JP2578488B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−トリプトファン、Ｌ−チロ
シンまたはＬ−フェニルアラニンの製造法に関する。Ｌ
−トリプトファンは医薬品、食品あるいは飼料添加物な
どとして有用なアミノ酸である。また、Ｌ−チロシンは
特に医薬において、Ｌ−フェニルアラニンは医薬、食品
工業において有用なアミノ酸である。
シンまたはＬ−フェニルアラニンの製造法に関する。Ｌ
−トリプトファンは医薬品、食品あるいは飼料添加物な
どとして有用なアミノ酸である。また、Ｌ−チロシンは
特に医薬において、Ｌ−フェニルアラニンは医薬、食品
工業において有用なアミノ酸である。
従来の技術 従来、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いてＬ−トリ
プトファンを発酵法で生産する方法としては、Ｌ−チロ
シンおよびＬ−フェニルアラニンを要求し、かつチロシ
ンアナログまたはフェニルアラニンアナログの一つもし
くは二つ以上に耐性を有するコリネバクテリウム属に属
する微生物を用いる方法（特公昭51−19037）、５−メ
チルトリプトファンなどのトリプトファンアナログに耐
性を有する微生物を用いる方法（特公昭48−18828、特
公昭51−38795、特公昭53−39517）、ヒスチジン要求株
を用いる方法（特公昭47−4505）、ピルビン酸キナーゼ
活性の低下または欠失したブレビバクテリウム属に属す
る微生物を用いる方法（特開昭62−253391）などが知ら
れている。
プトファンを発酵法で生産する方法としては、Ｌ−チロ
シンおよびＬ−フェニルアラニンを要求し、かつチロシ
ンアナログまたはフェニルアラニンアナログの一つもし
くは二つ以上に耐性を有するコリネバクテリウム属に属
する微生物を用いる方法（特公昭51−19037）、５−メ
チルトリプトファンなどのトリプトファンアナログに耐
性を有する微生物を用いる方法（特公昭48−18828、特
公昭51−38795、特公昭53−39517）、ヒスチジン要求株
を用いる方法（特公昭47−4505）、ピルビン酸キナーゼ
活性の低下または欠失したブレビバクテリウム属に属す
る微生物を用いる方法（特開昭62−253391）などが知ら
れている。
また、コリネ型グルタミン酸生産菌を用いた発酵法に
よるＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの製造法
としては、アミノ酸の栄養要求性変異、アミノ酸のアナ
ログに対する耐性変異あるいはピリビン酸キナーゼ活性
の低下または欠失変異さらにはそれらの変異の性質を併
有する菌株を用いる方法が知られている〔農芸化学会
誌、50 （１）、p.R 79（1979）特開昭61−128897〕。
一方、組換えDNA技術によるＬ−チロシンまたはＬ−フ
ェニルアラニンの生産菌も作成されており、Ｌ−チロシ
ン生産菌としては、たとえば３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ
（以下DSと略す）、コリスメートムターゼ（以下CMと略
す）およびプレフェネートデヒドロゲナーゼまたはプレ
チロシンアミノトランスフェラーゼの合成に関与する遺
伝子を含む組換え体DNAを保有したＬ−チロシン生産菌
などが知られている（特開昭60−34197）。またＬ−フ
ェニルアラニン生産菌としては、たとえばDSまたはCMお
よびプレフェネートデヒドラターゼ（以下PDと略す）の
合成に関与する遺伝子を含む組換え体DNAを保有したＬ
−フェニルアラニン生産菌などが知られている（特開昭
60−24192、特開昭61−260892、特開昭61−124375）。
よるＬ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの製造法
としては、アミノ酸の栄養要求性変異、アミノ酸のアナ
ログに対する耐性変異あるいはピリビン酸キナーゼ活性
の低下または欠失変異さらにはそれらの変異の性質を併
有する菌株を用いる方法が知られている〔農芸化学会
誌、50 （１）、p.R 79（1979）特開昭61−128897〕。
一方、組換えDNA技術によるＬ−チロシンまたはＬ−フ
ェニルアラニンの生産菌も作成されており、Ｌ−チロシ
ン生産菌としては、たとえば３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ
（以下DSと略す）、コリスメートムターゼ（以下CMと略
す）およびプレフェネートデヒドロゲナーゼまたはプレ
チロシンアミノトランスフェラーゼの合成に関与する遺
伝子を含む組換え体DNAを保有したＬ−チロシン生産菌
などが知られている（特開昭60−34197）。またＬ−フ
ェニルアラニン生産菌としては、たとえばDSまたはCMお
よびプレフェネートデヒドラターゼ（以下PDと略す）の
合成に関与する遺伝子を含む組換え体DNAを保有したＬ
−フェニルアラニン生産菌などが知られている（特開昭
60−24192、特開昭61−260892、特開昭61−124375）。
発明が解決しようとする課題 飼料添加物などとして有用なＬ−トリプトファン、医
薬品として有用なＬ−チロシン、または医薬、食品工業
において有用なＬ−フェニルアラニンを、工業的により
安価に製造する方法が求められている。
薬品として有用なＬ−チロシン、または医薬、食品工業
において有用なＬ−フェニルアラニンを、工業的により
安価に製造する方法が求められている。
課題を解決するための手段 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行
った。その結果、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（以下PCと略す）活性が低下または欠失し、Ｌ−
トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラ
ニン生産能を有するコリネ型グルタミン酸生産菌に属す
る微生物が、従来のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシン
またはＬ−フェニルアラニン生産菌より優れた該アミノ
酸生産能を有することを見い出し、本発明を完成するに
至った。
った。その結果、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（以下PCと略す）活性が低下または欠失し、Ｌ−
トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラ
ニン生産能を有するコリネ型グルタミン酸生産菌に属す
る微生物が、従来のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシン
またはＬ−フェニルアラニン生産菌より優れた該アミノ
酸生産能を有することを見い出し、本発明を完成するに
至った。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、コリネ型グリタミン酸生産菌に属し、PC活
性が低下または欠失し、かつＬ−トリプトファン、Ｌ−
チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産能を有する微
生物を培地に培養し、培養物中にＬ−トリプトファン、
Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンま
たはＬ−フェニルアラニンを採取することを特徴とする
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニル
アラニンの製造法を提供する。
性が低下または欠失し、かつＬ−トリプトファン、Ｌ−
チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産能を有する微
生物を培地に培養し、培養物中にＬ−トリプトファン、
Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを生成蓄積さ
せ、該培養物からＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンま
たはＬ−フェニルアラニンを採取することを特徴とする
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニル
アラニンの製造法を提供する。
本発明で用いられる微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌として知られているコリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属に属する微生物であって、
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニル
アラニン生産能を有し、しかもPC活性が低下または欠失
した菌株であればいずれでもよい。このような性質を有
する微生物を誘導する際に親株として用いる代表的なコ
リネ型グルタミン酸生産菌としては、下記に示す菌株を
あげることができる。
ミン酸生産菌として知られているコリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属に属する微生物であって、
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニル
アラニン生産能を有し、しかもPC活性が低下または欠失
した菌株であればいずれでもよい。このような性質を有
する微生物を誘導する際に親株として用いる代表的なコ
リネ型グルタミン酸生産菌としては、下記に示す菌株を
あげることができる。
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 上記したようなコリネ型ゲルタミン酸生産菌からＬ−
トリプトファン生産菌を誘導するには、チロシンおよび
フェニルアラニン要求性、５−メチルトリプトファンな
どのトリプトファンアナログ耐性を付与することによっ
て取得できる。
トリプトファン生産菌を誘導するには、チロシンおよび
フェニルアラニン要求性、５−メチルトリプトファンな
どのトリプトファンアナログ耐性を付与することによっ
て取得できる。
また、コリネ型ゲルタミン酸生産菌からＬ−チロシン
生産菌を誘導するには、Ｌ−フェニルアラニン要求性や
アミノ酸アナログ耐性あるいはそれらの性質を併有する
菌株を誘導することによって、Ｌ−チロシン生産菌を取
得することができる。また、組換えDNA技術による取得
法も知られており、たとえば、DS、CMおよびプレフェネ
ートデヒドロゲナーゼまたはプレチロシンアミノトラン
スフェラーゼの合成に関与する遺伝子を含む組換え体DN
Aを導入することによっても取得できる（特開昭60−341
97）。さらには共通の生合成経路を経て合成されるＬ−
トリプトファンの生産菌にDS、CMなどＬ−チロシン生合
成に関与する酵素の遺伝情報を担うDNA断片とベクターD
NAとの組換え体DNAを導入し、Ｌ−トリプトファン生産
菌をＬ−チロシン生産菌に転換することによっても取得
することができる（特開昭63−94985）。
生産菌を誘導するには、Ｌ−フェニルアラニン要求性や
アミノ酸アナログ耐性あるいはそれらの性質を併有する
菌株を誘導することによって、Ｌ−チロシン生産菌を取
得することができる。また、組換えDNA技術による取得
法も知られており、たとえば、DS、CMおよびプレフェネ
ートデヒドロゲナーゼまたはプレチロシンアミノトラン
スフェラーゼの合成に関与する遺伝子を含む組換え体DN
Aを導入することによっても取得できる（特開昭60−341
97）。さらには共通の生合成経路を経て合成されるＬ−
トリプトファンの生産菌にDS、CMなどＬ−チロシン生合
成に関与する酵素の遺伝情報を担うDNA断片とベクターD
NAとの組換え体DNAを導入し、Ｌ−トリプトファン生産
菌をＬ−チロシン生産菌に転換することによっても取得
することができる（特開昭63−94985）。
一方、コリネ型ゲルタミン酸生産菌からＬ−フェニル
アラニン生産菌を誘導するには、Ｌ−チロシン要求生や
アミノ酸アナログ耐性あるいはそれらの性質を併有する
菌株を誘導することによって、Ｌ−フェニルアラニン生
産菌を取得することができる。また、組換えDNA技術に
よる取得法も知られており、たとえば、DSまたはCMおよ
びPDの合成に関与する遺伝子を含む組換え体DNAを導入
することによっても取得できる（特開昭60−24192、特
開昭61−260892、特開昭61−124375）。さらにはＬ−ト
リプトファン生産菌にDS、CMおよびPDの合成に関与する
遺伝情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を導入し、Ｌ−トリプトファン生産菌をＬ−フェニルア
ラニン生産菌に転換することによっても取得することが
できる（特開昭63−105688）。
