし、開始コドンATGに由来するメチオニンを除いた）
であり、上記測定値とほぼ一致している。

（ii） Ｎ末端部分アミノ酸配列 本品のＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法［Arch.B
iochem.Biophys.,22,475（1949）］により決定した。

その結果、Ｎ末端部のアミノ酸配列は、NH₂−Pro−Se
r−Asp…であった。

（iii） Ｃ末端部分アミノ酸配列 本品のＣ末端部分のアミノ酸配列はカルボキシペプチ
ダーゼ−Ａ及び−Ｙを用いる酵素法により決定した。

その結果、Ｃ末端部分のアミノ酸配列は…Ile−Ala−
Leu−COOHであった。

以上のことより本品は、第１表におけるアミノ酸番号
84〜233番に相当するポリペプチドであることが確認さ
れた。

実施例３ ポリペプチド［TNF（149）］の製造 （１） 第１表に示したアミノ酸配列第85〜233番に相
当する149残基のアミノ酸よりなるポリペプチド［TNF
（149）］生産用の形質発現プラスミド（pHTR56）を、
参考例３に示した組み換え体プラスミド（pHTR91）を用
いて構築した（第４図参照）。

組み換え体プラスミドpHTR91に制限酵素Cla IとBal I
を作用させ、４つのDNA断片に切断し、それらのうち２
種の小さな断片（それぞれ113bpと0.6kbp）を５％ポリ
アクリルアミド電気泳動にて分離精製した。このうち小
さな断片（113bp）を、更に制限酵素Dde Iにて２つのDN
A断片（47bpと66bp）に切断し、47bpのDNA断片を単離し
た。このDNA断片を、以下47bp断片という。

この断片に、常法によりそれぞれ合成した次式 及び次式 で示される２種類のオリゴヌクレオチド アダプターを
T₄DNAリガーゼを用いて順次結合させた。このDNA断片
を、以下DNA断片（ニ）という。

更に、このDNA断片（ニ）に実施例１に示した方法に
より得たtrpプロモーター断片をT₄DNAリガーゼを用いて
結合させた。このDNA断片を、以下DNA断片（ホ）とい
う。

このDNA断片（ホ）に、先にプラスミドpHTR91より制
限酵素Cla IとBal Iにより切り出した0.6kbpのDNA断
片、すなわち、ヒトTNFポリペプチドのＣ末端部分をコ
ードする領域を含むDNA断片を、T₄DNAリガーゼを用いて
結合させた。このDNA断片を、以下DNA断片（ヘ）とい
う。

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoR IとCla I
を作用させ、切断された２種のDNA断片のうち大きな断
片（約4.3kbp）を単離し、この断片に上記のDNA断片
（ヘ）をT₄DNAリガーゼを用 て結合させることにより、ポリペプチド［TNF（149）］
生産用の形質発現プラスミドを構築した。この形質発現
プラスミドをpHTR56と名づけた。

（２） この形質発現プラスミドpHTR56を用い、実施例
１の（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製
し、培養したのち菌体抽出液を得た。この抽出液中の抗
腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結果、１×10³単
位/mlであった。

実施例４ ポリペプチド［TNF（149）］の製造 （１） 実施例３の（１）項で得た47bp断片に常法によ
り合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプター，実施例３
の（１）項で合成したオリゴヌクレオチド アダプター
〔Ｅ〕、更に常法により合成した次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT₄DNAリ
ガーゼを用いてそれぞれ順次結合させた。このDNA断片
を、以下DNA断片（ト）という。

一方、プラスミドpCT−１に制限酵素Hpa IとAat IIを
作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDN
A断片を切り出し、これを上記のDNA断片（ト）にT₄DNA
リガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下DNA
断片（チ）という。

更に、参考例３で得た組み換え体プラスミドpHTR91に
制限酵素Bal IとHind IIIを作用させ、ヒトTNFのＣ末端
部分をコードする領域を含むDNA断片（487bp）を切り出
し分離精製し、この断片を上記のDNA断片（チ）にT₄DNA
リガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下DNA
断片（リ）という。

