JP5135066B2

JP5135066B2 - 光学顕微鏡、及び観察方法

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Publication number: JP5135066B2
Application number: JP2008145989A
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Inventors: 孝博大出; 小林　　実
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Priority date: 2008-06-03
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2028-06-03
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Description

本発明は、光学顕微鏡、及び観察方法に関し、特に詳しくは光を合成して、試料に照射する光学顕微鏡、及び観察方法に関する。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱を利用したＣＡＲＳ（ＣｏｈｅｒｅｎｔＡｎｔｉ−ＳｔｏｋｅｓＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｔｉｎｇ）顕微鏡が開示されている（特許文献１、非特許文献１）。ＣＡＲＳ（ＣｏｈｅｒｅｎｔＡｎｔｉ−ＳｔｏｋｅｓＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｔｉｎｇ）顕微鏡は、無染色かつ高分解に生体試料を観測することができる顕微鏡として注目されている。

特許文献１や非特許文献１のＣＡＲＳ顕微鏡では、マイクロレンズアレイを用いて、ビームを分割している。例えば、非特許文献１では、数１０〜１００程度のスポットを作り、対物レンズで試料に投影している。マイクロレンズアレイを回転させることで、試料中の各スポットが移動する。これにより、試料のある断面のＣＡＲＳ画像を取得することができる。このように、複数の焦点で同時に試料を励起することで、時間分解能を向上している。

特開２００２−１０７３０１号公報「コヒーレントアンチストークスラマン散乱を用いた顕微鏡」橋本守、荒木勉、河田聡、電子情報通信学会技術研究報告，ｐｐ２５−２８（２００２）

一度に画像が得られる領域の広さは、マイクロレンズアレイに入射するビームの直径によって決まる。入射するビームを拡げると、より広い領域を観察することができる。しかしながら、面積あたりの入射レーザ強度は小さくなるため画像が暗くなる。そこで、試料に合わせて最適な観察範囲を得るためにビーム径が調整される。ビーム径の調整には、ビームエキスパンダなどが用いられる。

例えば、図５に示すように、ビームエキスパンダ５５によってビーム径を拡大している。なお、図５は、従来の光学顕微鏡における構成の一部を示す図である。第１の光源５１からの光ビームは、ミラー５３で反射されてダイクロイックミラー５４に入射する。そして、この光ビームは、ダイクロイックミラーで反射され、第２の光源５２からの光ビームと合成される。そして、合成された光ビームがビームエキスパンダ５５で拡大されて、マイクロレンズアレイ５６に入射する。

このように、ＣＡＲＳ顕微鏡においては、２つの光源からのビームを重ね合わせたのちに、１個のビームエキスパンダによって画像が得られる領域の広さを調整していた。従って、効率よく、ＣＡＲＳ光を発生させることができず、明るい画像を得ることが困難であるという問題点がある。なお、上記の問題は、ＣＡＲＳ顕微鏡に限らず、その他の光学顕微鏡でも生じる。

本発明は、このような事情を背景としてなされたものであって、本発明の目的は、明るい画像を得ることができる光学顕微鏡、及び観察方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様にかかる光学顕微鏡は、第１の光ビームを出射する第１の光源と、第２の光ビームを出射する第２の光源と、前記第１の光ビームのビーム径を変更する第１のビーム径変更手段と、前記第１のビーム径変更手段によってビーム径が変更された第１の光ビームを前記第２の光ビームと合成する光合成手段と、前記光合成手段によって合成された光ビームを複数の光ビームに分割するドットアレイと、前記第２の光源と前記ドットアレイとの間に設けられ、前記第２の光ビームのビーム径を変更する第２のビーム径変更手段と、前記ドットアレイによって分割された複数の光ビームを集光して、試料に照射するレンズと、を備えたものである。これにより、ビーム径を独立して変更することができるため、明るい画像を取得することができる。

本発明の第２の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１及び第２のビーム径変更手段が、前記ドットアレイ上で前記第１の光ビームと前記第２の光ビームのビーム径を一致させるように、ビーム径を変更することを特徴とするものである。これにより、第１の光ビームと第２の光ビームが入射する範囲がほぼ等しくなるため、より明るい画像を取得することができる。