アラニン生産菌を誘導するには、Ｌ−チロシン要求生や
アミノ酸アナログ耐性あるいはそれらの性質を併有する
菌株を誘導することによって、Ｌ−フェニルアラニン生
産菌を取得することができる。また、組換えDNA技術に
よる取得法も知られており、たとえば、DSまたはCMおよ
びPDの合成に関与する遺伝子を含む組換え体DNAを導入
することによっても取得できる（特開昭60−24192、特
開昭61−260892、特開昭61−124375）。さらにはＬ−ト
リプトファン生産菌にDS、CMおよびPDの合成に関与する
遺伝情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を導入し、Ｌ−トリプトファン生産菌をＬ−フェニルア
ラニン生産菌に転換することによっても取得することが
できる（特開昭63−105688）。
本発明のPC活性の低下または欠失したＬ−トリプトフ
ァン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産菌
は、公知のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニン生産能を有する菌株にPC活性を低下
または欠失させる変異を付与することによって取得でき
る。また、野生株から誘導したPC活性の低下または欠失
した変異株に、栄養要求性、アナログ耐性などの性質を
付与することによってもＬ−トリプトファン、Ｌ−チロ
シンまたはＬ−フェニルアラニン生産性の菌株を得るこ
とができる。
ァン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産菌
は、公知のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニン生産能を有する菌株にPC活性を低下
または欠失させる変異を付与することによって取得でき
る。また、野生株から誘導したPC活性の低下または欠失
した変異株に、栄養要求性、アナログ耐性などの性質を
付与することによってもＬ−トリプトファン、Ｌ−チロ
シンまたはＬ−フェニルアラニン生産性の菌株を得るこ
とができる。
本発明におけるPC活性低下または欠失した変異株は、
紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（以下NTGと略す）、亜硝酸などの化学処理
など、通常用いられる変異処理方法により変異処理した
菌株から、Ｌ−グルタミン酸要求性株として得ることが
できる。また、PCの触媒中心の親和性標識試薬に対して
感受性となった菌株、あるいはＬ−グルタミン酸要求性
（PC活性欠失）株の復帰変異株として選択することによ
っても得ることができる。親和性標識試薬とは、酵素の
活性部位と特異的な親和性をもちその酵素を失活させる
化合物をさし、活性部位指向性不可逆的阻害剤（active
−site−directed irreversible inhibitor）とも呼ば
れる〔「生化学辞典」東京化学同人（1984）〕。
紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（以下NTGと略す）、亜硝酸などの化学処理
など、通常用いられる変異処理方法により変異処理した
菌株から、Ｌ−グルタミン酸要求性株として得ることが
できる。また、PCの触媒中心の親和性標識試薬に対して
感受性となった菌株、あるいはＬ−グルタミン酸要求性
（PC活性欠失）株の復帰変異株として選択することによ
っても得ることができる。親和性標識試薬とは、酵素の
活性部位と特異的な親和性をもちその酵素を失活させる
化合物をさし、活性部位指向性不可逆的阻害剤（active
−site−directed irreversible inhibitor）とも呼ば
れる〔「生化学辞典」東京化学同人（1984）〕。
本発明の微生物によるＬ−トリプトファン、Ｌ−チロ
シンまたはＬ−フェニルアラニンの生産は、通常の培養
法で実施可能である。使用培地としては、炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を
程良く含有するものならば合成培地または天然培地いず
れも使用可能である。
シンまたはＬ−フェニルアラニンの生産は、通常の培養
法で実施可能である。使用培地としては、炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を
程良く含有するものならば合成培地または天然培地いず
れも使用可能である。
炭素源としてはグルコース、グリセロース、フラクト
ース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコ
ール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種
有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、
炭化水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜
は好適に用いられる。
ース、シュークロース、マルトース、マンノース、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコ
ール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種
有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、
炭化水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜
は好適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭素アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
硫酸アンモニウム、炭素アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。
さらに無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。
ン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。
培養は振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
