JP2013544242A - セレンテラジン誘導体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2010年11月2日に出願された米国特許出願第61/409,413号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、酵素の存在と活性をアッセイする化合物および方法を提供する。
式中、R2は−(CH2)n−TまたはC1~5アルキルであり;
R2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は共に水素、または共にC1~2アルキルであり;
RAはC1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたはCH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールであり;
Lはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線の結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
式中、R2は、−(CH2)n−TまたはC1~5アルキルであり;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
R11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、または共にC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
L’は直接結合またはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線の結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
式中、R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
R12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
Lは直接結合またはリンカーであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
式中、R2は−(CH2)n−TまたはC1~5アルキルであり;
R8は、
R16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2またはNHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール;
L’は直接結合またはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
「アルキル」という用語は、炭化水素化合物から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。アルキル基には、1〜30個の炭素原子、または1〜12個の炭素原子、または1〜10個の炭素原子、または1〜6個の炭素原子、または1〜4個の炭素原子が含まれてもよい。アルキル基は、直鎖または分岐でもよく、かつ飽和でも、一部不飽和でも、または完全に不飽和でもよい。アルキル基は、任意選択的に、例えばハロで置換してもよい。直鎖アルキル基の実施例には、エチル、n−プロピル、n−ブチル、およびn−プロピル、n−ヘキシルおよびn−ヘプチルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖不飽和アルキル基の実施例には、エテニル(ビニル、−CH=CH2),2−プロペニル(アリル、−CH−CH=CH2)、およびブテニルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素−炭素三重結合を含む不飽和アルキルの実施例として、エチニルおよび2−プロピニル(プロパルギル)が含まれるが、これらに限定されない。分岐アルキル基の実施例には、イソプロピル、イソ−ブチル、sec−ブチル、t−ブチルおよびイソ−ペンチルが含まれる。
セレンテラジンは、海洋ルシフェラーゼなど、広範な種類の生物発光タンパク質が作用すると発光することが知られている。海洋ルシフェラーゼの実施例として、ウミシイタケルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシアルシフェラーゼ、オプロフォルスルシフェラーゼ、およびウミホタルルシフェラーゼが含まれる。
R2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2、または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール;
Lはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;
(2)
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
R11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、または共にC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
L’は直接結合またはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;
(3)
R8は、
R12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