本発明の第３の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第２のビーム径変更手段が、前記光合成手段と前記ドットアレイとの間に配置され、前記第２のビーム径変更手段が前記第２の光ビームのビーム径とともに、前記第１の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とするものである。これにより、所望の観察範囲での観察を容易に行うことができる。

本発明の第４の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第１のビーム径変更手段が、前記光合成手段上で前記第１の光ビームのビーム径が前記第２の光ビームのビーム径と一致するように、前記第１の光ビームのビーム径を変更することを特徴とするものである。これにより、試料上において、第１の光ビームと第２の光ビームが入射する範囲がほぼ等しくなるため、より明るい画像を取得することができる。

本発明の第５の態様にかかる光学顕微鏡は、上記の光学顕微鏡であって、前記第２のビーム径変更手段が、前記第２の光源と前記光合成手段との間に配置されていることを特徴とするものである。これにより、簡便な構成で明るい画像を取得することができる。

本発明の第６の態様にかかる観察方法は、第１の光ビーム及び第２の光ビームが合成された合成ビームを試料に照射して、前記試料を観察する観察方法であって、第１のビーム径変更手段によって第１の光ビームのビーム径を変更するステップと、前記第１のビーム径変更手段によってビーム径が変更された第１の光ビームを第２の光ビームと合成するステップと、前記第１の光ビームと第２の光ビームが合成された合成ビームをドットアレイを通して、複数の光ビームに分割するステップと、前記ドットアレイに入射するまでに、第２のビーム径変更手段によって前記第２の光ビームのビーム径を変更するステップと、前記複数の光ビームを集光して、試料に照射するステップと、を備えるものである。これにより、ビーム径を独立して変更することができるため、明るい画像を取得することができる。

本発明の第７の態様にかかる観察方法は、上記の観察方法であって、前記第１及び第２のビーム径変更手段が、前記ドットアレイ上で前記第１の光ビームのビーム径と前記第２の光ビームのビーム径を一致させるように、ビーム径を変更することを特徴とするものである。これにより、所望の観察範囲での観察を容易に行うことができる。

本発明の第８の態様にかかる観察方法は、上記の観察方法であって、前記第２のビーム径変更手段に、第１の光ビームと第２の光ビームとが合成された合成ビームが入射し、前記第２のビーム径変更手段が前記第２の光ビームのビーム径とともに、前記第１の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とするものである。これにより、所望の観察範囲での観察を容易に行うことができる。

本発明の第９の態様にかかる観察方法は、上記の観察方法であって、前記第１の光ビームと前記第２の光ビームが光合成手段によって合成され、前記第１のビーム径変更手段が、前記光合成手段上において、前記第１の光ビームのビーム径が前記第２の光ビームのビーム径と一致するように、前記第１の光ビームのビーム径を変更することを特徴とするものである。これにより、試料上において、第１の光ビームと第２の光ビームが入射する範囲がほぼ等しくなるため、より明るい画像を取得することができる。

本発明の第１０の態様にかかる観察方法は、上記の観察方法であって、前記第２のビーム径変更手段が、前記第２の光ビームが前記第１の光ビームと合成される前に、前記第２の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とするものである。これにより、簡便な構成で明るい画像を取得することができる。

本発明によれば、明るい画像を得ることができる光学顕微鏡、及び観察方法を提供することができる。

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。

本実施の形態にかかる光学顕微鏡について図１を用いて説明する。図１は、光学顕微鏡１００の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、光学顕微鏡１００には、第１光源１１、第１ビームエキスパンダ１２、ミラー１３、第２光源１４、第２ビームエキスパンダ１５、ダイクロイックミラー１６、ビームスプリッタ１７、コリレータ１８、マイクロレンズアレイ１９、切り替えミラー２０、チューブレンズ２１、第１対物レンズ２４、第２対物レンズ３１、切り替えミラー３２、フィルタ３３、チューブレンズ３４、カメラ３５、照明光源４１、絞り４２、レンズ４３、接眼レンズ４４を有している。ここでは、光学顕微鏡がＣＡＲＳイメージングを行うＣＡＲＳ顕微鏡であるとして説明する。

光学顕微鏡１００は、ＣＡＲＳ光によるＣＡＲＳ画像を撮像するための光学系と、観察者４５が試料２５の透過像を観察するための光学系を有している。これらの光学系は、切り替えミラー２０、及び切り替えミラー３２によって切り替えられる。すなわち、ＣＡＲＳ光により観察を行う場合、切り替えミラー２０を光路中に配置し、切り替えミラー３２を光路中から取り除く。一方、透過光によって観察する場合、切り替えミラー３２を光路中に配置し、切り替えミラー２０を光路中から取り除く。

