JP2019035669A - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】対象物を時間的に効率よく観察する。【解決手段】観察装置であって、観察対象を観察して、観察対象の内部における観察領域に関連付けられた情報を取得する第１の観察系と、第１の観察系により取得された情報に基づいて特定された観察領域を観察する第２の観察系とを備える。上記観察装置において、第１の観察系は、第２の観察系よりも、単位時間当たりの観察範囲が広くてもよい。また、上記観察装置において、第１の観察系の観察範囲は、観察対象の表面を含み、情報は、観察対象が存在する空間的な領域を特定する情報を含んでもよい。【選択図】図２

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関する。

生細胞等を損傷することなく観察する方法として、ＣＡＲＳ光（コヒーレントアンチストークスラマン散乱光）を検出する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１ 特開２００５−０６２１５５号公報

走査型の顕微鏡による観察、例えば、非線形光学効果を利用した顕微鏡による観察では、観察画像が得られるまでに時間がかかる。また、非線形光学効果を利用した観察では、観察対象への照射光および観察対象からの射出光の経路に光学部材が挿入されると、検出効率が低下して、観察に一層多くの時間がかかる。

本発明の第１の態様によると、観察対象を観察して、観察対象の内部における観察領域に関連付けられた情報を取得する第１の観察系と、第１の観察系により取得された情報に基づいて特定された観察領域を観察する第２の観察系とを備える観察装置が提供される。

本発明の第２の態様によると、観察対象を観察して、観察対象の内部における観察領域に関連付けられた情報を取得する第１の観察段階と、第１の観察段階において取得された情報に基づいて特定された観察領域を観察する第２の観察段階とを備える観察方法が提供される。

なお、上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これら特徴群のサブコンビネーションもまた発明となり得る。

顕微鏡１００の模式図である。 顕微鏡１００による暗視野観察を説明する模式図である。 顕微鏡１００によるＣＡＲＳ光観察を説明する模式図である。 反射ＣＡＲＳ光による観察で分解可能な空間周波数の領域を示す図である。 透過ＣＡＲＳ光による観察で分解可能な空間周波数の領域を示す図である。 ＣＡＲＳ光の発生原理を説明する模式図である。 顕微鏡１００を用いた観察手順を示す流れ図である。 予備観察領域１１７の分布を示す模式図である。 詳細観察領域１１９の分布を示す模式図である。 予備観察領域１１７の分布を例示する模式図である。 詳細観察領域１１９の分布を例示する模式図である。 顕微鏡１００の模式図である。 顕微鏡１００の模式図である。 顕微鏡１００の模式図である。 顕微鏡１０１の模式図である。 顕微鏡１０２の模式図である。

発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、下記の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。下記の実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

図１は、観察装置の一例である顕微鏡１００の模式図である。顕微鏡１００は、ステージ１１０、制御部１２０、照明部１３０、対物光学系１４０、画像検出部１５０、レーザ装置１６０、励起部１７０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０、および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０を備える。

顕微鏡１００において、照明部１３０は第１の照射部を、レーザ装置１６０は、第２の照射部をそれぞれ形成する。また、画像検出部１５０は第１の検出部を、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０は第２の検出部を、下側ＣＡＲＳ光検出部１９０は第３の検出部をそれぞれ形成する。

ステージ１１０は、顕微鏡１００の観察対象となるサンプル１１２を支持する。これにより、ステージ１１０に置かれたサンプル１１２に対して、照明部１３０からの照明光を図中上方から照射できる。また、ステージ１１０に置かれたサンプル１１２は、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０により図中上側から観察できる。

ステージ１１０は、サンプル１１２の図中下面を露出させる開口を有する。これにより、ステージ１１０に置かれたサンプル１１２に対して、レーザ装置１６０および励起部１７０により図中下側からレーザ光を照射できる。また、ステージ１１０に置かれたサンプル１１２は、画像検出部１５０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０により、図中下側から観察できる。

また、ステージ１１０は、ステージスキャナ１１１に結合される。ステージスキャナ１１１は、図中に矢印ｘ−ｙにより示すように、サンプル１１２が置かれた面と平行にステージ１１０を移動させる。これにより、顕微鏡１００においては、光学系の光軸を固定したまま、サンプル１１２の広い範囲を観察できる。

制御部１２０は、処理装置１２２、キーボード１２４、マウス１２６および表示部１２８を有する。処理装置１２２は、制御手順を実行させるプログラムを汎用パーソナルコンピュータに実装することにより形成できる。

キーボード１２４およびマウス１２６は、処理装置１２２に接続され、処理装置１２２にユーザの指示を入力する場合に操作される。表示部１２８は、キーボード１２４およびマウス１２６によるユーザの操作に対してフィードバックを返すと共に、処理装置１２２が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。

制御部１２０は、画像検出部１５０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０の検出結果に基づいて、表示部１２８に表示する画像を生成する。また、制御部１２０は、ステージスキャナ１１１、照明部１３０、レーザ装置１６０および励起部１７０の各部に結合され、ユーザから受け付けた指示に応じてこれらの動作を制御する。

照明部１３０は、照明光源１３１、コレクタレンズ１３２、リレーレンズ１３３、１３５、１３８、リング絞り１３４および視野絞り１３６を有する。視野絞り１３６は、対物光学系１４０の焦点位置Ｐ_１１に対して共役な位置Ｐ_１２に配される。リング絞り１３４の位置については後述する。照明光源１３１は、例えばハロゲンランプ等により白色のインコヒーレントな照明光を発生する。コレクタレンズ１３２により集められた照明光は、リレーレンズ１３３、１３８、リング絞り１３４、視野絞り１３６を介し、帯域通過フィルタ１３９で可視光帯域の光のみを透過して、サンプル１１２に照射される。

対物光学系１４０は、ステージ１１０に対して互いに反対側に配された上側対物レンズ１４２および下側対物レンズ１４４を有する。図中上側の上側対物レンズ１４２は、照明部１３０から照射された照明光を、ステージ１１０に置かれたサンプル１１２に集光する。そのため上側対物レンズ１４２はコンデンサレンズとも呼ばれる。なお、対物レンズとして使用することを目的とした収差補正がされていない照明用のコンデンサレンズであっても、例えば上側対物レンズ１４２として用いることができる場合もある。また、図中下側の下側対物レンズ１４４は、励起部１７０から照射された励起光を、サンプル１１２の内部で集光させる。

