JP2653061B2 - 新規ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents
新規ポリペプチドおよびその製造法Info
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- JP2653061B2 JP2653061B2 JP62229317A JP22931787A JP2653061B2 JP 2653061 B2 JP2653061 B2 JP 2653061B2 JP 62229317 A JP62229317 A JP 62229317A JP 22931787 A JP22931787 A JP 22931787A JP 2653061 B2 JP2653061 B2 JP 2653061B2
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- ifn
- dna
- gln
- met
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Peptides Or Proteins (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬品などとして有用な新規ポリペプチド
およびその製造法に関するものである。
およびその製造法に関するものである。
従来の技術 γ型インターフエロン（以下、IFN−γと略称するこ
とがある）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起
るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため、
免疫インターフエロンとも呼ばれている。IFN−γはIFN
−αやIFN−βと比較して、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活
性が高いといわれており、臨床応用面からより期待され
ている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球が必要であ
ることなどの制約があるため、これまで効率のよい産生
系は確立されていなかった。
とがある）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起
るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため、
免疫インターフエロンとも呼ばれている。IFN−γはIFN
−αやIFN−βと比較して、抗細胞増殖活性や抗腫瘍活
性が高いといわれており、臨床応用面からより期待され
ている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球が必要であ
ることなどの制約があるため、これまで効率のよい産生
系は確立されていなかった。
しかし最近、遺伝子組み換え技術が広く利用されるに
いたって、IFN−γの相補DNA（cDNA）がクローン化さ
れ、そのヌクレオチド配列やその配列から予測されるア
ミノ酸配列が明らかにされるとともに、cDNAや化学合成
した遺伝子を各種の宿主を用いて発現させることが可能
となってきた［グレイ,P.W.ら，ネイチャー（Natur
e），295,503（1982），デボス,Rら，ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids.Res.）10,2487（198
2），タナカ,Sら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids.Res.），11,1707（1983）など］。
いたって、IFN−γの相補DNA（cDNA）がクローン化さ
れ、そのヌクレオチド配列やその配列から予測されるア
ミノ酸配列が明らかにされるとともに、cDNAや化学合成
した遺伝子を各種の宿主を用いて発現させることが可能
となってきた［グレイ,P.W.ら，ネイチャー（Natur
e），295,503（1982），デボス,Rら，ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids.Res.）10,2487（198
2），タナカ,Sら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids.Res.），11,1707（1983）など］。
グレイ（Gray）ら，ネイチャー，295,503（1982）お
よびデリンク（Derynck）ら，ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ10,3605（1982）には、IFN−γとして、146
個のアミノ酸よりなるペプチドが示されている。本明細
書においては、構成アミノ酸の番号は、上記文献に示さ
れたそれをいうものとする（第４図参照）。
よびデリンク（Derynck）ら，ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ10,3605（1982）には、IFN−γとして、146
個のアミノ酸よりなるペプチドが示されている。本明細
書においては、構成アミノ酸の番号は、上記文献に示さ
れたそれをいうものとする（第４図参照）。
さらにモノクローナル抗体を用いる精製法により、遺
伝子組み換え技術で得られるIFN−γ（以下、rIFN−γ
と略記することがある）の大量生産も可能になってきた
［EPC公開第0103898号公報参照］。
伝子組み換え技術で得られるIFN−γ（以下、rIFN−γ
と略記することがある）の大量生産も可能になってきた
［EPC公開第0103898号公報参照］。
IFN−γのアミノ酸配列のうち、生物活性に直接関与
しないと考えられるアミノ酸配列を欠失させることが種
々行なわれてきた。
しないと考えられるアミノ酸配列を欠失させることが種
々行なわれてきた。
たとえば、特開昭60−202899号公報には、IFN−γの
Ｎ末端の およびＣ末端の130位のGly乃至146位のGlnのペプチド鎖
においてそのＣ末端から数えて１〜17個のアミノ酸もし
くはペプチドが欠失したものが示されている。
Ｎ末端の およびＣ末端の130位のGly乃至146位のGlnのペプチド鎖
においてそのＣ末端から数えて１〜17個のアミノ酸もし
くはペプチドが欠失したものが示されている。
また、特開昭60−233100号公報には、アミノ酸配列５
−127,1−127および５−146よりなるIFN−γの部分配列
が示されている。しかしながら、アミノ酸配列５−127
のものはペプチドを発現するためのDNAを構築してはい
るものの、ポリペプチドの発現は行なわれていない。
−127,1−127および５−146よりなるIFN−γの部分配列
が示されている。しかしながら、アミノ酸配列５−127
のものはペプチドを発現するためのDNAを構築してはい
るものの、ポリペプチドの発現は行なわれていない。
さらに、特開昭61−5096号公報には、IFN−γのＮ末
端のCys−Tyr,Cys−Tyr−CysまたはCys−Tyr−Cys−Gln
およびＣ末端の131位のLys乃至146位のGlnのペプチド鎖
においてそのＣ末端から数えて１〜16個のアミノ酸もし
くはペプチドが欠失したものが示されている。
端のCys−Tyr,Cys−Tyr−CysまたはCys−Tyr−Cys−Gln
およびＣ末端の131位のLys乃至146位のGlnのペプチド鎖
においてそのＣ末端から数えて１〜16個のアミノ酸もし
くはペプチドが欠失したものが示されている。
発明が解決しようとする問題点 前述したとおり、IFN−γのＮ末端およびＣ末端のア
ミノ酸またはペプチドを欠失させた部分ポリペプチドに
ついて種々研究されてきたが、本発明は、Ｃ末端のアミ
ノ酸配列をさらに欠失させて最大のIFN−γ活性を有す
るポリペプチドを提供するところにある。
ミノ酸またはペプチドを欠失させた部分ポリペプチドに
ついて種々研究されてきたが、本発明は、Ｃ末端のアミ
ノ酸配列をさらに欠失させて最大のIFN−γ活性を有す
るポリペプチドを提供するところにある。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、rIFN−γの活性中心を確立すべく研究
の結果、おどろくべきことに、Ｃ末端を126位Alaよりも
さらに短くして122位Gluないし125位Proとすることによ
り、第４図に示されるインタクトなIFN−γよりも高いI
FN−γ活性を示すポリペルチドを見い出し、これに基づ
いてさらに研究を進めて、本発明を完成した。
の結果、おどろくべきことに、Ｃ末端を126位Alaよりも
さらに短くして122位Gluないし125位Proとすることによ
り、第４図に示されるインタクトなIFN−γよりも高いI
FN−γ活性を示すポリペルチドを見い出し、これに基づ
いてさらに研究を進めて、本発明を完成した。
本発明は、 （１）、式 ［式中、ＸはMetまたは結合手を示し、ＸがMetのときＹ
はGlnを、Ｘが結合手のときＹはGlnまたは＜Gluを、Ｚ
は（Ｎ）Leu Ser Pro（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜３個のアミノ酸もしく
はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
ド（Ｉ）、 （２）、ＸがMet、ＹがGlnである上記（１）項のポリペ
プチド、 （３）、ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有する
DNAを有するプラスミドを保持する細菌，酵母または動
物細胞を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチド
（Ｉ）を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該ポリペプチド（Ｉ）の製造法、および （４）、ＸがMet、ＹがGlnである上記（３）項の製造法
である。
はGlnを、Ｘが結合手のときＹはGlnまたは＜Gluを、Ｚ
は（Ｎ）Leu Ser Pro（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜３個のアミノ酸もしく
はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
ド（Ｉ）、 （２）、ＸがMet、ＹがGlnである上記（１）項のポリペ
プチド、 （３）、ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有する
DNAを有するプラスミドを保持する細菌，酵母または動
物細胞を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチド
（Ｉ）を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該ポリペプチド（Ｉ）の製造法、および （４）、ＸがMet、ＹがGlnである上記（３）項の製造法
である。
本発明のポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有す
るDNAとしては、ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域
を有するものであればいずれでもよい。
るDNAとしては、ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域
を有するものであればいずれでもよい。
該DNAの具体例としては、たとえば式 ［式中、Ｙ′はCAGまたは結合手を示し、Ｚ′は
（５′）CTG TCG CCA （３′）で示される塩基配列に
おいてその５′末端から数えて１〜３個のコドンからな
る塩基配列を示す。］で表されるDNAが挙げられる。
（５′）CTG TCG CCA （３′）で示される塩基配列に
おいてその５′末端から数えて１〜３個のコドンからな
る塩基配列を示す。］で表されるDNAが挙げられる。
５′末端にATGを有しその下流にポリペプチド（Ｉ）
をコードする領域、ついでっ翻訳終止コドンを有するDN
A（プラスミド）は、化学合成であるいは遺伝子工学的
に製造された公知のIFN−γのcDNAもしくは染色体由来
のIFN−γDNAを加工することにより製造することができ
る。
をコードする領域、ついでっ翻訳終止コドンを有するDN
A（プラスミド）は、化学合成であるいは遺伝子工学的
に製造された公知のIFN−γのcDNAもしくは染色体由来
のIFN−γDNAを加工することにより製造することができ
る。
ポリペプチド（Ｉ）をコードする領域を有するDNAを
有するプラスミドを製造するにあたって、ベクターとし
て用いられるプラスミドとしては、たとえばColEI 由
来のpBR322［ジーン（Gene），２,95（1977）］,pBR313
［ジーン，２,75（1977）］,pBR324,pBR325［ジーン４,
121（1978）］,pBR327,pBR328［ジーン９,287（198
0）］,pKY2289［ジーン３,1（1978）］,pKY2700［生化
学52,770（1980）］,pACYC177,pACYC184［ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）1
34,11141（1978）］,pRK248,pRK646,pDF［メソッズ・イ
ン・エンジーモロジー（Methds in Enzymology）68,268
（1979）］,pUC18,pUC19［ヤニシュ−ペロンら，ジーン
（Gene），33,103（1985）］などが挙げられる。また、
バクテリオファージ、たとえばλファージを使用したλ
gt系のλgt・λＣ［Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.71,4579
（1974）］，λgt・λＢ［Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.7
2,3416（1975）］，λDam［ジーン１,255（1977）］や
シャロンベクター［サイエンス（Science）196,161（19
77）：ジャーナル・オブ・ビーロロジー（Journal of V
irology）29,555（1979）］，繊維状ファージを使用し
たmp系のmp18,mp19［ヤニシュ−ペロンら，ジーン（Gen
e）33,103（1985）］ベクターなども挙げられる。
有するプラスミドを製造するにあたって、ベクターとし
て用いられるプラスミドとしては、たとえばColEI 由
来のpBR322［ジーン（Gene），２,95（1977）］,pBR313
［ジーン，２,75（1977）］,pBR324,pBR325［ジーン４,
121（1978）］,pBR327,pBR328［ジーン９,287（198
0）］,pKY2289［ジーン３,1（1978）］,pKY2700［生化
学52,770（1980）］,pACYC177,pACYC184［ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）1
34,11141（1978）］,pRK248,pRK646,pDF［メソッズ・イ
ン・エンジーモロジー（Methds in Enzymology）68,268
（1979）］,pUC18,pUC19［ヤニシュ−ペロンら，ジーン
（Gene），33,103（1985）］などが挙げられる。また、
バクテリオファージ、たとえばλファージを使用したλ
gt系のλgt・λＣ［Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.71,4579
（1974）］，λgt・λＢ［Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.7
2,3416（1975）］，λDam［ジーン１,255（1977）］や
シャロンベクター［サイエンス（Science）196,161（19
77）：ジャーナル・オブ・ビーロロジー（Journal of V
irology）29,555（1979）］，繊維状ファージを使用し
たmp系のmp18,mp19［ヤニシュ−ペロンら，ジーン（Gen
e）33,103（1985）］ベクターなども挙げられる。
上記DNAは、ATGの上流にプロモーターを有しているの
が好ましく、該プロモーターは、形質転換体の製造に用
いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかな
るものでもよい。
が好ましく、該プロモーターは、形質転換体の製造に用
いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかな
るものでもよい。
たとえば、大腸菌（Escherichia coli）ではtrpプロ
モーター,lacプロモーター,rec Aプロモーター，λPLプ
ロモーター,lppプロモーターなど、枯草菌（Bacillus s
ubtilis）ではSPO1プロモーター,SPO2プロモーター,pen
Pプロモーターなど、酵母（Saccharomyces cerevisia
e）ではPHO5プロモーター,PGKプロモーター,GAPプロモ
ーター,ADHプロモーターなど、動物細胞ではSV40由来の
プロモーターなどが挙げられる。
モーター,lacプロモーター,rec Aプロモーター，λPLプ
ロモーター,lppプロモーターなど、枯草菌（Bacillus s
ubtilis）ではSPO1プロモーター,SPO2プロモーター,pen
Pプロモーターなど、酵母（Saccharomyces cerevisia
e）ではPHO5プロモーター,PGKプロモーター,GAPプロモ
ーター,ADHプロモーターなど、動物細胞ではSV40由来の
プロモーターなどが挙げられる。
上記製造法をより具体的に説明するために、IFN−γ
遺伝子（cDNA）含有プラスミドpLC2（ヨーロッパ特許出
願公開第154316号公報Reference Example ４参照）を
原料にポリペプチド（I:但し、Ｚはペプチド,Gln−Le
u）をコードする領域を有するDNA含有プラスミドの製造
法を以下に例示する。
遺伝子（cDNA）含有プラスミドpLC2（ヨーロッパ特許出
願公開第154316号公報Reference Example ４参照）を
原料にポリペプチド（I:但し、Ｚはペプチド,Gln−Le
u）をコードする領域を有するDNA含有プラスミドの製造
法を以下に例示する。
プラスミドpLC2を制限酵素，たとえばEcoR Iにより消
化することにより、IFN−γ全領域をコードするDNA断片
を得ることができる。この断片をM13ファージ由来のベ
クターmp19に組み込むことによって、上記IFN−γ遺伝
子を含むファージ一本鎖DNAを取得する。この一本鎖DNA
とリン酸アミダイト法により合成されたオリゴヌクレオ
チド,ATG GCT GAA CTG TAA TGG TTG TCCを用いて、アマ
シャム社（Amersham International plc,Buckinghamsh
ire,England）のキット［オリゴヌクレドチド・ダイレ
クティッド・イン・ビトロ・ムタジェネシス・システム
（oligonucleotide−directed in vitro mutagenesi
s system）］を用いた公知の部位特異的突然変異誘発
法によって、124位から146位のコドンを欠失させた上記
IFN−γをコードするDNAを取得する。本DNAを適当なプ
ロモーターの下流につないで適当な宿主に導入する。必
要によりSD（シャインアンドダルガーノ）配列をプロモ
ーターの下流に挿入してもよい。
化することにより、IFN−γ全領域をコードするDNA断片
を得ることができる。この断片をM13ファージ由来のベ
クターmp19に組み込むことによって、上記IFN−γ遺伝
子を含むファージ一本鎖DNAを取得する。この一本鎖DNA
とリン酸アミダイト法により合成されたオリゴヌクレオ
チド,ATG GCT GAA CTG TAA TGG TTG TCCを用いて、アマ
シャム社（Amersham International plc,Buckinghamsh
ire,England）のキット［オリゴヌクレドチド・ダイレ
クティッド・イン・ビトロ・ムタジェネシス・システム
（oligonucleotide−directed in vitro mutagenesi
s system）］を用いた公知の部位特異的突然変異誘発
法によって、124位から146位のコドンを欠失させた上記
IFN−γをコードするDNAを取得する。本DNAを適当なプ
ロモーターの下流につないで適当な宿主に導入する。必
