JPH0783714B2 - 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法Info
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- JPH0783714B2 JPH0783714B2 JP58157512A JP15751283A JPH0783714B2 JP H0783714 B2 JPH0783714 B2 JP H0783714B2 JP 58157512 A JP58157512 A JP 58157512A JP 15751283 A JP15751283 A JP 15751283A JP H0783714 B2 JPH0783714 B2 JP H0783714B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が組
み込れている組換えDNA、該組換えDNAを有する細菌及び
該細菌を用いるアミノ酸の製造法に関する。
み込れている組換えDNA、該組換えDNAを有する細菌及び
該細菌を用いるアミノ酸の製造法に関する。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（4.1.1.31
phosphoenol pyruvate carboxylase;以下「PEPC」と記
す）は、ホスホエノールピルビン酸に１モルの二酸化炭
素を付加しオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する酵素
であり、アスパラギン酸の供給にきわめて重要な役割を
果たしていて、したがって、アルパラギン酸より生成さ
れるアミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロシ
ン、等の生産に重要な役割を果たしている。また、ホス
ホエノールピルビン酸に二酸化炭素を付加してオキザロ
酢酸を生成するのであるから、TCAサイクル有機酸から
生成されるアミノ酸、すなわちグルタミン酸、グルタミ
ン、プロリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン等
のアミノ酸の生成に重要な役割を果している。
phosphoenol pyruvate carboxylase;以下「PEPC」と記
す）は、ホスホエノールピルビン酸に１モルの二酸化炭
素を付加しオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する酵素
であり、アスパラギン酸の供給にきわめて重要な役割を
果たしていて、したがって、アルパラギン酸より生成さ
れるアミノ酸、すなわちリジン、スレオニン、イソロシ
ン、等の生産に重要な役割を果たしている。また、ホス
ホエノールピルビン酸に二酸化炭素を付加してオキザロ
酢酸を生成するのであるから、TCAサイクル有機酸から
生成されるアミノ酸、すなわちグルタミン酸、グルタミ
ン、プロリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン等
のアミノ酸の生成に重要な役割を果している。
本発明者等は大量のアミノ酸を生産することが知られて
いるコリネ型細菌例えばコリネバクテリウム・グルタミ
カム、ブレビバクテリウム・フラバムの細菌内でPEPC遺
伝子を増幅せしめることを意図して研究を開始した。そ
して、ついにPEPCをコードする遺伝子がコリネ型細菌細
胞内で増殖し得るプラスミドベクターと接続されている
組換えDNA及び同組換えDNAを有するコリネ型細菌を得る
ことに成功した。この様な細菌を培養すれば、培地中に
著量のアミノ酸が生産される。
いるコリネ型細菌例えばコリネバクテリウム・グルタミ
カム、ブレビバクテリウム・フラバムの細菌内でPEPC遺
伝子を増幅せしめることを意図して研究を開始した。そ
して、ついにPEPCをコードする遺伝子がコリネ型細菌細
胞内で増殖し得るプラスミドベクターと接続されている
組換えDNA及び同組換えDNAを有するコリネ型細菌を得る
ことに成功した。この様な細菌を培養すれば、培地中に
著量のアミノ酸が生産される。
すなわち本願発明は、アスパラギン酸、リジン、スルオ
ニン、イソロイシン、グルタミン酸、グルタミン、プロ
リン、アルギニン、シトルリン、オルニチンより選ばれ
るＬ−アミノ酸の製造法であって、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られるホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をコードす
るDNA断片がコリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌
に導入されて得られる当該Ｌ−アミノ酸生産能を有する
微生物を培養し、培養液中に蓄積された当該Ｌ−アミノ
酸を採取することを特徴とする当該Ｌ−アミノ酸の製造
法である。
ニン、イソロイシン、グルタミン酸、グルタミン、プロ
リン、アルギニン、シトルリン、オルニチンより選ばれ
るＬ−アミノ酸の製造法であって、コリネホルム・グル
タミン酸生産菌に属するDNA供与菌より得られるホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をコードす
るDNA断片がコリネホルム・グルタミン酸生産菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌
に導入されて得られる当該Ｌ−アミノ酸生産能を有する
微生物を培養し、培養液中に蓄積された当該Ｌ−アミノ
酸を採取することを特徴とする当該Ｌ−アミノ酸の製造
法である。
コリネ型細菌は、好気性、グラム陽性桿菌であり、非抗
酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デターミネイテ
ィブバクテリオロジー第８版599頁（1974）に記載され
ていて、そのうち特に以下に例示するようなＬ−グルタ
ミン酸を大量に生産するものが知られている。
酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デターミネイテ
ィブバクテリオロジー第８版599頁（1974）に記載され
ていて、そのうち特に以下に例示するようなＬ−グルタ
ミン酸を大量に生産するものが知られている。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有
するもののほかに、リジン、アルギニン等のアミノ酸を
生産する変異株も含まれる。
するもののほかに、リジン、アルギニン等のアミノ酸を
生産する変異株も含まれる。
PEPC遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のうちより
健全なPEPC遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura Biochem.Biop
hys.Ac ta72619（1963）の方法が利用できる）、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌で増
殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のPEPC欠損変異株を形質転換
せしめ、PEPC生成活性を保有するにいたった菌株を単離
し、それよりPEPC遺伝子を分離できる。
健全なPEPC遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura Biochem.Biop
hys.Ac ta72619（1963）の方法が利用できる）、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネ型細菌で増
殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のPEPC欠損変異株を形質転換
せしめ、PEPC生成活性を保有するにいたった菌株を単離
し、それよりPEPC遺伝子を分離できる。
PEPC遺伝子の供与菌としては、より望ましくはアスパラ
ギン酸によるフィードバック阻害が弱められている様な
株が良い。このような菌株は、アスパラギン酸拮抗阻害
剤に対する耐性株として得られる。
ギン酸によるフィードバック阻害が弱められている様な
株が良い。このような菌株は、アスパラギン酸拮抗阻害
剤に対する耐性株として得られる。
染色体遺伝子を、切断するには切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば巾広い種類の制限酵素が使
用できる。
て、切断の程度を調節すれば巾広い種類の制限酵素が使
用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。
（１）pAM 330 特開昭58−67699参照 （２）pHM 1519 特開昭58−77895参照 （３）pAJ 655 （ａ）宿主菌：エシェリヒア・コリAJ 11882 （FERM−P6517＝FERM−BP136など） （ｂ）分子量:6.6メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第１図参照 （ｄ）性 質:pAM 330とpBR 325（Gene 4121（1978））
の複合プラスミド。
の複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与る。