地のpHは中性付近に維持することが望ましい。培養期間
は通常１〜５日間である。
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
地のpHは中性付近に維持することが望ましい。培養期間
は通常１〜５日間である。
培養液からＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたは
Ｌ−フェニルアラニンを採取する方法は、培養終了後、
菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処理あるいは
イオン交換樹脂処理などの公知の方法によって行われ
る。
Ｌ−フェニルアラニンを採取する方法は、培養終了後、
菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処理あるいは
イオン交換樹脂処理などの公知の方法によって行われ
る。
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１ PC活性低下変異株の分離 （１） Ｌ−トリプトファン生産菌 Ｌ−トリプトファン生産能を有するコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC21851を親株として用いた。完全
培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水１に含
み、pH7.2に調整した培地）で30℃、16時間培養した菌
体を集め、0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）で洗浄後菌体の
濃度が約109細胞/mlになるように同緩衝液に懸濁し、こ
れにNTGを最終濃度が500μg/mlとなるように加え、30
℃、20分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌
体を同緩衝液で洗浄後、その菌体を第１表に示す組成の
最少培地にPCの親和性標識試薬として知られている３−
ブロモピルビン酸（以下3BPと略す）〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）86,1251〜1257
（1979）〕を0.5μg/ml含有する平板寒天培地に塗布し
た。
ム・グルタミクムATCC21851を親株として用いた。完全
培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水１に含
み、pH7.2に調整した培地）で30℃、16時間培養した菌
体を集め、0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2）で洗浄後菌体の
濃度が約109細胞/mlになるように同緩衝液に懸濁し、こ
れにNTGを最終濃度が500μg/mlとなるように加え、30
℃、20分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌
体を同緩衝液で洗浄後、その菌体を第１表に示す組成の
最少培地にPCの親和性標識試薬として知られている３−
ブロモピルビン酸（以下3BPと略す）〔ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）86,1251〜1257
（1979）〕を0.5μg/ml含有する平板寒天培地に塗布し
た。
30℃で５〜10日間培養し、該平板培地上に生育するコ
ロニーのうち小さいコロニーを釣菌した。このうち親株
に比べて3BPに対して感受性となった菌株を分離し、こ
のような変異株の中からPC活性の低下した菌株コリネバ
クテリウム・グルタミクムBPS−13を得た。
ロニーのうち小さいコロニーを釣菌した。このうち親株
に比べて3BPに対して感受性となった菌株を分離し、こ
のような変異株の中からPC活性の低下した菌株コリネバ
クテリウム・グルタミクムBPS−13を得た。
本菌株は昭和63年３月２日付で工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）にFERM BP−1777として寄託され
ている。
技術研究所（微工研）にFERM BP−1777として寄託され
ている。
第２表に、親株ATCC21851と変異株BPS−13の3BP感受
性と、それらのPC活性およびピルビン酸キナーゼ（以下
PKと略す）活性を示した。3BP感受性は、種々の濃度の3
BPを含む第１表に示した組成の最少寒天培地に両菌株を
塗布し、30℃、４日間培養後の生育の度合いで判定し
た。PC活性およびPK活性は、菌体の粗酵素抽出液を用い
てそれぞれジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.
Biochem.），66（３）,297〜311（1969）、アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Bio
l.Chem.），48（５）,1189〜1197（1984）に記載されて
いる方法で測定した。菌体の粗酵素抽出液は次のように
調製した。グリコース30g/、MgSO4・7H2O 0.5g/、
FeSO4・7H2O 10mg/、KH2PO41g/、MnSO4・4H2O 1m
g/、硫安4g/、尿素2g/、ビオチン50μg/、ｐ−
アミノ安息香酸2.5mg/、サイアミン塩酸塩1mg/、食
塩50mg/、Ｌ−チロシン50mg/、Ｌ−フェニルアラニ
ン50mg/の組成の培地（pH7.2）に菌株を接種し、30℃
で24時間振盪培養後集菌した。この菌体を0.2％塩化カ
リウム水溶液で２回洗浄し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.2）に懸濁後超音波処理で菌体を破砕した。遠心
分離後、上澄み液を同緩衝液で一夜透析し粗酵素液を得
た。第２表の酵素活性は、粗酵素抽出液中のタンパク量
あたりの比活性を算出し、親株の値を100とした相対値
で示されている。
性と、それらのPC活性およびピルビン酸キナーゼ（以下
PKと略す）活性を示した。3BP感受性は、種々の濃度の3
BPを含む第１表に示した組成の最少寒天培地に両菌株を
塗布し、30℃、４日間培養後の生育の度合いで判定し
た。PC活性およびPK活性は、菌体の粗酵素抽出液を用い
てそれぞれジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.