なお、対物光学系１４０において、上側対物レンズ１４２および下側対物レンズ１４４は、互いに略等しい開口数を有することが好ましい。これにより、コヒーレントな照射光をサンプル１１２に照射することで発生するコヒーレントな射出光を観察する場合に、画像あるいはスペクトルにアーチファクトが重畳されて、検出精度が低下することを防ぐことができる。より具体的には、上側対物レンズ１４２の開口数と下側対物レンズ１４４の開口数との比Ｒ_ＮＡは、右式［０．８＜Ｒ_ＮＡ＜１．２］を満たすことが好ましい。

画像検出部１５０は、ダイクロイックミラー１５１、結像レンズ１５２、リレーレンズ１５４、帯域通過フィルタ１５５、開口絞り１５６、リレーレンズ１５７およびＣＣＤカメラ１５８を有する。ダイクロイックミラー１５１は、サンプル１１２から射出された光のうち、可視光帯域の光を反射し、レーザ光源１６１、１６２からサンプル１１２に照射される波長帯域の光を透過させる。これにより、照明部１３０がサンプル１１２に照射した照明光のうち、サンプル１１２において透過または散乱した照明光が、画像検出部１５０に導入される。

帯域通過フィルタ１５５は、照明部１３０がサンプル１１２に照射した照明光の波長帯域の光に限って透過させ、他の波長の光を遮断する。結像レンズ１５２は、サンプル１１２により散乱した照明光による像を一次像面１５３に形成する。更に、リレーレンズ１５４、１５７は、ＣＣＤカメラ１５８の撮像面にその像を再結像する。ＣＣＤカメラ１５８は、照明光の帯域に感度を有するので、再結像された像を、暗視野観察像として撮像する。

レーザ装置１６０は、複数のレーザ光源１６１、１６２と、コンバイナ１６３とを有する。レーザ光源１６１は発光波長λ_Ｓのパルスレーザを、レーザ光源１６２は、発光波長λ_Ｐのパルスレーザを、それぞれ個別に発生する。レーザ光源１６１、１６２の発光波長λ_Ｓ、λ_Ｐは、互いに異なる波長である。また、レーザ光源１６１、１６２の発光波長λ_Ｓ、λ_Ｐは、帯域通過フィルタ１３９が透過する波長帯域とも異なる。

レーザ光源１６１、１６２としては、例えば、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ_４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。なお、レーザ光源１６１、１６２の一方を、レーザ光源１６１、１６２の他方が発生したパルスレーザの波長を変換する光パラメトリック発振器に置き換えてもよい。

レーザ光源１６１、１６２により発生したピコ秒パルスのうち、短い方の波長λ_Ｐを有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるポンプ光として利用される。また、レーザ光源１６１、１６２の発生するピコ秒パルスのうち、長い方の波長λ_Ｓを有するパルスレーザは、ＣＡＲＳ光観察におけるストークス光として利用される。

レーザ光源１６１、１６２から射出されたレーザ光は、コンバイナ１６３に入射されて単一のビームになる。これにより、ポンプ光とストークス光とを併せた励起光をサンプル１１２に照射してＣＡＲＳ光を発生させることができる。

なお、レーザ装置１６０は、レーザ光源１６１、１６２が発生するポンプ光とストークス光とを同期させる目的で遅延光路を備えてもよい。遅延光路は、互いの間隔を変更できる複数の反射鏡により形成できる。また、レーザ装置１６０においては、フォトニック結晶ファイバを用いてストークス光を広帯域化してもよい。

励起部１７０は、ガルバノスキャナ１７１およびスキャンレンズ１７２を有する。ガルバノスキャナ１７１は、互いに向きが異なる２軸の周りを揺動する反射鏡を備え、入射した照射光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。

なお、スキャンレンズ１７２は、ガルバノスキャナ１７１から射出された照射光を、予め定められた一次像面１７３上に合焦させる。これにより、レーザ装置１６０から射出された照射光でサンプル１１２の観察領域を走査させ、予め定められた広さを有する観察領域に照射光を照射できる。

上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０のそれぞれは、ダイクロイックミラー１８１、１９１、リレーレンズ１８２、１９２、１８３、１９３、帯域通過フィルタ１８４、１９４および光電子増倍管１８５、１９５を有する。ダイクロイックミラー１８１、１９１は、照明部１３０が照明光として発生する可視光帯域の光を透過し、励起部１７０からの励起光を透過し、サンプル１１２において発生したＣＡＲＳ光を反射する。これにより、ダイクロイックミラー１８１、１９１は、サンプル１１２において発生したＣＡＲＳ光を、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０または下側ＣＡＲＳ光検出部１９０に導入する。

更に、帯域通過フィルタ１８４、１９４は、ＣＡＲＳ光を透過し、照明部１３０からの照明光および励起部１７０からの励起光を含む、ＣＡＲＳ光以外の波長の光を遮断する。これにより、光電子増倍管１８５、１９５は、ＣＡＲＳ光を選択的に検出できる。よって、顕微鏡１００においては、ＣＡＲＳ光観察と暗視野観察とを同時に実行できる。

なお、照明部１３０において、視野絞り１３６およびリレーレンズ１３８の間には、反射鏡１３７が配される。また、励起部１７０においても、スキャンレンズ１７２および結像レンズ１７５の間に、反射鏡１７４が配される。反射鏡１３７、１７４は、照明光または励起光の光路を折り曲げることにより、顕微鏡１００の構造物が過剰に高くなることを防止する。

上記のような顕微鏡１００は、サンプル１１２に対して、照明部１３０および画像検出部１５０を用いた暗視野観察に使用できる。また、顕微鏡１００は、レーザ装置１６０、励起部１７０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０を用いたＣＡＲＳ光観察にも使用できる。

また、顕微鏡１００においては、照明部１３０および励起部１７０の反射鏡１３７、１７４と、画像検出部１５０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０のダイクロイックミラー１５１、１８１、１９１とは、いずれも対物光学系１４０の光軸Ｑ上に配される。よって、暗視野観察とＣＡＲＳ光観察との両方において対物光学系１４０が共通に使用される。

