JP2016158531A - 大腸癌の予後診断を補助する方法、記録媒体および判定装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】客観的な大腸癌の予後診断補助方法を提供する。
【解決手段】大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量を測定し、測定した発現量に基づいて、大腸癌の予後診断を補助する。
【選択図】なし
【解決手段】大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量を測定し、測定した発現量に基づいて、大腸癌の予後診断を補助する。
【選択図】なし
Description
本発明は、大腸癌の予後診断を補助する方法に関する。特に、大腸癌患者の組織から得た核酸について、SCEL遺伝子の発現量データを取得し、取得した発現量データに基づいて、患者の大腸癌の予後診断を補助する方法、記録媒体および判定装置に関する。
大腸癌は、盲腸、結腸、直腸に発生する癌腫の総称である。多くの癌と同様に、大腸癌においても早期の発見がその治療にとって重要である。癌の治療においては、強力な副作用を有する抗癌剤が使用される場合があり、この場合には患者は大きな負担を強いられる。このような患者の負担を低減するために、医師が患者にとって最適な治療法を選択することは重要であり、そのためには、医師は、患者の癌の進行度、悪性度、症状などを的確に把握することが必要である。
また、患者の予後を正確に予測することは、患者の予後におけるQOL（Quality of Life）の向上のために重要である。近年、大腸癌の病理学的予後因子として、簇出(budding)の出現の有無が注目されている。非特許文献１は、簇出が直腸および結腸粘液癌の予後因子として有用であり得ることを報告している。
Okuyama T.ら，Budding (sprouting) as a useful prognostic marker in colorectal mucinous carcinoma, Jpn J Clin Oncol, 2002;32(10)412-416
上記の従来法では病理医が顕微鏡での観察によって行うため、診断結果が主観的となる。本発明者は、簇出は1〜４個の癌細胞を含む巣であるため、顕微鏡による観察では見落とされる危険性がある。また、従来法による予後判定は高度な専門知識が要求されるため予後判断が難しいという課題を見出した。
本発明は、より客観的な大腸癌の予後診断の補助方法、記録媒体および判定装置を提供することを目的とする。
本発明は、より客観的な大腸癌の予後診断の補助方法、記録媒体および判定装置を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、SCEL遺伝子の発現が簇出の有無と相関することを見出し、本発明を完成させた。
本発明によれば、大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量を測定する工程と、測定した発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する工程と、を含む大腸癌の予後診断を補助する方法が提供される。
本発明によれば、医師等による大腸癌の予後の診断を補助する中間的な情報を取得することができる。
本実施形態の大腸癌の予後判定方法（以下、「判定方法」と記す場合がある。）では、まず、大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量を測定する工程を行う。
「生体試料」としては、大腸癌患者の腫瘍細胞由来の核酸（例えばmRNA）を含むものであれば特に限定されないが、例えば臨床検体を用いることができる。臨床検体として具体的には、手術又は生検により採取した組織、血液、血清などが挙げられる。好ましくは、臨床検体は、手術又は生検により採取した腫瘍組織、特に癌先進部周辺の組織であり得る。
SCEL (sciellin)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号１として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001160706の下公知である。
別の実施態様においては、測定工程において、SCEL遺伝子に加えて、さらにMGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子から選択される少なくとも１つの発現量が測定され得る。
MGAT3 (mannosyl (beta-1,4-)-glycoprotein beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号２として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001098270の下公知である。
SLC4A11 (solute carrier family 4, sodium borate transporter, member 11)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号３として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001174089の下公知である。
MSLN (mesothelin)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号４として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001177355の下公知である。
FOXC1 (forkhead box C1)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号５として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001453の下公知である。
