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JP2017506622A - 生細胞への適用のためのプロ基質 - Google Patents

生細胞への適用のためのプロ基質 Download PDF

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Abstract

提供されるのは生細胞のアッセイで有用なプロ基質である。該プロ基質を用いて生細胞にてルシフェラーゼのような酵素の存在または非存在を検出することができる。該プロ基質はセレンテラジンの誘導体または類似体であることができる。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照本出願は、２０１４年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／９３３，２１０号に対して優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本開示は一般に酵素の存在及び／または活性をアッセイするための化合物、組成物及び方法に関する。
レポーター分子を日常的に用いて生物学、生化学、免疫学、細胞生物学及び分子生物学の分野で分子事象をモニターする。たとえば、レポーター分子は、レポーター分子のレベルがレポーター分子に連結された特定のプロモータからの転写に起因するアッセイにおいて採用される。レポーター分子アッセイを用いて遺伝子発現、受容体活性、転写因子、細胞内シグナル伝達、ｍＲＮＡプロセッシング及びタンパク質の折り畳みを含む生物過程を研究することができる。そのようなアッセイで通常使用されるレポーター分子の分析には、放射性同位元素、酵素活性、蛍光または発光の検出が含まれる。
生物アッセイにおける発光には通常、発光性タンパク質の活性が関与する。アッセイ系に有用である発光性タンパク質には、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、Ｖａｒｇｕｌａ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及びエクオリンが挙げられるが、これらに限定されない。発光反応では、発光性タンパク質と発光団と呼ばれる適当な分子との相互作用が反応生成物の１つとして光を生じる。反応で生じた光の量を測定することができる。この測定を定性的に用いて対象の特定の物質または標的が試料に存在するかどうかまたは存在しないかどうかを決定してもよい。この測定をまた定量的に用いて反応における対象の発光性タンパク質、発光団、及び／または対象となる物質若しくは標的の濃度を算出してもよい。
発光反応を用いて非常に少量の特定の検体を検出することができ、その物質はアッセイで特定され、測定される。たとえば、発光反応を用いてプロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グリコシダーゼ、たとえば、ＡＴＰ ＤＨ及びレポーター分子のような種々の代謝産物を検出し、定量することができる。発光反応を用いて、たとえば、抗体及びヌクレオチドプローブが介在するもののような結合相互作用を介する検体を検出し、定量することもできる。発光反応の別の適用は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）であり、それは２つの分子が互いに結合することができるかどうか、または細胞にて共存することができるかどうかを決定することができる。通常、発光反応を用いて１×１０-16モル未満、多くは１×１０-19モル未満で試料に存在する検体を検出することができる。
セレンテラジンは海洋ルシフェラーゼのような種々の生物発光タンパク質に作用すると発光することが知られているレポーター分子である。そのような海洋ルシフェラーゼの例には、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、エクオリン、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ及びＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが挙げられる。
態様の１つでは、開示されるのは式（Ｉ）
の化合物またはその塩であり、
式中、
ＲAは細胞非透過性部分であり；
ＲBは−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり（たとえば、官能基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基への求核付加を触媒してもよく、及び／または官能基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基との求核付加反応を受けてもよい）；
ＲCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基によって置換され；
ＲDは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
ＲEは水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
式中、破線の結合は一緒に式（Ｉ）の化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
特定の実施形態では、
ＲAは、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲBは、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、且つアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲDは、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
ＲEは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
式中、破線の結合は一緒に式（Ｉ）の化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
特定の実施形態では、
ＲAは、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＯＰＯ2Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ2Ｎ（Ｒ8）（Ｒ9）、−（ＣＲ10Ｒ11）m−ＣＯ2Ｒ12、−（ＣＲ13Ｒ14）m−ＣＯＮ（Ｒ15）（Ｒ16）、−（ＣＲ17Ｒ18）m−ＯＮ（Ｒ19）（Ｒ20）、−（ＣＲ21Ｒ22）m−ヘテロシクリル−（ＣＲ23Ｒ24）n−Ｒ25、−（ＣＲ26Ｒ27）m−ヘテロアリール−（ＣＲ28Ｒ29）n−Ｒ30、−（ＣＲ31Ｒ32）m−アリール−（ＣＲ33Ｒ34）n−Ｒ35、及び−（ＣＲ36Ｒ37）m−シクロアルキル−（ＣＲ38Ｒ39）n−Ｒ40から成る群から選択され；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ36、Ｒ37、Ｒ38、及びＲ39はそれぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され；
Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35、及びＲ40は独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−（モノまたはポリアルコキシ）アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
及び
から成る群から選択され、
その際、Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35及びＲ40の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから独立して選択される１、２、３、４、または５の置換基で置換され；
Ｒ41、Ｒ42、及びＲ44は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、４−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され；
Ｒ43及びＲ45はそれぞれ独立して水素、−Ｃ（Ｏ）アルキル及び
から成る群から選択され；
ｍ、及びｎはそれぞれ独立して１、２、３、４、５、または６であり；
ｘ、及びｙはそれぞれ独立して１〜２０から選択される整数であり；
ＲBは、−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49または−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55であり；
Ｒ46及びＲ47は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から選択され；
Ｒ48及びＲ49はそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、−（ＣＲ50Ｒ51）z−ＯＣ（Ｏ）Ｒ52、−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55、−（ＣＲ56Ｒ57）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ58、−（ＣＲ59Ｒ60）Z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ61、−（ＣＲ62Ｒ63）Z−Ｎ（Ｒ64）（Ｒ65）、−（ＣＲ66Ｒ67）z−Ｎ（Ｒ68）Ｃ（Ｏ）Ｒ69、−（ＣＲ70Ｒ71）z−Ｎ（Ｒ72）Ｓ（Ｏ）2Ｒ73、−（ＣＲ74Ｒ75）z−Ｎ（Ｒ76）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ77）（Ｒ78）、−（ＣＲ79Ｒ80）z−Ｎ（Ｒ81）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ82）（Ｒ83）、−（ＣＲ84Ｒ85）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ86、−（ＣＲ87Ｒ88）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ89）、−（ＣＲ90Ｒ91）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ92）（Ｒ93）、及び−Ｃ（Ｒ94）＝Ｎ−ＯＲ95から選択され；
またはＲ48及びＲ49はそれらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−ＮＯ2、−ＣＮ、ハロゲン、オキソ、−ＯＲ96、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ97、−ＳＲ98、−Ｓ（Ｏ）Ｒ99、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ100、−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ101）（Ｒ102）、−Ｎ（Ｒ103）（Ｒ104）、−Ｎ（Ｒ105）Ｃ（Ｏ）Ｒ106、−Ｎ（Ｒ107）Ｓ（Ｏ）2Ｒ108、−Ｎ（Ｒ109）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ110）（Ｒ112）、−Ｎ（Ｒ113）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ114）（Ｒ115）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ116、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ117）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ118）（Ｒ119）、ハロアルキル、−（ＣＲ120Ｒ121）Z−ＣＮ、−（ＣＲ122Ｒ123）z−ＯＲ124、−（ＣＲ125Ｒ126）z−ＯＣ（Ｏ）Ｒ127、−（ＣＲ128Ｒ129）Z−ＳＲ130、−（ＣＲ131Ｒ132）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ133、−（ＣＲ134Ｒ135）z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ136、−（ＣＲ137Ｒ138）Z−Ｎ（Ｒ139）（Ｒ140）、−（ＣＲ141Ｒ142）Z−Ｎ（Ｒ143）Ｃ（Ｏ）Ｒ144、−（ＣＲ145Ｒ146）z−Ｎ（Ｒ147）Ｓ（Ｏ）2Ｒ148、−（ＣＲ149Ｒ150）z−Ｎ（Ｒ151）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ152）（Ｒ153）、−（ＣＲ154Ｒ155）z−Ｎ（Ｒ156）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ157）（Ｒ158）、−（ＣＲ159Ｒ160）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ161、−（ＣＲ162Ｒ163）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ164）及び−（ＣＲ165Ｒ166）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ167）（Ｒ168）から成る群から独立して選択される１、２、３、４、５または６の置換基によって置換され；
Ｒ52、Ｒ55、Ｒ64、Ｒ65、Ｒ68、Ｒ72、Ｒ69、Ｒ76、Ｒ77、Ｒ81、Ｒ82、Ｒ86、Ｒ89、Ｒ92、Ｒ93、Ｒ96、Ｒ97、Ｒ98、Ｒ101、Ｒ102、Ｒ103、Ｒ104、Ｒ105、Ｒ106、Ｒ107、Ｒ109、Ｒ110、Ｒ112、Ｒ113、Ｒ114、Ｒ115、Ｒ116、Ｒ117、Ｒ118、Ｒ119、Ｒ124、Ｒ127、Ｒ130、Ｒ139、Ｒ140、Ｒ143、Ｒ144、Ｒ147、Ｒ151、Ｒ152、Ｒ153、Ｒ156、Ｒ157、Ｒ158、Ｒ161、Ｒ164、Ｒ167、及びＲ168は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ58、Ｒ61、Ｒ73、Ｒ99、Ｒ100、Ｒ108、Ｒ133、Ｒ136、及びＲ148は各存在ごとにそれぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され；
Ｒ50、Ｒ51、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ59、Ｒ60、Ｒ62、Ｒ63、Ｒ66、Ｒ67、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ79、Ｒ80、Ｒ84、Ｒ85、Ｒ87、Ｒ88、Ｒ90、Ｒ91、Ｒ120、Ｒ121、Ｒ122、Ｒ123、Ｒ125、Ｒ126、Ｒ128、Ｒ129、Ｒ131、Ｒ132、Ｒ134、Ｒ135、Ｒ137、Ｒ138、Ｒ141、Ｒ142、Ｒ145、Ｒ146、Ｒ149、Ｒ150、Ｒ154、Ｒ155、Ｒ159、Ｒ160、Ｒ162、Ｒ163、Ｒ165、及びＲ166は各存在ごとにそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され；
Ｒ94及びＲ95は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素及びアルキルから選択され；
ｔは１、２、３、４、５、６、７、または８であり；
ｚは、各存在ごとにそれぞれ独立して１、２、３、または４であり；
ＲCは−（ＣＨ2）0-3−ＴまたはＣ1-5アルキルであり；その際、Ｔはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキルアミノアルキル）、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から独立して選択される１、２、または３の置換基によって置換され；
ＲDは、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びＣ1−Ｃ4−アルキルから成る群から選択され；且つ
ＲEは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルから成る群から選択され；
その際、式（Ｉ）の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい。
特定の実施形態では、ＲAは、−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、式中、ｍは２、３または４であり；Ｒ1及びＲ2は各存在ごとに水素であり；Ｒ3は水素またはメチルであり；且つＲ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、Ｒ4はｔｅｒｔ−ブトキシ、フェニル、メチル、４−トリフルオロメチルフェニル、イソプロピル、４−メトキシフェニルまたは４−フルオロフェニルである。
特定の実施形態では、ＲAは

及び
から成る群から選択される。
特定の実施形態では、ＲBはモルフォリニルアルキルである。
特定の実施形態では、ＲBは

及び
から成る群から選択される。
特定の実施形態では、ＲCはフリルメチルである。
特定の実施形態では、ＲCはベンジルである。
特定の実施形態では、ＲDはベンジルである。
特定の実施形態では、ＲEは水素である。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ−ｉ）；
またはその塩を有し、
式中、ＲA、ＲB、ＲC、ＲD及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ−ｉｖ）：
またはその塩を有し、
式中、Ｒ200はそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
ＲA及びＲBは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ−ｘ）
またはその塩を有し、
式中、
ｓは１または２であり、
Ｒ201は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
ＲAは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ−ｘｖｉｉ）：
またはその塩を有し、式中、ｑは１または２であり；ｓは１または２であり；Ｒ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は




及び
またはその塩から成る群から選択される。
別の態様では、開示されるのは、本発明のプロ基質化合物及び相当する細胞透過性基質を含む組成物である。そのような混合物は、カルバメートで保護された前駆体からの遊離の基質の有意な蓄積がある前のさらに早い時点でさらに高度な光強度を提供することができる。特定の実施形態では、開示されるのは、本発明の化合物と式（ＩＩ）：
の少なくとも１つの化合物の混合物を含む組成物であり、式中、ＲC、ＲD及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、（ＩＩ−ｉ）、（ＩＩ−ｉｉ）、（ＩＩ−ｉｉｉ）、（ＩＩ−ｉｖ）、及び（ＩＩ−ｖ）：

またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。
一部の態様では、開示されるのは、試料におけるルシフェラーゼの存在を検出する方法であって、該方法は、（ａ）本発明の化合物に試料を接触させることと、（ｂ）試料にて発光を検出することとを含み、それによって発光の検出がルシフェラーゼの存在を指し示す。特定の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、試料は生細胞を含む。特定の実施形態では、細胞はルシフェラーゼを含む。一部の実施形態では、細胞はＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼを含む。一部の実施形態では、ルシフェラーゼはＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼの変異体である。特定の実施形態では、工程（ａ）はさらに、式（Ｉ）の化合物と反応するように構成される求核試薬に試料を接触させて細胞透過性基質を提供することを含む。細胞透過性基質は上記で定義されたような式（ＩＩ）の化合物であってもよい。細胞透過性基質は上記で定義されたような式（ＩＩ−ｉ）、（ＩＩ−ｉｉ）、（ＩＩ−ｉｉｉ）、（ＩＩ−ｉｖ）、または（ＩＩ−ｖ）の化合物またはそれらの組み合わせであってもよい。
一部の態様では、開示されるのは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連結されたプロモータの活性を測定する方法であって、該方法は。（ａ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子に操作可能に連結されたプロモータを含む試料を得ることと、（ｂ）本発明の化合物に試料を接触させることと、（ｃ）反応混合物の発光を測定することによってプロモータの活性を決定することとを含む。特定の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、試料は生細胞を含む。特定の実施形態では、細胞はルシフェラーゼを含む。一部の実施形態では、細胞はＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼである。一部の実施形態では、ルシフェラーゼはＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼの変異体である。特定の実施形態では、工程（ａ）はさらに、式（Ｉ）の化合物と反応するように構成される求核試薬に試料を接触させて細胞透過性基質を提供することを含む。細胞透過性基質は上記で定義されたような式（ＩＩ）の化合物であってもよい。細胞透過性基質は上記で定義されたような式（ＩＩ−ｉ）、（ＩＩ−ｉｉ）、（ＩＩ−ｉｉｉ）、（ＩＩ−ｉｖ）、または（ＩＩ−ｖ）の化合物またはそれらの組み合わせであってもよい。
開示される方法では、該方法で使用される本発明の化合物は緩衝溶液中にあってもよい。化合物は少なくとも部分的に加水分解されて、試料との接触に先立って細胞透過性基質を遊離してもよい。緩衝溶液は、化合物の自己ベースの触媒を調節してまたは促進して細胞透過性基質を遊離するｐＨ（たとえば、６〜１０）を有してもよい。緩衝溶液には求核性の化合物または溶液が含まれてもよく、その際、求核試薬（たとえば、チオール、アミン、またはアルキルアミン）は本発明の化合物と反応して細胞透過性基質を遊離するように構成されてもよい。求核試薬または求核性溶液は本発明の化合物の自己ベースの触媒を調節してもよいし、または促進してもよい。緩衝溶液には本発明の化合物の細胞透過性基質部分を切断する非発光酵素（たとえば、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはスルファターゼ）が含まれてもよい。
一部の態様では、開示されるのは、試料における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、該方法は、（ａ）本発明の化合物に試料を接触させることと、（ｂ）試料におけるルシフェラーゼを検出することとを含み、その際、発光の検出が第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を指し示す。試料には（ｉ）第１の融合タンパク質が発光酵素の第１の断片と第１のタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）第２の融合タンパク質が発光酵素の第２の断片と第２のタンパク質とを含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが含まれてもよい。本発明の化合物は少なくとも部分的に加水分解されて細胞透過性基質を遊離してもよい。第１のタンパク質と第２のタンパク質が相互作用すると、発光酵素の第１の断片と発光酵素の第２の断片は、細胞透過性基質を安定的に結合することが可能である完全長の酵素を再構成してもよい。特定の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、試料は生細胞を含む。特定の実施形態では、細胞はセレンテラジンを利用するルシフェラーゼ酵素のような発光酵素を含む。セレンテラジンを利用する酵素はＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼ酵素またはその変異体または突然変異体であってもよい。
一部の態様では、開示されるのは、試料における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、該方法は、（ａ）本発明の化合物に試料を接触させることと、（ｂ）試料にて、生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または最近接を示す生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することとを含む。試料には（ｉ）第１の融合タンパク質が発光酵素と第１のタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）第２の融合タンパク質が蛍光アクセプター分子と第２のタンパク質とを含む第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが含まれてもよい。特定の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、試料は生細胞を含む。特定の実施形態では、細胞はセレンテラジンを利用するルシフェラーゼ酵素のような発光酵素を含む。セレンテラジンを利用する酵素はＯｐｈｌｏｐｈｏｒｕｓのルシフェラーゼ酵素またはその変異体または突然変異体であってもよい。
一部の態様では、開示されるのは、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子が発光酵素である生物発光ドナー分子とを含む第１の融合タンパク質と、第２の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第２の融合タンパク質と、本発明の化合物とを含む生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムである。
一部の態様では、開示されるのは、試料にて酵素を検出する方法であって、該方法は、（ａ）式（Ｉ）の化合物、式（ａ）の化合物、式（ｂ）の化合物、式（ｃ）の化合物、式（ｄ）の化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物に試料を接触させることと、