別途に、プラスミドベクターpBRS6（実施例２の
（１）項参照）に制限酵素Aat IIとHind IIIを作用さ
せ、大きなDNA断片（約3.6kbp）を単離精製した。このD
NA断片に先に調製したDNA断片（リ）をT₄DNAリガーゼを
用いて結合させることにより、第１表のアミノ酸番号85
〜233番に相当する149残基のアミノ酸よりなるポリペプ
チド［TNF（149）］生産用の形質発現プラスミドを構築
した。この形質発現プラスミドをpHTP367と名づけた
（第５図参照）。

（２） この形質発現プラスミドpHTP367を用い、実施
例１の（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製
し、培養したのちポリペプチド含有抽出液を得た。

この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定し
た結果、３×10⁶単位/mlであった。

（３） （２）項で得た抽出液から、ポリペプチドを分
離精製した。

抽出液100mlに10％ポリエチレンイミンの2mlを添加
し、混和放置後、遠心分離にて上清液を得た。この上清
液100mlに飽和硫酸アンモニウム水溶液の200mlを添加
し、混和放置後、遠心分離に沈殿を集めた。この沈殿を
10mlの20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に溶解し、同緩
衝液に対して透析した。

その透析内液を、あらかじめ同緩衝液にて平衡化した
DEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社）のカラム
に負荷した。20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて同カ
ラムを十分洗浄したのち、NaClの０〜0.3Mの濃度勾配で
溶出した。

抗腫瘍活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃
縮し、更にセファクリルＳ−200カラムによるゲル濾過
に付した。

溶媒には5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液（pH7.4）を用
いた。溶出位置として約35,000〜45,000ダルトンに相当
する画分に、抗腫瘍活性を有するポリペプチドを回収
し、精製ポリペプチド［TNF（149）］を得た。

ここで得られた精製ポリペプチドについて、実施例２
の（３）項に示した方法に従って分子量,N末端及びＣ末
端のアミノ酸配列を分析した結果、分子量は16,500±30
0ダルトンと求められ、Ｎ末端部分のアミノ酸配列は、S
er−Asp−Lys−Pro…であった。翻訳開始コドンATGに由
来するMetは除かれていた。また、Ｃ末端アミノ酸とし
てLeuが同定された。

以下の結果より、本品は第１表に示したアミノ酸配列
第85〜233番に相当するポリペプチドであることが確認
された。

実施例５ ポリペプチド［TNF（149）］の製造 （１） 第１表に示したアミノ酸配列第86〜第233番目
に相当するポリペプチド［TNA（148）］生産用の形質発
現プラスミド（pHTP369）を、参考例３に示した組み換
え体プラスミド（pHTR91）を用いて構築した（第６図参
照）。

実施例３の（１）項で得た47bp断片に、常法により合
成した次式 で示されるオリゴブヌクレオチド アダプター及び実施
例３の（１）項で合成したオリゴヌクレオチドアダプタ
ー〔Ｅ〕をT₄DNAリガーゼを用いて順次結合させた。

このDNA断片を、以下DNA断片（ヌ）という。

更に、このDNA断片（ヌ）に実施例４の（１）項で合
成したオリゴヌクレオチド アダプター〔Ｇ〕をT₄DNA
リガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下DNA
断片（ル）という。

一方、プラスミドpCT−１に制限酵素Hpa IとAat IIを
作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約380bpのDN
A断片を切り出し、これを上記のDNA断片（ル）にT₄DNA
リガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下DNA
断片（オ）という。

更に、参考例３で得た組み換え体プラスミドpHTR91に
制限酵素Bal IとHind IIIを作用させ、ヒトTNFのＣ末端
部分をコードする領域を含むDNA断片（487bp）を切り出
し分離精製し、この断片を上記のDNA断片（オ）にT₄DNA
リガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下DNA
断片（ワ）という。

別途に、プラスミド ベクターpBRS6に制限酵素Aat I
IとHind IIIを作用させ、大きなDNA断片（約3.6kbp）を
単離精製した。このDNA断片に先に調製したDNA断片
（ワ）をT₄DNAリガーゼを用いて結合させることによ
り、ポリペプチド［TNF（148）］生産用の形質発現プラ
スミドを構築した。この形質発現プラスミドをpHTP369
と名づけた。