RUNX2 (runt-related transcription factor 2)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号６として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_001015051の下公知である。
WNT11 (wingless-type MMTV integration site family, member 11)遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号７として表す。この塩基配列は、ヒトゲノムデータベースGenBankにおいてアクセッション番号NM_004626の下公知である。
簇出は、癌先進部付近の間質に存在する１〜４個の癌細胞を含む巣である。日本癌治療学会「がん診療ガイドライン」によれば、大腸癌について言及する場合、簇出は、癌細胞が癌組織から遊離して増殖したものであり、大腸癌のリンパ節転移リスク因子として知られている。簇出のグレードは、簇出が最も高度な領域を選択し、20×10倍視野で癌発育先進部を観察し、簇出の個数をカウントすることによって評価される。カウントされた簇出数が５個以上(Grade 2及び3)の個体は、４個未満(Grade 1)の個体と比較して、リンパ節転移率が有意に上昇する。
本発明者は、今回、上記の７つの遺伝子の発現量が、簇出を有する癌先進部において有意に上昇することを初めて見出した。したがって、上記の７つの遺伝子は、大腸癌の予後判定において有用な遺伝子マーカーとなり得る。遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法に従って測定および数値化することが可能であるため、これらの遺伝子の発現量を測定することで客観的に大腸癌の予後を判定できる。
「遺伝子の転写産物」とは、遺伝子が転写されることにより得られる産物のことである。具体的には、メッセンジャーRNA（mRNA）、mRNAの前駆体が例示される。
また、「遺伝子の発現量」とは、上記の生体試料中の遺伝子の転写産物の存在量またはそれを反映する物質の量のことである。よって、本実施形態においては、mRNAの量、またはmRNAから得られる相補デオキシリボ核酸（cDNA）もしくは相補RNA（cRNA）の量が測定され得る。通常、生体試料中のmRNAは微量であるので、そこから逆転写およびインビトロ転写（IVT）により得られるcDNAまたはcRNAの量を測定することが好ましい。
また、「遺伝子の発現量」とは、上記の生体試料中の遺伝子の転写産物の存在量またはそれを反映する物質の量のことである。よって、本実施形態においては、mRNAの量、またはmRNAから得られる相補デオキシリボ核酸（cDNA）もしくは相補RNA（cRNA）の量が測定され得る。通常、生体試料中のmRNAは微量であるので、そこから逆転写およびインビトロ転写（IVT）により得られるcDNAまたはcRNAの量を測定することが好ましい。
生体試料から遺伝子の転写産物を抽出する方法としては、当該技術において知られるRNA抽出法を挙げることができる。例えば、生体試料を遠心分離して、RNAを含む細胞を沈殿させ、前記細胞を物理的手法、化学的手法または酵素的手法によって破壊し、細胞破片を除去することによりRNA抽出物を得ることができる。RNAの抽出は、市販のRNA抽出キットなどを用いて行うこともできる。
上記のようにして得られた遺伝子の転写産物の抽出物から、遺伝子の発現量の測定時に混入していないことが好ましい生体試料由来の混入成分(例えば、生体試料が血液である場合はグロビンのmRNAなど)を除去するための処理を行うこともできる。
遺伝子の発現量の測定は、定量性のある方法であれば特に限定されない。例えば、DNA、RNA、人工核酸などをプローブとして用いるマイクロアレイ（以下、単に「マイクロアレイ」ともいう)、定量PCR (例えば定量RT-PCRなど)を用いて行なうことができる。好ましい実施形態においては、マイクロアレイを用いる方法が用いられ得る。
マイクロアレイを用いて遺伝子の発現量を測定する場合、例えば、基板上に固定された20〜25 mer程度の核酸プローブに、遺伝子の転写産物の抽出物または遺伝子の転写産物から作製したcDNAもしくはcRNAを接触させ、ハイブリッドの形成の有無を蛍光、発色、電流などの指標の変化を測定することにより、目的の遺伝子の発現量を測定できる。
上記の核酸プローブは、１つの遺伝子の転写産物に対して少なくとも１つ用いればよく、遺伝子の転写産物の長さなどに応じて、複数のプローブを用いることもできる。プローブの配列は、測定しようとする遺伝子の転写産物の配列に応じて当業者が適宜決定できる。例えば、本実施形態においては、このようなプローブとして、配列番号８〜84で表されるポリヌクレオチドが用いられ得る。
マイクロアレイを用いる遺伝子の発現量の測定方法としては、例えば、Affymetrix社により提供されるGeneChip（登録商標）システムを用いることができる。
マイクロアレイを用いて遺伝子の発現量を測定する場合、例えば、基板上に固定された20〜25 mer程度の核酸プローブに、遺伝子の転写産物の抽出物または遺伝子の転写産物から作製したcDNAもしくはcRNAを接触させ、ハイブリッドの形成の有無を蛍光、発色、電流などの指標の変化を測定することにより、目的の遺伝子の発現量を測定できる。
上記の核酸プローブは、１つの遺伝子の転写産物に対して少なくとも１つ用いればよく、遺伝子の転写産物の長さなどに応じて、複数のプローブを用いることもできる。プローブの配列は、測定しようとする遺伝子の転写産物の配列に応じて当業者が適宜決定できる。例えば、本実施形態においては、このようなプローブとして、配列番号８〜84で表されるポリヌクレオチドが用いられ得る。