（４）pAJ 611 （ａ）宿主菌：エシェリヒア・コリAJ 11884 （FERM−P6519＝FERM−BP138など） （ｂ）分子量:6.6メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第２図参照 （ｄ）性 質:pAM 281とpBR 325の複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与る。
（５）pAJ 440 （ａ）宿主菌：バチルスズブチリスAJ 11901 （FERM−BP140＝ATCC 39139など） （ｂ）分子量:6.0メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第３図参照 （ｄ）性 質:pAM 330とpUB 110（J.Bacteriol.,134 31
8（1978））の複合プラスミド。
8（1978））の複合プラスミド。
カナマイシン耐性に与る。
（６）pAJ 1844 （ａ）宿主菌：エシェリヒア・コリAJ 11883 （FERM−P6518＝FERM−BP 137など） （ｂ）分子量:5.4メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第４図参照 （ｄ）性 質:pHM 1519とpBR 325の複合プラスミド。
クロラムフェニコール耐性に与る。
（７）pAJ 3148 （ａ）宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカムSR 8
203 ATCC 39137など （ｂ）分子量:6.6メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第５図参照 （ｄ）性 質:pHM 1519とpUB 110との複合プラスミド。
203 ATCC 39137など （ｂ）分子量:6.6メガダルトン （ｃ）制限酵素切断地図：第５図参照 （ｄ）性 質:pHM 1519とpUB 110との複合プラスミド。
カナマイシン耐性に与る。
コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドのその他の
例としてはpCG 1（特開昭57−134500）、pCG2（特開昭5
8−35197）、pCG 4,pCG 11（特開昭57−183799）があ
り、これらはいずれも当然使用可能であろう。
例としてはpCG 1（特開昭57−134500）、pCG2（特開昭5
8−35197）、pCG 4,pCG 11（特開昭57−183799）があ
り、これらはいずれも当然使用可能であろう。
ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際に用いられ
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。
このようにして得られた、染色体DNAとベクタープラス
ミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌へ導
入するには、エシェリヒア・コリＫ−12について報告さ
れている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してD
NAの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.a
nd Young,F.E.,Gene,1,153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテントセ
ル）に導入する方法により可能である。あるいは、パチ
ルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られ
ている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.Gene
t.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,
O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hicks,J.B.an
d Fink,G,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929（197
8））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込む
プロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミ
ドをDNA受容菌を導入することも可能である。
ミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌へ導
入するには、エシェリヒア・コリＫ−12について報告さ
れている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してD
NAの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.a
nd Young,F.E.,Gene,1,153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテントセ
ル）に導入する方法により可能である。あるいは、パチ
ルス・ズブチリス、放線菌類および酵母について知られ
ている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen.Gene
t.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,
O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hicks,J.B.an
d Fink,G,R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929（197
8））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込む
プロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミ
ドをDNA受容菌を導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビクバクテリウム属のプロトプラス
トにポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ませる方
法も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチルセル
ロース、デキストラン、フイコール、プルロニックF68
（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込みを促進
させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビクバクテリウム属のプロトプラス
トにポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ませる方
法も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチルセル
ロース、デキストラン、フイコール、プルロニックF68
（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込みを促進
させる方法でも同等の結果が得られる。
PEPC欠損株を得るには、PEPCを経る経路がTCAサイクル
有機酸代謝の主要な経路であるから、グルタミン酸要求
菌を単離すればPEPC欠損株が得られる。より具体的に
は、グルタミン酸要求株の中でビオチン５μg/lを含む
最少培地で生育できず、ビチオン500μg/lを含む培地で
生育し得る株として得られる。
有機酸代謝の主要な経路であるから、グルタミン酸要求
菌を単離すればPEPC欠損株が得られる。より具体的に
は、グルタミン酸要求株の中でビオチン５μg/lを含む
最少培地で生育できず、ビチオン500μg/lを含む培地で
生育し得る株として得られる。
形質転換の後、PEPC生産性を獲得し、または、さらにプ
ラスミドベクターが有しているマーカーとしての性質を
発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。この
ような形質転換株は、PEPC遺伝子が組み込まれている組
換えDNAを有している。組換えDNAを単離する方法は、例
えば菌体をリゾチームSDS処理により溶菌させ、フェノ
ール処理ののち、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱
回収する。
ラスミドベクターが有しているマーカーとしての性質を
発現する菌株を所望の形質転換株として分離する。この
ような形質転換株は、PEPC遺伝子が組み込まれている組
換えDNAを有している。組換えDNAを単離する方法は、例
えば菌体をリゾチームSDS処理により溶菌させ、フェノ
ール処理ののち、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱
回収する。
上記組換えDNAを有するPEPC欠損株それ自体が各種のア
ミノ酸を生産する場合が多いが、より生産性の高いアミ
ノ酸生産菌を得るには、所望のアミノ酸のより生産性の
高い菌株を用いて組換えDNAにより形質転換すれば良
い。組換えDNA受容菌として、例えば、代表的なものを
例示すればリジン生産菌を得たい時にはホモセリン要求
菌、Ｓ−（２−アミノエチール）システイン耐性株等を
用いるアルギニン生産においては２−チアゾールアラニ
ン耐性菌、スレオニン生産においてはαアミノβヒドロ
キシバレリアン酸耐性株イソロイシン生産においてはα
