JP2577304B2 - ヒト インターロイキン１活性を有するポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト インターロイキン
１をコードするクローン化ＤＮＡを組み込んだベクター
により形質転換された宿主を培養することにより生産さ
れるヒト インターロイキン１及びそれと実質的に同等
の生物活性を有する物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】Geryらはヒト マクロファージの培養上
清中に、マイトーゲンによるマウス胸腺細胞分裂作用を
促進させる物質を見出し、これをリンパ球活性化因子
（lymphocyte activating factor、以下ＬＡＦと略記す
る）と名付けたが、1979年以降、インターロイキン１
（以下、ＩＬ−１と略記する）の名称が用いられてい
る。従って本明細書においてもこのような物質をインタ
ーロイキン１として扱う。

【０００３】ＩＬ−１はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促
進させ、またＴ細胞に作用してリンホカイン、特にイン
ターロイキン２（Ｔ細胞増殖因子）の産生を促進させる
効果を有し、抗体産生や細胞性免疫の調節に重要な役割
を果たす因子の一つと考えられている〔Staruch, M.J.,
et al., J. Immunol., 130, 2191（1983）〕。その
他、プロスタグランジンＥやコラゲナーゼの産生促進，
繊維芽細胞の増殖促進，又はインターロイキン２やイン
ターフェロンの有するＮＫ（ナチュラル キラー）細胞
活性化作用を増強させる効果があると報告されている
〔Simon, P.L., etal., "Lymphokines" vol. 6, p.47
(1982), Academic Press Inc., New York〕。

【０００４】このようにＩＬ−１は免疫応答のみなら
ず、生体の防御やその修復等にも関与する生体物質であ
り、免疫不全症に対する治療薬や抗腫瘍剤としての臨床
応用が期待されている。

【０００５】ＩＬ−１のこれまでの取得方法は、主とし
てマクロファージや末梢単核細胞又はマクロファージ様
株化細胞（例えばマウスＰ３８８Ｄ₁ 細胞）や単球性又
は骨髄性白血病細胞等を適当な誘導剤の存在下で培養
し、その培養上清中より単離するものである。

【０００６】ヒトＩＬ−１は、ヒト単球性白血病株化細
胞であるＵ９３７細胞及びヒト末梢単核細胞の培養上清
から分離精製され、その分子量が11,300及び15,000ダル
トンであると報告されている〔Mizel, S.B., et al.,
J. Immunol., 131, 1834 (1983); Schmidt, J.A., J. E
xp. Med., 160, 772 (1984)〕。

【０００７】最近、マウスＰ３８８Ｄ₁ 細胞を用いマウ
スＩＬ−１をコードするｃＤＮＡをクローニングし、Ｉ
Ｌ−１活性を有する１５６個のアミノ酸から成るポリペ
プチドを大腸菌で生産させることに成功したと報告され
ている〔Lomedico, P.T., etal., Nature, 312, 458 (1
984)〕。

【０００８】

【発明の目的】本発明者らは、遺伝子組み換え技術を応
用してヒトＩＬ−１を製造すべく鋭意研究を続けた結
果、ヒトＩＬ−１をコードするクローン化ＤＮＡの単離
に成功し、このクローン化ＤＮＡを組み込んだ組み換え
体プラスミドで形質転換された微生物がＩＬ−１を産生
することを確認し、本発明を完成した。

【０００９】更に詳述すれば、本発明者らはヒト白血病
細胞をin vitroで分化誘導剤と共に培養し、マクロファ
ージ様細胞に分化させた細胞をＩＬ−１産生のための誘
導剤と共に培養し、該細胞中にＩＬ−１ｍＲＮＡを産生
蓄積させ、このｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡライブラ
リーを作製し、この中からヒトＩＬ−１をコードするＤ
ＮＡのクローン化に成功し、その塩基配列を決定した。
そして、該クローン化ＤＮＡを形質発現べクターに組み
込ませ、該べクターで形質転換された宿主中にヒトＩＬ
−１活性を有するポリペプチドを産生せしめることに成
功した。この研究過程において、ヒトＩＬ−１が前駆体
として作られること及びその全アミノ酸配列を明らかに
した。

【００１０】

【発明の構成及び効果】ヒトＩＬ−１前駆体をコードす
るＤＮＡは配列番号１の塩基配列で表される。

【００１１】配列番号１で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡは、配列番号２で表されるポリペプチドをコードす
る。

【００１２】ヒトＩＬ−１の生物活性発現には、必ずし
も配列番号２で表されるポリペプチドの全構造を必要と
しない。このことは配列番号２中、Ｃ末端から２０９残
基のアミノ酸から成るポリペプチドはＬＡＦ活性を有し
ていることからも明らかである。

【００１３】従って、配列番号２で表されるポリペプチ
ドはヒトＩＬ−１の前駆体であり、その生物活性に必須
な部分はそのＣ末端側に存在すると考えられる。

【００１４】 ヒト ＩＬ−１をコードするＤＮＡに
は、配列番号２に対応する塩基配列の全部もしくはその
下流部を有するＤＮＡ及びその部分的に修飾されたＤＮ
Ａ並びにこれらの対立遺伝子変異体ＤＮＡが包含され
る。なお、対立遺伝子変異体ＤＮＡとは、「特定の遺伝
子配列の代替型（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）
であって、対応する染色体の同じ座に生じ、その優性又
は劣性遺伝子を問わない」とも定義されており、本願明
細書でもこれと同じ意味で使用する。従って、対立遺伝
子変異体（ポリペプチド）とは対立遺伝子変異体ＤＮＡ
の転写−翻訳物（ポリペプチド）を意味する。

【００１５】ヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡを組み込
んだ形質発現ベクターで形質転換された宿主により産生
されるポリペプチド又はその分解物がヒトＩＬ−１と実
質的に同等な生物活性を有するか或いは潜在的にそのよ
うな活性を有する限り、これらのポリペプチドは本発明
に係るポリペプチドに包含される。以下これらのポリペ
プチドを「本発明に係るポリペプチド」と総称する。

【００１６】なお、上述の部分的に修飾されたＤＮＡと
は、配列番号１で表される全塩基配列又はその下流部の
塩基配列において、一部のコドンが欠失及び／又は他の
コドンで置き換えた塩基配列、及び／又は他のコドンが
挿入及び／又は付加された塩基配列を有するＤＮＡを意
味する。

【００１７】ヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡは、ヒト
白血病細胞を分化誘導剤と共に培養し、マクロファージ
様細胞に分化させた細胞又はヒトマクロファージ或いは
ヒト末梢単核球を誘導剤と共に培養し、該細胞からヒト
ＩＬ−１ｍＲＮＡを含む画分を分離し、これをもとにし
てｃＤＮＡライブラリーを作製し、これよりヒトＩＬ−
１ｃＤＮＡをクローン化することにより製造することが
できる。