要によりSD（シャインアンドダルガーノ）配列をプロモ
ーターの下流に挿入してもよい。
本発明の形質転換体は、上記のようにして得られる発
現用プラスミドを自体公知の方法［例、コーエンS,N,
ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.），69,2
110（1972）］で宿主を形質転換することにより製造す
ることができる。
現用プラスミドを自体公知の方法［例、コーエンS,N,
ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.），69,2
110（1972）］で宿主を形質転換することにより製造す
ることができる。
形質転換される微生物の宿主としては、たとえば、エ
シエリヒア（Escherichia）属菌，バチルス（Bacillu
s）属菌，酵母などが挙げられる。
シエリヒア（Escherichia）属菌，バチルス（Bacillu
s）属菌，酵母などが挙げられる。
上記エシエリヒア属菌の例としては、エシエリヒア・
コリ（E.coli）が挙げられ、具体的にはエシエリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1［プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60,160（1968）］,JM−
103［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic A
cids Research）９,309（1981）］,JA221［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Mol
ecular Biorogy）120,517（1978）］,HB101［ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，41,459（196
9）］,C600［ジェネティックス（Genetics），39,440
（1954）］,N4830［セル（Cell）25,713（1981）］,K−
12MM294［プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ73,4174（1976）］など
が挙げられる。
コリ（E.coli）が挙げられ、具体的にはエシエリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1［プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60,160（1968）］,JM−
103［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic A
cids Research）９,309（1981）］,JA221［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Mol
ecular Biorogy）120,517（1978）］,HB101［ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，41,459（196
9）］,C600［ジェネティックス（Genetics），39,440
（1954）］,N4830［セル（Cell）25,713（1981）］,K−
12MM294［プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ73,4174（1976）］など
が挙げられる。
上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
ルス（Bacillus subtilis）が挙げられ、具体的にはバ
チルス・サチルスMI114（ジーン，24,255（1983））,20
7−21［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journ
al of Biochemistry）95,87（1984）］などが挙げられ
る。
ルス（Bacillus subtilis）が挙げられ、具体的にはバ
チルス・サチルスMI114（ジーン，24,255（1983））,20
7−21［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journ
al of Biochemistry）95,87（1984）］などが挙げられ
る。
上記酵母としては、たとえばサッカロマイセス・セレ
ビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられ、具
体的には、サッカロマイセス・セレビシアエAH22［Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.75 1929（1978）］,XSB52−23C
［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77 2173（1980）］,BH−64
1A（ATCC 28339）,20B−12［Genetics 85,23（197
6）］,GM3C−２［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78 2258（1
981）］などが挙げられる。
ビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられ、具
体的には、サッカロマイセス・セレビシアエAH22［Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.75 1929（1978）］,XSB52−23C
［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77 2173（1980）］,BH−64
1A（ATCC 28339）,20B−12［Genetics 85,23（197
6）］,GM3C−２［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78 2258（1
981）］などが挙げられる。
動物細胞としては、たとえばサル細胞COS−７［セル
（Cell）23,175（1981）］,Vero［（日本臨床21,1209
（1963）］，チャイニーズハムスター細胞CHO［ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（J.Exp.
Med.）108,945（1985）］，マウスＬ細胞［ジャーナル
・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート
（J.Nat.Cancer lnst.）４,165（1943）］，ヒトFL細胞
［プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォー
・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデイ
シン（Proc.Soc.Etp.Biol.Med.）94,532（1957）］，ハ
ムスターＣ細胞などが挙げられる。
（Cell）23,175（1981）］,Vero［（日本臨床21,1209
（1963）］，チャイニーズハムスター細胞CHO［ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（J.Exp.
Med.）108,945（1985）］，マウスＬ細胞［ジャーナル
・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート
（J.Nat.Cancer lnst.）４,165（1943）］，ヒトFL細胞
［プロシーディングス・オブ・ザ・ソサエティ・フォー
・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデイ
シン（Proc.Soc.Etp.Biol.Med.）94,532（1957）］，ハ
ムスターＣ細胞などが挙げられる。
ポリペプチド（Ｉ）は、上記形質転換体を培養し、培
養中にポリペプチド（Ｉ）を生成し、蓄積せしめ、これ
を採取することにより製造することができる。
養中にポリペプチド（Ｉ）を生成し、蓄積せしめ、これ
を採取することにより製造することができる。
培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含む
M9培地［ミラー,J.,エクスペリメンツ・イン・メレキュ
ラー・ジエネテイクス（Experiments in Molecular Gen
etics）,431−433（Cold Spring Horbor Laboratory,Ne
w York,1972）］,2×YT培地［メシング，メソッド・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），10
1,20（1983）］などが挙げられる。ここに、必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えてもよい。
M9培地［ミラー,J.,エクスペリメンツ・イン・メレキュ
ラー・ジエネテイクス（Experiments in Molecular Gen
etics）,431−433（Cold Spring Horbor Laboratory,Ne
w York,1972）］,2×YT培地［メシング，メソッド・イ
ン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），10
1,20（1983）］などが挙げられる。ここに、必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β
−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えてもよい。
培養は通常約15〜43℃で約３〜24時間行い、必要によ
り、通気や撹拌を加えてもよい。
り、通気や撹拌を加えてもよい。
λcItsリプレッサーと、λＰL−プロモーターを含有
する発現ベクターとを有する組み換え体を使用する場合
には、培養は約30℃〜36℃の温度で行い、λcItsプレッ
サーの不活化は約37℃〜42℃で行うのが好ましい。また