Biochem.），66（３）,297〜311（1969）、アグリカル
チュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric.Bio
l.Chem.），48（５）,1189〜1197（1984）に記載されて
いる方法で測定した。菌体の粗酵素抽出液は次のように
調製した。グリコース30g/、MgSO4・7H2O 0.5g/、
FeSO4・7H2O 10mg/、KH2PO41g/、MnSO4・4H2O 1m
g/、硫安4g/、尿素2g/、ビオチン50μg/、ｐ−
アミノ安息香酸2.5mg/、サイアミン塩酸塩1mg/、食
塩50mg/、Ｌ−チロシン50mg/、Ｌ−フェニルアラニ
ン50mg/の組成の培地（pH7.2）に菌株を接種し、30℃
で24時間振盪培養後集菌した。この菌体を0.2％塩化カ
リウム水溶液で２回洗浄し、0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.2）に懸濁後超音波処理で菌体を破砕した。遠心
分離後、上澄み液を同緩衝液で一夜透析し粗酵素液を得
た。第２表の酵素活性は、粗酵素抽出液中のタンパク量
あたりの比活性を算出し、親株の値を100とした相対値
で示されている。
（２） Ｌ−チロシン生産菌 Ｌ−トリプトファン生産菌コリネバクテリウム・グル
タミクムATCC21851を、特開昭63−94985か開示されたコ
リネバクテリウム・グルタミクムのDSおよびCM遺伝子を
有する組換え体プラスミドpCDS−CM1を用いて形質転換
し、Ｌ−チロシン生産能を有するコリネバクテリウム・
グルタミクムT6株（ATCC21851/pCDS−CM1）を得た。形
質転換株の取得は特開昭63−94985に記載の方法で行っ
た。すなわち、NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5
gを水１に含み、pH7.2に調整した培地）で増殖したAT
CC21851株の種培養液4mlをＬ−チロシンおよびＬ−フェ
ニルアラニン各100μg/mlを含む40mlの半合成培地SSM
〔グリコース20g、（NH4）2SO4 10g、尿素3g、酵母エ
キス1g、KH2PO4 1g、MgCl2・6H2O 0.4g、FeSO4・7H2O
10mg、MnSO4・４〜6H2O 0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9m
g、CuSO4・5 H2O 0.4mg、Na2B4O7・10H2O 0.09mg、（N
H4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビオチン30μｇおよびサ
イアミン塩酸塩1mgを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養した。東京光電比色計で
660nmにおける吸光度（OD）を測定し、ODが0.2になった
時点で培養液へ0.5単位/mlの濃度となるようにペニシリ
ンＧを添加し、さらに培養を継続した。ODが0.6になっ
た時点で集菌し、該細胞をRCGPに培地〔グルコース5g、
カザミノ酸5g、酵母エキス2.5g、K2HPO43.5g、KH2PO41.
5g、MgCl2・6H2O 0.41g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・
４〜6H2O 2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、（NH4）6Mo7O24
・4H2O 0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミン塩酸塩2m
g、コハク酸二ナトリウム135g、ポリビニルピロリドン
（分子量10,000）30gを水１に含む培地〕に1mg/mlの
リゾチームを含む溶液（pH7.6）10mlに約109細胞/mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃で５時間穏
やかに振盪反応してプロトプラスト化した。
タミクムATCC21851を、特開昭63−94985か開示されたコ
リネバクテリウム・グルタミクムのDSおよびCM遺伝子を
有する組換え体プラスミドpCDS−CM1を用いて形質転換
し、Ｌ−チロシン生産能を有するコリネバクテリウム・
グルタミクムT6株（ATCC21851/pCDS−CM1）を得た。形
質転換株の取得は特開昭63−94985に記載の方法で行っ
た。すなわち、NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5
gを水１に含み、pH7.2に調整した培地）で増殖したAT
CC21851株の種培養液4mlをＬ−チロシンおよびＬ−フェ
ニルアラニン各100μg/mlを含む40mlの半合成培地SSM
〔グリコース20g、（NH4）2SO4 10g、尿素3g、酵母エ
キス1g、KH2PO4 1g、MgCl2・6H2O 0.4g、FeSO4・7H2O
10mg、MnSO4・４〜6H2O 0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9m
g、CuSO4・5 H2O 0.4mg、Na2B4O7・10H2O 0.09mg、（N
H4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビオチン30μｇおよびサ
イアミン塩酸塩1mgを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養した。東京光電比色計で
660nmにおける吸光度（OD）を測定し、ODが0.2になった
時点で培養液へ0.5単位/mlの濃度となるようにペニシリ
ンＧを添加し、さらに培養を継続した。ODが0.6になっ
た時点で集菌し、該細胞をRCGPに培地〔グルコース5g、
カザミノ酸5g、酵母エキス2.5g、K2HPO43.5g、KH2PO41.