アミノβヒドロキシバレリアン酸耐性株、プロリン生産
においては、２−４デヒドロプロリン耐性株、グルタミ
ン酸生産においては、ケトマロン酸耐性株等が用いられ
る。
ミノ酸を生産する場合が多いが、より生産性の高いアミ
ノ酸生産菌を得るには、所望のアミノ酸のより生産性の
高い菌株を用いて組換えDNAにより形質転換すれば良
い。組換えDNA受容菌として、例えば、代表的なものを
例示すればリジン生産菌を得たい時にはホモセリン要求
菌、Ｓ−（２−アミノエチール）システイン耐性株等を
用いるアルギニン生産においては２−チアゾールアラニ
ン耐性菌、スレオニン生産においてはαアミノβヒドロ
キシバレリアン酸耐性株イソロイシン生産においてはα
アミノβヒドロキシバレリアン酸耐性株、プロリン生産
においては、２−４デヒドロプロリン耐性株、グルタミ
ン酸生産においては、ケトマロン酸耐性株等が用いられ
る。
得られたＬ−アミノ酸生産菌を培養する方法は、従来の
Ｌ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加
水分解液、ホエイ、糖密等が用いられる。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が使用できる。
Ｌ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加
水分解液、ホエイ、糖密等が用いられる。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ−アミノ酸の生産蓄積が停止するまで行
なわれる。
つ、実質的にＬ−アミノ酸の生産蓄積が停止するまで行
なわれる。
かくして培養液中には養量のＬ−アミノ酸が生成蓄積さ
れる。培養液よりＬ−アミノ酸を採取するには、通常の
方法が適用できる。
れる。培養液よりＬ−アミノ酸を採取するには、通常の
方法が適用できる。
実施例 （１）PEPC遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC 13869
を１のCMG培地（ペプトン1g/dl、酵母エキス1g/dl、
グルコース0.5g/dl、及びNaCl 0.5g/dlを含み、pH7.2に
調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行
ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチー
ム・SDSで溶菌させたのち、通常のフェノール処理法に
より、染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。
を１のCMG培地（ペプトン1g/dl、酵母エキス1g/dl、
グルコース0.5g/dl、及びNaCl 0.5g/dlを含み、pH7.2に
調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行
ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチー
ム・SDSで溶菌させたのち、通常のフェノール処理法に
より、染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。
（２）ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ 43（分子量3.5メガダルトン）を用
い、そのDNAをpAJ 655及びpBR 325から次の様にして調
製した。
い、そのDNAをpAJ 655及びpBR 325から次の様にして調
製した。
pAM 330は次のようにして得た。
蒸留水１あたりペプトン10g、粉末酵母エキス10g、塩
化ナトリウム5g、グルコース5gを含むCMG培地（pH7.2）
１中に温度30℃でブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムATCC 13869を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を、リゾチームとSDSにより溶
菌させる簡便法により溶菌せしめた後、30,000×ｇで30
分間遠心分離し64mlの上澄液を得た。上澄液中のプラス
ミドDNAは、上澄液にポリエチレングリコール（最終濃
度10％）を添加し沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に溶
解した。
化ナトリウム5g、グルコース5gを含むCMG培地（pH7.2）
１中に温度30℃でブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムATCC 13869を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を、リゾチームとSDSにより溶
菌させる簡便法により溶菌せしめた後、30,000×ｇで30
分間遠心分離し64mlの上澄液を得た。上澄液中のプラス
ミドDNAは、上澄液にポリエチレングリコール（最終濃
度10％）を添加し沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に溶
解した。
DNAをリボヌクレアーゼで処理した後（リボヌクレアー
ゼ150μg/mlで37℃,30分間反応）、フェノール抽出し、
ついで２倍量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱さ
せ、沈澱を1mlのTEN緩衝液に溶解した。このDNA溶液を
アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルから約74μｇの純
粋なプラスミドDNAを分離した。
ゼ150μg/mlで37℃,30分間反応）、フェノール抽出し、
ついで２倍量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱さ
せ、沈澱を1mlのTEN緩衝液に溶解した。このDNA溶液を
アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルから約74μｇの純
粋なプラスミドDNAを分離した。
pAJ 655を次のように調製した。
プラスミドpBR 325（Boliver,F.Gene,4,121（1978）、
ベセスダリサーチラボラトリーより購入）0.2μｇに１
ユニットの制限酵素BamH I（BRLから購入）を37℃で60
分間反応させ、DNAを充分分解した。
ベセスダリサーチラボラトリーより購入）0.2μｇに１
ユニットの制限酵素BamH I（BRLから購入）を37℃で60
分間反応させ、DNAを充分分解した。
プラスミドpAM 330（1.2μｇ）に0.2ユニットの制限酵
素Mbo Iを37℃で15分間反応させ、DNAを部分分解した。
素Mbo Iを37℃で15分間反応させ、DNAを部分分解した。
得られたDNA断片を混合し制限酵素を不活化するため65
℃で10分間熱処理した後、ATPとジチオスレイトール存
在下22℃で２時間0.01ユニットのT4DNAリガーゼを作用
させた。T4 DNAリガーゼを65℃,10分間の処理で不活化
し、２倍量のエタノールを加えた後、15,000g15分間の
遠心分離によりDNAを回収した。このようにして得た複
合プラスミドをトランスフォーメイションに使用した。
℃で10分間熱処理した後、ATPとジチオスレイトール存
在下22℃で２時間0.01ユニットのT4DNAリガーゼを作用
させた。T4 DNAリガーゼを65℃,10分間の処理で不活化
し、２倍量のエタノールを加えた後、15,000g15分間の
遠心分離によりDNAを回収した。このようにして得た複
合プラスミドをトランスフォーメイションに使用した。
エッシェリヒア・コリＣ−600（thr-，leu-，thiamin
e-，r-，m-）（Meselson,M.and Yuan,R,Nature,217,111
0（1968））を20mlのCMG培地に30℃で対数増殖期中期ま
で培養し、菌体を集めた。Kushner等（“Genetic Engin
eering",p.17（1978）,Elsevier/North Holland Biomed
ical Press）の方法に従って得られたDNAを用いてＣ−6
00を形質転換した。
e-，r-，m-）（Meselson,M.and Yuan,R,Nature,217,111
0（1968））を20mlのCMG培地に30℃で対数増殖期中期ま
で培養し、菌体を集めた。Kushner等（“Genetic Engin
eering",p.17（1978）,Elsevier/North Holland Biomed
ical Press）の方法に従って得られたDNAを用いてＣ−6
00を形質転換した。
形質転換株は20μg/mlのクロラムフェニコールを含むCM
G培地で37℃,24時間培養し選択した。形質転換株の中か
らAJ 11882（FERM−BP136）を選択し、次の実験に用い
た。
G培地で37℃,24時間培養し選択した。形質転換株の中か
らAJ 11882（FERM−BP136）を選択し、次の実験に用い
た。
得られた複合プラスミドpAJ 655は、次のような方法に
よりAJ 11882の溶菌液から分離した。AJ 11882をCMG培
地で培養後、簡便法（Tanaka et al.,J.Bacteriol.,12
1,354（1975））により溶菌せしめ、溶菌液をアガロー
スゲルにかけ、電気泳動にかけた（Sharp et al.,Bioch
emistry 12,3055（1973））。分子量マーカーとの比較
により、プラスミドの分子量は6.6Mdと計算された。プ
ラスミドの制限酵素切断地図を第１図に示した。プラス
