SE537103C2 - System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer - Google Patents
System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer Download PDFInfo
- Publication number
- SE537103C2 SE537103C2 SE1351503A SE1351503A SE537103C2 SE 537103 C2 SE537103 C2 SE 537103C2 SE 1351503 A SE1351503 A SE 1351503A SE 1351503 A SE1351503 A SE 1351503A SE 537103 C2 SE537103 C2 SE 537103C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- fluorochrome
- fluorochromes
- light
- analog
- excitation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 title abstract description 6
- 230000023077 detection of light stimulus Effects 0.000 title description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 155
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 65
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 24
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 17
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical class C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N ATTO 425-2 Chemical compound CC1CC(C)(C)N(CCCC(O)=O)C2=C1C=C1C=C(C(=O)OCC)C(=O)OC1=C2 WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLQQGEVQWLDVDF-UHFFFAOYSA-N ATTO 610-2 Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=C2CCC[N+](CCCC(O)=O)=C2C=C2C1=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1C2(C)C SLQQGEVQWLDVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000005274 electronic transitions Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/06—Means for illuminating specimens
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/06—Means for illuminating specimens
- G02B21/08—Condensers
- G02B21/088—Condensers for both incident illumination and transillumination
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
- G02B6/0001—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings specially adapted for lighting devices or systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N2021/6463—Optics
- G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
- G02B26/007—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements the movable or deformable optical element controlling the colour, i.e. a spectral characteristic, of the light
- G02B26/008—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements the movable or deformable optical element controlling the colour, i.e. a spectral characteristic, of the light in the form of devices for effecting sequential colour changes, e.g. colour wheels
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Microscoopes, Condenser (AREA)
Abstract
537 103 SAMMANDRAG Foreliggande uppfinning ror fluorescensmikroskopi och mer specifikt en metod for att detektera fluorescens som emitteras fran ett prov markt med atminstone fyra fOrbestamda fluorokromer, ddr de atminstone fyra olika fluorokromerna innefattar en forsta och en andra fluorokrom som bildar ett par av fluorokromer, varvid paret av fluorokromer vdljs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller paret av fluorokromer vdljs som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen. Detektion av fluorescens fran de atminstone fyra forbestamda fluorokromerna uppnas i enlighet med uppfinningen genom att valja ett excitationsvaglangdsintervall for den andra fluorokromen sa att exciteringen av den forsta fluorokromen reduceras. och genom att valja ett emissionsvaglangdsintervall for den forsta fluorokromen sa att genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen är reducerad.
Description
537 103 .SYSTEM Oaf METOD FOR FLUOR.ESCENSMIKROSKOPI M.ED DETEKTERING AV LJUSEMISSION FRAN MULTIPLA. FLUORQKROME,R TEKNIsKT OMRADE FOreliggande uppfinninen hitifOr sig allmant till lluorescensmikroskopi oeb mer specitikt till forbattringar av en metod fOr mikroskopisystem och ett motsvarande fluoreseensmi kroskopisystem tlr att tiliita separat detektion av ett emitterande ljus fin ell prov som ir indrkt mai ett flertal Alka fluorokromer.
BAKGRUND TILL UPPF1NNINGEN Fluorescensmikroskopi är en 1,j usmikroskopiteknik fir all studera strukturer eller egenskaper hos ett prov genom att avbilda ftuoreseerande eller lbsforerande emission HD specifika airmen sasom organiska molokykr eller oorganiska amen lokaliserade pa eller inuti ett prov. Exempelvis kan provet vara markt med en eller ett tiertal olika fluorokromer Oven betecknade sum fluoroforer), molekyler som !tar de absorberar ljus ddrefier avger deraS okade energi pa olika sitt varav ett dr emission av ljus med langre vtigliingder.
Mir en sadan molekyl bestralas mod ultraviolett, synligt, tiara infrarotr eller infrinOtt hus kan den germ-alga en elektronisk fortlyttning under vilkon molekylen absorber& en viss mangd energi, och cmi elektron exeiteras filita den orbital den upptar i grundtillstiindet till en anon orbital av hogre energi. Vaglangdsspektrat vid vi [ken den bestralade molekylen absorberar ljus kallas thr absorptionsspektra eller exeitationsspekira. De fiesta exciterade tillstand ar kortvariga och de t vanligaste odet fir den absorberade energin dr ateremitteri lig av ijus i fbrm av fosforeseens eller fluorescens. Vagldngdsspektrat vid vilken den bestralade molekyien emitterar ijus kallas fir emissionsspektra. De fluoreseerande egenskaperna av orgimiska och oorganiska fargainnen utgor grunden fir ett antai analytiska metoder, avvilka en dr immunofluoreseens, vilka anyinder fluomokromkonjugerade antikroppar for alt detektera proteiner och andra molekyler.
Ett typiskt fluoresc.‘ensmikroskop sum vanligtvis anvands for sddana analyser innefahas av en 1,juskalia, optik for alt overfora ljus in i en excitationsijusbana, ett excitanonsfilter fir all selektera &am ett eller flera band av exeitationsv5glangder sum overaws till objektet, en dikroidspegel utformad alt rellektera banden av exeitationsViiglangder tifl prove och samtidigt vidarebefordra de einitterande 1 537 103 fluerescensvAgliAngderna fran provet till den optiska emissionsbanan, ett effiissionsfilter SOM blockerar exeiterande stroljusvaglangder sorn Overfors till den optiska ernissionsbanan rich optik alt vidarebefordra de fluorescerande emissionsvaglangderna till ogat eller tilt en apparator son/ tar bilder, sasem en karnera.
Generai it alla moderna ankreskop fbrsedda riled tient snabbi vaxlingsbara nfilterkuber", dar varje filterkub hr ti lilt:mid en specifik floorokrom (eller en uppsattning av liknande fluorokromer) och innehaller enanpassad uppsattning av excitationsfilter, dikroldspegel cell emissionsfilter, Separat °Oh sckvent.ieii visualisering av olika fluorokrernokan lAtt astadkernmas genom att yaxla mellan de matehade filteruppstittningarna, en i taget Sitdan sekventiell visualiscring av olika fluorekromer, som var cell en bar ett unikt excitationsfemissionsvagllingdsspektra, kan till exempel anvandas fllr aft aysldja den rumsliga ickaliseringen av tvii (eller flera) preteiner i en vavnad, genom alt anyanda fluoreseerande- proteiner (t ex CiFP) eller fluorokrcramarkta antikroppar (A kallad immunoflocreseens) eller detektering av tva (eller flora) DNA-mutationer i celler, genom anyandning av fluerokrommarkta nukleinsyror (prober).
Adana studier finns det otla en onskan att kombinera manga kanaler or all utvinna flier information. Till exempel hir del i bioiogiska studier vanligt art visualisera fiera (Aka celltyper I eti vavnadsprov genom alt anvanda cellsiveifika antikroppar tnarkta med olika fluorckromer, ldag kart dock endast ett begransat antal fluorofbrer ordentligt skihas At i sarnma proy, pA gaind av genombiodning ay einitterat lijus frAn olika fluorokromer. Problemet mod genornbtodning, (ii\IQT/ katlat spill-over artefakter) kan losas genom kompensatien, dvs, datorbaserade berakningar SOM kompenserar COI adderande signaler fran delvis overlappande thorokromspcktra. Detta at- ernellertid en komplieerad process scm -hate ratinmassigt anyands inom forskning eller laboratoriemedicin, Det skulle darfor vara (inskvart an tillhandahalla en meted cell ett mikroskopisystem utformat fdr enkel separation col/ tbrbattrad detektering av tiusemission frAn mer un fyra olika iluerokromer.
