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JP2013525838A - 試料表面を結像する装置 - Google Patents

試料表面を結像する装置 Download PDF

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Abstract

本発明は、共焦点顕微鏡法により、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法により、実質的に共焦点の平面ないし焦点平面で、表面のトポグラフィを有する試料(16)の面を、特に表面を結像する方法に関する。本発明は、前記装置が特に表面トポグラフィセンサである機構を含んでおり、前記機構により、特に前記表面トポグラフィセンサにより、表面のトポグラフィの値が決定され、表面のトポグラフィの前記値を用いて結像されるべき面が、特に表面が、共焦点顕微鏡法による走査時に、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法による走査時に、共焦点の平面へと移されることを特徴とする。
【選択図】図1b

Description

本発明は、共焦点顕微鏡法を用いて表面の実質的に点状の多数の領域を走査することによって、面を、特に試料の表面を結像する装置に関する。共焦点顕微鏡法では画像平面にある検出器によって、表面の実質的に点状の領域の共焦点結像が行われる。特に本発明は、いわゆる共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡に関し、ないしは、共焦点の蛍光顕微鏡法および/またはラマン顕微鏡法のための装置に関するものであるが、これに限定されるものではない。
面を、特に表面を結像する装置のほか、共焦点顕微鏡法または共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法によって結像することができる表面のトポグラフィを判定する装置も記載される。ラマン測定ないし蛍光測定により、たとえばレーザ光源のような光源で試料を励起させ、試料から放出されるラマン信号ないしは蛍光信号に基づき、化学的に相違している試料の材質を結像することが可能である。
共焦点顕微鏡法では、光源の光が試料までの経路上で対物レンズを通るように案内され、そのようにして、実質的に点状の領域に集束され、ないしは試料表面の点に集束される。それと同時に対物レンズは、試料から放出される光を、特に放出されるラマン光ないし蛍光を受けとめて、これを検出器へ案内する役目を果たすことができる。つまり対物レンズを用いて、試料の点ないし実質的に点状の領域を、照明光路および/または検出光路の方向に対して実質的に垂直に共焦点で結像することが可能である。試料ないし対物レンズないし照明を移動させれば、x−y方向のスキャンを行い、そのようにして試料全体を走査することが可能である。共焦点の結像では、実質的に点状の光源、好ましくはレーザ光源が、波としての光の性質から生じる焦点に結像され(アッベの条件)、ないしは実質的に点状の領域に結像され、理想的な場合には試料の点に結像される。次いで、この画点が好ましくは同一の光学系により、すなわち同じ対物レンズにより、検出器の手前にある穴あき板へ、いわゆるピンホールへ集束される。検出器の手前に別個のピンホールを配置する代わりに、検出器自体がピンホールをなすことも可能である。共焦点の結像を顕微鏡法に応用すると、画像コントラストの大幅な向上を実現することができる。対物レンズの焦点平面だけしか結像に寄与しないからである。
共焦点の測定は、たとえばラマン測定および/または蛍光測定のような多くの用途で利点を有している。存在する散乱光背景が非常に強く抑圧されるからである。しかし共焦点の測定ないし共焦点の顕微鏡法で問題となるのは、ドリフト、試料の起伏、粗さ、あるいは試料の傾動などのために、結像されるべき平面ないし面が、特に表面が、試料を走査するときにしばしば焦点平面にとどまっていないことである。
共焦点の光学顕微鏡法に関しては、共焦点対物レンズを備える顕微鏡が詳細に説明されている特許文献1を参照されたい。
共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡は、後に公開された特許文献2から公知となっている。
特許文献3より、共焦点顕微鏡と組み合わされたAFM顕微鏡またはSTM顕微鏡が公知となっている。AFM探針により、特許文献3から知られている顕微鏡では、特にz方向でも試料を走査することができる。
特許文献3では、AFM探針を用いて深度情報が取得される。AFM測定中に、特にAFMトポグラフィ測定中に、光学信号も記録されるので、AFMトポグラフィ測定から得られたトポグラフィデータを光学データと相関づけることができる。特許文献3では、共焦点測定は常にトポグラフィ測定と同時に行われる。特許文献3の欠点は、x−y平面で100μmから最大300μmの範囲内にある制約されたスキャン領域にある。さらにAFM探針によっては、z方向で最大5−10μmの範囲内でしか深度情報を利用することができない。このように特許文献3は、>300μmの試料範囲および>10μmの粗さの測定を可能にするものではない。
表面における、特に>300μmの比較的広い試料範囲における、および工業的な表面における共焦点顕微鏡法では、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法では、結像が非常に困難にしか可能でないという問題が生じる。十分に平坦ではない試料トポグラフィがしばしば与えられるからである。その場合、所定の平面でのスキャンのとき、いわゆるX−Yスキャンのとき、試料表面が再三にわたって顕微鏡の焦点平面から外に出るために、試料表面ないし試料の簡単で完全な結像が可能ではない。
ドイツ特許出願公開第19902234A1号明細書 ドイツ特許出願公開第102009015945A1号明細書 米国特許第5,581,082号明細書
したがって本発明の課題は、従来技術の欠点を回避することができる装置を提供することにある。特に本発明は、平面ないし面を、特に試料の表面を、共焦点で結像し、すなわち共焦点顕微鏡法により結像することを可能にすることが意図される。このことは、十分に平坦でない試料トポグラフィをもつ試料でも、たとえば湾曲した試料でも、可能であるのが望ましい。