ミドはpBR 325とpAM 330のフラグメントから成ること
を、K.J.Dannaの方法（Methods in Enzymology 65,449,
Academic Press（1980））により確認した。
よりAJ 11882の溶菌液から分離した。AJ 11882をCMG培
地で培養後、簡便法（Tanaka et al.,J.Bacteriol.,12
1,354（1975））により溶菌せしめ、溶菌液をアガロー
スゲルにかけ、電気泳動にかけた（Sharp et al.,Bioch
emistry 12,3055（1973））。分子量マーカーとの比較
により、プラスミドの分子量は6.6Mdと計算された。プ
ラスミドの制限酵素切断地図を第１図に示した。プラス
ミドはpBR 325とpAM 330のフラグメントから成ること
を、K.J.Dannaの方法（Methods in Enzymology 65,449,
Academic Press（1980））により確認した。
pAJ 655より次のようにしてpAJ 43を造成した。
pAJ 655を保持するブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムNo.64はクロラムフェニコール100μg/mlを含む
CMG寒天培地（ペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、グル
コース5g/l、NaCl5g/l、寒天20g/lを含みpH7.2に調製し
たもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG培地で培
養し、クロラムフェニコール100μg/mlを含むCMG液体培
地に30℃で一晩培養後、同濃度のクロラムフェニコール
を含むCMG培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養する
ことによりクロラムフェニコール100μg/mlに耐性を示
す株を１株得た。本株のクロラムフェニコール耐性度度
をCMG培地で調べたところ200μg/mlまで耐性を示した。
メンタムNo.64はクロラムフェニコール100μg/mlを含む
CMG寒天培地（ペプトン10g/l、酵母エキス10g/l、グル
コース5g/l、NaCl5g/l、寒天20g/lを含みpH7.2に調製し
たもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG培地で培
養し、クロラムフェニコール100μg/mlを含むCMG液体培
地に30℃で一晩培養後、同濃度のクロラムフェニコール
を含むCMG培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養する
ことによりクロラムフェニコール100μg/mlに耐性を示
す株を１株得た。本株のクロラムフェニコール耐性度度
をCMG培地で調べたところ200μg/mlまで耐性を示した。
上記の結果、得られたクロラムフェニコール高濃度耐性
株からpAJ 43をDNA次のようにして調製した。まず本株
をクロラムフェニコールを10μg/ml含む１のCMG液体
培地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌
した。常法によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた
後、30,000×g,30分の超遠心により上清を得た。これに
ポリエチレングリコール（最終濃度10％）を添加してDN
Aを沈澱せしめ、これを濃度後、沈澱物をトリス・EDTA
・NaClバッファー（pH8.0）10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ150μg/mlで37
℃,30分間反応）後、フェノールを抽出し、ついで２倍
量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物
を1mlのトリス・EDTA・NaClバッファーに溶解した。こ
のDNA溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル1cm当
り5V,15時間）によって最終150μｇの純粋なpAJ43プラ
スミドDNAを分画採取した。
株からpAJ 43をDNA次のようにして調製した。まず本株
をクロラムフェニコールを10μg/ml含む１のCMG液体
培地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌
した。常法によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた
後、30,000×g,30分の超遠心により上清を得た。これに
ポリエチレングリコール（最終濃度10％）を添加してDN
Aを沈澱せしめ、これを濃度後、沈澱物をトリス・EDTA
・NaClバッファー（pH8.0）10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ150μg/mlで37
℃,30分間反応）後、フェノールを抽出し、ついで２倍
量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物
を1mlのトリス・EDTA・NaClバッファーに溶解した。こ
のDNA溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル1cm当
り5V,15時間）によって最終150μｇの純粋なpAJ43プラ
スミドDNAを分画採取した。
pAJ43DNAの性質は次のとおりである。
pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳動によっ
た。
た。
アガロースゲル電気泳動はシャープ（P.A.Sharp）らの
方法（Biochemistry 12,3055（1973））により、0.8％
ゲルを用い、ゲル長さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳
動した。分子量はpAJ 43を１ケ所切断する制限酵素Hind
III 0.5ユニットをpAJ 43,0.5μｇに37℃、１時間反応
させ、切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのHind III フラグメント（BRLから
購入）との移動度の比較によって算出し、3.4Mdと計算
された。pAJ 43DNAの制限酵素切断地図の作成 制限酵素はBRLの市販品を使用し、制限酵素によるpAJ 4
3DNAの切断は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用し
て、各酵素毎に指定された条件で行なった。制限酵素切
断地図作成のためにプラスミドDNAを１種以上の制限酵
素で切断する場合には、第１の制限酵素切断断片を分離
用アガロースゲルよりタナカらの方法（T.Tanaka.,B.We
isblum。J.Bacteriol.,121,354（1975））により単離
後、エタノール沈澱により濃縮し第２の制限酵素で切断
した。切断断片を実施例３の方法によりアガロースゲル
電気泳動にかけ、分子量を算出し、制限酵素切断地図第
６図を作成した。この結果からpAJ 43はpAJ 655からin
vivoでdeletionにより生じたpBR 325のクロラムフェニ
コール耐性遺伝子領域を含む約1MdとPAM330の複製維持
に必須の領域を含む約2.4Mdのフラグメントから成る小
型プラスミドであることが判明した。
方法（Biochemistry 12,3055（1973））により、0.8％
ゲルを用い、ゲル長さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳
動した。分子量はpAJ 43を１ケ所切断する制限酵素Hind
III 0.5ユニットをpAJ 43,0.5μｇに37℃、１時間反応
させ、切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マ
ーカー、λファージのHind III フラグメント（BRLから
購入）との移動度の比較によって算出し、3.4Mdと計算
された。pAJ 43DNAの制限酵素切断地図の作成 制限酵素はBRLの市販品を使用し、制限酵素によるpAJ 4
3DNAの切断は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用し
て、各酵素毎に指定された条件で行なった。制限酵素切
断地図作成のためにプラスミドDNAを１種以上の制限酵
素で切断する場合には、第１の制限酵素切断断片を分離
用アガロースゲルよりタナカらの方法（T.Tanaka.,B.We
isblum。J.Bacteriol.,121,354（1975））により単離
後、エタノール沈澱により濃縮し第２の制限酵素で切断
した。切断断片を実施例３の方法によりアガロースゲル
電気泳動にかけ、分子量を算出し、制限酵素切断地図第
６図を作成した。この結果からpAJ 43はpAJ 655からin
vivoでdeletionにより生じたpBR 325のクロラムフェニ
コール耐性遺伝子領域を含む約1MdとPAM330の複製維持
に必須の領域を含む約2.4Mdのフラグメントから成る小
型プラスミドであることが判明した。
pAJ 43のコピー数の測定 pAJ 43を保持するブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムNo.64（AJ 11997,FERM−P6857,FERM BP−591）を
クロラムフェニコール10μg/mlを含む5mlのCMZG液体培