SA MN AN FATTNING AV UPPFINNINGEN Enligt en forsta aspekt av upptinningen ar det ovanstaende 5.tininstone delyis astadkommit genom en meted for aft detektera fluereseens sum emitteras frin ett prey markt Tried ett flertal tZratbestamda fluorckreiner cell anvandning av ett mikroskopsystem innefattande en buskalleanordning, vari meteden innefattar stegen an yalja minst fyra olika 2 537 103 fluorokromer i fmiade att avge ljus inom dot syrdiga tiusapektrat, do iitminsti:me fyra o'ika fluoroknimerna innefintar en fOrsta cob en andra fluorokrom son bildar ett par avfluorokromer, ,aija exeitationsvaglangdsintervaller for de iitminstone fyra olika fluorokromer, varvid excitaionsvAglangdsintervallet fir den andra fluorokromen valjs tift att exciteringen av den RV:4a fluorokromen r redueerad, utforma en filteranordning i mikroskopisysternet fi-33- at sekktiv tiHiia ljUS att passera Mom emissionsvAglangdsintervall som Overensstammer med nissionsvisIdngdsinterval len hos de aminstone fyra olika fluorokromerna, varvid emissionsiisKingdsintervallet fir den forsta fluorokromen ln vald fr att minska genomblodning av ljusemiSsion ffan den andra fluorokromen, sekventiellt emittera tins inom trninstone en del av de valda exenationsvaglangdintervallerna, °eh detektera ljus som emitteras fran provet genom filteranordningen, varvid paid t av fincrokromer vdijs sum en Cy3 fluerokromanalog sum bildar den forsta fluorokromen oela en 594 fluorokromanalog sum bildar den andra fluorokromen, oiler paret av fluorokromer valjs sum en 425 fluorokromanalog sum bildar den forsta fluorokromen °eh en 488 fluorokroma ialog sum bildar den andra fluorokrornen.
Uppfinningen iir baserad p nasikten aft senom aft lOsa dot primdra mob imet med att separera flucreacenssipaler sum emitteras fran en prey markt med en firsta tluorekrom cob en andra fluorokrom, kommer fordelar med minskade komplikationer for an ocksii miijliggora separation av ytterligare fiuoreseenssignaler fiiin en tredje °eh en fjarde (annan) floorokrorn, bogransat till dot fall d.i fluorokromerna emitterar tins inom de synliga spektrat (i ex vanligtvis inom mtervallet 400 till 640 nm) oeli den firsta cob den andra fluorokromen iir antingen en kombination/par av flucrokrorner sum talgors i'AV en Cy3 fluoroknomanalog cob en 594 fluorokmaanalog, respektive, oiler den tbrsta °eh den andra fluorokrotnen iii antint._:,,en en kombinationipar av fluorokromer sum utgors av en 415 fluomkromanalog cob en 488 fluorokromanalog, respektivo Delta uppinis enlighet mod uppfirmingen geliora all valja ett excitationsvaglangdsintervall fir den andra fluorokromen, att exciteringen av den firsta fluorokromen reduceras cob genom att vakia ett emissionsvagliingdsintervall fir den firsta fluorokromen, si att genomblodning av ijuserniasion fin den andra fluorokromen iii reducerad.
Mom ramen for tapptinningen är dot mojligt au uppna signalseparation av do atinmatoTle fyra fluorokromenia. Varje prey lief/river emellertid inte nodvandigtvis vid vane given tidpunkt vara inmarkt med do minst fyra Miorokromema. Foljakthgen, de atminatone fyra fluorokromer sum kan separenas iir till finfbgande med hjä1p av uppfinningen, men into nddvthdigtvis alla sekventiellt exciterade "samtidigt", t.ex. i visaa utforinsf(tfriler kan endast 3 537 103 en, tsdk eller tre av de itminstone fyra flurirokromerna exciteras, men mikroskopet Iar kapacitet att separera signaler fun var och en av de atminstone cyra floorokrornerna, fraga on en av de ovan diskuterade paren av fluorokromer, bor tennen 'Cy3 fluorokromanalog" tolkas i sin vidaste bernakelse, inklusive organisk eller oorganisk foremng soni bar ett liknande exeitationsfernissionsspektrum. Saledes kan en Cy3 fluorokromanalog exempelvis vara itagon av en Cy3, en CF543, en AttoRho6G, en AF546 eller en Dylight549-baserad fluorokrom, Pa samma salt, en "594 fluorokromanalog kan exompeivis vara nAgen av en Texas rod, en CF594, en CF620R, en AF594, en 1)ylight594 Atto590, en Atto594, en Atto610 eller en CF620R-baserad fluorokrom, Det bar notera.s att listan into är exklusiv och ytterligiu-e nuvarande ()eh frarritida rnotsvarande fluorokrorner kan -i,verviigas, Deft vara inom ramen for uppfinningen. 1 fraga Om on annan av de ovan diskuterade par av fluorokromer bor tennen "425 Iluorokromanalog" tolkas i sin vidaste beinarkelse, inklusive organisk eller oorganisk fOrening som bar et liknande exeitationsiernissionsspektrum. Saledes, en 42.5 fluorokromanalog kan exernpelvis vain nagon av en Atto425, Sytox blue, eller en CEPbaserad fluorokrom. Pi. samma siitt, en "488 analog fluorokroin" kan exempelvis vara nagon av en CF488. en AF488, en Dylight488, en Atto488, en FITC, en EGFP eller m GFP-baserad fluorokroin.
Dessutom, baserat pa molekylar kornplexitet och syntetiska metoder, ska den alindinna tenner3'fluorokrom." tolkas hrett, inklusivc alla type: av fluorokromer baserade pa proteiner och peptider, sma organiska foreninitar, svntetiska oligomerer och polymerer, eller flerkomponentsystern, uttryck sum ar val kanda inorn omrAdet. Bowen& pa, tillampning kan typen av fluorokrom SOM anvands variera. Det viii saga, i icke-levande prover ãr dot i nilmànhet anskvart att valjafotostabil fluorokrom, medan nar dot gailer till exempel en "live-imaging" applikation (innefattande ievande prov) am dot ofta nodvandigt att valja en fluorokrom som liar egenskaper sasom till exempel att vara icke-toxisk, Olika tillarnpningar kan yam mojliga i enlighettried nya metoden.
Separationen av fluoreseenssignaler frim de knlitiStOile fyra fluorokromerna kommer att ha stoma fordelar inom oinrAdet fluoreseensmikroskopi, speciellt eftersom dot konuner att mojliggdra 'screening" av en stor panel av proteiner inom nagra i vihinadspro Dessntom mojliggor den avaneerade sandokatiseringsanalyser, dlii manga proteinerk-.an visualiseras i samma prov (Lex. for multifargaingsanalys). Dessatom forenklar dot anvandandet av thorescensinikroskopi for anvandarna, efiersom de kan valja att raiirka in prover rued viika som heist ay alma de fluorokromer sorn filreruppsanningarna kan separera 4 537 103 utan att behova tank pa eventuella genomblodningsartefalder.
Metoden innefattar foretradesvis liven steget att marks prove't med de atminstone -,f)rs olika flucrokromerna. Det finns R'Sr naivarande manga olika tillgangliga metoder for att marks ett pros', dar ininarkraingsmetoderna iir beroende av vilken tt-u av prOv Samt vilken del av provet ik dot Onskvart att. marka. Foljaktligen och &Isom inses av fackman, kan prover till exempel markas med fluorokrommarkta antikroppar, eellmembranfarger. DNA-bindandefittorokromer, flunrokrommarkta nukleinsyraprober ocb fluoreseerande proteiner for att t information om biologin ()eh patologin hos proteiner, DNA, cella oeb vavnader friln miinniskor, djur, vaxter och mikroorganismer. en fardelaktig uttOringsform av upplinningen valjs fem olika fluorokrorner tit och metoden anpassas I enlighet damned. FOljaktligen, fOr en sadan utinringsform filis ett par av fluorokromer :far Cy3 flwirokromanalogen hildar den Rirsta fluorokromen oeh 594 ftuorokromanalogen bildar den andra fluorokromen, och ett ytterligare par av fluorokromer viihs dar 425 fluorokromanalogen bildar den forsta fluorokromen neh 488 fluorokromanalogen bildar den andra fluorokromen.