【００１８】このヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡは従
来既知の手法を用いて、該ＤＮＡの塩基配列の一部のコ
ドンが欠失及び／又は他のコドンで置き換えた塩基配
列，及び／又は他の塩基配列が挿入及び／又は付加され
た塩基配列を有するＤＮＡに修飾することができる。該
ＤＮＡ又はその修飾体ＤＮＡは更にそのコドンの一部を
対応する縮重コドンと置き換えることも可能である。

【００１９】ヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡの製造法
を工程順に示すと以下の通りである。 （１） ヒトマクロファージ又はマクロファージ様細胞
を誘導剤と共に培養する。 （２） 該細胞からヒトＩＬ−１ｍＲＮＡを含む画分を
分離する。 （３） 該ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてｓ
ｓｃＤＮＡを合成し、次いでｄｓｃＤＮＡに変換する。 （４） 該ｄｓｃＤＮＡをべクターに組み込む。 （５） 該組み換え体を宿主に導入し、形質転換せしめ
ｃＤＮＡライブラリーを作製する。 （６） 該ライブラリーからヒトＩＬ−１をコードする
ｃＤＮＡをクローニングする。 （７） 所望により、該クローン化ｃＤＮＡを改築す
る。

【００２０】ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡを組み込んだ形質発
現ベクターにより形質転換した宿主を培養し、その宿主
中又は培地中にヒトＩＬ−１の生物活性或いは潜在活性
を有するポリペプチドを産生せしめることができる。

【００２１】以下にヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡの
製造方法並びに本発明に係るポリペプチドの産生方法を
より具体的に説明する。

【００２２】ヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡの製造 Ｉ．ヒトＩＬ−１ｍＲＮＡの調製 ヒト白血病細胞を用いる場合には、該細胞を１×10⁵ 〜
５×10⁶ 個／mlの細胞密度で播き、これに分化誘導剤を
添加する。分化誘導剤の添加量は、その種類，細胞の種
類，培養条件等により異なるが、一般に約100 〜2,000n
g/ml（最終濃度）が好ましい。ヒト白血病細胞を分化誘
導剤と共に35〜38℃、好ましくは約37℃、約５〜10％炭
酸ガス含有空気中、湿度約90〜100 ％で約24〜72時間培
養する。

【００２３】ここで使用しうるヒト白血病細胞としては
分化誘導剤の作用によりマクロファージ様細胞に分化す
るヒト白血病株細胞はすべて用いることができる。例え
ばＨＬ−６０細胞（ATCC, CCL240），ＴＨＰ−１細胞，
Ｍｏｎｏ−１−２０７細胞が挙げられる。また、白血病
患者から分離した初代細胞も同様に用いることができ
る。

【００２４】分化誘導剤としては、例えば、ホルボール
エステル類、メゼレインのようなジテルペン系化合物が
挙げられる。

【００２５】培地としては、高等動物細胞の培養に適し
た各種合成培地が用いられ、例えばＲＰＭＩ−１６４
０，イーグルのＭＥＭ培地，ダルベッコ変法によるＭＥ
Ｍ培地〔宗村庚修編「細胞培養マニュアル」，講談社
（1982）及びCell and Tissue Culture, J. Paul, E. &
S. Livingstone Ltd.（1970）参照〕が挙げられる。培
地には全培養液量の約１〜20％の動物血清（例えば牛胎
児血清，子牛血清）を加えておくのが好ましい。

【００２６】細胞が培養容器面に付着し、マクロファー
ジ様細胞に分化したことを確認した後、以下の操作を行
う。なお、白血病細胞を用いることなく、肺，血液，腹
腔，胎盤，脾臓等の組織から採取したヒトマクロファー
ジを用いる場合には上記の分化誘導操作は省略できる。

【００２７】上記の培養を行った後、培養液及び浮遊細
胞を吸引除去する。次いで、ＩＬ−１の産生を誘導する
誘導剤（例えばグラム陰性菌より得られたエンドトキシ
ン）と、蛋白合成阻害剤（例えばシクロヘキシミド）を
加え、更に３〜８時間培養することにより、ヒトＩＬ−
１ｍＲＮＡを該分化細胞中に蓄積させる。エンドトキシ
ンの場合の添加量は一般に約0.1 〜1000μg/ml、好まし
くは約１〜100 μg/mlであり、シクロヘキシミドの場合
の好ましい添加量は0.1 〜50μg/mlである。

【００２８】培養終了後、該細胞より、例えばChirgwin
らの方法〔Biochemistry, 18, 5294(1979) 〕により全
ＲＮＡを抽出し、次いでこれを常法に従ってオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース又はポリ（Ｕ）セファロースなどを用い
る吸着カラムクロマトグラフィーに付すか又はバッチ法
によりポリ（Ａ）ｍＲＮＡ画分を分離する。このポリ
（Ａ）ｍＲＮＡ画分を酸性尿素アガロースゲル電気泳動
又はショ糖密度勾配遠心分離に付すことによりヒトＩＬ
−１ｍＲＮＡを濃縮精製することができる。

【００２９】ここに得られたｍＲＮＡ画分が目的とする
ヒトＩＬ−１をコードするｍＲＮＡを含むものであるこ
とを確認するためには該ｍＲＮＡ画分をタンパクに翻訳
させてその生物活性を調べればよい。例えば該ｍＲＮＡ
画分をアフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細
胞に注入するか、又は網状赤血球ライセート，小麦胚芽
のような適当な蛋白合成系に添加してタンパクに翻訳さ
せ、そのタンパクがＬＡＦ活性を有することを確認すれ
ばよい。

【００３０】II．ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡのクローニング Ｉの工程で得られたｍＲＮＡ画分を鋳型とし、オリゴ
（ｄＴ）をプライマーとして、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵素（例えばトリ骨
髄性白血病ウイルス由来逆転写酵素）によりｍＲＮＡと
相補的なｓｓｃＤＮＡを合成し、次いでこのｓｓｃＤＮ
Ａを鋳型にして、逆転写酵素あるいは大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（ラージフラグメント）等を用いてｄｓｃＤ
ＮＡを合成する。ここに得られたｄｓｃＤＮＡを、ポリ
（ｄＧ）−ポリ（ｄＣ）ホモポリマー伸長法〔Nelson,
T.S., "Methods in Enzymology", 68, 41 (1979), Acad
emicPress Inc., New York参照〕のような常法に従っ
て、例えばプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＰｓｔＩ
切断部位に組み込ませる。得られた組み換え体プラスミ
ドを、例えばCohen らの方法〔Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 69, 2110（1972）参照〕に準じて例えばE. coliχ
１７７６株のような宿主に導入して形質転換させ、テト
ラサイクリン耐性株を選択してｃＤＮＡライブラリーを
作製する。