本発明によるとこの課題は、本発明の第1の態様においては、共焦点顕微鏡法により、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法により、平面ないし面、特にトポグラフィをもつ試料表面を結像する装置が提供されることによって解決され、表面のトポグラフィの値が表面トポグラフィセンサによって、好ましくは非触覚式の表面センサによって判定され、表面のトポグラフィの値を用いて、結像されるべき面が、特に表面が、走査時に共焦点顕微鏡法の、特にラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法の共焦点平面へと移される。
好ましくは非触覚式のセンサによる、本発明に基づく表面トポグラフィの判定は、後続するラマン測定のときに表面にとどまるか、または定義された深度で測定をすることを可能にする。
本発明の第1の実施形態(2段階の方法)では、測定されたトポグラフィが記憶され、処理され、引き続いて追従される。
本発明の第2の実施形態では、試料を焦点に(またはこれと平行な平面に)保つために制御が適用される(1段階の方法)。
共焦点顕微鏡法による、特にラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法による平面ないし面、特に表面の結像は、平面ないし面の、特に表面の実質的に点状の多数の領域の走査によって、平面ないし面の、特に表面の実質的に点状の領域を焦点平面で検出器に共焦点結像する装置により実現される。
上に説明したとおり、表面トポグラフィの値が既知となったとき、試料を2通りの仕方で共焦点の平面ないし焦点平面に保つことができる。
本発明の第1の実施形態(2段階の方法)では、まず試料の結像されるべき部分が走査され、その際に表面トポグラフィの値が記録され、これに引き続いて、表面トポグラフィを考慮したうえで、試料平面が結像されることが意図される。表面トポグラフィの値は、この装置においては結像されるべき平面が試料の共焦点顕微鏡による走査時に、特に共焦点のラマン顕微鏡または蛍光顕微鏡による走査時に、試料の起伏や湾曲に関わりなく、共焦点顕微鏡の焦点平面にとどまるように試料を移動させるために利用される。
本件出願において表面のトポグラフィが意味するものについて、ないし試料トポグラフィが意味するものについて、共焦点クロマティックセンサを備える共焦点ラマン顕微鏡を取りあげて説明するが、これは一例であり完結するものではない。試料トポグラフィとは、このような種類の共焦点クロマティックセンサを備える構成においては、1nmよりも大きい、特に10nmよりも大きい、好ましくは100nmよりも大きい試料起伏を意味している。
粗さとは、本件出願においては、実質的にz方向の試料起伏であって、特に共焦点クロマティックセンサの光スポットの横方向長さに基づいて解像することができないものを意味している。このことは、たとえば共焦点クロマティックセンサを備えるラマン顕微鏡では、たとえば100nmよりも小さい、好ましくは10nmよりも小さい、特に1nmよりも小さい、すなわちサブμm単位の、実質的にz方向の試料起伏である。
平面を結像するとき、第1のステップでは、試料の実質的に点状の多数の領域について表面のトポグラフィの値が判定され、そこから試料の表面トポグラフィが決定され、第2のステップでは、試料が実質的に点状の多数の領域で、ステップ1で判定された表面トポグラフィの値を考慮したうえで、共焦点顕微鏡法の共焦点平面へと移される。これは2段階のプロセスであり、まず表面トポグラフィが決定されてから、共焦点顕微鏡法が実施される。
別案の実施形態では、まず試料の実質的に点状の領域で表面トポグラフィの値が決定され、結像されるべき平面の焦点平面ないし共焦点平面へと試料が移され、引き続いてこの領域が共焦点で、たとえば共焦点ラマン顕微鏡法または蛍光顕微鏡法により結像される。このようにして、試料全体を走査することができる。このような種類の装置は次のような特徴がある。
−走査のときに試料がまず実質的に点状の領域に移され、表面のトポグラフィの値が決定され、トポグラフィの値を用いて試料が共焦点平面へ移動させられ、実質的に点状の領域が結像される。
−実質的に点状の領域の結像後、次のステップでは、実質的に点状の別の領域へ試料が移動させられ、そこで同じく表面のトポグラフィの別の値が決定され、トポグラフィのこの別の値を用いて試料が共焦点平面へ移動させられ、実質的に点状の別の領域が結像され、平面ないし面、特に表面の少なくとも1つの部分が走査されるまでこれらのステップが反復される。
表面トポグラフィの値の判定が表面トポグラフィセンサによって、特に非触覚式の表面トポグラフィセンサによって、たとえば共焦点クロマティックセンサによって行われると特別に好ましい。
ここでは一例として共焦点クロマティックセンサを表面トポグラフィセンサとして挙げているが、本発明は決してこれに限定されるものではない。
表面トポグラフィセンサは、試料表面のトポグラフィに関する情報を取得することができる、あらゆる形式の無接触式の(触覚式でない)ないし接触式の(触覚式の)センサであってよい。触覚式センサの例は、たとえばいわゆるプロフィロメータと呼ばれる表面トポグラフィセンサや触針装置である。
非接触式ないし非触覚式のセンサの例は、基本的に、光学式のセンサや、白色光干渉計、三角測量法センサ、レーザ・スキャニング・システムなどに基づく表面トポグラフィセンサ、あるいは上述した共焦点クロマティックセンサである。
共焦点クロマティックセンサは、白色光で照射されたときに異なる波長の光が異なる焦点平面で結像されることを特徴としている。反射されて異なる焦点平面で結像された光がピンホールを通って分光計に結像され、分光計によって評価されると、この信号から、たとえば共焦点クロマティックセンサから試料の表面までの距離を直接決定し、それに伴って表面トポグラフィを判定することができる。
その際に利用されるのは、焦点平面に試料表面が存在している波長が、たとえば分光計で強度最大値を示すことである。このことは、分光計で各々の波長に1つの試料間隔を割り当てることを可能にする。このように共焦点クロマティックセンサを用いて、純粋に光学式に、迅速かつ直接的に試料のトポグラフィを決定することが可能である。
共焦点クロマティックセンサは、試料表面トポグラフィの光学式の決定を可能にし、それに伴って十分に平坦でないトポグラフィの場合でも、試料の走査と試料表面の共焦点結像を可能にする。