Dot kult dessutom vara mojiigt att ocksa inkludera atminstone en ytterligare kompletterande fluorokrorn, som sander ut bust det nara infiaroda spektrat tt, ex, vanligtvis Mom intervallet frail 640 till 700 nm), vilket mOjliggOr separation av en ytterligare tluoreseenssi gush Vidare kan det orksia vara mOjligt att inkludera Anninstone en ytterligare fluorokrom, som sander ut bus morn det infraroda spektrwnet (Lox. vanligtvis Over 700 nm). Dessa ytterligare fluorokromer kan ooksa inkluderas individuellt oiler i sOillet fOr att separera de btida ovanstaende tva diskuterade par av fluorokromer i syaligt" spektrurn, en tOrdelaktig utforingsfom, fir de iiterstiiende fluorokromerna vidare utvalda &An en grupp bestAende av en DAPI fluorokromanalog eller en 8V42 I fluorokromanalog, en 425 fluorokromanalog, en 488 fluorokronlanalog, Cy3 fluorokromanalog, en 594 fluorokromanalog, en 660 fluorokromanalog eller en PerC.P fluornkromanalog, nob en DRAQ5 flunrokromanalog, Genom att valja ytterligare finorokromer tiled emission i det nara infrarodaiinfraroda spektrat kan det vara mOjhgt att skilja sfl ming) sorn final, sex oiler till nth med sju fluoreseenssignaler frin varandra ((let vitt saga utan att inkludera ytterligare datorbaserad behandling som diskuterats ovan) °eh forifarande anviinda en lysiinde Ijuskfilla for ultraviolett °eh synligt ljus, sElsom en kvieksilvedampa (eventuellt med tillsats av en ljuskalla fOr ekcitering if10111 dot infrarOda spektrat). Exempel p rika infraroda fluorokromer innefattar en 660 analog fluorokrom (I ex vald fran en gnapp innefattande en CF660R. AF660 537 103 eller eFlour660") oiler en PerCP fluor( kmnanalog (t ex veld ti-an on grupp innefaitande en PerCP, en PerCP-Cy5,5, eiter PerCP -eFluor? I U baseradfluorokrom), &ilk den infraroda fluerokromen exempeivis kanen DRAQ5 analog finerekrom ttsex„ en DRAQ5 oiler en Red dot baserad fluorokrom).
Enligt on annen espekt av oppfirmingen tilihandahalles ett mikreskopisystem for att separere fluerescenssignaler sem emitterasett prey markt mod ett fled& fat-tithe:sta.:nada fiuorekromer, mikreskopisystemet innefattat en uslailieanordning konfigurerad att sande ut ijus, en ljusledare for att ledaljus fran ljusklilleanordningen till . ,et far excitering av on flertal foratbestamda fluorekromer, en filteranordning konfigurered far separation av fluoresrens SOM emitteres av namnda tlertal forutbestamde fluerokromer corn marker in preye,t, ea en detektionsanordning kontigurered ffir att ta emot ljus sem overfars gen6.nn filteranordningen, varyid mikroekopets filteruppsattningar ken separera signaler fran mind t Ira ()like tluerekromer sem emitterar ljus inom dot synliga tjusspektrat innefettande en forsta °eh en tmdre fluorokrorn som 'Hider ett par UV fluorokromer ljuskalleanordningen hr konfigurerad att sekventient avge ljus inom &millstone lyre ()like exeitationsvagliingdsintervall, excitationsvaglangdsintervallet for den amine fluerokromen valjs tar ett roducera excitering av den forsta fluorokromen, filteranordningen innefattar atminstone lyre matchade filter konfigurczzade for aft tillata ljus aft passere mem minst fyra olika emissionsvEiglangdsinterval I. emissionsvgllingdsintervcIiet far den firsta fluorokromen hr vald for att minska genombladning av ljusemission frail den endre fluerokromen, °eh paret av fluorokremer valjs corn en Cy3 illiOnikr0111analOg SOrn bildar den tsarsta fluorokramen och en 594 fluorokromenatog som bildar den andra flunrokromen, oiler v4is panel av fluorokromer corn en 425 fluorokromanalmt corn bildar den tbrsta fluorokromen och en 488 fluerektomanalog sem bildu den andrafluorokromen, en fardelaktig utforingsferm a v uppfinningen innefattar detektionsenordningen en bildfangande anordning konfil.,urerad for aft ta bilder av fluorescensen i provet. En sadan bildtagande anordningen kan vara en kamera corn ar ansluten nil en dater, lienom aft seks,,entierit ta ocb lagra ett fiertal Wider av dot emitterade tinsel frin var ech on av fluorokromerna ken dot vara mOjilgi aft lagga bildema ovanpa varandra for att till exernpel tO en multifargenelys cv provet. Dot bar noteras alt mikroskopisystemetikameran/ansluten dater ken konfigureras far "live-imaging", dar en ibrtsatt (sekventiell) strain av bilder (Lex, video stream) tas ay proyet, del viii saga att Over :id" anskaffa men an en bild av vaije fluorekrom.
Paretrildesvis innefattar ljuskalloanordningen en Lille for ultraviolett °eh synlig,-t. lius. Gob atminstone fyra matchade filter som at konfigurerade an tillata 'jut; aft 'passera inem 6 537 103 atininstone fyra olika excitationsviiglangdsintervallen, LjuskAllan kan exempelvis vara en kvieksilveriampa eller en xerionlampa, .Andra lAmpliga buskiillor Ar givetvis majliga och inom raraen fir uppfinningen. 1 en typisk tilliimpning dr de titminstone fyra anpaasade filtren sum At konfigurerade fOr att til1a iljus passera inom iitminstone fyra olika excitationsvig ngdsintervall ("excitationstilter") och filteranordningen innefattande Anainstone fyta anpassade filter konfigurerade RSr att tilidta bus passerm him iinninstone fyra olika emissionsvaglangdsintervall ("emissionsintervall som 5r anordnade i fyra separata "filterkuher"., respektive som ocksa innefa,ttar en dikroidspegel. Foljaktligen i cu sAdant utforande kan filteranordningen oeksd ses innehAlla fyra olika filterkuber sarskilt anpassade fir att ti Ilan separation av de atminstone fyra fluorokromer pA dot sat SOM diskuterats ovan. ett sadant utforande kan det uppfiDllingsenliga konceptet tiliAmpas som en "retro-fir applikation ddr uppiinningskonceptet 5r valt for aft anpassa ett tiflgAngiigt mikroskopisystem dar ett a7itt "set" av filterkuber tillhandaháfls SOM milbliggor utfOrandet av uppfinningskonceptet.