（式中、Ｒ’は各存在ごとに独立してハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から選択され；ｙ’は０、１、２、３、または４であり；ＲA、ＲB、ＲC、ＲD及びＲEは上記で定義されたとおりである）；
（ｂ）試料にて発光を検出することとを含み、その際、式（Ｉ）の化合物、式（ａ）の化合物、式（ｂ）の化合物、式（ｃ）の化合物、式（ｄ）の化合物、またはそれらの組み合わせは、非発光酵素との反応を介して１以上の細胞透過性基質に変換される。非発光酵素は、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはスルファターゼであってもよい。
一部の態様では、開示されるのは、本発明の化合物を含むキットである。
化合物、組成物、方法及び工程は本明細書でさらに説明される。
細胞膜に対して外来性である細胞透過性基質に変換される本明細書で開示されるようなプロ基質の模式図である。細胞透過性基質は細胞膜を透過し、細胞透過性基質はルシフェラーゼに作用する。 セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現している細胞に加えられ、発光が検出された化合物ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７及びＰＢＩ−５４８８を示す図である。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞（それぞれ３Ａ〜Ｄ）に化合物ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７及びＰＢＩ−５４８８を加え、発光を検出した。実施例２０を参照のこと。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞（それぞれ４Ａ〜Ｄ）に化合物ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７及びＰＢＩ−５４８８を加え、発光を検出した。実施例２０を参照のこと。 化合物ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７及びＰＢＩ−５４８８に曝露した細胞の発光（５Ａ及び５Ｃ）及び生存率（５Ｂ及び５Ｄ）を示す図である。実施例２０を参照のこと。 セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現している細胞に加えられ、発光が検出された化合物ＰＢＩ−５４５７、ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８及びＰＢＩ−５４８９を示す図である。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８、及びＰＢＩ−５４５７（図６）を加え、発光を検出した。実施例２１を参照のこと。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８、及びＰＢＩ−５４５７（図６）を加え、発光を検出した。実施例２１を参照のこと。 化合物ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８、及びＰＢＩ−５４５７に曝露された細胞の発光（９Ａ及び９Ｃ）及び生存率（９Ｂ及び９Ｄ）を示す図である。実施例２１を参照のこと。 セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現している細胞に加えられ、発光が検出された化合物ＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８を示す図である。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８を加え、発光を検出した。実施例２２を参照のこと。 プロ基質として作用する開示される化合物の能力を示す図である。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−４３７７，ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８を加え、発光を検出した。実施例２２を参照のこと。 化合物ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７、ＰＢＩ−５４１８、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−４３７７、ＰＢＩ−５３９３及びＰＢＩ−５２９６に曝露された細胞の生存率を示す図である。実施例２２を参照のこと。 ＰＢＩ−５４５５の加水分解によるフリマジンの遊離はｐＨ依存性であることを示す図である。 フリマジンと共にＰＢＩ−５４５５を用いたＨＴＳ操作を示す模式図である。
本明細書で開示されるのは、細胞非透過性のプロ基質である。プロ基質を用いて生細胞にて発光酵素を測定することができる。細胞内酵素に基質を提供する従来の方法は、内在性のエステラーゼ、還元酵素またはプロテアーゼの活性を介して基質に変換される細胞透過性のプロ基質に依存してきた。本明細書で記載されるアプローチは、加水分解の際、細胞透過性の基質（たとえば、セレンテラジン、またはフリマジンのようなその誘導体または類似体）の持続する遊離を提供する細胞非透過性のプロ基質を利用してもよい。細胞非透過性の基質がアミン塩基（または求核試薬）及び任意で１以上の荷電した官能基を含有する高度に官能化されたカルバメートによって覆い隠されてもよい。適当な内部塩基の選択によってカルバメートの加水分解を調節してもよい。内部塩基及び任意の導入された負の電荷は基質の溶解度を最大化し、細胞透過性を最小化してもよい。保護された細胞非透過性のプロ基質を細胞に加えると、細胞外培地における反応（自己ベースの触媒）によってそれは脱保護され（細胞透過性になり）、基質（脱保護された）は、それが発光酵素によって利用されてもよい細胞の中に自由に拡散してもよい。
開示されている化合物、組成物及び方法の利点には、速度実験について保護されていないセレンテラジンまたはその誘導体または類似体に比べて高いシグナル安定性；さらに従来のアプローチを用いて保護されたセレンテラジンまたはその誘導体または類似体の使用に比べてシグナル強度の有意な上昇；保護されていないセレンテラジンまたはその誘導体または類似体、またはさらに従来のアプローチを用いて保護されたセレンテラジンまたはその誘導体または類似体に比べて高い溶解度；及び保護されていないセレンテラジンまたはその誘導体または類似体、またはさらに従来のアプローチを用いて保護されたセレンテラジンまたはその誘導体または類似体に比べて低下した細胞傷害性が挙げられる。これらの特性の結果、開示される化合物は、レポーター遺伝子アッセイ、ＢＲＥＴ及びタンパク質再構成を含む応用で使用することができる。
１． 用語の定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が規制するであろう。本明細書で記載されるものに類似するまたは同等の方法及び材料を本発明の実践及び試験で使用することができるけれども、好まれる方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される出版物、特許出願、特許及び他の参考文献はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で開示される材料、方法及び実施例は説明に役立つのみであって、限定を意図されるものではない。
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｃａｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」及びそれらの変形は、本明細書で使用されるとき、追加の行為または構造の可能性を除外しない、制約がない従来の語句、用語または単語であることが意図される。本開示はまた、明白に言及されようとされまいと、本明細書で提示される実施形態及び要素を「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」他の実施形態も熟考する。
本明細書で使用されるとき、用語「好適な置換基」は、化学的に許容可能な官能基、たとえば、本発明の化合物の活性を無効にしない部分を意味するように意図される。好適な置換基の説明に役立つ例には、ハロ基、パーフルオロアルキル基、パーフルオロアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、ハロ基、オキソ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、ニトロ基、アジドアルキル基、アリールまたはヘテロアリール基、アリールオキシまたはヘテロアリールオキシ基、アラルキルまたはヘテロアラルキル基、アラルコキシまたはヘテロアラルコキシ基、ＨＯ−（Ｃ＝Ｏ）−基、複素環基、シクロアルキル基、アミノ基、アルキル−及びジアルキルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基等が挙げられるが、これらに限定されない。置換基は追加の置換基によって置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」は２〜１０の炭素を含有し、及び２つの水素の除去によって形成される少なくとも１つの炭素／炭素二重結合を含有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表例には、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、及び３−デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルケニル基は非置換であってもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは１〜３の、上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルコキシの代表例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシアルコキシ」は、本明細書で定義されるような別のアルコキシ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシアルコキシの代表例には、ｔｅｒｔ−ブトキシメトキシ、２−エトキシエトキシ、２−メトキシエトキシ、及びメトキシメトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシアルキル」は本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシアルキルの代表例には、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、２−エトキシエチル、２−メトキシエチル及びメトキシメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシカルボニル」は本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。アルコキシカルボニルの代表例には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は好ましくは１〜３０の炭素原子、１〜１０の炭素原子、１〜６の炭素原子、または１〜４の炭素原子を有する線状または分岐状の炭化水素ラジカルを指す。用語「Ｃ1−Ｃ6アルキル」は線状または分岐状の配置で１、２、３、４、５または６の炭素を有するアルキル基を含むように定義される。たとえば、「Ｃ1−Ｃ6アルキル」には具体的に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。本発明のアルキル基は非置換でもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは１〜３の上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルアミノ」は、本明細書で定義されるようなアミノ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルキルアミノの代表例には、メチルアミノ、エチルアミノ、及びｓｅｃ−ブチルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルアミノアルキル」は本明細書で定義されるようなアミノアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。アルキルアミノアルキル基の代表例には、メチルアミノエチル及びメチルアミノ−２−プロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルカルボニル」は、本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加されるアルキル基を指す。アルキルカルボニルの代表例には、アセチル、１−オキソプロピル、２，２−ジメチル−１−オキソプロピル、１−オキソブチル及び１−オキソペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルカルボニルアルコキシ」は本明細書で定義されるようなアルコキシ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキルカルボニル基を指す。アルキルカルボニルアルコキシの代表例には、３−オキソペンチルオキシ、３−オキソブトキシ及び２−オキソプロポキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルカルボニルアルコキシアルキル」はアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキルカルボニルアルコキシ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキルカルボニルオキシ」は酸素原子を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアルキルカルボニル基を指す。アルキルカルボニルオキシの代表例には、アセチルオキシ、エチルカルボニルオキシ、及びｔｅｒｔ−ブチルカルボニルオキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の炭素を有し、及び１以上の炭素／炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。本発明のアルキニル基には、エチニル、プロピニル及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルキニル基は、非置換でもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは１〜３の、上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ」は−ＮＨ2基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は天然の及び非天然のアミノ酸の双方を指す。それには保護された天然の及び非天然のアミノ酸も含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノアルキル」は本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるような少なくとも１つのアミノ基を指す。アミノアルキルの代表例には、アミノメチル、２−アミノエチル及び２−アミノプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は単環式、二環式または三環式の芳香族ラジカルを意味する。アリール基の代表例には、フェニル、ジヒドロインデニル、インデニル、ナフチル、ジヒドロナフタレニル及びテトラヒドロナフタレニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアリール基は１以上の好適な置換基、好ましくは１〜５の、上記で定義されたような好適な置換基によって任意で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「アリールアルキル」は本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。アリールアルキルの代表例には、フェニルメチル及びフェニルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アリールカルボニル」は本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアリール基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「アジド」は−Ｎ＝Ｎ+＝Ｎ-（−Ｎ3）基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「アジドアルキル」は本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなアジド基を指す。アジドアルキルの代表例には、アジドメチル及びアジドエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボニル」または「（Ｃ＝Ｏ）」（アルキルカルボニル、アルキル−（Ｃ＝Ｏ）またはアルコキシカルボニルのような語句で使用されるような）はアルキル基またはアミノ基（すなわち、アミド基）のような第２の部分への＞Ｃ＝Ｏ部分の結合を指す。アルコキシカルボニルアミノ（すなわち、アルコキシ（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）はアルキルカルバメート基を指す。カルボニル基は本明細書では（Ｃ＝Ｏ）としても同等に定義される。アルキルカルボニルアミノはアセトアミドのような基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシ」は−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシアルコキシアルキル」は−アルキル−Ｏ−アルキル−ＣＯ2Ｈを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「カルボキシアルキル」は、本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなカルボキシ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞非透過性」は、有効量の化合物が細胞内に送達される程度に細胞膜透過性ではない化合物または部分を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞透過性」は、有効量の化合物が細胞内に送達される程度に細胞膜透過性である化合物または部分を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「シクロアルキル」は、任意で１または２の二重結合を含有する単環式、二環式または三環式の炭素環ラジカル（たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル及びビシクロ［５．２．０］ノナニル等）を指す。本発明のシクロアルキル基は、非置換でもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは、１〜５の、上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ジ（アルキル）アミノ」は本明細書で定義されるようなアミノ基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるような独立して選択された２つのアルキル基を指す。ジ（アルキル）アミノの代表例には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ及びＮ−イソプロピル−Ｎ−メチルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ジ（アルキル）アミノアルキル」は本明細書で定義されるようなアルキル基を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるようなジ（アルキル）アミノ基を指す。ジ（アルキル）アミノアルキルの代表例には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル及びＮ，Ｎ−メチル（２−プロピル）アミノエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ハロゲン」または「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードのラジカルを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ハロアルコキシ」は１、２、３または４のハロゲン原子によって置換された本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。ハロアルコキシの代表例には、クロロメトキシ、２−フルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ及びペンタフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ハロアルキル」は１、２、３または４のハロゲン原子によって置換された本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。ハロアルキルの代表例には、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、２−クロロ−３−フルオロペンチル及び４，４，４−トリフルオロブチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は単環式のヘテロアリールまたは二環式のヘテロアリールを指す。単環式のヘテロアリールは５員環または６員環である。５員環は２つの二重結合を含有する。５員環はＯまたはＳから選択されるヘテロ原子を１つ；または１、２、３若しくは４の窒素原子及び任意で酸素原子若しくはイオウ原子を１つ含有してもよい。６員環は３つの二重結合、及び１、２、３または４の窒素原子を含有する。単環式のヘテロアリールの代表例には、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、１、３−オキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、１，３−チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、及びトリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールには、フェニルに縮合された単環式ヘテロアリール、または単環式シクロアルキルに縮合された単環式ヘテロアリール、または単環式シクロアルケニルに縮合された単環式ヘテロアリール、または単環式ヘテロアリールに縮合された単環式ヘテロアリール、または単環式複素環に縮合された単環式ヘテロアリールが挙げられる。二環式ヘテロアリールの代表例には、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、６，７−ジヒドロ−ｌ，３−ベンゾチアゾリル、イミダゾ［ｌ，２−ａ］ピリジニル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル、チアゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル及び５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−５−イルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のヘテロアリール基は非置換でもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは、１〜５の、上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「複素環」または「ヘテロシクリル」は単環式の複素環、二環式の複素環、または三環式の複素環を指す。単環式の複素環は、酸素、窒素、リン及びイオウから成る群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する３、４、５、６、７、または８員環である。３員環または４員環はゼロまたは１つの二重結合と酸素、窒素、リン及びイオウから成る群から選択されるヘテロ原子１つを含有する。５員環はゼロまたは１つの二重結合と酸素、窒素、リン及びイオウから成る群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。６員環はゼロ、１または２の二重結合と酸素、窒素、リン及びイオウから成る群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。７員環及び８員環は、ゼロ、１、２または３の二重結合と酸素、窒素、リン及びイオウから成る群から選択される１、２または３のヘテロ原子を含有する。単環式の複素環の代表例には、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルフォリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ホスフィナン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルフォリニル、１，１−ジオキシドチオモルフォリニル（チオモルフォリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式の複素環は、フェニル基に縮合された単環式の複素環、または単環式シクロアルキルに縮合された単環式の複素環、または単環式シクロアルケニルに縮合された単環式の複素環、または単環式の複素環に縮合された単環式の複素環、または環の隣接しない２つの原子が１、２、３若しくは４の炭素原子のアルキレン架橋または２、３若しくは４の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結される架橋された単環式の複素環の環系である。二環式の複素環の代表例には、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．ｌ］ヘプト−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−ｌＨ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、９−ホスファビシクロ［３．３．１］ノナン、８−ホスファビシクロ［３．２．１］オクタン、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式の複素環は、フェニル基に縮合された二環式の複素環、または単環式シクロアルキルに縮合された二環式の複素環、または単環式シクロアルケニルに縮合された二環式の複素環、または単環式の複素環に縮合された二環式の複素環、または環の隣接しない２つの原子が１、２、３若しくは４の炭素原子のアルキレン架橋または２、３若しくは４の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結される二環式の複素環によって例示される。三環式の複素環の例には、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−ｌＨ−ｌ，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アドマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、オキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）及び２，４，６−トリオキサ−８−ホスファトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の複素環基は、非置換でもよく、または１以上の好適な置換基、好ましくは、１〜３の、上記で定義されたような好適な置換基で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシ」は−ＯＨ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシアルコキシ」は少なくとも１つのヒドロキシ基によって置換された、本明細書で定義されるようなアルコキシ基を指す。ヒドロキシアルコキシの代表例には、ヒドロキシエトキシ及び２−ヒドロキシプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシアルキル」は少なくとも１つのヒドロキシ基によって置換された、本明細書で定義されるようなアルキル基を指す。ヒドロキシアルキルの代表例には、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシペンチル、４−ヒドロキシブチル、２−エチル−４−ヒドロキシヘプチル、３，４−ジヒドロキシブチル、及び５−ヒドロキシペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシカルボニル」は本明細書で定義されるようなカルボニル基を介して親分子部分に付加される本明細書で定義されるようなヒドロキシ基を指す。
用語「リンカー」は基質部分を親分子部分に連結する２〜５０の原子の鎖を指してもよい。リンカーには１以上のヘテロ原子が含まれてもよい。リンカーはまた、オキソ基、アミノ基、アルキル基、ハロゲン及びニトロ基によって置換されてもよい。リンカーはまたアリール基を含有してもよい。リンカーは「痕跡のない」または「自壊性の」リンカーであってもよい。用語「痕跡のないリンカー」または「自壊性のリンカー」は、リンカーからの基質部分の切断が親分子部分からのリンカーの自然発生的な切断を生じさせるリンカーを指す。
用語「低級シクロアルキル」は３〜６の炭素原子を有する炭化水素化合物から水素原子を取り外すことによって得られる一価の部分を指す。飽和低級シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルのような基が挙げられるが、これらに限定されない。１以上の炭素／炭素二重結合を有する不飽和低級シクロアルキル基の例には、たとえば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルのような基が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「発光酵素」は特定されない限り、基質としてセレンテラジン、及び／またはセレンテラジンの誘導体またはその類似体を使用する天然に存在する、組換えのまたは変異体の発光酵素を指す。発光酵素は天然に存在するならば、生物から当業者によって容易に得られてもよい。発光酵素が、天然に存在するまたは組換えであるものまたは変異体の発光酵素であるならば、すなわち、天然に存在する発光酵素のルシフェラーゼ／セレンテラジン反応における活性を保持するものであるならば、それは、発光酵素をコードする核酸を発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養物から容易に得ることができる。さらに、組換えのまたは変異体の発光酵素は、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いた試験管内の無細胞系に由来することができる。好適な発光酵素には、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａのような生物発光性甲殻類に由来するルシフェラーゼ、たとえば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ−由来のルシフェラーゼ、たとえば、刺胞動物（たとえば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、Ａｒｉｓｔｅｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ、Ｓｅｒｇｅｓｔｉｄａｅ、Ｐａｓｉｐｈｅｉｄａｅ及びＴｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ甲殻類ファミリーのような海洋生物に由来するルシフェラーゼ、及びエクオリンのような発光タンパク質、並びに前記ルシフェラーゼの変異体及び突然変異体が挙げられる。
「発光反応混合物」は発光酵素が光シグナル、すなわち、発光を生成するのを可能にするであろう物質を含有する。混合物はまた酵素も含有してもよい。発光シグナルを生成するのに必要とされる物質及び必要とされる物質の特定の濃度及び／または量は使用される発光酵素と同様に実施されるアッセイの種類に応じて変化するであろう。適当なｐＨで反応を維持するための緩衝液、たとえば、酵素活性を維持するのに役立つためのＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、還元剤、界面活性剤等のような添加剤を含む他の物質が溶液に添加されることが多いであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「メチレンジオキシ」はメチレンジオキシの酸素原子が２つの隣接する炭素原子を介して親分子部分に連結される−ＯＣＨ2Ｏ−基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「窒素保護基」は合成手順の間での望ましくない反応に対してアミノ基を保護するように意図される基を指す。代表的な窒素保護基には、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ホルミル、フェニルスルホニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、トリフルオロアセチル、及びトリフェニルメチル（トリチル）が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「オキソ」は、結合相手が炭素原子である二重結合した酸素（＝Ｏ）ラジカルを指す。そのようなラジカルはカルボニル基として考えることができる。
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は少なくとも２つのアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、ペプチドは８０以下のアミノ酸、または３５以下のアミノ酸、または１０以下のアミン酸を含有してもよい。
用語「糖類」は、糖または他の糖質、特に単糖を指す。それには、アルファアノマー及びベータアノマーの双方が含まれる。糖類は、Ｃ6−ポリヒドロキシ化合物、通常Ｃ6−ペンタヒドロキシ、多くは環状グリカールであることができる。それには、既知の単糖及びその誘導体、と同様に２以上の単糖類残基を伴った多糖類も含まれる。糖類はヒドロキシル基上に保護基を含むことができる。糖類のヒドロキシル基は１以上のアセトアミド、ハロまたはアミノ基によって置き換えることができる。さらに、炭素原子の１以上を、たとえば、ケト基、またはカルボニル基に酸化することができる。好適な糖類には、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸及びノイラミン酸が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「スルホニル」は＞Ｓ（Ｏ）2基を指す。
多成分置換基に付けられる接頭辞はそれが先行する最初の成分に適用されるだけである。例えれば、用語「アルキルシクロアルキル」は２つの成分：アルキルとシクロアルキルを含有する。従って、Ｃ1−Ｃ6アルキルシクロアルキルにおけるＣ1−Ｃ6接頭辞はアルキルシクロアルキルのアルキル成分が１〜６の炭素原子を含有することを意味し；Ｃ1−Ｃ6接頭辞はシクロアルキル成分を説明しない。さらに例えれば、ハロアルコキシアルキルにおける接頭辞「ハロ」はアルコキシアルキル置換基のアルコキシ成分のみが１以上のハロゲンラジカルで置換されることを示す。ハロゲン置換がアルキル成分で生じるだけであるならば、置換基は代わりに「アルコキシハロアルキル」と記載されることになる。
置換基は、それが１以上の水素原子に結合される少なくとも１つの炭素原子または窒素原子を含むのであれは、「置換可能である」。従って、たとえば、水素、ハロゲン、及びシアノはこの定義の範囲内に入らない。加えて、そのような原子を含有するヘテロシクリルにおけるイオウ原子は１または２のオキソ置換基で置換可能である。
置換基が「置換されている」と記載されるのであれば、非水素ラジカルが置換基の炭素または窒素上の水素ラジカルの位置にある。従って、たとえば、置換されたアルキル置換基は、少なくとも１つの非水素ラジカルがアルキル置換基の水素ラジカルの位置にあるアルキル置換基である。例えれば、モノフルオロアルキルは、フルオロラジカルで置換されたアルキルであり、ジフルオロアルキルは２つのフルオロラジカルで置換されたアルキルである。置換基上で１を超える置換があるのならば、各非水素ラジカルは同一であってもよいし、異なっていてもよいこと（特に言及されない限り）が認識されるべきである。
置換基が「非置換である」と言われる、または「置換された」若しくは「任意で置換された」と言われない場合、置換基はどんな置換基も有さないことを意味する。置換基が「任意で置換されている」と記載されるのであれば、置換基は、（１）置換されていない、または（２）置換されているのいずれかである。置換基が特定の数までの非水素ラジカルによって任意で置換されていると記載されるのであれば、その置換基は、（１）置換されていない、または（２）非水素ラジカルの特定の数まで、若しくは置換基上の置換可能な位置の最大数まで、いずれか少ない方で置換されてもよい。従って、たとえば、置換基が３つまでの非水素ラジカルによって任意で置換されるヘテロアリールとして記載されるのであれば、そのときは、３未満の置換可能な位置を持つヘテロアリールが、そのヘテロアリールが置換可能な位置を有するのと同じ数までの非水素ラジカルによって任意で置換されることになる。例えれば、テトラゾリル（たった１つの置換可能な位置を有する）は１つまでの非水素ラジカルによって任意で置換されることになる。さらに例えれば、アミノ窒素が２までの非水素ラジカルによって任意で置換されていると記載されるのであれば、そのときは、１級アミノ窒素は２までの非水素ラジカルによって任意で置換されるであろう一方で、２級アミノ窒素はたった１つの非水素ラジカルによって任意で置換されるであろう。
置換基が基から「独立して選択される」と記載されるのであれば、各置換基は他とは独立して選択される。従って、各置換基は他の置換基と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
２．細胞非透過性のプロ基質
本発明の化合物には細胞非透過性のプロ基質が含まれる。生細胞における酵素の存在／非存在及び／または活性を検出する方法にてプロ基質を使用することができる。細胞非透過性のプロ基質は細胞透過性基質の持続遊離を提供する。分子内反応及び／または分子間反応によって細胞非透過性のプロ基質が細胞透過性基質に変換されてもよい。細胞非透過性のプロ基質は緩衝溶液中にあってもよい。細胞非透過性のプロ基質は、プロ基質の細胞非透過性部分を切断する（たとえば、求核付加反応を介して及び／または、たとえば、加水分解反応のような求核付加反応の触媒を介して）ように構成された官能基（たとえば、塩基性官能基）を含んでもよい。官能基は、同一分子内での分子内反応を介して、及び／または異なるプロ基質分子に作用する分子間反応を介して細胞非透過性部分を切断してもよい。細胞に侵入する際、細胞透過性基質はルシフェラーゼのような酵素に作用されてもよい。開示されるプロ基質はその結果、酵素を検出する方法にて有用であり得るってもよい。
ａ．化合物
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ）：
またはその塩を有し、
式中、
ＲAは細胞非透過性部分であり；
ＲBは−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり（たとえば、官能基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基への求核付加を触媒してもよく、及び／または官能基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基との求核付加反応を受けてもよい）；
ＲCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基によって置換され；
ＲDは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
ＲEは水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
式中、破線の結合は一緒に式Ｉの化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
特定の実施形態では、ＲAはアミノ酸、ペプチドまたは糖類を含む細胞非透過性部分である。特定の実施形態では、ＲAはポリペプチドまたは多糖類を含む細胞非透過性部分である。特定の実施形態では、ＲBはモルフォリニル基を含む部分である。特定の実施形態では、ＲBはモルフォリニルアルキルである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ）：
またはその塩を有し、
式中、
ＲAは、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲBは、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、且つアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
ＲDは、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
ＲEは、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
式中、破線の結合は一緒に式Ｉの化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ）：
またはその塩を有し、
式中、
ＲAは、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＯＰＯ2Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ2Ｎ（Ｒ8）（Ｒ9）、−（ＣＲ10Ｒ11）m−ＣＯ2Ｒ12、−（ＣＲ13Ｒ14）m−ＣＯＮ（Ｒ15）（Ｒ16）、−（ＣＲ17Ｒ18）m−ＯＮ（Ｒ19）（Ｒ20）、−（ＣＲ21Ｒ22）m−ヘテロシクリル−（ＣＲ23Ｒ24）n−Ｒ25、−（ＣＲ26Ｒ27）m−ヘテロアリール−（ＣＲ28Ｒ29）n−Ｒ30、−（ＣＲ31Ｒ32）m−アリール−（ＣＲ33Ｒ34）n−Ｒ35、及び−（ＣＲ36Ｒ37）m−シクロアルキル−（ＣＲ38Ｒ39）n−Ｒ40から成る群から選択され；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ36、Ｒ37、Ｒ38、及びＲ39はそれぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され；
Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35、及びＲ40は独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−（モノまたはポリアルコキシ）アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
及び
から成る群から選択され、
その際、Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35及びＲ40の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから独立して選択される１、２、３、４、または５の置換基で置換され；
Ｒ41、Ｒ42、及びＲ44は、存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、４−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され；
Ｒ43及びＲ45はそれぞれ独立して水素、−Ｃ（Ｏ）アルキル及び
から成る群から選択され；
ｍ、及びｎはそれぞれ独立して１、２、３、４、５、または６であり；
ｘ、及びｙはそれぞれ独立して１〜２０から選択される整数であり；
ＲBは、−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49または−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55であり；
Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から選択され；
Ｒ48及びＲ49は、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、−（ＣＲ50Ｒ51）z−ＯＣ（Ｏ）Ｒ52、−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55、−（ＣＲ56Ｒ57）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ58、−（ＣＲ59Ｒ60）Z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ61、−（ＣＲ62Ｒ63）Z−Ｎ（Ｒ64）（Ｒ65）、−（ＣＲ66Ｒ67）z−Ｎ（Ｒ68）Ｃ（Ｏ）Ｒ69、−（ＣＲ70Ｒ71）z−Ｎ（Ｒ72）Ｓ（Ｏ）2Ｒ73、−（ＣＲ74Ｒ75）z−Ｎ（Ｒ76）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ77）（Ｒ78）、−（ＣＲ79Ｒ80）z−Ｎ（Ｒ81）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ82）（Ｒ83）、−（ＣＲ84Ｒ85）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ86、−（ＣＲ87Ｒ88）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ89）、−（ＣＲ90Ｒ91）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ92）（Ｒ93）、及び−Ｃ（Ｒ94）＝Ｎ−ＯＲ95から選択され；
またはＲ48及びＲ49は、それらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−ＮＯ2、−ＣＮ、ハロゲン、オキソ、−ＯＲ96、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ97、−ＳＲ98、−Ｓ（Ｏ）Ｒ99、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ100、−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ101）（Ｒ102）、−Ｎ（Ｒ103）（Ｒ104）、−Ｎ（Ｒ105）Ｃ（Ｏ）Ｒ106、−Ｎ（Ｒ107）Ｓ（Ｏ）2Ｒ108、−Ｎ（Ｒ109）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ110）（Ｒ112）、−Ｎ（Ｒ113）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ114）（Ｒ115）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ116、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ117）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ118）（Ｒ119）、ハロアルキル、−（ＣＲ120Ｒ121）Z−ＣＮ、−（ＣＲ122Ｒ123）z−ＯＲ124、−（ＣＲ125Ｒ126）z−ＯＣ（０）Ｒ127、−（ＣＲ128Ｒ129）Z−ＳＲ130、−（ＣＲ131Ｒ132）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ133、−（ＣＲ134Ｒ135）z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ136、−（ＣＲ137Ｒ138）Z−Ｎ（Ｒ139）（Ｒ140）、−（ＣＲ141Ｒ142）Z−Ｎ（Ｒ143）Ｃ（Ｏ）Ｒ144、−（ＣＲ145Ｒ146）z−Ｎ（Ｒ147）Ｓ（Ｏ）2Ｒ148、−（ＣＲ149Ｒ150）z−Ｎ（Ｒ151）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ152）（Ｒ153）、−（ＣＲ154Ｒ155）z−Ｎ（Ｒ156）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ157）（Ｒ158）、−（ＣＲ159Ｒ160）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ161、−（ＣＲ162Ｒ163）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ164）及び−（ＣＲ165Ｒ166）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ167）（Ｒ168）から成る群から独立して選択される１、２、３、４、５または６の置換基によって置換され；
Ｒ52、Ｒ55、Ｒ64、Ｒ65、Ｒ68、Ｒ72、Ｒ69、Ｒ76、Ｒ77、Ｒ81、Ｒ82、Ｒ86、Ｒ89、Ｒ92、Ｒ93、Ｒ96、Ｒ97、Ｒ98、Ｒ101、Ｒ102、Ｒ103、Ｒ104、Ｒ105、Ｒ106、Ｒ107、Ｒ109、Ｒ110、Ｒ112、Ｒ113、Ｒ114、Ｒ115、Ｒ116、Ｒ117、Ｒ118、Ｒ119、Ｒ124、Ｒ127、Ｒ130、Ｒ139、Ｒ140、Ｒ143、Ｒ144、Ｒ147、Ｒ151、Ｒ152、Ｒ153、Ｒ156、Ｒ157、Ｒ158、Ｒ161、Ｒ164、Ｒ167、及びＲ168は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され；
Ｒ58、Ｒ61、Ｒ73、Ｒ99、Ｒ100、Ｒ108、Ｒ133、Ｒ136、及びＲ148は、存在ごとにそれぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され；
Ｒ50、Ｒ51、Ｒ53、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ59、Ｒ60、Ｒ62、Ｒ63、Ｒ66、Ｒ67、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ79、Ｒ80、Ｒ84、Ｒ85、Ｒ87、Ｒ88、Ｒ90、Ｒ91、Ｒ120、Ｒ121、Ｒ122、Ｒ123、Ｒ125、Ｒ126、Ｒ128、Ｒ129、Ｒ131、Ｒ132、Ｒ134、Ｒ135、Ｒ137、Ｒ138、Ｒ141、Ｒ142、Ｒ145、Ｒ146、Ｒ149、Ｒ150、Ｒ154、Ｒ155、Ｒ159、Ｒ160、Ｒ162、Ｒ163、Ｒ165、及びＲ166は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され；
Ｒ94及びＲ95は、各存在ごとにそれぞれ独立して水素及びアルキルから選択され；
ｔは１、２、３、４、５、６、７、または８であり；
ｚは、各存在ごとに独立して１、２、３、または４であり；
ＲCは−（ＣＨ2）o-3−ＴまたはＣ1-5アルキルであり；その際、Ｔはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキルアミノアルキル）、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から独立して選択される１、２、または３の置換基によって置換され；
ＲDは、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びＣ1−Ｃ4−アルキルから成る群から選択され；及び
ＲEは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルから成る群から選択され；
その際、式（Ｉ）の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい。
特定の実施形態では、ＲAはアルキルである。特定の実施形態では、ＲAはＣ1−Ｃ10−アルキル、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、またはＣ1−Ｃ4−アルキルである。特定の実施形態では、ＲAはメチル、エチル、プロピル（たとえば、ｎ−プロピル、イソプロピル）、ブチル（たとえば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル）、ペンチル（たとえば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、３−ペンチル）、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、またはデシルである。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7であり、その際、Ｒ5及びＲ6は、各存在ごとに水素であり、Ｒ7は上記で定義されたとおりであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7であり、その際、Ｒ5及びＲ6は各存在ごとに水素であり、Ｒ7は水素であり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ5Ｒ6）ｍ−ＳＯ3Ｒ7であり、その際、Ｒ5及びＲ6は、各存在ごとに水素であり、Ｒ7は水素であり、ｍは２または３であり、その際、式（Ｉ）の化合物は、ＲAが
または
であるように塩の形態である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4は上記で定義されたとおりであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは、
または
であり、Ｒ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はＣ1−Ｃ4−アルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はメチルまたはイソプロピルであり、ｍは２または３である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアルコキシであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はＣ1−Ｃ4−アルコキシであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はｔｅｒｔ−ブトキシであり、ｍは２または３である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアリールまたはヘテロアリールであり、ｍは２または３であり、前記アリール及びヘテロアリールは、それぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、及びアミノから独立して選択される１、２、３、４または５の置換基によって置換される。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はフェニルであり、ｍは２または３であり、前記フェニルは、非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、及びアミノから独立して選択される１、２、３、４または５の置換基によって置換される。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はフェニルであり、ｍは２または３であり、前記フェニルは、非置換であり、またはハロゲン、ハロアルキル及びアルコキシから選択される置換基１つによって置換される。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はフェニルであり、ｍは２または３であり、前記フェニルは、非置換であり、またはフルオロ、トリフルオロメチル及びメトキシから選択される置換基１つによって置換される。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はカルボキシアルキルまたはカルボキシアルコキシアルキルであり、ｍは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はカルボキシメチル（−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）またはカルボキシメトキシメチル（−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ）であり、ｍは２、３または４である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアルキルカルボニルアルコキシアルキルであり、ｍは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はメチルカルボニルメトキシメチル（−ＣＨ2ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）ＣＨ3）であり、ｍは２、３または４である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はペプチド含有部分であり、ｍは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はポリペプチド含有部分であり、ｍは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はポリアスパラギン酸含有部分であり、ｍは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4は
または
であり、ｍは２、３または４であり、その際、ｘ、ｙ、Ｒ41、Ｒ42、Ｒ43、Ｒ44、及びＲ45は上記で定義されたとおりである。特定の実施形態では、Ｒ41、Ｒ42及びＲ44は−ＣＨ2ＣＯ2Ｈからそれぞれ選択される。特定の実施形態では、Ｒ43及びＲ45はアセチル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3）から選択される。特定の実施形態では、ｘは１または２である。特定の実施形態では、ｙは３である。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアリールアルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はベンゾキノニルアルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4は２，５，６−トリアルキル−１，４−ベンゾキノニルアルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4は２，５，６−トリアルキル−１，４−ベンゾキノニル−Ｃ1−Ｃ6アルキルであり、ｍは２または３である。特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4は
であり、ｍは２または３である。
特定の実施形態では、ＲAは、
及び
から選択される。
特定の実施形態では、ＲAは−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、その際、Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに水素であり、Ｒ3は水素またはメチルであり、Ｒ4はアリールアルキルであり、ｍは２または３である。
特定の実施形態では、ＲAは
、
及び
から選択される。
特定の実施形態では、ＲAは