recAプロモーターをより効率良く働かせるため、すなわ
ちrecA遺伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要に
よりマイトマイシンC,ナルジキシン酸などのような薬剤
を添加したり、紫外線を照射してもよい。
する発現ベクターとを有する組み換え体を使用する場合
には、培養は約30℃〜36℃の温度で行い、λcItsプレッ
サーの不活化は約37℃〜42℃で行うのが好ましい。また
recAプロモーターをより効率良く働かせるため、すなわ
ちrecA遺伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要に
よりマイトマイシンC,ナルジキシン酸などのような薬剤
を添加したり、紫外線を照射してもよい。
培養後、公知の方法で菌体を集め、たとえば緩衝的に
懸濁したのち、たとえば、蛋白変性剤処理，超音波処理
やリゾチームなどの酵素処理を行って菌体を粉砕し、遠
心分離など公知の方法によって上清を得る。
懸濁したのち、たとえば、蛋白変性剤処理，超音波処理
やリゾチームなどの酵素処理を行って菌体を粉砕し、遠
心分離など公知の方法によって上清を得る。
なお、Ｚが３以下のアミノ酸を有するポリペプチドも
しくはアミノ酸残基であるポリペプチド（Ｉ）は、当該
Ｚよりも多くのアミノ酸を有する（例えば、Ｚが前記４
個すべてのアミノ酸を有するペプチド）ポリペプチド
（Ｉ）をコードする領域を有するDNAを含有する形質転
換体を培養し、形質転換体中のプロテアーゼの作用をう
けやすい条件下に精製することによっても製造すること
ができる。
しくはアミノ酸残基であるポリペプチド（Ｉ）は、当該
Ｚよりも多くのアミノ酸を有する（例えば、Ｚが前記４
個すべてのアミノ酸を有するペプチド）ポリペプチド
（Ｉ）をコードする領域を有するDNAを含有する形質転
換体を培養し、形質転換体中のプロテアーゼの作用をう
けやすい条件下に精製することによっても製造すること
ができる。
上記により得られた上清からポリペプチド（Ｉ）を単
離するには、通常知られている蛋白質の精製法に従えば
よい。とりわけIFN−γまたはポリペプチド（Ｉ）に結
合能を有する抗体、とりわけその抗体カラムを用いて有
利に精製することができ、たとえば＜Glu−Asp−Pro−T
yr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−T
yr−Phe−Asn−Ala−Gly−OHで示されるペプチドに対す
るモノクローナル抗体の抗体カラム［特開昭60−107569
号公報 実施例11（WNγ２−76.53モノクローナル抗体
の抗体カラム）］などが例示される。
離するには、通常知られている蛋白質の精製法に従えば
よい。とりわけIFN−γまたはポリペプチド（Ｉ）に結
合能を有する抗体、とりわけその抗体カラムを用いて有
利に精製することができ、たとえば＜Glu−Asp−Pro−T
yr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−T
yr−Phe−Asn−Ala−Gly−OHで示されるペプチドに対す
るモノクローナル抗体の抗体カラム［特開昭60−107569
号公報 実施例11（WNγ２−76.53モノクローナル抗体
の抗体カラム）］などが例示される。
上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえば
ポリペプチド（Ｉ）含有物を中性付近の緩衝液、たとえ
ばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カ
ラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄した
のち、ポリペプチド（Ｉ）を溶出する。溶出液として
は、弱酸性溶液たとえば酢酸溶液，ポリエチレングリコ
ールを含む溶液，ポリペプチド（Ｉ）にくらべ抗体によ
り結合し易いペプチドを含む溶液，高濃度塩溶液などお
よびこれらの組合わせ溶液などが用いられ、ポリペプチ
ド（Ｉ）の分解をあまり促進しないものが好ましい。
ポリペプチド（Ｉ）含有物を中性付近の緩衝液、たとえ
ばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カ
ラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄した
のち、ポリペプチド（Ｉ）を溶出する。溶出液として
は、弱酸性溶液たとえば酢酸溶液，ポリエチレングリコ
ールを含む溶液，ポリペプチド（Ｉ）にくらべ抗体によ
り結合し易いペプチドを含む溶液，高濃度塩溶液などお
よびこれらの組合わせ溶液などが用いられ、ポリペプチ
ド（Ｉ）の分解をあまり促進しないものが好ましい。
カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要
により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行うこと
ができる。
により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行うこと
ができる。
ポリペプチド（Ｉ）において、Ｘが結合手であるポリ
ペプチドとＸがMetであるそれとの混合物として得ても
よい。
ペプチドとＸがMetであるそれとの混合物として得ても
よい。
また、ポリペプチド（Ｉ）においてＮ末端アミノ酸が
GInのときは、それが＜Gluであるポリペプチド（Ｉ）と
の混合物として得られることもある。該混合物はそのま
までも以下に記載の目的に使用できるが、必要により、
例えば上記精製操作の後、加熱または弱酸（例、希酢
酸）処理を行うことによりＮ末端アミノ酸が＜Gluであ
るポリペプチド（Ｉ）に導くことができる。
GInのときは、それが＜Gluであるポリペプチド（Ｉ）と
の混合物として得られることもある。該混合物はそのま
までも以下に記載の目的に使用できるが、必要により、
例えば上記精製操作の後、加熱または弱酸（例、希酢
酸）処理を行うことによりＮ末端アミノ酸が＜Gluであ
るポリペプチド（Ｉ）に導くことができる。
このようにして得られるポリペプチド（Ｉ）のなかで
もＸがMet、ＹがGlnであるポリペプチド（Ｉ）が好まし
く、さらに好ましい具体例としては、たとえば後述の実
施例で得られるポリペプチド などが挙げられる。
もＸがMet、ＹがGlnであるポリペプチド（Ｉ）が好まし
く、さらに好ましい具体例としては、たとえば後述の実
施例で得られるポリペプチド などが挙げられる。
ここで得られるポリペプチド（Ｉ）溶液は透析に付
し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることが
できる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニト
ール，デキストロース，マルトース，グリセロールなど
の安定剤を加えることができる。
し、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることが
できる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニト
ール，デキストロース，マルトース，グリセロールなど
の安定剤を加えることができる。
かくして得られるポリペプチド（Ｉ）は、rIFN−γ活
性を有し、しかもCysを有しないため、二量化や多量化
を起こしにくく安定であるため、有利に医薬品等として
使用できるものである。
性を有し、しかもCysを有しないため、二量化や多量化
を起こしにくく安定であるため、有利に医薬品等として
使用できるものである。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は、ヒト羊膜由来WISH細
胞に対する水泡性口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効
果阻止試験によるウイルス活性測定において106U/mg以
上の比活性を有するポリペプチドに精製することがで
き、公知のrIFN−γ［グレイ,P.W.ら，前出］や天然由
来のIFN−γ（＝type2IFN）［サルビンら，ジャーナル
・オブ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート
（J.National Cancer Institute），55,1233（1975）］
と同様の目的に同様の用法により使用できる。
胞に対する水泡性口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性効
果阻止試験によるウイルス活性測定において106U/mg以
上の比活性を有するポリペプチドに精製することがで
き、公知のrIFN−γ［グレイ,P.W.ら，前出］や天然由
来のIFN−γ（＝type2IFN）［サルビンら，ジャーナル
・オブ・ナショナル・キャンサー・インスチチュート
（J.National Cancer Institute），55,1233（1975）］
と同様の目的に同様の用法により使用できる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は、抗ウイルス，抗腫
瘍，細胞増殖抑制，免疫増強作用を示し、しかもその毒
性は低く、抗原性もない。
瘍，細胞増殖抑制，免疫増強作用を示し、しかもその毒
性は低く、抗原性もない。
従って、本発明のポリペプチド（Ｉ）は、抗ウイルス
剤、抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤，免疫増強剤などとし
て、ウイルス性疾患、腫瘍、免疫低下疾患を有する温血
哺乳動物（例、マウス，ラット，ネコ，犬，羊，ヤギ，
牛，ヒトなど）のこれら疾患の予防，治療に用いること
ができる。
剤、抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤，免疫増強剤などとし
て、ウイルス性疾患、腫瘍、免疫低下疾患を有する温血
哺乳動物（例、マウス，ラット，ネコ，犬，羊，ヤギ，
牛，ヒトなど）のこれら疾患の予防，治療に用いること
ができる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）は滅菌水，ヒト血清アル
ブミン（HSA），生理食塩水その他公知の生理学的に許