まず、ＣＡＲＳ画像を撮像するための光学系について説明する。光学顕微鏡１００は、ＣＡＲＳ画像を撮像するために波長の異なる光を試料２５に照射している。従って、第１光源１１と第２光源１４は、異なる波長の光を出射する。例えば、第１光源１１、及び第２光源１４としては、線幅１０ｃｍ^−１以下、パルス幅１〜１００ｐｓｅｃ程度のコヒーレント光を放射する光源を用いることができる。このような光源としては、レーザ光源を用いることができる。

例えば、２台のチタンサファイアレーザ光源を第１光源１１、及び第２光源１４として用いることができる。具体例として、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ製チタンサファイアレーザＴｓｕｎａｍｉ（登録商標）を用いることができる。あるいは、一方の光源を１台のＮｄ：ＶＡＮレーザ光源またはチタンサファイアレーザ光源とし、他方の光源をこのレーザによって励起されるＯＰＯ（光パラメトリック発振）光源とすることもできる。さらには、１台のＮｄ：ＶＡＮレーザ光源またはチタンサファイアレーザによって励起される２台のＯＰＯ光源を第１光源１１、及び第２光源１４として用いてもよい。もちろん、光源の種類については特に限定されるものではない。ここでは、第１光源１１、及び第２光源１４がパルスレーザ光を出射するとして説明を行う。

第１光源１１からは所定のビーム径（スポット径）を有する光ビームが出射する。第１光源１１から出射された光ビームを第１光ビームとする。第１光源１１は第１光ビームとして平行光束を出射する。そして、第１光源１１からの第１光ビームは、第１ビームエキスパンダ１２に入射する。第１ビームエキスパンダ１２は、例えば、１対のレンズから構成され、光ビームを屈折する。第１ビームエキスパンダ１２は、ビーム径を拡大して、出射する。第１ビームエキスパンダ１２は、第１光ビームを一定の倍率の平行光束に広げて出射する。第１ビームエキスパンダ１２は、第１光ビームのビーム径を観察範囲に応じた大きさに変化する第１ビーム径変更手段である。そして、第１ビームエキスパンダ１２からの第１光ビームはミラー１３で反射され、ダイクロイックミラー１６に入射する。

同様に、第２光源１４からは所定のビーム径を有する光ビームが出射する。第２光源１４から出射された光ビームを第２光ビームとする。第２光ビームのビーム径は、第１光ビームのビーム径と異なっていてもよい。第２光源１４は第２光ビームとして平行光束を出射する。そして、第２光源１４からの第２光ビームは、第２ビームエキスパンダ１５に入射する。第２ビームエキスパンダ１５は、ビーム径を拡大して、出射する。第２ビームエキスパンダ１５は、第２光ビームのビーム径を観察範囲に応じた大きさに変更する第２ビーム径変更手段である。第２ビームエキスパンダ１５は、第２光ビームを一定の倍率の平行光束に広げて出射する。そして、第２ビームエキスパンダ１５からの第２光ビームは、ダイクロイックミラー１６に入射する。

ダイクロイックミラー１６は、第１光ビームと第２の光ビームとの光軸の交差位置に配置されている。そして、ダイクロイックミラー１６は、波長に応じて、光を反射又は透過する。ここでは、ダイクロイックミラー１６は、第１光ビームの波長の光をビームスプリッタ１７の方向に反射して、第２光ビームの波長の光をビームスプリッタ１７の方向に透過する。これにより、第１光ビームと第２光ビームが重ね合わされて、合成される。すなわち、ダイクロイックミラー１６は、第１光ビームと第２光ビームを合成する光合成手段である。これにより、ビーム径の等しい２本の光ビームが合成されて、１本の合成ビームが生成される。このとき、第１光ビームと第２光ビームの光軸が一致する。また、ダイクロイックミラー１６を用いることで波長の違いを利用して、合成することができる。よって、異なる波長の第１光ビームと第２光ビームを効率よく合成することができる。もちろん、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）やハーフミラーを光合成手段として用いてもよい。偏光ビームスプリッタは、偏光方向に応じて光を通過、又は合成する。よって、第１光ビームと第２光ビームの偏光方向を直交させれば、同じ波長の光ビームであっても効率よく、合成することができる。