及び
から成る群から選択される。
特定の実施形態では、ＲBは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり、該官能基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基への求核付加を触媒する。
特定の実施形態では、ＲBは、塩基性官能基を含む部分（たとえば、アミノ基を含む部分）である。塩基性官能基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基への求核付加（たとえば、加水分解）を触媒してもよいし、及び／または塩基性官能基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基との求核付加反応を受けてもよい。
特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素である。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４である。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49はそれぞれアルキルである。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49は、それぞれ−（ＣＲ87Ｒ88）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ89）であり、その際、Ｒ87及びＲ88は、各存在ごとに水素であり、Ｒ89は水素またはアルキルであり、ｚは１である。
特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49はそれらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、前記ヘテロシクリルは非置換である、または置換される。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49は、それらが連結される窒素原子と一緒にピペラジンを形成し、前記ピペラジンは非置換である、または置換される。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49は、それらが連結される窒素原子と一緒にピペラジンを形成し、前記ピペラジンは−Ｃ（Ｏ）Ｒ116で置換され、Ｒ116はアリールである。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49は、それらが連結される窒素原子と一緒にモルフォリンを形成し、前記モルフォリンは非置換である、または置換される。特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49であり、その際、Ｒ46及びＲ47は各存在ごとに水素であり、ｔは２、３または４であり、Ｒ48及びＲ49はそれらが連結される窒素原子と一緒にモルフォリンを形成し、前記モルフォリンは非置換である。
特定の実施形態では、ＲBはモルフォリニルアルキルである。特定の実施形態では、ＲBはモルフォリニル−Ｃ1−Ｃ4アルキルである。
特定の実施形態では、ＲBは