特に共焦点クロマティックセンサを用いて、たとえばラマン顕微鏡において焦点平面ないし共焦点平面をトラッキングし、そのようにして特徴のある、すなわち平坦でない試料トポグラフィの場合でも、共焦点ラマン顕微鏡法を実施することが可能である。1つの特別な実施形態では、表面トポグラフィセンサの位置信号が、共焦点平面ないし焦点平面の調節のために利用される。共焦点クロマティックセンサは、光学システム、特に色収差の大きいレンズシステムを含んでいるのが特別に好ましい。レンズシステムにおいて色収差ないしクロマティックアベレーションとは、レンズで使用される材料の屈折率の波長依存性によって引き起こされる誤差を意味している。大きい色収差を生成するための光学コンポーネントとしてのレンズに代えて、回折コンポーネントを共焦点クロマティックセンサで使用することもできる。屈折コンポーネントのガラスの屈折率の波長依存性の結果として、焦点距離も波長依存性を有することになり、すなわち、共焦点平面は異なる波長について異なる地点に位置することになる。
共焦点クロマティックセンサに関しては、たとえばドイツ国94496オルテンブルク、ケーニヒスバッハーシュトラーセ15所在のMicro−Epsilon Messtechnik GmbH & Co.KG社(www.micro−epsilon.de)の共焦点クロマティックセンサを援用し、インターネットページの開示内容を全面的に本件出願に引用する。共焦点クロマティックセンサは、1nm以上1μmまで、好ましくは1nm以上100nmまでの範囲内の解像度の走査測定に特別に適している。このセンサは高い測定精度に基づき、およびそれと同時にたとえば100μmから40mm、特に120μmから21mm、きわめて好ましくは40μmから12mmに達する広い測定範囲に基づき、再焦点合わせをする必要がないからである。x−y平面の光スポットは、測定領域に応じてたとえば0.1μmから1mm、好ましくは7μmから150μm、特に10μmから100μmの範囲の大きさを有しており、ならびに、センサに応じて100μm以上から200mmにまで達する広い作業間隔を有している。
第1の装置について先ほど説明したとおり、2段階のプロセスでは、まず試料表面が共焦点クロマティックセンサにより測定され、次いで、このトポグラフィが共焦点光学測定で、たとえば共焦点ラマン顕微鏡法で追従される。このようにして試料の事前設定された平面が、たとえば表面が、共焦点で結像される。
単色でない光源の光が、好ましくは広帯域の光源の光が、共焦点クロマティックセンサにおいて回折レンズシステムにより試料表面の実質的に点状の領域へ光スポットとして案内され、試料によって反射されて集められ、分光計によって評価され、共焦点平面に試料表面が存在している波長が、分光計で強度最大値を示す。単色でない、好ましくは広帯域の光源は、白色光源すなわち可視波長領域の広帯域光源であるのが好ましい。あるいは、可視光を発するのではない広帯域光源、たとえば赤外波長領域または紫外波長領域のものも考えられる。このような種類の試料表面の照明は、共焦点クロマティックセンサの光路とたとえばラマン顕微鏡の光路を切り離し、ラマン顕微鏡を用いたラマン測定についてもクロマティックセンサについても同じ対物レンズを利用する可能性を与えることになる。
それにより、分光計を用いてセンサから試料表面までの間隔を決定することが可能である。各々の波長に、ちょうど1つの試料間隔を割り当てることが可能だからである。
共焦点クロマティックセンサを用いた表面トポグラフィの値の決定のほか、それ以外の可能性も考えられる。たとえば共焦点クロマティックセンサによって表面トポグラフィを決定するのではなく、試料をz方向に沿ってたとえば周期的に動かすことも可能であろう。それにより、試料はz方向で周期的に焦点を通って動くことになる。試料の周期的な運動により、試料表面に対して垂直の方向で、すなわちz方向で、平均値を得ることができ、そのようにして、試料表面の常に鮮明な画像を比較的均等な強度で得ることができる。このような装置は、エクステンデッドフォーカス装置ないし拡張焦点装置とも呼ばれる。ただしその場合、試料の粗さないしトポグラフィの運動に合わせて変調深度を適合化することが必要である。
先ほど説明したように、焦点決定のための試料の運動、いわゆる拡張焦点測定は、自動式の焦点トラッキングと組み合わせることもできる。その場合、非常に粗い試料の場合に変調深度をあまりに大きく選択しなくてすむようにするために、変調すなわち周期運動の中心がz方向でトラッキングされる。その際には、変調中に光源の焦点が表面を通って動くことが利用される。そのときに検出される信号は、最大値の位置が表面への理想的な焦点合わせに一致するガウス曲線に近似している。そして最大強度の位置をコントローラに与えれば、このことは、変調の中心をトラッキングすることを可能にする。このような方式の測定により、やはり試料のトポグラフィを決定することができる。変調された信号における強度最大値は、試料トポグラフィと相関関係にあるからである。
表面粗さを補償するためのz方向への試料の運動は、共焦点クロマティックセンサにより決定される表面トポグラフィに基づく試料のトラッキングに重ね合わされていてもよい。これら両方の装置の組み合わせは、試料の表面トポグラフィを考慮に入れると同時に、表面粗さを補償することを可能にする。このようなトラッキングは、たとえば本出願の図6に詳細に示されている。同所の説明を援用する。
共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡は、試料で光エミッションを励起するための光源と、光エミッションにより放出される光子、特に放出されるラマン光子および/または蛍光光子を検出するための検出器とを含んでいるのが特別に好ましい。
この装置に加えて本発明は、表面の実質的に点状の領域を検出器で焦点平面に共焦点結像する機構を含む、表面の実質的に点状の多数の領域の走査によって試料の表面を結像する装置も提供するものであり、この装置は表面トポグラフィセンサを有しているのが好ましい。表面トポグラフィセンサは、1つの実施形態では、1つの独立した機構であってよい。しかしこのことは、本発明にとって絶対に必要なわけではない。表面トポグラフィセンサとしては、表面トポグラフィすなわちたとえば試料表面と試料平面との差異を試料表面に対して垂直の方向で、すなわちz方向で測定することが可能となる、どのような種類のセンサでも適している。このような種類の表面トポグラフィセンサは、無接触式でも非接触式でもよく、すなわち触覚式の表面トポグラフィセンサであってよい。触覚式の表面トポグラフィセンサの例は、機械式のプロフィロメータ、原子間力顕微鏡(AFM顕微鏡)、たとえばWiTec GmbH社のAFM顕微鏡alpha 300A、あるいは触針装置である。
無接触式の表面トポグラフィの例は、特に白色光干渉計のような光学式のセンサ、三角測量法センサ、たとえば共焦点顕微鏡法を利用するレーザ・スキャニング・システム、共焦点クロマティックセンサなどがある。
