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WO2015181872A1 - 光学分析装置 - Google Patents

光学分析装置 Download PDF

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Publication number
WO2015181872A1
WO2015181872A1 PCT/JP2014/063852 JP2014063852W WO2015181872A1 WO 2015181872 A1 WO2015181872 A1 WO 2015181872A1 JP 2014063852 W JP2014063852 W JP 2014063852W WO 2015181872 A1 WO2015181872 A1 WO 2015181872A1
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WO
WIPO (PCT)
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sample
light
irradiation
unit
spectrum
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/063852
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
秀治 三上
白井　正敬
Original Assignee
株式会社日立製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立製作所 filed Critical 株式会社日立製作所
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Priority to CN201480079184.3A priority patent/CN106461558B/zh
Priority to US15/308,656 priority patent/US20170160200A1/en
Priority to PCT/JP2014/063852 priority patent/WO2015181872A1/ja
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    • G01N2201/1053—System of scan mirrors for composite motion of beam

Definitions

  • the present invention relates to high performance optical analyzers.
  • the optical microscope is an indispensable observation tool in the natural science, engineering, and industrial fields.
  • more advanced microscopes using a laser as an illumination light source have become essential in advanced technology development.
  • a typical example is a fluorescent confocal microscope, which is widely used in the fields of medicine and biology as a means for observing the distribution of a specific substance in a biological sample in combination with a fluorescent reagent.
  • the technological development of nonlinear optical microscopes using nonlinear optical effects and the increasing needs in the fields of medicine and biology are remarkable.
  • nonlinear optical microscopes examples include two-photon fluorescence microscope (Non-Patent Document 1), SHG microscope (Non-Patent Document 2), coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope (Non-Patent Document 3), and stimulated Raman.
  • a scattering (SRS) microscope (Non-Patent Document 4) is known.
  • a two-photon fluorescence microscope can select a wavelength region in which the absorption of the sample is small as a laser beam applied to the sample, and can image deeper than a conventional fluorescence confocal microscope.
  • the SHG microscope is a microscope for observing the second harmonic from a sample, and can selectively detect a specific structure such as a fiber structure such as collagen or a cell membrane.
  • the CARS microscope is a microscope that irradiates a sample with two types of laser light, excitation light and Stokes light, and observes anti-Stokes light generated as a result of the difference frequency between these lights resonating with the natural vibration of the sample molecule.
  • the distribution of a specific substance in a sample can be observed based on the wavelength and intensity distribution of anti-Stokes light, and is attracting attention as a label-free, non-invasive microscope that replaces a fluorescence microscope.
  • the SRS microscope is a microscope that irradiates the sample with excitation light and Stokes light, and observes the natural vibration of the substance as a change in the intensity of the two types of light, and is a non-invasive microscope similar to the CARS microscope. .
  • the nonlinear optical microscope provides various high-performance observation means that could not be realized with a conventional microscope.
  • CARS is light emission by third-order polarization, and excitation light, Stokes light, and probe light are required to generate CARS.
  • the probe light is substituted with excitation light.
  • ⁇ r (3) ( ⁇ AS ) is a resonance term of molecular vibration of third-order electrical susceptibility
  • ⁇ nr (3) is a non-resonance term.
  • E P the electric field of excitation light and probe light
  • E S the electric field of Stokes light
  • the non-resonant term has no frequency dependence.
  • An asterisk attached to the shoulder of the E S of the formula (1) denotes a complex conjugate.
  • the intensity of CARS light is expressed as follows.
  • FIG. 13 shows the resonance term process.
  • 1401 represents the vibrational ground state of the molecule
  • 1402 represents the vibrational excited state.
  • the molecule is excited to a vibration excitation level having 1402 through the virtual level 1403.
  • this excited molecule is irradiated with probe light having the frequency ⁇ P
  • the molecule returns to the vibrational ground state while generating CARS light having the frequency ⁇ AS via the virtual level 1404.
  • this resonance CARS light is generated only when the difference in frequency ⁇ P ⁇ S between the excitation light and the Stokes light coincides with a certain vibration excitation state of the observation sample.
  • the Planck unit system is adopted here, and the Planck constant is 1. Therefore, when a broadband light source is used as Stokes light, the generated CARS light is also broadband light, but has a spectrum having a sharp peak at a wavelength corresponding to the vibrationally excited state. This spectrum is called a Raman spectrum and reflects the distribution of vibrationally excited states of molecules in the sample and can be used for identification of molecular species.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating one process related to the non-resonant term of Equation (1).
  • the frequency of the Stokes light is not a vibrationally excited state, but a process through the virtual level 1405. 'Participating virtual level 1405 such as electrons are excited by the simultaneous irradiation of the P of the probe light, yet the frequency omega' exciting light frequency omega P and the frequency omega by Stokes light of S, the frequency omega via a virtual level 1406 AS non-resonant CARS light is generated. Since this non-resonant CARS light is generated regardless of the vibration excitation state, when a wide-band Stokes light is used, a wide-band non-resonant CARS light having no wavelength dependency of intensity is generated.
  • Non-Patent Document 5 For example, in the maximum entropy method, which is a method for recovering a phase spectrum from an intensity spectrum, a mathematical calculation is performed, and a complex of resonance terms is calculated. Find the part.
  • Excitation light having a predetermined frequency and Stokes light in a lower frequency region are incident on the sample, and CARS light is generated in a frequency region larger than the excitation light.
  • the CARS microscope performs a plurality of measurements on the Raman spectrum obtained as described above by changing the position where the excitation light and the Stokes light are collected, and as a result, acquires an image of the spatial distribution for each molecular species.
  • each point in the sample is irradiated with a laser beam, and the spectrum of the CARS light is measured with a spectroscope, and different positions over a two-dimensional or three-dimensional region are measured.
  • a spectroscope When analyzing a sample such as a cell in the above-described CARS microscope, each point in the sample is irradiated with a laser beam, and the spectrum of the CARS light is measured with a spectroscope, and different positions over a two-dimensional or three-dimensional region are measured.
  • Each obtains spectral data of CARS light, and as a result, spectral information and spatial information (image information) of the sample are obtained from these data.
  • it takes a long time to acquire data due to restrictions on the data transfer rate of the detection unit of the spectroscope, it is sometimes difficult to measure the sample within a realistic time.
  • the conventional method for acquiring spectral information and spatial information has problems such as a huge amount of data itself, difficulty in storing data after measurement, and long data analysis.
  • the long analysis time of data performed using the above-mentioned maximum entropy method or the like reduces the substantial slew rate of sample analysis, which is significant when a CARS microscope is applied as an analysis method. It becomes a problem.
  • the problems described so far are common to measurement methods (hyperspectral imaging) that acquire spectra at each point of the sample.
  • fluorescence spectra are acquired using a Raman microscope or a fluorescence confocal microscope. The same applies to the case.
  • an object of the present invention is to provide an optical analyzer capable of analyzing a sample at high speed.
  • Hyperspectral imaging such as conventional CARS microscopes is based on the idea of obtaining as much information (spectrum information and spatial information) as possible from a sample to facilitate analysis.
  • information such as CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD34, CD
  • a light source such as a short pulse laser, a sample holding unit for holding the sample, an irradiation optical system for condensing and irradiating a light beam from the light source onto the sample held by the sample holding unit, and light irradiation from the sample
  • a spectroscopic unit that splits the generated light, a detection unit that includes a detector array such as a line sensor or an area sensor that detects the light split by the spectroscopic unit, and a light irradiation position on the sample by the irradiation optical system are controlled.
  • An irradiation control unit, and the detection unit continues the exposure state over a plurality of light irradiation positions on the sample by the irradiation control unit, and outputs a spectrum obtained by integrating the spectrum generated from each light irradiation position. .
  • the detection unit outputs a plurality of integrated spectra and averages the plurality of output spectra.
  • an image data acquisition unit that acquires image data of the sample held in the sample holding unit, and a shape recognition unit that recognizes the shape of the sample based on the acquired image data, and irradiation Based on the shape of the sample recognized by the shape recognition unit, the control unit condenses and irradiates the light beam from the light source onto a specific region of the sample.
  • the irradiation control unit includes a scan mirror, and the control direction of the scan mirror is a direction perpendicular to the spectral direction of the detection unit.
  • the irradiation control unit scans the sample two-dimensionally.
  • the irradiation control unit scans the sample three-dimensionally.
  • a light source, a sample holding unit that holds a plurality of cells as a sample, an observation unit that observes the cells held in the sample holding unit, and a light beam from the light source is condensed on the cells held in the sample holding unit
  • An irradiation control unit for controlling, a cell destruction means for destroying cells held in the sample holding unit, and a biomolecule capture device for capturing biomolecules in the cells released from the cells by the destruction, the detection unit Then, the exposure state is continued over a plurality of light irradiation positions on the cell by the irradiation control unit, and a spectrum obtained by integrating the spectrum generated from each light irradiation position is output
  • the schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer The schematic diagram of the light-receiving part of a CCD camera. The sequence diagram of data acquisition operation. The block diagram in the case of using a scan mirror. The block diagram of the optical analyzer which detects the backscattering of CARS light.