（２） この形質発現プラスミドpHTR369を用い実施例
１の（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製
し、培養したのちポリペプチド含有抽出液を得た。この
抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法に従い測定した結
果、５×10⁵単位/mlであった。

（３） （２）項で得た抽出液から、ポリペプチド［TN
F（148）］を分離精製した。

抽出液100mlに10％ポリエチレンイミンの2mlを添加
し、混和放置後、遠心分離にて上清液を得た。この上清
液100mlに硫酸アンモニウムを55％飽和になるように添
加し、混和放置後、遠心分離にて沈殿を集めた。この沈
殿を10mlの20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）に溶解し、
同緩衝液に対して透析した。

その透析内液を、あらかじめ同緩衝液にて平衡化した
DEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社）のカラム
に負荷した。20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて同カ
ラムを十分洗浄したのち、NaClの０〜0.2Mの濃度勾配で
溶出した。

抗腫瘍活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて濃
縮し、更にセファクリルＳ−200カラムによるゲル濾過
に付し、抗腫瘍活性を有するポリペプチドを回収した。
溶媒には5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液（pH7.4）を用い
た。

この画分を再び上記と同方法でDEAE−セファロースCL
−6Bを用いるカラム クロマトグラフィーを繰返し、更
に限外濾過にて濃縮したのち、トヨパールHW−55カラム
によるゲル濾過に付し、精製ポリペプチドTNF（148）を
得た。

この精製ポリペプチドについて、実施例２の（３）項
に示した方法に従って、分子量,N末端及びＣ末端部分の
アミノ酸配列を分析した結果、分子量は16,500±2,000
ダルトンと求められた。Ｎ末端部分のアミノ酸配列は、
Met−Asp−Lys−Pro−Val−…であった。また、Ｃ末端
アミノ酸としてLeuが同定された。

以上の結果より本品は、第１表におけるアミノ酸番号
第86〜233番に相当するポリペプチドのＮ末端にMetが付
加されたものであることが確認された。

実施例６ ポリペプチド［TNF（147）］の製造 （１） 第１表に示したアミノ酸配列第87〜233番目に
相当するポリペプチド［TNF（147）］生産用の形質発現
プラスミドを、実施例５の（１）項に示した方法に従
い、但し合成オリゴヌクレオチド アダプター〔Ｈ〕の
代りに、次式〔Ｉ〕 で示される合成アダプターを用いて構築した。

（２） この形質発現プラスミドを用い、実施例１の
（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培
養したのちポリペプチド［TNF（147）］含有抽出液を得
た。この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法により測定
した結果、６×10⁵単位/mlであった。

（３） （２）項で得られた抽出液から、実施例５の
（３）項に示した方法に従って、ポリペプチド［TNF（1
47）］を分離精製した。

この精製ポリペプチドについて、実施例２の（３）項
に示した方法に従って分子量,N末端及びＣ末端部分アミ
ノ酸配列を分析した結果、分子量は16,300±2,000ダル
トンと求められた。Ｎ末端部分のアミノ酸配列は、Met
−Lys−Pro−Val−Ala…であった。またＣ末端アミノ酸
としてLeuが同定された。以上の結果より、本品は第１
表におけるアイノ酸第87〜233番に相当するポリペプチ
ドのＮ末端にMetが付加されたものであることが確認さ
れた。

実施例７ ポリペプチド［TNF（146）］の製造 （１） 第１表に示したアミノ酸配列第88〜233番目に
相当するポリペプチド［TNF（146）］生産用の形質発現
プラスミドを、実施例５の（１）項に示した方法に従
い、但し合成オリゴヌクレオチド アダプター〔Ｈ〕の
代りに、次式 で示されるアダプターを用いて構築した。

（２） この形質発現プラスミドを用い、実施例１の
（２）項に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培
養したのちポリペプチド［TNF（146）］含有抽出液を得
た。この抽出液中の抗腫瘍活性は前記評価法により測定
した結果、１×10²単位/mlであった。