マイクロアレイを用いる遺伝子の発現量の測定方法としては、例えば、Affymetrix社により提供されるGeneChip（登録商標）システムを用いることができる。
マイクロアレイを用いる場合、遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、核酸プローブとのハイブリッド形成を容易にするために、断片化してよい。断片化は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素を用いて行うことができる。
マイクロアレイにおいて核酸プローブと接触させる遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、通常、5〜20μg程度であればよい。接触条件は、通常、45℃にて16時間程度である。
核酸プローブと接触させてハイブリッドを形成した遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAは、そのハイブリッド形成の有無およびハイブリッド形成した量について、蛍光物質、色素またはハイブリッド形成したことによるマイクロアレイ上を流れる電流量の変化などに基づいて検出することができる。
ハイブリッドの形成を、蛍光物質または色素の検出により測定する場合、遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAが、蛍光物質または色素の検出のための標識物質で標識されていることが好ましい。このような標識物質は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。通常、ビオチン化ヌクレオチドまたはビオチン化リボヌクレオチドを、cDNAまたはcRNAを合成するときのヌクレオチドまたはリボヌクレオチド基質として混合しておくことにより、得られるcDNAまたはcRNAをビオチンで標識することができる。cDNAまたはcRNAがビオチン標識されていると、マイクロアレイ上で、ビオチンに対する結合パートナーであるアビジンまたはストレプトアビジンが結合できる。アビジンまたはストレプトアビジンが、適切な蛍光物質または色素と結合していることにより、ハイブリッドの形成が検出できる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられる。通常、フィコエリスリン−ストレプトアビジンのコンジュゲートが市販されているので、これを用いることが簡便である。
また、アビジンまたはストレプトアビジンに対する標識抗体を、アビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、標識抗体の蛍光物質または色素を検出することもできる。
ハイブリッドの形成を、蛍光物質または色素の検出により測定する場合、遺伝子の転写産物またはそのcDNAもしくはcRNAが、蛍光物質または色素の検出のための標識物質で標識されていることが好ましい。このような標識物質は、当該技術において通常用いられるものを用いることができる。通常、ビオチン化ヌクレオチドまたはビオチン化リボヌクレオチドを、cDNAまたはcRNAを合成するときのヌクレオチドまたはリボヌクレオチド基質として混合しておくことにより、得られるcDNAまたはcRNAをビオチンで標識することができる。cDNAまたはcRNAがビオチン標識されていると、マイクロアレイ上で、ビオチンに対する結合パートナーであるアビジンまたはストレプトアビジンが結合できる。アビジンまたはストレプトアビジンが、適切な蛍光物質または色素と結合していることにより、ハイブリッドの形成が検出できる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェリン、フィコエリスリンなどが挙げられる。通常、フィコエリスリン−ストレプトアビジンのコンジュゲートが市販されているので、これを用いることが簡便である。
また、アビジンまたはストレプトアビジンに対する標識抗体を、アビジンまたはストレプトアビジンと接触させ、標識抗体の蛍光物質または色素を検出することもできる。
この工程で得られる遺伝子の発現量は、生体試料中の各遺伝子の転写産物の存在量を相対的に表す値であれば、特に限定されない。上記のマイクロアレイにより測定を行う場合、発現量は、蛍光強度、発色強度、電流量などに基づくマイクロアレイから得られるシグナルであり得る。
これらのシグナルは、マイクロアレイ用の測定装置を用いて測定できる。
これらのシグナルは、マイクロアレイ用の測定装置を用いて測定できる。
次いで、判定工程において、測定工程において得られた遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する。好ましくは、判定工程は、遺伝子の発現量またはその対数と、所定の基準値とを比較する工程を含む。遺伝子の発現量としては、上述した測定方法で取得できる値をそのまま用いることができる。たとえば、マイクロアレイで発現量を測定する場合、遺伝子の発現量として蛍光強度の値を用いることができる。定量RT-PCRで発現量を測定する場合、PCRサイクル数、PCRサイクル数から算出されるmRNAコピー数などの値を用いることができる。
遺伝子の発現量の対数の底は特に限定されず、２や１０が用いられ得る。
複数の遺伝子の発現量に基づいて判定工程を実行する場合は、遺伝子の発現量の平均値、遺伝子の発現量の中央値、遺伝子の発現量の対数の平均値、当該対数の中央値、遺伝子の発現量を標準化した値の平均値、当該標準化した値の中央値などを用いることができる。上記比較工程においてはこれらの値と所定の基準値が比較される。
所定の基準値以上である場合には、予後は良好でないと判定され得る。基準値未満である場合には、予後は良好であると判定され得る。
遺伝子の発現量の対数の底は特に限定されず、２や１０が用いられ得る。