  • the schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer The schematic diagram which shows the structural example of an optical analyzer.
  • the schematic diagram which shows the structural example of a biomolecule analyzer. The detailed drawing of the periphery of the sample which shows the structural example of a biomolecule collection system. The top view of a pore array sheet. The flowchart explaining operation
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a basic configuration example of the optical analyzer of the present invention. The operation of this embodiment will be described below with reference to FIG.
  • the light is divided into two, that is, transmitted light and reflected light.
  • the reflected light is coupled to the photonic crystal fiber 104 by the condensing lens 103, and broadband supercontinuum light is generated inside the fiber.
  • the generated supercontinuum light is collimated by the collimating lens 105 and then enters the long pass filter 106 to block the wavelength of the short pulse laser light source and the shorter wavelength component.
  • the dichroic mirror 108 has a property of reflecting light having a wavelength of excitation light and a shorter wavelength region and transmitting light having a wavelength region longer than the excitation light. Therefore, the excitation light is reflected, and the Stokes light is transmitted and combined as a result.
  • This combined light beam is condensed at one point of the sample 110 by an objective lens 109 (NA 0.9, magnification 40 times) that constitutes an irradiation optical system that collects and irradiates the light beam from the light source onto the sample.
  • CARS light reflecting the resonance vibration of molecules present at the location is generated.
  • the CARS light is converted into parallel light by the condenser lens 111 (NA 0.65), passes through the short-pass filter 112, and the excitation light and the Stokes light, which are coaxial components, are blocked. And is detected separately for each wavelength by the detection unit 115, and the spectrum is output as a detection signal.
  • the spectroscope 113 includes a spectroscopic unit 114 that diffracts incident light in a different direction for each wavelength by a diffraction grating, and a one-dimensional or two-dimensional detector array (CCD camera, CMOS camera, etc.) of the light diffracted by the spectroscopic unit 114. It consists of the detection part 115 detected by.
  • a CCD camera is used as the detection unit 115, and the light receiving unit 201 has two-dimensionally arranged pixels 202 as shown in FIG.
  • the light split by the spectroscopic unit 114 enters the light receiving unit as a horizontally long beam 203, and the wavelength varies depending on the position in the horizontal direction.
  • the CCD camera of the detection unit 115 is in an exposure state for a predetermined time by external control, that is, in a state in which each pixel is exposed to incident light and converts incident light into electric charge to accumulate electric charge.
  • the total charge accumulated in the vertically aligned pixel columns is transferred to the buffer 204 (full vertical binning), and the charge in the buffer 204 is output to the outside as a serial signal. Therefore, the output signal is a signal proportional to the intensity of each wavelength of incident light, that is, a spectrum signal of incident light.
  • the detection unit 115 drives the XYZ stage 12 holding the sample 110 during the exposure state, and the focusing position of the excitation light and the Stokes light on the sample is three-dimensionally or Scan two-dimensionally. More specifically, for example, a rectangular parallelepiped region or a rectangular region designated in advance is scanned at a constant speed. Therefore, one type of spectrum signal can be obtained in one sample measurement.
  • This one type of spectrum corresponds to a spectrum obtained by integrating the spectra generated from the respective positions of the sample on the scanning line.
  • the number of data is the number of pixels in the horizontal direction of the CCD camera.
  • this acquired signal is referred to as a CARS spectrum.
  • the CARS spectrum is acquired every time the condensing positions of the excitation light and the Stokes light are changed, a large number of CARS spectra are acquired as data.
  • the CARS spectrum obtained in the present embodiment is subjected to signal processing such as a maximum entropy method and converted to a Raman spectrum.
  • the Raman spectrum obtained here represents the content of various chemical species in the sample. Since the CARS spectrum obtained in this example is a signal obtained by scanning the position of the excitation light / Stokes light, the total content of each chemical species (within the scanning region) of the entire sample is determined from this signal. I can know.
  • FIG. 3A shows a conventional sequence, in which exposure, data transfer, and position movement operations are repeated by the number of data points. Note that the order of data transfer and position movement may be reversed or may be performed simultaneously.
  • the sequence of the present embodiment is as shown in FIG. 3B. Exposure and position movement are repeated until the scanning of the sample is completed, and data transfer is finally performed. In FIG. 3B, exposure, position movement, and data transfer are performed serially. However, the previous exposure operation may be continued during the position movement, or data transfer is performed simultaneously with the previous position movement. It may be broken.
  • the data acquisition time of the conventional method is obtained by multiplying the sum of the exposure time, movement time, and spectral data transfer time of one spectrum measurement by the number of measurement points (the number of positions where measurement is performed in the sample space).
  • the data acquisition time of this embodiment is the data acquisition time of the conventional method when the data transfer time is regarded as zero. Therefore, when the exposure time is equal to or shorter than the data transfer time, the data acquisition time can be shortened.
  • the data amount of the conventional method is obtained by multiplying the data amount of this embodiment by the number of measurement points. Usually, since the number of measurement points is tens of thousands to millions in order to acquire an image, the data amount is reduced to about 1 / hundredths of a million by this embodiment.
  • the sample position is scanned discretely, that is, the position during exposure is fixed for each measurement point and moved to another position after the exposure is completed, and the sample position is continuously changed at a predetermined speed. Any of them may be used.
  • the light spot in the sample is continuously scanned during the exposure time of the detection unit, and when the scanning is completed, the exposure of the detection unit is terminated and data transfer is performed.
  • one measurement point in the conventional method can be handled in the same way as in the discrete case, assuming that it corresponds to a spatial region of the condensed spot size in the sample of excitation light and Stokes light. .
  • continuous scanning is almost equivalent to discrete scanning where the amount of position movement is the focused spot size and the exposure time per measurement point is the pixel residence time (pixel dwell time).
  • the pixel residence time is defined as (condensed spot size) / (sample scanning speed).
  • the XYZ stage 12 is used as an irradiation control unit for controlling the light irradiation position on the sample by the irradiation optical system, and the sample position is scanned for scanning the measurement point.
  • the light irradiation position is controlled by the irradiation control unit.
  • the method is not limited to this.
  • a scanning mirror such as a galvano mirror or a MEMS mirror that scans the incident angle of the excitation light / Stokes light to the sample by external control may be used as the irradiation control unit, or the position of the objective lens 109 may be scanned. Absent.
  • a combination of the methods described above may be used.
  • a galvanometer mirror 1601 is inserted between the dichroic mirror 108 and the objective lens 109 so that the excitation light / Stokes light is reflected before entering the objective lens 109.
  • the installation angle of the galvano mirror 1601 is controlled by external control from the computer 11, and thereby the angle of the light beam of the excitation light / Stokes light can be controlled.
  • the excitation light / Stokes light whose angle has been changed by the galvanometer mirror 1601 is condensed in the sample 110 at a position different from that before the angle change, and the generated CARS light also enters the light receiving surface of the CCD camera at a different position.
  • the angular scanning direction of the galvanometer mirror 1601 is set so that the position of the CARS light on the light receiving surface of the CCD camera changes in the vertical direction in FIG.
  • the CARS light beam 203 moves in the vertical direction.
  • the other axes are scanned using the XYZ stage 12. This operation is the same when another scan mirror such as a MEMS mirror is used. Since these scan mirrors normally operate at a higher speed than an XYZ stage or the like, high-speed measurement is possible by applying these.
  • the spectroscope is arranged on the side opposite to the excitation light / Stokes light incident side of the sample.
  • the spectroscope is arranged on the same side, and the backscattered light from the sample is converted into parallel light by the objective lens 109. You may detect with a spectrometer.
  • the excitation light / Stokes light and the CARS light are coaxial, it is necessary to separate the CARS light from the excitation light / Stokes light using a beam splitter 301 or the like.
  • a CCD camera is assumed as a detector.
  • the detector is not limited to this, and a similar effect can be obtained when a line sensor that is a COMS camera or a one-dimensional detector array is used.
  • the scan of this embodiment may be two-dimensional or three-dimensional
  • it is possible to use a three-dimensional scan for a comparatively thick sample roughly, the excitation light focused on the sample or more than the focal depth of Stokes light. This is effective because the integrated amount of signals from the entire sample can be obtained with high accuracy.
  • the integrated amount of the signal can be acquired accurately in a short time by performing a two-dimensional scan.
  • This example is an example in which a plurality of exposure operations are performed in the measurement of a sample.
  • the configuration example of the optical analyzer of the present embodiment is the same as that of the first embodiment.
  • the time sequence for data acquisition in this example is shown in FIG.