及び
から成る群から選択される。
特定の実施形態では、ＲBは−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55であり、その際、Ｒ53、Ｒ54及びＲ55は、各存在ごとに水素である。
特定の実施形態では、ＲCは−（ＣＨ2）0-3−Ｔであり、その際、Ｔはアリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、ＲCは−（ＣＨ2）0-3−Ｔであり、その際、Ｔはフェニルまたは５員環ヘテロアリールである。特定の実施形態では、ＲCは−（ＣＨ2）0-3−Ｔであり、その際、Ｔはフェニルまたはフリルである。特定の実施形態では、ＲCは−（ＣＨ2）−Ｔであり、その際、Ｔはフェニルまたはフリルである。特定の実施形態では、ＲCは、
及び
から成る群から選択される。
特定の実施形態では、ＲDはベンジルである。
特定の実施形態では、ＲEは水素である。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ＲA、ＲB、Ｒc、ＲD、及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ＲA、ＲB、Ｒc、及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｉｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ＲA、ＲB、及びＲCは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｉｖ）：
またはその塩を有し、
式中、Ｒ200はそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；及び、ＲA及びＲBは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｖ）：
またはその塩を有し、
式中、ＲA及びＲBは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｖｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり、ＲA及びＲBは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｖｉｉ）：
またはその塩を有し、
ＲA及びＲBは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｖｉｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；且つ、ＲA、ＲC、ＲD及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｉｘ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；且つ、ＲA、ＲC、ＲD及びＲEは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；Ｒ201は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；且つ、ＲAは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；及びＲAは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；及びＲAは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｉｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｓは１または２であり；及びＲAは上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｉｖ）：
またはその塩を有し、
式中、ｑは１または２であり；ｓは１または２であり；Ｒ202は、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；且つ、Ｒ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｖ）：
またはその塩を有し、
式中、ｑは１または２であり；ｓは１または２であり；及びＲ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｖｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｑは１または２であり；ｓは１または２であり；ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり；及びＲ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は式（Ｉ−ｘｖｉｉ）：
またはその塩を有し、
式中、ｑは１または２であり；ｓは１または２であり；及びＲ4は上記で定義されたとおりである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、
５２９５：２，８−ジベンジル−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（３−（Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル１−３，６−ジオキソシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）ブタンアミド）プロピル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５２９６：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（３−（Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−ｌ，４−ジエン−ｌ−イル）ブタンアミド）プロピル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５３９３：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５３９４：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（４−モルフォリノブチル）カルバメート；
５３９６：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（２−モルフォリノエチル）カルバメート；
５４４２：３−（（（（２，８−ジベンジル−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロパン−１−スルホネート；
５４５５：１５−アセトアミド−４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）−９，１２−ビス（カルボキシメチル）−７−メチル−１−モルフォリノ−８，１１，１４−トリオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１７−酸；
５４５６：２１−アセトアミド−４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）−１５，１８−ビス（カルボキシメチル）−７−メチル−１−モルフォリノ−８，１４，１７，２０−テトラオキソ−９−オキサ−４，７，１３，１６，１９−ペンタアザトリコサン−２３−酸；
５４５７：２−（２−（（２−（（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（３−モルフォリノプロピル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）−２−オキソエトキシ）酢酸；
５４８８：１６−アセトアミド−４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）−１０，１３−ビス（カルボキシメチル）−８−メチル−ｌ−モルフォリノ−９，１２，１５−トリオキソ−４，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸；
５４８９：１９−アセトアミド−４−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）−１０，１３，１６−トリス（カルボキシメチル）−８−メチル−１−モルフォリノ−９，１２，１５，１８−テトラオキソ−４，８，１ｌ，１４，１７−ペンタアザヘニコサン−２１−酸；
５３７０：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（Ｎ，３−ジメチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−ｌ，４−ジエン−ｌ−イル）ブタンアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５５４５：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エチル）（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルバメート；
５３９３：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５３９４：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（４−モルフォリノブチル）カルバメート；
５３９６：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イルメチル（２−モルフォリノエチル）カルバメート
５４２２：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（３−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）プロピル）（メチル）カルバメート；
５４１６：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４１７：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（Ｎ−メチルベンズアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４１８：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（Ｎ−メチルアセトアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４５２：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（Ｎ−メチル−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４５３：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（Ｎ−メチルイソブチルアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４５０：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４５１：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（４−メトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５４５４：８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（４−フルオロ−Ｎ−メチルベンズアミド）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート；
５５１２：３−（（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロパン−ｌ−スルホネート；
５５４７：ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）グリシネート；
５５４６：２，２’−（（３−（（（（２，８−ジベンジル−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）プロピル）アザネジイル）二酢酸；
５４８６：２−（２−（（３−（（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロピル）（メチル）アミノ）−２−オキソエトキシ）酢酸；
及び
５４８７：３−アセトアミド−４−（（ｌ−（（３−（（（（８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３−イル）オキシ）カルボニル）（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロピル）（メチル）アミノ）−３−カルボキシ−ｌ−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸；またはその塩から成る群から選択される。
特定の実施形態では、以下の化合物：

及び
は式（Ｉ）の化合物として除外される。
ｂ． 分子内反応
分子内反応によって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。細胞非透過性の基質はアミン塩基（または求核試薬）と、任意で１以上の荷電した官能基を含有してもよい。細胞非透過性のプロ基質は、プロ基質の細胞非透過性部分を切断する（たとえば、加水分解反応のような求核付加反応の触媒を介して）ように構成された官能基を含んでもよい。「自己ベースの加水分解」と呼ばれる同一分子内での分子内反応を介して官能基は細胞非透過性部分を切断してもよい。細胞非透過性部分の切断は細胞透過性基質を遊離する。
たとえば、式（Ｉ）の化合物のような細胞非透過性のプロ基質は細胞を含有する試料の細胞外培地にて細胞透過性基質に変換されてもよい。プロ基質の細胞非透過性部分の切断は培地の内部塩基及び／またはｐＨの選択、及び／または培地への求核試薬の添加によって調節することができる。培地への添加に好適な求核試薬には、アルコール（たとえば、エタノール）、アルコキシドアニオン（たとえば、メトキシド、エトキシド）、硫化水素、チオール（たとえば、メタンチオール）、チオレートアニオン、アジド及びアミン（たとえば、メチルアミン）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、細胞非透過性のプロ基質を含有する溶液のｐＨを調整することによって細胞非透過性のプロ基質の反応の速度が制御されてもよい。細胞非透過性部分は、細胞非透過性のプロ基質が試料に接触する前にまたは後で求核試薬を含有する溶液または非発光酵素によって切断されてもよい。
ｃ．非発光酵素の反応
式（Ｉ）の化合物を含むが、これらに限定されない本明細書で開示される細胞非透過性のプロ基質は細胞を含有する試料の細胞外培地にて細胞透過性基質に変換されてもよい。細胞非透過性の部分を切断して細胞透過性基質を遊離する非発光酵素（たとえば、ホスフェート、プロテアーゼ、エステラーゼ、またはスルファターゼ）に細胞非透過性のプロ基質を接触させることによって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。たとえば、細胞非透過性のプロ基質を試料に接触させる前にまたは後でプロ基質を非発光酵素に接触させることによって細胞非透過性のプロ基質を細胞透過性基質に変換してもよい。非発光酵素との反応を介して細胞透過性基質に変換されてもよい細胞非透過性のプロ基質には、式（Ｉ）の化合物、式（ａ）の化合物、式（ｂ）の化合物、式（ｃ）の化合物、及び式（ｄ）の化合物：