容される担体と混合することができ、非経口的に又は局
所に投与することができる。たとえば、その１日投与量
は、約２千〜200万ユニット/kg、好ましくは、約８万〜
80万ユニット/kgを、静注または筋注などにより非経口
的に投与することができる。
ブミン（HSA），生理食塩水その他公知の生理学的に許
容される担体と混合することができ、非経口的に又は局
所に投与することができる。たとえば、その１日投与量
は、約２千〜200万ユニット/kg、好ましくは、約８万〜
80万ユニット/kgを、静注または筋注などにより非経口
的に投与することができる。
本発明のポリペプチド（Ｉ）を含有する製剤は、塩，
希釈剤，アジュバント，他の担体，バッファー，結合
剤，界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他
の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与製剤
は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁
液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用時
希釈して使用しうる滅菌粉末（通常ポリペプチド（Ｉ）
溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供され
る。
希釈剤，アジュバント，他の担体，バッファー，結合
剤，界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他
の活性成分も含有していてもよい。非経口的投与製剤
は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁
液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用時
希釈して使用しうる滅菌粉末（通常ポリペプチド（Ｉ）
溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提供され
る。
作用 後述の実施例および参考例から明らかなように、本発
明のポリペプチド（Ｉ）は顕著なIFN−γ活性を示し、
本発明のポリペプチド（Ｉ）に最大のIFN−γ活性が存
在する。
明のポリペプチド（Ｉ）は顕著なIFN−γ活性を示し、
本発明のポリペプチド（Ｉ）に最大のIFN−γ活性が存
在する。
実施例 以下、実施例および参考例により本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。
本明細書および図面において、アミノ酸，ペプチド，
保護基，活性基，その他に関し略号で表示する場合、そ
れらはIUPAC−IUB（Commission on Biochemical Nomenc
lature）による略号あるいは当該分野における慣用略号
に基づくものであり、その例を第１表に挙げる。また、
アミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合は、特に
い明示しなければＬ体を示すものとする。
保護基，活性基，その他に関し略号で表示する場合、そ
れらはIUPAC−IUB（Commission on Biochemical Nomenc
lature）による略号あるいは当該分野における慣用略号
に基づくものであり、その例を第１表に挙げる。また、
アミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合は、特に
い明示しなければＬ体を示すものとする。
第１表 DNA:デオキシリボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン RNA:リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTB:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP:アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS:ドデシル硫酸ナトリウム Gly:グリシン Ala:アラニン Val:バリン Leu:ロイシン Ile:イソロイシン Ser:セリン Thr:スレオニン Met:メチオニン Glu:グルタミン酸 Asp:アスパラギン酸 Lys:リジン Arg:アルギニン His:ヒスチジン Phe:フェニールアラニン Tyr:チロシン Trp:トリプトファン Pro:プロリン Asn:アスパラギン Gln:グルタミン ＜Gln:ピログルタミン酸 本明細書におけるポリペプチド（Ｉ）のユニット
（Ｕ）は、JRU（Japanese Reference Unit）であり、そ
の測定法は次に示される。すなわち、ヒト羊膜由来のFL
細胞に対するシンドビス ウイルス（Sindbis Virus）
の細胞変性効果阻止試験により、目的とする標品および
ユニット（Ｕ）の確定した国内標準品（Japan standar
d）の細胞変性効果阻止能を測定し、それらの比率から
抗ウイルス活性（U/ml）を求めた。さらに、タンパク濃
度（mg/ml）の値をもとにして比活性（U/mg）を算出し
た。
（Ｕ）は、JRU（Japanese Reference Unit）であり、そ
の測定法は次に示される。すなわち、ヒト羊膜由来のFL
細胞に対するシンドビス ウイルス（Sindbis Virus）
の細胞変性効果阻止試験により、目的とする標品および
ユニット（Ｕ）の確定した国内標準品（Japan standar
d）の細胞変性効果阻止能を測定し、それらの比率から
抗ウイルス活性（U/ml）を求めた。さらに、タンパク濃
度（mg/ml）の値をもとにして比活性（U/mg）を算出し
た。
なお、上記のJRUで示されたユニットは、特開昭59−1
86995号公報（ヨーロッパ特許公開第110044号公報に対
応する。）に記載のユニット（Ｕ）の1/6.4に相当す
る。
86995号公報（ヨーロッパ特許公開第110044号公報に対
応する。）に記載のユニット（Ｕ）の1/6.4に相当す
る。
なお、下記実施例を開示している形質転換体エシェヒ
ア・コリ（Escherichia coli）DH1/pRK248cIts/pIGT−
123,エシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−124お
よびエシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−125
は、昭和62年９月１日から財団法人醗酵研究所（IFO）
に寄託番号IFO 14647,IFO 14648およびIFO 14649と
してそれぞれ寄託され、また昭和62年９月９日から通商
産業省工業技術院微生物工業研究所（FRI）に受託番号F
ERM BP−1474,FERM BP−1475およびFERM BP−1476と
してそれぞれ寄託されている。
ア・コリ（Escherichia coli）DH1/pRK248cIts/pIGT−
123,エシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−124お
よびエシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−125
は、昭和62年９月１日から財団法人醗酵研究所（IFO）
に寄託番号IFO 14647,IFO 14648およびIFO 14649と
してそれぞれ寄託され、また昭和62年９月９日から通商
産業省工業技術院微生物工業研究所（FRI）に受託番号F
ERM BP−1474,FERM BP−1475およびFERM BP−1476と
してそれぞれ寄託されている。
一方、下記参考例に開示している形質転換体エシエリ
ヒア・コリ N4830/pIGT−126は、昭和61年12月19日か
ら財団法人醗酵研究所（IFO）に寄託番号IFO 14557と
して寄託され、また昭和61年12月25日から通商産業省工
業技術院微生物工業研究所（FRI）に受託番号FERM Ｐ
−9113として寄託されている。
ヒア・コリ N4830/pIGT−126は、昭和61年12月19日か
ら財団法人醗酵研究所（IFO）に寄託番号IFO 14557と
して寄託され、また昭和61年12月25日から通商産業省工
業技術院微生物工業研究所（FRI）に受託番号FERM Ｐ
−9113として寄託されている。
実施例１（形質転換体の製造） IFN−γ発現プラスミドpLC2（EPC公開第154316号公報
Reference Example 4）を制限酵素EcoR Iで消化し、IFN
−γ遺伝子部分を含むDNA断片を分取した。この断片
を、EcoR I消化したMI3ファージ由来のDNA,mp19にT4−D
NAリガーゼを用いて組み込み、大腸菌JM103［メシング
ら，ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid
Res.）９,309（1981）］に形質導入した。得られたＭ
−13ファージのプラークよりIFN−γ遺伝子のマイナス
鎖をファージ粒子中に含むものを選択し、DNAを抽出精
製することによって、単鎖DNAmp19−IGT（−）を得た。
Reference Example 4）を制限酵素EcoR Iで消化し、IFN
−γ遺伝子部分を含むDNA断片を分取した。この断片
を、EcoR I消化したMI3ファージ由来のDNA,mp19にT4−D
NAリガーゼを用いて組み込み、大腸菌JM103［メシング
ら，ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid
Res.）９,309（1981）］に形質導入した。得られたＭ
−13ファージのプラークよりIFN−γ遺伝子のマイナス
鎖をファージ粒子中に含むものを選択し、DNAを抽出精
製することによって、単鎖DNAmp19−IGT（−）を得た。
この単鎖DNA及びリン酸アミダイト法により合成した
オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｃ）： （ａ） ATGGCTGAACTGTAATGGTTGTCC,（ｂ） GCTGAACTG
TCGTAATGGTTGTCC,（ｃ） GAACTGTCGCCATAATGGTTGTCCを