地に接種し30℃で一晩培養後のその0.1mlをクロラムフ
ェニコール10μg/mlを含む5mlのCMZG液体培地に再度接
種した。30℃で対数増殖期の初期まで培養し1000μg/ml
になるようにアンピシリンを添加後さらに２時間培養
し、遠心分離により菌体を集め10mg/mlのリゾチームを
含むトリス・EDTA.NaClバッファー1.5mlに懸濁し37℃で
２時間インキューベート後、SDS（最終濃度４％）を添
加し65℃,20分間溶菌した。プロトプラストは完全に溶
菌したことを確認した後、フェノール抽出し、ついで２
倍量のエタノールの加え−20℃でDNA沈澱させ、沈澱物
を少量のトリス・EDTA・NaClバッファーに懸濁した。こ
のDNA溶液をリボヌクレアーゼで処理（リポヌクレアー
ゼ150μg/mlで37℃,60分間反応）後、再度フェノールを
抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−20℃でDNA
を沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・EDNA・NaClバッフ
ァーに懸濁後0.8％のアガロースゲル電気泳動にかけ、
泳動ネガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色体DN
AとプラスミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量
を3.0×109ダルトン、pAJ 43を3.4×106ダルトンとして
計算によりコピー数を求めたところ、染色体あたり24コ
ピー存在することが判明した。同様の方法で求めたpAJ
655のコピー数は、11コピーであり、小型化することに
よりコピー数が倍増したことを認めた。
ンタムNo.64（AJ 11997,FERM−P6857,FERM BP−591）を
クロラムフェニコール10μg/mlを含む5mlのCMZG液体培
地に接種し30℃で一晩培養後のその0.1mlをクロラムフ
ェニコール10μg/mlを含む5mlのCMZG液体培地に再度接
種した。30℃で対数増殖期の初期まで培養し1000μg/ml
になるようにアンピシリンを添加後さらに２時間培養
し、遠心分離により菌体を集め10mg/mlのリゾチームを
含むトリス・EDTA.NaClバッファー1.5mlに懸濁し37℃で
２時間インキューベート後、SDS（最終濃度４％）を添
加し65℃,20分間溶菌した。プロトプラストは完全に溶
菌したことを確認した後、フェノール抽出し、ついで２
倍量のエタノールの加え−20℃でDNA沈澱させ、沈澱物
を少量のトリス・EDTA・NaClバッファーに懸濁した。こ
のDNA溶液をリボヌクレアーゼで処理（リポヌクレアー
ゼ150μg/mlで37℃,60分間反応）後、再度フェノールを
抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−20℃でDNA
を沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・EDNA・NaClバッフ
ァーに懸濁後0.8％のアガロースゲル電気泳動にかけ、
泳動ネガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色体DN
AとプラスミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量
を3.0×109ダルトン、pAJ 43を3.4×106ダルトンとして
計算によりコピー数を求めたところ、染色体あたり24コ
ピー存在することが判明した。同様の方法で求めたpAJ
655のコピー数は、11コピーであり、小型化することに
よりコピー数が倍増したことを認めた。
（３）染色体DNA断片のベクターへの挿入 （１）で得た染色体DNA20μｇと（２）で得たプラスミ
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼHind IIIでそ
れぞれを37℃,1時間処理し、完全に切断した。65℃,10
分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレ
イトール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによっ
て10℃,24時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃,5分の熱
処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取した。
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼHind IIIでそ
れぞれを37℃,1時間処理し、完全に切断した。65℃,10
分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレ
イトール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによっ
て10℃,24時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃,5分の熱
処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取した。
（４）PEPC遺伝子のクローニング PEPC活性が50％に減少したブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム（AJ 121061）を受容菌として用いた。
ファーメンタム（AJ 121061）を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、プロトラストトランスフォー
メーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培地
で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユ
ニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシュークロス、20mMマレ
イン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセイブロ
ス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗浄し
た。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸濁
し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000×g,10
分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られたプロトプ
ラストと（３）で調製したDNA10μｇを5mM EDTA存在下
で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30％に
なる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取り込ま
せる為に室温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁し、形質発
現の為、30℃で２時間培養した。この培養液をpH7.0の
プロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト
再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、MgCl2
・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、ペプトン4g、粉末酵母
エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K2HPO40.2g、グ
ルタミン酸10g、ビオチン500μｇ、コハク酸ナトリウム
135g、寒天8g及びクロラムフェニコール３μg/mlを含
む。
メーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培地
で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6ユ
ニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離
により菌体を集め、菌体を0.5Mシュークロス、20mMマレ
イン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセイブロ
ス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗浄し
た。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸濁
し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000×g,10
分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られたプロトプ
ラストと（３）で調製したDNA10μｇを5mM EDTA存在下
で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が30％に
なる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取り込ま