ここで、顕微鏡１００においては、暗視野観察の照明光を形成するリング絞り１３４を、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０と上側対物レンズ１４２との間ではなく、リレーレンズ１３８、１３５からなるリレー光学系を介することにより照明部１３０に配している。即ち、リング絞り１３４は、上側対物レンズ１４２の射出瞳の位置Ｐ_１と光学的に共役な位置Ｐ_２に配される。

そして、暗視野観察像を形成する開口絞り１５６が、下側対物レンズ１４４と下側ＣＡＲＳ光検出部１９０との間ではなく、結像レンズ１５２とリレーレンズ１５４からなるリレー光学系を介することにより画像検出部１５０に配される。即ち、開口絞り１５６は、下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３と光学的に共役な位置Ｐ_４に配される。

また、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０のダイクロイックミラー１８１は、上側対物レンズ１４２と照明部１３０との間に配され、下側ＣＡＲＳ光検出部１９０のダイクロイックミラー１９１は、下側対物レンズ１４４と画像検出部１５０との間に配される。

図中に矢印Ｍで示すように、リング絞り１３４は、光軸Ｑと平行な方向に移動させることができる。さらに、図中に点線で示す光学部材Ｇ_１を、リング絞り１３４とリレーレンズ１３５との間に挿抜することもできる。光学部材Ｇ_１としては、レンズ、平行平面ガラス等を使用する。これらにより、顕微鏡１００においては、上側対物レンズ１４２とリング絞り１３４との間の光路長を変化させることができる。特に光学部材Ｇ_１の挿抜では、上側対物レンズ１４２とリング絞り１３４との間の光路長を大きく変化させても、ケーラー照明に必要なリング絞り１３４と照明光源１３１の結像関係を保つことができる。

よって、例えば、ピント調節のためなどで上側対物レンズ１４２を上下させてリレーレンズ１３８との間隔を変えた場合に、リング絞り１３４の位置を光軸Ｑと平行な方向に移動させて、上側対物レンズ１４２とリング絞り１３４との間の光路長を調節する。

また、観察倍率等の異なる光学特性が求められる場合や、上側対物レンズ１４２がサンプル１１２等に接触して汚染された場合等で、上側対物レンズ１４２を倍率や開口数の異なる別の対物レンズに交換すると、上側対物レンズ１４２の射出瞳の位置Ｐ_１の位置が大きく変わることもあるし、リング絞り１３４の適切なリングの大きさも変わることがある。その場合には、リング絞り１３４を適切な大きさのものに交換し、光学部材Ｇ_１を追加したり交換したりして、上側対物レンズ１４２とリング絞り１３４との間の光路長をおおよそ合わせ、その後にリング絞り１３４の位置を光軸Ｑと平行な方向に移動させて、上側対物レンズ１４２とリング絞り１３４との間の光路長を微調節する。

このとき、リング絞り１３４と光学部材Ｇ_１が一体となった交換可能なリング絞りブロックとして構成されていてもよい。その場合には、上側対物レンズ１４２の交換と合わせて、適切なリング絞りブロックに一括で交換することができるので、操作を簡単化できるし、さらには上側対物レンズ１４２の交換に連動して自動的に交換される機構にする場合にも交換機構を単純化しやすいので都合が良い。

リング絞り１３４の位置の調節は、ユーザがサンプル１１２を暗視野観察しながら、照明光の直接光が漏れずに観察像が最も鮮明になる位置にリング絞り１３４を移動させてもよい。また、暗視野像のコントラストを評価して、最もコントラストが高くなる位置にリング絞り１３４を移動させる仕組みを設けてもよい。このように、リング絞り１３４の位置を調節可能にすることにより、リング絞り１３４の位置を上側対物レンズ１４２の入射瞳の位置Ｐ_１と光学的に共役な位置Ｐ_２に精度よく合わせて、暗視野顕微鏡としての解像度の低下を防止できる。

また、開口絞り１５６も、光軸Ｑと平行な方向に移動させることができる。さらに、図中に点線で示す光学部材Ｇ_２を、開口絞り１５６とリレーレンズ１５４との間に挿抜することもできる。光学部材Ｇ_２としては、レンズ、平行平面ガラス等を使用する。これらにより、顕微鏡１００においては、下側対物レンズ１４４と開口絞り１５６との間の光路長を変化させることができる。特に光学部材Ｇ_２の挿抜では、下側対物レンズ１４４と開口絞り１５６との間の光路長を大きく変化させても、開口絞り１５６とリレーレンズ１５７の光路長を保つことができるので、ＣＣＤカメラ１５８で適切にサンプル１１２からの射出光を受けることができる。

よって、例えば、ピント調節のためなどで下側対物レンズ１４４を上下させて結像レンズ１５２との間隔を変えた場合に、開口絞り１５６の位置を光軸Ｑと平行な方向に移動させて、下側対物レンズ１４４と開口絞り１５６との間の光路長を調節する。

また、観察倍率等の異なる光学特性が求められる場合や、下側対物レンズ１４４がサンプル１１２等に接触して汚染された場合等で、下側対物レンズ１４４を倍率や開口数の異なる別の対物レンズに交換すると、下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３の位置が大きく変わることもあるし、開口絞り１５６の適切な開口の大きさも変わることがある。その場合には、開口絞り１５６の開口を適切な大きさに変えたり、適当な大きさの開口絞りに交換したり、光学部材Ｇ_２を追加したり交換したりして、下側対物レンズ１４４と開口絞り１５６との間の光路長をおおよそ合わせ、その後に開口絞り１５６の位置を光軸Ｑと平行な方向に移動させて、下側対物レンズ１４４と開口絞り１５６との間の光路長を微調節する。

このとき、開口絞り１５６と光学部材Ｇ_２が一体となった交換可能な開口絞りブロックとして構成されていてもよい。その場合には、下側対物レンズ１４４の交換と合わせて、適切な開口絞りブロックに一括で交換することができるので、操作を簡単化できるし、さらには下側対物レンズ１４４の交換に連動して自動的に交換される機構にする場合にも交換機構を単純化しやすいので都合が良い。

リング絞りブロックと開口絞りブロックの交換は、上側対物レンズ１４２および下側対物レンズ１４４の交換と合わせて、電動機構により自動的に行われることが、顕微鏡１００を操作する操作者の負荷が最も少なくて都合が良い。