Emenertid i en alternativ uttbringsform kan buskalkanordningen innefatta. ett flertal ljusemitterande dioder (LED). I ett sadant uttbrande believer dot inte nodvandigtvis vara i behov av alt inkludera specifika exeitationstilter, eftersom lysdioderna kan iiIja aft vara smalbandigm och konfigurerade for att i sig 'avge bus inorn varje av de sarski It utvaldm excitationsvigilingdsintervalien. fortidllande till de hada ovarindrimda utibrinitsformerna som rbr valet av busk:dila, vAljs busklillan for att avge ljus mom dot ultravioletta och synligm ljusspektrat, sasom en kvicksilverlampa, dvs, variligtvis Indian 350 till 020 am, Det kan eMellertid inom rarnen for uppfirmingen yammOjligt att inform ytterligare en busemitterande anordning, sasom bland annat en eller ett flertal lysdioder ihop med Lex. en kvicksilverlampa air alt "ge understod" till en sddan lampa inom de hogre vigliingdsomrddena, vartligtvis Over 630 am, I en sadan utforingsform kan viterligare (analoga) fluorokromer, i det nava infraroda och infraroda spektra, som inte a5mnts ovan dessutom informs, vilket mbjliggor separation ay liven mer An tsex, sju fluorokromer, Emellertid dr det i ett sadant scenario nodvandigt att innefatta detekteringsanordning anpassat for att ta C11101 lus mom det icke synhiga spektra. Fobaktligen dr dot nate mojligt alt uteslutande detektera bus som emitteras fran provet med hjaip av dot miinskliga Ogat. vilket iir mOiigi enligt dot all Manna konceptet has uppfinningen.
Ytterligare sardrag hos, och tbrdelar med., tbreliggande uppfmning kommer alt OH uppenbara yid studier av de bifogade kraven och den oftertbljande beskrivningen. Fackmannen inser att olika sdrdrag has den aktuella upptinningen kan kombineras for att 7 537 103 skapa andra an de son) beskrivs i R31. jande utfOringsfonmer utan att avvika fran ramen fOr Toreliggande uppli KORT BESKRIVNING AV RITNINGA.RNA De olika aspektema av uppfinningen, inklusive dess sarskilda sardtag och fordelar kommer Hitt att fOrstas av den foljande detaljc.trade heskrivningen och de bifbgade rimingarna, i vino.
Fig. I visar et typiskt mikroskepisystem &mho uppfinningen; Fig. 2a och 2b illustrerar alternativa filtemppsattningar fOr mikreskopisystemet; Fig. $ visar ett exeltationsiemissionsdiagam for en fiertal olika fluorokromer som tillampas I enlighet med uppfinningen, och Fig. 4 iir ett flodesschema som illustrerar metodstegen file an detektera fluorescens frail en prov markt i enlighet tried uppfinningen.
DETALIERAD lElESKRIVNING FOrelig,gande uppfinning kornmer nu aft beskrivas mer fullstandigt hamedan tned hanvisning till de bifbg,ade ritningarna, vilka for narvarande fordelaktiga inforingsforiner av uppfinningen visas, Denna applinning kan emellertid utfbras i maruna olika former och skall inte toikas som begransad till de utfOringsformer SOM anges hart', snarare tillhandahalls dessa utforingsformer for noggranrinet °eh fullstandighet, och file a .t fullstandigt flit-media cameo for uppfinningen for fackmannen. Samma hanvisningsbeteckningar hanvi sat genomgaende tll satuma element.
.Med hanvisning nu till ritningarna ()oh till Fig, 1 i synnerhet, visas ett mikroskopisystemet 100 enligt en fordelaktig utforingsform av uppfinningen. Miktoskopisystemet 100 ar i drift for alt avbilda ett pray 102 anordnad pA ett objektsbord 104. Provet 104 ar markt med ett fiertal olika fluotokramer som absorberar ljus vid en exeiteringsvi--iglangd och, sorn svar pA data ljus, fluoreseerar, emitterar ljus vid emissionsvaglangder langre an exeitationsvAglangderna, En ljuskal la 106 emitterar ljus loom det ultravioletta °oh synliga spektrat (dvs. vanligtvis hog emission thorn omeadet mdlan 350 till 620 nm), sAsom en kvicksilverlampa, genererar ljus vid excitationsvagliangden for fluorokromerna och ljuskallan 106 är kopplad till en fiberkabel 108, som leder en exeiteringsljusstrAle 110 fran finskallan 106 till en filterkub 112. 1 vissa utforingsformer passerar ljus som sands fian liuskiillan 106 direkt till filterkuhen 112 utan alt bli bunco av en fiberkahel. I andra utakingsformer passerar excitationsijusstralen 8 537 103 110 genorrt optiska element, sasom linser och oppmngar, innan den kommer till filterkuben 112. Exenationsbusstralen 110 kornmer in i filterkuben 112 som är anordnad 1 en filterrevolver (ej visad)i mikroskopisystemet 100. Filter evolvem ih konstrueradfOr att.tilhata ett flertal aka filterkaber att Vara sekventiellt plaeerade Mom den optiska axeln Indian buskallan 106 och provet 102.
Filterkuben 112 nmehaller CU. bandpassexeitationsfilter 114, sum tar mot exeiteringsljusstrale 110 flan fiberkabel 108 oth endast for vidue en del av exciteringsljussniden 110 tried ett vaglangdsintervall Mom exeitationsvaglangdsintervallet for en av fluorokromema 102 sum provet inmarkt Med. Exeltationsbasstrale 110 passerar genom exeltationstliter 114 Gel manias av en dikroidspegel 116, vilken reflekterar bus yid exenationsvaglangden bus fluorokromerna och slapped- igf...morn bus vid emissionsvagliingden for finorokromerna. Exeiteringsbusstrale 110 reflekteras saledes av dikroidspegel 114. Dikroidspegel 114 11r vanligen orienterad diagonalt inuti tilterkub 112. vanligtvis vid en 45 graders vinkel i forhailande till riktningen for exeiteringsbusstralen 110, sit att exciteringsljusstrale 1 If) retlekteras i riktnin.g mot provet 102.
Vidare passerar exeiteringsbusstralen 110 genom en objektivlins 116 och trillTar prov 102 dar den exciterar fluorokrumerna aiirvarande 1 prey 102. Fluorokromerna tlaorescerat, avger fluoreseensljus 118 vid emissionsvagliingderna for fluorokromerna. luorescensen 118 fingas app RV objektivlinsen 117 och fomias till en emissionsbasstrale 120 sum gar in i filterkuben 112. Emissionsbusstralen 120 fors sedan genom dikroidspeuel 116 °eh traffar ett emissionsfilter 12.2 sum ocksA firms 1 filterkuben 112, Emissionsfiltret 122 ar även ett bandpassfilter (eller i vissa fall ett hingpasstilter) sum skipper igenom bus runt emissionsvaglangden fOr fluoroktomerna °eh reliekterar andra bus, sasom, till exempel, strobus frith exeiteringsljusstralen °eh emissionsbus fran andra fluor:Ammer i provet 102.
Emissionsbasstriilen 120 iiverffirs siiledes genom emissionsfilter 122 ()eh ãr riktad at ur mikroskopisystemet 100 till en dartill anslaten detekteringsanordning 124. Detekteringsanordningen 124 kan exempelvis vara en sensor, en spektrumeter, en CCD- eller CMOS-karnera, eller ett okular, vi s sa utfodngsfunner av optiska element sitter linser eller straldelare pia:Trade mellan emissionsfilter 122 och detekteringsanordning 124 for att rikta emissionsstrale 120 pa ran satt. Gallande detekteringsanordningen 124, som innefattar en digital karnera: sifisom en eNernpeivis en CCD-eller CMOS-kamera, ingar vanligtvisen automatisk slutare far exponeringskontroll av de insarnlade bilderna (en videctstrom kan ocksa spelas in sum diskuterats ovaa Det at vanligt att anvanda en svartvit kamera for att La mdividudlla Mier av emissionen frtIn vane fluorokrom, lagga pa en pseadorarg digitalt, ()eh 9 537 103 lagg,a dem over varandra filr tt t en slutfig hikl vid anvindniiett 'flertal olika 7ilterkober 112.