  • the basic method is the same as that of the first embodiment, but in this embodiment, the exposure state of the detection unit 115 is not continued over the entire scanning of the sample, but the exposure state of the detection unit 115 is interrupted halfway. Data transfer is performed, and then the exposure state is repeated again. Then, after the data acquisition is completed, signal processing or the like is performed in the same manner as in the first embodiment, using the average value of a plurality of spectrum data obtained as final acquisition data.
  • the scanning performed over the entire desired region of the sample is divided into a plurality of scans by the excitation light and the Stokes light, and the detection unit 115 of the spectroscope 113 is divided into the first embodiment for each of the divided partial scans.
  • the spectrum accumulated during each partial scan is output. In this way, the same number of integrated spectra as the number of partial scans is obtained, and the averaged spectrum is used as final spectrum data.
  • the exposure time for one time is shorter than that in the first embodiment, it is possible to avoid a situation where the light receiving portion is saturated and data cannot be output normally.
  • the noise (mainly generated by an amplifier that converts charge into voltage) is averaged for each output of spectrum data at one time, thereby comparing with the first embodiment. It is possible to improve the S / N ratio.
  • the single exposure of the detection unit in this embodiment needs to be performed over a plurality of positions of the sample.
  • the exposure time of the detection unit needs to be longer than the pixel residence time.
  • the conventional method corresponds to the case where the exposure time is equal to the pixel residence time.
  • FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a configuration example of the optical analyzer according to the present embodiment.
  • the optical analysis apparatus of the present embodiment has a configuration capable of observing a sample with a differential interference microscope.
  • the illumination light from the illumination 401 passes through the Wollaston prism 402, is reflected by the dichroic mirror 403, is condensed on the sample 110 by the condenser lens 111, and differential interference of the sample 110 is performed.
  • the image is imaged on an imaging device such as a CCD camera 408 using the objective lens 109, the dichroic mirror 404, the Wollaston prism 405, the polarizer 406, and the imaging lens 407 to obtain an image of the sample.
  • This configuration is identical to that of the well-known differential interference microscope.
  • the dichroic mirrors 403 and 404 reflect the wavelength (400 to 700 nm) of the visible light region of the illumination 401, and transmit the excitation light, Stokes light, and CARS light (both have a near infrared wavelength of 700 nm or more). It does not affect the generation and detection of CARS signals.
  • the image acquired by the CCD camera 408 is sent to the computer 11, and the computer recognizes the shape and structure of the sample and analyzes the image data for extracting the outline of the sample (cells, etc.).
  • 11 sends a command to the stage 12 to scan only within the range of the contour, and during this scanning time, the detection unit 115 of the spectroscope 113 continues to be exposed and the CARS spectrum integrated is acquired.
  • the scanning range of the light spot is limited to the measurement sample, it is possible to shorten the data acquisition time as compared with the first embodiment. Further, the scanning range is not necessarily the entire sample, and it is also possible to acquire the CARS spectrum from only a part of the region, for example, the cell nucleus.
  • a differential interference image is acquired in the same manner, and the contour of the nucleus portion is extracted by the computer 11 and then only the nucleus portion is scanned.
  • CARS spectra may be acquired separately from a plurality of locations (for example, cell nuclei and other than nuclei) of the same sample.
  • the differential interference microscope is used as the sample observation means.
  • the differential interference microscope may be an ordinary bright field microscope (Wollaston prism 402, 405, corresponding to a configuration in which the polarizer 406 is removed), an image data acquisition unit such as a phase-contrast microscope, or a combination of these may be used.
  • This example is an example in which a spontaneous Raman spectrum or a fluorescence spectrum is obtained instead of the CARS spectrum.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a configuration example of the optical analyzer of the present embodiment.
  • the optical analyzer according to the present embodiment has a configuration in which the Stokes light generation unit is omitted from the optical analyzer illustrated in the first embodiment. That is, the excitation light emitted from the laser 101 is directly incident on the objective lens 109. Further, the spectrum acquisition range in the spectroscope 113 is set to a longer wavelength side than the excitation light, unlike CARS. This setting is made by setting the angle of the diffraction grating provided in the spectroscopic unit 114 in the spectroscope 113.
  • Example 2 the operation is the same as in Example 1 and Example 2, and the spectrum reflecting the chemical species in the sample or the content of the fluorescent label is obtained according to the sequence shown in FIG. 3B or 3C. To be acquired. Even when acquiring a spontaneous Raman spectrum or fluorescence spectrum from a focused laser, in order to analyze the entire sample, spectrum data was conventionally acquired for each focused spot. Speedup and data reduction can be achieved.
  • This example is an example of a biomolecule analysis device in which the optical analysis device of the present invention is applied to single cell analysis, and is an example of acquiring a CARS spectrum as one form of cell analysis.
  • FIG. 8 and 9 are schematic views showing a configuration example of the biomolecule analyzer according to the present embodiment.
  • FIG. 8 is a schematic view showing the optical system portion of the present apparatus
  • FIG. 9 is a detailed view of the periphery of the sample showing a configuration example of the biomolecule collection system.
  • FIG. 9 includes a biomolecule collection system 2 that captures the mRNA of a sample cell for gene expression analysis. The optical system part and the biomolecule collection system are controlled by the computer 11 and data acquisition is performed.
  • the optical system portion of the apparatus shown in FIG. 8 includes a cell destruction laser 5 (pulse laser with a wavelength of 355 nm, an average output of 2 W, and a repetition frequency of 5 kHz), a driver 602, a laser in addition to the configuration shown in FIG. 5 is provided with a dichroic mirror 603 for making the emitted light from 5 coaxial with the excitation light.
  • the optical system portion includes three functions: (1) acquisition of differential interference microscope images, (2) acquisition of CARS spectra, and (3) destruction of cells. The functions (1) and (2) are as described in the third embodiment.
  • the function (3) is a function of condensing the emitted light from the cell destruction laser 5 on the cell to be observed by the objective lens 109, destroying the cell, and releasing biomolecules such as mRNA inside the cell to the outside. is there.
  • the released mRNA is captured and analyzed by the biomolecule collection system 2 as described later.
  • the biomolecule collection system 2 shown in FIG. 9 includes an array device in which regions for capturing biomolecules such as mRNA released from cells are arranged.
  • a cDNA library can be constructed by capturing mRNA in a plurality of regions of the array device for each single cell and performing a reverse transcription reaction in the array device.
  • the array device is constructed of a transparent porous membrane in which a large number of through holes are formed perpendicular to the surface, and this will be referred to as a pore array sheet 30 hereinafter.
  • a structure in which a cDNA library is formed on the pore array sheet 30 is referred to as a cDNA library pore array sheet.
  • a separation wall 31 can be formed on the pore array sheet 30 to separate regions that capture biomolecules.
  • the separation wall 31 can be formed by a semiconductor process using polydimethylsiloxane (PDMS), for example, and can be brought into close contact with the pore array sheet 30 with a thickness of about 80 ⁇ m.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 10 is a top view of the pore array sheet 30.
  • a region 300 for capturing a large number of biomolecules such as mRNA is formed in the pore array sheet 30 (size 2 mm ⁇ 2 mm, thickness 80 ⁇ m).
  • the size of the region 300 is set such that one side is 100 ⁇ m and the interval is 80 ⁇ m (arranged at a cycle of 180 ⁇ m).
  • the size of the region 300 can be freely designed from about 1 ⁇ m to about 10 mm in accordance with the amount of biomolecules to be captured and the ease of diffusion in the plane (molecule size).
  • an array device in addition to the pore array sheet 30 made of a porous membrane formed by anodizing aluminum, a device in which a large number of through holes are formed by anodizing a material such as silicon may be used. . Furthermore, an array device may be constructed by providing a large number of through holes in a silicon oxide or silicon nitride thin film using a semiconductor process.
  • a loop-shaped platinum electrode 32 is joined to the tip of a shield wire 33 as a means for guiding biomolecules released from cells to a specific region in the pore array sheet 30 by electrophoresis.
  • the diameter of the wire of the platinum electrode 32 is 30 ⁇ m.
  • the loop side is processed into a circle with a diameter of 100 ⁇ m.
  • Two such electrodes are prepared, arranged so as to sandwich the pore array sheet 30, and a direct current of 1.5 V is applied by the power source 35. Since the released mRNA 36 has a negative charge, the upper platinum electrode 32 is used as a positive electrode.
  • a silver-silver chloride reference electrode 39 is provided, and 0.2 V is applied to the lower platinum electrode 32.
  • mRNA 36 can be induced by electrophoresis inside the region 300 for capturing biomolecules.
  • the diameter of the loop of the upper platinum electrode 32 may be set to 50 ⁇ m in order to realize concentration of mRNA by lateral electrophoresis.
  • the wire has a diameter of 10 ⁇ m.
  • FIG. 11 shows an example of a flowchart.