表面トポグラフィセンサが光学式のセンサであるとき、これは第1の実施形態では、表面の実質的に点状の領域を共焦点結像する機構のほかに独立した光路を有している。
本発明の第2の実施形態では、ラマン測定のためのレーザの励起焦点は、表面トポグラフィセンサの励起焦点と同じ対物レンズを通って案内される。
本発明の特別な実施形態では、共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡の光は第1の波長領域にあり、共焦点クロマティックセンサの光は第2の波長領域にあり、第1および第2の波長領域が重なっていないと特別に好ましい。これらの波長領域が重ならないとき、これらの波長領域は、検査されるべき量の判定されたルミネセンススペクトルおよび/またはラマンスペクトルの限界によって第1の波長領域が定義され、第2の波長は第1の波長領域と重なることなく第1の波長領域の上方または下方に位置するように選択されるのが好ましい。たとえば第1の波長領域は、検査されるべき試料の判定されたルミネセンススペクトルまたはラマンスペクトルについて500nmから1100nmの範囲内、特に532nmから650nmに及ぶことができる。第2の波長領域は350nmから500nm、好ましくは400nmから500nmに及ぶ。
表面トポグラフィを決定するための触覚式の装置を、共焦点光学顕微鏡と、たとえば共焦点ラマン顕微鏡と組み合わせるとき、ラマン顕微鏡と組み合わせるための触覚式の装置としては、原子間力顕微鏡(AFM)が適している。
AFM顕微鏡に関しては、このような種類のAFMを示している国際公開第02/48644A1号パンフレットを援用する。AFMでは、特に探針の形態の走査プローブを用いて試料表面が走査される。
国際公開第02/48644A1号パンフレットの開示内容を全面的に本件出願に取り入れる。
上で説明したとおり、共焦点顕微鏡法では単色光源の光が試料へ向かう経路上で対物レンズを通って案内され、そのようにして、実質的に試料表面の一点に集束される。本装置が特に共焦点ラマン顕微鏡であるケースでは、試料から放出される光を、すなわちラマン光ないし蛍光を、分光計がスペクトル分解することが意図されていてよい。このようなスペクトル分解は分光計で、たとえばグリッドやプリズムにより行うことができる。こうして分解された光をCCDカメラで撮影すれば、試料から散乱されるラマン光ないし蛍光のスペクトル一式を記録することが可能である。ラマン顕微鏡でラマン光をスペクトル分解する利点は、たとえば分光計のグリッドの回転によって、測定をする検出器のために任意のスペクトル領域を選択できるという点にある。
本装置は、特に共焦点顕微鏡は、好ましくは共焦点ラマン顕微鏡および/または共焦点蛍光顕微鏡は、試料の移動によってたとえば試料表面を結像することを可能にする、移動可能な試料台を有することができる。その代替または追加として、試料の結像を得るために、励起光源ないし検出器も移動させることができる。試料のスペクトル特性の立体地図を記録することも可能である。特に共焦点結像により、非常に高い深度解像度が実現される。試料台の移動可能性は、試料ないし試料領域の走査を可能にする。
先ほど説明したとおり共焦点クロマティックセンサは、通常、結像をする装置に追加して配置され、すなわち独自の光路で配置される。
たとえば共焦点光学センサを用いて決定される表面トポグラフィは、通常、後続または同時に実施されるラマン測定で利用して、走査時に試料表面を常に対物レンズの焦点平面に、たとえば共焦点ラマン顕微鏡法の平面に保つために利用される。そのために試料のX−YスキャンがX−Y−Zスキャンに拡張され、Zスキャンは試料トポグラフィを補償する役目をする。
次に、実施例を参照しながら本発明について詳しく説明する。
表面トポグラフィセンサ、特に光学式の表面トポグラフィセンサを備えるラマン顕微鏡の原理的な構造であり、表面トポグラフィセンサの光路はラマン顕微鏡の光路とは異なっている。 光学式の表面トポグラフィセンサを備えるラマン顕微鏡の原理的な構造であり、ラマン測定のためのレーザの励起焦点は、光学式の表面トポグラフィセンサの励起焦点と同じ対物レンズを通って案内される。 図1bの装置による試料のトポグラフィ測定である。 共焦点クロマティックセンサを備える装置で測定された硬貨のトポグラフィである。 ラマン顕微鏡法に基づく情報と重ね合わされた、錠剤のトポグラフィ画像である。 拡張された焦点測定のための光学的な光路と、自動式の焦点トラッキングである。 共焦点ラマン画像(図5a)としての、および試料ないし対物レンズがz方向へ周期的に動くときの共焦点ラマン画像(図5b)としての、粗いシリコン表面の図像である。 共焦点ラマン画像(図5a)としての、および試料ないし対物レンズがz方向へ周期的に動くときの共焦点ラマン画像(図5b)としての、粗いシリコン表面の図像である。 自動焦点トラッキングのための制御ループの略図である。 光学的な画像およびトポグラフィ画像としての、共焦点の自動焦点トラッキングによる測定である。 光学的な画像およびトポグラフィ画像としての、共焦点の自動焦点トラッキングによる測定である。 試料および図1bの機構による測定である。 試料および図1bの機構による測定である。 試料および図1bの機構による測定である。 試料および図1bの機構による測定である。
以下においては、特に散乱ラマン光を用いて試料表面を結像する装置、いわゆる共焦点ラマン顕微鏡の実施例を取りあげて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。むしろ、本発明はあらゆる共焦点顕微鏡を含んでおり、特に、共焦点の光学顕微鏡や蛍光顕微鏡も含んでいる。このような種類の共焦点顕微鏡についても、検査されるべき試料の表面トポグラフィに特徴がある場合に共焦点平面をトラッキングするために、クロマティックセンサを利用することができる。
図1aには、試料表面を撮像するための共焦点ラマン顕微鏡の第1の実施形態の原理的な構造が示されている。共焦点ラマン顕微鏡法を用いて、回折による限界があるおよそ200ナノメートルの分解能の領域まで、液体成分や固体成分の化学的な特性や位相を分析することができる。たとえば蛍光顕微鏡法の場合のような蛍光物質による試料のマーキングは必要ない。共焦点の構造により、たとえば切断を行わなくても試料を奥深くまで分析することを可能にする奥行きの解像が提供される。