L’は直接結合またはリンカーであり;
Vは、−S−または−O−であり;
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;
(4)
R8は、
R16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCはアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール;
L’は直接結合またはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。
Xはそれぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Zは−CH−または−N−であり; Yは−Hまたは−OHであり;Wは−NH2、ハロ、−OH、−NHC(O)R、−CO2Rであり;およびRはC1~7アルキルである。
XはOまたはSである。別の実施形態では、R2はC2~5直鎖アルキルである。ある実施形態では、R8は、
本発明のセレンテラジン誘導体は、チトクロームP450酵素、プロテアーゼまたはグリコシダーゼなどの非発光酵素の存在または活性を検出するために、アッセイ試薬で使用され得る。発光酵素およびその基質を使用するアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、発光酵素、発光反応混合物および非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を、非発光酵素含有と思われるサンプルに加えてもよい。もし非発光酵素がサンプルに存在するなら、非発光酵素がセレンテラジン誘導体に作用して、発光酵素により認識され、発光信号を産生する。代わりに、非発光酵素が、発光性セレンテラジン誘導体を非発光性形態、すなわち信号アッセイの喪失状態に変換することもできる。
本発明はまた、一つまたは複数の非ルシフェラーゼ酵素の存在または活性を決定するためのキットを提供する。キットには、以下のうち一つまたは複数が含まれ得る。すなわち、セレンテラジン誘導体(複数可)、非ルシフェラーゼ酵素(複数可)、セレンテラジン−依存性発光酵素(複数可)、および反応緩衝剤(複数可)である。反応緩衝剤は、非ルシフェラーゼ酵素反応および発光酵素反応のための個々の調剤に存在してもよく、または単独ステップアッセイの単独調剤に存在してもよい。本発明のキットにはまた、非ルシフェラーゼ酵素(複数可)の阻害剤、活性剤および/または強化剤が含まれ得る。本発明のキットにはまた、アッセイの陽性対照および/または陰性対照が含まれ得る。
フラスコにFmoc−Asp(OtBu)−OH (6.7g、16.28mmol)および100mlの乾燥THFを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水N−メチルモルホリン(1.9mL、17.28mmol)を加え、溶液を−20℃まで冷却した。無水イソブチルクロロホルメート(2.2mL、16.96mmol)をシリンジで加え、得られた懸濁液を10分間攪拌した。アミノアルコール(2.0g、16.24mmol)を一回分加え、反応混合物を10分間攪拌し、その後、冷浴から取り出し、周囲温度で2時間攪拌を継続した。前記反応混合物を300mLの酢酸エチルで希釈し、その混合物を50mLの水で2回、50mLの0.5MのHCl、50mLのブライン溶液で2回と、連続して洗浄した。有機相を乾燥させ(MgSO4)、真空下で濃縮した。残渣を、ヘプタン/酢酸エチルの勾配を用いたシリカクロマトグラフィーにかけた。これにより、白色固体として5.2g(10.7mmol)の産物を得た。1H NMR(300MHz、dmso)、d10.02(s、1H)、7.89(d、J=7.5、2H)、7.81〜7.67(m、3H)、7.55(d、J=8.4、2H)、7.47〜7.27(m、4H)、7.24(d、J=8.4、2H)、5.09(t、J=5.7、1H)、4.51(m、1H)、4.43(d、J=5.7、2H)、4.37〜4.16(m、3H)、2.76〜2.51(m、2H)、1.37(s、9H)。
フラスコに、アルコール(13)(0.5mg、0.97mmol)および15mLの乾燥ベンゼンを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水トリエチルアミンを加え、2分間攪拌した後、混合物を氷/水浴槽で10分間冷却した。これに、無水塩化チオニル(78μL、1.07mmol)を加え、2分後に冷浴槽を取り除き、周囲温度で3時間攪拌を継続した。反応混合物を、セライトパッドを通じて濾過し、濾過ケークを30mLの乾燥ベンゼンで濯いだ。濾過液を真空下で濃縮し、塩化メチレンを用いたシリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製した。これにより、粘着性白色固体として、457mg(0.85mmol)の産物を得た。1H NMR(300MHz、dmso)δ10.16(s、1H)、7.89(d、J=7.5、2H)、7.79(d、J=8.1、1H)、7.76〜7.68(m、2H)、7.61(d、J=8.5、2H)、7.44〜7.27(m、6H)、4.72(s、2H)、4.58〜4.44(m、1H)、4.33〜4.18(m、3H)、2.63(ddd、J=6.0、14.6、21.8、2H)、1.37(s、9H)。
乾燥フラスコに、アルゴン雰囲気下で、セレンテラジン−h(7)(200mg、 .37mmol)および15mLの無水、脱酸素DMFを入れた。この溶液に、周囲温度で、ヨウ化カリウム(31mg、0.19mmol)および炭酸カリウム(51mg、0.37mmol)を加え、その混合物を約2時間攪拌した。これに、化合物14を加え、その混合物を18時間攪拌した。産物を逆相および順相クロマトグラフィー双方により精製した。