複数の遺伝子の発現量に基づいて判定工程を実行する場合は、遺伝子の発現量の平均値、遺伝子の発現量の中央値、遺伝子の発現量の対数の平均値、当該対数の中央値、遺伝子の発現量を標準化した値の平均値、当該標準化した値の中央値などを用いることができる。上記比較工程においてはこれらの値と所定の基準値が比較される。
所定の基準値以上である場合には、予後は良好でないと判定され得る。基準値未満である場合には、予後は良好であると判定され得る。
「基準値」は、遺伝子の発現量のデータの蓄積から適宜設定することができる。具体的には、予後が良好でない患者と予後が良好である患者とを精度良く分類することができる閾値であり得る。たとえば、基準値は、予後が既知である複数の患者の遺伝子の発現量を測定し、予後が良好でない患者群と予後が良好である患者群を最も精度良く分類することができる値となる。本実施形態の方法により予後が未知である患者の遺伝子の発現量を測定し、基準値と比較することによって予後が良好か、良好でないかを判定することができる。
本実施形態において、基準値は、複数の検体についてマイクロアレイによって測定された遺伝子の発現量の対数(底＝２)の平均値を用いてROC解析を行い、得られたROC曲線に基づいて設定された閾値であり得る。本実施形態においては、予後判定の対象となる個体に由来する検体についてマイクロアレイによって測定された遺伝子の発現量の対数(底＝２)の平均値が上記の閾値である場合、当該個体の大腸癌の予後は良好ではないと判定され得る。一方、上記の閾値未満である場合、当該個体の大腸癌の予後は良好であると判定され得る。
本発明には、患者の大腸癌の予後判定をコンピュータに実行させるためのプログラム製品も含まれる。このようなプログラム製品としては、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体などが例示される。
たとえば、以下のような工程をコンピュータに実行させるためのプログラムが例示される。
大腸癌患者から採取された生体試料における、遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程；
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程。
大腸癌患者から採取された生体試料における、遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程；
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程。
以下に、本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図１は、患者の大腸癌の予後判定に用いる診断補助装置の一例を示した概略図である。図１に示された診断補助装置１０は、測定装置２０と、前記測定装置２０と接続された判定装置３０とを含んでいる。
本実施形態においては、測定装置２０は、マイクロアレイ用の測定装置であり得る。この測定装置２０は、遺伝子の発現量そのものおよびマイクロアレイの蛍光の色相や蛍光強度のような遺伝子の発現量に関連する情報を取得することができる。大腸癌患者から採取された生体試料を測定装置２０にセットすると、測定装置２０は、前記生体試料における遺伝子の発現量に関連する情報を取得し、得られた情報を判定装置３０に提供することができる。
判定装置３０は、コンピュータ本体３００と、キーボードやマウスからなる入力部３０１と、ＬＣＤやＣＲＴからなり検体情報や判定結果などを表示する表示部３０２とを含む。判定装置３０は、測定装置２０から、それぞれ遺伝子の発現量に関連する情報を取得する。そして、判定装置３０は、これらの情報に基づいて、被検者の大腸癌の予後を判定するプログラムを実行する。入力部３０１から、後述する「１遺伝子判定を行なう」、「３遺伝子判定を行なう」等を入力することができる。
なお、判定装置３０は、図１に示されるように測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、判定装置３０は、それ自体で診断補助装置１０であり得る。
なお、判定装置３０は、図１に示されるように測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、判定装置３０は、それ自体で診断補助装置１０であり得る。
図２は、判定装置３０のコンピュータ本体３００のソフトウェアを機能ブロックで示すブロック図である。図２に示されるように、コンピュータは、取得部３２１と、記憶部３２２と、算出部３２３と、判定部３２４と、出力部３２５とを備える。取得部３２１は、測定装置２０と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。判定部３２４には、入力部３０１を介して大腸癌の予後判定の実施に必要な情報、具体的には１遺伝子判定を行なうか否かに関する情報および／または３遺伝子判定を行なうか否かに関する情報を入力することができる。
取得部３２１は、測定装置２０から提供された情報を取得する。記憶部３２２は、判定に必要な基準値および遺伝子の発現量を算出するための式や処理プログラムなどを記憶する。算出部３２３は、取得部３２１で取得された情報を用い、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。判定部３２４は、取得部３２１によって取得されたか、または算出部３２３によって算出された遺伝子の発現量が、記憶部３２２に記憶された基準値以上であるか否かを判定する。出力部３２５は、判定部３２４による判定結果を、被検者の大腸癌の予後判定結果として表示部３０２へ出力する。