共焦点顕微鏡法では、点状の光源が、好ましくはレーザが、試料の一点で結像される。次いで、この画点が好ましくは同じ光学系によって検出器の手前の絞りへ、いわゆるピンホールへ集束される。このとき絞りの大きさは、照明画像の回折限界のある結像に合わせて適合化されていなくてはならない。そして画像は、照明源の点が試料全体にわたって走査されることによって生成され、すなわち、試料が点ごとに走査される。このような方式の結像により、画像コントラストの大幅な向上が得られる。対物レンズの焦点平面だけが結像に寄与するからである。さらに、絞りの開口による回折点の畳み込みに基づき、解像度をおよそ係数√2だけ引き下げておよそλ/3にすることができる。これに加えて、ほぼ波長の軸方向解像度で試料構造の三次元画像を得ることができる。
共焦点顕微鏡法に関してはたとえば特許文献1を参照されたい。
図1aには、一例としてドイツ国D−89081ウルム所在のWitec GmbH社の顕微鏡alpha300 Rの共焦点ラマン顕微鏡の考えられる構造が示されている。共焦点ラマン顕微鏡1では、光源10の光がビームスプリッタミラー12でビーム拡張器14の後、試料台18の上の試料16の方向へ方向転換される。方向転換された光線19は、適当な光学系21により、試料16の実質的に点状の領域20に集束される。レーザ10の光は試料16の材質と相互作用する。一方では、試料から後方散乱された、入射光と同じ波長のレイリー光が生じる。この光はビームスプリッタ12を介してエッジフィルタないしノッチフィルタ13へと方向転換されて、検出光学系には入らない。
異なる周波数をもつ光は、すなわち試料から放出されるレイリー光は、すなわちラマン光は、ビームスプリッタ12を通過する。ビームスプリッタ12を過ぎた後のラマン光は、符号22が付されている。図示しないピンホールを介して、ラマン光22は光ファイバ30に入力結合されて、分光計40に達する。分光計40では、ラマン光を含むビームが適当な光学系によって再び拡張され、グリッドスペクトルフィルタ44に当たるビーム42を生じる。グリッドスペクトルフィルタ44は、光をその波長に応じて異なる方向へ回折させ、それにより、CCDチップ50で位置依存的にスペクトル信号を記録することができる。CCDチップ50は、たとえば1024チャネルを有しており、それによりCCDチップの全部で1024チャネルが、異なる波長の光を記録することができる。
試料の画像は、x−y平面における矢印方向130での走査によって生じる。
調節ないし観察をするために、白色光源120の光を試料16へ入力結合することができる。
さらに共焦点ラマン顕微鏡1は、共焦点クロマティックセンサ80を含んでいる。共焦点クロマティックセンサ80は、共焦点ラマン顕微鏡1に追加して設置されている。共焦点クロマティックセンサは、図示した図1aの実施形態では、ラマン顕微鏡1から独立した独自の光路を含んでいる。すなわち共焦点クロマティックセンサ80は、独自の白色光源8120と、屈折光学素子8122と、試料から反射された光を記録するための光学構造と、対応するスペクトル色を認識して評価することができる感光性のセンサユニット、たとえば分光計とを有している。
白色光源8120の光は、屈折光学素子の色収差が大きいレンズシステムを通過する。このとき入射する白色光は、波長に応じて異なる焦点平面に結像される。異なる焦点平面に結像された光は試料16で反射され、たとえば光学系により受けとめられて、センサコンポーネントとしての分光計8140へ供給される。分光計8140を用いて信号を評価し、この信号を基にして、共焦点クロマティックセンサ80の屈折光学素子8122から試料16の表面までの間隔を直接決定し、それによって表面トポグラフィを判定することができる。
このとき利用されるのは、焦点平面に試料表面が存在している波長が、たとえば分光計8140で強度最大値を示すことである。強度値の決定は、分光計8140で各々の波長に試料間隔を割り当て、すなわち試料16と屈折光学素子8122の間隔を割り当てることを可能にする。このように共焦点クロマティックセンサ80を用いて、純粋に光学式に迅速かつ直接的に、すなわち試料平面に対して垂直方向すなわちz方向で時間コストのかかるスキャンをすることなく、試料のトポグラフィを決定することが可能である。
このように共焦点クロマティックセンサ80は、試料表面トポグラフィの光学式の決定を可能にする。
図1aに示す本実施例では、共焦点クロマティックセンサは独自の光路を有しているが、それが絶対に必要なわけではない。図1bに示す別案の実施形態では、共焦点クロマティックセンサの光路は、たとえば共焦点ラマン顕微鏡のような共焦点顕微鏡の光路に統合されていてよい。
図1bには共焦点ラマン顕微鏡の原理的な構造が示されており、ラマン測定のための光源ないしレーザの励起放射は、本発明の第2の実施例に基づき、トポグラフィ測定のための励起放射と平行に案内される。先ほどの図1aと同じコンポーネントには2000を足した符号が付されている。図1bに示すラマン顕微鏡2001では、ラマン効果を励起するための光源2010の光と、共焦点クロマティックセンサ2080の光はいずれも同じ光学系2029を通って、試料2016の実質的に同じ領域2020に集束される。ラマン測定のための焦点位置、すなわちラマン効果を励起するための光源2010の励起レーザ光の共焦点の焦点は、共焦点クロマティックセンサの測定領域内部で選択することができる。光源2010の光の入力結合は、ビームスプリッタ2012.1によって試料2016の方向で行われる。光線2019は、ビームスプリッタ2012.1で試料2016の方向へ方向転換されて、別のビームスプリッタ2012.2を通過する。相互作用によって試料で生成されるラマン光は、ビームスプリッタ2012.1とビームスプリッタ2012.2を両方とも通過し、ビームスプリッタ2012.2を過ぎてからは符号2022が付されている。ビームスプリッタ2012.2を過ぎてから、光線2022は検出器(図示せず)の手前のピンホール2013に集束される。クロマティックセンサ2080とレンズ2094の間の光経路に示されている楕円体2092は、クロマティックセンサ2080の焦点平面の空間的な分布を示唆している。これがレンズ2094および対物レンズ2029によって試料2016に結像される。レンズ2094と対物レンズ2029からなるこのレンズシステムの縮小によって、楕円体が圧縮される。検出器では、ラマン光がたとえばスペクトル分解されて検出される。
試料でラマン効果を励起するために利用される光源2010の光に追加して、別のビームスプリッタ2012.2を介して、共焦点クロマティックセンサ2080の光源(図示せず)の光が、ラマン効果を励起するための光と同じ光学系2029を通って試料2016へと案内される。この光線には符号2019が付されている。試料へと誘導される共焦点クロマティックセンサの光源の白色光は、符号2088が付されている。試料に入射する白色光は波長に応じて異なる焦点平面に結像されて、試料により反射される。反射された光2089は同じく別のビームスプリッタ2012.2を介して共焦点クロマティックセンサ2080へと案内されて評価され、それによって表面トポグラフィを決定する。