このようなリング絞り１３４および開口絞り１５６の配置により、顕微鏡１００においては、図中上側の上側ＣＡＲＳ光検出部１８０から上側対物レンズ１４２までの間の光路上からリング絞り１３４が排除される。また、図中下側の下側ＣＡＲＳ光検出部１９０から下側対物レンズ１４４までの光路上から開口絞り１５６が排除される。

顕微鏡１００においては、例えば、下記の表１に記載する波長特性の組み合わせとした場合に、暗視野観察とＣＡＲＳ光観察とを同時に実行できる。この場合、サンプル１１２から発生するＣＡＲＳ光の波長は、８００〜１０１０［ｎｍ］である。ただし、励起光およびフィルタ類の特性の組み合わせが下記のものに限られないことはもちろんである。また、リング絞り１３４に換えて、中央を遮光した偏った開口を有する偏心絞りを用いても、顕微鏡１００を用いてサンプル１１２を暗視野観察できる。

図２は、上記のように設定された顕微鏡１００による暗視野観察を説明する模式図である。顕微鏡１００における暗視野観察においては、対物光学系１４０および制御部１２０に加えて、照明部１３０および画像検出部１５０を使用する。

図中に点線で示すように、照明部１３０において照明光源１３１が射出した照明光は、それぞれリレーレンズ１３３、１３５、１３８を介して、リング絞り１３４、視野絞り１３６および帯域通過フィルタ１３９を通じて、照明部１３０から射出される。これにより、ステージ１１０上のサンプル１１２に対して、照射角度が上側対物レンズの開口数の周辺部分だけの環状に制限された照明光が、図中上方から照射される。

サンプル１１２に照射された照明光のうち大部分はサンプル１１２を通過するときに直進する。そして下側対物レンズ１４４で取り込まれ、画像検出部１５０のダイクロイックミラー１５１で反射されてＣＣＤカメラ１５８の方向に向かうが、開口絞り１５６で遮光されＣＣＤカメラ１５８までは到達しないので検出されない。しかしながら、照明光の一部は、サンプル１１２を通過するときに散乱されてその進む方向を変えられ、開口絞り１５６を通過し、ＣＣＤカメラ１５８に到達して検出される。よって、サンプル１１２により散乱された照明光により暗視野像が観察できるのである。

画像検出部１５０は、そのような散乱光を検出して、サンプル１１２の形状に応じた明暗像を検出する。このような暗視野観察は、サンプル１１２が透明でコントラストが低い場合であっても、微小構造・微小病原体・微小スクラッチ傷を容易に確認できる。

図３は、顕微鏡１００によるＣＡＲＳ光観察を説明する模式図である。顕微鏡１００におけるＣＡＲＳ光観察においては、対物光学系１４０および制御部１２０に加えて、レーザ装置１６０、励起部１７０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０を使用する。

図中に点線で示すように、励起部１７０から射出された励起光は、ダイクロイックミラー１５１、１９１を透過して、ステージ１１０上のサンプル１１２に図中下方から照射される。下側対物レンズ１４４により励起光をサンプル１１２の内部に集光させることにより、サンプル１１２においては、サンプル１１２に含まれる分子の組成に応じた波長を有するＣＡＲＳ光が発生する。

よって、顕微鏡１００において、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０を用いて、サンプル１１２を観察できる。ここで、顕微鏡１００においては、リング絞り１３４、開口絞り１５６等の光量を減少させる光学素子が、サンプル１１２においてＣＡＲＳ光を発生させる励起光の光路上にも、サンプル１１２で発生したＣＡＲＳ光の光路上にも、配置されていない。よって、励起光の利用効率を向上させることができる。また、発生したＣＡＲＳ光を効率よく検出できるので、観察に要する作業時間も短縮できる。

なお、サンプル１１２に対して励起部１７０と同じ側に配置された下側ＣＡＲＳ光検出部１９０により観察するＣＡＲＳ光は、恰もサンプル１１２により反射された、言わば反射ＣＡＲＳ光である。一方、サンプル１１２に対して励起部１７０と反対側に配置された上側ＣＡＲＳ光検出部１８０により観察するＣＡＲＳ光は、恰もサンプル１１２を透過した、言わば透過ＣＡＲＳ光である。

図４は、反射ＣＡＲＳ光による観察で分解可能な空間周波数の領域を示す図である。図５は、透過ＣＡＲＳ光による観察で分解可能な空間周波数の領域を示す図である。ここで、分解可能な空間周波数の領域とは、観察対象を仮に複数の空間周波数に分解すなわちフーリエ変換した場合に、複数の空間周波数のうち、像の形成に寄与する空間周波数を含む領域である。

なお、図４および図５において、図中右側に示すスケールにおいて、図中上端側は光強度が高いことを示し、図中下端側は光強度が低いことを示す。また、各図の中央付近に表示される観察画像の各々においては、図中で中央側の光強度が高く、外周側の光強度が低いことを示しており、表示画像の濃淡が、それぞれ上記スケールに示された濃淡に対応している。

図４に示すように、反射ＣＡＲＳ光による観察の分解可能な空間周波数の領域と、図５に示す透過ＣＡＲＳ光による観察の分解可能な空間周波数の領域とは、互いに異なり、互いに排他的である。よって、サンプル１１２を観察する目的に応じて、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０と下側ＣＡＲＳ光検出部１９０とを適宜使い分けることが好ましい。また、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０の検出結果と下側ＣＡＲＳ光検出部１９０の検出結果とを組み合わせることにより、より広い周波数領域を観察することができる。

また、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０と下側ＣＡＲＳ光検出部１９０とで、レーザ装置１６０を共通の光源として用いているため、観察対象における同一の位置を同時に検出することができる。これにより、反射ＣＡＲＳ光による画像と透過ＣＡＲＳ光による画像とに位置ずれが生じることなく、別々の装置で用いて行う場合に比べてより正確な画像を取得することができる。

図６はレーザ顕微鏡１００において、観察対象がＣＡＲＳ光を発生するＣＡＲＳ過程を説明する模式図である。ＣＡＲＳ過程は、互いに異なる光周波数ω_１、ω_２を有するポンプ光およびストークス光の二つのレーザ光を含む励起光を被観察物（サンプル１１２）に照射して、ポンプ光の光周波数ω_１とストークス光の光周波数ω_２との差［ω_１−ω_２］が、被観察物に含まれる分子の固有振動の角振動数ω_０と一致した場合に発生する。