参考例１ ヒトTNF前駆体をコードするDNAのクローニン
グ （１）ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の単離 ヒト肺洗浄液からマクロファージを採取し、この肺胞
マクロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−164培地
に懸濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当た
り９×10⁶個となるように播き、37℃で前培養した。１
時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポ
ポリサッカライド）,TPA及びシクロヘキシミドをそれぞ
れ最終濃度が10μg/ml,10ng/ml及び１μg/mlとなるよう
に添加混和し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後に
培養液を吸引除去しディッシュ上に残ったマクロファー
ジを0.6％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと6mMクエ
ン酸ナトリウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で
溶解し、ホモジナイズした。このホモジネートを0.1M E
DTAが含有5.7M CsCl₂水溶液上に重層し、超遠心分離機
（RPS27−２ローター，日立製作所製）を用い26,500rpm
で20時間遠心し、全RNA画分をペレットとして得た。こ
れを0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素
液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝
液（pH7.4）（以下TE液という）1mlに溶解し、65℃で５
分間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオ
リゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したpoly
（Ａ）mRNAをTE液で溶出することにより、poly（Ａ）mR
NAを得た。

（２）cDNAの合成 （１）項で得られたpoly（Ａ）mRNAを鋳型としてグブ
ラーとホフマンの方法［Gene25,263（1983）］に従って
cDNAを合成した。すなわち、６μｇのpoly（Ａ）mDNA
を、10mM MgCl₂,10mMジチオスレイトール,4mMピロホス
フェート ナトリウム,1.25mM dGTP,1.25mM dATP,1.25m
M dTTP,0.5mM dCTP,0.167μＭα−³²P−dCTP（比活性30
00Ci/mmole）,4μｇオリゴ（dT）_12〜18および120単位
トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵素を含む50mM T
ris−HCl緩衝液（pH8.3）の40μに溶解させ、43℃で3
0分間反応させた後、EDTAを加えて反応を停止させ、フ
ェノール−クロロホルム混液（1:1）で抽出し、その水
層に酢酸アンモニウムを最終濃度2.5Mになるように加
え、エタノールにより反応生成物（sscDNA−RNA複合
体）を沈殿させた。このsscDNA−RNA複合体を、5mM MgC
l₂,10mM（NH₄）₂SO₄,100mM KCl,0.15mM β−ニコチンア
ミド アデニン ジヌクレオチド,50μg/mlウシ血清ア
ルブミン,40μM dGTP,40μM dATP,40μM dTTP,40μM dC
TP,0.9単位大腸菌リボヌクレアーゼH,23単位大腸菌DNA
ポリメラーゼＩを含む20mM Tris−HCl緩衝液（pH7）100
μに溶解した。

12℃で60分間、続いて22℃で60分間反応させた後、ED
TAを加えて反応を停止させ、上記と同様にフェノール−
クロロホルム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ
てdscDNAを得た。

（３）dCテール付加cDNAの調製 （２）項で得られたdscDNAを2mM CoCl₂,0.2mMジチオ
スレイトール,0.1mM³²P−dCTP（比活性3Ci/mmole）及び
10単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを含有する100mMカコジル酸ナトリウム（pH7.2）
100μに溶解し、37℃で30分間反応させ、dscDNAの
３′末端にdCテールを付加させた。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−
クロロホルム混液で抽出し、dCテ−ル付加cDNAをエタノ
ールにより沈殿させ回収した。これを10mM Tris−HCl緩
衝液（pH7.4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含む水溶液に
1ml当たり２μｇのdCテール付加cDNAを含むように溶解
した。

（４）dGテール付加プラスミドpBR322DNAの調製 プラスミドpBR322DNAの10μｇを、20mM Tris−HCl緩
衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM（NH₄）₂SO₄及び1ml当
たり0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液100μに
溶解し、制限酵素Pst Iエンドヌクレアーゼ15単位を加
え、37℃で１時間反応させた。反応液からDNAをフェノ
ール−クロロホルム混液による抽出とエタノール沈殿に
よって回収した。得られたDNAを（３）項に示した方法
に従って、dGテープ付加プラスミドpBR322を得た。但
し、反応液量は200μとし、³²P−dCTPの代わりに³H−
dGTPを用い、さらに80単位のターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃で20分
間反応させた。これを（３）項に示したdCテール付加cD
NAの場合と同様の緩衝液に1ml当たり20μｇのdGテール
付加プラスミドpBR322DNAを含むように溶解した。