用いて、アマシャム社（Amersham International pl
c,Buckinghamshire,England）のキット［オリゴヌクレ
オチド・ダイレクティッド・イン・ビトロ・ムタジェネ
シス・システム］を用いた公知の方法により部位特異的
突然変異誘発を行なった。なお、上記合成オリゴヌクレ
オチドは遺伝子の不用部分を欠損させ、（ａ）は123
位，（ｂ）は124位，（ｃ）は125位までのIFN−γの配
列をそれぞれ有するものとなるように設計したものであ
る（第２図参照）。
オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｃ）： （ａ） ATGGCTGAACTGTAATGGTTGTCC,（ｂ） GCTGAACTG
TCGTAATGGTTGTCC,（ｃ） GAACTGTCGCCATAATGGTTGTCCを
用いて、アマシャム社（Amersham International pl
c,Buckinghamshire,England）のキット［オリゴヌクレ
オチド・ダイレクティッド・イン・ビトロ・ムタジェネ
シス・システム］を用いた公知の方法により部位特異的
突然変異誘発を行なった。なお、上記合成オリゴヌクレ
オチドは遺伝子の不用部分を欠損させ、（ａ）は123
位，（ｂ）は124位，（ｃ）は125位までのIFN−γの配
列をそれぞれ有するものとなるように設計したものであ
る（第２図参照）。
上記キットの指示に従ってDNA操作の後、大腸菌JM−1
03をトランスフォーメーションすることによって得られ
たプラークより、大腸菌JM−103をホストとしてファー
ジを培養し、培養液中のファージ粒子より単鎖DNAを、
ホストの菌体中より二重鎖DNAをそれぞれ取得した。単
鎖DNAを用いて変異部位の塩基配列を決定し、それぞれ
変異を確認した。二重鎖DNAを制限酵素EcoR Iで消化す
ることによって、変異したIFN−γ遺伝子のDNA断片をそ
れぞれ単離することができた。これらのDNA断片を制限
酵素EcoR Iで消化したpLC2のλＰLプロモーターの下流
にそれぞれ挿入した（第１図参照）。一方、大腸菌DHI
株にλＰLプロモーターの温度感受性リプレッサー遺伝
子をもったプラスミド［pRK248cIts;ハンスーウリヒ
ら，メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymol.）68,482（1979）］をマニアティスらによる手
順書［モレキュラー・クローニング（Molecular lonin
g），（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory］に従
って形質変換した株E.Coli DHI/pRK248cItsを樹立し
た。本株を、上記DNAによって、同方法に従ってそれぞ
れ形質転換し、目的のポリペプチド LFN−γをコードする発現プラスミド pIGT−123を保持
する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i） DHI/pRK248cIts/pIGT−123（IFO14647,FERM BP−
1474），ポリペプチド をコードする発現プラスミドpIGT−124を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリ DHI/pRK 248cIts/pIGT−1
24（IFO 14648,FERM BP−1475），およびポリペプチ
ド IFN−γをコードする発現プラスミド pIGT−125を保持
する形質転換体エシェリヒア・コリ DHI/pRK248cIts/p
IGT−125（IFO 14649,FERM BP−1476）がそれぞれ得
られた。
03をトランスフォーメーションすることによって得られ
たプラークより、大腸菌JM−103をホストとしてファー
ジを培養し、培養液中のファージ粒子より単鎖DNAを、
ホストの菌体中より二重鎖DNAをそれぞれ取得した。単
鎖DNAを用いて変異部位の塩基配列を決定し、それぞれ
変異を確認した。二重鎖DNAを制限酵素EcoR Iで消化す
ることによって、変異したIFN−γ遺伝子のDNA断片をそ
れぞれ単離することができた。これらのDNA断片を制限
酵素EcoR Iで消化したpLC2のλＰLプロモーターの下流
にそれぞれ挿入した（第１図参照）。一方、大腸菌DHI
株にλＰLプロモーターの温度感受性リプレッサー遺伝
子をもったプラスミド［pRK248cIts;ハンスーウリヒ
ら，メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymol.）68,482（1979）］をマニアティスらによる手
順書［モレキュラー・クローニング（Molecular lonin
g），（1982）,Cold Spring Harbor Laboratory］に従
って形質変換した株E.Coli DHI/pRK248cItsを樹立し
た。本株を、上記DNAによって、同方法に従ってそれぞ
れ形質転換し、目的のポリペプチド LFN−γをコードする発現プラスミド pIGT−123を保持
する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i） DHI/pRK248cIts/pIGT−123（IFO14647,FERM BP−
1474），ポリペプチド をコードする発現プラスミドpIGT−124を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリ DHI/pRK 248cIts/pIGT−1
24（IFO 14648,FERM BP−1475），およびポリペプチ
ド IFN−γをコードする発現プラスミド pIGT−125を保持
する形質転換体エシェリヒア・コリ DHI/pRK248cIts/p
IGT−125（IFO 14649,FERM BP−1476）がそれぞれ得
られた。
実施例２（形質転換体の培養） 実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ
DHI/pRK248cIts/pIGT−123（IFO 14647,FERM BP−147
4），エシェリヒア・コリ DHI/pRK248cIts/pIGT−124
（IFO 14648,FERM BP−1475）およびエシェリヒア・
コリ DHI/pRK248cIts/pIGT−125（IFO 14649,FERM B
P−1476）を、50μg/mlのアンピシリンを含む1.6％バク
ト トリプトン,1％イースト エキストラクト,0.5％Na
Clよりなる２×TY培地で、30℃にてそれぞれ一夜培養
し、飽和培養液を得た。これを２×TY培地で３倍に希釈
し、42℃で更に５時間培養し、遠心分離により菌体を集
めた。菌体は、それぞれ使用時まで−80℃に凍結保存し
た。
DHI/pRK248cIts/pIGT−123（IFO 14647,FERM BP−147
4），エシェリヒア・コリ DHI/pRK248cIts/pIGT−124
（IFO 14648,FERM BP−1475）およびエシェリヒア・
コリ DHI/pRK248cIts/pIGT−125（IFO 14649,FERM B
P−1476）を、50μg/mlのアンピシリンを含む1.6％バク
ト トリプトン,1％イースト エキストラクト,0.5％Na
Clよりなる２×TY培地で、30℃にてそれぞれ一夜培養
し、飽和培養液を得た。これを２×TY培地で３倍に希釈
し、42℃で更に５時間培養し、遠心分離により菌体を集
めた。菌体は、それぞれ使用時まで−80℃に凍結保存し
た。
実施例３（ポリペプチドの精製） 実施例２の方法で得られた凍結菌体50gを7M塩酸グア
ニジンを含むホウ酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）48mlに
懸濁し、４℃で１時間撹拌したのち22,000×ｇで30分間
遠心分離にかけてそれぞれ上清57mlを得た。これらの上
清を、IM尿素を含んだ137mM塩化ナトリウム,2.7mM塩化
カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウムおよび1.5mMリン酸
一カリウムからなる緩衝液（pH7.4）（以下PBSと略す）
で14倍に希釈し、抗体カラム（WNγ２−76.53,カラム容
量14ml）に流速40ml/時間でかけた。そののち、1M尿素
を含むPBS50mlでカラムを洗浄し、ついで2M塩酸グアニ
ジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で溶
出し、 を含む画分30mlをそれぞれ得た。
ニジンを含むホウ酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）48mlに
懸濁し、４℃で１時間撹拌したのち22,000×ｇで30分間
遠心分離にかけてそれぞれ上清57mlを得た。これらの上
清を、IM尿素を含んだ137mM塩化ナトリウム,2.7mM塩化
カリウム,8.1mMリン酸二ナトリウムおよび1.5mMリン酸
一カリウムからなる緩衝液（pH7.4）（以下PBSと略す）
で14倍に希釈し、抗体カラム（WNγ２−76.53,カラム容
量14ml）に流速40ml/時間でかけた。そののち、1M尿素
を含むPBS50mlでカラムを洗浄し、ついで2M塩酸グアニ
ジンを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で溶
出し、 を含む画分30mlをそれぞれ得た。
これらの画分をあらかじめ2M塩酸グアニジンを含む25
mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したセフ
ァクリルＳ−200（ファルマシア社製）のカラム（5.0×
51cm,カラム容量1000ml）にかけ、同一緩衝液で溶出し
て を含む画分37mlをそれぞれ得た。
mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したセフ
ァクリルＳ−200（ファルマシア社製）のカラム（5.0×
51cm,カラム容量1000ml）にかけ、同一緩衝液で溶出し
て を含む画分37mlをそれぞれ得た。
これらの画分を25mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH6.