Vidare innefattar mikroskopisystemet 100 (yariligtvis) en styrenbet 126 for att stym drifien av mikroskopisystemet WO, inklusive positionen fOr filterrevolvern, detekteringsenheten 124 och juskailan 106. Styrenheten 126 kan innefatta en genera processor, en applikationsspecifik processor, en kre s som innehaller bearbetningskomponenter, en grupp av distribuerade processkomponenter, en 2rupp av distribuerade datorer konfigurerade fOr bearbetning, etc. Processom kan vara eller innefatta olika antal hardvarakomponenter for utforande av data- eller signalbearbetnina eller for alt exekvera datorkod sum lagras i minuet. Minuet kan vara en eller flora anon-Ming& fOr lagring av data ochleiler datorkod for alt slutfOra eller underUtta do olika metoderna sum beskrivs foreliggande besknvning, Minnet kan innefatta flyktigt eller ett icke-tlyktigt mimic. Minuet kan innefatta databaskomponenter, ohjektkodskomponenter, skrivkomponenter, eller naQ,on annan typ av intbrmationsstruktur far alt stodja olika funktioner i den foreliggande beskrivningen. Enligt en exempt ifierande utforingsform kan vado distribuerad eller Iokal In inn Csanordningen Uttl yttjas rued s:,,,,stetnen och metoderna enligt foreliggande beskrivning, Enligt en exemplifierande utfOringsfonn dr minuet kommunieerbart ansicten till proeessorn (Lox. via en krets oiler magen annan trAdbunden, triidlost, eller ni.itverksanslatning) och innefattar datorkod for art exekvera en oiler flera processor sum beskrivs Silsom naamts ovan medger filterrevolvern bytbar inforings- och positionskontroll av ett flertal filterkuber 112. Det vill saga, pa grund av alt vane typ irs" fluorokrom bar sitt eget unika excitations- och emissionsspektra, anvands en unik kombination av exciteringsfitter 114, dikroidspegel 116, och emissionsfitter 122 fOr varje typ av fluorokrom. Saledes tar en filterkub sum bar en specifik koinbination av filter och spegel ihopsatt for att anvandas tili en viss typ av finorokrom. Beroende pa vilken typ fluorokromer sum hr narvarande i prov 102, fors i enlighet tried detta en filterkab 112 med liimpUg kombination av filter och spegel in i filterrevolvern, Likasá valjs de filter ()eh den spogel I filterkuben 112 for anvandning av en specifik fiuskdila De Yard iga optiska konfiguratianema sum beskrivs ovun an vander mikroskopoptik fOr alt direkt producera en fOrstorad bild av provet pa kamerasensom fOr alt fanga en hogupplost bild av provet, Delta optiska system kallas vanligen "wide field" mikroskopi. Fackmannen inom mikroskopi torde inse att en hOgupplost bild av provet kan skapas genom en mangd andra optiska system.
For alt kort berOra figurema It 2e. vilka iilustrerar en alten tiv tillampning av 10 537 103 filter ochijuskallaarrangemang for dctkxmc ptucJia eiforandet av uppfinningen„ Fig, 2a exemplifieras appfinningskonceptet pa en liknande satt som 1 Fig, 1, men 1 stLiikt for att tillhandahlilla en endabeskiilla, .slisom en kvicksilveriampa teller likaandel, tillhandahalls ett fiertal tysdioder 106', dar vat och en av lysdioderna 106 dr smalbandiga lysdioder soul vanligen ernitterar ljus endast irom ett begansat vagllingdsintmall, exempelvis en bandaredd amkring 20 - 50 am. Foljaktligen, genom alt anviinda ett stidant anangemang kan det vara mojligt alt utesluta excitationsfilter ho s filterkuben 112. . Foljaktligen .maste var och en .av lysdioderna 106' vara justerade sii aft de endaat sunder en exciteringsljusstriiie 110 am liar ett vagiMgdaintervalli110111 excitationsvagliingdsintervallet has en av delluorokromer sum arivands for mãrkning OV prove 102 (sflsorn diskuteras ovan).
Altemativt kan uppftiming,skonceptet tillämpas i enlighet med en sd kallad ".Pinkel-" (Fig. 2h) eller en "Sedat-" (Fig. 20 konfigaration, Bade Pinkel- och Sedatkonfigurationerna inkluderat en flerbandsdikroidspegel; emeilertid skiljer de sig i den kornbination av excitations- och emissionsfilter sum anvands, Sedatfilterkonfigurationen anvander bkle enkelband5 excnationsfiher och erikeibands emissionsfilter, medal) -Pinkelkonligurationen anvander erikelbands excitationsfilter och ett tlerbands enlissionsfilter, Forhallandet specifik signal mat bak.grundssignal sorn -uppnas nal' en Pinkelanordning anvands Lirpotemielit hogre An vid anvandning aV en komplett fierbandskonfiguration, men i jiimfOrelse med fierbandsfiltersatser, ger Sedatkontigurationen i de fiesta fall det hogsta signal-till-brus-forhallandet, I jamfbrelse med filterkubtilliimpningen sum visas i Fig. I kan IPinkel ochleller Sedatkontigurationen eventuellt mejliegora mycket snabbt byte vid owkoppling av Mika .filterkonfigurationer, Det ska tillaggas alt /ilia de olika tillampningar sant illustreras i Fig. I och 2a-2c visas sum en tillinnpning att genemaira en ljasrefiekterande strategi", dvs. att ljus traffar pinvet 102 //eh sedan retlekteras fillhaka mot detekteringsanordningen 124, Del bor dock forstas att det uppfinningsenliga -koncepte dven kart tiHihnpas genom att 16.ta lius passera. "genom" ph-wet 102, vilket t ex gOr det mojiig att plaeera detekteringsanordningen 124. "bakom" .provet 102, eller yid flagon artaari vinkek Med hanvisning nu till Fig. 3, sum visar exchationslemissionsdiawam for en tlertal olika fluorokromer sum fillampas I enlighet med uppfinninge.n, I. illustrationen I Fig, 3 bar prove 102 miirkts med sju olika Fluerokremer, och ger &armed s-ju alike Fluoreseenssignalef son/ kommer till detekterings.anordning-en 1.24.
Silsom diskuterats ovan„ det generella problem sorn loses genom uppfmningen är separering av signalerna frail cIt pray markt med den flirsta -fluorokromen orb samndigt. 11 537 103 markt med den andra fluorokroinen Som bildar et par av flunrokromer. Siisom diskuterats man ar den Kirsta och den andra florokromen vaida bland tluorokremer som emitterar hus "nom det syriliga spekttat (t ex vanligtvis Mom 400 till 640 run), och den fOrsta nub den andra flunrokromen ir awing= en kombinationinar av fluorokromer bestdende av en Cy3 uorokromanalog och en 594 fiuorokromanalog, respektive, eller den fOrsta ()eh den andra fluorokromen ir antingen en kombinationipar av fluorokromer bestaende av en 425 fluorokronlanalog oeh en 488 ft uorokromanalog; respektive.