（５）組み換え体プラスミドの作製 （３）項で得られたdCテール付加cDNA溶液120μ
を、（４）項で得られたdGテール付加pBR322DNA溶液120
μと混合し、65℃で５分間、57℃で120分間インキュ
ベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラスミド
溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択 （５）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用
い、E.coli χ1776株を形質転換させた。即ち、E.coli
χ1776株を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミ
ジン40μg/mlを補ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度
（600nm）が0.5となるまで培養し、菌体を４℃で遠心し
て集め、50mM CaCl₂含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.
3）10mlに分散し、４℃で再度遠心して沈殿させた。集
めた菌体を同じ緩衝液2mlに分散し、０℃で５分間静置
した。この分散液0.2mlに（５）項で得られた組み換え
体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静
置し、更に42℃で２分間保持した後、前の培養で用いた
のと同一組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培
養を行った。この培養液の一部を取り、上記成分の他に
テトラサイクリン15μg/mlを含むＬ−ブロス寒天天板に
広げ、37℃で約12時間培養し、テトラサイクリン耐性菌
を選択してcDNAライブラリーを作製した。

（７）クローニング （６）項で得られたcDNAライブラリーについて、ヒト
TNFをコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換
体をスクリーニングするため、コロニー・ハイブリダイ
ゼーション試験をハナハン（Hanahan）らの方法［Gene1
0,63（1980）］に従って行った。プローブとして、参考
例２の（８）項で得たウサギTNFをコードするクローン
化DNAを制限酵素Hae II及びAva Iを用いて切り出し、そ
れぞれ第２表の18〜105番の88bpから成るDNA断片と270
〜568番の299bpから成る２種類のDNA断片を単離し、³²P
で標識したものを用いた。約２万個のコロニーから、こ
れらの標識プローブと強く結合する６個のコロニーを選
び出した。

（８）クローン化DNAの塩基配列の決定 （７）項で選択された組み換え体プラスミドの中から
pHTNF−13を選び、そのクローン化cDNAの塩基配列をマ
キサム−ギルバート法により決定した。この塩基配列の
解析により明らかにされたヒトTNF前駆体をコードする
領域の塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されるアミノ
酸配列は第１表の通りである。成熟ヒトTNFをコードす
る領域（〔 〕で囲んだ部分）は、第２表に示した成熟
ウサギTNFをコードする塩基配列との相同性に基づいて
決定した。

参考例２ ウサギTNFをコードするDNAのクローニング （１）ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の単離 ウサギ（体重約2.5kg）にプロピオニバクテリウム
アクネス死菌体を１羽当り100mgの投与量で静脈内に注
入し、８日後に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、気管
内に挿入したチューブを介してリン酸緩衝化生理食塩液
を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを採取し、
この肺胞マクロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−
1640倍地に懸濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に
１枚当り２×10⁷個となるように播き、37℃で１時間培
養した。更に、参考例１の（１）項に示した方法に従っ
て、エンドトキシン,TPA及びシクロヘキシミドとともに
培養し、マクロファージからpoly（Ａ）mRNAを得た。こ
こで得たpoly（Ａ）mRNAをアガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度１％,6M尿素存在下,pH4）に付し、分子サイズと
して1.6〜2.7kbに相当する画分にウサギTNF mRNAを高濃
度に回収した。

（２）cDNAの合成 （１）項で得た精製poly（Ａ）mRNA4μｇを、10mM Mg
Cl₂,70mM KCl,1mMジチオスレイトール,0.5mM dTTP,0.5m
M dCTP,0.5mM dATP,0.5mM dGTP（但しdCTPは³²Pで標
識，比活性4.4×10⁶cpm/nmole）,3μｇオリゴ（dT）
_12〜18及び80単位トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写
酵素を含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.3）の100μに
溶解させ、43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液で反
応を停止させた。フェノール−クロロホルム混液（1:
1）によりcDNA−mRNA複合体を抽出し、エタノールによ
り沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処理すること
によりmRNAを分解除去した後、合成されたsscDNAをエタ
ノールにより沈殿させ回収した。