ラマン効果を励起するための光と共焦点クロマティックセンサの光が両方とも通過できるようにするために、異なるスペクトル領域または時間多重装置のいずれかが適用されると好ましい。たとえばクロマティック光学センサの光は400nmから500nmの波長領域にあってよく、ラマン効果を励起するための光波長は532nmであってよい。このような構成は、通常、532nmを上回るラマンスペクトルの記録を可能にすることになる。当然ながら、これ以外の波長の選択も考えられる。異なる波長領域の代替として、測定を時間的に交互に行い、時間多重装置で評価を行うこともできる。
図1bに示す構造は、共焦点クロマティックセンサ2080を用いて試料表面のトポグラフィをトラッキングすることを可能にするものであり、ラマン測定のためのレーザの励起焦点はトポグラフィと平行に案内される。試料におけるレーザの焦点位置は、クロマティックセンサ2080の検出領域の内部で任意に調整することができる。スキャナまたはステッピングモータの追従は、コントローラを介して行うこともアクチュエータを介して行うこともできる。ただし後者の場合、クロマティック光学センサ2080は高解像度の対物レンズ2029用としてキャリブレーションされていなくてはならない。
ラマン測定のほか、高解像度の対物レンズ2029単独による純粋なトポグラフィ測定も可能である。縮小結像により、クロマティック光学センサの横方向の解像度が縮小の係数だけ改善されるからである。それと同時に、トポグラフィの解像度も改善される。このような無接触式のトポグラフィ測定は、AFM(>5μm)ではトポグラフィが大きすぎる試料や、ピエゾスキャナの典型的なスキャン領域(100μm)よりも横方向の構造がはるかに大きい試料に特別に良く適している。
図1cは、クロマティック光学センサを用いて高解像度対物レンズ(50x/NA=0.8)により撮影されたトポグラフィ画像を示している。スキャン領域は500μmx500μmであり、カラースケール(黒から白へ)は0−5μmに延びている。この画像では、クロマティック光学センサ2080の位置信号によりスキャン台がz方向へ、すなわち試料表面に対して垂直に制御されている。このような種類の制御により、同時のラマン測定のときに励起レーザが試料表面に対して常に同じ間隔に保たれる。
試料台の横方向への変位すなわちx方向とy方向への変位は、ステッピングモータにより行われている。
図1aないし図1bのトポグラフィ測定ないしラマン測定の記録された光は、たとえばCCDチップ50によって評価ユニット100,2100へ伝送される。評価ユニット100,2100は、試料台18,2018の制御部の一部である。評価ユニット100,2100により、試料台18,2018のx方向とy方向とz方向の正確な位置も記録される。一般に試料16,2016の走査は、スライドテーブル110,2110として設計された試料台を変位させることによって行われる。スライドテーブルはピエゾテーブルとして構成されていてよい。スライドテーブル110およびその上に配置された試料のx方向、y方向、およびz方向への変位は圧電素子によって行うことができる。
試料の表面トポグラフィないし画像は、x平面とy平面での走査によって決定される。そのために、光源または入力結合ファイバを動かすことができ、および/または試料を動かすことができる。まず最初に表面トポグラフィが決定されると、表面トポグラフィの値が記録され、実質的に点状の各領域に割り当てられて、記憶される。試料全体が走査され、表面トポグラフィの値が決定されてから、表面トポグラフィの値が決定されている実質的に点状の領域の少なくとも1つの部分へと試料が移されて、表面トポグラフィを考慮したうえで、当該点についてラマン測定および/または蛍光測定を実施する。したがってこのプロセスはいわゆるツー・パス・プロセスであり、すなわち、トポグラフィ測定とラマン測定が時間的に相前後して行われる。これに加えて、この装置ではトポグラフィの小さな変調を行うことができ、それによって試料の粗さが考慮に含まれる。
それに対して、トポグラフィに追加してたとえばラマンデータも収集されると、すなわち、焦点平面を制御するためのトポグラフィ信号がラマン信号に利用されると、これは1段階のプロセスとなる。以下の図2と図3は、純粋なトポグラフィ画像(図2)と、表面トポグラフィを追加のラマン情報とともに示す1段階の方法で得られる画像(図3)との相違を示している。
図2では、共焦点クロマティックセンサ(図1の符号80)により計測された10セント硬貨のトポグラフィが示されている。スキャンが行われるx平面とy平面が同じく図示されている。
トポグラフィはz方向にも延びている。白色光が屈折光学素子によってx平面とy平面で試料に誘導される図1aないし図1bのクロマティックセンサ80,2080により、クロマティックセンサ80,2080の反射レンズシステムの大きい色収差に基づき、異なる波長の光が異なる焦点平面で結像される。そして、試料16から反射される光をたとえば分光計でスペクトル分析すれば、強度分布を基にして、センサと試料表面との間隔を推定することができる。このとき成り立つのは、焦点平面に試料表面が存在している波長が、スペクトルにおいて強度最大値を示すことである。そして試料をx方向、y方向で走査すれば、試料の各々のほぼ点状の領域について、どの波長で強度最大値が現れるかを決定することができる。さらに波長から、色収差に基づいてクロマティックセンサから表面までの間隔を推定し、それに伴って表面トポグラフィを推定することができる。
x/y方向への走査によってもトポグラフィ画像が得られる。たとえば1つの点で、強度最大値が現れる波長が500nmであるが、試料の別の地点ではたとえば550nmであることが確認されれば、一方の領域は他方の領域に比べてたとえば隆起している。
図2に示す画像は、そのような試料表面の純粋なトポグラフィ画像であり、すなわち図2は、たとえばラマン測定や蛍光測定によって判定することができる表面の物質に関するいかなる情報も使わずに、クロマティックセンサを用いて表面トポグラフィを表示したものにすぎない。
それに対して図3は、クロマティックセンサにより決定された表面トポグラフィに追加して、共焦点ラマン顕微鏡法の枠内でラマンデータも収集された表面の図像を示している。同じくx/y方向ならびにz方向が図示されている。
x/y方向では寸法はそれぞれ12mmであり、z方向では384マイクロメートルである。