【００３１】このｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−
１をコードするｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラ
スミドを含む形質転換体を得るには、次の方法を用いる
ことができる。例えばヒト以外の動物からＩＬ−１をコ
ードするｃＤＮＡが得られればそのｃＤＮＡをプローブ
として用い、コロニー ハイブリダイゼーション試験
〔Hanahan, D., et al., Gene, 10, 63 (1980)〕を行う
ことにより該ｃＤＮＡプローブと相同性のある塩基配列
を含むｃＤＮＡを有するクローンを該ｃＤＮＡライブラ
リーから釣り上げることができる。

【００３２】また、上述したような適当なプローブがな
い場合には、プラス−マイナス法によるコロニー ハイ
ブリダイゼーション試験でスクリーニングすればよい。
即ち、Ｉの工程で得られたヒトＩＬ−１ｍＲＮＡ画分を
鋳型として³²Ｐ標識ｃＤＮＡを合成し、これを誘導プラ
ス・プローブとする。別途に、分化誘導操作及び／又は
エンドトキシン等による誘導操作を省略した無処理の細
胞から全ＲＮＡを抽出し、さらにＩに示したのと同じ操
作により調製したポリ（Ａ）ｍＲＮＡ画分を鋳型とし
て、³²Ｐ標識ｃＤＮＡを合成し、これを誘導マイナス・
プローブとする。

【００３３】上記のｃＤＮＡライブラリーの中から、誘
導プラス・プローブと強く結合し、誘導マイナス・プロ
ーブとは結合しないクローンをコロニー ハイブリダイ
ゼーション試験〔Hanahan, D., et al., Gene, 10, 63
(1980)〕により選択する。

【００３４】ここに得られたクローンがヒトＩＬ−１を
コードするｃＤＮＡを含有する組み換え体プラスミドに
より形質転換された宿主のクローンであることを確認
し、且つさらにスクリーニングするために、以下のハイ
ブリダイゼーション トランスレーション試験を行う。
即ち、上記の選択されたクローンからプラスミドＤＮＡ
を分離し、加熱又はアルカリ変性により単鎖ＤＮＡとし
ニトロセルロースフィルターに固定する。これにヒトＩ
Ｌ−１ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を加えハイブリダイ
ズさせた後、結合したｍＲＮＡを溶出回収する。これを
アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、回収された上
記のｍＲＮＡがヒトＩＬ−１をコードしているか否かを
試験すればよい。

【００３５】以上の方法により、ヒトＩＬ−１ｍＲＮＡ
と相補性のある塩基配列を含むＤＮＡ断片が組み込まれ
たプラスミドを有する形質転換体のクローンを得ること
ができる。

【００３６】このようにして得られるいくつかのクロー
ン化ＤＮＡ断片について例えばMaxam-Gilbert 法〔Pro
c. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)〕又はＭ１３
ファージを用いるジデオキシ法〔Sanger, F., et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA,74, 5463 (1977) 及びMess
ing, J., "Methods in Enzymology", 101, 20 (1983),
Academic Press Inc., New York〕に従って塩基配列を
解析することによりヒトＩＬ−１のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードする塩基配列を有するクローン化
ｃＤＮＡを最終的に得ることができる。

【００３７】かくして得られたクローン化ＤＮＡは、必
要により常法に従い、（１） その塩基配列の一部のコ
ドンが欠失した塩基配列、及び／又は（２） その塩基
配列の一部のコドンが他のコドンで置き換った塩基配列
を有し又は含むＤＮＡに改築することができる。また、
上記ＤＮＡは、その一部のコドンを対応する縮重コドン
と置き換えてもよい。

【００３８】本発明に係るポリペプチドの製造 上記のようにして得られたクローン化ＤＮＡを適当な形
質発現べクターに組み込んで本発明のポリペプチド生産
用ベクターを得ることができる。べクターとしては、形
質転換させる微生物中で増殖するものはすべて用いるこ
とができる。例えばプラスミド（大腸菌プラスミド、ｐ
ＢＲ３２２など）、ファージ（ラムダファージ誘導体な
ど）、ウイルス（ＳＶ４０など）が挙げられる。これら
は単独で、又はそれらの組合せ、例えばｐＢＲ３２２−
ＳＶ４０ハイブリッド プラスミドなどの形で用いても
よい。そのＤＮＡの組み込み部位も任意に選択すること
ができる。即ち、適当な形質発現べクターの適当な位置
を常法により適当な制限酵素を作用させて開裂させ、そ
の開裂部位に該クローン化ＤＮＡを適当な長さに処理し
て組み込むことができる。

【００３９】更に詳細には、配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列又はそのＣ末端部からなるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡに、必要に応じてその５′末端に開始コド
ンＡＴＧを付加し、そして３′末端に終止コドン（ＴＡ
Ａ，ＴＡＧ又はＴＧＡ）を含む塩基配列をもつＤＮＡ断
片を、適当なプロモーター及びシャイン・ダルガーノ
（ＳＤ）配列に続いて結合させ、べクター（例えばプラ
スミド）に組み込むことにより、非融合型の該ポリペプ
チド生産用の形質発現ベクターを構築する。また、融合
型の該ポリペプチド生産用の形質発現ベクターは、宿主
中で発現し得るオペロンの構造遺伝子の翻訳領域の途中
に読み枠をあわせて、上記の塩基配列を含むＤＮＡ断片
を挿入すればよい。

【００４０】プロモーターとしては、例えばｌａｃ，ｔ
ｒｐ，ｔａｃ，ｐｈｏＳ，ｐｈｏＡ，ＰＬ，ＳＶ４０初
期プロモーター等が挙げられる。

【００４１】これらの形質発現ベクターを微生物又は動
植物細胞のような宿主、例えば大腸菌に、例えばCohen
らの方法〔Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (197
2)〕により導入することにより形質転換体を得、次いで
該形質転換体を培養することにより目的とするポリペプ
チド又はそのＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチ
ドを産生させることができる。該生産物は使用したプロ
モーターと形質発現べクターの構築法により、宿主中の
細胞質内又は細胞質外のいずれにも蓄積させることがで
きる。細胞質外に分泌させるには、分泌型蛋白の遺伝
子、例えばアルカリホスファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）
やリン酸結合蛋白遺伝子（ｐｈｏＳ）を用い、それらの
シグナルペプチドをコードする領域に続いて目的とする
ポリペプチドをコードするＤＮＡを結合させた形質発現
べクターを構築すればよい。このようにして得られた形
質転換体を、それぞれの形質転換体に応じた適当な培養
条件下で、目的のポリペプチドが十分に産生されるまで
培養したのち、培養物からポリペプチドを抽出する。産
生したポリペプチドが細胞質内に蓄積される場合は例え
ば、リゾチーム消化と凍結融解や超音波破砕，フレンチ
プレス等により宿主細胞を破壊したのち、遠心分離又は
濾過にて抽出液を集める。また、ペリプラスムに蓄積さ
れる場合は、例えばWi11sky らの方法〔J. Bacteriol.,
127, 595 (1976)〕に従って抽出することができる。