  • a sample composed of adherent cultured cells 21, 22, and 23 is placed on the petri dish 20.
  • the measurement target is a cultured cell
  • the cell is cultured in advance using the petri dish 20 so that the measurement target cell adheres to the bottom surface.
  • the sample is a frozen section, it is placed on the petri dish 20.
  • a sample in which a plurality of cells are three-dimensionally arranged in a gel may be used.
  • a differential interference image of a target cell group is acquired using a microscope system, and a user determines a target cell from which a biomolecule is collected and measured.
  • the computer 11 receives input of information on a cell or a cell portion to be measured from a user.
  • the computer 11 determines the order of cells that capture biomolecules, and first drives the XYZ stage 12 so that the first target cell is placed at the center of the field of view.
  • the CARS spectrum of the cell arranged at the center of the visual field is acquired by the method described in the third embodiment, and the data is stored in the computer 11.
  • the computer 11 uses the XYZ stage 34 to locate a specific region (for example, (1, 1)) of the pore array sheet 30 in the vicinity of the cell from which the CARS spectrum was acquired (in the example of FIG. 9, directly above the cell).
  • the address area 300) is approached.
  • the distance between the lower surface of the pore array sheet 30 and the petri dish 20 is set to 300 ⁇ m, but this distance can be changed depending on the type of biomolecule to be collected and the electrode structure. For example, about 1 ⁇ m to 10 mm is preferable.
  • the movement of the pore array sheet 30 by the XYZ stage 34 is automatically performed by the computer 11 according to a prior program.
  • a voltage is applied to the platinum electrode 32 for electrophoresis, and at the same time, in order to destroy the cell membrane of the cell to be measured, the laser light from the cell destruction laser light source 5 is applied to the cell. Irradiate.
  • the irradiation time can be, for example, 10 seconds, and the electrophoresis driving time can be 60 seconds.
  • the computer 11 drives the XYZ stage 12 to position the registered second target cell at the center of the visual field. Thereafter, the CARS spectrum of the second cell is acquired, and the data is stored in the computer 11. Next, the computer 11 drives the XYZ stage 34 to locate a specific region (for example, (1, 2) of the pore array sheet 30 near the second target cell (immediately above the cell in the configuration example of FIG. 9). The address area 300) is approached. Then, the second cell registered in the computer 11 is irradiated with the laser beam from the cell destruction laser 5. At this time, a voltage is simultaneously applied to the platinum electrode 32 as described above.
  • the CARS spectrum is acquired for the sequentially designated cells, the cells are destroyed, the biomolecules in the cells are captured in the specific region 300 of the pore array sheet 30, and then the captured biomolecules are captured.
  • the process for measuring is executed.
  • the portion corresponding to the destroyed cell in the differential interference image, the region 300 where the biomolecule is captured in the pore array sheet 30, and the acquired CARS spectrum are associated with each other and presented to the user.
  • the cell to be destroyed is one cell.
  • one cell 300 on the array device is released and electrophoresed when a plurality of cells are destroyed.
  • mRNA may be captured.
  • a plurality of cells may be destroyed at the same time, or the cells may be destroyed one by one without moving the array device.
  • the CARS spectrum is acquired and the biomolecule is captured sequentially for different cells. For example, after acquiring the differential interference image of the sample, all the CARS spectra of the target cells are measured. Alternatively, the flow may be such that each cell is sequentially destroyed to supplement biomolecules.
  • This example makes it possible to acquire CARS spectra and gene expression data for individual cells. Using this function, it is possible to confirm the dynamic characteristics of cells with high accuracy.
  • a CARS spectrum is acquired.
  • the cell is destroyed for the cell selected by the user, the biomolecule in the cell is captured on the array device, and the amount is Measure.
  • the CARS spectrum and the cell state and type can be associated with each other with high accuracy.
  • the CARS spectrum can obtain more information on the chemical species to be measured in that a Raman spectrum can be obtained compared to a fluorescent confocal microscope that is usually used for single cell analysis. Such highly accurate analysis is possible.
  • FIG. PC in the figure is an abbreviation for principal-component, where PC1 indicates the first main factor and PC2 indicates the second main factor.
  • Each point corresponds to gene expression data for one cell. In many cases, it is divided into a plurality of clusters (in this example, 6 clusters) corresponding to the state and type of cells.
  • FIG. 12 since each point corresponds to a cell, it is possible to make a correspondence based on gene expression analysis data even if it is not possible to determine which cell is what kind of cell only by the CARS spectrum. it can.