検査された表面は錠剤の表面である。錠剤そのものの作用物質分布が、ラマンスペクトルによって判定されている。
トポグラフィ画像を用いて、実施されるラマン測定と同時に、試料表面が常にラマン対物レンズの焦点平面に保たれる。それによって図3を得ることができる。
図3の図像では、第1のラマンスペクトルで得られた作用物質分布に関する情報がトポグラフィ画像に追加されている。
図3は、平坦でない試料の作用物質分布を判定することができた画像を初めて示している。
クロマティックセンサによる表面トポグラフィの決定に代えて、試料をz方向に沿って周期的に動かすことも可能である。それにより、試料は焦点を通ってz方向に動く。表面トポグラフィがたとえば試料の粗さによってのみ惹起されているとき、試料の運動によって少なくとも平均化されたx/y平面でのラマンスペクトルの平均値が得られ、そのようにして、強度が比較的均等である試料表面の鮮明な画像が常に得られる。
図4には、試料がz方向で周期的に動くシステムの光学的な光路が示されている。
励起光はレーザ光源1000によって準備され、対物レンズ1010を介して試料表面1016へ案内される。このような励起により生成された光は、すなわち反射、放出、ないし散乱された光は、ビームスプリッタ1030を介して検出器1050へ、たとえばCCDカメラへ案内される。ラマン光の生成は散乱プロセスである。
試料がx/y方向で異なる地点に移され、x/y方向での走査によって試料の画像が生じると、試料が追加的にさらにz方向へ周期的に動かされる。z方向へ試料が周期的に運動するとき、試料は常に共焦点の焦点平面を通って動く。それにより試料の粗さを判定することができる。
図5aから図5bを見ると明らかなように、z方向への運動により、粗い表面の場合でも共焦点ラマン測定の信号を得ることができる。これについて以下に説明する。
ここで図5aは、z方向への変調のない共焦点ラマン測定を示している。
図5aの多くの領域は試料の粗さに基づいて焦点に存在していないため、画像の多くの領域が暗くなっており、すなわち信号がない。
変調すなわちz方向への運動を適用すると暗い領域が消えて、図5bに示すように、強度が均等な常に鮮明な画像が得られる。
変調振幅が十分に大きければ、すなわち最大の試料トポグラフィよりも大きければ、各々の振幅周期におけるラマン強度最大値ないしレイリー強度最大値の位置を判定することで、トポグラフィを判定することができる。このようなケースでは、共焦点クロマティックセンサは必要ない。この方式は、トポグラフィを判定ないし補償するための代替方式である。その利点はワン・パス・プロセスであることにあり、すなわち、ラマン測定とトポグラフィ測定が同時に行われることにある。ただし振幅が大きいと、変調振幅の小さな部分の間でしか焦点が試料表面の領域に存在せず、このことは、ラマン測定時間が効率的に活用されないという帰結につながることがある。
測定時間を最善に活用するために、小さい変調振幅で作業を行うことができる。そうしたケースでは、変調が常に直近に見出されたトポグラフィ値の周辺で行われるように、すなわち、共焦点の自動式の焦点トラッキングを行うためにz方向の変調が利用されるように、制御が作用する。このような種類のトラッキングについての信号推移が図6に示されている。
図6を見ると明らかなように、試料がz方向で変調されて反射の信号推移が記録される。反射の信号推移から最大強度の位置が決定され、このとき最大強度の位置は、表面への最善の焦点合わせに一致する。そして最大強度の位置をコントローラへ与えれば、それによって変調の中心をトラッキングすることができ、すなわち試料の表面トポグラフィに合わせて適合化することができる。このような種類の共焦点の自動式の焦点トラッキングを用いた測定が、図7aと図7bに示されている。ここで図7aは反射光を示しており、図7bは焦点トラッキングに基づいて決定された試料の表面トポグラフィを示している。
図8aから図8dには検査されるべき物体が示されており、本例では、面5100が図1bの装置を用いて検査された図8aに示す石5000が示されている。
図8bには、図8aに符号5100が付された表面でのラマン測定が示されている。図8aの物体の試料表面5100のトポグラフィが考慮されないままであるとき、ラマン信号5200は、ラマン顕微鏡の焦点平面の領域でのみ得られるにすぎない。
共焦点クロマティックセンサを用いて、試料表面のトポグラフィないし等高線が記録されると、図8cに示すトポグラフィ画像が得られる。
図1bの装置によって図8cで得られるトポグラフィが、ラマン測定の焦点をトラッキングするために利用されると、図8dに示す表面が得られる。表面5100のさまざまな領域について、異なる材料についての異なるラマン信号が得られる。図8cのトポグラフィを考慮したときに得られる材料の異なる領域に、一例として、符号5300.1,5300.2が付されている。
このようにトポグラフィトラッキングにより、図8aに示す対象物の表面全体を分光計で検査することが可能である。トポグラフィ測定がラマン測定に援用されないとき、図8bに示すように、ラマン顕微鏡の焦点が位置することになる領域についてのみ、ラマン測定が得られる。
本発明では、表面トポグラフィに関する情報を簡単な仕方で、かつ迅速に得ることを可能にする装置が初めて提供される。特にこのことはクロマティックセンサを用いて実現され、さらにこれを光学式の測定方法と、たとえば共焦点ラマン顕微鏡法と、組み合わせることができる。別案として、z方向への試料の変調を利用して表面トポグラフィを判定することができる。

Claims (17)

  1. 共焦点顕微鏡法により、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法により、実質的に共焦点の平面ないし焦点平面で、表面のトポグラフィを有する試料(16)の面を、特に表面を結像する方法において、前記装置は特に表面トポグラフィセンサである機構を含んでおり、前記機構により、特に前記表面トポグラフィセンサにより、表面のトポグラフィの値が決定され、表面のトポグラフィの値を用いて、結像されるべき面が、特に表面が、共焦点顕微鏡法による走査時に、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法による走査時に、共焦点の平面へと移されることを特徴とする方法。