このsscDNAを、0.5mM dATP,0.5mM dTTP,0.5mM dGTP,
0.5mM dCTP,5mM MgCl₂,70mM KCl,1.5mM β−メルカプト
エタノール,8単位大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ラージフ
ラグメント）を含有する0.1Mへペス緩衝液（pH6.9）の4
0μに溶解し、15℃で20時間反応させdscDNAを合成し
た。反応液にSDS水溶液を加えて反応を停止させ、dsc D
NAをフェノール−クロロホルム混液で抽出し、エタノー
ルにより沈殿させ回収した。

得られたdscDNAの沈殿を、50mM酢酸ナトリウム（pH4.
5）,1mM ZnSO₄,200mM NaCl,0.5％グリセロール及びS1ヌ
スレアーゼ0.5単位を含有する水溶液100μに溶解し、
37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂させた。反
応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−クロ
ロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した後、
エタノールにより沈殿させdscDNAを回収した。

（３）dCテール付加cDNAの調製 （２）項で得られたdscDNAの３′末端に参考例１の
（３）項に示した方法に準じて、dCテールを付加させ、
これを10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）,1mM EDTA及び10
0mM NaClを含む水溶液に1ml当り0.2μｇのdCテール付加
cDNAを含むように溶解した。

（４）dGテール付加プラスミドpBR322 DNAの調製 dGテール付加プラスミドpBR322は参考例１の（４）項
の方法により調製した。これをdCテール付加cDNAの場合
と同様の緩衝液に1ml当り２μｇのdGテール付加プラス
ミドpBR322 DNAを含むように溶解した。

（５）組み換え体プラスミドの作製 dCテール付加cDNA溶液50μをdGテール付加pBR322 D
NA溶液50μと混合し、65℃で10分間、57℃で120分
間、45℃で60分間、35℃で60分間及び室温で60分間イン
キュベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラス
ミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択 （５）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用
い、参考例１の（６）項の方法に従ってE.coli χ1776
株を形質転換させ、cDNAライブラリーを作製した。

（７）ハイブリダイゼーション試験 （６）項で得られたcDNAライブラリーの中から、下記
の方法によりウサギTNFをコードするcDNAを含むプラス
ミドを持つ形質転換体をスクリーニングした。（１）項
の方法で得たmRNAを鋳型として、（２）項の方法で合成
した³²P標識sscDNAを誘導プラス プローブとした。但
し、³²P−dCTPは高放射能比活性のものを用い、高濃度
に標識した。別に、エンドトキシン,TPA及びシクロヘキ
シミドによる培養を省略したマクロファージを用いて、
同じ方法により調製した³²P標識sscDNAを誘導マイナス
プローブとした。約２万個のコロニーについて、これ
らのプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーショ
ン試験を行ったところ、誘導プラスのプローブと強く結
合し、誘導マイナスのプローブとはハイブリダイズしな
い塩基配列を含む組み換え体プラスミドを有する50個の
コロニーを選別した。

次いで、これらの選択された形質転換体の20個につい
てハイブリダイゼーション・トランスレーション試験を
マニアティス編“モレキュラークローニング”［“Mole
cular Cloning",329（1980）,Cold Spring Harbor La
b.,］に記載の方法に従って行った。それぞれの形質転
換体よりプラスミドDNAを抽出し、ニトロセルロースフ
ィルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記
（１）項で得たウサギTNF mRNAを含むpoly（Ａ）mRNA画
分を加え、50℃で180℃分間反応させ、ハイブリダイゼ
ーションを行った。結合したmRNAを溶出回収した後、ア
フリカツメガエルの卵母細胞を用いる方法により蛋白質
に翻訳させ、その蛋白質のＬ細胞傷害活性をラフの方法
［J.Immunol 126,235（1981）］に準じて測定すること
により、回収されたmRNAがウサギTNF mRNAであるか否か
を検定した。この試験により、ウサギTNF mRNAと強くハ
イブリダイズするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換
体３個を見いだした。そのうち最も長いcDNA（約750b
p）を有するプラスミドよりcDNAを単離し、制限酵素Dde
IでDNA断片を切り出し、二次スクリーニング用のプロ
ーブとした。このDNA断片を³²Pで標識し、上記（６）項
で得たcDNAライブラリーについて再度コロニー・ハイブ
リダイゼーション試験を行い、標識プローブと強く結合
するcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を選んだ。
cDNAライブラリーの約６万個のコロニーのうち98個が陽
性コロニーであった。これらからcDNAを制限酵素Pst I
で切り出し、そのサイズをポリアクリルアミドゲル電気
泳動で調べ、1kbp以上のサイズを有する17個のクローン
を選び出した。これらのうち最も大きなcDNAを含む形質
転換体（組み換え体プラスミド番号:pRTNF802）につい
て、クローン化DNAを単離し、塩基配列を決定した。