0）２に対して４℃で１日透析し、透析外液を置換し
てさらに１日透析した。そののち、YM−５膜を用いてDi
aflo（アミコン社製）で濃縮し、アクロディスクフィル
ターを通して、5.3mlの標品をそれぞれ得た。ウシ血清
アルブミンを標準液としてLowry法［ローリーら，ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem），193,265（1951）］で測定した総タンパク量
は、 が15.6mgであった。
0）２に対して４℃で１日透析し、透析外液を置換し
てさらに１日透析した。そののち、YM−５膜を用いてDi
aflo（アミコン社製）で濃縮し、アクロディスクフィル
ターを通して、5.3mlの標品をそれぞれ得た。ウシ血清
アルブミンを標準液としてLowry法［ローリーら，ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem），193,265（1951）］で測定した総タンパク量
は、 が15.6mgであった。
これらの標品をLaemmliの方法［ネイチャー（Natur
e），227,680（1970）］に準じてドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によ
って分析したところ、分子量約14,000の位置に単一バン
ドが検出された（第３図参照）。第３図において、１は
分子量マーカー（ホスホリラーゼB,92,500;ウシ血清ア
ルブミン,66,200;オブアルブミン,45,000;カルボニック
アンヒドラーゼ,31,000;ダイズトリプシンインヒビタ
ー,21,500;リゾチーム,14,400）の、２および３は後述
の参考例で得られた の、4,5および６は前述の のSDS−PAGEの結果をそれぞれ示す。
e），227,680（1970）］に準じてドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によ
って分析したところ、分子量約14,000の位置に単一バン
ドが検出された（第３図参照）。第３図において、１は
分子量マーカー（ホスホリラーゼB,92,500;ウシ血清ア
ルブミン,66,200;オブアルブミン,45,000;カルボニック
アンヒドラーゼ,31,000;ダイズトリプシンインヒビタ
ー,21,500;リゾチーム,14,400）の、２および３は後述
の参考例で得られた の、4,5および６は前述の のSDS−PAGEの結果をそれぞれ示す。
ここに、均一な （以下、IFN−γ ４−123と略記することがある）， （以下、IFN−γ ４−124と略記することがある）およ
び （以下、IFN−γ ４−125と略記することがある）の標
品をそれぞれ得た。これらの標品について、以下の諸性
質を調べた。
び （以下、IFN−γ ４−125と略記することがある）の標
品をそれぞれ得た。これらの標品について、以下の諸性
質を調べた。
（ａ）、アミノ酸組成： 上記で得られた標品70μｇをそれぞれガラス製加水分
解用試験管にとり、４％チオグリコール酸を含む定沸点
塩酸を加えて、減圧下に封管したのち、110℃で24時間
加水分解した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除
去し、残渣を0.02N塩酸に溶解して日立製835型アミノ酸
分析計によりアミノ酸分析を実施した。その結果を第２
表に示す。
解用試験管にとり、４％チオグリコール酸を含む定沸点
塩酸を加えて、減圧下に封管したのち、110℃で24時間
加水分解した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除
去し、残渣を0.02N塩酸に溶解して日立製835型アミノ酸
分析計によりアミノ酸分析を実施した。その結果を第２
表に示す。
（ｂ）、Ｎ末端アミノ酸配列 標品12μｇに気相プロティンシークエネーター（アプ
ライド・バイオシステムズ社製470A型、アメリカ）を用
いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸配
列をそれぞれ分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸（PTH−アミノ酸）はミクロパックSP−ODSカラム
（バリアン社製，アメリカ）を用いる高速液体クロマト
グラフィーにより同定した。各ステップで検出されたPT
H−アミノ酸を第３表に示す。
ライド・バイオシステムズ社製470A型、アメリカ）を用
いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸配
列をそれぞれ分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸（PTH−アミノ酸）はミクロパックSP−ODSカラム
（バリアン社製，アメリカ）を用いる高速液体クロマト
グラフィーにより同定した。各ステップで検出されたPT
H−アミノ酸を第３表に示す。
（ｃ）、Ｃ末端アミノ酸： 標品220μｇをそれぞれガラス製ヒドラジン分解用試
験管にとり、無水ヒドラジン0.05mlを加えて減圧下に封
管したのち、100℃で６時間加熱した。得られたヒドラ
ジン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水に溶解した。こ
の溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温で１時間撹拌
し、遠心分離を行なったのち、上清を得た。この上清を
凍結乾燥し、日立製835型アミノ酸分析計によりアミノ
酸分析を実施した。その結果、IFN−γ ４−123,IFN−
γ ４−124,IFN−γ ４−125について、それぞれロイ
シン，セリン，プロリンのみが検出された。
験管にとり、無水ヒドラジン0.05mlを加えて減圧下に封
管したのち、100℃で６時間加熱した。得られたヒドラ
ジン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水に溶解した。こ
の溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温で１時間撹拌
し、遠心分離を行なったのち、上清を得た。この上清を
凍結乾燥し、日立製835型アミノ酸分析計によりアミノ
酸分析を実施した。その結果、IFN−γ ４−123,IFN−
γ ４−124,IFN−γ ４−125について、それぞれロイ
シン，セリン，プロリンのみが検出された。
（ｄ）、抗ウイルス活性： IFN−γ ４−123,IFN−γ ４−124,IFN−γ ４−1
25について、それぞれ14.5×106,9.87×106,12.1×106U
/mgタンパク質であった。
25について、それぞれ14.5×106,9.87×106,12.1×106U
/mgタンパク質であった。
後述の参考例で得られたIFN−γ ４−121,IFN−γ
４−126,IFN−γ ４−127と抗ウイルス活性について比
較すると第４表のとおりである。
４−126,IFN−γ ４−127と抗ウイルス活性について比
較すると第４表のとおりである。
第４表から、IFN−γ ４−123,IFN−γ ４−124,IF
N−γ ４−125が顕著な抗ウイルス活性を示すことが明
らかである。
N−γ ４−125が顕著な抗ウイルス活性を示すことが明
らかである。
参考例１（形質転換体の製造） 実施例１で得られた単鎖DNAmp19−IGT（−）及びリン
酸アミダイト法によって合成したオリゴヌクレオチド
（ｄ）：（ｄ）GTCGCCAGCATAGAAAACAGGを用いて、以下
の部位特異的突然変異誘発［ゾラーら，メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.），100,4
68（1983）］を行なった。
酸アミダイト法によって合成したオリゴヌクレオチド
（ｄ）：（ｄ）GTCGCCAGCATAGAAAACAGGを用いて、以下
の部位特異的突然変異誘発［ゾラーら，メソッズ・イン
・エンザイモロジー（Methods in Enzymol.），100,4
68（1983）］を行なった。
一本鎖DNAと合成オリゴヌクレオチド（ｄ）との間
に、二重鎖を形成させ、続いてDNAポリメラーゼクレノ
断片及びDNAリガーゼを用いて、二重鎖閉鎖環状DNAを作
成した。このDNAを制限酵素EcoR Iで消化することによ
って、IFN−γ遺伝子の変異したプラス鎖を含むDNA断片
を単離することができた。このDNA断片を制限酵素EcoR
Iで消化したpLC2のλＰLプロモーターの下流に挿入し
た。一方、大腸菌DHI株にλＰLプロモーターの温度感受
性リプレッサー遺伝子をもったプラスミド［pRK248cIt
s;ハンスーウリヒら，メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methods in Enzymol.）68,482（1979）］をマニ
アティスらによる手順書［モレキュラークローニング
（Moleculer cloning），（1982）,Cold Spring Har
bor Laboratory］に従って形質転換した株 E.coli D
HI/pRK248cItsを樹立した。本株を上記DNAによって、法
方向に従って形質転換した。
に、二重鎖を形成させ、続いてDNAポリメラーゼクレノ
断片及びDNAリガーゼを用いて、二重鎖閉鎖環状DNAを作
成した。このDNAを制限酵素EcoR Iで消化することによ
って、IFN−γ遺伝子の変異したプラス鎖を含むDNA断片
を単離することができた。このDNA断片を制限酵素EcoR
Iで消化したpLC2のλＰLプロモーターの下流に挿入し
た。一方、大腸菌DHI株にλＰLプロモーターの温度感受
性リプレッサー遺伝子をもったプラスミド［pRK248cIt
s;ハンスーウリヒら，メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methods in Enzymol.）68,482（1979）］をマニ
アティスらによる手順書［モレキュラークローニング
（Moleculer cloning），（1982）,Cold Spring Har
bor Laboratory］に従って形質転換した株 E.coli D
HI/pRK248cItsを樹立した。本株を上記DNAによって、法
方向に従って形質転換した。
得られた形質転換コロニーの中から、 を発現している株を選択した。
この株が含有するプラスミド中でIFN−γをコードす
る部分は、式［II］において、Ｙ′はCAGでＺ′は
（５′）GCT GAA CTG TCG CAA GCA（３′）でそれ
ぞれ示される塩基配列であることが確認され、目的の をコードする発現プラスミド pIGT−126が構築され
た。
る部分は、式［II］において、Ｙ′はCAGでＺ′は
（５′）GCT GAA CTG TCG CAA GCA（３′）でそれ
ぞれ示される塩基配列であることが確認され、目的の をコードする発現プラスミド pIGT−126が構築され
た。
このプラスミドを用いて、大腸菌N4830［リード，セ
ル（Cell）25,713（1981）］を形質転換し形質転換体エ
シェリヒア・コリN4830/pIGT−126（IFO 14557,FERM
Ｐ−9113を得た。
ル（Cell）25,713（1981）］を形質転換し形質転換体エ
シェリヒア・コリN4830/pIGT−126（IFO 14557,FERM
Ｐ−9113を得た。
参考例２（形質転換体の構造） 実施例１で得た単鎖DNAmp19−IGT（−）及びリン酸ア
ミダイト法によって合成したオリゴヌクレオチド（ｅ）
〜（ｆ）:CAAGTGATGGCTTAATGGTTGTCC,TCGCCAGCAGCTTAAT
GGTTGTCCを用いて、実施例１と同様にして をコードする発現プラスミドpIGT−121を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリDH1/pRK248cIts/pIGT−121, をコードする発現プラスミドpIGT−127を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−127
がそれらを得られた。
ミダイト法によって合成したオリゴヌクレオチド（ｅ）
〜（ｆ）:CAAGTGATGGCTTAATGGTTGTCC,TCGCCAGCAGCTTAAT
