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JP2003534323A - ３−（ピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体のマンニッヒ塩基プロドラッグ - Google Patents

３−（ピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体のマンニッヒ塩基プロドラッグ

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Publication number
JP2003534323A
JP2003534323A JP2001586257A JP2001586257A JP2003534323A JP 2003534323 A JP2003534323 A JP 2003534323A JP 2001586257 A JP2001586257 A JP 2001586257A JP 2001586257 A JP2001586257 A JP 2001586257A JP 2003534323 A JP2003534323 A JP 2003534323A
Authority
JP
Japan
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compound
group
hydrogen
well
compounds
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2001586257A
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English (en)
Inventor
ムーン，マルコム・ウィルソン
モロゾウィッチ，ウォルター
ガオ，ピン
タン，ペン・チョウ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sugen LLC
Original Assignee
Sugen LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は，蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）の活性を調節するある種の３−（ピロール−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体のマンニッヒ塩基プロドラッグに関する。これらの化合物を含む医薬組成物，これらの化合物を含む医薬組成物を用いて異常なＰＫ活性に関連する疾病を治療する方法，およびこれらを製造する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】クロスリファレンス 本出願は，米国特許仮出願６０／２０７，０００（２０００年５月２４日出願
）および６０／２２５，０４５（２０００年８月１１日出願）に基づく優先権を
主張しており，これらの開示の全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】発明の背景 発明の分野 本発明は，蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）の活性を調節するある種の３−（ピロー
ル−２−イルメチリデン）−２−インドリノン誘導体のマンニッヒ塩基プロドラ
ッグに関する。これらの化合物を含む医薬組成物，これらの化合物を含む医薬組
成物を用いて異常なＰＫ活性に関連する疾病を治療する方法，およびこれらを製
造する方法も開示される。
【０００３】従来の技術 蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）は，蛋白質のチロシン，セリンおよびトレオニン残
基上のヒドロキシ基のリン酸化を触媒する酵素である。ＰＫは，慣用的に２種類
に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）およびセリン−ト
レオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。ＰＫ活性の主な観点の１つは，成長因子レセプタ
ーに対するその関与である。成長因子レセプターは細胞表面蛋白質である。成長
因子リガンドが結合すると，成長因子レセプターは活性型に変換され，これが細
胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用する。この相互作用は，レセプターおよび他
の蛋白質のチロシン残基のリン酸化を引き起こし，細胞内部で種々の細胞質シグ
ナリング分子との複合体を形成する。次にこれらの複合体は多くの細胞性応答，
例えば，細胞分裂（増殖），細胞分化，細胞成長，細胞外微細環境への代謝的効
果の発現等を行う（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅ
ｕｒｏｎ，９：３０３−３９１，１９９２を参照）。
【０００４】 ＰＴＫ活性を有する成長因子レセプターはレセプターチロシンキナーゼ（"Ｒ
ＴＫ"）として知られている。これらは，多様な生物学的活性を有する貫膜レセ
プターの大きなファミリーを含む。現在のところ，ＲＴＫの少なくとも１９個の
異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は，"Ｈ
ＥＲ"ＲＴＫと称されるサブファミリーであり，これにはＥＧＦＲ（上皮成長因
子レセプター），ＨＥＲ２，ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。
【０００５】 別のＲＴＫサブファミリーは，インスリンレセプター（ＩＲ），インスリン様
成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリンレセプター関連レセプ
ター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒはインスリン，ＩＧＦ−Ｉおよ
びＩＧＦ−ＩＩと相互作用して，２つの完全に細胞外のグリコシル化されたαサ
ブユニットと，細胞膜を横断しチロシンキナーゼドメインを含有する２つのβサ
ブユニットのヘテロ４量体を形成する。
【０００６】 第３のＲＴＫサブファミリーは，血小板由来成長因子レセプター（"ＰＤＧＦ
Ｒ"）群と称され，これにはＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，ｃ−ｋ
ｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。別の群は，胎児肝キナーゼ（"ｆｌｋ"）レセ
プターサブファミリーである。この群は，キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎
児肝キナーゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１），ｆｌｋ−１Ｒ，ｆｌｋ−４およびｆ
ｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。
【０００７】 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別のメンバーは，線維芽細
胞成長因子（"ＦＧＦ"）レセプターサブグループである。この群は，４つのレセ
プター，ＦＧＦＲ１−４，および７つのリガンド，ＦＧＦ１−７から構成される
。まだあまり明確にされていないが，レセプターは，可変数のイムノグロビン様
ループを含有するグリコシル化された細胞外ドメイン，およびチロシンキナーゼ
配列が関係のないアミノ酸配列の領域により分断されている細胞内ドメインから
構成されるようである。