【００４２】上記のようにして得られた粗製の本発明に
係るポリペプチドは一般的な蛋白の精製法、例えば限外
濾過，透析，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾
過，電気泳動，アフィニティクロマトグラフィー等の組
み合わせにより精製することができる。更に、得られた
ポリペプチドを酵素等で処理して、他のポリペプチドに
誘導することもできる。

【００４３】本発明に係るポリペプチドの製剤化にあた
っては、溶液及び凍結乾燥品のいずれでも良いが、長期
安定性の点から凍結乾燥品が望ましい。そして賦形剤や
安定化剤を添加するのが好ましい。安定化剤としては、
例えばアルブミン，グロブリン，ゼラチン，プロタミン
塩，グルコース，ガラクトース，キシロース，マンニッ
ト，グルクロン酸，トレハロース，デキストラン，ヒド
ロキシエチルデンプン，非イオン界面活性剤（ポリオキ
シエチレン脂肪酸エステル，ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル，ポリオキシエチレンアルキルフェニルエー
テル，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル，
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル，ポリオ
キシエチレン硬化ヒマシ油，ポリオキシエチレンヒマシ
油，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキル
エーテル，ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブ
ロックポリマー，ソルビタン脂肪酸エステル，ショ糖脂
肪酸エステル，グリセリン脂肪酸エステル）等が挙げら
れる。

【００４４】本明細書では記載の簡略化のために以下の
略記を使用する。 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａｌａ アラニン Ａｒｇ アルギニン Ａｓｎ アスパラギン Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｃｙｓ システイン Ｇｌｎ グルタミン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ｇｌｙ グリシン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｉｌｅ イソロイシン Ｌｅｕ ロイシン Ｌｙｓ リジン Ｍｅｔ メチオニン Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｐｒｏ プロリン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｔｒｐ トリプトファン Ｔｙｒ チロシン Ｖａｌ バリン ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ 相補ＤＮＡ ｓｓｃＤＮＡ 単鎖ｃＤＮＡ ｄｓｃＤＮＡ 二重鎖ｃＤＮＡ ＲＮＡ リボ核酸 ｍＲＮＡ 伝令ＲＮＡ ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸 ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸 ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸 オリゴ（ｄＣ） オリゴデオキシシチジル酸 オリゴ（ｄＧ） オリゴデオキシグアニル酸 オリゴ（ｄＴ） オリゴデオキシチミジル酸 ポリ（Ａ） ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ） ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ） ポリデオキシアデニル酸 ポリ（ｄＣ） ポリデオキシシチジル酸 ポリ（ｄＧ） ポリデオキシグアニル酸 ポリ（ｄＴ） ポリデオキシチミジル酸 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ｋｂ キロ塩基 ｋｂｐ キロ塩基対 ｂｐ 塩基対

【００４５】

【実施例】以下に実施例、参考例及び試験例を挙げて本
発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。

【００４６】また下記の実施例等の説明の理解を容易に
するため図１〜図３を示した。図１〜図３は形質発現ベ
クターｐＨＬＰ１０１の構築工程を示す。

【００４７】実施例１ ヒトＩＬ−１をコードするｃＤＮＡのクローニング及び
塩基配列の決定 （１）急性骨髄性白血病株細胞（ＨＬ−６０細胞）から
のヒトＩＬ−１ｍＲＮＡの調製

【００４８】ＨＬ−６０細胞をペトリディッシュ（直径
８cm）に１×10⁷ 個／10ml／dishの条件で播いた。培養
液には10％牛胎児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０培地を
用い、分化誘導剤としてホルボール−12−ミリステート
−13−アセテートとビタミンＡ酸をいずれも最終濃度と
して500 ng／mlになるように添加した。37℃で５％炭酸
ガス含有空気中、湿度90〜100 ％で２日間培養した後、
培養液と浮遊細胞を吸引除去した。分化した細胞が付着
したディッシュに10％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４
０培地に誘導剤としてエンドトキシン（大腸菌由来のリ
ポポリサッカライド）を10μg ／ml濃度に、蛋白合成阻
害剤としてシクロヘキシミドを１μg ／ml濃度に添加し
た培地の10mlを加え、更に５時間培養した。培養終了
後、培養液を吸引除去し、ディッシュ上に残った分化細
胞を0.5 ％ラウロイルサルコシン酸ナトリウム，５mMク
エン酸ナトリウム及び0.1M２−メルカプトエタノールを
含む６M グアニジンチオシアネート液で溶解し、ホモジ
ナイズした。このホモジネートを0.1MＥＤＴＡ含有5.7M
塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離機（ＲＰＳ
２７−２ ローター，日立工機）を用い26,500rpm で20
時間遠心し全ＲＮＡ画分をペレットとして得た。これを
0.35M ＮａＣｌ，20mMＴｒｉｓ及び20mMＥＤＴＡを含む
７M 尿素液の少量に溶解し、エタノール沈澱として回収
した。ＨＬ−６０細胞の1.5 ×10⁸ 個より全ＲＮＡとし
て1.7mg が得られた。

【００４９】この全ＲＮＡ画分を１mMＥＤＴＡを含む10
mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ7.4 ）（以下ＴＥ液と
いう）２mlに溶解し、65℃で５分間加熱した。これにＮ
ａＣｌ溶液を0.5Mとなるように加えた後、あらかじめ0.
5MＮａＣｌを含むＴＥ液で平衡化したオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラムに付し、吸着したポリ（Ａ）ｍＲＮＡを
ＴＥ液で溶出することにより、75μg のポリ（Ａ）ｍＲ
ＮＡを得た。このポリ（Ａ）ｍＲＮＡをアフリカツメガ
エルの卵母細胞にマイクロインジェクション法で注入
し、その10個を100 μl のバース培養液〔Gurdon, J.
B., J. Embryol. Exp. Morphol., 20, 401 (1968)〕
中、22℃で24時間培養し、ホモジナイズした後、その遠
心分離上清液を検液として、ＬＡＦ活性を測定した〔測
定法は試験例（２）項参照〕。その結果、卵母細胞１個
当たり、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの約150 ngを注入し、上記
培養条件で培養して得た検液の320 倍希釈液で約15,000
〜18,000cpm の ³Ｈ−チミジンの取込みを認め、該ポリ
（Ａ）ｍＲＮＡ調製品中にＩＬ−１ｍＲＮＡが含まれて
いることを確認した。