GGTTGTCCを用いて、実施例１と同様にして をコードする発現プラスミドpIGT−121を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリDH1/pRK248cIts/pIGT−121, をコードする発現プラスミドpIGT−127を保持する形質
転換体エシェリヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−127
がそれらを得られた。
参考例３（形質転換体の培養およびポリペプチドの精
製） 参考例１および参考例２で得られた形質転換体エシェ
リヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−121,エシェリヒ
ア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−127およびエシェリヒ
ア・コリN4830/pIGT−126（IFO 14557,FERM Ｐ−911
3）を、それぞれ実施例２と同様の方法により培養し、
遠心分離により菌体を集めた。これらの菌体から、それ
ぞれ実施例３と同様の方法により精製して を取得した。
製） 参考例１および参考例２で得られた形質転換体エシェ
リヒア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−121,エシェリヒ
ア・コリ DH1/pRK248cIts/pIGT−127およびエシェリヒ
ア・コリN4830/pIGT−126（IFO 14557,FERM Ｐ−911
3）を、それぞれ実施例２と同様の方法により培養し、
遠心分離により菌体を集めた。これらの菌体から、それ
ぞれ実施例３と同様の方法により精製して を取得した。
これらの標品を実施例３に記載の方法によりドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）によって分析したところ、 については、分子量約14,000の位置に単一バンドが検出
された（第３図参照）。
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）によって分析したところ、 については、分子量約14,000の位置に単一バンドが検出
された（第３図参照）。
なお、 については単一バンドが得られたが、抗ウイルス活性は
検出されなかった。
検出されなかった。
均一な （以下、IFN−γ ４−126と略記することがある）およ
び （以下、IFN−γ ４−127と略記することがある）の標
品について、以下の諸性質を調べた。
び （以下、IFN−γ ４−127と略記することがある）の標
品について、以下の諸性質を調べた。
（ａ）、アミノ酸組成： 実施例３に記載の方法によりアミノ酸分析を実施し
た。その結果を第５表に示す。
た。その結果を第５表に示す。
（ｂ）、アミノ酸配列 実施例３に記載の方法によりＮ末端アミノ酸配列を分
析した。その結果を第６表に示す。
析した。その結果を第６表に示す。
（ｃ）,Cアミノ酸： 実施例３に記載の方法によりカルボキシル末端アミノ
酸を同定したところ、IFN−γ ４−126,IFN−γ ４−
127について、いずれもアラニンのみが検出された。
酸を同定したところ、IFN−γ ４−126,IFN−γ ４−
127について、いずれもアラニンのみが検出された。
（ｄ）、抗ウイルス活性： IFN−γ ４−126,IFN−γ ４−127について、それ
ぞれ3.3×106,2.6×106U/mgタンパク質であった。
ぞれ3.3×106,2.6×106U/mgタンパク質であった。
発明の効果 本発明のポリペプチド（Ｉ）は、第４図に示されるイ
ンタクトなIFN−γより強い抗ウイルス作用，抗腫瘍作
用，免疫増強作用等を有し、安定であるので医薬品等と
して有利に使用できる。
ンタクトなIFN−γより強い抗ウイルス作用，抗腫瘍作
用，免疫増強作用等を有し、安定であるので医薬品等と
して有利に使用できる。
第１図は、実施例１に示したプラスミドpIGT−123の構
築図を示す。 はIFN−γ遺伝子を示す。 は変異点を示す。） 第２図は、実施例１で用いる単鎖DNAmp19−IGT（−）の
塩基配列の一部および実施例１で用いる合成オリゴヌク
レオチドを示す。（−は欠損部分を示す。＊＊＊は翻訳
終止コドンを示す。） 第３図は、実施例３および参考例３で得られたSDS−PAG
Eのパターンを示す。 第４図は、IFN−γのアミノ酸配列および本明細書で用
いる構成アミノ酸の番号を示す。
築図を示す。 はIFN−γ遺伝子を示す。 は変異点を示す。） 第２図は、実施例１で用いる単鎖DNAmp19−IGT（−）の
塩基配列の一部および実施例１で用いる合成オリゴヌク
レオチドを示す。（−は欠損部分を示す。＊＊＊は翻訳
終止コドンを示す。） 第３図は、実施例３および参考例３で得られたSDS−PAG
Eのパターンを示す。 第４図は、IFN−γのアミノ酸配列および本明細書で用
いる構成アミノ酸の番号を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭61−5096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−202899（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−63696（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−24599（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−108397（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−501430（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】式 ［式中、ＸはMetまたは結合手を示し、ＸがMetのときＹ
はGlnを、Ｘが結合手のときＹはGlnまたは＜Gluを、Ｚ
は（Ｎ）Leu Ser Pro（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜３個のアミノ酸もしく
はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
ド。 - 【請求項２】ＸがMet、ＹがGlnである特許請求の範囲第
１項記載のポリペプチド。 - 【請求項３】式 ［式中、ＸはMetまたは結合手を示し、ＸがMetのときＹ
はGlnを、Ｘが結合手のときＹはGlnまたは＜Gluを、Ｚ
は（Ｎ）Leu Ser Pro（Ｃ）で示されるペプチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜３個のアミノ酸もしく
はペプチドをそれぞれ示す。］で表わされるポリペプチ
ドをコードする領域を有するDNAを有するプラスミドを
保持する細菌，酵母または動物細胞を培地に培養し、培
養物中に該ポリペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする該ポリペプチドの製造法。 - 【請求項４】ＸがMet、ＹがGlnである特許請求の範囲第
３項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62229317A JP2653061B2 (ja) | 1986-12-27 | 1987-09-11 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
| EP87119078A EP0273373A3 (en) | 1986-12-27 | 1987-12-22 | Novel peptides and production thereof |
| US07/136,712 US4980455A (en) | 1986-12-27 | 1987-12-22 | Novel polypeptides and production thereof |
| CN198787108308A CN87108308A (zh) | 1986-12-27 | 1987-12-24 | 新的多肽及其生产 |
| US07/575,552 US5157004A (en) | 1986-12-27 | 1990-08-29 | Polypeptides and production thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-313382 | 1986-12-27 | ||
| JP31338286 | 1986-12-27 | ||
| JP62229317A JP2653061B2 (ja) | 1986-12-27 | 1987-09-11 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63264500A JPS63264500A (ja) | 1988-11-01 |
| JP2653061B2 true JP2653061B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=26528744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62229317A Expired - Lifetime JP2653061B2 (ja) | 1986-12-27 | 1987-09-11 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4980455A (ja) |
| EP (1) | EP0273373A3 (ja) |
| JP (1) | JP2653061B2 (ja) |
| CN (1) | CN87108308A (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| US4855238A (en) | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| EP0472467A3 (en) * | 1990-08-20 | 1993-03-17 | Chiba Flour Milling Co. Ltd. | Lps-containing analgesics and veterinary analgesics |
| CA2090478A1 (en) * | 1990-08-31 | 1992-03-01 | Satwant K. Narula | Human interferon- 4-134, functional equivalents thereof and methods of using and compositions employing these materials |
| BR0015506A (pt) | 1999-11-12 | 2002-07-23 | Maxygen Holdings Ltd | Conjugados de interferon gama, métodos para sua preparação, composições farmacêuticas que compreendem ás moléculas e seu uso no tratamento de doenças |
| YU32402A (sh) | 1999-11-12 | 2005-03-15 | Maxygen Holdings Ltd. | Konjugati gama interferona |
| US7038015B2 (en) * | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US6822073B2 (en) * | 2001-12-20 | 2004-11-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Modular peptide-based reagent |
| WO2004005341A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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