  • principal factor analysis is used for clustering based on gene expression of cells, but various methods such as hierarchical clustering and k-means method can be applied. Also, as a method of machine learning, various methods used for data mining such as a support vector machine are known, and any of them may be used.
  • the CARS spectrum is used as the spectrum obtained from the sample.
  • the same effect can be obtained by using a spontaneous Raman spectrum or a fluorescence spectrum instead of the CARS spectrum.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • the present invention makes it possible to provide an analyzer capable of acquiring information from a large amount of sample at a high speed, and accelerate research and development in the medical and pharmaceutical fields.

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Abstract

　試料のＣＡＲＳスペクトルなどのスペクトルデータを、データ量を抑えて高速に取得する。試料に集光して照射される照射光の走査中、試料から発生される光を分光する分光器の検出部の露光状態を継続し、試料内の複数の位置で発生されたスペクトルを積算したスペクトルデータを取得する。

Description

光学分析装置
　本発明は、光学分析装置の高性能化に関する。
　光学顕微鏡は言うまでも無く自然科学、工学、産業分野において無くてはならない観察ツールである。特に近年は、照明光源としてレーザを用いたより高機能な顕微鏡が先端技術開発において必須となりつつある。その代表例が蛍光共焦点顕微鏡であり、蛍光試薬との組み合わせにより生体試料中の特定物質の分布を観察する手段として医学、生物学の分野において広く普及している。更に近年の高性能な短パルスレーザ光源の登場とあいまって、非線形光学効果を用いた非線形光学顕微鏡の技術発展と、医学、生物学分野におけるニーズの高まりが著しい。非線形光学顕微鏡（あるいは非線形顕微鏡）の例として、二光子蛍光顕微鏡（非特許文献１）、ＳＨＧ顕微鏡（非特許文献２）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡（非特許文献３）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡（非特許文献４）などが知られている。例えば二光子蛍光顕微鏡は、試料に照射するレーザ光として試料の吸収が小さい波長域を選択することができ、従来の蛍光共焦点顕微鏡と比較して深部のイメージングが可能である。ＳＨＧ顕微鏡は試料からの第二高調波を観察する顕微鏡であり、コラーゲンなどの繊維構造や、細胞膜など特定の構造体を選択的に検知することができる。ＣＡＲＳ顕微鏡は励起光とストークス光の２種類のレーザ光を試料に照射し、これらの光の差周波が試料分子の固有振動に共鳴した結果生じるアンチストークス光を観測する顕微鏡である。アンチストークス光の波長、強度分布により試料中の特定物質の分布を観測することができ、蛍光顕微鏡に代わるラベルフリー、非侵襲な顕微鏡として注目されている。ＳＲＳ顕微鏡はＣＡＲＳ顕微鏡と同様に励起光、ストークス光を試料に照射し、物質の固有振動を上記２種類の光の強度変化として観測する顕微鏡であり、ＣＡＲＳ顕微鏡と同様に非侵襲な顕微鏡である。このように、非線形光学顕微鏡は従来の顕微鏡では実現不可能であった様々な高機能な観察手段を提供する。
　ここでＣＡＲＳ顕微鏡の動作原理について説明する。ＣＡＲＳは３次の分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、励起光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光は励起光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は
（式１）
　　　ＰAS (3)(ωAS)＝|χr (3)(ωAS)＋χnr (3)|ＥP 2(ωP)Ｅ* S(ωS)
で表される。ここに、χr (3)(ωAS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、χnr (3)は非共鳴項である。また、励起光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表されている。非共鳴項は周波数依存性がない。式(1)のＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度は以下のように表される。
（式２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　図１３に示した分子のエネルギー準位図を用いて、ＣＡＲＳ光が発生する機構を説明する。図１３は共鳴項のプロセスを示している。１４０１は分子の振動基底状態を表し、１４０２は振動励起状態を表す。周波数ωPの励起光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は仮想準位１４０３を介して、１４０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、仮想準位１４０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はωAS＝２・ωP－ωSと表される。
　この共鳴ＣＡＲＳ光は、図１３から明らかなように、励起光とストークス光の周波数の差ωP－ωSが観測試料のある振動励起状態に一致する場合にのみ発生する。但し、ここではプランク単位系を採用しており、プランク定数は１としている。従って、ストークス光として広帯域な光源を用いた場合、発生するＣＡＲＳ光も広帯域な光となるが、振動励起状態に対応する波長において鋭いピークを持つスペクトルを有する。このスペクトルはラマンスペクトルと呼ばれ、試料中の分子の振動励起状態の分布を反映しており、分子種の同定に用いることができる。
　図１４は、式(1)の非共鳴項に関係する一つのプロセスを示す図である。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、仮想準位１４０５を介したプロセスとなる。周波数ωPの励起光と周波数ω’Pのプローブ光の同時照射により電子等の関与する仮想準位１４０５が励起され、さらに周波数ω’Sのストークス光により、仮想準位１４０６を介して周波数ωASの非共鳴のＣＡＲＳ光が発生する。この非共鳴のＣＡＲＳ光は振動励起状態と無関係に発生するため、広帯域なストークス光を使用した場合は、強度の波長依存性を持たない広帯域な非共鳴ＣＡＲＳ光が発生する。これらの共鳴ＣＡＲＳ光と非共鳴ＣＡＲＳ光とは互いにコヒーレントであり、干渉することになる。実際に試料の分子種の同定に必要なのは共鳴ＣＡＲＳ光のスペクトル、すなわちラマンスペクトルであるため、取得したＣＡＲＳ光のスペクトルからラマンスペクトルを取得する信号処理が必要である。この信号処理についてはいくつかの方法が知られており（非特許文献５参照）、たとえば、強度スペクトルから位相スペクトルを回復する方法である最大エントロピー法では数学的な計算を行い、共鳴項の複素部分を求める。
　なお、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係は図１５のように図示される。所定の周波数を持った励起光と、それより小さな周波数領域にあるストークス光が試料に入射され、励起光よりも大きな周波数領域にＣＡＲＳ光が発生する。
　ＣＡＲＳ顕微鏡は、上記のようにして求められたラマンスペクトルを、励起光、ストークス光を集光する位置を変化させて複数測定を行い、結果的に分子種ごとの空間分布の画像を取得する。
W. Denk et al., "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, Volume 248, Issue 4951, pp. 73-76 (1990) P. J. Campagnola et al., "Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms", Nature Biotechnology 21, 1356-1360 (2003) M. Okuno et al., "Quantitative CARS Molecular finger printing of living Cells", Angewandte Chemie International Edition 49, 6773-6777(2010) B. G. Saar et al., "Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering", Science Vol.330 1368(2010) J. P. R. Day, K. F. Domke, G. Rago, H. Kano, H. Hamaguchi, E. M. Vartiainen, and M. Bonn, "Quantitative Coherent Anti-Stokes Scattering (CARS) Microscopy", J. Phys. Chem. B, Vol. 115, 7713-7725 (2011)
　上に述べたＣＡＲＳ顕微鏡において細胞などの試料を分析する場合、試料内の各点にレーザ光を照射してＣＡＲＳ光のスペクトルを分光器で測定し、２次元もしくは３次元の領域にわたる異なる位置のそれぞれでＣＡＲＳ光のスペクトルデータを取得し、これらのデータから結果的に試料のスペクトル情報と空間情報（画像情報）を得る。しかしながら、この場合、分光器の検出部のデータ転送レートの制約からデータの取得に長時間を有するため、場合により現実的な時間内で試料を測定することが困難になる。特に多数の細胞を解析する用途（単一細胞解析）にＣＡＲＳ顕微鏡を用いる場合、データ取得速度が遅いことが致命的な欠点となり、現状のＣＡＲＳ顕微鏡を単一細胞解析に応用することは実質的に困難である。さらに、スペクトル情報と空間情報を取得する従来の方法では、データ量そのものが膨大となり、測定後のデータの保存が困難、データ解析が長時間になるなどの課題がある。例えば上述の最大エントロピー法などを用いて行われるデータの解析が長時間になることは、試料分析の実質的なスルーレートを低下させることになるため、分析手法としてＣＡＲＳ顕微鏡を応用する場合に大きな問題となる。これまで述べてきた問題は、試料の各点でスペクトルを取得する測定方法（ハイパースペクトルイメージング）に共通の問題であり、ＣＡＲＳ顕微鏡のほか、ラマン顕微鏡や、蛍光共焦点顕微鏡で蛍光スペクトルを取得する場合にも同様に当てはまる。
　上記の課題に鑑み、本発明の目的は、高速に試料の分析を可能とする光学分析装置を提供することにある。