ダイクロイックミラー１６上において、第１光ビームと第２ビームのビーム径は一致している。すなわち、第１ビームエキスパンダ１２、及び第２ビームエキスパンダ１５は、ダイクロイックミラー１６に入射する第１光ビームと第２光ビームのビーム径を等しくしている。従って、ほぼ同じビーム径を有する２本の光ビームが合成される。ダイクロイックミラー１６上において、第１光ビームと第２光ビームのスポット位置が一致する。そして、第１光ビームと第２光ビームが合成ビームとなって、共通の光軸に沿って伝播していく。よって、ＣＡＲＳ光の光量を増加させることができる。なお、この理由については後述する。

合成ビームは、観察範囲に応じたビーム径を有する平行光束になっている。ダイクロイックミラー１６からの合成ビームは、ビームスプリッタ１７に入射する。ビームスプリッタ１７は、合成ビームの一部を取り出す、ビームサンプラーである。すなわち、ビームスプリッタ１７は、合成ビームに含まれている第１光ビームのパルスと第２光ビームのパルスを取り出す。そして、ビームスプリッタ１７によって取り出された一部の合成ビームは、コリレータ１８に入射する。コリレータ１８は、合成ビームに含まれる２つのパルス光のずれを検出し、第１光ビームのパルスと第２光ビームのパルスを同期するために必要な信号を出力する。コリレータ１８は、例えば、第１光源１１や第２光源１４にタイミング調整用の信号を出力する。このようにすることで、ビームスプリッタ１７によって取り出されなかった合成ビームに含まれるパルス光のタイミングを調整することができる。よって、同期した状態の第１光ビームと第２光ビームが試料２５に入射して、ＣＡＲＳ光の光量を増加させることができる。

そして、ビームスプリッタ１７からの合成ビームは、マイクロレンズアレイ１９に入射する。マイクロレンズアレイ１９には、複数のマイクロレンズがアレイ状に形成されている。それぞれのマイクロレンズが、入射した光を屈折されて、複数の焦点を形成する。すなわち、マイクロレンズアレイ１９によって、１本の合成ビームが複数に分割される。よって、複数のサブビームからなるマルチビームが形成される。

マイクロレンズアレイ１９によって形成されたマルチビームは、切り替えミラー２０に入射する。切り替えミラー２０は、光路中に挿脱可能に配置されている。ＣＡＲＳ光による観察を行う場合、切り替えミラー２０は光路中に配置される。また、透過像の観察を行う場合、切り替えミラー２０は光路中から取り除かれる。このように、切り替えミラー２０を移動させることで、透過像観察とＣＡＲＳ光により観察とを切り替えることができる。

切り替えミラー２０は、マルチビームを試料２５の方向に反射する。切り替えミラー２０で反射されたマルチビームは、チューブレンズ２１で屈折され、第１対物レンズ２４に入射する。チューブレンズ２１、及び第１対物レンズ２４は、マルチビームに含まれる各サブビームは試料２５上に結像される。これにより、試料２５からＣＡＲＳ光が発生する。すなわち、各サブビームの焦点位置からは、ＣＡＲＳ光が発生する。複数の焦点で同時に試料を励起することで、時間分解能を向上している。

試料２５で発生したＣＡＲＳ光は、第２対物レンズ３１によって屈折される。そして、第２対物レンズ３１からのＣＡＲＳ光は、フィルタ３３に入射する。なお、第２対物レンズ３１とフィルタ３３の間に図示されている切り替えミラー３２は、光路中に挿脱可能に配置されている。ＣＡＲＳ光による観察を行う場合、切り替えミラー３２は光路上から取り除かれる。また、透過像観察を行う場合、切り替えミラー３２は光路中に配置される。このように、切り替えミラー３２を移動させることで、通常の観察とＣＡＲＳ光により観察とを切り替えることができる。

フィルタ３３は、波長に応じて光を透過又は遮光する。フィルタ３３は、ＣＡＲＳ光を透過して、レーザ光を遮光する。ここでは、レーザ光を十分に遮光するために、複数のフィルタ３３を配置している。そして、ＣＡＲＳ光は、フィルタ３３を通過して、チューブレンズ３４に入射する。チューブレンズ３４は、カメラ３５上にＣＡＲＳ光を結像する。第２対物レンズ３１とチューブレンズ３４によって、ＣＡＲＳ光は、カメラ３５上に画像を形成する。