【０００８】 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーのさらに別のメンバーは血管
内皮成長因子（ＶＥＧＦ"）レセプターサブグループである。ＶＥＧＦは，ＰＤ
ＧＦに類似する二量体の糖蛋白質であるが，インビボで異なる生物学的機能およ
び標的細胞特異性を有する。特に，ＶＥＧＦは，現在，脈管形成および新脈管形
成において必須の役割を果たすと考えられている。
【０００９】 既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（本明細書において
完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する
）に記載されている。
【００１０】 ＲＴＫに加え，"非レセプターチロシンキナーゼ"または"細胞性チロシンキナ
ーゼと称される，完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書にお
いては"ＣＴＫ"と略されるこの後者の定義を用いる。ＣＴＫは細胞外および貫膜
ドメインを含有しない。現在のところ，１１個のサブファミリー（Ｓｒｃ，Ｆｒ
ｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，Ｚａｐ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋお
よびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサブファミリー
は，これまでのところ，ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであり，Ｓｒｃ，
Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋを含む
。ＣＴＫのより詳細な議論については，Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２
０２３−２０３１（１９９３）（本明細書において完全に記載されているように
，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。
【００１１】 セリン／トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは，ＣＴＫと同様に，主として細
胞内にあるが，ＳＴＫタイプのレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも
一般的なサイトゾルキナーゼである。すなわち，細胞質オルガネラおよび細胞骨
格以外の，細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは，
細胞の中間代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例え
ば，蛋白質がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。
【００１２】 ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて，病原性状態，特に癌を含む状態の宿主
であることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の病原性状態には
，限定されないが，乾癬，肝硬変，糖尿病，動脈硬化，新脈管形成，再狭窄，眼
性疾患，慢性関節リウマチおよび他の炎症性疾患，自己免疫疾患等の免疫疾患，
アテローム性動脈硬化等の心臓血管疾患，および種々の腎臓疾患が含まれる。
【００１３】 癌に関しては，腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の
２つは，ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち，
悪性細胞成長は細胞分裂および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因
することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は，細胞成長
および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これら
のプロトオンコジンの蛋白質産物には，上で議論した，細胞外成長因子，貫膜成
長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ），細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾル
ＳＴＫが含まれる。
【００１４】 ＰＫに関連する細胞活性と広範な種類のヒト疾患との間の見かけ上の連結の観
点から，ＰＫ活性を調節する方法を同定しようとする試みに多大な努力が払われ
ていることは驚くべきことではない。例えば，ＰＫ阻害剤として作用する小分子
を同定する試みがなされている。例えば，ビス単環，二環およびヘテロ環アリー
ル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２），ビニレンアザインドール誘導体（
ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８）および１−シクロプロピル−４−ピリジルキノ
ロン類（米国特許５，３３０，９９２）が，チロシンキナーゼ阻害剤として記載
されている。スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピ
リジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），キナゾリン誘導体（欧州特許出
願０５６６２６６Ａ１），セレナインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ
９４／０３４２７），三環ポリヒドロキシル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６
６０）およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）。さ
らに，ＰＫ調節能力を示し，異常なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果
を有する新規ピロール−置換２−インドリノン化合物のファミリーが発見されて
いる（米国特許Ｎｏ．５，７９２，７８３およびＰＣＴ／ＷＯ９９／６１４２２
）。種々の化学種のピロール−置換２−インドリノン化合物の投与は，多くの種
類の固体腫瘍を治癒させる有効な治療方法であることが示されている。例えば，
血管内皮細胞成長因子レセプター（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）の非常に活性な選択的
阻害剤である３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−
１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンは，チロシンキナーゼの触媒活性，腫
瘍脈管形成，および多くのタイプの腫瘍の成長を阻害する（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：９９−１０６）。しかし，これ
らの化合物は，非常に親油性であり，生理学的ｐＨにおいて水および最も一般的
なベヒクルに対する溶解性が低いため，その処方，したがってその投与が制限さ
れている。
【００１５】 したがって，そのような欠点を示さないＰＫ阻害剤が必要とされている。本発
明はこの必要性および関連する必要性を満たすものである。