　従来のＣＡＲＳ顕微鏡などのハイパースペクトルイメージングは、試料からできるだけ多くの情報（スペクトル情報と空間情報）を取得して分析を容易にするという考え方に基づいている。しかし実際は、取得データのすべての情報が必要ではない場合が多く、例えば細胞内の一部もしくは全体のある物質の含有量などが分かれば十分な場合がある。そこで本発明では、試料の全ての空間点からスペクトルを取得するのではなく、一部もしくは全体の領域内のスペクトルの積算値を取得することで、問題の解決を行う。具体的には以下の手段を用いた。
（１）短パルスレーザなどの光源と、試料を保持する試料保持部と、光源からの光束を試料保持部に保持された試料に集光して照射する照射光学系と、光照射によって試料から発生された光を分光する分光部と、分光部により分光された光を検出するラインセンサやエリアセンサ等の検出器アレイを含む検出部と、照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部と、を備え、検出部は、照射制御部による試料への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することとした。
　これにより、データ取得時間の短縮とデータ量の削減が可能となる。
（２）（１）において、検出部は積算したスペクトルを複数出力し、複数出力されたスペクトルを平均することとした。
　これにより、測定される光の強度が強い場合でも分光器の飽和を回避することができ、また複数のスペクトルの和や平均を取ることでノイズを相対的に低減し、スペクトル信号のＳ／Ｎ比を高めることが可能となる。
（３）（１）において、試料保持部に保持された試料の画像データを取得する画像データ取得部と、取得した画像データを元に試料の形状を認識する形状認識部と、を備え、照射制御部は、形状認識部によって認識した試料の形状にもとづき、試料の特定領域に光源からの光束を集光して照射することとした。
　これにより、測定時間の短縮が実現される。また、試料の別々の部分からスペクトル信号を取得することができ、より詳細な試料の解析が可能となる。
（４）（１）において、スペクトルとしてＣＡＲＳスペクトルを検出することとした。
　これにより、無染色かつ高速な試料の解析が可能となる。
（５）（１）において、照射制御部がスキャンミラーを含み、スキャンミラーの制御方向が検出部の分光方向と垂直な方向であることとした。
　これにより、走査がより高速となり、高速な測定が可能となる。
（６）（１）において、照射制御部が試料を２次元的に走査することとした。
　これにより、比較的薄いサンプルに対し、高速な測定が可能となる。
（７）（１）において、照射制御部が試料を３次元的に走査することとした。
　これにより、比較的厚いサンプルに対し、信頼性の高い測定値を取得することが可能となる。
（８）光源と、試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、光源からの光束を試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、分光部により分光された光を検出する検出部と、照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、検出部は、照射制御部による細胞への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することとした。
　これにより、生体試料の高速な解析が可能となる。
　本発明によると、従来よりもデータ量を抑制した高速な光学分析装置の提供が可能となる。
　上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
光学分析装置の構成例を示す模式図。 ＣＣＤカメラの受光部の模式図。 データ取得動作のシーケンス図。 スキャンミラーを用いる場合の構成図。 ＣＡＲＳ光の後方散乱を検出する光学分析装置の構成図。 光学分析装置の構成例を示す模式図。 光学分析装置の構成例を示す模式図。 生体分子解析装置の構成例を示す模式図。 生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図。 細孔アレイシートの上面図。 生体分子解析装置の動作を説明するフローチャート。 主因子分析の結果を示す図。 共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。 非共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。 励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係を示す図。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
　図１は、本発明の光学分析装置の基本的な構成例を示す模式図である。以下、図１に従って本実施例の動作を説明する。
　コンピュータ１１からの指示によりドライバ１０を通して発光制御される光源すなわち短パルスレーザ光源１０１（中心波長１０６４ｎｍ、パルス幅９００ｐｓ、繰り返し周波数３０ｋＨｚ、平均出力２００ｍＷ）から出射したレーザ光は、ビームスプリッタ１０２により、励起光である透過光と反射光とに２分割される。反射光は集光レンズ１０３によりフォトニック結晶ファイバ１０４に結合され、ファイバ内部で広帯域なスーパーコンティニューム光が生成される。生成されたスーパーコンティニューム光はコリメートレンズ１０５により平行光とされた後、ロングパスフィルタ１０６に入射して短パルスレーザ光源の波長とそれより短い波長の成分が遮断される。ロングパスフィルタ１０６を通過した励起光よりも波長の長い成分であるストークス光は上記励起光とダイクロイックミラー１０８により合波される。ここでダイクロイックミラー１０８は励起光の波長とそれより短い波長域の光を反射し、励起光よりも長い波長域の光を透過する性質を有する。従って励起光は反射し、ストークス光は透過して結果的に合波される。
　この合波光束は光源からの光束を試料に集光して照射する照射光学系を構成する対物レンズ１０９（ＮＡ０．９、倍率４０倍）により試料１１０の一点に集光され、試料の集光箇所に存在する分子の共鳴振動を反映したＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光はコンデンサレンズ１１１（ＮＡ０．６５）により平行光とされ、ショートパスフィルタ１１２を通過して同軸成分である励起光とストークス光が遮断された後、分光器１１３に入射し、分光部１１４により分光され、検出部１１５により波長ごとに別々に検出されて、スペクトルが検出信号として出力される。
　ここで、分光器１１３の検出動作について説明する。分光器１１３は、入射した光を回折格子で波長ごとに異なる方向に回折させる分光部１１４と、分光部１１４により回折した光を１次元もしくは２次元の検出器アレイ（ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等）で検出する検出部１１５からなる。本実施例では検出部１１５としてＣＣＤカメラを用いており、その受光部２０１は図２に示されるように画素２０２が２次元的に配列したものになっている。分光部１１４で分光された光は横長のビーム２０３として受光部に入射し、横方向の位置により波長が異なる。ここで検出部１１５のＣＣＤカメラは外部からの制御により所定時間の間露光状態、すなわち各画素が入射した光に露光され入射光を電荷に変換して電荷を蓄積する状態となる。そして露光終了後、縦に並んだ画素列に蓄積された総電荷量がバッファ２０４に転送され（full vertical binning）、バッファ２０４の電荷が外部にシリアル信号として出力される。このため出力信号は入射光の波長ごとの強度に比例した信号、すなわち入射光のスペクトル信号となっている。
　ここで本実施例では、検出部１１５が露光状態の間、試料１１０を保持しているＸＹＺステージ１２を駆動して、試料への励起光及びストークス光の集光位置が試料を３次元的もしくは２次元的に走査する。より具体的には、予め指定した例えば直方体領域もしくは長方形領域を一定速度で走査する。従って、一度の試料測定において１種類のスペクトル信号が得られる。この１種類のスペクトルは、走査線上にある試料の各位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルに相当する。データ数はＣＣＤカメラの横方向の画素数である。以後、この取得信号をＣＡＲＳスペクトルと呼ぶ。なお、従来の方法では、励起光とストークス光の集光位置を変えるごとにＣＡＲＳスペクトルを取得するため、多数のＣＡＲＳスペクトルがデータとして取得される。
　本実施例で得られたＣＡＲＳスペクトルは、最大エントロピー法などの信号処理が施されてラマンスペクトルに変換される。ここで得られたラマンスペクトルは、試料中の様々な化学種の含有量を表している。本実施例で得られたＣＡＲＳスペクトルは、励起光・ストークス光の位置を走査して得られた信号であるため、この信号より試料全体の（走査領域内の）各化学種の総含有量を知ることができる。
　本実施例のデータ取得のシーケンスを、図３を用いて説明する。図３（ａ）は従来法のシーケンスを表し、露光、データ転送、位置移動の動作をデータ点数分だけ繰り返す。なお、データ転送と位置移動の順番は逆であっても構わないし、同時に行ってもよい。これに対し本実施例のシーケンスは図３（ｂ）のようになっており、露光、位置移動を試料の走査が終了するまで繰り返し、最後にデータ転送を行う。なお、図３（ｂ）では露光、位置移動、データ転送がシリアルに行われるが、位置移動の間に直前の露光動作が継続していてもよいし、データ転送が直前の位置移動と同時に行われてもよい。
　本実施例と従来法を、データ取得時間とデータ量について比較する。従来法のデータ取得時間は、１回のスペクトル測定の露光時間、移動時間、スペクトルデータの転送時間の和に、測定点数（試料空間上の測定を行う位置の数）を乗じたものとなる。これに対して本実施例のデータ取得時間は、およそデータ転送時間を０とみなした場合の従来法のデータ取得時間となる。従って上記露光時間がデータ転送時間と同程度かそれよりも小さい場合、データ取得時間の短縮が可能である。データ量については、従来法のデータ量は本実施例のデータ量に測定点数を乗じたものとなる。通常、イメージを取得するために測定点数は数万点から数百万点とするため、本実施例によりデータ量が数百万分の１から数万分の１程度に削減される。
　本実施例における試料位置の走査は、離散的すなわち測定点ごとに露光中の位置を固定し露光終了後に別の位置に移動する場合と、連続的すなわち所定の速度で試料位置を連続的に変化させる場合のいずれでも構わない。連続的な走査の場合は、検出部の露光時間中に試料中の光スポットを走査し続け、走査が終了した時点で検出部の露光を終了してデータ転送を行う。なお、連続的な走査の場合は、従来法における１測定点が、励起光とストークス光の試料中の集光スポットサイズの空間領域に相当するとして、離散的な場合と同等に扱うことができる。すなわち、連続的な走査は、位置移動量を集光スポットサイズとし、１測定点あたりの露光時間をピクセル滞在時間（pixel dwell time）とした場合の離散的走査とほぼ同等である。なお、ピクセル滞在時間は、（集光スポットサイズ）÷（試料の走査速度）として定義される。
　本実施例では照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部としてＸＹＺステージ１２を用い、測定点の走査のために試料位置を走査したが、照射制御部による光照射位置の制御方法はこの限りではない。例えば、照射制御部として励起光・ストークス光の試料への入射角度を外部制御により走査するガルバノミラー、ＭＥＭＳミラーなどのスキャンミラーを用いてもよいし、対物レンズ１０９の位置を走査しても構わない。あるいは上に述べた方法の組み合わせであっても構わない。