【００５０】ここで得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを以下
の実験に用いた。

【００５１】（２）ｃＤＮＡの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを鋳型としてGu
blerらの方法〔Gene,25, 263 (1983)〕に準じてｃＤＮ
Ａを合成した。該ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ（６μg）を６μl
の蒸留水に溶解させ、これに0.6 μl の100 mM水酸化
メチル水銀水溶液を添加し室温で10分間放置した。次い
で、20単位のＲＮＡ分解酵素阻害剤〔RNasin（登録商
標），Promega Biotec社製品〕を含む500 mM２−メルカ
プトエタノール液の1.7 μl を添加した。室温で５分間
放置した後、更に10mMＭｇＣｌ₂ ，1.25mMｄＧＴＰ，1.
25mMｄＡＴＰ，1.25mMｄＴＴＰ，0.5 mMｄＣＴＰ，0.17
μMα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性，750 Ci／mmole ），
４μg オリゴ（ｄＴ）_12-18，120 単位トリ骨髄性白血
病ウイルス由来逆転写酵素を含む32μl の50mMＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ 8.3）緩衝液を添加し、42℃で60分間反
応させた後、ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。フェ
ノール／クロロホルム混液（１：１）で抽出し、その水
層に酢酸アンモニウムを終濃度2.5Mになるように加え、
エタノールにより反応生成物（ｓｓｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ
複合体）を沈澱させた。このｓｓｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複
合体を下記組成の反応緩衝液100 μl に溶解した。

【００５２】反応緩衝液組成：５mMＭｇＣｌ₂ ，10mM
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ，100 mMＫＣｌ，0.15mMβ−ニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチド，40μM ｄＧＴＰ，
40μM ｄＡＴＰ，40μM ｄＴＴＰ，40μM ｄＣＴＰ，及
び５μg ウシ血清アルブミン，1.25単位大腸菌リボヌク
レアーゼＨ，24単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを含む
20mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.5）緩衝液。

【００５３】該溶解液を12℃で60分間反応させ、これに
2.5 単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼを添加し、更に22℃で
60分間反応させた。ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた
後、上記と同様にフェノール／クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ）を沈
澱させ、回収した。

【００５４】 （３）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの調製 （２）項で得られたｄｓｃＤＮＡを下記組成の反応緩衝
液100 μl に溶解させ、37℃で30分間反応させ、ｄｓｃ
ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。反応緩衝
液組成：２mMＣｏＣｌ₂ ，0.2mM ジチオスレイトール，
0.1 mMα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性１Ci／mmole ）及び
10単位ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼを含有する100 mMカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
7.2）。

【００５５】反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止さ
せ、フェノール／クロロホルム混液で抽出し、オリゴ
（ｄＣ）テール付加ｄｓｃＤＮＡをエタノールにより沈
澱させ回収した。これを１mMＥＤＴＡ及び100mM ＮａＣ
ｌを含む10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.4）緩衝液に
て、２μg ／mlの濃度に溶解させた。

【００５６】（４）組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄＧ）付加ｐＢＲ３２２（Bethesda Res. Lab
s. Inc.製）と（３）項で得られたオリゴ（ｄＣ）付加
ｄｓｃＤＮＡを1.5 mlの１mMＥＤＴＡ及び100 mMＮａＣ
ｌを含む10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.4）緩衝液中、
それぞれ1.5 μg及び0.09μg 含むように溶解混合させ
た後、65℃で10分間，57℃で２時間，更に45℃で２時間
加温しアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液
を調製した。

【００５７】（５）形質転換体の選択 （４）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、
E. coliχ１７７６株を形質転換させた。即ち、E. coli
χ１７７６株を、ジアミノピメリン酸100 μg／ml及び
チミジン40μg ／mlを補ったＬ−ブロス（組成：１l 当
たりトリプトン10 g，酵母エキス５ g，ＮａＣｌ５ g，
ブドウ糖1 g ，ｐＨ 7.2 ）20ml中、37℃で吸光度（60
0 nm）が0.5 となるまで培養し、菌体を遠心分離し、50
mMＣａＣｌ₂ 含有10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
7.3）10mlにて洗浄した。

【００５８】集めた菌体を同じ緩衝液２mlに懸濁させ、
０℃で５分間静置した。この懸濁液0.2 mlに上記組み換
え体プラスミド溶液0.1 mlを添加混合し、０℃で15分間
静置し、更に42℃で２分間保持した後、上記の培養で用
いたのと同一組成のＬ−ブロス0.5 mlを加えて１時間振
盪培養を行った。この培養液の一部を取り、上記組成に
加えてテトラサイクリン（15μg ／ml）が添加されたＬ
−ブロス寒天平板に広げて37℃で約12時間培養し、テト
ラサイクリン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラリーを
作製した。

【００５９】（６）クローニング （５）項で得られたｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ
−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを有する形
質転換体をスクリーニングするため、参考例に示したウ
サギＩＬ−１をコードすると思われるクローン化ｃＤＮ
Ａをプローブとして用い、コロニー ハイブリダイゼー
ション試験を行った。

【００６０】参考例に示した方法により得た組み換え体
プラスミドｐＲＬ１５から制限酵素ＰｓｔＩにより組み
込まれたｃＤＮＡ断片（約1.１kbp ）を切り出し、これ
を³²Ｐにて標識しプローブとした。

【００６１】約２万個のクローンから、該³²Ｐ標識プロ
ーブと強く結合する塩基配列を含むｃＤＮＡを有するク
ローンを５個選び出した。この５クローンの中から２kb
p 以上の大きさのｃＤＮＡが挿入された組み換え体プラ
スミドを含む２クローンを選び、ハイブリダイゼーショ
ン トランスレーション試験を行った〔Maniatis, T.,
et al., "Molecular Cloning" 329 (1980), Cold Sprin
g Harbor Lab. 〕。各クローンによりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、ニトロセルロース フィルター上に加熱変性
させた後固定し、これに上記（１）項で得たヒトＩＬ−
１ｍＲＮＡを含む画分を含むポリ（Ａ）ｍＲＮＡを加
え、50℃で５時間反応させ、ハイブリダイズさせた。結
合したｍＲＮＡを溶出回収した後、アフリカツメガエル
の卵母細胞に注入し、回収されたｍＲＮＡがＩＬ−１を
コードするものであるか否かについて検定した。この試
験により、いずれのクローンについてもヒトＩＬ−１ｍ
ＲＮＡと強くハイブリダイズするｃＤＮＡが組み込まれ
たプラスミドを含むことを確認した。

【００６２】この２クローンから約2.1kbpの大きさのｃ
ＤＮＡが挿入された組み換え体プラスミド（プラスミド
番号ｐＨＬ４；クローン番号χ１７７６／ｐＨＬ４）に
ついて、クローン化ｃＤＮＡを単離し下記の方法で塩基
配列を決定した。

【００６３】 （７）クローン化ｃＤＮＡの塩基配列の決定 （６）項で選択された形質転換体（χ１７７６／ｐＨＬ
４）をジアミノピメリン酸及びチミジンを添加したＬ−
ブロス〔（５）項参照〕で培養し、その菌体からWilkie
らの方法〔Nucleic Acids Res., 7, 859 (1979)〕に従
って、プラスミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡ
を制限酵素ＰｓｔＩで分解し、分離精製してクローン化
ｃＤＮＡを得た。