ＣＡＲＳ過程により、被観察物に含まれる特定の分子構造の振動モードが励振されると、分子振動が光周波数ω_３を有する第３のレーザ光であるプローブ光と相互作用することにより、三次の非線形分極に由来するＣＡＲＳ光が発生する。

更に、ポンプ光はプローブ光としても利用できるので、［ω_１＝ω_３］という条件の下で、ＣＡＲＳ光が発生する。被観察物において発生するＣＡＲＳ光は、［ω_ＣＡＲＳ＝ω_１−ω_２＋ω_３］を満たす光周波数を有する。

よって、被観察物から射出されたＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物に含まれる特定の分子構造、例えば官能基の存在を検出できる。また、励起光を被観察物に照射する位置を変えながら繰り返しＣＡＲＳ光を検出することにより、被観察物における特定の分子構造の分布を画像化することができる。

ＣＡＲＳ光は自発ラマン散乱光等に比べると光強度が高いので、光電気変換素子を用いた場合に短時間で検出できる。よって、単に、検出に要する時間が短くなるばかりではなく、ビデオレートでの観察もできる。

これにより、特定分子構造の分布だけではなく、分布の変化も検出することができる。また、被観察物に照射する励起光の帯域を、生細胞に与えるダメージが少ない赤外帯域とすることにより、被観察物の生細胞を生かしたまま観察することができる。

更に、非線形光学効果により生じるＣＡＲＳ光は、下側対物レンズ１４４により励起光が絞り込まれた極めて狭い領域において発生する。このため、ＣＡＲＳ光検出の対象となる領域は、照射光の光軸に交差する方向と、光軸と平行な方向の両方に関して狭い領域となる。よって、ＣＡＲＳ光による被観察物の観察は、立体的に高い解像度を有する。

従って、赤外帯域または近赤外帯域の照射光を用いて、観察平面を被観察物の内部に形成してもよい。また、観察平面を、被観察物の深さ方向に順次移動させることにより、特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成できる。

なお、上記のように、コヒーレントな照射光をサンプル１１２に照射した場合に非線形光学効果を生じる現象として、ＣＡＲＳ光の他に誘導ラマン散乱等のラマン散乱光を生じる現象や、多光子励起による蛍光を生じる現象や、第二高調波、第三高調波などの高調波を生じる現象などが知られている。これらの非線形現象により生じた光のうち、例えばラマン散乱光を検出することにより、サンプル１１２における特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成できる。また、ラマン散乱光以外の光でも、サンプル１１２の三次元的な構造を反映した画像を生成することができる。このため、顕微鏡１００において、レーザ装置１６０が射出するレーザ光の波長や各種フィルタの波長特性等を適切に調整することにより、顕微鏡１００を用いて、多光子励起蛍光、第二高調波、第三高調波、誘導ラマン散乱等によるサンプル１１２の観察が実行できる。

図７は、顕微鏡１００を用いたサンプル１１２の観察手順を示す流れ図である。まず、サンプル１１２をステージ１１０に保持させる（ステップＳ１０１）。一旦ステージ１１０に保持させたサンプル１１２は、続いて説明する一連の観察手順が完了するまで移動させない。

次に、サンプル１１２を広域観察する。本実施例では、図２に示したように、照明部１３０を点灯してサンプル１１２を暗視野観察する（ステップＳ１０２）。暗視野観察にかかる時間は短く、ステージスキャナ１１１を駆動してステージ１１０の位置を変えながらサンプル１１２をリアルタイムで観察できるので、サンプル１１２が存在する空間的な領域（対物光学系の焦点に対するサンプル１１２の位置）を素早く把握することができる。

即ち、ＣＡＲＳ光観察等の非線形光学効果を利用した観察方法においては、励起される領域が狭く、焦点深度が浅いので、検出対象となる分子がサンプル１１２に含まれていないためにサンプルからのＣＡＲＳ光が検出できない場合と、励起光の焦点がサンプル１１２からはずれているためにサンプルからのＣＡＲＳ光が検出できない場合とを区別できない。しかしながら、サンプル１１２の表面を含む広い範囲を暗視野観察することにより、サンプル１１２が存在する空間的領域を把握しておけば、サンプル１１２が存在しない領域をＣＡＲＳ光観察するという無効な観察を防止できる。

更に、顕微鏡１００は、暗視野観察等の広域観察とＣＡＲＳ光観察等の非線形光学効果による観察とを同時に実行できるので、広域観察により対物光学系の焦点がサンプル１１２の内部にあることを確認しながら、同時に非線形光学効果による観察をすることができる。そこで、図示の手順においては、観察手法としてＣＡＲＳ光観察を用いて予備ＣＡＲＳ光観察を実行する（ステップＳ１０３）。

ＣＡＲＳ光は、励起光を非常に細く収束させた場合に生じる光線形光学効果により発生するので、観察できる範囲が狭い。そこで、顕微鏡１００においては、ガルバノスキャナ１７１等により励起光を走査させて、走査した領域から検出したＣＡＲＳ光により観察画像を生成する。このように、ＣＡＲＳ光による観察は、走査により観察画像を生成するので、単位面積あたりの観察に要する時間が長い。

そこで、顕微鏡１００を用いた予備ＣＡＲＳ光観察（ステップＳ１０３）においては、間隔をおいて設定した複数の予備観察領域についてＣＡＲＳ光観察することにより、サンプル１１２の全体、または、広い領域を概観する。ここで、個々の予備観察領域１１７は狭いので、予備ＣＡＲＳ光観察に係る時間を短縮できる。また、顕微鏡１００においては、ステージスキャナ１１１を併用することにより、広い間隔で予備観察領域を配置できる。こうして、サンプル１１２全体の状態を、短時間で把握することができる。

図８は、顕微鏡１００によりサンプル１１２を観察する場合の、予備ＣＡＲＳ光観察におけるサンプル１１２内の予備観察領域１１７の分布を例示する模式図である。予備ＣＡＲＳ光観察においては、間隔をおいて設定され、個々の領域は狭い複数の予備観察領域１１７を、サンプル１１２全体にわたって観察する。これにより、予備ＣＡＲＳ光観察においては、短時間でサンプル１１２全体を概観できる。