5g、MgCl2・6H2O 0.41g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・
４〜6H2O 2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、（NH4）6Mo7O24
・4H2O 0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミン塩酸塩2m
g、コハク酸二ナトリウム135g、ポリビニルピロリドン
（分子量10,000）30gを水１に含む培地〕に1mg/mlの
リゾチームを含む溶液（pH7.6）10mlに約109細胞/mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃で５時間穏
やかに振盪反応してプロトプラスト化した。
このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、2,5
00×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液（MgCl210mM、C
aCl230mM、トリス50mM、ショ糖400mM、pH7.5）1mlに再
懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに再懸濁した。
この菌液にpCDS−CM1プラスミドDNA1μｇを含むTSMC緩
衝液10μを加えて混和し、次いでTSMC緩衝液に20％PE
G6,000（半井化学薬品社製）を含む液0.8mlを添加して
混合した。３分後RCGP培地（pH7.2）2mlを添加し、2,50
0×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈
降したプロトプラストを1mlのRCGP培地に懸濁してか
ら、この菌液0.2mlをスペクチノマイシン400μg/mlを含
むRCGP寒天培地（RCGP培地に1.4％寒天を含む培地、pH
7.2）に塗布し、30℃で７日間培養した。寒天培地上に
生育した菌株を形質転換株として選択した。
00×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液（MgCl210mM、C
aCl230mM、トリス50mM、ショ糖400mM、pH7.5）1mlに再
懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに再懸濁した。
この菌液にpCDS−CM1プラスミドDNA1μｇを含むTSMC緩
衝液10μを加えて混和し、次いでTSMC緩衝液に20％PE
G6,000（半井化学薬品社製）を含む液0.8mlを添加して
混合した。３分後RCGP培地（pH7.2）2mlを添加し、2,50
0×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈
降したプロトプラストを1mlのRCGP培地に懸濁してか
ら、この菌液0.2mlをスペクチノマイシン400μg/mlを含
むRCGP寒天培地（RCGP培地に1.4％寒天を含む培地、pH
7.2）に塗布し、30℃で７日間培養した。寒天培地上に
生育した菌株を形質転換株として選択した。
得られたコリネバクテリウム・グルタミクムT6株（AT
CC21851/pCDS−CM1）を親株として、実施例１の（１）
と同様にして変異処理を行い、3BP感受性変異株を分離
することによりPC活性が低下したＬ−チロシン生産菌コ
リネバクテリウム・グルタミクムK77株を得た。実施例
１（１）と同様な方法で親株T6と変異株K77の3BP感受
性、PC活性およびPK活性を測定した結果を第３表に示し
た。K77株は昭和63年９月21日付で微工研にFERM BP−20
62として寄託されている。
CC21851/pCDS−CM1）を親株として、実施例１の（１）
と同様にして変異処理を行い、3BP感受性変異株を分離
することによりPC活性が低下したＬ−チロシン生産菌コ
リネバクテリウム・グルタミクムK77株を得た。実施例
１（１）と同様な方法で親株T6と変異株K77の3BP感受
性、PC活性およびPK活性を測定した結果を第３表に示し
た。K77株は昭和63年９月21日付で微工研にFERM BP−20
62として寄託されている。
（３） Ｌ−フェニルアラニン生産菌 Ｌ−トリプトファン生産菌コリネバクテリウム・グル
タミクムATCC21851を、特開昭63−105688に開示された
大腸菌のDS、CMおよびPD遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドpEaroG−pheA3を用いて実施例１の（２）と同様にし
て形質転換し、Ｌ−フェニルアラニン生産菌コリネバク
テリウム・グルタミクムT17株（ATCC21851/pEaroG−phe
A3）を得た。ただし、形質転換株の選択には、スペクチ
ノマイシンの代わりにカナマイシン200μg/mlを含むRCG
P寒天培地を用いた。
タミクムATCC21851を、特開昭63−105688に開示された
大腸菌のDS、CMおよびPD遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドpEaroG−pheA3を用いて実施例１の（２）と同様にし
て形質転換し、Ｌ−フェニルアラニン生産菌コリネバク
テリウム・グルタミクムT17株（ATCC21851/pEaroG−phe
A3）を得た。ただし、形質転換株の選択には、スペクチ
ノマイシンの代わりにカナマイシン200μg/mlを含むRCG
P寒天培地を用いた。
得られたコリネバクテリウム・グルタミクムT17株（A
TCC21851/pEaroG−pheA3）を親株として、実施例１の
（１）と同様にして変異処理を行い、PC活性が低下した
Ｌ−フェニルアラニン生産菌コリネバクテリウム・グル
タミクムK78株を得た。実施例１（１）と同様の方法で
親株T17と変異株K78の3BP感受性、PC活性およびPK活性
を測定した結果を第４表に示した。
TCC21851/pEaroG−pheA3）を親株として、実施例１の
（１）と同様にして変異処理を行い、PC活性が低下した
Ｌ−フェニルアラニン生産菌コリネバクテリウム・グル
タミクムK78株を得た。実施例１（１）と同様の方法で
親株T17と変異株K78の3BP感受性、PC活性およびPK活性
を測定した結果を第４表に示した。
K78株は昭和63年９月21日付で微工研にFERM BP−206
3として寄託されている。
3として寄託されている。
実施例２ （１） Ｌ−トリプトファン生産試験 コリネバクテリウム・グルタミクムBPS−13（FERM B
P−1777）を20mlの種培地（グリコース２％、ポリペプ
トン1.5％、酵母エキス1.5％、食塩0.25％、尿素0.1
％、Ｌ−チロシン200mg/、Ｌ−フェニルアラニン200m
g/、pH7.2）を含む300ml容三角フラスコに接種し、30