カメラ３５は、ＣＣＤカメラなどの２次元光検出器であり、アレイ状に画素が配列されている。そして、カメラ３５がＣＡＲＳ画像を取得することができる。カメラ３５としては、高感度カメラを用いることが好ましい。例えば、高感度カメラとしては、冷却ＣＣＤカメラ、ＥＭ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ）−ＣＣＤカメラ、インテンシファイドＣＣＤカメラなどを用いることができる。もちろん、上記のカメラ以外の光検出器を用いてもよい。さらに、一方の光源の波長を走査して、ＣＡＲＳ画像を取得してもよい。これにより、試料２５を構成する分子を同定することができる。

次に、透過像を観察するための光学系について、説明する。透過像用の光学系の一部は、ＣＡＲＳ画像用の光学系と共通していている。すなわち、透過光とＣＡＲＳ光は、共通の光軸に沿って伝搬する。照明光源４１は、例えば、可視光を出射するランプ光源である。照明光源４１から出射した照明光は、絞り４２を通過して、レンズ４３に入射する。レンズ４３で屈折された照明光は、上記のように光路中に配置された切り替えミラー３２に入射する。そして、照明光は、切り替えミラー３２で試料２５の方向に反射される。

切り替えミラー３２で反射された照明光は、第２対物レンズ３１に入射する。第２対物レンズ３１は、照明光を集光して、試料２５上に結像する。そして、試料２５を透過した透過光は、第１対物レンズ２４、及びチューブレンズ２１によって、屈折される。なお、切り替えミラー２０は、上記のように光路上から取り除かれている。そして、チューブレンズ２１からの透過光は、接眼レンズ４４に入射する。接眼レンズ４４で屈折された透過光は、観察者４５の目に入射する。観察者４５が試料２５の透過像を拡大して観察することができる。もちろん、観察者４５が直接観察する構成に限らず、カメラを用いて観察してもよい。

ここで、マイクロレンズアレイ１９による試料２５の走査について、図２を用いて説明する。なお、図２は、マイクロレンズアレイ１９から試料２５までの光学系を簡略化して示す図である。マイクロレンズアレイ１９は、所定の規則に従って配置された複数のマイクロレンズを備えており、試料２５上に複数の焦点を形成することができる。これにより、合成ビームからマルチビームが形成される。なお、マルチビームに含まれるサブビームの数は、合成ビームが入射しているマイクロレンズの数に相当する。そして、それぞれのサブビームが異なる位置に集光される。それぞれのサブビームがチューブレンズ２１、及び第１対物レンズ２４によって、試料２５上に集光される。複数のマルチビームは、試料２５上において、異なる位置に集光される。

このように、ビーム径を拡大された合成ビームは、マイクロレンズアレイ１９に入射する。マイクロレンズアレイ１９は、マイクロレンズが配列された円板状の基板である。円板の中心が光軸とずれて配置されている。そして、その中心に回転モータなどの駆動装置１９ａが取り付けられている。マイクロレンズアレイ１９には、回転軸を除いて、略全体にマイクロレンズが形成されている。従って、マイクロレンズアレイ１９のマイクロレンズが形成された部分に合成ビームが入射する。マイクロレンズアレイ１９は、駆動装置１９ａによって所定の角速度で回転されている。回転数はマイクロレンズアレイ１９の構造、撮像系の条件などによって適宜選択される。さらに、マイクロレンズアレイ１９が回転することによって試料２５上の複数の焦点が移動し、集光された複数のサブビームが試料２５上を同時に走査することができる。すなわち、複数の焦点がモータの回転に応じて回転して、試料２５上において光が入射する位置が変化する。よって、試料２５の観察範囲において、試料２５を励起する励起光の強度分布を平均化することができる。ＣＡＲＳ画像の取得に要する時間を短縮することができる。