図３は、図２に示すコンピュータ本体３００のハードウェア構成を示すブロック図である。図３に示されるように、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読出装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読出装置３１５、通信インターフェイス３１６および画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１に記憶されているプログラムおよびＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０がプログラムを実行することにより、図２に示す各機能が実行される。これにより、判定装置３０が、被検者の大腸癌の予後を判定するための判定装置として機能する。
ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、前述のようにＣＰＵ３１０によって実行されるプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１およびハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被検者の大腸癌の予後を判定するためのプログラム)などのプログラムおよび当該プログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラムまたはデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、当該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
次に、診断補助装置１０による、被検者の大腸癌の予後判定の処理手順を説明する。
図４は、大腸癌の予後判定のフローチャートの一例である。ここでは、被検者由来の生体試料を用いて得られた蛍光情報から蛍光強度を算出し、得られた蛍光強度から遺伝子の発現量を算出し、得られた発現量が基準値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
図４は、大腸癌の予後判定のフローチャートの一例である。ここでは、被検者由来の生体試料を用いて得られた蛍光情報から蛍光強度を算出し、得られた蛍光強度から遺伝子の発現量を算出し、得られた発現量が基準値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
まず、ステップＳ１−１において、診断補助装置１０の取得部３２１は、測定装置２０からSCEL遺伝子、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子の発現量に関連する蛍光情報を取得する。
次に、ステップＳ１−２において、算出部３２３は、取得した蛍光情報から蛍光強度を算出し、記憶部３２２に送信する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３２３は、記憶された蛍光強度に基づき、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。
その後、ステップＳ１−４において、判定部３２４は、ステップＳ１−３で算出された発現量が、記憶部３２２に記憶された基準値以上であるか否かの判定を行う。ここで、発現量が基準値以上であるとき、ルーチンはステップＳ１−５に進行する。そして、判定部３２４は被検者の大腸癌の予後が良好でないことを示す判定結果を出力部３２５に送信する。一方、発現量が基準値未満であるとき、ルーチンはステップＳ１−６に進行する。そして、判定部３２４は被検者の大腸癌の予後が良好であることを示す判定結果を出力部３２５に送信する。
最後に、ステップＳ１−７において、出力部３２５は、被検者の大腸癌の予後判定結果を出力し、表示部３０２に表示させる。これにより、診断補助装置１０は、被検者の大腸癌の予後が良好であるのか、または良好でないのかについて診断することを補助する情報を医師などに提供することができる。
この実施形態において、予後判定に用いる遺伝子は、SCEL遺伝子のみであってもよいし、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに加えた２つ以上であってもよい。
また、別の実施形態では、予後判定に用いる遺伝子をユーザが選択できるようにしてもよい。図５を例として、このような処理手順について説明する。ここでは、SCEL遺伝子のみを用いるか(１遺伝子判定)、SCEL遺伝子、MGAT3遺伝子およびSLC4A11遺伝子を用いるか(３遺伝子判定)、あるいは、SCEL遺伝子、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子を用いるか(７遺伝子判定)をユーザが選択できる。
まず、ステップＳ２−１において、入力部３０１から「１遺伝子判定を行なう」と入力された場合には、ルーチンはＳ２−３に進行する。そして、判定装置３０の取得部３２１は、測定装置２０からSCEL遺伝子の発現量に関連する蛍光情報を取得する（１遺伝子判定）。
一方、「１遺伝子判定を行なう」と入力されていない場合には、ルーチンはＳ２−２に進行する。そして、ステップＳ２−２において、入力部３０１から「３遺伝子判定を行なう」と入力された場合には、ルーチンはＳ２−４に進行する。その後、診断補助装置１０の取得部３２１は、測定装置２０からSCEL遺伝子、MGAT3遺伝子およびSLC4A11遺伝子の発現量に関連する蛍光情報を取得する（３遺伝子判定）。
ステップＳ２−２において、「３遺伝子判定を行なう」と入力されていない場合には、ルーチンはＳ２−５に進行する。そして、診断補助装置１０の取得部３２１は、測定装置２０からSCEL遺伝子、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子の発現量に関連する蛍光情報を取得する（７遺伝子判定）。
次に、ステップＳ２−６において、算出部３２３は、取得した蛍光情報から蛍光強度を算出し、記憶部３２２に送信する。そして、ステップＳ２−７において、算出部３２３は、記憶された蛍光強度に基づき、記憶された式にしたがって、遺伝子の発現量を算出する。