（８）クローン化DNAの塩基配列の決定 （７）項で選択された組み換え体プラスミド（pRTNF8
02）から単離したクローン化cDNAの塩基配列をマキサム
−ギルバート法で決定した。

その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ
酸配列は第２表の通りである。ウサギTNF前駆体は第２
表の19〜723番の塩基配列に、成熟ウサギTNFは262〜723
番の塩基配列にコードされている。

参考例３ 成熟ヒトTNF生産用形質発現プラスミドの構
築 実施例１の（１）項で得たプラスミドpHT113に制限酵
素Ava IとSal Iを作用させ、３種のDNA断片（それぞれ
約0.8kbp,1.3kbp及び2.6kbp）に切断した。これらの断
片のうち、ヒトTNFをコードする領域の大部分とプラス
ミドpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む
約1.3kbpのDNA断片を分離精製した。この断片に、次式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをT₄DNAリ
ガーゼを用いて結合させた。このDNA断片を、以下HTNF
−アダプター断片という。

別途に、プラスミドpBR322に制限酵素EcoR IとSal I
を作用させ、大きなDNA断片（約3.7kbp）を切り出し
た。これに、先に調製したHTNF−アダプター断片と実施
例１の（１）項で得たtrpプロモーター断片をT₄DNAリガ
ーゼを用いて結合させることにより、第１表のアミノ酸
番号79〜233番に相当する155残基のアミノ酸よりなる成
熟ヒトTNF生産用の形質発現プラミドを構築した。この
形質発現プラスミドをpHTR91と名づけた。

第７図はpHTR91の構築工程を示す。

参考例４ ポリペプチド［TNF（151）］の製造 第１表に示したアミノ酸配列第83〜233番目に相当す
るポリペプチド［TNF（151）］生産用の形質発現プラス
ミドを、参考例３の示した方法に従い、但し合成オリゴ
ヌクレオチド アダプター〔Ｋ〕の代りに で示される合成アダプターを用いて構築した。

この形質発現プラスミドを用い、実施例１の（２）項
に示した方法に従い、形質転換体を作製し、培養したの
ちポリペプチド含有抽出液を得た。

この抽出液について、実施例１の（２）項に記載した
抗腫瘍活性の評価法により測定した結果、２×10⁵単位/
mlであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトTNFのアミノ酸配列の親水性・疎水性領域
解析図を示す。 第２図は形質発現プラスミドpHTR55の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ａ〕，〔Ｂ〕は実施例１で示したそれ
ぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味す
る。 第３図は形質発現プラスミドpHTP361の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ｃ〕は実施例２で示した合成オリゴヌ
クレオチド アダプターを意味する。 第４図は形質発現プラスミドpHTR56の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ｄ〕，〔Ｅ〕は実施例３で示したそれ
ぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプターを意味す
る。 第５図は形質発現プラスミドpHTP367の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ｅ〕は実施例３で、〔Ｆ〕，〔Ｇ〕は
実施例４で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド
アダプターを意味する。 第６図は形質発現プラスミドpHTP369の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ｅ〕は実施例３で、〔Ｇ〕は実施例４
で、〔Ｈ〕は実施例５で示したそれぞれの合成オリゴヌ
クレオチド アダプターを意味する。 第７図は形質発現プラスミドpHTR91の構築工程図を示
す。尚、図中の〔Ｂ〕は実施例１で、〔Ｋ〕は参考例３
で示したそれぞれの合成オリゴヌクレオチド アダプタ
ーを意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (56)参考文献 特表 昭62−500631（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．312，（1984) Ｐ．724−729

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列： Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Try Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu からなるポリペプチドのＮ末端にPro−Ser−Asp−Lys−
   が結合してなる抗腫瘍活性を有するポリペプチド。