なお、合成ビームをマルチビームに変換する構成は、マイクロレンズアレイ１９に限られるものではない。例えば、マイクロレンズアレイ１９の代わりに、複数のピンホールを有するピンホールアレイ基板を用いてもよい。ピンホールアレイ基板を用いた場合、ピンホール通過した光のみ、試料２５に照射され、ピンホールの外側に入射した光は遮光される。従って、ピンホールアレイ基板の像を試料２５上に結像することで、複数の焦点を形成することができる。そして、ピンホールアレイ基板をマイクロレンズアレイ１９と同様に配置して、回転させる。これにより、マルチビームで試料２５を走査することができる。このように、ドットであるマイクロレンズ、又はピンホールがアレイ状に設けられているドットアレイを用いればよい。合成ビームをドットアレイに入射させることで、ドット毎にサブビームが形成される。そして、複数の焦点を形成するドットアレイを回転させることで、複数のサブビームからなるマルチビームが試料２５を走査する。よって、時間分解能を向上することができる。

さらに、本実施の形態では、図３に示すように、第１光ビーム、及び第２光ビームのそれぞれの光路中に、ビームエキスパンダを設けている。第１光ビームのビーム径は、第１ビームエキスパンダ１２によって拡がり、第２光ビームのビーム径は、第２ビームエキスパンダ１５によって拡がっている。そして、マイクロレンズアレイ１９において、第１光ビームと第２光ビームのビーム径を一致させている。このように、マイクロレンズアレイ１９に入射する合成ビームのビーム径は、ＣＡＲＳ光の光量が高くなるように、最適化されている。すなわち、第１光ビーム、及び第２光ビームのビーム径が一致しているため、効率よくＣＡＲＳ光を発生させることができる。これにより、より明るいＣＡＲＳ画像を取得することができる。この理由について以下に説明する。

マイクロレンズアレイ１９に入射する２つの光ビームのビーム径と、試料２５から得られるＣＡＲＳ光の強度について説明する。マイクロレンズアレイ１９に入射する光ビームが強度分布を持つ場合、得られる画像の明るさの分布は入射ビームの強度分布を反映する。レーザビームとしては、光ビームの断面における光強度がガウス関数で表される、ガウシャンビームが用いられる場合が多い。入射レーザビームがガウシャンビームである場合、得られる画像の明るさは、画像の中心が明るく、端が暗い、ガウス関数の分布を持つ。すなわち、光軸上で光強度が最大で、光軸から離れるにしたがって光強度が弱くなる。

ここで、第１光ビームがビーム径ω_１のガウシャンビームであり、第２光ビームがビーム径ω_２のガウシャンビームであるとする。それぞれの光ビームのビーム径ω_１、ω_２のが調整されるとき、断面における第１ビーム、及び第２光ビームの光強度Ｉ_１、Ｉ_２の分布はそれぞれ式１、２で表される。

ここでＡ_１およびＡ_２は定数である。マイクロレンズアレイ１９を回転させることにより光ビームを走査すると、試料２５における各光ビームの平均強度は、式３、４に示されるように、やはりガウス関数で表される。

ここでＭは照明系の倍率である。一様なサンプルを観察した場合、サンプル上で発生するＣＡＲＳ光の平均強度Ｉ_ＣＡＲＳは式５で与えられる。

従って、試料の観察したい領域の大きさがφであるとすると、以下の式６になるように、ビーム径を調整すればよい。

このとき、ＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳは、以下の式７に示すようになる。

式７に示すように、ＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳは式８に比例するため、式９となるように、ビーム径を調整すればよい。

式９からわかるように、２つのビーム径ω_１、ω_２を一致させるように調整することで、ＣＡＲＳ光強度Ｉ_ＣＡＲＳを最大にすることができる。すなわち、より明るいＣＡＲＳ画像を取得することができる。

このように、２つの光ビームのビーム径を一致させてマイクロレンズアレイ１９に入射させる。さらに、マイクロレンズアレイ１９に入射する２つの光ビームを観察範囲に合わせたビーム径とすることで、効率よくＣＡＲＳ光を観察することができる。すなわち、所望の観察範囲から得られるＣＡＲＳ光が最大となり、カメラ３５で明るいＣＡＲＳ画像を得ることができる。明るい画像での観察が可能となる。２つのビームエキスパンダを用いることで、それぞれの光ビームのビーム径を独立して変更することができる。これにより、簡易な構成で、明るい画像を取得することができる。

さらに、ビームエキスパンダを図４に示すような配置とすることも可能である。図４では、第１ビームエキスパンダ１２が第１光ビームの光路中に配置され、第２ビームエキスパンダ１５が合成ビームの光路中に配置されている。すなわち、第１ビームエキスパンダ１２が第１光源１１とダイクロイックミラー１６の間に配置され、第２ビームエキスパンダ１５がダイクロイックミラー１６とマイクロレンズアレイ１９との間に配置されている。