その後、ステップＳ２−８において、判定部３２４は、ステップＳ２−７で算出された発現量が、記憶部３２２に記憶された基準値以上であるか否かの判定を行う。ここで、発現量が基準値以上であるとき、ルーチンはステップＳ２−９に進行する。そして、判定部３２４は被検者の大腸癌の予後が良好でないことを示す判定結果を出力部３２５に送信する。一方、発現量が基準値未満であるとき、ルーチンはステップＳ２−１０に進行する。そして、判定部３２４は被検者の大腸癌の予後が良好であることを示す判定結果を出力部３２５に送信する。
最後に、ステップＳ２−１１において、出力部３２５は、被検者の大腸癌の予後判定結果を出力し、表示部３０２に表示させる。これにより、診断補助装置１０は、被検者の大腸癌の予後が良好であるのか、または良好でないのかについて診断することを補助する情報を医師などに提供することができる。
本発明には、被検者の大腸癌の予後判定に適する判定装置も含まれる。
なお、記憶部３２２は、以下の工程を判定装置３０に実行させるためのプログラムを記録している：
大腸癌患者から採取された生体試料における遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程；
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程。
大腸癌患者から採取された生体試料における遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程；
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程。
本実施形態においては、マイクロアレイにより測定した遺伝子の発現量に関する情報を取得し、取得した情報に基づいて、被検者の大腸癌の予後が判定され得る。例えば、被検者の大腸癌の予後が良好である、または、良好でない、との判定結果を提供することができる。上記の判定結果を医師等に提供することによって、大腸癌の予後についての医師等による診断を補助することができる。
実施例１：７遺伝子を用いる大腸癌の予後判定(トレーニングセット)
（１）マーカーの探索
簇出マーカーの探索は以下の手順に沿って行った。具体的には、まず、簇出がみられる大腸癌組織3検体の先進部および基底部の合計2カ所ずつについて、(1)マイクロアレイ(Affymetrix製)測定における発現値の平均が200以上である23,509遺伝子を選択した。次いで、(2) 3検体における先進部および基底部間の発現比の最低値が2以上である73遺伝子(簇出がある先進部の方が基底部よりもおよそ２倍発現量が多い遺伝子)を選択した。その後、(3) 先進部および組織全体間の発現比が1以上である34遺伝子(簇出がある先進部の方が、組織全体より発現量が多い遺伝子)を選択した。
（１）マーカーの探索
簇出マーカーの探索は以下の手順に沿って行った。具体的には、まず、簇出がみられる大腸癌組織3検体の先進部および基底部の合計2カ所ずつについて、(1)マイクロアレイ(Affymetrix製)測定における発現値の平均が200以上である23,509遺伝子を選択した。次いで、(2) 3検体における先進部および基底部間の発現比の最低値が2以上である73遺伝子(簇出がある先進部の方が基底部よりもおよそ２倍発現量が多い遺伝子)を選択した。その後、(3) 先進部および組織全体間の発現比が1以上である34遺伝子(簇出がある先進部の方が、組織全体より発現量が多い遺伝子)を選択した。
そして、(4) 前記3検体を含む大腸がん組織85検体を用いて、上記の34遺伝子のうち、簇出陽性検体(グレード3)：26例と陰性検体(グレード1): 44例との間のT検定で、有意差(p<0.05)があり、且つ簇出陽性検体において発現が上昇している7遺伝子を選択した。選択された７つの遺伝子およびそれらの発現量測定に用いたプローブセットのIDを下記の表１に示す。また、各プローブの塩基配列(いすれもアンチセンス鎖)を配列番号８〜84で表す。
上記で算出した発現量の対数（底＝２）の平均値（以下、Budding Signature Score；BSSと称する；具体的な計算式を下記に示す）と、病理診断による簇出グレードとの相関を図６に示す。ここで、簇出グレードは、日本癌治療学会のがん診療ガイドラインにおける［簇出のGrade］に定義されるとおりに定めた。すなわち、検体中の簇出が最も高度な領域を選択後、20×10倍視野で癌発育先進部を観察し、簇出の数をカウントした結果、その数が0〜4個である場合にGrade 1とし、5〜9個である場合にGrade 2とし、10個以上である場合にGrade 3とした。図６から、簇出グレードの上昇に伴い、BSSが上昇することがわかった。すなわち、簇出グレードが高いほど、遺伝子が多く発現していることがわかった。
（２）予後判定
上記で算出したBSS値を用いて85検体についてROC解析を行い、閾値を設定した。結果を図７に示す。図７のROC曲線でsensitivity, specificityが最も高くなる値(ROC曲線上で(感度, 特異度)＝(1,1)に最も近くなる点に対応)を閾値(8.436)とした。曲線下面積(Area under the curve, AUC)は、0.602であった。
上記で算出したBSS値を用いて85検体についてROC解析を行い、閾値を設定した。結果を図７に示す。図７のROC曲線でsensitivity, specificityが最も高くなる値(ROC曲線上で(感度, 特異度)＝(1,1)に最も近くなる点に対応)を閾値(8.436)とした。曲線下面積(Area under the curve, AUC)は、0.602であった。