せる為に室温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁し、形質発
現の為、30℃で２時間培養した。この培養液をpH7.0の
プロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト
再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、MgCl2
・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、ペプトン4g、粉末酵母
エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K2HPO40.2g、グ
ルタミン酸10g、ビオチン500μｇ、コハク酸ナトリウム
135g、寒天8g及びクロラムフェニコール３μg/mlを含
む。
30℃で２週間培養後、約500個のクロラムフェニコール
耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン酸を
含まない培地（Glu欠培地:2％グルコース、１％硫酸ア
ンモニウム、0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウ
ム、0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2p
pmマンガンイオン、200μg/lサイアミン塩酸塩、５μg/
lビオチン、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール耐性でかつグルタミン酸要求性の消失し
た１株を得た。この株をAJ 12066（FERM−P 7176,FERM
BP−590）と名付けた。
耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン酸を
含まない培地（Glu欠培地:2％グルコース、１％硫酸ア
ンモニウム、0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウ
ム、0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2p
pmマンガンイオン、200μg/lサイアミン塩酸塩、５μg/
lビオチン、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール耐性でかつグルタミン酸要求性の消失し
た１株を得た。この株をAJ 12066（FERM−P 7176,FERM
BP−590）と名付けた。
（５）形質転換株のプラスミド解析 AJ 12066を（２）で述べた方法により、溶菌液を調製
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDNA
を検出したところ、ベクターのpAJ 43よりも明らかに大
きな分子量10.5メガダルトンのプラスミドが検出され
た。この組換えプラスミドをpAJ 200と名付けた。pAJ 2
00の制限酵素切断地図を第８図に示す。
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDNA
を検出したところ、ベクターのpAJ 43よりも明らかに大
きな分子量10.5メガダルトンのプラスミドが検出され
た。この組換えプラスミドをpAJ 200と名付けた。pAJ 2
00の制限酵素切断地図を第８図に示す。
（６）再トランスホーメーション （５）で検出された7.1メガダルトンのDNA断片を含む組
換えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することを確認す
るためこのプラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムAJ 12061を再度、形質転換した。
換えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することを確認す
るためこのプラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムAJ 12061を再度、形質転換した。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ30個を釣り上げグルタミン酸要求性をしらべると、す
べてのコロニーについて要求性が回復しており、上記の
組換えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
れ30個を釣り上げグルタミン酸要求性をしらべると、す
べてのコロニーについて要求性が回復しており、上記の
組換えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
（７）安定化プラスミド保持株の採取とプラスミド 解析 上記プラスミドは、非常に不安定であったので小型化し
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。
コリネ型細菌のプロトプラスト形式転換では分子量の大
きいプラスミドを菌体内に導入すると、DNA鎖の一部脱
落をおこしプラスミドが小型化することがあり、再形質
転換株100株のプラスミド検索をおこなった。その結
果、８株中に小型化プラスミドが検出された。これら小
型化プラスミドは、菌株に安定に保持された。そのうち
１株よりプラスミドを大量に調製し、pAJ 201と名付け
た。pAJ 201の制限酵素切断地図を第７図に示す。
きいプラスミドを菌体内に導入すると、DNA鎖の一部脱
落をおこしプラスミドが小型化することがあり、再形質
転換株100株のプラスミド検索をおこなった。その結
果、８株中に小型化プラスミドが検出された。これら小
型化プラスミドは、菌株に安定に保持された。そのうち
１株よりプラスミドを大量に調製し、pAJ 201と名付け
た。pAJ 201の制限酵素切断地図を第７図に示す。
（８）形質転換株の酵素活性 形質転換株AJ 12065（FERM−P7175,FERM BP−589）、受
容菌AJ 12061そしてこれらの原株である野生株ATCC 138
69を、グルタミン酸生産培地（グルコース8g/dl,KH2PO4
0.1g/dl,MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・7H2O0.001g/dl,Mn
SO4・4H2O0.001g/dl,尿素0.4g/dl,サイアミン塩酸塩200
μg/l,ビチオン３μg/l,及び大豆蛋白加水分解液36mg/d
l（全窒素として）、を含みpH6.8に調節した培地）で尿
素添加法によりpHを調節しつつ48時間振盪培養した。得
られた菌体を、0.1M硫酸アンモニウムを含くむpH7.5の
トリスバッファーに懸濁し、超音波処理した後32,000×
ｇにて30分間遠心分離して、上清を得た。この上清を硫
安処理し低分子物質を除去し、この上清について100mM
トリス塩酸塩（pH7.5）,2mMホスホエノールピルビン
酸、3.3mM MnSO4,10mM NaHCO3,0.1mMアセチルCoA,0.15m
MNADH,10μｇマレートデヒドロゲネースから成る酵素反
応液を用い、PEPC活性を測定した。反応は比色計セル中
で行ない、オキザロ酢酸の増加を366nmにおける吸光度
を計測してNADHの減少速度を測定することにより定量し
た結果を第１表に示す。
容菌AJ 12061そしてこれらの原株である野生株ATCC 138
69を、グルタミン酸生産培地（グルコース8g/dl,KH2PO4
0.1g/dl,MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・7H2O0.001g/dl,Mn
SO4・4H2O0.001g/dl,尿素0.4g/dl,サイアミン塩酸塩200
μg/l,ビチオン３μg/l,及び大豆蛋白加水分解液36mg/d
l（全窒素として）、を含みpH6.8に調節した培地）で尿
素添加法によりpHを調節しつつ48時間振盪培養した。得
られた菌体を、0.1M硫酸アンモニウムを含くむpH7.5の
トリスバッファーに懸濁し、超音波処理した後32,000×
ｇにて30分間遠心分離して、上清を得た。この上清を硫
安処理し低分子物質を除去し、この上清について100mM
トリス塩酸塩（pH7.5）,2mMホスホエノールピルビン
酸、3.3mM MnSO4,10mM NaHCO3,0.1mMアセチルCoA,0.15m
MNADH,10μｇマレートデヒドロゲネースから成る酵素反
応液を用い、PEPC活性を測定した。反応は比色計セル中
で行ない、オキザロ酢酸の増加を366nmにおける吸光度
を計測してNADHの減少速度を測定することにより定量し
た結果を第１表に示す。
（９）形質転換株のグルタミン酸生産能 pAJ 201を（４）に記載した形質転換法により、ブレビ
バクテリウムラクトファーメンタムATCC 13869とコリネ
バクテリウムグルタミカムATCC 13060に導入し、クロラ
ムフェニコール耐性を指標として形質転換株を選択し
た。このようにして得られたブレビバクテリウムラクト
ファーメンタムATCC 13869由来のAJ 12062（FERM−P717
3,FERM BP−585）とコリネバクテリウムグルタミカムAT
CC 13060由来のAJ 12067（FERM−P7177,FERM BP−588）
を培養し、グルタミン酸生産能をしらべたところ第２表
に示す結果を得た。培養は、グルコース10g/dl,KH2PO
40.1g/dl.MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・4H2O0.001g/dl,M
nSO4・4H2O0.001g/dl,大豆蛋白加水分解液36mg/dl（全