図４に示す配置では、第１光源１１からの第１光ビームが第１ビームエキスパンダ１２で拡大されて、ミラー１３に入射する。ミラー１３はビーム径が拡大された第１光ビームを光合成手段であるダイクロイックミラー１６の方向に反射する。一方、第２光源１４からの第２光ビームはビームエキスパンダで拡大される前に、ダイクロイックミラー１６に入射する。ダイクロイックミラー１６が第１光ビーム及び第２光ビームを合成する。ダイクロイックミラー１６で合成された合成ビームは、第２ビームエキスパンダ１５で拡大されて、マイクロレンズアレイ１９に入射する。すなわち、第２ビームエキスパンダ１５は、合成ビームに含まれる第１光ビーム及び第２光ビームのビーム径を拡大する。第２ビームエキスパンダ１５によって、第２光ビームのビーム径とともに、第１光ビームのビーム径が変化する。

ここで、第１ビームエキスパンダ１２は、ダイクロイックミラー１６上において、第２光ビームのビーム径と一致するように、第１光ビームのビーム径を拡大している。ダイクロイックミラー１６によって合成される前において、第１光ビームと第２光ビームは、ビーム径が等しくなっている。従って、ダイクロイックミラー１６上において、第１光ビームのビーム径は第２光ビームのビーム径と等しくなっている。そして、第２ビームエキスパンダ１５によって、合成ビームに含まれる第１光ビーム及び第２光ビームが同じ倍率だけ拡大される。これにより、第１光ビーム、及び第２光ビームのビーム径が一致した状態で、第１光ビーム、及び第２光ビームを含む合成ビームがマイクロレンズアレイ１９に入射する。従って、試料２５上において、第１光ビームが照射される範囲と第２光ビームが照射される範囲が同じになる。よって、効率よくＣＡＲＳ光を発生させることができ、明るいＣＡＲＳ画像を取得することができる。

図４の構成では、第１ビームエキスパンダ１２は、ビーム径を一致するために利用され、第２ビームエキスパンダ１５は、観察範囲を設定するために利用される。従って、観察範囲の調整を容易に行うことができる。すなわち、観察範囲を変更したい場合、第２ビームエキスパンダ１５を変更、調整すればよい。従って、１つの第１ビームエキスパンダ１２によって、ダイクロイックミラー１６上でのビーム径を一致させておくことで、観察範囲の調整を容易に行うことができる。

なお、上記の説明では、第１ビームエキスパンダ１２、及び第２ビームエキスパンダ１５によって、ビーム径を拡大したが、ビーム径を縮小するビームリデューサー（ビーム縮小器）を用いてもよい。例えば、図４に示す構成において、第１ビームエキスパンダ１２の換わりにビームリデューサーを用いてもよい。すなわち、大きいビーム径を有する方の光ビームの光路中に、ビームリデューサーを配置して、所定の倍率でビーム径を縮小する。そして、ダイクロイックミラー１６に入射する２つの光ビームのビーム径を一致させる。このようにすることで、効率よくＣＡＲＳ光を発生させることができ、明るいＣＡＲＳ画像を取得することができる。すなわち、所定の倍率でビーム径を拡大、又は縮小すればよい。もちろん、第１ビームエキスパンダ１２、及び第２ビームエキスパンダ１５の一方でビーム径を拡大し、他方がビーム径を縮小してもよく、両方でビーム径を縮小してもよい。

なお、上記の説明では、ＣＡＲＳ顕微鏡について説明したが、ＣＡＲＳ顕微鏡以外の光学顕微鏡についても適用することができる。すなわち、本実施形態にかかる光学顕微鏡１００は、合成ビームをマイクロレンズアレイによって走査する光学顕微鏡に適用可能である。これにより、２つの光ビームのビーム径を一致させた状態で試料２５に照射することができる。具体的には、２光子励起レーザ顕微鏡や、ポンププローブ分光顕微鏡などに利用することが可能である。特に、２光子吸収等による非線形光学効果を用いて観察する非線形光学顕微鏡に用いることが好適である。さらには、２光子に限らず、３以上の光子を吸収する多光子吸収に基づいて観察することも可能である。すなわち、３つの光源からの光ビームのそれぞれに対して、ビームエキスパンダを配置して、３つの光ビームのビーム径を一致させてもよい。