【００６４】制限酵素ＳａｃＩ，ＲｓａＩ，Ｈｉｎｄ I
II，ＨｉｎｃII，Ｆｎｕ４ＨＩ，ＨｉｎｆＩ，ＢａｌＩ
及びＥｃｏＲＩを用い、それぞれ単独または２種の制限
酵素の組み合わせにより、上記クローン化ｃＤＮＡを分
解し、150 〜700bp のＤＮＡ断片を切り出し、分離精製
して塩基配列解析に用いた。

【００６５】各ＤＮＡ断片の塩基配列はＭ１３ファージ
を用いるジデオキシ法にて決定した。Ｍ１３ｍｐ１８及
びＭ１３ｍｐ１９（Pharmacia P-L Biochemicals社製）
をクローニングベクターとし、Ｍ１３シークエンシング
キット（Amersham International plc社製）を用い、
「Ｍ１３クローニング及びシークエンシング ハンドブ
ック」（Amersham International plc社製）に従って実
施した。

【００６６】その塩基配列及びその塩基配列から推測さ
れるアミノ酸は配列番号３に示すとおりである。

【００６７】第61〜63番の塩基が開始コドンＡＴＧであ
り、第874 〜876 番の塩基は終止コドンＴＡＧである。

【００６８】このアミノ酸配列からは、典型的なシグナ
ルペプチドの配列〔Von Heijne, G., Eur. J. Bioche
m., 133, 17 (1983) 〕は存在しない。これはマウスＩ
Ｌ−１の例にも認められている〔Nature, 312, 458 (19
84)〕。

【００６９】実施例２ ヒトＩＬ−１ポリペプチドの生産 （１） ヒトＩＬ−１生産用形質転換体の作製 ｔｒｐ プロモーターを用いて、ヒトＩＬ−１生産用形質
発現ベクターを図１〜図３に示すように構築した。実施
例１−（７）項に示すごとく組み換え体プラスミドｐＨ
Ｌ４からヒトＩＬ−１をコードする塩基配列を含むクロ
ーン化ｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡ（20μg ）を100μl
の反応緩衝液〔50mM ＮａＣｌ, 6mM ＭｇＣｌ₂ 及び6
mM ２−メルカプトエタールを含む10mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ7.5 ）緩衝液〕に溶解し、制限酵素ＨｉｎｄII
I （240 単位）にて37℃で60分間反応させた後、更に10
0 μl の0.2MＮａＣｌを加え、制限酵素ＳｃａＩ（100
単位）にて37℃で60分間反応させた。次いで、ＮａＣｌ
を終濃度0.3Mになるように加え、更に２倍容のエタノー
ルを添加し、ＤＮＡ断片を沈殿させ回収した。これを５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付しヒトＩＬ−１
をコードする領域を含む約1.6kbpのＤＮＡ断片を分離精
製し、約５μg 得られた。

【００７０】このＤＮＡ断片に配列番号４で示される下
記の合成オリゴヌクレオチド アダプター をＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得ら
れたＤＮＡ断片を、以下ＨＩＬ−アダプター断片とい
う。

【００７１】一方、ｔｒｐプロモーター ベクターｐＤ
Ｒ７２０〔Russell,D.R., et al.,Gene, 20,231（198
2）; Pharmacia P-L Biochemicals社製〕に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＨｐａＩを作用させ、ｔｒｐプロモーター領
域の一部を含むＤＮＡ断片（35bp）を切り出し、そのＨ
ｐａＩにより切断された平滑末端に続いて、これに配列
番号５で示される下記の合成オリゴヌクレオチド アダ
プター ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAT ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATAGC をＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得ら
れたＤＮＡ断片を、以下ｔｒｐプロモーター断片とい
う。

【００７２】別途に、プラスミドｐＢＲ３２２の20μg
を100 μl の上記反応緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII （180 単位）にて、37℃で60分間反応させた後、
フェノール／クロロホルム混液による抽出後、エタノー
ル沈殿としてＤＮＡを回収し、これを20μl のＴＥ液
〔実施例１−（１）項参照〕に溶解した。該溶解液の10
μl をとり、これに40μl の反応緩衝液〔12.5mMＭｇＣ
ｌ₂ , 0.125mM ジチオスレイトール，0.25mMｄＧＴＰ，
0.25mM ｄＡＴＰ，0.25mMｄＴＴＰ， 0.25mM ｄＣＴ
Ｐ, 2.5 μg のウシ血清アルブミン, 及び2.6 単位の大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント）を含
む62.5mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 7.2）緩衝液〕を添
加し、20℃にて60分間反応させた後、反応生成物をフェ
ノール／クロロホルム混液による抽出、次いでエタノー
ルにより沈殿させ回収し、これを20μl のＴＥ液に溶解
した。以上の操作により、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵
素ＨｉｎｄIII で開裂させ、次いで得られた直鎖二重鎖
ＤＮＡの末端を平滑末端に修復したＤＮＡが得られた。
更に、該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより２つの断片
に切断し、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きなＤＮＡ
断片（約4.3kbp）を単離精製した（以下、このＤＮＡ断
片をｐＢＲ３２２−Ａｍｐ^r 断片という。）。

【００７３】上記ＨＩＬ−アダプター断片とｔｒｐプロ
モーター断片のそれぞれ制限酵素ＣｌａＩの粘着末端を
Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。このようにし
て得られた両端にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩの粘着末
端と、平滑末端をもつＤＮＡ断片を、上記ｐＢＲ３２２
−Ａｍｐ^r 断片とＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せ、ヒトＩＬ−１生産用形質発現べクター（ｐＨＬＰ１
０１）を構築した。

【００７４】この形質発現ベクターを下記の方法により
E. coliＨＢ１０１に導入し形質転換体を得た。即ち、
E. coliＨＢ１０１をＬ−ブロス（組成: １l 当たり、
トリプトン10g ，酵母エキス5g，ＮａＣｌ 5g ，ブドウ
糖１ g，ｐＨ7.2 ）の５mlに接種し、37℃で一夜培養し
た。その菌体懸濁液の１mlを100ml のＬ−ブロスに接種
し、濁度（吸光度650nm ）が0.6 になるまで37℃で培養
した。氷水中で30分間静置後、菌体を遠心分離により集
め、これを50mlの50mMＣａＣｌ₂ に懸濁し、０℃で60分
間静置した。次いで、遠心分離により菌体を集め、20％
グリセリンを含む50mMＣａＣｌ₂ の10mlに再懸濁した。

【００７５】この懸濁液に上記の形質発現ベクターｐＨ
ＬＰ１０１を添加し、これを氷水中で20分間、42℃で１
分間, 室温で10分間インキュベートした後、ＬＢ−ブロ
ス（組成は次項参照）を加え、37℃で60分間振盪した。
その菌体懸濁液の一部を25μg ／mlアンピシリンを含む
ＬＢ−寒天平板に播き、37℃で一夜培養した後、アンピ
シリン耐性クローンを選択して形質転換体を得た。この
形質転換体をＨＢ１０１／ｐＨＬＰ１０１と名づけた。