3mLのジクロロメタンに化合物17または18のいずれか(365mg、0.4mmol)を周囲温度で混ぜた溶液に、7mLのジクロロメタンにピペリジン(2mL)を混ぜた溶液を加えた。反応混合物を30分間攪拌し、50mLのトルエンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、0.1%TFA/水とアセトニトリルの勾配を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリルにした。位置異性体の混合物(133mg、0.19mmol)を2mLの乾燥DMFで分解し、HOBt(30mg、0.22mmol)およびz−DEVD−CO2H(140mg、0.23mmol)を加えた。この溶液に、周囲温度で、EDC(42mg、0.22mmol)を加え、その反応混合物を一晩中攪拌した。前記粗反応混合物を1mLのアセトニトリルで希釈し、20mMの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、54mgの化合物19および69mgの化合物20を得た。
化合物19および20の粗混合物を、2mLのジクロロメタンで分解し、周囲温度でこの溶液に、4mLのトリフルオロ酢酸、2mLのジクロロメタン、0.4mLのトリイソプロピルシラン、および0.4mLのチオアニソールを含む脱保護カクテルを加えた。反応混合物を3時間攪拌し、30mLのジエチルエーテルで希釈した。この懸濁液を遠心分離し、その固体を10mLのジエチルエーテルで2回すりつぶした。残渣を、2mLのメタノールで分解し、20mMの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、オレンジ色の固体として、9mgの化合物21を得た。
50mMのHEPES緩衝剤pH7.2、2mMのDTT、および0.5%CHAPSの中で、化合物21(50μM)を、ウミシイタケルシフェラーゼ(6.5μg/ml、ウミシイタケ−GST融合)と混ぜ合わせ、20分間培養し、ウミシイタケルシフェラーゼの基質となり得る任意の遊離セレンテラジン誘導体を取り除いた。精製されたカスパーゼ−3酵素(50U/ml)または緩衝剤コントロールを、最終濃度がそれぞれ25μMのZ−DEVD−セレンテラジンh誘導体基質、25U/mlのカスパーゼ−3および3.25ug/mlルシフェラーゼを1:1の容積比で加えた。発光は、110分間かけて測定した。経時的に、カスパーゼを含有しない対照サンプルと比べて、100倍の発光増加が観察されたが、これはすなわち、セレンテラジンの酵素放出を示しており、本発明のセレンテラジン化合物が、カスパーゼ酵素(図1)の検出に用いられ得ることを実証したものである。
250mLの丸フラスコの中で、b(6g、0.011mole)をジメチルホルムアミド(60mL)で分解した。ピペリジン(10mL)を加えた。4時間後、TLCが反応の完了を示した。溶媒を蒸発させた。残渣を、シーライト(250mLのEtOAc中15g)上に載せ、MeOH(DCM中10%)に向かって勾配するDCMを用いて、シリカ(80g)上で溶出することにより精製した。混ぜ合わされた分画を蒸発させた。収率(76%);Rf=0.2(50/50Hept/EtOAc)、1H NMR(300MHz、dmso)δ7.56(d、J=8.3、2H)、7.22(d、J=8.3、2H)、5.06(t、J=5.4、1H)、4.41(d、J=4.6、2H)、3.61(t、J=6.5、1H)、2.59(dd、J=5.8、15.5、1H)、2.41(dd、J=7.2、15.6、1H)、1.35(s、9H);m/z。
100mLの丸底フラスコに、Z−D(tBu)E(tBu)V−OH(3.96g、6.5mmol)、c(1.6g、5.4mmol)、HOBt(0.915g、5.9mmol)、およびDMF(25mL)を加えた。攪拌する溶液に、EDAC(1.15g、5.9mmol)を加えた。18時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc(200mL)で再分解した。溶液をクエン酸(30%、50mL)、重炭酸塩(bicarbonatesat)(50mL)、水(2×50mL)およびブライン(50mL)で洗浄した。材料をシーライト(15g)上で吸着し、ヘプタンからEtOAcへ勾配するシリカ上で精製した。収率(74%)。1H NMR(300MHz、dmso)δ9.85(s、1H)、8.33(d、J=7.7、1H)、7.95(d、J=8.1、1H)、7.83(d、J=8.3、1H)、7.59(d、J=8.3、1H)、7.53(d、J=8.5、2H)、7.43〜7.26(m、5H)、7.21(d、J=8.6、2H)、5.06(t、J=5.7、1H(D2Oシェーク上で消失))、5.02(d、J=4.7、2H)、4.70(q、J=7.7、1H)、4.41(d、J=5.6、2H(D2Oシェーク上でsへコラプス))、4.38〜4.25(m、2H)、4.17〜4.09(m、1H)、2.79〜2.63(m、1H)、2.62〜2.35(m、4H)、2.26〜2.11(m、2H)、2.00〜1.79(m、2H)、1.73(d、J=6.0、1H)、1.34(dd、J=4.7、7.4、31H)、0.81(t、J=6.3、6H)。MS:C45H65N5O13の計測値883.5;実測値883.7。