次いで、上記閾値以上のBSSを示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで生存期間を比較した。結果を図８に示す。図８に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と閾値未満のBSSを示す検体とでは、生存可能性(Probability)の観点から有意差(p = 0.0479)が認められた。以上より、SCEL遺伝子、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子およびWNT11遺伝子の７つの遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌患者の予後が高リスクであるか、または低リスクであるかについて判定することができることが示唆された。
実施例２：７遺伝子を用いる大腸癌の予後判定(バリデーションセット)
上記７つの遺伝子の大腸癌予後マーカーとしての有用性について、公開されている大腸癌の遺伝子発現量データを用いて、さらに検証した。データは公共データベースであるGene Expression Omunibus（GEO）のGE39582（461検体）を用いた（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39582）。
実施例1と同様にしてROC解析を行い、閾値(7.686, AUC = 0.5752)を設定し、上記閾値以上のBSSを示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで生存期間を比較した。結果を図９および１０に示す。図１０に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、無病生存率(Disease Free Survival)の観点から有意差(p = 0.000473)が認められた。この結果は、実施例１の結果を再現している。よって、上記の７つの遺伝子が大腸癌の予後マーカーとして有用であることが確認された。
上記７つの遺伝子の大腸癌予後マーカーとしての有用性について、公開されている大腸癌の遺伝子発現量データを用いて、さらに検証した。データは公共データベースであるGene Expression Omunibus（GEO）のGE39582（461検体）を用いた（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39582）。
実施例1と同様にしてROC解析を行い、閾値(7.686, AUC = 0.5752)を設定し、上記閾値以上のBSSを示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで生存期間を比較した。結果を図９および１０に示す。図１０に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、無病生存率(Disease Free Survival)の観点から有意差(p = 0.000473)が認められた。この結果は、実施例１の結果を再現している。よって、上記の７つの遺伝子が大腸癌の予後マーカーとして有用であることが確認された。
実施例３：３遺伝子を用いる大腸癌の予後判定
本発明者は、SCEL遺伝子、MGAT3遺伝子およびSLC4A11遺伝子の３遺伝子について、実施例２と同じデータベースを用いて、実施例２と同様の実験を行った。具体的には、実施例２と同様にしてROC解析を行い、閾値(6.112, AUC = 0.5828)を設定し、上記閾値以上のBSS (３遺伝子測定の場合のBSSの具体的な計算式を下記に示す)を示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで無再発生存期間(r.f.s. delay、日数)を比較した。結果を図１１および１２に示す。図１２に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、生存可能性の観点から有意差(p = 0.000684)が認められた。よって、上記の３つの遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定することができることが示された。
本発明者は、SCEL遺伝子、MGAT3遺伝子およびSLC4A11遺伝子の３遺伝子について、実施例２と同じデータベースを用いて、実施例２と同様の実験を行った。具体的には、実施例２と同様にしてROC解析を行い、閾値(6.112, AUC = 0.5828)を設定し、上記閾値以上のBSS (３遺伝子測定の場合のBSSの具体的な計算式を下記に示す)を示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで無再発生存期間(r.f.s. delay、日数)を比較した。結果を図１１および１２に示す。図１２に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、生存可能性の観点から有意差(p = 0.000684)が認められた。よって、上記の３つの遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定することができることが示された。
実施例４：SCEL遺伝子を用いる大腸癌の予後判定
SCEL遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後判定を行うことが可能か否かについて検証した。すなわち、SCEL遺伝子について、実施例２と同じデータベースを用いて、実施例２と同様の実験を行った。具体的には、実施例２と同様にしてROC解析を行い、閾値(5.300, AUC = 0.6003)を設定し、上記閾値以上のBSS (３遺伝子測定の場合のBSSの具体的な計算式を下記に示す)を示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで無再発生存期間(日数)を比較した。結果を図１３および１４に示す。図１４に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、生存可能性の観点から有意差(p = 0.000702)が認められた。よって、SCEL遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定することができることが示された。