窒素として）、サイアミン塩酸塩200μg/l,ビオチン３
μg/l,(NH4)2SO44.5g/dl（2.5g/dl）、炭酸カルシウム5
g/dl及びクロラムフェニコール10μg/ml（形質転換株の
場合に使用）を含み、pH7.0（KOH）に調節した培地20ml
を肩付フラスコに入れ72時間、31.5℃にて振盪しつつ行
った。培養終了後、培養液中のグルタミン酸をグルタミ
ン酸オートアナライザーで定量した。
バクテリウムラクトファーメンタムATCC 13869とコリネ
バクテリウムグルタミカムATCC 13060に導入し、クロラ
ムフェニコール耐性を指標として形質転換株を選択し
た。このようにして得られたブレビバクテリウムラクト
ファーメンタムATCC 13869由来のAJ 12062（FERM−P717
3,FERM BP−585）とコリネバクテリウムグルタミカムAT
CC 13060由来のAJ 12067（FERM−P7177,FERM BP−588）
を培養し、グルタミン酸生産能をしらべたところ第２表
に示す結果を得た。培養は、グルコース10g/dl,KH2PO
40.1g/dl.MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・4H2O0.001g/dl,M
nSO4・4H2O0.001g/dl,大豆蛋白加水分解液36mg/dl（全
窒素として）、サイアミン塩酸塩200μg/l,ビオチン３
μg/l,(NH4)2SO44.5g/dl（2.5g/dl）、炭酸カルシウム5
g/dl及びクロラムフェニコール10μg/ml（形質転換株の
場合に使用）を含み、pH7.0（KOH）に調節した培地20ml
を肩付フラスコに入れ72時間、31.5℃にて振盪しつつ行
った。培養終了後、培養液中のグルタミン酸をグルタミ
ン酸オートアナライザーで定量した。
（10）形質転換株のリジン生産能 pAJ 201を（４）に記載した形質転換法により、ブレビ
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 12019（NRRLB−1
5346）（ホモセリン要求性）に導入し得られた形質転換
株AJ 12073（FERM−P7205,FERM BP−586）についてリジ
ン生産能をしらべた結果を第３表に示す。培養はグルコ
ース10g/dl,硫安5.5g/dl,KH2PO40.1g/dl,MgSO4・7H2O0.
1g/dl,FeSO4・4H2O0.001g/dl,MnSO4・4H2O0.001g/dl,サ
イアミン塩酸塩200μg/l,ニコチンアミド0.5ml/dl,大豆
蛋白加水分解液105mg/dl（全窒素として）及び、炭酸カ
ルシウム5g/dlを含みpH8.0に調節した培地20mlを肩付フ
ラスコに入れ72時間31.5℃にて振盪しつつ行った。培養
終了後、培養液中のリジンを高速液体クロマトグラフィ
ーで定量した。
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 12019（NRRLB−1
5346）（ホモセリン要求性）に導入し得られた形質転換
株AJ 12073（FERM−P7205,FERM BP−586）についてリジ
ン生産能をしらべた結果を第３表に示す。培養はグルコ
ース10g/dl,硫安5.5g/dl,KH2PO40.1g/dl,MgSO4・7H2O0.
1g/dl,FeSO4・4H2O0.001g/dl,MnSO4・4H2O0.001g/dl,サ
イアミン塩酸塩200μg/l,ニコチンアミド0.5ml/dl,大豆
蛋白加水分解液105mg/dl（全窒素として）及び、炭酸カ
ルシウム5g/dlを含みpH8.0に調節した培地20mlを肩付フ
ラスコに入れ72時間31.5℃にて振盪しつつ行った。培養
終了後、培養液中のリジンを高速液体クロマトグラフィ
ーで定量した。
（11）形質転換株のプロリン生産能 pAJ 201を（４）に記載した形質転換法により、ブレビ
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 11225（FERM−P4
3701,FERM BP−1219）に導入し得られた形質転換株につ
いて（AJ 12063（FERM−P7173,FERM BP−585））プロリ
ン生産能をしらべた。（結果を第４表に示す）培養はグ
ルコース10g/dl,硫酸アンモニウム6g/dl,KH2PO40.1g/d
l,MgSO4・7H2O0.08g/dl,FeSO4・7H2O0.001g/dl,MnSO4・
4H2O0.001g/dl,サイアミン塩酸塩1mg/l,大豆蛋白加水分
解液「味液」0.1％及び炭酸カルシウムを含みpH7.0に調
節した培地20mlを肩付フラスコに入れ31.5℃にて72時間
振盪することにより行った。培養終了後、培養液中のプ
ロリンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 11225（FERM−P4
3701,FERM BP−1219）に導入し得られた形質転換株につ
いて（AJ 12063（FERM−P7173,FERM BP−585））プロリ
ン生産能をしらべた。（結果を第４表に示す）培養はグ
ルコース10g/dl,硫酸アンモニウム6g/dl,KH2PO40.1g/d
l,MgSO4・7H2O0.08g/dl,FeSO4・7H2O0.001g/dl,MnSO4・
4H2O0.001g/dl,サイアミン塩酸塩1mg/l,大豆蛋白加水分
解液「味液」0.1％及び炭酸カルシウムを含みpH7.0に調
節した培地20mlを肩付フラスコに入れ31.5℃にて72時間
振盪することにより行った。培養終了後、培養液中のプ
ロリンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
（12）形質転換株のスレオニン生産能 pAJ 201を（４）に記載した形質転換法により、ブレビ
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 11188（FERM−P4
190）に導入し得られた形質転換株AJ12064（FERM−P717
4,FERM BP−592）のスレオニン生産能をしらべた。（結
果を第５表に示す）培養は、グルコース10g/dl,硫安4.5
g/dl,KH2PO40.1g/dl,MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・4H2O
0.001g/dl,MnSO4・4H2O0.001g/dl,サイアミン塩酸塩300
mg/l,ビオチン100μg/l,大豆蛋白加水分解液「味液」45
mg/dl（全窒素として）イソロイシン25mg/dl,ロイシン3
0mg/dl及び炭酸カルシウム5g/dlを含みpH7.2に調節し
た。培地20mlを肩付フラスコに入れ72時間31.5℃にて振
盪することにより行った。培養終了後、培養液中のスレ
オニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
バクテリウムラクトファーメンタムAJ 11188（FERM−P4
190）に導入し得られた形質転換株AJ12064（FERM−P717
4,FERM BP−592）のスレオニン生産能をしらべた。（結
果を第５表に示す）培養は、グルコース10g/dl,硫安4.5
g/dl,KH2PO40.1g/dl,MgSO4・7H2O0.1g/dl,FeSO4・4H2O
0.001g/dl,MnSO4・4H2O0.001g/dl,サイアミン塩酸塩300
mg/l,ビオチン100μg/l,大豆蛋白加水分解液「味液」45
mg/dl（全窒素として）イソロイシン25mg/dl,ロイシン3
0mg/dl及び炭酸カルシウム5g/dlを含みpH7.2に調節し
た。培地20mlを肩付フラスコに入れ72時間31.5℃にて振
盪することにより行った。培養終了後、培養液中のスレ
オニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12061
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869を2,000μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンに0.℃にて20分間接触せしめて変異処
理し、Glu欠培地で生育しえずGlu欠培地にＬ−グルタミ
ン酸1.0g/dlを加えた培地で生育しうる菌株として分離
したものである。AJ 12061,AJ 11225,AJ 11188及びAJ 1
2019は、それぞれAJ 12066又はAJ 12065,AJ 12063,AJ 1
2064及びAJ 12073より宿主細胞を損うことなく宿主細胞
中の複合プラスミドを除去することにより容易に得られ
る。即ち、プラスミドは宿主より自然に失なわれること
もあるし、「除去」操作によって除くこともできる。
（Bact.Rev.,36,p361−405（1972））。除去操作の一例
は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害する濃
度（２−50μg/ml）のアクリジンオレンジを含む培地
に、1ml当り約104細胞程度になる様に少量の菌株を接種
し宿主菌の生育を不完全に阻害してから27−35℃で一夜
培養する（J.Bacteriol.,88,261（1964））。培養液を
寒天培地に塗布し、27−42℃で一夜培養する。
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869を2,000μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンに0.℃にて20分間接触せしめて変異処