100mLのRBフラスコへ、ベンゼン(50mL)と共にd(3.56g、4mmol)を加えた。溶液を蒸発させ、高真空下で、一晩中蓄積した。乾燥ベンゼン(70mL)をTEA(610μL、4.4mmol)と共に固体に添加した。溶液を氷浴で氷冷し、SOCl2(320μL、4.4mmol)をゆっくりと添加した。溶液が室温になるまで放置した。4時間後、追加のTEA(241μL)およびSOCl2(100μL)を加えた。さらに2時間後、反応混合物をシーライト(10g)上で吸着し、DCMからDCM中5%MeOHへと勾配するシリカ上で溶出した。収率(33%)。1H NMR(300MHz、dmso)δ10.00(s、1H)、8.35(d、J=7.8、1H)、7.95(d、J=7.8、1H)、7.84(d、J=8.3、1H)、7.67(d、J=8.6、3H)、7.41〜7.22(m、7H)、5.11〜4.91(m、2H)、4.77〜4.59(m、3H)、4.43〜4.21(m、2H)、4.19〜4.04(m、1H)、3.30(s、(水))、2.79〜2.32(m、4H+DMSO)、2.26〜2.07(m、2H)、2.00〜1.79(m、2H)、1.77〜1.60(m、1H)、1.40〜1.24(m、27H)、0.81(t、J=6.4、6H)。
セレンテラジン−h(50mg、122μmol)およびK2CO3(34mg、245μmol)を含有する、アルゴンガスで脱気したガラス瓶へ、DMF(500μL)にe(133mg、147μmol)を混ぜた脱気溶液を加えた。2時間後、PR−HPLCに直接反応を注入し、0.1%TFA(aq)からアセトニトリルへの勾配で溶出した。主要ピークを単離し、蒸発させた。収率(13%)。UV:ピークは250、300、および420nm。1H NMR(300MHz、dmso)δ9.79(s、1H)、8.27(d、J=7.5、1H)、7.92(d、J=8.0、1H)、7.85(d、J=10.1、1H)、7.58(d、J=8.3、1H)、7.53(d、J=8.7、2H)、7.45〜7.14(m、15H)、7.09〜6.80(m、6H)、6.72(d、J=8.8、2H)、5.13〜4.90(m、2H)、4.73〜4.53(m、1H)、4.22(dd、J=5.0、17.7、3H)、4.16〜4.01(m、3H(D2Oシェーク後2H))、3.25〜3.01(m、J=10.0、16.5、4H)、2.76〜2.53(m、J=15.6、2H)、2.51〜2.33(m、2H+DMSO)、2.24〜2.04(m、2H)、1.99〜1.77(m、2H)1.76〜1.61(m、1H)、1.40〜1.07(m、27H)、0.89〜0.62(m、6H)。MS:C71H84N8O14の計算値は1272.6;実測値は1272.8。
30の調製方法(実施例4)と類似の方法を活用して40を作成した。ヘプタン/酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、60%(0.32g)の収率を得た。1H NMR(300MHz、CD2Cl2)δ8.47(s、1H)、8.03(m、2H)、7.57(d、2H)、7.1〜7.5(m、7H)、6.33(s、1H)、6.17(s、1H)、4.58(s、2H、CH2)、4.19(s、2H、CH2)、3.3〜3.7(m、4H、NCH2)、2.7〜3.2(m、8H、2NCH3+CH2)、1.0〜2.2(m、15H、CH3)。MS(m/e):728.5(M+)。HPLC精度:262nmで90%
PBI4442の調製方法と類似の方法(実施例20)を活用して50を作成した。ヘプタン/酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、17%(0.15g)の収率を得た。1H NMR(300MHz、CD2Cl2)δ8.42(s、1H)、7.99(m、2H)、7.57(d、2H)、7.1〜7.5(m、10H)、4.58(s、2H、CH2)、4.19(s、2H、CH2)、3.3〜3.7(m、4H、NCH2)、2.7〜3.2(m、8H、2NCH3+CH2)、1.0〜2.2(m、15H、CH3)。MS(m/e):738.5(M+)。HPLC精度:262nmで95%。
本実施例では、代謝活性細胞の量を測定するために、キニーネ含有セレンテラジン誘導体の使用を示す。生細胞は代謝活性状態を維持するが、細胞が損傷すると、その状態が失われれるのは不可避である。生きた細胞に入ると、キノンセレンテラジンは、オプロフォルスルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼなど、セレンテラジンを利用したルシフェラーゼの基質であるセレンテラジン誘導体に還元する。キノンセレンテラジンの変換は、代謝活性細胞の数に比例し、よって、ルシフェラーゼ反応により産生される光をモニタリングすることで量的に測定することが可能である。
オプロフォルスルスルシフェラーゼ(OgLuc)異形、9B8optを、DEVDカスパーゼ−3切断配列を含むpro−セレンテラジン基質を用いた生物発光アッセイに使用した。精製したカスパーゼ−3酵素を、製造者の取扱説明書に従って、HALOLINK(商標)樹脂(Promega社)を用いて精製した異形9B8optを発現する大腸菌の溶解物サンプルと混ぜ合わせ、100mMのMESpH6.0、1mMのCDTA,150mMのKCl、35mMのチオ尿素、2mMのDTT、0.25%のTERGITOL(登録商標)NP−9(v/v)、0.025%MAZU(登録商標)を含有し、100mMのHERPESpH7.5中の23.5μMz−DEVD−セレンテラジン−hを含むかまたは含まない緩衝剤で、10倍に希釈した。カスパーゼ−3酵素を、室温で3時間、溶解物サンプルで培養し、様々な時点において、Turner MODULUS(商標)ルミノメーターで発光を検出した。バクテリア溶出物のみを含有するサンプルおよびカスパーゼ−3のみを含有するサンプルを対照として使用した。3つの複製物が使用された。図2および表1は、本発明のpro−セレンテラジン基質を用いることで、対象の酵素が検出可能であることを示している。