なお、予備ＣＡＲＳ光観察においては、予備観察領域１１７相互の間隔を広くすることに加えて、個々の予備観察領域１１７内における走査速度を高くしてもよい。更に、個々の予備観察領域１１７は１点の観察点であってもよいし、走査により形成された２次元的な拡がりを有する領域であってもよい。

このように、顕微鏡１００においては、制御部１２０によりステージスキャナ１１１およびガルバノスキャナ１７１を制御することにより、サンプル１１２における観察領域の位置に関連付けられる情報を取得する第１の観察系を形成できる。図１に示した例では、制御部１２０、レーザ装置１６０、励起部１７０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０で第１の観察系を形成できる。

また、顕微鏡１００における予備ＣＡＲＳ光観察では、ＣＡＲＳ光観察と暗視野像観察とを同時に実行できるので、サンプル１１２における励起光の照射位置、特に、励起光がサンプル１１２内に合焦して照射されているか否かを実時間で把握できる。よって予備ＣＡＲＳ光観察において、サンプル１１２における励起光の焦点位置を継続的に監視して、励起光の照射位置がサンプル１１２からはずれることを防止できる。これにより、観察画像の取得に時間を要するＣＡＲＳ過程による観察を効率よく実行できる。

また、例えば、サンプル１１２として、生細胞と死細胞とが混在する細胞シートを観察した場合に、死細胞であることが予備ＣＡＲＳ光観察の段階で歴然としている領域は、後述する特定観察領域１１８の抽出候補から省くことができる。同様に、サンプル１１２において、生細胞であることが予備ＣＡＲＳ光観察の段階で歴然としている領域も、特定観察領域１１８の抽出候補から省くことができる。よって、少ない領域を高精度に観察することにより、サンプル１１２全体を高精度に観察した場合と同様の観察精度が得られ、実効的な観察のスループットを向上させることができる。

再び図７を参照すると、上記のように、暗視野像観察と予備ＣＡＲＳ光観察とを併用することにより、サンプル１１２において予め定められた条件に合致する領域、例えば、サンプル１１２において変色、変形、変質等の変異が認められた、詳細に観察すべき特定観察領域１１８が予備観察領域１１７から抽出されて特定される（ステップＳ１０４）。この場合、検出すべき変異は、暗視野像観察により見いだしたものであっても、ＣＡＲＳ光観察により見いだしたものであってもよい。

また、暗視野像観察および予備ＣＡＲＳ光観察により変異が検出された場合、制御部１２０は、サンプル１１２における当該変異の位置に関連する情報を取得する。なお、ひとつのサンプル１１２に対して複数の特定観察領域１１８が特定された場合は、特定観察領域１１８の数に応じて、例えばその表面を基準として、サンプル１１２において当該領域が存在する深さ方向の位置にひも付けられた位置情報が取得できる。これにより、後述する詳細ＣＡＲＳ光観察において、特定観察領域１１８を確実且つ迅速に観察できる。

図９は、詳細ＣＡＲＳ光観察におけるサンプル１１２内の詳細観察領域１１９の分布を例示する模式図である。サンプル１１２における詳細観察領域１１９の各々は、予備ＣＡＲＳ光観察において位置が特定された特定観察領域１１８を含む。特定観察領域１１８の位置は、例えば、ガルバノスキャナ１７１およびステージスキャナ１１１による走査位置と、予備ＣＡＲＳ光観察により取得された、サンプル１１２の深さにひも付けられたサンプル１１２の深さ方向の位置情報Ｚ_１、Ｚ_２、Ｚ_３に基づいて特定できる。

図示の例において、詳細観察領域１１９の各々は、各々が対応する特定観察領域１１８よりも広い。更に、詳細観察領域１１９におけるＣＡＲＳ光観察においては、ガルバノスキャナ１７１による励起光の走査速度を低くしてもよい。これにより、詳細観察領域１１９においては、ＣＡＲＳ光観察の高い解像度で特定観察領域１１８とその周辺を観察できる。このように、顕微鏡１００においては、制御部１２０によりステージスキャナ１１１およびガルバノスキャナ１７１を制御して、サンプル１１２における観察領域の画像を取得する第２の観察系を形成する。

なお、ＣＡＲＳ光観察は、検出対象となる分子の立体的な分布を反映した画像を形成することもできる。よって、特定観察領域１１８および詳細観察領域１１９の少なくとも一方を立体的な領域として設定してもよい。例えば、予備ＣＡＲＳ光観察におけるサンプル１１２の深さ方向の間隔に応じて、立体的な詳細観察領域１１９の深さ方向の幅（高さ）を決定してもよい。

図１０は、顕微鏡１００により予備ＣＡＲＳ光観察をする場合の、サンプル１１２内における予備観察領域１１７の他の形状を例示する模式図である。図示の予備ＣＡＲＳ光観察においては、サンプル１１２内で間隔をおいて立体的に配された予備観察領域１１７の各々が、サンプル１１２の深さ方向に幅を有する。これにより、予備ＣＡＲＳ光観察において、予備観察領域１１７から抽出して特定された個々の特定観察領域１１８における変異等の空間的な分布の傾向を把握できる。

図１１は、上記のような予備観察領域１１７による予備ＣＡＲＳ光観察により特定した詳細観察領域１１９の形状を例示する模式図である。図示の詳細観察領域１１９のそれぞれは、対応する予備観察領域１１７を内側に含み、予備観察領域１１７よりも立体的に広い範囲に形成される。これにより、変異が生じている予備観察領域１１７の周囲を詳細に観察して、サンプル１１２に生じた変異の画像を迅速且つ確実に取得できる。

なお、図示の詳細観察領域１１９の深さ方向の幅（高さ）は、立体的に配列された予備観察領域１１７の、サンプル１１２の深さ方向の間隔により決定してもよい。図は予備観察領域１１７の深さ方向の間隔の１倍とした場合である。または特定観察領域１１８を中央に配してその幅を間隔の２倍としても良い。これにより、サンプル１１２における詳細観察領域１１９の深さ方向の幅に関しては、取り損ねる可能性のある領域を最小にした十分なものとなる。

図１２は、顕微鏡１００を用いて、サンプル１１２を位相差観察する場合の設定を示す図である。なお、図１２に示す設定は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１００と変わらない。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