理し、Glu欠培地で生育しえずGlu欠培地にＬ−グルタミ
ン酸1.0g/dlを加えた培地で生育しうる菌株として分離
したものである。AJ 12061,AJ 11225,AJ 11188及びAJ 1
2019は、それぞれAJ 12066又はAJ 12065,AJ 12063,AJ 1
2064及びAJ 12073より宿主細胞を損うことなく宿主細胞
中の複合プラスミドを除去することにより容易に得られ
る。即ち、プラスミドは宿主より自然に失なわれること
もあるし、「除去」操作によって除くこともできる。
（Bact.Rev.,36,p361−405（1972））。除去操作の一例
は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害する濃
度（２−50μg/ml）のアクリジンオレンジを含む培地
に、1ml当り約104細胞程度になる様に少量の菌株を接種
し宿主菌の生育を不完全に阻害してから27−35℃で一夜
培養する（J.Bacteriol.,88,261（1964））。培養液を
寒天培地に塗布し、27−42℃で一夜培養する。
培地上に出現したコロニーの多くは、プラスミドが除去
されている可能性が高い。
されている可能性が高い。
又AJ 11225（2,4−デヒドロプロリン耐性）は特公昭57
−22319に、AJ 11188（α−アミノ−β−ヒドロキシ−
吉草酸及びＳ−メチルシスティンスルホキサイド耐性,L
−イソロイシン及びＬ−ロイシン要求性）は特公昭56−
3038に記載されている。
−22319に、AJ 11188（α−アミノ−β−ヒドロキシ−
吉草酸及びＳ−メチルシスティンスルホキサイド耐性,L
−イソロイシン及びＬ−ロイシン要求性）は特公昭56−
3038に記載されている。
第１図：複合プラスミドpAJ 655の制限酵素切断地図 第２図：複合プラスミドpAJ 611の制限酵素切断地図 第３図：複合プラスミドpAJ 1844の制限酵素切断地図 第４図：複合プラスミドpAJ 440の制限酵素切断地図 第５図：複合プラスミドpAJ 3148の制限酵素切断地図 第６図：複合プラスミドpAJ 43の制限酵素切断地図 第７図:pAJ 201の制限酵素切断地図 第８図:pAJ 200の制限酵素切断地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/14 Ａ 2121−4Ｂ 13/24 Ａ 2121−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） 審査前置に係属中 (56)参考文献 特開 昭56−148296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−160997（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−186496（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−29290（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】リジン、スレオニン、グルタミン酸、及び
プロリンより選ばれるＬ−アミノ酸の製造法であって、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属するDNA供与菌
より得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子をコードするDNA断片がコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラス
ミドに接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生産菌
に属するDNA受容菌に導入されて得られる当該Ｌ−アミ
ノ酸生産能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積さ
れた当該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする当該
Ｌ−アミノ酸の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58157512A JPH0783714B2 (ja) | 1983-08-29 | 1983-08-29 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
| EP84110141A EP0143195B1 (en) | 1983-08-29 | 1984-08-24 | Recombinant dna having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant dna and a process for producing amino acids using said bacteria |
| DE8484110141T DE3485750D1 (de) | 1983-08-29 | 1984-08-24 | Rekombinante dna mit einem darin insertierten phosphoenol-pyruvat-carboxylase-gen, bakterien, die die genannte rekombinante dna enthalten und ein verfahren zur herstellung von aminosaeuren unter verwendung der genannten bakterien. |
| US06/645,107 US4757009A (en) | 1983-08-29 | 1984-08-28 | Recombinant DNA having a phosphoenol pyruvate carboxylase gene inserted therein, bacteria carrying said recombinant DNA and a process for producing amino acids using said bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58157512A JPH0783714B2 (ja) | 1983-08-29 | 1983-08-29 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6087788A JPS6087788A (ja) | 1985-05-17 |
| JPH0783714B2 true JPH0783714B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=15651292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58157512A Expired - Lifetime JPH0783714B2 (ja) | 1983-08-29 | 1983-08-29 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4757009A (ja) |
| EP (1) | EP0143195B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0783714B2 (ja) |
| DE (1) | DE3485750D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030973A1 (ja) | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵液からのコハク酸の精製方法 |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0158940B1 (en) * | 1984-04-04 | 1991-12-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Transducible composite plasmid |
| JPS6178378A (ja) * | 1984-09-27 | 1986-04-21 | Ajinomoto Co Inc | 芳香族アミノ酸生合成遺伝子を含有する組換えｄｎａ及びそれを有するコリネ型細菌 |
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JPS6255089A (ja) * | 1985-05-10 | 1987-03-10 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 |
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| DE3737729A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Degussa | Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen |
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| JP3880636B2 (ja) * | 1994-01-10 | 2007-02-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
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