(O−(8−ベンジル−2−(フラン−2−イルメチル)−6−フェニルイミダゾ[1,2−a]ピラジン−3(7H)−オン−イル)3,4,5,6−テトラアセトキシ−β−ガラクトシド)
本発明のジアホラーゼ検出用pro−セレンテラジン基質を使用して、サンプルに存在するNADHの量を測定した。NADH、ジアホラーゼ、pro−セレンテラジン基質、およびエステラーゼを混ぜ合わせて、サンプルに存在するNADHを検出した。ジアホラーゼにより利用されるpro−セレンテラジンをセレンテラジンに変換した。生成されたセレンテラジンの量は、オプロフォルスルスルシフェラーゼ異形により検出され、生成された発光は、サンプルに存在するNADHの量に比例する。
Claims (16)
- 式(II)で示される化合物。
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
R11は、ペプチド、アミノ酸、糖類, −O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、または共にC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
L’は直接結合またはリンカーであり;
nは、0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい;
の化合物。 - 式(I)
式中、R2は、−(CH2)n−TまたはC1~5アルキルであり;
R2'は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
R6は、−H、−OH、−NH2、−OC(O)Rまたは−OCH2OC(O)Rから成る群から選択され;
R8は、
式中、R3およびR4は共に水素、または共にC1~2アルキルであり;
RAはC1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
Lは、リンカーであり;
nは、0〜3であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;
Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。 - 式(III)で示される化合物。
R8は、
R12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2または−NHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;
L’は直接結合またはリンカーであり;
Vは、−S−または−O−であり;および
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。 - 式(IV)で示される化合物。
R8は、
R16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、−O−RA、−OC(O)O−RA、−N(RB)2またはNHC(O)ORAから成る群から選択され;
式中、R3およびR4は共に水素、またはC1~2アルキルであり;
RAは、C1~4アルキル、置換C1~4アルキル、−CH2−RCまたは−CH2−V−RCであり;
RBは、それぞれ独立して、−Hまたは−RAであり;
RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール;
L’は、直接結合またはリンカーであり;
nは0〜3であり;
Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;
Vは、−S−または−O−であり;
Xは、それぞれ独立して、−S−、−O−または−NH−であり;
Rは、それぞれ独立して、C1~7アルキルであり;および
破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。 - 式中、R2は、C2~5直鎖アルキルである、請求項5に記載の化合物。
- 式中、R8は、ベンジルである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
- Vが、Sである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物。
- 酵素を含有すると思われるサンプルを、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含むことを特徴とする酵素の存在または量の検出方法。 - 発光が、定量化されている、請求項11に記載の方法。
- サンプルには第2酵素が含有されると疑われ、
前記サンプルを、請求項1〜10のいずれか一項に記載の、第2酵素のための基質を含有する第2化合物と接触させる工程、および
該サンプルの発光を検出する工程、
を含む、請求項11に記載の方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与する工程、および
発光を検出する工程、
を含む、in vivoで酵素の存在を検出する方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物を動物に投与する工程、
動物からサンプルを得る工程、および
サンプルの発光を検出する工程、
を含む、酵素の存在を検出する方法。
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