【００７６】（２） ヒトＩＬ−１ポリペプチドの生産 （１）で得た形質転換体ＨＢ１０１／ｐＨＬＰ１０１を
ＬＢ−ブロス（組成:１l 当たり，トリプトン10g ，酵
母エキス５g 及びＮａＣｌ 10g，ｐＨ7.5 ）中37℃で一
夜振盪培養した。その菌体懸濁液の0.1ml を10mlの改良
Ｍ９培地（組成：1.5 ％Ｎａ₂ＨＰＯ₄・12Ｈ₂Ｏ，0.3
％ＫＨ₂ＰＯ_4, 0.05 ％ＮａＣｌ，0.1 ％ＮＨ₄Ｃｌ，2m
g ／l ビタミンＢ₁ ，0.5 ％カザミノ酸, 2mM ＭｇＳＯ
₄ ,0.1mMＣａＣｌ₂ , 0.5 ％ブドウ糖）に接種し、37℃
で１時間培養し、次いでインドール−３−アクリル酸を
終濃度20μg ／mlになるように加え、更に24時間培養を
継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌体を１ml
の30mMＮａＣｌを含む50mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ8.0
）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静置した後、ドラ
イアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融解を６回
繰り返した。次いで、遠心分離により菌体残渣を除き、
清澄な上清液を得た。

【００７７】この上清液を検体として、試験例に示すご
とくＬＡＦ活性を測定した。

【００７８】試験例 ＬＡＦ（リンパ球活性化因子）活性測定 （１） 検液の調製 実施例２−（２）項で得られた形質転換体からの抽出上
清液を除菌フィルター〔Microflow （登録商標），孔径
0.2 μm, Flow Labs. 〕で濾過したものを以下のＬＡＦ
活性測定用の検液とした。

【００７９】（２） ＬＡＦ活性の測定法 検液を培地にて適当な濃度に希釈する。その希釈液の50
μl を96穴組織培養用マイクロプレート（Flow Labs.）
のウェルに入れる。これに50μg ／ml濃度のフィトヘマ
グルチニン（Difco Labs. ）液の50μl を添加する。更
に、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系マウス（６〜10週令）から採取した
胸腺細胞の懸濁液（１×10⁷ 個／ml）の100 μl を添加
し、37℃で５％炭酸ガス存在下で２日間培養する。

【００８０】培地には５％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−
１６４０培地を用いる。上記２日間の培養の後、 ³Ｈ−
チミジンの１μCiを添加し、更に18時間培養する。細胞
をタイターテック・セルハーベスター（Flow Labs.）に
より、ガラス繊維製フィルター（Flow Labs.）上に捕集
し、細胞中に取り込まれた ³Ｈ−チミジン量（cpm ）を
計測する。検液の代わりに培地を添加した測定系におけ
る ³Ｈ−チミジンの取り込み量を基準として、 ³Ｈ−チ
ミジン取り込み量の増加によりＬＡＦ活性を評価する。

【００８１】（３） 測定結果 （１）項で調製した形質転換体（ＨＢ１０１／ｐＨＬＰ
１０１）の抽出液及び陰性対照液としてプラスミドｐＢ
Ｒ３２２を含むE. coliＨＢ１０１（ＨＢ１０１／ｐＢ
Ｒ３２２）を実施例２−（２）項で示した条件で培養
し、得られたその菌体抽出液をそれぞれ検液とした。

【００８２】その結果、検液の代わりに培地を添加した
測定系での ³Ｈ−チミジンの取り込み量は、3,502 cpm
であった。陰性対照検液を添加した系（最終希釈倍数；
16倍）での取り込み量は574cpmであり、E. coli抽出液
の添加により有意な抑制が認められた。

【００８３】このような測定系において、形質転換体
（ＨＢ１０１／ｐＨＬＰ１０１）の抽出液では最終希釈
16倍で8,103 cpm の ³Ｈ−チミジンの取り込みを認め、
ＬＡＦ活性が検出された。

【００８４】参考例 ウサギＩＬ−１ｃＤＮＡの調製 （１） ウサギＩＬ−１ｍＲＮＡの調製 ウサギにPropionibacterium acnes死菌体を１羽当たり1
00 mgの投与量で静脈内に注入し、８日後に屠殺した。
直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入したチューブを介
してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰り返し、
肺胞マクロファージを採取した。この肺胞マクロファー
ジを10％牛胎児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸
濁させてペトリディッシュ（直径８cm）に１枚当たり１
×10⁷ 個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空
気中、湿度90〜100 ％で前培養した。１時間の前培養の
後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリサッカライ
ド）、ＴＰＡ（ホルボール−12−ミリステート−13−ア
セテート）及びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が
10μg ／ml，500 ng／ml及び１μg ／mlとなるように添
加混和し、更に培養を継続した。

【００８５】４時間後に培養液を吸引除去し、ディッシ
ュ上に残ったマクロファージを0.5％ラウロイルサルコ
シン酸ナトリウムと５mMクエン酸ナトリウム及びO.1M２
−メルカプトエタノールを含有する６M グアニジンチオ
シアネート液で溶解しホモジナイズした。このホモジネ
ートをO.1MＥＤＴＡ含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重
層し、超遠心分離機（ＲＰＳ２７−２ ローター, 日立
工機）を用い26,500rpm で20時間遠心し全ＲＮＡ画分を
ペレットとして得た。これを0.35M ＮａＣｌ，20mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ及び20mMＥＤＴＡを含む７M 尿素液の少量
に溶解し、エタノール沈殿として回収した。

【００８６】この全ＲＮＡ画分から実施例１−（１）に
示した方法に従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用い
る吸着カラムクロマトグラフィーによりポリ（Ａ）ｍＲ
ＮＡを得た。ここで得たポリ（Ａ）ｍＲＮＡをアガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度１％、６M 尿素存在下, ｐＨ
４）に付し、2.6 〜3.7kb の分子サイズに相当する泳動
位置からポリ（Ａ）ｍＲＮＡを回収した。

【００８７】（２） ｃＤＮＡライブラリーの作製 （１）項で得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを鋳型として、
実施例１−（２）から（５）に示した方法に準じて、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作製した。

【００８８】（３） クローニング 上記のｃＤＮＡライブラリーについて、ウサギＩＬ−１
をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質転換
体をスクリーニングするため³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ
を用いるコロニー ハイブリダイゼーション試験をHana
hanらの方法〔Gene，10，63（1980）〕に従って行っ
た。エンドトキシン，ＴＰＡ及びシクロヘキシミドと共
に培養〔上記（１）項参照〕した肺胞マクロファージ及
びこれらの誘導操作を省略した肺胞マクロファージから
それぞれ上記（１）項の方法で得たポリ（Ａ）ｍＲＮＡ
を鋳型として、実施例１−（２）項の方法で合成し、³²
Ｐで標識したｃＤＮＡをそれぞれ誘導プラス及び誘導マ
イナス・プローブとした。この試験により誘導プラスの
プローブと結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブ
リダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを
有する形質転換体を選別した。約5,000 個のクローンか
ら648 個のクローンが選び出された。