Vanligtvis iir dessa flunrokromer dr ljusstarka nob har spektral Overlappning (425 jamfort med 488 och Cy3 jiirriRirt med 594), len exemplifterande utforingsform av uppfilmingen bar 594 excitationsfiltret fortlyttats over 595 am 1t.ex. 602/13 nm), som fOljaktligen gor det mOjligt art excitera 594 utan art exciter:a Cy3. Dessutom, genom alt flytta Cy3 emissionsfiltret under 585 rim (t.ex. 577110 nm", har det overraskande varit mojligt alt detektera emissionssignal fiat; Cy3 utan alt detektera emissionssignal frail 594. Med dessa optimeringar„ gOr flberanordningarna for Cy3 (hus och filterkomponenter) och filteranordningama for 594 det mOjligt an separera signalema fran varje enskild flunrokrorn. Det ska interns att flunrescerissignalema forblev tillftedstallande starka med de optimerade filtersatsema. En liknande anpassning kat: i ett annat exempel gOras fOr kombinationen av en 425 och en 488 fluerokromanalog, Dart ill bar signal-till-brus-thrbidlandet i kanalen for 488/FITC (flunresceinisotioeyanat) optimerats genom aft annska autoil )reseens frdi viivnaden, vilket Or en vanligt problem for detektion av 488/F1TC. Miniga molekyler i viivnader aktiveras av hus i det MO spektrat, exempelvis mitokondriella proteiner, kollagen och clastin, vilket ger upphov till autotllioreseens nub emission av hus Over ett brett vagidngtisintervall Genom alt flytta excitationsfiltret Over 490 rim (500/20 tin) forsvann den storsta delen av autotflUOreSOCTIscn, vilket viisentligt fOrbattrade signal -ti11-bms-fOrhiillandet, Man masie vara noga med an viilja ett emissionsfilter for 488/PTEC (525/15 rim) som inc tar in emissionssignal frOn Cy3. FOrflyttningen av emissionsfiltret for 488/FITC gay utrymme for ytterligare en kanal mellan DAP.1 och FITC (excitation nvanfor 420 nm och emission under 495). Detta interval l dr problematiskt gdllande hog autofhiorescerts frdri viivnad ()eh fluorokrnmen maste vara hasstark nog alt ge ett acceptabeit signal-till-brus-tbrhallande. Det finns ba.ra en "landfall flourokromer i detta intervail, och tiertalet tit svaga or:Weller paverkds av foioblekning. Likvid visade sig Atto425 vara extremt fotostabil nub ljusstark nog alt overskrida autofluoreseens frdn viivnad. Aven kai-nfargen Sytoxrilue uppicyllde kriterierna delta interval!. 12 537 103 Slutligen valdeslintrodueeradesfanvandes Mira infrarOda littorokromer for att marka in provet 102.kvieksilverlampan ärsvag vid vaglangder over 600 nm lir det swirl att f tilirackligt med rjusenergi for att piteti adekvat satt excitera Mira infrarOda thorn:km/7nm :Her att ha testat ett ant& fluorokromer, visade sip; PerCP och dens analoger (t,ex. PerCP-C y5,5) vara utmarkta.
PerCP bar ett ston (i jimfdrelse) Stoke skill och kan dammed aktiveras med blatt ljus med hOg energi, °eh dess signal kunde latt skiljas Iran de andra flunrokromema uppstillningen, Av alla infrarOda iluerokrorner sum testades med mindre jarniZrelse; Stoke skiti, har Oct visat sig att CF66OR gay en tillrackligt bra signal iiven nar den aktiverades vid ett vinallingdsintervall > 625 nal, AIItsâ kunde bide PerCP och CF66OR anvandas i denna tletilirgsuppstallning.
Foljaktligea, med hjilp av uppfinningen iir Oct mO1igt att separat detektera signaler fran fyra eller flera olika fluorokromer son: emitterar ljus inom Oct synliga spektrumet. Genom att dessutom valja fatorokromer sum avger kjus i Oct Mira infrarOda eller infrarOda spektrumet (typiskt Over Oct synliga spektrumet) am del m&iigt att separera sii manga sum sju olika fluorescenssignaler. Vidare, det vill saga mer in silt olika fluoreseenssignaler skulle kunna vara mojligt att separera vid anvandning av en ljuskalla (tex. en "normal" Isk511a i kombination ineci ii.t exempel ytterligare LED-lampor) sum avger ljus I bSde det synliga spektrumet och del infrarOda spektrumet I kombination medlinorokromer sumir aktiva i Oct infrarOda spektrumet. Samna koneept iir naturligtvis mai ligt liven RV Oct oltravioleta spektrumet sAväl sum far andra ljuskallakombinationer.
.Nedan ges en mojlig kombination av exemplifierade fluorokrom • (eller andra analoga fluorokmmer) med lainpliga interval! tr att placera excitation och enusslonsfilter if/OM, .Fh,torokrorn Exeitationstilter Emissionsfilter DAPI 330-380 4.20-500 Atto4420-4435-48 488. .480-5500-5. 535-55.565-59.. 594 590-6600-65 6(JOR diem 625-660 660 - PerCP-C,,,,i5,420-500 645 - 13 537 103 Alternativt kan i en annan utforingsform av uppfinningen nedanstaende kombination vara inkij ig.
FluorOkrom .Exeitationsfriter Ernissionsfilter 8V42.1. 330-380 41.0-440: Atto4425-.0. 455-480 488 480-5500-.5 Cy3 535-55565.-595. 594. 5904600-6.5 .PerCP. 420-500 655:- DRAQ600-655. 695 - Slutligen till Fig. 4 scm illustrerar eft exernplitierande fli3desschema sorn visar mttodstegen for att skota mikroskopisystemet 100 i enlighet med upptirmingens Processen borjar med valet, Si av iinninstone fyra olika fluorokromer, inklusIve en (.!y3 fluorokromanalog och en 594 floorokromanalog„ De anninstone fyra olika iluorokromerna anvands sedan for att marks provet 102. ett prov är av flagon av de ovan diskuterade typerna.
Pti grkmdval av de finoroKromer som wilts for att naarka provet 102, viiljs ott motsvarande antal tvanligtvis sâ m6,11g:a som antalet valda fluorokromeo excitationsvagiiingdsintervall, S2, diir excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen am speei fikt valt med hansyn till evanstlende diskwsion och sá att exciteringen ay den forsta fluorokromen ar reducerad. Sedan vahs tilteranordningen, t ex emissionsfiltret/filtren av fiiterkub ealuberna 112 (eller alternativt enligt Pinkel oiler Sedat konfiguration), S3, fbr att tillâta ljns att passera Mom olika emissionsvaglanadsintervall som overenssammer med ernissionsviigliingdsintervallen hos minst fra aka fluorokromer. Avon ham ska de alimanna kriterierna uppfyllas, due emissionsvagPangdsinterval let for den forsta fluorokromen vabs f?'.1r att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, dam en Cy3 fluorokromanaIng bildar den Rirsta fluorokromen rich en 594 fluorokrornanalog bildar den andra fluorokromen, oiler en 425 fluorokromanaiog bildar den tOrsta fluorokromen rich en 488 fluorokromanalog bildar den andra fluorokromen.
Genom an t ox anvanda st3n-enheten 126 i kombination med ljuskallan 106, filterrevolvern rich filterkober 112, anvands mikroskopisystemet 100 for aft sekventiolit emittera ljus. 54, inom de utvaida excitatio svildiinndsintervallen. Antingen baserat pd en 14 537 103 Iwnfiguration med reflekterande bus eller genem att lata ljus passel-a genom provet 102, detekteras thoreseerande ijus fnan fluerokromerna SOM anviinds for att marka provet 102 till exempel under kontroll av stymnheten 126 i kennbination med den digitala kameran (detektionsanordning 124) Mir ljuset har passerat genem filteranordningen (van4rtvis ilittninstone inkluderat emissiensfilter).
Siesem diskuterats ()van, kan bildema vara tagna individucilt, en pseudolirg, kan digitait applieeras, och bildema kan sedan ägas samman Over yarandra for att skaps en flerfargsbild. Det kan, s1som ocksi diskuterats ovan, vara mOillg att utfOra en kontinuerlig insamling Hider som tas efter hand.