  2. まず試料の実質的に点状の多数の領域について表面のトポグラフィの値が判定され、それを基にして試料の表面トポグラフィが決定され、これに続いて試料が実質的に点状の多数の領域で、ステップ1で判定された表面トポグラフィの値を考慮したうえで、共焦点顕微鏡法のための、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法のための共焦点平面へと移されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  3. 走査時に試料がまず実質的に点状の領域へと移され、表面のトポグラフィの値が決定され、トポグラフィの値を用いて試料が共焦点平面へ移動させられ、実質的に点状の領域が共焦点顕微鏡法により、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法により結像され、
    共焦点顕微鏡法による、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法による実質的に点状の領域の結像後に、その次のステップで試料が実質的に点状の別の領域へ移動させられ、そこで同じく表面のトポグラフィの別の値が決定され、トポグラフィの別の値を用いて試料が共焦点平面へ移動させられ、実質的に点状の別の領域が共焦点顕微鏡法により、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法により結像され、平面ないし面の、特に表面の少なくとも1つの部分が走査されるまで、前記ステップが反復されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  4. 表面のトポグラフィの値は少なくとも1つの屈折光学素子と分光計とを備える共焦点クロマティックセンサを用いて判定され、白色光または複数の波長をもつ光または光源の波長領域の光が前記屈折光学素子によって試料の表面の実質的に点状の領域へと案内され、実質的に点状の領域から反射された光が分光計によりスペクトル分析されて、表面のトポグラフィの値をもたらすことを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 表面のトポグラフィの値は表面に対して実質的に垂直方向への試料の運動によって、特に周期的な運動によって、および光学信号の分析によって決定されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
  6. 共焦点顕微鏡法を用いて、特に共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法を用いて、表面の実質的に点状の多数の領域(20)を走査することによって試料(16)の表面を結像する装置(1)において、表面の実質的に点状の領域を焦点平面で検出器(50)に共焦点結像するための機構を含んでいる、そのような装置において、
    前記装置は表面トポグラフィセンサを有しており、特に共焦点クロマティックセンサ(80,2080)またはプロフィロメータまたはAFMまたは白色光干渉計または三角測量法センサまたはレーザ・スキャニング・システムを有していることを特徴とする装置。
  7. 前記表面トポグラフィセンサは位置信号を提供し、前記装置は共焦点平面ないし焦点平面を調整ないし制御する制御装置を含んでいることを特徴とする、請求項6に記載の装置。
  8. 前記共焦点クロマティックセンサ(80,2080)は光学システムを含んでおり、特に色収差の大きい屈折コンポーネントおよび/または回折コンポーネントと分光計とを備える光学システムを含んでいることを特徴とする、請求項6または7に記載の装置。
  9. 前記装置は以下の装置のいずれか1つであり、すなわち、
    共焦点ラマン顕微鏡、
    共焦点蛍光顕微鏡、
    共焦点ラマン/蛍光顕微鏡、
    共焦点光学顕微鏡、
    のいずれか1つであることを特徴とする、請求項6から8のいずれか1項に記載の装置。
  10. 前記装置は共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡であり、共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡は、試料で光エミッションを励起するための光源(10,2010)と、試料から光エミッションで放出される光子、特に放出されるラマン光子および/または蛍光光子を検出するための検出器(50)とを含んでいる、請求項9に記載の装置。
  11. 共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡は前記光源(10,2010)の光が試料に集束される光学素子、特に対物レンズ(2029)を含んでいることを特徴とする、請求項10に記載の装置。
  12. 前記装置は、共焦点クロマティックセンサの光および共焦点のラマン顕微鏡法および/または蛍光顕微鏡法の励起のための前記光源(2010)の光が共焦点クロマティックセンサ(2080)の光と同一の光学素子を通って、特に対物レンズ(2029)を通って、試料(2016)へ案内されるように構成されていることを特徴とする、請求項11に記載の装置。
  13. 共焦点のラマン顕微鏡および/または蛍光顕微鏡の光は第1の波長領域に位置しており、共焦点クロマティックセンサの光は第2の波長領域に位置していることを特徴とする、請求項1から12のいずれか1項に記載の装置。
  14. 第1の波長領域と第2の波長領域は重なっていないことを特徴とする、請求項11に記載の装置。
  15. 第1の波長領域は検査されるべき試料の判定されたルミネセンススペクトルおよび/またはラマンスペクトルの限界によって定義され、第2の波長領域は第1の波長領域と重なることなく第1の波長領域の上方または下方に位置することを特徴とする、請求項14に記載の装置。
  16. 第1の波長領域は500nmから1100nm、特に532nmから650nmを含んでおり、第2の波長領域は350nmから500nm、特に400nmから500nmの波長を含んでいることを特徴とする、請求項14から15のいずれか1項に記載の装置。
  17. 共焦点クロマティックセンサの実質的に点状の領域は0.1μmから1mm、好ましくは7μmから150μm、特に10μmから100μmの範囲内の横方向の長さを有しており、および/または共焦点クロマティックセンサの測定領域は100μmから40mm、好ましくは120μmから21mmであり、および/またはz方向の解像度は1nmから1μm、好ましくは1nmから100nmの範囲内であることを特徴とする、請求項6から16のいずれか1項に記載の装置。
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