　特にガルバノミラーを用いて１軸をスキャンする場合の例について図４を用いて説明する。この場合、ダイクロイックミラー１０８と対物レンズ１０９の間にガルバノミラー１６０１を挿入し、励起光・ストークス光が反射してから対物レンズ１０９に入射する構成とする。ここで、ガルバノミラー１６０１はコンピュータ１１からの外部制御により設置角度が制御され、これにより励起光・ストークス光の光束の角度を制御することができる。ガルバノミラー１６０１により角度が変化した励起光・ストークス光は試料１１０中で角度変化前と異なる位置に集光され、ＣＣＤカメラの受光面においても発生したＣＡＲＳ光が異なる位置に入射される。ここでガルバノミラー１６０１の角度走査方向を、ＣＣＤカメラの受光面においてＣＡＲＳ光の位置が図２の垂直方向（分光される方向とほぼ垂直な方向）に変化するように設定する。この場合、ＣＡＲＳ光のビーム２０３が垂直方向に移動するが、上述のようにデータ取得時には垂直方向に積算されたデータが出力されるため、ビームの位置が変化しても出力信号には影響がない。他の軸はＸＹＺステージ１２を用いて走査する。この動作はＭＥＭＳミラーなどの他のスキャンミラーを用いても同様である。これらのスキャンミラーは通常、ＸＹＺステージなどに比べると高速に動作するため、これらを適用することにより高速な測定が可能である。
　また、本実施例で分光器は励起光・ストークス光の試料への入射側と反対側に配置されているが、同じ側に配置し、試料からの後方散乱光を対物レンズ１０９で平行光として分光器で検出してもよい。この場合、図５の模式図に示すように、励起光・ストークス光とＣＡＲＳ光が同軸となるため、ビームスプリッタ３０１などを用いてＣＡＲＳ光を励起光・ストークス光と分離する必要がある。
　本実施例では検出器としてＣＣＤカメラを想定したが、検出器はこの限りではなく、ＣＯＭＳカメラや１次元の検出器アレイであるラインセンサを用いた場合も同様の効果を得ることができる。
　本実施例のスキャンは２次元でも３次元でもよいと述べたが、比較的厚い（大雑把には試料に集光した励起光、ストークス光の焦点深度以上）試料については３次元スキャンを用いることで試料全体からの信号の積算量を精度良く取得できるため、有効である。逆に薄い（試料に集光した励起光、ストークス光の焦点深度以下）試料については２次元スキャンを行うことで短時間に精度よく信号の積算量が取得できる。
　本実施例は、試料の測定において複数回の露光動作を行う実施例である。本実施例の光学分析装置の構成例は実施例１と同じである。
　本実施例のデータ取得の時間シーケンスを図３（ｃ）に示す。基本的な方法は実施例１と同等であるが、本実施例では試料の走査全体に渡って検出部１１５の露光状態を継続するのではなく、途中で検出部１１５の露光状態を中断してデータ転送を行い、その後再び露光状態とすることを繰り返す。そしてデータ取得終了後、複数得られたスペクトルデータの平均値を最終的な取得データとして、実施例１と同様に信号処理等を行う。すなわち、本実施例では、励起光とストークス光によって試料の所望領域全体にわたって行われる走査を複数の走査に分割し、分割された各部分走査に対して分光器１１３の検出部１１５は実施例１と同様にそれぞれの部分走査の間に積算したスペクトルを出力する。こうして部分走査の数と同数の積算スペクトルを得、それを平均したものを最終的なスペクトルデータとする。
　この場合、実施例１に比べて一度の露光時間が短くなるため、受光部が飽和して正常にデータ出力ができなくなることを避けることができる。また、複数のデータの平均を取ることで、一度のスペクトルデータの出力ごとに加算されるノイズ（電荷を電圧に変換するアンプで主に発生）を平均化することにより、実施例１に比べてＳ／Ｎ比を向上させることが可能である。
　なお、本実施例の一度の検出部の露光は、言うまでもなく試料の複数位置にわたって行われる必要がある。言い換えると、検出部の露光時間をピクセル滞在時間よりも長くする必要がある。従来法は露光時間とピクセル滞在時間が等しい場合に相当する。
　本実施例は、試料の特定領域からデータを取得する実施例である。図６は、本実施例の光学分析装置の構成例を示す模式図である。本実施例の光学分析装置は、実施例１の光学分析装置の構成に加え、試料を微分干渉顕微鏡で観察できる構成を備える。
　本実施例では、まず照明４０１（ハロゲンランプ）からの照明光を、ウォラストンプリズム４０２を通過させてからダイクロイックミラー４０３で反射させてコンデンサレンズ１１１によって試料１１０に集光し、試料１１０の微分干渉像を対物レンズ１０９、ダイクロイックミラー４０４、ウォラストンプリズム４０５、ポラライザ４０６、結像レンズ４０７を用いてＣＣＤカメラ４０８等の撮像装置上に結像させて試料のイメージを取得する。この構成はよく知られた微分干渉顕微鏡のそれと同一である。なお、ダイクロイックミラー４０３，４０４は照明４０１の可視光域の波長（４００－７００ｎｍ）は反射し、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光（いずれも７００ｎｍ以上の近赤外域の波長を有する）は透過するように設計されており、ＣＡＲＳ信号の生成、検出には影響を及ぼさない。
　ここで、ＣＣＤカメラ４０８により取得されたイメージはコンピュータ１１に送られ、試料の形状や構造を認識する形状認識部で試料（細胞など）の輪郭を抽出する画像データの解析がなされた後、コンピュータ１１がステージ１２に輪郭の範囲内のみ走査するよう命令を送り、この走査時間中に分光器１１３の検出部１１５が露光状態を継続して積算されたＣＡＲＳスペクトルが取得される。このとき、光スポットの走査範囲が測定試料に限定されるため、実施例１に比べてデータ取得時間を短縮することが可能である。また、走査範囲は必ずしも試料の全体とは限らず、一部の領域、たとえば細胞の核の部分のみからＣＡＲＳスペクトルを取得することも可能である。この場合も同様に微分干渉像を取得して、核の部分の輪郭抽出をコンピュータ１１で行ってから核の部分だけの走査を行えばよい。さらに、例えば同一試料の複数個所（例えば細胞の核と核以外）から別々にＣＡＲＳスペクトルを取得してもよい。
　本実施例では試料の観察手段として微分干渉顕微鏡を用いたが、試料の輪郭抽出が可能な画像データが取得できればよいのであって、微分干渉顕微鏡を例えば通常の明視野顕微鏡（ウォラストンプリズム４０２，４０５、ポラライザ４０６を取り除いた構成に相当）、位相差顕微鏡などの画像データ取得部に置き換えてもよく、あるいはこれらの組み合わせを用いても構わない。
　本実施例は、ＣＡＲＳスペクトルの代わりに自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを取得する実施例である。
　図７は、本実施例の光学分析装置の構成例を示す模式図である。本実施例の光学分析装置は実施例１に示した光学分析装置からストークス光の生成部が省略された形となっている。すなわち、レーザ１０１から出射された励起光が直接対物レンズ１０９に入射する。また、分光器１１３でのスペクトル取得範囲はＣＡＲＳと異なり、励起光よりも長波長側に設定される。この設定は分光器１１３中の分光部１１４に設けられた回折格子の角度の設定によりなされる。
　本実施例でも動作は実施例１や実施例２と同様であり、図３（ｂ）あるいは図３（ｃ）に示したシーケンスに従って試料中の化学種あるいは蛍光ラベルの含有量を反映したスペクトルが取得される。集光したレーザから自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを取得する場合にも、試料全体の解析を行うために従来は集光箇所ごとにスペクトルデータを取得していたが、本実施例によりデータ取得速度の高速化とデータ量の削減を行うことができる。
　本実施例は、本発明の光学分析装置を単一細胞解析に適用した生体分子解析装置の実施例であり、細胞解析の一つの形態としてＣＡＲＳスペクトルを取得する実施例である。
　図８、図９は、本実施例に係る生体分子解析装置の構成例を示す模式図である。図８は本装置の光学系部分を示した概略図であり、図９は生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図である。図９には遺伝子発現解析を行うために試料である細胞のｍＲＮＡを捕捉する生体分子採取システム２が含まれている。光学系部分及び生体分子採取システムはコンピュータ１１により制御され、またデータの取得が行われる。
（光学系部分の説明）
　図８に示した装置の光学系部分は、実施例３の図６に示した構成に加え、細胞破壊用レーザ５（波長３５５ｎｍ、平均出力２Ｗ、繰り返し周波数５ｋＨｚのパルスレーザ）及びドライバ６０２、レーザ５からの出射光を励起光と同軸にするためのダイクロイックミラー６０３を備える。光学系部分には、（１）微分干渉顕微鏡像の取得、（２）ＣＡＲＳスペクトルの取得、（３）細胞の破壊、の３つの機能が含まれる。（１）及び（２）の機能については実施例３で述べたとおりである。（３）の機能は、細胞破壊用レーザ５からの出射光を対物レンズ１０９により観測対象の細胞に集光し、細胞を破壊して細胞内部のｍＲＮＡ等の生体分子を外部に放出させる機能である。放出されたｍＲＮＡは、後述するように生体分子採取システム２により捕捉・解析される。
（生体分子採取システムの説明）
　図９に示す生体分子採取システム２は、細胞から放出されたｍＲＮＡ等の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスを備える。例えば、単一細胞ごとにアレイデバイスの複数の領域にｍＲＮＡを捕捉し、アレイデバイスにおいて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。本実施例では、アレイデバイスは、多数の貫通孔が面に垂直に形成された透明な多孔質メンブレンから構築され、以下、これを細孔アレイシート３０と呼ぶ。また、細孔アレイシート３０にｃＤＮＡライブラリーが形成されたものをｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートと呼ぶ。
　本実施例においては、細孔アレイシート３０として、直径０．２μｍの貫通孔が陽極酸化によって多数形成された、厚さ８０μｍ、大きさ２ｍｍ×２ｍｍの酸化アルミニウム製多孔質メンブレンを用いている。細孔アレイシート３０には、生体分子を捕捉する領域同士を分離するため分離壁３１を形成することができる。この分離壁３１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、半導体プロセスにより形成することができ、厚さは８０μｍ程度で細孔アレイシート３０に密着させることができる。
　図１０は、細孔アレイシート３０の上面図である。細孔アレイシート３０（大きさ２ｍｍ×２ｍｍ、厚さ８０μｍ）には、多数の生体分子、例えばｍＲＮＡを捕捉するための領域３００が形成される。領域３００のサイズは、ここでは、一辺を１００μｍとし、間隔を８０μｍとしている（１８０μｍ周期で配置）。領域３００のサイズは、捕捉対象とする生体分子の量や面内での拡散しやすさ（分子の大きさ）に応じて１μｍ程度から１０ｍｍ程度まで自由に設計することが可能である。
　アレイデバイスとしては、アルミニウムを陽極酸化することによって形成した多孔質メンブレンからなる細孔アレイシート３０の他、シリコン等の材料を陽極酸化することによって多数の貫通孔を形成したものを用いても良い。さらに、半導体プロセスを用いて、シリコン酸化物やシリコン窒化物薄膜に多数の貫通孔を設けることによって、アレイデバイスを構築しても良い。
　図９に示すように、細胞から放出される生体分子を、電気泳動によって細孔アレイシート３０における特定の領域まで導く手段として、ループ状の白金電極３２をシールド線３３の先端に接合している。白金電極３２の線材の直径は３０μｍであり、線材を２つ折にして、リード線接合部分を捻って一本化した後、ループ側を直径１００μｍの円形に加工する。このような電極を２つ作製し、細孔アレイシート３０を挟むように配置し、電源３５によって直流１．５Ｖを印加する。放出されるｍＲＮＡ３６は負の電荷を持つので、上側の白金電極３２を正極とする。ただし、銀－塩化銀の参照電極３９を設けて、下側の白金電極３２に０．２Ｖを印加する。このような操作によって、生体分子を捕捉する領域３００の内部にｍＲＮＡ３６を電気泳動によって誘導することができる。また、生体分子の捕捉効率をより向上するために、横方向の電気泳動によるｍＲＮＡの濃縮を実現するため、上側の白金電極３２のループの直径を５０μｍにしても良い。この場合、線材の直径は１０μｍとする。