SCEL遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後判定を行うことが可能か否かについて検証した。すなわち、SCEL遺伝子について、実施例２と同じデータベースを用いて、実施例２と同様の実験を行った。具体的には、実施例２と同様にしてROC解析を行い、閾値(5.300, AUC = 0.6003)を設定し、上記閾値以上のBSS (３遺伝子測定の場合のBSSの具体的な計算式を下記に示す)を示す検体と、上記閾値未満のBSSを示す検体とで無再発生存期間(日数)を比較した。結果を図１３および１４に示す。図１４に示されるように、閾値以上のBSSを示す検体と、閾値未満のBSSを示す検体とでは、生存可能性の観点から有意差(p = 0.000702)が認められた。よって、SCEL遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定することができることが示された。
１０ 診断補助装置
２０ 測定装置
３０ 判定装置
４０ 記録媒体
３００ コンピュータ本体
３０１ 入力部
３０２ 表示部
３１０ ＣＰＵ
３１１ ＲＯＭ
３１２ ＲＡＭ
３１３ ハードディスク
３１４ 入出力インターフェイス
３１５ 読出装置
３１６ 通信インターフェイス
３１７ 画像出力インターフェイス
３１８ バス
３２１ 取得部
３２２ 記憶部
３２３ 算出部
３２４ 判定部
３２５ 出力部
２０ 測定装置
３０ 判定装置
４０ 記録媒体
３００ コンピュータ本体
３０１ 入力部
３０２ 表示部
３１０ ＣＰＵ
３１１ ＲＯＭ
３１２ ＲＡＭ
３１３ ハードディスク
３１４ 入出力インターフェイス
３１５ 読出装置
３１６ 通信インターフェイス
３１７ 画像出力インターフェイス
３１８ バス
３２１ 取得部
３２２ 記憶部
３２３ 算出部
３２４ 判定部
３２５ 出力部
Claims (9)
- 大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する工程と、を含む大腸癌の予後診断を補助する方法。 - 前記判定工程において、
前記発現量又はその対数を所定の基準値と比較し、
前記発現量又はその対数が前記基準値以上の場合は予後が良好でないと判定され、前記発現量又はその対数が前記基準値未満の場合は予後が良好であると判定する、請求項１に記載の方法。 - 前記測定工程において、MGAT3遺伝子、SLC4A11遺伝子、MSLN遺伝子、FOXC1遺伝子、RUNX2遺伝子及びWNT11遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現量をさらに測定し、
前記判定工程において、前記測定工程で測定された遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する、請求項１に記載の方法。 - 前記測定工程において、MGAT3遺伝子およびSLC4A11遺伝子の発現量をさらに測定し、
前記判定工程において、前記測定工程で測定された遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する、請求項１に記載の方法。 - 前記測定工程において、さらにMSLN遺伝子の発現量、FOXC1遺伝子の発現量、RUNX2遺伝子の発現量及びWNT11遺伝子の発現量を測定し、
前記判定工程において、前記測定工程で測定された遺伝子の発現量に基づいて、大腸癌の予後を判定する、請求項４に記載の方法。 - 前記判定工程において、
前記測定工程で測定された遺伝子の発現量の対数を算出し、
前記対数と所定の基準値とを比較し、
前記対数が前記基準値以上の場合は予後が良好でないと判定され、前記対数が前記基準値未満の場合は予後が良好であると判定する、請求項１記載の方法。 - 前記判定工程において、
前記測定工程で測定された遺伝子の発現量の平均値またはその対数を算出し、
前記平均値または対数と所定の基準値とを比較し、
前記平均値または対数が前記基準値以上の場合は予後が良好でないと判定され、前記平均値または対数が前記基準値未満の場合は予後が良好であると判定する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。 - コンピュータに、
大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程と、
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程と、
を実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。 - プロセッサとメモリとを含むコンピュータを少なくとも備え、
前記メモリには、
大腸癌患者から採取された生体試料における、SCEL遺伝子の発現量に関連する情報を測定装置から取得する工程と、
取得した情報に基づいて、前記患者の大腸癌の予後を判定する工程と、
を前記コンピュータに実行させるためのプログラムが記録されている、大腸癌の予後を判定する判定装置。
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| JP2018038351A (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 乳癌の予後の診断補助方法、ならびに乳癌の予後の診断補助のためのキットおよび装置 |
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- 2016-02-22 WO PCT/JP2016/055124 patent/WO2016136684A1/ja active Application Filing
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