暗視野観察とＣＡＲＳ光観察とを併用する場合に使用した顕微鏡１００は、第２の光学部材として画像検出部１５０に組み込んだ開口絞り１５６を取り外し、その代わりに、位相リング１４６を配することにより位相差観察にも使用できる。位相リング１４６は、下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３と光学的に共役であり、射出瞳の実像ができる位置Ｐ_４に組み込まれる。なお、一般的には位相差観察をする場合に用いられるリング絞り１３４の径は、暗視野観察の場合に用いるリング絞り１３４よりも小さい。

上記のように設定することにより、顕微鏡１００を用いて、ステージ１１０に置いたサンプル１１２を位相差観察できる。また、図１に示した設定の場合と同様に、位相差観察の設定を維持したまま、ＣＡＲＳ光観察も同時に実行できる。

なお、下側対物レンズ１４４とダイクロイックミラー１９１との間で、下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３と光学的に共役であり、射出瞳の実像ができる位置に位相リング１４６を配置しても、ＣＡＲＳ光観察を実行することができる。この場合、サンプル１１２に照射される励起光が位相リング１４６を透過することにより減衰するので、サンプル１１２を励起してＣＡＲＳ光を発生させることができるものの、検出されるＣＡＲＳ光の光強度は低下する。

図１３は、顕微鏡１００を用いて、サンプル１１２を微分干渉観察する場合の設定を示す図である。図１３に示す設定は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１００と変わらない。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

図示の顕微鏡１００は、第１の光学部材として、リング絞り１３４に換えて、ポラライザ２３２およびウォラストンプリズム２３４が照明部１３０に組み込まれる。また、この設定の顕微鏡１００では、第２の光学部材として、開口絞り１５６に換えて、ウォラストンプリズム２３６およびアナライザ２３８が画像検出部１５０に組み込まれる。これにより、顕微鏡１００を用いて、サンプル１１２の微分干渉観察ができる状態になる。なお、ウォラストンプリズム２３４、２３６は、ノマルスキー型であってもよい。

ウォラストンプリズム２３４は、これによって分離される常光線と異常光線の交差点が上側対物レンズ１４２の射出瞳の位置Ｐ_１と光学的に共役な位置Ｐ_２になるように決められたＰ_２の近傍の位置に組み込まれ、ポラライザ２３２はそのすぐ隣の照明光源１３１側に配される。ポラライザ２３２は、照明光源１３１が発生した照明光を直線偏光に変換し、ウォラストンプリズム２３４は照明光を振動方向が互いに直交する２つの直線偏光に分離する。

ウォラストンプリズム２３６は、これによって合成される常光線と異常光線の交差点が下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３と光学的に共役な位置Ｐ_４になるように決められたＰ_４の近傍の位置に組み込まれ、アナライザ２３８はそのすぐ隣のＣＣＤカメラ１５８側に配される。ウォラストンプリズム２３６は、分離されていた２つの直線偏光を１つに合成し、アナライザ２３８で特定の方向の偏光成分だけが透過される。

上記のような光学部材を装着することにより、顕微鏡１００の画像検出部１５０においては、照明部１３０側のウォラストンプリズム２３４により分離された２つの直線偏光が、サンプル１１２を透過する際にサンプル１１２の位相分布に応じた位相差を生じ、画像検出部１５０側のウォラストンプリズム２３６とアナライザ２３８を透過する際に干渉を生じる。よって、画像検出部１５０において検出される画像に、サンプル１１２の屈折率分布の微分量に応じたコントラストが生じる。

図１４は、顕微鏡１００を用いて、サンプル１１２を変調コントラスト観察する場合の設定を示す図である。図１４に示す設定は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１００と変わらない。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

図示の顕微鏡１００には、第１の光学部材として、リング絞り１３４に換えて、偏光板２３１およびスリット絞り２３５が照明部１３０に組み込まれる。また、顕微鏡１００は、第２の光学部材として、開口絞り１５６に換えて、モジュレータ２３３が画像検出部１５０に組み込まれる。これにより、顕微鏡１００を用いて、サンプル１１２の変調コントラスト観察ができる状態になる。

スリット絞り２３５は、上側対物レンズ１４２の射出瞳の位置Ｐ_１と光学的に共役な位置Ｐ_２に組み込まれ、光軸からはずれた位置に開口する矩形のスリットを有する。モジュレータ２３３は、下側対物レンズ１４４の射出瞳の位置Ｐ_３と光学的に共役な位置Ｐ_４に組み込まれる。スリット絞り２３５とモジュレータ２３３は光学的に共役な位置に配される。モジュレータ２３３は、透過光に対して透明な透明領域と、透過光を減衰させて透過するグレー領域と、透過光を遮断する暗黒領域とを有する。モジュレータ２３３のグレー領域は、スリット絞り２３５のスリット像が形成される位置に配される。これにより、サンプル１１２の屈折率の勾配に応じて透過光が屈折して偏向し、モジュレータ２３３を透過する透過光の割合が変わるので、画像検出部１５０において検出される検出画像に明暗を生じる。

なお、このほかに、スリット絞り２３５の開口部の一部に偏光板が取り付けられ、そして偏光板２３１がスリット絞り２３５のすぐ隣の照明光源１３１側に配されていてもよい。この場合は、偏光板２３１を回転させることで検出画像のコントラストを調節できる。

図１５は、顕微鏡１０１を用いて、サンプル１１２を暗視野観察する場合の他の設定を示す図である。図１５における設定は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１００と変わらない。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

図示の設定においては、画像検出部１５０が、上側対物レンズ１４２と上側ＣＡＲＳ光検出部１８０との間に配される。この場合、画像検出部１５０の開口絞り１５６は、上側対物レンズ１４２の射出瞳の位置Ｐ_１と光学的に共役な位置Ｐ_５に配される。さらに、顕微鏡１００の画像検出部１５０で用いられていたダイクロイックミラー１５１は、波長特性の異なるダイクロイックミラー１５９に交換される。

ダイクロイックミラー１５９は、サンプル１１２から発生したＣＡＲＳ光を透過し、照明部１３０からの照明光の一部を透過するとともにサンプル１１２から射出された光のうちの可視光帯域の光の一部を反射する。これにより、画像検出部１５０は、サンプル１１２で散乱して再び上側対物レンズ１４２に戻った照明光を検出して暗視野像を生成する。ダイクロイックミラー１５９は、例えば、下記の表２に記載する波長特性を持つ。