本発明にかかる光学顕微鏡の構成を模式的に示す図である。マイクロレンズアレイによる焦点形成を示す図である。本発明にかかる光学顕微鏡において、ビーム径を調整するビームエキスパンダの配置例を示す図である。本発明にかかる光学顕微鏡において、ビーム径を調整するビームエキスパンダの他の配置例を示す図である。従来のＣＡＲＳ顕微鏡におけるビームエキスパンダの配置を示す図である。

符号の説明

１１第１光源
１２第１ビームエキスパンダ
１３ミラー
１４第２光源
１５第２ビームエキスパンダ
１６ダイクロイックミラー
１７ビームスプリッタ
１８コリレータ
１９マイクロレンズアレイ
２０切り替えミラー
２１チューブレンズ
２２
２４第１対物レンズ
２５試料
３１第２対物レンズ
３２切り替えミラー
３３フィルタ
３４チューブレンズ
３５カメラ
４１照明光源
４２絞り
４３レンズ
４５接眼レンズ
４６観察者

Claims

第１の光ビームを出射する第１の光源と、
第２の光ビームを出射する第２の光源と、
前記第１の光ビームのビーム径を変更する第１のビーム径変更手段と、
前記第１のビーム径変更手段によってビーム径が変更された第１の光ビームを前記第２の光ビームと合成する光合成手段と、
前記光合成手段によって合成された光ビームを複数の光ビームに分割するドットアレイと、
前記第２の光源と前記ドットアレイとの間に設けられ、前記第２の光ビームのビーム径を変更する第２のビーム径変更手段と、
前記ドットアレイによって分割された複数の光ビームを集光して、試料に照射するレンズと、を備えた光学顕微鏡。
前記第１及び第２のビーム径変更手段が、前記ドットアレイ上で前記第１の光ビームと前記第２の光ビームのビーム径を一致させるように、ビーム径を変更することを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡。
前記第２のビーム径変更手段が、前記光合成手段と前記ドットアレイとの間に配置され、
前記第２のビーム径変更手段が前記第２の光ビームのビーム径とともに、前記第１の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とする請求項１、又は２に記載の光学顕微鏡。
前記第１のビーム径変更手段が、前記光合成手段上で前記第１の光ビームのビーム径が前記第２の光ビームのビーム径と一致するように、前記第１の光ビームのビーム径を変更することを特徴とする請求項３に記載の光学顕微鏡。
前記第２のビーム径変更手段が、前記第２の光源と前記光合成手段との間に配置されていることを特徴とする請求項１、又は２に記載の光学顕微鏡。
第１の光ビーム及び第２の光ビームが合成された合成ビームを試料に照射して、前記試料を観察する観察方法であって、
第１のビーム径変更手段によって第１の光ビームのビーム径を変更するステップと、
前記第１のビーム径変更手段によってビーム径が変更された第１の光ビームを第２の光ビームと合成するステップと、
前記第１の光ビームと第２の光ビームが合成された合成ビームをドットアレイを通して、複数の光ビームに分割するステップと、
前記ドットアレイに入射するまでに、第２のビーム径変更手段によって前記第２の光ビームのビーム径を変更するステップと
前記複数の光ビームを集光して、試料に照射するステップと、を備える観察方法。
前記第１及び第２のビーム径変更手段が、前記ドットアレイ上で前記第１の光ビームのビーム径と前記第２の光ビームのビーム径を一致させるように、ビーム径を変更することを特徴とする請求項６に記載の観察方法。
前記第２のビーム径変更手段に、第１の光ビームと第２の光ビームとが合成された合成ビームが入射し、
前記第２のビーム径変更手段が、前記第２の光ビームのビーム径とともに、前記第１の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とする請求項６、又は７に記載の観察方法。
前記第１の光ビームと前記第２の光ビームが光合成手段によって合成され、
前記第１のビーム径変更手段が、前記光合成手段上において、前記第１の光ビームのビーム径が前記第２の光ビームのビーム径と一致するように、前記第１の光ビームのビーム径を変更することを特徴とする請求項８に記載の観察方法。
前記第２のビーム径変更手段が、前記第２の光ビームが前記第１の光ビームと合成される前に、前記第２の光ビームのビーム径を変化させることを特徴とする請求項６、又は７に記載の観察方法。