Sammanfattningsvzs rdr tbreliggande uppfmning en meted ifir att detektera fluorescens som emitteras frtin ett prey markt mod ett flertal fdrutbestZimda fluorokromer med anylindning av ell mikreskopisystem som innefattar en ljuskalleanerdning, varvid metoden innefattar stegen all vhja itminstone fyra olika ftuerekromer kentigurerade for att avge llus inom det synli,ga ljusspektrumet, de iitminstone fyra elika fluomkromema innefattas en forsta °eh en andra tluerokrom .som bildar ett par av fluorokromer, yaija excitationsvilgllingdsintervall for de .itminstone fyra elika fluorokremerna, diir excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluerekromen väjs sO att exeiteringen av den forsta fluorokromen äï redueerad, konfiguration f.1% en filteranordning hos mikroskopisystemet fir all selektivt tillOta ljus att passers Mom emissionsviigl.tingdsinteryall som Overensst-amtner med emissionsviiglangdsinteryallen hos de Anninstene fyra elika fluorekromema, Our emissionsvagliingdsintervallet for den forsta thorokromen är vald fOr att minska genombiodning av jusernissien frau den andra fluerekroinen, sekventiellt mitten: ljus >nom ilitminstone en del av de valda exeiteringsvag,langdsintervalierna ech detektera ijus anm emitteras frau provet genera fliteranerdningen, dl=ir pare av fluorokromer IIjs som en Cy3 tiorokromanalog som bildat den fOrsta fittorokromen °eh en 594 fluorokromanaiog som bildar den andra fluorekromen, eller pact ày fluerekromer ,41,js som en 425 fluorokremanalog sum bildar den forsta fluorokromen ()eh en 488 fluerekromanale2, sem bildar den andra fluorokromen, Uppfinningen Or baserad pa ins; kten att genorn alt lOss det primiira problemet med ad separera fluerescenssignaler sum emitteras frin ett prey markt med en thrsta fluorokrom och en andra fluorekrom, kommer fordelar med reducerade komplikationer fkir att eeksA tillata sepuering av ytterligare fluorescenssigtialer barstarnmade frail en tredje cell en tjarde (olika) fluorokrom, begransat till (let fall 00 fluorokromerna emitterar tins mom dci synliga spektrat (t. ex typiskt i intervallei 400 till 640 ran) eel: de forsta och andra 537 103 fluorokromerna är antingen en kombinationipar as fluorokromer som utgors av en Cy3 fluorokromanalog och en 594 analoa fit:lora:Tom, respektive, eller de .65rsta °elk andra fluorokrumerna är en kombinationlpar av fluorokromer som utgors av en 425 fluorokromanalog Ca en 488 fluorokrornanalog, respektive. Detta i enlighet med uppfinningen uppnas g.enom aft vdija ett exciteringsvagldngdsintervall for den andra fluorokromen, s aft exeiteringen av den fOrsta fluorokromen reduceras och genom att vidlja ett emissionsvagliingdsinterval/ for den fOl.sta fluorokromen, sá att genomblodning ov ljusemission frn den andra fluorokromen är redueerad.
A.ven om figurerna kan visa en viss ordning av metodste2 kan ordningen av stegen skilja sig frn Widen, Dessatom kan tv eller flera steg utfOras samtidigt eller delvls samtidigt. Siidana variationer beror pa utformarens vol. Alla &Matta variationer dr inm ramen for upptdekten. Dessetom, hien um npplinningen bar beskrivits med banvisning tiil spec:Ilk:a utthringsexempel, kommer manga olika ambingar, modifieringar och liknande att bli uppenbara 1-13r fackmannen inom teknikontrildet. Variationer av de beskrivna utforingsfonnerna kan fOrstds och genoinforas av fackmannen vid anvandning av den patelm.:43kta uppfinningen, genom aft begrurlda ritningarna, beskrivningen och de hifogade kraven. Dessutom, i kraven, ordet "innefattande" uteslater low andra element eller steg, och den obestamda artikeln "en' eller "en' utesluter ini.0 en mangfaid, 16
Claims (10)
1. en ljuskalleanordning konfigurerad att emittera ljus;
2. en ljusledare for att leda ljus fran ljuskalleanordningen till provet for excitering av de flertal forutbestamda fluorokromerna;
3. en filteranordning konfigurerad for att tillata separation av fluorescens som emitteras av de flertal forutbestamda fluorokromerna som provet är inmarkt med. och
4. en detekteringsanordning konfigurerad for att ta emot ljus som passerar genom filteranordningen, dar
5. filtersatserna i mikroskopet kan separera signaler fran atminstone fyra olika fluorokromer som avger ljus i det synliga ljusspektrumet med en fOrsta och en andra fluorokrom som bildar ett par fluorokromer,
6. ljuskalleanordningen är konfigurerad for att sekventiellt emittera ljus inom atminstone fyra olika excitationsvaglangdsintervall,
7. excitationsvaglangdsintervallet for den andra fluorokromen är vald for att reducera excitering av den forsta fluorokromen, 8. filteranordningen innefattar atminstone fyra matchade filter konfigurerade for att tillâta ljus att passera inom minst fyra olika emissionsvaglangdsintervall, 9. emissionsvaglangdsintervallet for den forsta fluorokromen är vald for att minska genomblodning av ljusemission fran den andra fluorokromen, och 10. paret av fluorokromer valjs som en Cy3 fluorokromanalog som bildar den 18 537 103 fOrsta fluorokromen och en 594 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen, eller paret av fluorokromer valjs som en 425 fluorokromanalog som bildar den forsta fluorokromen och en 488 fluorokromanalog som bildar den andra fluorokromen.
8. Mikroskopisystem enligt krav 7, varvid detektionsanordningen innefattar en bildfangande anordning konfigurerad for att ta fluorescensbilder av provet.
9. Mikroskopisystem enligt nagot av kraven 7-8, varvid ljuskalleanordningen innefattar ett flertal smalbandade lysdioder.