℃で24時間、210rpmのロータリーシェーカー上で振盪培
養した。この種培養液2mlを20mlの下記組成の発酵培地
を含む300ml容三角フラスコに接種して、72時間、種培
養と同様の方法で培養した。対照として親株ATCC 2185
1も同様に培養した。培養後、培養液をペーパークロ
マトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量
してＬ−トリプトファンを生成量を測定した。
P−1777）を20mlの種培地（グリコース２％、ポリペプ
トン1.5％、酵母エキス1.5％、食塩0.25％、尿素0.1
％、Ｌ−チロシン200mg/、Ｌ−フェニルアラニン200m
g/、pH7.2）を含む300ml容三角フラスコに接種し、30
℃で24時間、210rpmのロータリーシェーカー上で振盪培
養した。この種培養液2mlを20mlの下記組成の発酵培地
を含む300ml容三角フラスコに接種して、72時間、種培
養と同様の方法で培養した。対照として親株ATCC 2185
1も同様に培養した。培養後、培養液をペーパークロ
マトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量
してＬ−トリプトファンを生成量を測定した。
その結果を第５表に示した。
発酵培地の組成：グルコース６％、KH2PO40.05％、K2
HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.025％、硫安２％、ビオチ
ン30μg/、MnSO4・7H2O 10mg/、コーン・スチープ
・リカー0.5％、CaCO32％（pH7.2） （２） Ｌ−チロシン生産試験 コリネバクテリウム・グルタミクムK77（FERM BP−2
062）を、20mlの種培地（グルコース２％、ポリペプト
ン1.5％、酵母エキス1.5％、食塩0.25％、尿素0.1％、p
H7.2）を含む300ml容三角フラスコに接種し、30℃で24
時間210rpmのロータリーシェーカー上で振盪培養した。
この種培養液2mlを20mlの発酵培地を含む300ml容三角フ
ラスコに接種し、種培養と同様の方法で72時間培養し
た。対照として親株T6（ATCC21851/pCDS−CM1）も同様
に培養した。
HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.025％、硫安２％、ビオチ
ン30μg/、MnSO4・7H2O 10mg/、コーン・スチープ
・リカー0.5％、CaCO32％（pH7.2） （２） Ｌ−チロシン生産試験 コリネバクテリウム・グルタミクムK77（FERM BP−2
062）を、20mlの種培地（グルコース２％、ポリペプト
ン1.5％、酵母エキス1.5％、食塩0.25％、尿素0.1％、p
H7.2）を含む300ml容三角フラスコに接種し、30℃で24
時間210rpmのロータリーシェーカー上で振盪培養した。
この種培養液2mlを20mlの発酵培地を含む300ml容三角フ
ラスコに接種し、種培養と同様の方法で72時間培養し
た。対照として親株T6（ATCC21851/pCDS−CM1）も同様
に培養した。
培養後、培養液1mlに6N NaOH溶液を50μ加え、65
℃で５分間加熱し、析出しているＬ−チロシンを完全に
溶解させた後、培養液をペーパークロマトグラフィー
にかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−チロシ
ンの生成量を測定した。
℃で５分間加熱し、析出しているＬ−チロシンを完全に
溶解させた後、培養液をペーパークロマトグラフィー
にかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−チロシ
ンの生成量を測定した。
その結果を第６表に示す。
発酵培地としては、グルコース６％、KH2PO40.05％、
K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.025％、硫安２％、ビオ
チン30μg/、MnSO4・7H2O 10mg/、コーン・スチー
プ・リカー0.5％、CaCO32％（pH7.2）の組成の培地を用
いた。
K2HPO40.05％、MgSO4・7H2O 0.025％、硫安２％、ビオ
チン30μg/、MnSO4・7H2O 10mg/、コーン・スチー
プ・リカー0.5％、CaCO32％（pH7.2）の組成の培地を用
いた。
（３） Ｌ−フェニルアラニン生産試験 コリネバクテリウム・グルタミクムK78（FERM BP−2
063）および親株T17ATCC21851/pEaroG−pheA3）を、実
施例２の（２）と同様に培養した。培養後、培養液を
ペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色
後、比色定量してＬ−フェニルアラニンの生成量を測定
した。
063）および親株T17ATCC21851/pEaroG−pheA3）を、実
施例２の（２）と同様に培養した。培養後、培養液を
ペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色
後、比色定量してＬ−フェニルアラニンの生成量を測定
した。
その結果を第７表に示す。
発明の効果 本発明で得られたPC活性低下変異株を用いることによ
り、従来のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニン生産菌より高い収率でＬ−トリプト
ファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを発
酵生産することができる。
り、従来のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニン生産菌より高い収率でＬ−トリプト
ファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを発
酵生産することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (1)
- 【請求項１】コリネ型グリタミン酸生産菌に属し、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が低下また
は欠失し、かつＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまた
はＬ−フェニルアラニン生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシン
またはＬ−フェニルアラニンを生成蓄積させ、該培養物
からＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェ
ニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−トリプト
ファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの製
造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63241688A JP2578488B2 (ja) | 1988-03-04 | 1988-09-27 | アミノ酸の製造法 |
| DE68919246T DE68919246T2 (de) | 1988-03-04 | 1989-03-01 | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren. |
| EP89103578A EP0331145B1 (en) | 1988-03-04 | 1989-03-01 | Process for producing amino acids |
| KR1019890002697A KR920007405B1 (ko) | 1988-03-04 | 1989-03-04 | 아미노산의 제조방법 |
| US08/130,995 US5484716A (en) | 1988-03-04 | 1993-10-04 | Process for producing L-tryptophan by a Corynebacterium strain having decreased phosphoenolpyruvate carboxylase activity |
| US08/429,472 US5595906A (en) | 1988-03-04 | 1995-04-27 | Corynebacterium strain for producing L-tryptophan decreased in phosphoenolpyruvate carboxylase activity |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5135888 | 1988-03-04 | ||
| JP63-51358 | 1988-03-04 | ||
| JP63241688A JP2578488B2 (ja) | 1988-03-04 | 1988-09-27 | アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01317395A JPH01317395A (ja) | 1989-12-22 |
| JP2578488B2 true JP2578488B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=26391889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63241688A Expired - Lifetime JP2578488B2 (ja) | 1988-03-04 | 1988-09-27 | アミノ酸の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5484716A (ja) |
| EP (1) | EP0331145B1 (ja) |
| JP (1) | JP2578488B2 (ja) |
| KR (1) | KR920007405B1 (ja) |
| DE (1) | DE68919246T2 (ja) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5169768A (en) * | 1983-10-07 | 1992-12-08 | Biotechnica International, Inc. | Method of biosynthesis of phenylalanine |
| JP3023615B2 (ja) * | 1990-08-30 | 2000-03-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
| DE19523279A1 (de) * | 1995-06-27 | 1997-01-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren mittels rekombinanter Mikroorganismen mit erhöhter Sekretionsrate |
| CA2234412C (en) | 1997-06-09 | 2008-09-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing optically active compound |
| GB0007651D0 (en) * | 2000-03-29 | 2000-05-17 | Ascorbex Ltd | Gene sequence |
| AR030430A1 (es) * | 2000-06-29 | 2003-08-20 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Procedimiento para la obtencion de quimicos finos por cultivo de organismos que presentan una via de shiquimato modificada, composicion de acido nucleinico, uso de dicho acido nucleinico para la obtencion de plantas transgenicas, organismo geneticamente modificado, procedimiento para la produccion d |
| AT500455B1 (de) * | 2000-09-15 | 2007-08-15 | Roth Hermann Dr | Verwendung von benzophenanthridinalkaloiden als futteradditiv |
| JP2005065641A (ja) * | 2003-08-27 | 2005-03-17 | Mitsubishi Chemicals Corp | 非アミノ有機酸の製造方法 |
| US8003356B2 (en) * | 2004-04-20 | 2011-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Methods for the preparation of para-hydroxycinnamic acid and cinnamic acid at alkaline pH |
| DE102005043979A1 (de) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen |
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