なお、上記の例では、画像検出部１５０を、上側対物レンズ１４２と上側ＣＡＲＳ光検出部１８０との間に配置した。しかしながら、画像検出部１５０を、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０および照明部１３０の間に配置しても、同様に、暗視野観察とＣＡＲＳ光観察とを同時に実行できる。

図１６は、他の顕微鏡１０２の構造を示す模式図である。顕微鏡１０２は、次に説明する部分を除いて、顕微鏡１００と同じ構造を有する。よって、共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

顕微鏡１０２は、全体で共通するステージ１１０、制御部１２０、および対物光学系１４０と、照明部１３０および画像検出部１５０を含むひとつの観察系と、レーザ装置１６０、励起部１７０、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０、および下側ＣＡＲＳ光検出部１９０を含む他の観察系とを備える点で、図１等に示した顕微鏡１００と共通する。

顕微鏡１００と比較すると、顕微鏡１０２においては、第１の照射部を形成する照明部１３０が、ステージ１１０に対して、第２の照射部となる励起部１７０と、上側対物レンズ１４２および下側対物レンズ１４４の光軸と平行な方向について同じ側に配される。また、画像検出部１５０は、ステージ１１０に対して照明部１３０と上記方向について反対側において、上側ＣＡＲＳ光検出部１８０に隣接して配される。

このようにレイアウトした顕微鏡１０２は、図１に示した顕微鏡１００と同じ操作により、サンプル１１２を同じように観察できる。更に、それぞれが熱源であると共に消費電力が大きいレーザ装置１６０および照明部１３０をまとめて配置できるので、熱的および電力的な管理が容易になる。

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示している場合、および、前の処理の出力を後の処理において用いる場合を除き、任意の順序で実現し得ることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明した場合も、この順序で実施することが必須であることを意味するものではない。

１００、１０１、１０２ 顕微鏡、１１０ ステージ、１１１ ステージスキャナ、１１２ サンプル、１１７ 予備観察領域、１１８ 特定観察領域、１１９ 詳細観察領域、１２０ 制御部、１２２ 処理装置、１２４ キーボード、１２６ マウス、１２８ 表示部、１３０ 照明部、１３１ 照明光源、１３２ コレクタレンズ、１３３、１３５、１３８、１５４、１５７、１８２、１８３、１９２、１９３ リレーレンズ、１３４ リング絞り、１３６ 視野絞り、１３７、１７４ 反射鏡、１３９、１５５ 帯域通過フィルタ、１４０ 対物光学系、１４２ 上側対物レンズ、１４４ 下側対物レンズ、１４６ 位相リング、１５０ 画像検出部、１５３、１７３ 一次像面、１５２、１７５ 結像レンズ、１５６ 開口絞り、１５８ ＣＣＤカメラ、１５１、１５９、１８１、１９１ ダイクロイックミラー、１６０ レーザ装置、１６１、１６２ レーザ光源、１６３ コンバイナ、１７０ 励起部、１７１ ガルバノスキャナ、１７２ スキャンレンズ、１８０ 上側ＣＡＲＳ光検出部、１８４、１９４ 帯域通過フィルタ、１９０ 下側ＣＡＲＳ光検出部、１８５、１９５ 光電子増倍管、２３１ 偏光板、２３２ ポラライザ、２３３ モジュレータ、２３４、２３６ ウォラストンプリズム、２３５ スリット絞り、２３８ アナライザ

Claims (14)

1. 観察対象を観察して、前記観察対象の内部における観察領域に関連付けられた情報を取得する第１の観察系と、
   前記第１の観察系により取得された前記情報に基づいて特定された観察領域を観察する第２の観察系と
   を備える観察装置。
2. 前記第１の観察系は、前記第２の観察系よりも、単位時間当たりの観察範囲が広い請求項１に記載の観察装置。
3. 前記第１の観察系の観察範囲は、前記観察対象の表面を含み、
   前記情報は、前記観察対象が存在する空間的な領域を特定する情報を含む請求項２に記載の観察装置。
4. 前記第１の観察系は、前記観察対象において間隔をおいて配された複数の予備観察領域を観察し、
   前記第２の観察系は、前記複数の予備観察領域の少なくともひとつを含む本観察領域を観察する請求項２または請求項３に記載の観察装置。
5. 前記複数の予備観察領域は、前記観察対象において３次元的に配される請求項４に記載の観察装置。
6. 前記本観察領域の範囲は、前記情報に基づいて、前記観察対象の内部に制限される請求項４または請求項５に記載の観察装置。
7. 前記本観察領域は、前記複数の予備観察領域の少なくともひとつを含み、前記複数の予備観察領域のひとつよりも広い観察範囲を有する請求項４から請求項６までのいずれか一項に記載の観察装置。
8. 前記第１の観察系は、
   前記観察対象に照射する照射光を発生する第１の照射部と、
   前記照射光を照射された前記観察対象から線形光学現象により射出された射出光を検出する第１の検出部と
   を有する請求項１から請求項７までのいずれか一項に記載の観察装置。
9. 前記第１の観察系は、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察および変調コントラスト観察のいずれかにより前記観察対象を観察する請求項８に記載の観察装置。
10. 前記第２の観察系は、前記第１の観察系よりも高い解像度を有する請求項１から請求項９までのいずれか一項に記載の観察装置。
11. 前記第２の観察系は、
    前記観察対象に照射する照射光を発生する第２の照射部と、
    前記照射光を照射された前記観察対象から非線形光学現象により射出された射出光を検出する第２の検出部と
    を有する請求項１０に記載の観察装置。
12. 前記第２の検出部は、前記観察対象において発生した第３高調波、誘導ラマン散乱光およびＣＡＲＳ光のいずれかを検出する請求項１１に記載の観察装置。
13. 前記観察対象は、複数の細胞を含む細胞シートである請求項１から請求項１２までのいずれか一項に記載の観察装置。
14. 観察対象を観察して、前記観察対象の内部における観察領域に関連付けられた情報を取得する第１の観察段階と、
    前記第１の観察段階において取得された前記情報に基づいて特定された観察領域を観察する第２の観察段階と
    を備える観察方法。