【００８９】次いで、これらの選択されたクローンにつ
いてハイブリダイゼーション トランスレーション試験
を上記（１）項で得たポリ（Ａ）ｍＲＮＡを用い実施例
１−（６）項に示した方法に従って行った。その結果、
ウサギＩＬ−１ｍＲＮＡと強くハイブリダイズするｃＤ
ＮＡを含む組み換え体プラスミドを含む９クローンを見
出した。これらのうち、ウサギＩＬ−１ｍＲＮＡと最も
強くハイブリダイズしたクローン，即ち回収されたｍＲ
ＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入した時、そ
の卵母細胞中に最も多くのＩＬ−１が検出されたクロー
ンを選び出した。このクローンの有する組み換え体プラ
スミドをｐＲＬ１５と名づけた。

【配列表】

【００９０】配列番号：1 配列の長さ：813 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATG GCC AAA GTT CCA GAC ATG TTT GAA GAC CTG AAG AAC TGT TAC AGT 48 GAA AAT GAA GAA GAC AGT TCC TCC ATT GAT CAT CTG TCT CTG AAT CAG 96 AAA TCC TTC TAT CAT GTA AGC TAT GGC CCA CTC CAT GAA GGC TGC ATG 144 GAT CAA TCT GTG TCT CTG AGT ATC TCT GAA ACC TCT AAA ACA TCC AAG 192 CTT ACC TTC AAG GAG AGC ATG GTG GTA GTA GCA ACC AAC GGG AAG GTT 240 CTG AAG AAG AGA CGG TTG AGT TTA AGC CAA TCC ATC ACT GAT GAT GAC 288 CTG GAG GCC ATC GCC AAT GAC TCA GAG GAA GAA ATC ATC AAG CCT AGG 336 TCA TCA CCT TTT AGC TTC CTG AGC AAT GTG AAA TAC AAC TTT ATG AGG 384 ATC ATC AAA TAC GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC CTC AAT CAA AGT ATA 432 ATT CGA GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG 480 GAT GAA GCA GTG AAA TTT GAC ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA AAG GAT 528 GAT GCT AAA ATT ACC GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA ACT CAA TTG TAT 576 GTG ACT GCC CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG CTG CTG AAG GAG ATG CCT 624 GAG ATA CCC AAA ACC ATC ACA GGT AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC TTC 672 TGG GAA ACT CAC GGC ACT AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT GCC CAT CCA 720 AAC TTG TTT ATT GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG GTG TGC TTG GCA GGG 768 GGG CCA CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG ATA CTG GAA AAC CAG GCG 813

【００９１】配列番号：2 配列の長さ：271 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln 20 25 30 Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met 35 40 45 Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys 50 55 60 Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val 65 70 75 80 Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg 100 105 110 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 115 120 125 Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile 130 135 140 Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 145 150 155 160 Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp 165 170 175 Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr 180 185 190 Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro 195 200 205 Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe 210 215 220 Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro 225 230 235 240 Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly 245 250 255 Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala 260 265 270

【００９２】配列番号：3 配列の長さ：900 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 細胞の種類：ヒト急性骨髄性白血病株細胞 セルライン：HL-60 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：61..876 特徴を決定した方法：E 配列 CAAGCTGCCA GCCAGAGAGG GAGTCATTTC ATTGGCGTTT GAGTCAGCAA AGAAGTCAAG 60 ATG GCC AAA GTT CCA GAC ATG TTT GAA GAC CTG AAG AAC TGT TAC AGT 108 Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser 1 5 10 15 GAA AAT GAA GAA GAC AGT TCC TCC ATT GAT CAT CTG TCT CTG AAT CAG 156 Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln 20 25 30 AAA TCC TTC TAT CAT GTA AGC TAT GGC CCA CTC CAT GAA GGC TGC ATG 204 Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met 35 40 45 GAT CAA TCT GTG TCT CTG AGT ATC TCT GAA ACC TCT AAA ACA TCC AAG 252 Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys 50 55 60 CTT ACC TTC AAG GAG AGC ATG GTG GTA GTA GCA ACC AAC GGG AAG GTT 300 Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val 65 70 75 80 CTG AAG AAG AGA CGG TTG AGT TTA AGC CAA TCC ATC ACT GAT GAT GAC 348 Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp 85 90 95 CTG GAG GCC ATC GCC AAT GAC TCA GAG GAA GAA ATC ATC AAG CCT AGG 396 Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg 100 105 110 TCA TCA CCT TTT AGC TTC CTG AGC AAT GTG AAA TAC AAC TTT ATG AGG 444 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 115 120 125 ATC ATC AAA TAC GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC CTC AAT CAA AGT ATA 492 Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile 130 135 140 ATT CGA GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG 540 Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 145 150 155 160 GAT GAA GCA GTG AAA TTT GAC ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA AAG GAT 588 Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp 165 170 175 GAT GCT AAA ATT ACC GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA ACT CAA TTG TAT 636 Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr 180 185 190 GTG ACT GCC CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG CTG CTG AAG GAG ATG CCT 684 Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro 195 200 205 GAG ATA CCC AAA ACC ATC ACA GGT AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC TTC 732 Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe 210 215 220 TGG GAA ACT CAC GGC ACT AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT GCC CAT CCA 780 Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro 225 230 235 240 AAC TTG TTT ATT GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG GTG TGC TTG GCA GGG 828 Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly 245 250 255 GGG CCA CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG ATA CTG GAA AAC CAG GCG 873 Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala 260 265 270 TAGGTCTGGA GTCTCACTTG TCTCACT 900

【００９３】配列番号：4 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：3 から12まで相補的で、他の鎖には13から16
にTCGAが存在する。 配列 CGTCCATGTC CA 12

【００９４】配列番号：5 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 他の情報：1 から32まで相補的で、他の鎖には33から34
にGCが存在する。 配列 AACTAGTACG CAAGTTCACG TAAAAAGGGT AT 32

【図面の簡単な説明】

【図１】形質発現べクターｐＨＬＰ１０１の構築工程の
一部であり、ＨＩＬ−アダプター断片の構築を示す。

【図２】形質発現べクターｐＨＬＰ１０１の構築工程の
一部であり、ｔｒｐプロモーター断片の構築を示す。

【図３】形質発現べクターｐＨＬＰ１０１の構築工程を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
   するヒト インターロイキン１α前駆体又はその対立遺
   伝子変異体又は該前駆体若しくは変異体のＮ末端領域を
   ＬＡＦ活性が消失しない限度において欠失せしめたアミ
   ノ酸配列を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
   するヒト インターロイキン１α前駆体のＮ末端側の６
   ２個のアミノ酸残基が欠失してなるポリペプチドである
   請求項１記載のポリペプチド。