及び
が挙げられるが、これらに限定されず、
式中、Ｒ’は、各存在ごとに水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から独立して選択され；ｙ’は０、１、２、３、または４であり；且つ、ＲA、ＲB、ＲC、ＲD、及びＲEは上記で定義されたとおりである。
３．方法
開示されている化合物をアッセイにて用いて酵素の存在または活性を検出してもよい。本発明の化合物は、ルシフェラーゼの基質、たとえば、セレンテラジンが使用されているどんな方法で使用されてもよい。たとえば、試料、たとえば、酵素、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、またはＯＨラジカル、または１以上の条件、たとえば、レドックス条件にて１以上の分子を検出するのにセレンテラジンを採用する生物発光法にてそれらを使用してもよい。開示されている化合物は加水分解されて、発光酵素、たとえば、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼのための基質である細胞透過性基質を提供してもよい。特定の実施形態では、工程（ａ）はさらに、式（Ｉ）の化合物と反応するように構成された求核性化合物に試料を接触させて細胞透過性基質を提供することを含む。細胞透過性基質は上記で定義されたような式（ＩＩ）の化合物であってもよい。
一部の態様では、提供されるのは、発光酵素、たとえば、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼの存在を検出する方法である。該方法には、（ａ）開示されている化合物に試料を接触させることと、（ｂ）試料にて発光を検出することとが含まれる。発光の検出は発光酵素の存在を指し示す。酵素の存在、量、スペクトル分布、放射動態または比活性が検出され、定量されてもよい。多相溶液（たとえば、エマルジョンまたは懸濁液）を含む溶液にて、または固形支持体（たとえば、粒子、キャピラリーまたはアッセイ容器）にて酵素が検出され、定量されてもよい。一部の実施形態では、発光酵素は、別の分子（たとえば、蛍光団、発色団、またはナノ粒子）へのエネルギー供与体として使用されてもよい。さらに他の実施形態では、種々の顕微鏡及び画像化法を用いて、発光酵素及び／または開示されている化合物を含有する試料（細胞、組織、動物等）をアッセイしてもよい。
開示されている化合物は細胞を分析するインサイチュ法においても有用である。ルシフェラーゼを用いて細胞のインサイチュ分析を実施する方法は当該技術で既知である。
開示されている化合物を用いて酵素の基質と阻害剤の間を区別してもよい。スクリーニングは試験管内または生体内のいずれかで実施されてもよい。
加えて、本明細書で記載される生物発光アッセイのいずれかについては、ルシフェラーゼの不活化を阻害する若しくは妨げる、またはさもなければ発光シグナルを延長する若しくは増強するものを含むが、これらに限定されない他の試薬が反応混合物に添加されてもよい。
（１）発光酵素
特定の実施形態では、方法には発光酵素を発現している細胞に本明細書で開示されている化合物を接触させることが含まれてもよい。開示されている化合物は細胞内ルシフェラーゼのために基質、すなわち、細胞透過性基質を提供してもよい。好適な発光酵素には、セレンテラジン（またはその誘導体または類似体）を基質として利用するルシフェラーゼ（セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ）、たとえば、生物発光性甲殻類、たとえば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａに由来するルシフェラーゼ、たとえば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ、海洋生物、たとえば、刺胞動物（たとえば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、Ａｒｉｓｔｅｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ、Ｓｅｒｇｅｓｔｉｄａｅ、Ｐａｓｉｐｈｅｉｄａｅ及びＴｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ甲殻類ファミリーに由来するルシフェラーゼ、カイアシ類のルシフェラーゼ、たとえば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、たとえば、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼ、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ、たとえば、Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ及びＭｅｔｒｉｄｉａ ｐａｃｉｆｌｃａのルシフェラーゼｓ、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、たとえば、Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｌｉルシフェラーゼ、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ ｘｉｐｈｉａｓルシフェラーゼ、及びそれらの変異体、組換え体及び突然変異体が挙げられる。化合物は、たとえば、エクオリン、オベリン、イフォチナ（ｉＰｈｏｔｉｎａ）のような発光タンパク質及びそれらの変異体、組換え体及び突然変異体と共に使用されてもよい。一部の実施形態では、ルシフェラーゼはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの変異体、たとえば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）であってもよい。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、双方ともその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５５７，９７０号及び米国特許出願公開第２０１２０１１７６６７号にて記載されている。
（２）転写レポーターとの使用
開示されている化合物は遺伝子転写レポーター系と共に使用されてもよい。特定の実施形態では、提供されるのは、試料におけるプロモータの活性を測定する方法であって、その際、該プロモータは発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結される。該方法には、（ａ）開示されている化合物に試料を接触させることと、（ｂ）試料の発光を測定することによってプロモータの活性を決定することとを含み、その際、試料はプロモータを含む。プロモータは翻訳融合または転写融合を介して遺伝子に操作可能に連結されてもよい。対象の生物経路は、たとえば、発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結されるプロモータを含む細胞を経路の誘導剤で処理することによって調べられてもよい。次いでこのプロモータ活性を測定し、モニターしてプロモータの活性と当該経路の間の相関を検討すると共に、遺伝子発現に関連する動態測定（たとえば、誘導性、抑制及び活性化）を得てもよい。
一部の実施形態では、発光酵素、たとえば、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼは、異なる波長で発光する別の酵素（たとえば、ルシフェラーゼ）、たとえば、緑色ホタルルシフェラーゼ、たとえば、Ｐｈｏｔｉｎｕ ｓｐｙｒａｌｉｓ（たとえば、Ｌｕｃ２；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）または赤色コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と共に多重化してもよい。たとえば、本発明の発光酵素が機能的レポーターとして使用されるのであれば、そのときは、緑色ホタルルシフェラーゼまたは赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼを用いて遺伝子調節に対する非特異的な効果を制御すればよく、または形質移入効率について基準化すればよい。一部の実施形態では、発光酵素から生成される発光（およそ４６０ｎｍ）及び赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）から生成される発光（およそ６１０ｎｍ）は波長識別フィルターを持つルミノメータを用いて容易に分割することができ、同じ試料からの双方のシグナルの測定を可能にする。別の例では、発光酵素を転写レポーターとして用い、アッセイ試薬に含有される異なる波長で発光するルシフェラーゼと対合させればよい。別の例では、発光酵素を１以上の追加のルシフェラーゼと共に用いてもよく、その際、各ルシフェラーゼの発光は選択的な酵素阻害剤の使用を介して別々に測定されてもよい。たとえば、第１のルシフェラーゼの発光は適当な基質と緩衝液の添加の際に測定されてもよく、適当な基質と緩衝液と第１のルシフェラーゼに対する１以上の選択的な阻害剤のその後の添加の際の第２のルシフェラーゼの測定が続いてもよい。別の例では、アッセイ試薬に含有されるルシフェラーゼを細胞生理学の特定の態様、たとえば、ＡＴＰを測定するのに用いて細胞の生存率を推定してもよく、またはカスパーゼ活性を測定するのに用いて細胞のアポトーシスを推定してもよい。
（３）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）
開示されている化合物は、リガンド／タンパク質及び／またはタンパク質／タンパク質の相互作用を検出するどんな方法で使用されてもよい。開示されている化合物から生成される細胞透過性基質は発光酵素によって使用され得る。種々の実施形態では、発光酵素を用いてエネルギーをエネルギーアクセプターに移動させてもよい。そのような方法の１つが生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。ＢＲＥＴに関して、生物発光ドナーからの蛍光アクセプターへのエネルギー移動は発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質／タンパク質またはリガンド／タンパク質の試験管内または生体内での相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。一部の実施形態では、ＢＲＥＴ法は、リガンド／タンパク質及び／またはタンパク質／タンパク質の相互作用のためのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が介在する生物発光共鳴エネルギー移動（ＮＡＮＯＢＲＥＴ（登録商標））アッセイであってもよい。ＮＡＮＯＢＲＥＴは、２つの異なる方法：（１）ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）とＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）の技法、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を用いてタンパク質／タンパク質及び／またはリガンド／タンパク質の相互作用を検出することが、増加したシグナルと低下したスペクトルの重複によって達成されてもよいこと；及び（２）対象のタンパク質に融合されたＮＡＮＯＬＵＣと、蛍光トレーサを用いて生細胞にてリガンド／受容体の相互作用を検出することを含む。
一部の実施形態では、ＢＲＥＴ分析で使用される発光酵素を用いて２つの分子が互いに結合することが可能であるかどうか、または細胞にて同時局在することが可能であるかどうかを決定することができる。たとえば、対象の分子または対象のタンパク質と組み合わせる生物発光ドナー分子として発光酵素を用いて第１の融合タンパク質を創り出すことができる。種々の実施形態では、第１の融合タンパク質は発光酵素と対象のタンパク質とを含有する。種々の実施形態では、発光酵素を含有する第１の融合タンパク質をＢＲＥＴ分析に用いて、細胞溶解物、無傷細胞及び生きている動物を含むが、これらに限定されない系にてタンパク質／タンパク質の相互作用を検出することができる。種々の実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を蛍光アクセプター分子として使用することができる。一部の実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を第２の対象タンパク質または発光酵素に融合することができる。たとえば、発光酵素をＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）に融合し、細胞または動物で発現させることができ、且つＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）ＴＭＲリガンドのような蛍光ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドで標識することができる。その後、細胞透過性発光酵素基質の存在下で融合物は励起され、蛍光を発することができる。一部の実施形態では、２、３の非限定例を挙げると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質または、フルオレセイン、ローダミン緑、オレゴン緑、もしくはアレクサ４８８を含む蛍光標識と組み合わせて発光酵素を用いてＢＲＥＴを実施してもよい。
（４）生細胞または溶解型のためのタンパク質近接アッセイ
一部の実施形態では、開示されている化合物を循環置換型（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｒｅｍｕｔｅｄ）（ＣＰ）または直鎖開裂型（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｓｐｌｉｔ）（ＳＳ）の発光酵素融合タンパク質と共に用いてタンパク質の近接を測定してもよい。発光酵素はプロテアーゼ基質のアミノ酸配列（たとえば、ＴＥＶ）の挿入を介して置換され、または開裂されて低い生物発光を生成する。不活性の発光酵素を（たとえば、遺伝子融合を介して）モニタータンパク質に繋げる。相互作用する可能性のあるタンパク質が（たとえば、遺伝子融合を介して）プロテアーゼ（たとえば、ＴＥＶ）に繋がれる。２つのモニタータンパク質が相互作用する、または十分に近接する（たとえば、構成的な相互作用、薬剤刺激または経路の応答を介して）と、発光酵素が切断されて高い生物発光活性を生成する。その例が細胞または生化学アッセイにおいてタンパク質近接の測定に適用されてもよい。
（５）タンパク質相補アッセイ
一部の実施形態では、開示されている化合物は、たとえば、タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイのようなリガンド／タンパク質及びタンパク質／タンパク質の相互作用または近接性を検出する他の方法で使用されてもよい。タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）は２つの生体分子、たとえば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。ＰＣＡは、互いに最接近させると機能的に活性のあるタンパク質に再構成する同じタンパク質、たとえば、酵素の２つの断片を利用する。一部の実施形態では、ＮＡＮＯＢＩＴ（登録商標）技術（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出してもよい。ＮＡＮＯＢＩＴは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼに由来する非発光性ペプチド（ＮＬＰｅｐ）及び非発光性ポリペプチド（ＮＬＰｏｌｙ）を利用する。ＮＬＰｅｐ及びＮＬＰｏｌｙは対象タンパク質に融合される。対象タンパク質が相互作用するのであれば、ＮＬＰｅｐ及びＮＬＰｏｌｙが相互作用して完全長のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ酵素を再構成する。
たとえば、分離に寛容な部位にて発光酵素を２つの断片に分離することができ、分離された発光酵素の各断片を相互作用すると考えられる対象ポリペプチドの対、たとえば、ＦＫＢＰ及びＦＲＢの一方に融合することができる。２つの対象ポリペプチドが実際相互作用するのであれば、たとえば、発光酵素の断片はそのとき、互いに最接近して機能的で活性のある発光酵素を再構成する。一部の実施形態では、次いで、開示されている化合物と細胞透過性基質を用いて再構成された発光酵素の活性を検出し、測定することができる。一部の実施形態では、Ｌａｃ−Ｚ（Ｌａｎｇｌｅｙら，ＰＮＡＳ，７２：１２５４−１２５７（１９７５））またはリボヌクレアーゼＳ（Ｌｅｖｉｔ及びＢｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１３３３−１３３９（１９７６））に類似するさらに一般的な相補系にて分割発光酵素を使用することができる。一部の実施形態では、別の発光酵素断片（「Ｂ」と命名）と相補性であることが知られる発光酵素断片（「Ａ」）を標的タンパク質に融合することができ、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解物における発光を介して、得られる融合物をモニターすることができる。一部の実施形態では、断片Ｂの供給源は同一細胞であってもよく（たとえば、断片Ｂの遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれるまたは細胞内での別のプラスミドに含有されるのであれば）、またはそれは別の細胞に由来する溶解物若しくは精製タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、この同一の融合タンパク質（断片Ａ）は、固形支持体への付着が可能なＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）のようなポリペプチドと断片Ｂとの間での融合を用いて捕捉または不動化されてもよい。一部の実施形態では、発光を用いて上手くいった捕捉を明らかにすることができ、または捕捉された物質の量を定量することができる。
（６）二量体化アッセイ
一部の実施形態では、開示されている化合物は、各結合相手、たとえば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰに融合される完全長の循環置換型発光酵素と共に使用され、タンパク質相補型アッセイで使用されてもよい。本明細書で開示されている方法と従来のタンパク質相補性アッセイとの間での重大な差異は、相補性はなかったが、むしろ、２つの完全長の酵素、たとえば、循環置換型発光酵素の二量体化があったということである。
手短には、低活性用に類似して構成された循環置換型のレポータータンパク質を融合タンパク質の相手の双方に融合する。たとえば、各融合相手は同一に構成された置換型レポーターに連結されてもよい。融合相手の相互作用によって置換型レポーターを最接近させ、それによってさらに高い活性を有するハイブリッドレポーターの再構成を可能にする。
（７）組み合わせ
特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、細胞非透過性のプロ基質とそれに対応する細胞透過性基質との混合物に試料（たとえば、細胞）を接触させることが含まれる（たとえば、図１５を参照）。特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、適当なｐＨの緩衝液条件にてまたは適当な求核試薬溶液にて開示されている細胞透過性化合物を事前にインキュベートしてある程度細胞透過性基質を遊離し、次いで上記の事前にインキュベートした溶液に試料（たとえば、細胞）を接触させることが含まれる。特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法には、細胞非透過性基質と細胞透過性基質のカルバメート官能基に反応するように構成された求核性化合物とに試料を接触させて細胞透過性基質（たとえば、セレンテラジン）を遊離することが含まれる。一部の実施形態では、開示されている化合物と方法を用いて高処理能力スクリーニング操作アッセイ方式の初期輝度を増大させてもよい。そのような方法は試料へのセレンテラジンの持続的な遊離による試料継続時間での高い輝度を提供する。
（８）試料
生物成分を含有する試料と共に開示されている化合物を使用してもよい。試料は細胞を含んでもよい。試料は、成分（無傷細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、及びそれらの混合物を含む）の異種混合物、または単一成分、または成分（たとえば、天然のまたは合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または脂質膜複合体）の同種群を含んでもよい。化合物は一般に、使用の濃度の範囲内で生細胞及び他の生物成分に対して非毒性である。
試料は、動物（たとえば、脊椎動物）、植物、真菌、生理的流体（たとえば、血液、血漿、尿、粘液、分泌物等）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または細胞の精製分画（たとえば、細胞内分画）を含んでもよい。特定の実施形態では、試料は細胞であってもよい。一部の実施形態では、試料は生細胞であってもよい。細胞は、真核細胞、たとえば、酵母、鳥類、植物、昆虫の細胞、または、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ若しくはブタの細胞を含むが、これらに限定されない哺乳類の細胞、または原核細胞、または２以上の異なる生物に由来する細胞、または細胞溶解物若しくはその上清であってもよい。細胞は、組換え技術を介して遺伝子操作されていなくてもよく（非組換え細胞）、または、組換えＤＮＡによって一時的に形質移入される、及び／またはそのゲノムが組換えＤＮＡによって安定的に増強される、若しくは遺伝子を破壊するように、たとえば、プロモータ、イントロン若しくはオープンリーディングフレームを破壊するように、若しくはＤＮＡ断片の１つを別のもので置き換えるようにゲノムが修飾されている組換え細胞であってもよい。組換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡの断片は、本発明の方法によって検出される分子、検出される分子のレベル若しくは活性を変化させる部分、及び／または分子のレベル若しくは活性を変化させる分子若しくは部分に無関係な遺伝子産物をコードしてもよい。細胞はルシフェラーゼを発現してもよいし、または発現しなくてもよい。細胞は組換え法によって遺伝子操作されていてもよい。
４．キット
開示されるのは、１以上の酵素（たとえば、ルシフェラーゼ）の存在または活性を測定するためのキットである。キットは、以下：本発明の化合物または組成物、セレンテラジン依存性の発光酵素及び反応緩衝液の１以上を含んでもよい。反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応及び発光酵素反応のために個々の製剤で存在してもよく、または単一工程アッセイのために単一製剤で存在してもよい。キットはまた、非ルシフェラーゼ酵素のための阻害剤、活性化剤及び／または増強剤を含有してもよい。キットはまたアッセイのための陽性対照及び／または陰性対照を含有してもよい。
前述のことは以下の実施例を参照してさらに良好に理解されてもよいが、それらは説明目的のために提示されるのであって、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
実施例１：
３−［（Ｎ−メチル−Ｎ−Ｂｏｃ］プロパナールの合成
Ｄｅｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（１６．０２ｇ，３７．７８ミリモル）を０℃にて３−（Ｎ−メチル−Ｎ−Ｂｏｃ）プロパノール（６．５ｇ，３４．３５ミリモル）の塩化メチレン溶液１２０ｍｌに加え、得られた混合物を室温で４時間撹拌した。飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で反応混合物の反応を止め、生成物を塩化メチレンで抽出した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液、ブライン溶液及び水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。減圧下で溶媒を蒸発させ、溶離液としてヘプタンと酢酸エチルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製して７４．６４％の収率で４．８ｇの所望の生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2）δｐｐｍ：９．８０（ｓ，１Ｈ，ＨＣ＝Ｏ），３．５０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２），２．８３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．６２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２）；ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：１８８．２［Ｍ＋Ｈ］．
Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−ｌ，３−ジアミンの合成
モルフォリンプロピルアミン（０．２３１ｇ，１．６０ミリモル）のメタノール溶液２０ｍｌに、３−［（Ｎ−メチル）Ｂｏｃ］プロパナール（０．３ｇ，１．６０ミリモル）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。ＮａＢＨ4（０．１８ｇ，４．８１ミリモル）を０℃にて混合物に加え、得られた混合物を０℃で１時間及び室温で１時間撹拌した。５ｍｌの水を加えることによって反応を止めた。溶媒を除いた後、５ｍｌの水を加え、塩化メチレンで混合物を３回抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、所望の生成物を得、さらに精製することなく生成物をそのまま次の工程で使用した。
セレンテラジン ＨＨ−［Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−ｌ，３−ジアミン］カルバメートの合成
セレンテラジン ＨＨ（０．１ｇ，０．２５６ミリモル）とビス（ペンタフルオロフェニル）ジカルボネート（０．１１２ｇ，０．２５６ミリモル）の無水ＴＨＦ１０ｍｌにおける混合物にＴＥＡ（５２ｍｇ，０．５１２ミリモル）をアルゴンのもとで室温にて加えた。固形物が消失するまで混合物２〜３分撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロピル）カルバメート（０．１６１ｇ，０．５１２ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、６９．３％の収率で生成物を得た（０．１３ｇ、０．１７７ミリモル）。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：７１９．５［Ｍ＋Ｈ］+．
セレンテラジン ＨＨ−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−ｌ，３−ジアミン］カルバメートの合成
セレンテラジンＨＨ−［Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−１，３−ジアミン］カルバメート（０．１ｇ，０．１３６ミリモル）とトリイソプロピルシラン（５０ｕｌ）を１０ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、高真空下で一晩、残留物を乾燥させ、生成物をそのまま次の工程で使用した。
＃５２９５の合成。
３−メチル−３−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−ｌ，４−ジエン−ｌ−イル）ブタン酸（１０２．５ｍｇ，０．４０９ミリモル）とクロロギ酸イソブチル（５５．９ｍｇ，０．４０９ミリモル）の無水ＴＨＦ溶液１０ｍｌに０℃で、Ｎ−メチルモルフォリン（８２．８ｍｇ）を加えた。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌し、５ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中のセレンテラジンＨＨ−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−ｌ，３−ジアミン］カルバメートを加え、得られた混合物を１時間撹拌した。溶離液としてヘプタン及び酢酸エチルを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を直接精製し、７４％の収率（０．０８７ｇ）で生成物を得た。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：８６５．５［Ｍ＋Ｈ］+．
実施例２：
フリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）プロパン−ｌ，３−ジアミン］カルバメートの合成
無水ＴＨＦ２０ｍｌにおけるフリマジン（３００ｍｇ，０．７８８ミリモル）とビス（ペンタフルオロフェニル）ジカルボネート（３８０ｍｇ，０．８６７ミリモル）の混合物にアルゴンのもとで室温にてＴＥＡ（１６０ｍｇ，１．５８ミリモル）を加えた。混合物を２〜３分撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロピル）カルバメート（０．４９７ｇ，０．５１２ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、７２．３％の収率で生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2）δｐｐｍ：７．９−８．０（ｍ，３Ｈ），７．５３（ｄ，２Ｈ），７．２−７．５（ｍ，７Ｈ），６．３４（ｍ，１Ｈ，フラン），６．１３（ｄ，１Ｈ，フラン），４．５９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），４．１８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），３．６６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2Ｏ），３．２０−３．５６（ｍ，６Ｈ），２．８４（ｄ，３Ｈ，ＮＣＨ3），２．３−２．５（ｍ，６Ｈ），１．７９−２．０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2），１．４１（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：７２３．５９［Ｍ＋Ｈ］+．