10. Mikroskopisystem enligt nagot av kraven 7-9, varvid ljuskalleanordningen innefattar en kombination av en ljuskalla som emitterar ljus inom ett ultravioletta och synliga vaglangdsspektrumet och ett flertal lysdioder som avger ljus inom Atminstone en av det nara infraroda eller infraroda ljusspektrumet. 19 Styming av position till filterrevolver Styming av position till filterrevolver 114 106 110—"—! ;-■..-1 1 1 1 117 104 I
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1351503A SE537103C2 (sv) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer |
| EP14872537.7A EP3084503A4 (en) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes |
| JP2016547559A JP2017509010A (ja) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | 多数の蛍光色素からの発光の検出を伴う蛍光顕微鏡のためのシステムおよび方法 |
| US15/100,646 US20160306156A1 (en) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes |
| CN202010099834.8A CN111208106A (zh) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | 显微镜系统和用显微镜系统检测从样本发射的荧光的方法 |
| PCT/SE2014/051484 WO2015094088A1 (en) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes |
| EP20170591.0A EP3745181B1 (en) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | Fluorescence microscopy system and method |
| CN201480068794.3A CN105829944A (zh) | 2013-12-16 | 2014-12-11 | 用于荧光显微镜以检测来自多种荧光染料的光发射的系统和方法 |
| US15/627,601 US11668918B2 (en) | 2013-12-16 | 2017-06-20 | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1351503A SE537103C2 (sv) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE1351503A1 SE1351503A1 (sv) | 2015-01-07 |
| SE537103C2 true SE537103C2 (sv) | 2015-01-07 |
Family
ID=52122270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE1351503A SE537103C2 (sv) | 2013-12-16 | 2013-12-16 | System och metod för fluorescensmikroskopi med detektering av ljusemission från multipla fluorokromer |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20160306156A1 (sv) |
| EP (2) | EP3745181B1 (sv) |
| JP (1) | JP2017509010A (sv) |
| CN (2) | CN111208106A (sv) |
| SE (1) | SE537103C2 (sv) |
| WO (1) | WO2015094088A1 (sv) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180065038A (ko) * | 2016-11-29 | 2018-06-18 | 한국화학연구원 | 자외선 검사 장치 |
| CN106596497A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-04-26 | 浙江大学 | 一种短波红外荧光显微成像的方法 |
| JP6977287B2 (ja) * | 2017-03-29 | 2021-12-08 | 東ソー株式会社 | 複数の蛍光物質を用いた標識方法 |
| CN110488024B (zh) * | 2019-09-23 | 2022-07-12 | 北京纳诺金生物科技有限公司 | 采用荧光技术检测多种待检测物质的方法及荧光检测产品 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5863504A (en) * | 1995-03-16 | 1999-01-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fluorescence imaging instrument utilizing fish |
| CA2350692A1 (en) * | 1998-10-29 | 2000-05-11 | Cell Works Inc. | Multiple marker characterization of single cells |
| GB0121700D0 (en) * | 2001-09-07 | 2001-10-31 | Univ Leicester | Detection of fluorescence |
| JP4673000B2 (ja) * | 2004-05-21 | 2011-04-20 | 株式会社キーエンス | 蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡装置を使用した表示方法、蛍光顕微鏡画像表示プログラム及びコンピュータで読み取り可能な記録媒体並びに記憶した機器 |
| JP4789454B2 (ja) * | 2004-12-03 | 2011-10-12 | 株式会社キーエンス | 蛍光顕微鏡 |
| JP4968575B2 (ja) * | 2006-01-27 | 2012-07-04 | 横河電機株式会社 | 共焦点顕微鏡 |
| US7776613B2 (en) * | 2006-08-07 | 2010-08-17 | President And Fellows Of Harvard College | Sub-diffraction image resolution and other imaging techniques |
| JP2008139796A (ja) * | 2006-12-05 | 2008-06-19 | Keyence Corp | 蛍光顕微鏡、蛍光顕微鏡の操作方法、蛍光顕微鏡操作プログラム及びコンピュータで読み取り可能な記録媒体並びに記録した機器 |
| WO2008114372A1 (ja) * | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Shimadzu Corporation | 生体用蛍光測定装置及び蛍光測定用励起光照射装置 |
| WO2009001390A1 (en) * | 2007-06-28 | 2008-12-31 | Gian Luca Ferri | Adjustable multi-band excitation and visualization / imaging system for simultaneous viewing multiple fluorescence |
| WO2009057301A1 (ja) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Nikon Corporation | レーザ励起蛍光顕微鏡 |
| WO2009069675A1 (ja) * | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Nikon Corporation | 蛍光顕微鏡 |
| US8031924B2 (en) * | 2007-11-30 | 2011-10-04 | General Electric Company | Methods and systems for removing autofluorescence from images |
| DE102008049886B4 (de) * | 2008-09-30 | 2021-11-04 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Vorrichtung, insbesondere ein Mikroskop, zur Untersuchung von Proben |
| JP2010284101A (ja) * | 2009-06-11 | 2010-12-24 | Hitachi High-Technologies Corp | 反応容器，並列処理装置、及びシーケンサ |
| DE202010010932U1 (de) * | 2010-04-19 | 2011-10-07 | Witec Wissenschaftliche Instrumente Und Technologie Gmbh | Vorrichtung zur Abbildung einer Probenoberfläche |
| JP6075963B2 (ja) * | 2012-03-26 | 2017-02-08 | オリンパス株式会社 | 蛍光観察方法及び蛍光観察装置 |
| EP2757402B1 (en) * | 2013-01-22 | 2016-03-30 | FEI Company | Method of observing samples with a fluorescent microscope |
| CN103513411B (zh) * | 2013-09-27 | 2016-02-03 | 香港应用科技研究院有限公司 | 荧光显微镜中聚焦的装置和方法 |
-
2013
- 2013-12-16 SE SE1351503A patent/SE537103C2/sv unknown
-
2014
- 2014-12-11 JP JP2016547559A patent/JP2017509010A/ja active Pending
- 2014-12-11 EP EP20170591.0A patent/EP3745181B1/en active Active
- 2014-12-11 EP EP14872537.7A patent/EP3084503A4/en not_active Ceased
- 2014-12-11 US US15/100,646 patent/US20160306156A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-11 CN CN202010099834.8A patent/CN111208106A/zh active Pending
- 2014-12-11 WO PCT/SE2014/051484 patent/WO2015094088A1/en active Application Filing
- 2014-12-11 CN CN201480068794.3A patent/CN105829944A/zh active Pending
-
2017
- 2017-06-20 US US15/627,601 patent/US11668918B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE1351503A1 (sv) | 2015-01-07 |
| CN111208106A (zh) | 2020-05-29 |
| EP3084503A1 (en) | 2016-10-26 |
| EP3745181A1 (en) | 2020-12-02 |
| US11668918B2 (en) | 2023-06-06 |
| US20160306156A1 (en) | 2016-10-20 |
| EP3745181C0 (en) | 2024-05-29 |
| JP2017509010A (ja) | 2017-03-30 |
| US20170285317A1 (en) | 2017-10-05 |
| EP3745181B1 (en) | 2024-05-29 |
| CN105829944A (zh) | 2016-08-03 |
| WO2015094088A1 (en) | 2015-06-25 |
| EP3084503A4 (en) | 2017-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6190096B2 (ja) | インターリーブされた画像によるマルチイメージングシステム | |
| US11668918B2 (en) | System and method for fluorescence microscopy with detection of light emission from multiple fluorochromes | |
| US20080029711A1 (en) | Multimarking Fibre-Type Fluorescence Microscopic Imaging Method And System | |
| US20110183370A1 (en) | Optical imaging for identifying cells labeled with fluorescent nanoparticles | |
| WO2017210180A1 (en) | Imaging system with oblique illumination | |
| US20180252909A1 (en) | Microscopy system and microscopy method for quantifying a fluorescence | |
| JP2009065848A (ja) | 遺伝子発現解析方法および遺伝子発現解析システム | |
| US11041756B2 (en) | Method and apparatus of filtering light using a spectrometer enhanced with additional spectral filters with optical analysis of fluorescence and scattered light from particles suspended in a liquid medium using confocal and non confocal illumination and imaging | |
| CN212514276U (zh) | 宽光谱荧光多通道实时成像系统 | |
| JP2017078724A (ja) | 多色蛍光画像分析装置 | |
| US20210181112A1 (en) | Devices and methods for imaging biomolecules | |
| Butler et al. | Multi-dimensional spectral single molecule localization microscopy | |
| US20160215330A1 (en) | Nucleic-Acid-Sequence Determination Device and Nucleic-Acid-Sequence Determination Method | |
| US20190227291A1 (en) | Fluorescence microscope | |
| DE102011055639A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur simultanen Multikanal- und Multimethoden-Akquisition von synchronisierten Parametern in systemübergreifenden Fluoreszenzlebensdaueranwendungen | |
| Connolly et al. | Simultaneous multi‐spectral, single‐photon fluorescence imaging using a plasmonic colour filter array | |
| WO2018074833A1 (ko) | 다중 파장 내시경 시스템 및 이를 이용한 영상 처리 방법 | |
| JP2007225381A (ja) | 蛍光測定方法及び蛍光顕微鏡 | |
| KR20130042791A (ko) | 형광 영상을 촬영하는 장치 및 방법 | |
| US10610088B2 (en) | Multi-wavelength endoscopic system and image processing method using same | |
| KR20240071010A (ko) | 멀티컬러 동시 형광 이미징 장치 및 방법 | |
| JP2024519860A (ja) | 生体試料を分析する方法およびデバイス | |
| JP2005069827A (ja) | レーザ走査型蛍光顕微鏡 | |
| US20180128684A1 (en) | Dye measurement device and dye measurement method |