（動作フローの説明）
　次に、本実施例に係る生体分子解析装置の動作フローについて説明する。図１１にフローチャートの一例を示す。
　最初に接着系培養細胞２１，２２，２３からなる試料をシャーレ２０に載せる。この実施例では測定対象が培養細胞であるから、シャーレ２０を使って事前に培養し、測定対象の細胞が底面に接着するようにする。試料が凍結切片の場合には、これをシャーレ２０の上に載せる。あるいは、複数の細胞をゲル中に３次元的に配置したものを試料としても良い。次に、顕微鏡システムを用いて、対象となる細胞群の微分干渉像を取得し、生体分子を採取、測定する対象細胞をユーザーが決定する。次に、コンピュータ１１は、ユーザーから測定対象とする細胞又は細胞の部分に関する情報の入力を受ける。一般に、ユーザーは複数の細胞を測定対象とする場合が多い。その場合には、生体分子を捕捉する細胞の順序をコンピュータ１１が決定し、まず、１番最初に対象となった細胞が視野の中心に配置されるようにＸＹＺステージ１２を駆動する。ここで、実施例３に述べた方法により視野の中心に配置された細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。
　次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を用いて、ＣＡＲＳスペクトルを取得した細胞の近傍（図９の例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，１）番地の領域３００）を接近させる。本実施例では細孔アレイシート３０の下面とシャーレ２０との間の距離を３００μｍに設定しているが、この距離は、採取する生体分子の種類や、電極構造によって変化させることができる。例えば、１μｍから１０ｍｍ程度が好適である。ＸＹＺステージ３４による細孔アレイシート３０の移動は、コンピュータ１１が事前のプログラムに従って自動的に行う。移動の完了をコンピュータ１１が確認した後、電気泳動用の白金電極３２に電圧を印加すると同時に、測定対象とする細胞の細胞膜を破壊するために、細胞破壊用レーザ光源５からのレーザ光を細胞に照射する。ここで照射時間は、例えば１０秒とし、電気泳動駆動時間は６０秒とすることができる。
　一つの細胞の破壊とその細胞中の生体分子の捕捉が終了した後、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ１２を駆動して登録された２番目の対象細胞を視野の中心に位置づける。その後、２番目の細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を駆動して２番目の対象細胞の近傍（図９の構成例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，２）番地の領域３００）を接近させる。そして、コンピュータ１１に登録された２番目の細胞へ細胞破壊用レーザ５からのレーザ光を照射する。このとき、前記と同様に、同時に白金電極３２に電圧を印加する。その後、順次指定された細胞に対し、上記のＣＡＲＳスペクトル取得を行い、細胞を破壊して、その細胞中の生体分子を細孔アレイシート３０の特定の領域３００に捕捉した後、捕捉した生体分子を測定するための処理を実行する。最後に、微分干渉像における破壊された細胞に相当する部分と、細孔アレイシート３０における生体分子を捕捉した領域３００、取得したＣＡＲＳスペクトルを対応付けて、ユーザーに提示する。
　ここでは破壊する細胞を１細胞としたが、より粗い分解能のデータを取得したい場合は、アレイデバイス上の一つの領域３００に対して、複数の細胞を破壊したときに放出され、電気泳動されるｍＲＮＡを捕捉しても良い。その際の破壊は複数の細胞を同時に破壊しても良いし、アレイデバイスを動かさずに１細胞ずつ順次破壊しても良い。また、本実施例ではＣＡＲＳスペクトルの取得と生体分子の捕捉を異なる細胞に対して順次行うフローとしたが、例えば試料の微分干渉像の取得後、対象となる細胞のＣＡＲＳスペクトルを全て測定したのち、各細胞を順次破壊して生体分子を補足する、というフローであっても構わない。
　本実施例により、個々の細胞に対してＣＡＲＳスペクトルと遺伝子発現データを取得することができる。この機能を利用して、細胞の動的特性を高い精度で確認することが可能となる。このような解析を実行するために、まず、ＣＡＲＳスペクトルを取得する。取得したＣＡＲＳスペクトルと細胞の詳細な状態との対応を確認したいと考えた時点で、ユーザーが選択した細胞について細胞を破壊し、その細胞内の生体分子をアレイデバイス上に捕捉して、その量を計測する。この生体分子の定量によって詳細な細胞の状態や種類を同定し、ＣＡＲＳスペクトルとの対応をとることによって、ＣＡＲＳスペクトルと細胞の状態や種類との対応付けを高精度に行うことが可能となる。ＣＡＲＳスペクトルは、通常単一細胞の解析に用いられる蛍光共焦点顕微鏡に比べてラマンスペクトルを取得可能であるという点で測定対象の化学種に対してより多くの情報を得ることが可能であり、このような高精度な解析が可能となる。
　次に、細胞の分類をＣＡＲＳスペクトルで行うための方法について示す。ＣＡＲＳスペクトルを取得後、例えば１８０個の細胞の２０個の遺伝子発現解析を行って、主因子分析を行い、上位２つの主因子についてプロットした図を図１２に示す。図中のＰＣはprincipal componentの略であり、ＰＣ１が第一の主因子、ＰＣ２が第２の主因子を指す。個々の点は１つの細胞の遺伝子発現データに対応する。多くの場合に細胞の状態や種類に対応して複数のクラスター（この例では６個のクラスター）に分かれる。図１２において、一つ一つの点は細胞に対応するので、どの細胞がどのような種類の細胞であるかをＣＡＲＳスペクトルだけでは判定できなくても、遺伝子発現解析データに基づいて対応させることができる。この対応付けを利用して、どのようなＣＡＲＳスペクトルが得られたときにどのような細胞の状態や種類になるかを判定させるような機械学習をコンピュータシステムにさせることができ、学習が完了した後はＣＡＲＳスペクトルの取得のみで細胞の状態や種類の分類が可能となる。
　なお、この例では、細胞の遺伝子発現に基づくクラスタリングに主因子分析を用いたが、階層的クラスタリングやk-means法等様々の方法を適用することができる。また、機械学習の方法としては、サポートベクタマシン等、データマイニングに用いられる様々な方法が知られており、それらのいずれを用いても良い。
　また、本実施例では、試料から得られる分光スペクトルとしてＣＡＲＳスペクトルを用いて説明したが、ＣＡＲＳスペクトルの代わりに自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを用いても同様の効果を得ることができる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　本発明により、大量の試料から高速に情報を取得可能な分析装置を提供することが可能となり、医療や製薬分野における研究開発を加速することができる。
　２：生体分子採取システム、５：細胞破壊用レーザ、１１：コンピュータ、２１，２２，２３：接着系培養細胞、３０：細孔アレイシート、３２：白金電極、１０１：短パルスレーザ光源、１０４：フォトニック結晶ファイバ、１０９：対物レンズ、１１０：試料、１１３：分光器、１１４：分光部、１１５：検出部、２０１：ＣＣＤカメラ受光部、４０１：照明、４０７：結像レンズ、４０８：ＣＣＤカメラ

Claims (9)

  1. 　光源と、
    　試料を保持する試料保持部と、
    　前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された試料に集光して照射する照射光学系と、
    　光照射によって試料から発生された光を分光する分光部と、
    　前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
    　前記照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部と、を備え、
    　前記検出部は、前記照射制御部による試料への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする光学分析装置。
  2. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記検出部は前記積算したスペクトルを複数出力し、前記複数出力されたスペクトルを平均することを特徴とする光学分析装置。
  3. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記試料保持部に保持された試料の画像データを取得する画像データ取得部と、
    　取得した画像データを元に試料の形状を認識する形状認識部と、を備え、
    　前記照射制御部は、前記形状認識部によって認識した試料の形状にもとづき、試料の特定領域に前記光源からの光束を集光して照射することを特徴とする光学分析装置。
  4. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記スペクトルはＣＡＲＳスペクトルであることを特徴とする光学分析装置。
  5. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記照射制御部はスキャンミラーを含み、
    　前記スキャンミラーの制御方向が前記検出部の分光方向とほぼ垂直な方向であることを特徴とする光学分析装置。
  6. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記照射制御部は前記試料を２次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
  7. 　請求項１に記載の光学分析装置において、
    　前記照射制御部は前記試料を３次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
  8. 　光源と、
    　試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、
    　前記試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、
    　前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、
    　光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、
    　前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
    　前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、
    　前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、
    　破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、
    　前記検出部は、前記照射制御部による細胞への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする生体分子解析装置。
  9. 　請求項８に記載の生体分子解析装置において、
    　前記細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することを特徴とする生体分子解析装置。
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