＃５２９６の合成。
＃５２９５の合成に使用した上記の方法を用いて＃５２９６を調製した。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：８５５．３８［Ｍ＋Ｈ］+．
実施例３：
５３９３の合成。
氷水槽にて窒素のもとでビス（ペンタフルオロフェニル）カルボネート（７７ｍｇ，０．２０ミリモル）とトリエチルアミン（４０ｍｇ，０．３９ミリモル）を８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニル−ｌ，７−ジヒドロイミダゾ［ｌ，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン（５０ｍｇ，０．１３ミリモル）のＴＨＦ溶液に連続して加えた。混合物を５分間撹拌し、Ｎ−メチル−３−モルフォリン−４−イルプロパン−ｌ−アミン（ＨＣ１塩，３８ｍｇ，０．２０ミリモル）を加え、混合物をさらに１０分間撹拌した。ＴＬＣが出発物質の消失を示した後、溶媒を取り除き、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して黄色っぽい固形物として生成物（４２ｍｇ、５７％）を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．８６（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｍ，８Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ），３．６０（ｍ，６Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），２．４１（ｍ，６Ｈ），１．７４（ｍ，２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５６６．５．
実施例４：
５３９６の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．９６（ｍ，３Ｈ），７．３２（ｍ，８Ｈ），６．９７（ｓ，ＩＨ），６．３２（ｓ，ＩＨ），６．１２（ｓ，ＩＨ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｍ，６Ｈ），３．３５（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｍ，６Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｍ，２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５８０．５．
実施例５：
５３９４の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．３９（ｍ，１１Ｈ），６．９７（ｓ，ＩＨ），６．２８（ｓ，ＩＨ），６．１３（ｓ，ＩＨ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｍ，６Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５５１．５．
実施例６：
Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミンの合成
モルフォリンプロピルアミン（０．５０ｇ，３．４６ミリモル）の無水メタノール溶液４０ｍｌに、３−（Ｎ−メチル−Ｎ−Ｂｏｃ）アセトアルデヒド（０．６ｇ，３．４６ミリモル）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。０℃で混合物にＮａＢＨ4（０．３９３ｇ，１０．３９ミリモル）を加え、得られた混合物を０℃で１時間及び室温で１時間撹拌した。５ｍｌの水を加えることによって反応を止めた。溶媒を取り除いた後、１０ｍｌの水を残留物に加えた。塩化メチレンで混合物を３回抽出し、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、所望の生成物を得たが、さらに精製することなく、生成物をそのまま次の工程で使用した。
＃５４１６の合成。
アルゴンのもとで室温にて無水ＴＨＦ２０ｍｌにおけるフリマジン（２５０ｍｇ，０．６５７ミリモル）とビス（ペンタフルオロフェニル）ジカルボネート（０．３１７ｍｇ，０．７２２ミリモル）の混合物にＴＥＡ（７３ｍｇ，０．５１２ミリモル）を加えた。混合物を２〜３分間撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノエチル））カルバメート（０．３９６ｇ，１．３１ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、７６．４％の収率（０．３５６ｇ）で生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2）δｐｐｍ：７．９−８．０（ｍ，３Ｈ），７．５８（ｄ，２Ｈ），７．２−７．５（ｍ，７Ｈ），６．３６（ｍ，１Ｈ，フラン），６．１５（ｄｄ，１Ｈ，フラン），４．５９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），４．２０（ｄ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），３．６７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2Ｏ），３．３０−３．６０（ｍ，６Ｈ），２．８７（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ3），２．３−２．５（ｍ，６Ｈ），１．６−２．０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．４４（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：７０９．６２［Ｍ＋Ｈ］+．
実施例７：
フリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメートの合成
フリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ’−Ｂｏｃ−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメート＃５４１６（０．３５０ｇ，０．４９４ミリモル）とトリイソプロピルシラン（１００uｌ）を２０ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、高真空下で一晩、残留物を乾燥させ、生成物をそのまま次の工程で使用した。
＃５４１７の合成。
室温で無水ＴＨＦ１０ｍｌにおけるフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメート（０．０５６３ミリモル）と無水安息香酸（６３ｍｇ，０．２８２ミリモル）の混合物にＴＥＡを加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチルを用いたフラッシュシリカカラムによって化合物を７５％の収率（３０ｍｇ）で直接精製した。ＭＳ−ＥＳＩ （ｍ／ｅ）：７１３．５［Ｍ＋Ｈ］+．
実施例８：
＃５４１８の合成。
室温で無水ＴＨＦ１０ｍｌにおけるフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメート（０．０５６３ミリモル）と塩化アセチル（４４ｍｇ，０．２８２ミリモル）の混合物にＴＥＡを加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。溶離液としてヘプタン及び酢酸エチルを用いたフラッシュシリカカラムによって化合物を直接精製し、６８％の収率（２５ｍｇ）を得た。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：６５１．５［Ｍ＋Ｈ］+．
実施例９：
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（３−オキソプロピル）カルバメートの合成
Ｎ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−アミノプロパン−３−ｏｌ（５．５５ｇ，２９．３ミリモル）のジクロロメタン（１００ｍｌ）溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペリオジナン（１４．９３ｇ，３５．２ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで得られた混合物を飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、飽和炭酸ナトリウム溶液及びブラインで洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を取り除き、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製して透明な油（３．５ｇ、６４％）として生成物を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：９．７８（ｓ，１Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）プロピル）（メチル）カルバメートの合成
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（３−オキソプロピル）カルバメート（０．５７ｇ，３．２９ミリモル）のメタノール（２０ｍｌ）溶液に１−ベンゾイルピペラジン（０．６３ｇ，３．２９ミリモル）を加えた。反応混合物を１時間撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム（０．２５ｇ，６．５８ミリモル）を加えた。次いで混合物をさらに４時間撹拌し、酢酸エチル／水で抽出した。有機層を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残留物をフラッシュクロマトグラフィによって精製し、白色固形物（０．８４ｇ、７０％）として生成物を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．４１（ｍ，５Ｈ），３．５０（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．３６（ｍ，６Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）．
（４−（３−（メチルアミノ）プロピル）ピペラジン−１−イル）（フェニル）メタノンの合成
Ｔｅｒｔ−ブチル（３−（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）プロピル）（メチル）カルバメート（０．８ｇ，２．２ミリモル）をジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（５ｍｌ）と２〜３滴のトリイソプロピルシランを連続して加えた。次いで得られた混合物を１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、さらに精製することなく、残留物を次の工程で使用した。
５４２２の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．９５（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，１２Ｈ），６．９７（ｓ，５Ｈ），５．０２（ｓ，３Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｍ，６Ｈ），３．０５（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，４Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６９．５
実施例１０：
３−モルフォリノプロパナールの合成
３−［（Ｎ−メチル−Ｎ−Ｂｏｃ］プロパナール（「１３０７−８４」）の合成に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（２−モルフォリノエチル）アミノ）エチル）カルバメートの合成
１３０７−８４に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
５４５０の合成
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：８．０３（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｍ，１２Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｓ，２Ｈ），３．６６（ｍ，６Ｈ），３．４６（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ，６Ｈ），２．４３（ｍ，６Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６９５．５．
実施例１１：
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（２−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）エチル）カルバメートの合成
１３０７−８４に使用したものと同じ手順に従った。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。粗精製物をそのまま次の工程で使用した。
８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメートの合成
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2，δ）：７．９５（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｍ，１２Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），３．６２（ｍ，６Ｈ），３．３６（ｍ，７Ｈ），２．７９（ｍ，２Ｈ），２．４７（ｍ，６Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７０９．５
５４５１の合成。
８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−イル（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）エチル）（３−モルフォリノプロピル）カルバメート（１３２８−１９）（９０ｍｇ，０．１３ミリモル）のジクロロメタン（５ｍｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（１ｍｌ）と２〜３滴のトリイソプロピルシランを加えた。反応混合物を１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を高真空下で乾燥させた。ジクロロメタン（５ｍｌ）を残留物に加え、その後、塩化４−メトキシベンゾイル（４３．３ｍｇ，０．２５ミリモル）を加えた。次いでトリエチルアミン（０．１８ｍｌ，１．２７ミリモル）をゆっくり加え、得られた混合物をさらに１時間撹拌した。溶媒を取り除き、フラッシュクロマトグラフィによって残留物を精製し、黄色っぽい固形物（４０ｍｇ、４３％）として生成物を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７４３．５
５４５２の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃl2，δ）：７．５３（ｍ，１８Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．５５（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｍ，８Ｈ），２．９１（ｍ，５Ｈ），２．４９（ｍ，８Ｈ），１．４３（ｍ，２Ｈ）；ＦＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃl2，δ）：−６１．１７（ｓ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７８１．４
５４５３の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2，δ）：８．１８（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｍ，１２Ｈ），５．０２ ６．９７（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．１６（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｍ，６Ｈ），３．０９（ｍ，５Ｈ），２．４１（ｍ，７Ｈ），１．２８（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６７９．５
５４５４の合成。
５３９３に使用したものと同じ手順に従った。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2，δ）：７．６８（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，１４Ｈ），６．８７（ｍ，２Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｍ，６Ｈ），２．９４（ｍ，５Ｈ），２．４１（ｍ，８Ｈ），１．３３（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７３１．４
実施例１２：
３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロパン−１−スルホネートの合成
５０ｍｌのイソプロパノールにおける３−モルフォリノプロパン−１−アミン（１．０ｇ，６．９３ミリモル）と１，３−プロパンスルトン（０．８４６ｇ，６．９３ミリモル）とＴＥＡ（０．７０１ｇ，６．９３ミリモル）の混合物を２日間還流した。溶媒を取り除き、残留物をエーテルで粉砕し、次いで遠心分離の後、エーテルを静かに捨て、エーテルによる粉砕、遠心分離及び溶媒を静かに捨てることを３回繰り返した。淡白色の固形物を回収し、真空下で一晩乾燥させ、そのまま次の工程で使用した。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃ１2）δｐｐｍ：８．５２（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｔ，２Ｈ），７．１−７．６（ｍ，１３Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），４．０８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｐｈ），３．３−３．８（ｍ，１０Ｈ），２．９１（ｓ，３Ｈ，ＮＣＨ3），２．１−２．５（ｍ，６Ｈ），１．６−２．０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2）；ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：６８４．３９［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９９．３％
＃５４４２の合成。
アルゴンのもとで室温にて１０ｍｌの無水ＴＨＦにおけるセレンテラジンＨＨ（３００ｍｇ，０．７６８ミリモル）とビス（ペンタフルオロフェニル）ジカルボネート（０．４３７ｍｇ，０．９９８ミリモル）の混合物にＴＥＡ（２０２ｍｇ，２ミリモル）を加え、混合物を２〜３分撹拌し、次いで１５ｍｌのＤＭＦ中の３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロパン−１−スルホネート（０．６１１ｍｇ，２．３０ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。真空下で溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン／酢酸エチル及び塩化メチレン／ＭｅＯＨを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、１２．４％（６５ｍｇ）の収率を得た。
実施例１３：
＃５５１２の合成。
アルゴンのもとで室温にてセレンテラジンＨＨ（２００ｍｇ，０．５２５ミリモル）とビス（ペンタフルオロフェニル）ジカルボネート（０．２７６ｍｇ，０．６３１ミリモル）の１０ｍｌの無水ＴＨＦにおける混合物にＴＥＡ（０．６４ｍｇ，０．６３ミリモル）を加え、混合物を２〜３分撹拌し、次いで１０ｍｌのＤＭＦ中の３−（（３−モルフォリノプロピル）アミノ）プロパン−ｌ−スルホネート（０．４１８ｇ，１．５８ミリモル）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。真空下で溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン／酢酸エチル及び塩化メチレン／ＭｅＯＨを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、８．５％（３０ｍｇ）の収率を得た。６７４．３６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９８．２％
実施例１４：
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−Ｃ２−ＭＯＰ−フリマジンカルバメートの合成
アルゴンのもとで０℃にてＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＣＯＯＨ（６６６．７ｍｇ，１．１６ミリモル）とイソクロロホルメート（０．１５８ｇ，１．１６ミリモル）の無水ＴＨＦ４０ｍｌ溶液にＮ−メチルモルフォリン（０．２３５ｇ，２．３２ミリモル）を加えた。混合物を０℃〜室温で１時間撹拌し、５ｍｌの塩化メチレン中のフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（０．２ｌｍｇ，０．２９ミリモル）を加え、その後、さらなるＮ−メチルモルフォリン（０．２３５ｇ，２．３２）を添加し（ｐＨをチェックすること、塩基性である必要あり）、次いで得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチル及び酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を１００ｍｌの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を３回洗浄して、ＴＨＦ溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるＮ−メチルモルフォリンＨＣｌ塩を取り除いた。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、６６．４％（０．２１ｇ）の収率を得た。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+ｌ１６４．６７；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９５．６％
＃５４５５（Ａｃ−ＤＤＤ−ＭＯＰ−Ｃ２−ＦＲＺ）の合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−Ｃ２−ＭＯＰ−フリマジンカルバメート（０．２１ｇ）とトリイソプロピルシラン（０．１ｍｌ）を１５ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン（２０ｍｌ）を加え、残留ＴＦＡを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで３回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。［Ｍ＋Ｈ］+９９６．５０；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９５．６％
実施例１５：
＃５４５７（ＣＯＯＨ−ＭＯＰ−Ｃ２−ＦＲＺ）の合成
室温にて２０ｍｌの無水ＴＨＦにおける１，４−ジオキサン−２，６−ジオン（０．２５ｇ，０．４３５ミリモル）とフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（０．１０４ｇ，０．１４４モル）の混合物にＴＥＡ（８８ｍｇ，０．８７１ミリモル）を加えた。出発物質アミンが完全に消費されるまで（ｐＨをチェックのこと、塩基性条件が求められ、必要に応じてさらなるＴＥＡが添加されるべきである）、混合物を室温で１時間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって生成物を精製した。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+７２５．４４；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９７．８％．
実施例１６：
＃５４８６（ＣＯＯＨ−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺ）の合成
室温にて２０ｍｌの無水ＴＨＦにおけるｌ，４−ジオキサン−２，６−ジオン（８８ｍｇ，０．７６０ミリモル）とフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）エチレンジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（８０ｍｇ，０．１０９ミリモル）の混合物にＴＥＡ（７７ｍｇ，０．７６ミリモル）を加えた。出発物質アミンが完全に消費されるまで（ｐＨをチェックのこと、塩基性条件が求められ、必要に応じてさらなるＴＥＡが添加されるべきである）、混合物を室温で１時間撹拌した。溶離液としてヘプタン／酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって生成物を精製した。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+７３９．４７；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて８５．１％．
実施例１７：
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺの合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＣＯＯＨ（２３９ｍｇ，０．５９３ミリモル）とクロロギ酸イソブチル（８１ｍｇ，０．５９３ミリモル）の４０ｍｌ無水ＴＨＦ溶液にＮ−メチルモルフォリン（８５．８ｍｇ，０．８４８ミリモル）を０℃で加えた。混合物を０℃〜室温で１時間撹拌し、５ｍｌの塩化メチレン中のフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−ｌ，３−プロパン−ジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（１２５ｍｇ，０．１６９ミリモル）を加え、その後さらなるＮ−メチルモルフォリン（８６ｍｇ，０．８４８ミリモル）を加え（ｐＨをチェックのこと、塩基性である必要あり）、次いで、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチル及び酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を１００ｍｌの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を３回洗浄して、ＴＨＦ溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるＮ−メチルモルフォリンＨＣｌ塩を取り除いた。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液として酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を再精製し、５８．２％（０．１０ｇ）の収率を得た。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+１００７．８；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９６．９％
＃５４８７（ＡｃＤＤ−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺ）の合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−Ｃ３−ＭＯＰ−フリマジンカルバメート（１００ｍｇ）とトリイソプロピルシラン（５０uｌ）を１５ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン（２０ｍｌ）を加え、残留ＴＦＡを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで３回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+８９５．６２；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９８．６％
実施例１８：

ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺの合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＣＯＯＨ（３７３ｍｇ，０．６５１ミリモル）とクロロギ酸イソブチル（８９ｍｇ，０．６５１ミリモル）の４０ｍｌ無水ＴＨＦ溶液に０℃にてＮ−メチルモルフォリン（１３１ｍｇ，１．３０ミリモル）を加えた。混合物を０℃〜室温で１時間撹拌し、５ｍｌの塩化メチレン中のフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−ｌ，３−プロパン−ジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（１２０ｍｇ，０．１６２ミリモル）を加え、その後さらなるＮ−メチルモルフォリン（８６ｍｇ，０．８４８ミリモル）を加え（ｐＨをチェックすること、塩基性である必要あり）、次いで得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチル及び酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製した。次いで精製した化合物を１００ｍｌの塩化メチレンに溶解し、水で溶液を３回洗浄して、ＴＨＦ溶媒によってカラムから洗い流された可能性があるＮ−メチルモルフォリンＨＣｌ塩を取り除いた。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶媒を取り除いた後、溶離液として酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を再精製して５２．１％（０．１０ｇ）の収率を得た。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+１１７８．８９；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９６．６％
＃５４８８（ＡｃＤＤＤ−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺ）の合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−Ｃ３−ＭＯＰ−フリマジンカルバメート（１００ｍｇ）とトリイソプロピルシラン（５０uｌ）を１５ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン（２０ｍｌ）を加え、残留ＴＦＡを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで３回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］+１０１０．５４；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて９７．８％
実施例１９：
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺの合成
０℃にてＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−ＣＯＯＨ（３００ｍｇ，０．４０３ミリモル）とクロロギ酸イソブチル（５５ｍｇ，０．４０３ミリモル）の３０ｍｌ無水ＴＨＦ溶液にＮ−メチルモルフォリン（８１．５ｍｇ，０．８０５ミリモル）を加えた。混合物を０℃〜室温で１時間撹拌し、５ｍｌの塩化メチレン中のフリマジン−［Ｎ’−メチル−Ｎ−（３−モルフォリノプロピル）−ｌ，３−プロパン−ジアミン］カルバメートＴＦＡ塩（７４．２ｍｇ，０．１ミリモル）を加え、その後、さらなるＮ−メチルモルフォリン（８６ｍｇ，０．８４８ミリモル）を加え（ｐＨをチェックすること、塩基性である必要あり）、次いで得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチル及び酢酸エチル／ＴＨＦを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィによって化合物を精製し、５８．８％（８０ｍｇ）の収率を得た。
＃５４８９（ＡｃＤＤＤＤ−ＭＯＰ−Ｃ３−ＦＲＺ）の合成
ＡｃＤ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）Ｄ（ｔＢｕ）−Ｃ３−ＭＯＰ−フリマジンカルバメート（８０ｍｇ）とトリイソプロピルシラン（５０uｌ）を１５ｍｌの塩化メチレンとＴＦＡ（容積で１：１）に溶解し、混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を取り除いた後、トルエン（２０ｍｌ）を加え、残留ＴＦＡを同時蒸発させた。残留固形物をエーテルで３回粉砕した。エーテルを静かに捨てた後、固形物を真空下で乾燥させた。ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｅ）：［Ｍ＋Ｈ］／２ ５６３．４５；ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにて８４．９％
実施例２０：
ＨｅＬａ細胞におけるＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７、及びＰＢＩ−５４８８（図２）を加え、発光を検出した。
５，０００個／ウェルでＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに入れた。３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした後、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（３：１の脂質：ＤＮＡの比；５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ／ウェル）を用いてＣＭＶ−ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）構築物（ｐＦ５Ｋ／Ｎｌｕｃ）またはｐＧＥＭ−３Ｚ陰性対照ベクターで細胞に一時的に形質移入し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で再び一晩インキュベートした。
翌日、細胞培地を取り除き、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地に置き換えた。ＰＢＩ−５５１２、ＰＢＩ−５４５５、ＰＢＩ−５４８７、またはＰＢＩ−５４８８をＤＭＳＯで連続希釈して５００×ストックを作り、その後、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地で２５０×希釈して２×ストックを作った。次いで細胞と培地の既存の容量に同等の容量の２×基質ストックを加えた。２秒間の積分時間を伴ったＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメータにて３７℃で１５分ごとに発光を測定した。図３Ａ〜３Ｄ（１０％ＦＢＳ）及び図４Ａ〜４Ｄ（０．５％ＦＢＳ）におけるデータは、各プロ基質がフリマジン基質を持続遊離することができ、経時変化全体にわたる細胞内ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）による触媒代謝回転のためにフリマジンを利用可能にすることを実証している。
細胞生存率を測定するために、推奨されたプロトコールの改変版に従ってｐＧＥＭ−３Ｚ形質移入細胞（ルシフェラーゼの発現を欠く対照ＤＮＡ）にてＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。２時間後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉルミノメータ（２秒間の積分時間）を用いて発光を測定し（図５Ａ及び５Ｃ）、調べた濃度の関数として各化合物についての異なる毒性プロファイルを示す（図５Ｂ及び５Ｄ）。
実施例２１：
ＨｅＬａ細胞におけるＰＢＩ−５４５７、ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、ＰＢＩ−５４８８及び５４８９
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５４５７、ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、及びＰＢＩ−５４８８（図６）を加え、発光を検出した。
５，０００個／ウェルでＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに入れた。３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした後、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（３：１の脂質：ＤＮＡの比；５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ／ウェル）を用いてＣＭＶ−ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）構築物（ｐＦ５Ｋ／Ｎｌｕｃ）またはｐＧＥＭ−３Ｚ陰性対照ベクターで細胞に一時的に形質移入し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で再び一晩インキュベートした。
翌日、細胞培地を取り除き、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地に置き換えた。ＰＢＩ−５４５７、ＰＢＩ−５４８６、ＰＢＩ−５４８７、びＰＢＩ−５４８８または５４８９をＤＭＳＯで連続希釈して３００．３×ストックを作り、その後、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地で１５０倍希釈して２×ストックを作った。次いで細胞と培地の既存の容量に同等の容量の２×基質ストックを加えた。２秒間の積分時間を伴ったＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメータにて３７℃で１５分ごとに発光を測定した。図７Ａ〜７Ｄ（１０％ＦＢＳ）及び図８Ａ〜８Ｄ（０．５％ＦＢＳ）におけるデータは、各プロ基質がフリマジン基質を持続遊離することができ、経時変化全体にわたる細胞内ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）による触媒代謝回転のためにフリマジンを利用可能にすることを実証している。
細胞生存率を測定するために、推奨されたプロトコールの改変版に従ってｐＧＥＭ−３Ｚ形質移入細胞（ルシフェラーゼの発現を欠く対照ＤＮＡ）にてＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。２時間後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉルミノメータ（０．５秒の積分時間）を用いて発光を測定し（図９Ａ及び９Ｃ）、調べた濃度の関数として各化合物についての異なる毒性プロファイルを示す（図９Ｂ及び９Ｄ）。
実施例２２：
ＨｅＬａ細胞におけるＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８
開示されている化合物のプロ基質として作用する能力を実証するために、セレンテラジンを利用するルシフェラーゼ、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を発現している細胞に化合物ＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８（図１０）を加え、発光を検出した。
５，０００個／ウェルでＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに入れた。３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした後、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（３：１の脂質：ＤＮＡの比；５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ／ウェル）を用いてＣＭＶ−ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）構築物（ｐＦ５Ｋ／Ｎｌｕｃ）またはｐＧＥＭ−３Ｚ陰性対照ベクターで細胞に一時的に形質移入し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で再び一晩インキュベートした。
翌日、細胞培地を取り除き、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地に置き換えた。ＰＢＩ−５２９６、ＰＢＩ−５３７０、ＰＢＩ−５３９３、ＰＢＩ−５４１６、ＰＢＩ−５４１７及びＰＢＩ−５４１８をＤＭＳＯで連続希釈し（６０６×ストック）、その後、１０％または０．５％のＦＢＳを加えたＣＯ2非依存性培地で３０３倍希釈して２×ストックを作った。次いで細胞と培地の既存の容量に同等の容量の２×基質ストックを加えた。２秒間の積分時間を伴ったＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメータまたはＶａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈルミノメータにて３７℃で１５分ごとに発光を測定した。図１１Ａ〜１１Ｈ（１０％ＦＢＳ）及び図１２Ａ〜１２Ｈ（０．５％ＦＢＳ）におけるデータは、各プロ基質がフリマジン基質を持続遊離することができ、経時変化全体にわたる細胞内ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）による触媒代謝回転のためにフリマジンを利用可能にすることを実証している。
ｐＧＥＭ−３Ｚ形質移入細胞（対照）の細胞生存率を測定するために、推奨されたプロトコールの改変版に従ってｐＧＥＭ−３Ｚ形質移入細胞（ルシフェラーゼの発現を欠く対照ＤＮＡ）にてＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。１６．５時間後、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉルミノメータ（０．５秒間の積分時間）を用いて発光を測定し（図１３Ａ及び１３Ｃ）、調べた濃度の関数として各化合物についての異なる毒性プロファイルを示す（図１３Ｂ及び１３Ｄ）。
実施例２３：
開示されている化合物の加水分解に対するｐＨの効果は高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）にとって有用であってもよい。２６２ｎｍでのＨＰＬＣを用いて、５．９〜７．６に及ぶ様々なｐＨ値を持つ１ｍＭのＰＢＩ−５４５５溶液にて遊離されたフリマジンの比率が経時的に検出された。図１４はＰＢＩ−５４５５の加水分解によるフリマジンの遊離がｐＨ依存性であることを示している。これらの化合物を用いてＨＴＳ操作法を支援し、ｐＨを調整するまたは適当な求核試薬を加えることによって初期輝度を高めることができる。
実施例２４：
実施例２３で示したように、ＰＢＩ−５４５５はやや酸性の緩衝液で１０時間安定である。ｐＨが高ければ高いほど、遊離は速い。タンパク質／タンパク質及び／またはリガンド／タンパク質の相互作用を検出するためのＢＲＥＴでの適用については、それが一時点の読み取りであるならば、培地における濃度は１００〜２００μＭより高くてもよい。緩衝液ストックにおけるｐＨを利用して初期輝度を調整し、それをフリマジンに匹敵させ、フリマジンの動態を維持することができる。図１５はフリマジンを用いることに比べたＰＢＩ−５４５５を用いたＨＴＳ操作を示す模式図である。
絶対項または近似項のいずれかで与えられる任意の範囲は双方を包含するように意図され、本明細書で使用される任意の定義は明確にすることが意図されるのであって、限定することは意図されない。本発明の広い範囲を言及する数範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例で言及される数値は出来るだけ正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、各試験測定にて見いだされる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含有する。さらに、本明細書で開示されている範囲はすべてその中に含められた任意の及びすべての部分的な範囲（少数値及び全体値すべてを含む）を包含するように理解されるべきである。
さらに、本発明は本明細書で記載されている種々の実施形態の一部またはすべての任意のまたはすべての考えられる組み合わせを包含する。本出願で引用された特許、特許出願、科学論文及び他の参考文献はその中で引用された参考文献と共にそのいずれかまたはすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。

Claims (44)

  1. 式（Ｉ）
    の化合物またはその塩であって、
    式中、
    ＲAは細胞非透過性部分であり；
    ＲBは−ＯＣ（Ｏ）ＮＲAＲBのカルボニル基と反応するように構成される官能基を含む部分であり；
    ＲCは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基によって置換され；
    ＲDは水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
    ＲEは水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
    式中、破線の結合は一緒に式（Ｉ）の化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である、前記式（Ｉ）の化合物またはその塩。
  2. ＲAが、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルから成る群から選択され、その際、前記アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
    ＲBが、アミノアルキルまたはチオアルキルであり、その際、前記アルキルは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、及びアミノアルキルの前記アミノは非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され、またはアミノアルキルの窒素原子が複素環基の一部を形成し、前記複素環基は非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
    ＲCが、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルは、それぞれ独立して非置換であり、または１以上の好適な置換基で置換され；
    ＲDが、水素、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはシクロアルキルアルキルであり；
    ＲEが、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジ（アルキル）アミノ、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、または−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）アルキルであり；
    式中、破線の結合は一緒に式（Ｉ）の化合物における任意の６員環の存在を示し、任意の環は飽和または不飽和である請求項１に記載の化合物。
  3. ＲAが、アルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アジドアルキル、シアノアルキル、マレイミドアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルコキシアルコキシ、アルケニル、アルキニル、−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ3Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＯＰＯ2Ｒ7、−（ＣＲ5Ｒ6）m−ＳＯ2Ｎ（Ｒ8）（Ｒ9）、−（ＣＲ10Ｒ11）m−ＣＯ2Ｒ12、−（ＣＲ13Ｒ14）m−ＣＯＮ（Ｒ15）（Ｒ16）、−（ＣＲ17Ｒ18）m−ＯＮ（Ｒ19）（Ｒ20）、−（ＣＲ21Ｒ22）m−ヘテロシクリル−（ＣＲ23Ｒ24）n−Ｒ25、−（ＣＲ26Ｒ27）m−ヘテロアリール−（ＣＲ28Ｒ29）n−Ｒ30、−（ＣＲ31Ｒ32）m−アリール−（ＣＲ33Ｒ34）n−Ｒ35、及び−（ＣＲ36Ｒ37）m−シクロアルキル−（ＣＲ38Ｒ39）n−Ｒ40から成る群から選択され；
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ26、Ｒ27、Ｒ28、Ｒ29、Ｒ31、Ｒ32、Ｒ33、Ｒ34、Ｒ36、Ｒ37、Ｒ38、及びＲ39は、それぞれ独立して水素及びアルキルから成る群から選択され；
    Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35、及びＲ40は、それぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルコキシルアルキル、アルキルカルボニルオキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ヒドロキシ−（モノまたはポリアルコキシ）アルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルコキシアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、シクロアルキルアルキル、
    及び
    から成る群から選択され、
    その際、Ｒ4、Ｒ7、Ｒ9、Ｒ12、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ30、Ｒ35及びＲ40の前記アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクリルアルキル、及びシクロアルキルアルキルはそれぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから独立して選択される１、２、３、４、または５の置換基で置換され；
    Ｒ41、Ｒ42、及びＲ44は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、スルホネートアルキル、テトラアルキルアンモニウムアルキル、ピリジニウムアルキル、イミダゾリルアルキル、グアニジノールアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキサミドアルキル、チオアルキル、セラニルアルキル、ピロリジニル、メチルチオアルキル、フェニルアルキル、４−ヒドロキシフェニルアルキル、及びインドリルアルキルから成る群から選択され；
    Ｒ43及びＲ45は、それぞれ独立して水素、−Ｃ（Ｏ）アルキル及び
    から成る群から選択され；
    ｍ、及びｎはそれぞれ独立して１、２、３、４、５、または６であり；
    ｘ、及びｙはそれぞれ独立して１〜２０から選択される整数であり；
    ＲBが、−（ＣＲ46Ｒ47）t−ＮＲ48Ｒ49または−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55であり；
    Ｒ46及びＲ47は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から選択され；
    Ｒ48及びＲ49は、それぞれ独立して水素、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、−（ＣＲ50Ｒ51）z−ＯＣ（Ｏ）Ｒ52、−（ＣＲ53Ｒ54）Z−ＳＲ55、−（ＣＲ56Ｒ57）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ58、−（ＣＲ59Ｒ60）Z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ61、−（ＣＲ62Ｒ63）Z−Ｎ（Ｒ64）（Ｒ65）、−（ＣＲ66Ｒ67）z−Ｎ（Ｒ68）Ｃ（Ｏ）Ｒ69、−（ＣＲ70Ｒ71）z−Ｎ（Ｒ72）Ｓ（Ｏ）2Ｒ73、−（ＣＲ74Ｒ75）z−Ｎ（Ｒ76）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ77）（Ｒ78）、−（ＣＲ79Ｒ80）z−Ｎ（Ｒ81）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ82）（Ｒ83）、−（ＣＲ84Ｒ85）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ86、−（ＣＲ87Ｒ88）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ89）、−（ＣＲ90Ｒ91）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ92）（Ｒ93）、及び−Ｃ（Ｒ94）＝Ｎ−ＯＲ95から選択され；
    またはＲ48及びＲ49はそれらが連結される窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成し、その際、前記ヘテロシクリルは非置換であり、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、−ＮＯ2、−ＣＮ、ハロゲン、オキソ、−ＯＲ96、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ97、−ＳＲ98、−Ｓ（Ｏ）Ｒ99、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ100、−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ101）（Ｒ102）、−Ｎ（Ｒ103）（Ｒ104）、−Ｎ（Ｒ105）Ｃ（Ｏ）Ｒ106、−Ｎ（Ｒ107）Ｓ（Ｏ）2Ｒ108、−Ｎ（Ｒ109）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ110）（Ｒ112）、−Ｎ（Ｒ113）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ114）（Ｒ115）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ116、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ117）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ118）（Ｒ119）、ハロアルキル、−（ＣＲ120Ｒ121）Z−ＣＮ、−（ＣＲ122Ｒ123）z−ＯＲ124、−（ＣＲ125Ｒ126）z−ＯＣ（Ｏ）Ｒ127、−（ＣＲ128Ｒ129）Z−ＳＲ130、−（ＣＲ131Ｒ132）z−Ｓ（Ｏ）Ｒ133、−（ＣＲ134Ｒ135）z−Ｓ（Ｏ）2Ｒ136、−（ＣＲ137Ｒ138）Z−Ｎ（Ｒ139）（Ｒ140）、−（ＣＲ141Ｒ142）Z−Ｎ（Ｒ143）Ｃ（Ｏ）Ｒ144、−（ＣＲ145Ｒ146）z−Ｎ（Ｒ147）Ｓ（Ｏ）2Ｒ148、−（ＣＲ149Ｒ150）z−Ｎ（Ｒ151）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ152）（Ｒ153）、−（ＣＲ154Ｒ155）z−Ｎ（Ｒ156）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ157）（Ｒ158）、−（ＣＲ159Ｒ160）z−Ｃ（Ｏ）Ｒ161、−（ＣＲ162Ｒ163）z−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ164）及び−（ＣＲ165Ｒ166）z−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ167）（Ｒ168）から成る群から独立して選択される１、２、３、４、５または６の置換基によって置換され；
    Ｒ52、Ｒ55、Ｒ64、Ｒ65、Ｒ68、Ｒ72、Ｒ69、Ｒ76、Ｒ77、Ｒ81、Ｒ82、Ｒ86、Ｒ89、Ｒ92、Ｒ93、Ｒ96、Ｒ97、Ｒ98、Ｒ101、Ｒ102、Ｒ103、Ｒ104、Ｒ105、Ｒ106、Ｒ107、Ｒ109、Ｒ110、Ｒ112、Ｒ113、Ｒ114、Ｒ115、Ｒ116、Ｒ117、Ｒ118、Ｒ119、Ｒ124、Ｒ127、Ｒ130、Ｒ139、Ｒ140、Ｒ143、Ｒ144、Ｒ147、Ｒ151、Ｒ152、Ｒ153、Ｒ156、Ｒ157、Ｒ158、Ｒ161、Ｒ164、Ｒ167、及びＲ168は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ハロアルコキシアルキル、及びハロアルキルから成る群から選択され；
    Ｒ58、Ｒ61、Ｒ73、Ｒ99、Ｒ100、Ｒ108、Ｒ133、Ｒ136、及びＲ148は、各存在ごとに、それぞれ独立してアルキル及びハロアルキルから選択され；
    Ｒ50、Ｒ51、Ｒ53、Ｒ54、Ｒ56、Ｒ57、Ｒ59、Ｒ60、Ｒ62、Ｒ63、Ｒ66、Ｒ67、Ｒ70、Ｒ71、Ｒ74、Ｒ75、Ｒ79、Ｒ80、Ｒ84、Ｒ85、Ｒ87、Ｒ88、Ｒ90、Ｒ91、Ｒ120、Ｒ121、Ｒ122、Ｒ123、Ｒ125、Ｒ126、Ｒ128、Ｒ129、Ｒ131、Ｒ132、Ｒ134、Ｒ135、Ｒ137、Ｒ138、Ｒ141、Ｒ142、Ｒ145、Ｒ146、Ｒ149、Ｒ150、Ｒ154、Ｒ155、Ｒ159、Ｒ160、Ｒ162、Ｒ163、Ｒ165、及びＲ166は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、及びハロアルキルから選択され；
    Ｒ94及びＲ95は、各存在ごとに、それぞれ独立して水素及びアルキルから選択され；
    ｔは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり；
    ｚは、各存在ごとに、それぞれ独立して１、２、３、または４であり；
    ＲCは、−（ＣＨ2）0-3−ＴまたはＣ1-5アルキルであり；その際、Ｔはアリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキルであり、その際、前記アリール、ヘテロアリール、及びシクロアルキルは、それぞれ独立して非置換であり、またはハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキルアミノアルキル）、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から独立して選択される１、２、または３の置換基によって置換され；
    ＲDが、水素、低級シクロアルキル、ベンジル、及びＣ1−Ｃ4−アルキルから成る群から選択され；および
    ＲEが、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルまたは−ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）−Ｃ1−Ｃ7−アルキルから成る群から選択され；
    その際、式（Ｉ）の破線の結合は任意の環の存在を示し、それは飽和されてもよいし、または不飽和であってもよい請求項１に記載の化合物。
  4. ＲAが、−（ＣＲ1Ｒ2）m−Ｎ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4であり、式中、ｍは２、３または４であり；Ｒ1及びＲ2は、各存在ごとに、水素であり；Ｒ3は水素またはメチルであり；ならびにＲ4は上記で定義されたとおりである請求項３に記載の化合物。
  5. Ｒ4がｔｅｒｔ−ブトキシ、フェニル、メチル、４−トリフルオロメチルフェニル、イソプロピル、４−メトキシフェニルまたは４−フルオロフェニルである請求項４に記載の化合物。
  6. ＲAが

    及び
    から成る群から選択される請求項１に記載の化合物。
  7. ＲBがモルフォリニルアルキルである請求項１に記載の化合物。
  8. ＲBが

    及び
    から成る群から選択される請求項１に記載の化合物。
  9. ＲCがフリルメチルである請求項１に記載の化合物。
  10. ＲCがベンジルである請求項１に記載の化合物。
  11. ＲDがベンジルである請求項１に記載の化合物。
  12. ＲEが水素である請求項１に記載の化合物。
  13. 式（Ｉ−ｉ）：
    またはその塩を有し、
    式中、ＲA、ＲB、ＲC、ＲD、及びＲEが上記で定義されたとおりである請求項１に記載の化合物。
  14. 式（Ｉ−ｉｖ）：
    またはその塩を有し、
    式中、Ｒ200がそれぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
    ＲA及びＲBが上記で定義されたとおりである請求項１に記載の化合物。
  15. 式（Ｉ−ｘ）
    またはその塩を有し、
    式中、
    ｓが１または２であり、
    Ｒ201が、それぞれ任意で、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ及びアミノから成る群から独立して選択される１、２または３の置換基によって置換されるアリールまたはヘテロアリールであり；
    ＲAが上記で定義されたとおりである請求項１に記載の化合物。
  16. 式（Ｉ−ｘｖｉｉ）：
    またはその塩を有し、式中、ｑが１または２であり；ｓが１または２であり；Ｒ4が上記で定義されたとおりである請求項３に記載の化合物。




  17. 及び
    またはその塩から成る群から選択される請求項１に記載の化合物。
  18. 請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩ）
    の少なくとも１つの化合物との混合物を含む組成物であって、式（ＩＩ）におけるＲC、ＲD及びＲEが上記で定義されたとおりである、前記組成物。
  19. 式（ＩＩ）の化合物が、（ＩＩ−ｉ）、（ＩＩ−ｉｉ）、（ＩＩ−ｉｉｉ）、（ＩＩ−ｉｖ）、及び（ＩＩ−ｖ）：
    またはそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１８に記載の組成物。
  20. 試料における発光酵素の検出方法であって、
    （ａ）前記試料を請求項１に記載の化合物に接触させることと、
    （ｂ）前記試料にて発光を検出することとを含み、
    発光の検出が発光酵素の存在を示す、前記検出方法。
  21. 試料におけるプロモータの活性の測定方法であって、前記プロモータが発光酵素をコードする遺伝子に操作可能に連結され、
    （ａ）試料を請求項１に記載の化合物に接触させて反応混合物を作製することと、
    （ｂ）前記反応混合物の発光を測定することによってプロモータの活性を決定することとを含み、前記試料が前記プロモータを含む、前記測定方法。
  22. 前記試料が細胞を含む請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 前記細胞が前記発光酵素を含む請求項２３に記載の方法。
  24. 前記細胞が前記発光酵素を発現する請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１に記載の前記化合物が緩衝溶液中にある請求項２０または２１に記載の方法。
  26. 請求項１に記載の前記化合物が少なくとも部分的に加水分解されて前記試料との接触に先立って細胞透過性基質を遊離する請求項２５に記載の方法。
  27. 前記緩衝溶液が請求項１に記載の前記化合物の自己ベースの触媒を調節するまたは促進するｐＨを有して前記細胞透過性基質を遊離する請求項２６に記載の方法。
  28. 前記緩衝溶液が求核試薬溶液を含み、前記求核試薬溶液が式（Ｉ）の化合物と反応して前記細胞透過性基質を遊離するように構成された求核試薬を含む請求項２６に記載の方法。
  29. 前記緩衝溶液が式（Ｉ）の前記化合物の細胞非透過性部分を切断して細胞透過性基質を遊離する非発光酵素を含む請求項２６に記載の方法。
  30. 工程（ａ）がさらに、式（Ｉ）の化合物と反応して細胞透過性基質を提供するように構成された求核試薬または非発光酵素に前記試料を接触させることを含む請求項２０または２１に記載の方法。
  31. 前記細胞透過性基質が式（ＩＩ）
    の化合物であって、式（ＩＩ）におけるＲC、ＲD及びＲEが上記で定義されたとおりである請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 式（ＩＩ）の化合物が、（ＩＩ−ｉ）、（ＩＩ−ｉｉ）、（ＩＩ−ｉｉｉ）、（ＩＩ−ｉｖ）、及び（ＩＩ−ｖ）：
    またはそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項３１に記載の方法。
  33. 試料における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の検出方法であって、
    （ａ）試料と請求項１の前記化合物と接触させ、前記試料は、
    （ｉ）第１の融合タンパク質は発光酵素の第１の断片と第１のタンパク質とを含み、前記第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと
    （ｉｉ）第２の融合タンパク質は発光酵素の第２の断片と第２のタンパク質とを含み、前記第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含み、
    （ｂ）前記試料における発光を検出することとを含み、
    前記発光の検出が前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を示す、前記検出方法。
  34. 請求項１に記載の前記化合物が少なくとも部分的に加水分解されて細胞透過性基質を遊離する請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質が相互作用すると、前記発光酵素の前記第１の断片と前記発光酵素の前記第２の断片が前記細胞透過性基質を安定して結合することが可能である完全長の酵素を再構成する請求項３４に記載の方法。
  36. 試料における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用の検出方法であって、
    （ａ）試料と請求項１の前記化合物と接触させ、前記試料は、
    （ｉ）第１の融合タンパク質が発光酵素と第１のタンパク質とを含み、前記第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと
    （ｉｉ）第２の融合タンパク質が蛍光アクセプター分子と第２のタンパク質とを含み、前記第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含み、
    （ｂ）前記試料にて、生物発光ドナーと蛍光アクセプターの相互作用または最近接を示す生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）検出することとを含む、前記検出方法。
  37. 前記試料が細胞を含む請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記細胞が発光酵素を含む請求項３７に記載の方法。
  39. 前記発光酵素がセレンテラジンを利用するルシフェラーゼ酵素である請求項３８に記載の方法。
  40. セレンテラジンを利用する酵素がＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ酵素またはその変異体または突然変異体である請求項３９に記載の方法。
  41. 生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、生物発光ドナー分子が発光酵素である、前記生物発光ドナー分子と第１の標的タンパク質とを含む第１の融合タンパク質と、第２の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第２の融合タンパク質と、請求項１に記載の前記化合物とを含む前記生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム。
  42. 請求項１に記載の化合物を含むキット。
  43. 試料における酵素の検出方法であって、
    （ａ）式（Ｉ）の化合物、式（ａ）の化合物、式（ｂ）の化合物、式（ｃ）の化合物、式（ｄ）の化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物に前記試料を接触させることと、

    及び
    （式中、Ｒ’は、各存在ごとに、独立してハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジ（アルキル）アミノアルキル、シアノアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、及びジ（アルキル）アミノから成る群から選択され；ｙ’は０、１、２、３、または４であり；ＲA、ＲB、ＲC、ＲD及びＲEは請求項１で定義されたとおりである）；
    （ｂ）前記試料にて発光を検出することとを含み、その際、式（Ｉ）の前記化合物、式（ａ）の前記化合物、式（ｂ）の前記化合物、式（ｃ）の前記化合物、式（ｄ）の前記化合物、またはそれらの前記組み合わせは、非発光酵素との反応を介して１以上の細胞透過性基質に変換される、前記検出方法。
  44. 前記非発光酵素が、ホスファターゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはスルファターゼである請求項４３に記載の方法。
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