【００１６】発明の概要 １つの観点においては，本発明は，式（Ｉ）：
【化５】 ［式中， Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6は，独立して，水素，アルキル，トリハロアルキル，シ
クロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール，ヘテロ脂
環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，
アリールチオ，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スルホン
アミド，トリハロメタン−スルホンアミド，カルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−
カルボキシ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，シアノ，ニトロ，ハロ，Ｏ−カルバミル
，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，アミノおよび−
ＮＲ11Ｒ12からなる群より選択され，ここでＲ11およびＲ12は，独立して，水素
，アルキル，シクロアルキル，アリール，カルボニル，アセチル，スルホニル，
およびトリフルオロメタンスルホニルからなる群より選択されるか，またはＲ11 およびＲ12は，これらが結合している窒素原子と一緒になって，５員または６員
のヘテロ脂環式環を形成し，ただし，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6の少なくとも２つ
は水素であり；または Ｒ3およびＲ4，Ｒ4およびＲ5，またはＲ5およびＲ6は，一緒になって，６員のア
リール環，メチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基を形成し； Ｒ7は，水素，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール
，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，
カルボニル，アセチル，Ｃ−アミド，Ｃ−チオアミド，アミジノ，Ｃ−カルボキ
シ，Ｏ−カルボキシ，スルホニル，およびトリハロメタンスルホニルからなる群
より選択され； Ｒ8，Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，トリハロアルキル，シクロ
アルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式
，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，アリ
ールチオ，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スルホンアミ
ド，カルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，シアノ，ニトロ，ハロ，Ｏ
−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ
−アミド，Ｎ−アミド，アミノおよび−ＮＲ11Ｒ12からなる群より選択され，こ
こで，Ｒ11およびＲ12は上で定義したとおりであり； Ｒ1'は，水素またはアルキルであり；および Ｒ3'およびＲ4'は，独立して，アルキルであるか，またはＲ3'およびＲ4'は，こ
れらが結合している窒素原子と一緒になって，ヘテロ脂環式環またはヘテロアリ
ール環を形成し，ただし，ヘテロ脂環式環はピペリジン−１−イルまたはモルホ
リン−４−イルではない］ の化合物またはその薬学的に許容しうる塩に関する。
【００１７】 特に，本発明の化合物は，インビボで，ＰＫ調節能力，特にＰＫ阻害能力を示
し，したがって異常なＰＫ活性に関連する疾患の治療に有用な式（ＩＩ）：
【化６】 の化合物に変換される。本発明の化合物から形成される活性化合物（ＩＩ）は，
米国特許５，７９２，７８３，ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６１４２２，および米国特
許出願０９／７８３，２６４（２００１年２月１５日出願，表題"ＰＹＲＲＯＬ
Ｅ ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ ２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥ ＡＳ ＰＲＯＴＥＩ
Ｎ ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ"（その開示を本明細書の一部として
ここに引用する）に開示されている。
【００１８】 本発明のプロドラッグ化合物は，改良された水溶性および処方可能性のため，
式（ＩＩ）の化合物より利点を有する。例えば，本出願人はＲ3−Ｒ7およびＲ9
が水素であり，Ｒ8およびＲ10がメチルである，化合物（ＩＩ）のＮ−ピロリジ
ン−１−イルメチルプロドラッグが，親化合物と比較して予測されないほど高い
水溶性を与え，したがってＩＶ処方に特に適していることを見いだした。本発明
に含まれる，Ｎ−ピロリジン−１−イルメチル成分または他の−ＣＨＲ1'ＮＲ3' Ｒ4'基を有する本発明の式（Ｉ）の他の化合物についても同様の増強された溶解
性が認められることが企図される。薬学的に有用な化合物としてのプロドラッグ
の利点および使用についての一般的記述は，ＷａｌｌｅｒおよびＧｅｏｒｇｅの
論文（Ｂｒ．Ｉ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４９７−
５０７，１９８９）に見いだされる。
【００１９】 第２の観点においては，本発明は，式（Ｉ）の１またはそれ以上の化合物また
はその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物
に関する。
【００２０】 第３の観点においては，本発明は，生物，特にヒトにおいて，蛋白質キナーゼ
，特に，レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプター蛋白質チロシン
キナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン／トレオニン蛋白質キナーゼ（ＳＴＫ）の異常
な活性により媒介される疾病を治療する方法に関する。該方法は，前記生物に，
式（Ｉ）の化合物，その薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤
を含む医薬組成物を投与することを含む。そのような疾病には，例として，限定
されないが，癌，糖尿病，肝硬変，心臓血管疾病，例えばアテローム性動脈硬化
症，新脈管形成，免疫学的疾病，例えば自己免疫疾病，例えば，ＡＩＤＳおよび
狼瘡，および腎臓疾病が含まれる。特に，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ
４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲＲ，ＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，
Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌ
ｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３Ｒ，ＦＧＦＲ−４Ｒ，
Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ／Ｆｐｓ，Ｆａ
ｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，Ｆｇ
ｒ，Ｙｒｋ，ＣＤＫ２およびＲａｆに媒介される疾病である。
【００２１】 第４の観点においては，本発明は，本発明の化合物または本発明の化合物およ
び薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を用いて，ＰＫ，特に，レセプタ
ーチロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ
）およびセリン／トレオニン蛋白質キナーゼ（ＳＴＫ）の触媒活性を調節する（
例えば触媒活性を阻害する）方法に関する。該方法は，インビトロで行ってもイ
ンビボで行ってもよい。特に，その触媒活性が本発明の化合物により調節される
レセプター蛋白質キナーゼは，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，
ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲＲ，ＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ
，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，Ｆ
ＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３ＲおよびＦＧＦＲ−４Ｒからなる
群より選択される。その触媒活性が本発明の化合物により調節される細胞性チロ
シンキナーゼは，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅ
ｓ／Ｆｐｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌ
ｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋからなる群より選択される。その触媒活性が本
発明の化合物により調節されるセリン−トレオニン蛋白質キナーゼは，ＣＤＫ２
およびＲａｆからなる群より選択される。
【００２２】 第５の観点においては，本発明は，異常なＰＫ活性により媒介される疾病を治
療するのに有用な医薬品の製造における，式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００２３】 第６の観点においては，本発明は，式（Ｉ）の化合物を製造する方法に関する
。該方法は，式（ＩＩ）：
【化７】 の化合物を式Ｒ1'ＣＨＯのアルデヒドの存在下で式−ＮＲ3'Ｒ4'のアミンと反応
させ，（式中，Ｒ1'，Ｒ3'およびＲ4'は上述の式（Ｉ）において定義したとおり
である）； 任意にＲ3−Ｒ10基のいずれかを修飾し； 任意に酸付加塩を製造することを含む。
【００２４】発明の詳細な説明 定義 特に記載しない限り，明細書および特許請求の範囲において用いられる以下の
用語は，以下に議論される意味を有する。
【００２５】 "アルキル"とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖基および分枝鎖基を含む。
好ましくは，アルキル基は，１−２０個の炭素原子を有する（本明細書において
数値範囲，例えば"１−２０"と記載される場合，これはその基（この場合はアル
キル基）が，１個の炭素原子，２個の炭素原子，３個の炭素原子，以下同様に，
２０個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する）。より好ましくは，
アルキルは１−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルである。よ
り好ましくは，アルキルは１−４個の炭素原子を有する低級アルキル，例えば，
メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル，ブチル，イソブチル，ｔｅｒｔ
−ブチル等である。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。
置換されている場合，置換基は，好ましくは，シクロアルキル，アリール，ヘテ
ロアリール，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカ
プト，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ハロ，カルボニル，チオカルボニ
ル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミ
ル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，ニトロ，シリ
ル，アミノ，アンモニウムおよび−ＮＲ13Ｒ14（ここで，Ｒ13およびＲ14は，独
立して，水素，アルキル，未置換アルキル，シクロアルキル，アリール，カルボ
ニル，アセチル，スルホニル，アミノ，およびトリフルオロメタンスルホニルか
らなる群より選択されるか，またはＲ13およびＲ14は，これらが結合している窒
素原子と一緒になって，５員または６員のヘテロ脂環式環を形成する）からなる
群より独立して選択される１またはそれ以上，より好ましくは１または２個の基
である。より好ましくは，置換基は，ヒドロキシ，アミノ，または−ＮＲ13Ｒ14 であり，ここで，Ｒ13およびＲ14は，独立して，未置換低級アルキル，アミノま
たはヒドロキシで置換されている低級アルキルからなる群より選択されるか，ま
たはＲ13およびＲ14は，これらが結合している窒素原子と一緒になって，ピロリ
ジン，モルホリン，またはピペラジンを形成する。
【００２６】 "シクロアルキル"基は，３−６個の環原子を有し，１またはそれ以上の環は完
全に共役したパイ電子系を有しない全炭素単環（すなわち，隣接する炭素原子の
対を共有する環）を表し，例えば，シクロプロピル，シクロブチル，シクロペン
チル，シクロヘキシル，シクロブテニル，シクロペンテニル，シクロヘキセニル
等が挙げられる。シクロアルキル基の例としては，限定されないが，シクロプロ
パン，シクロブタン，シクロペンタン，シクロペンテン，シクロヘキサン，アダ
マンタン，シクロヘキサジエン，シクロヘプタンおよび，シクロヘプタトリエン
が挙げられる。シクロアルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい
。置換されている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，未置換アルキル，ア
リール，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式，未置換ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，ア
ルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ
，ハロ，カルボニル，チオカルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，Ｏ−
カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，ニトロ，アミノおよび
−ＮＲ13Ｒ14（ここで，Ｒ13およびＲ14は上で定義したとおりである）から独立
して選択される，１またはそれ以上，より好ましくは１または２個の基である。
【００２７】 "アルケニル"基は，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−
炭素二重結合から構成される，本明細書において定義されるアルキル基を表し，
例えば，エテニル，プロペニル，ブテニルまたはペンテニルおよびその構造異性
体，例えば，１−または２−プロペニル，１−，２−，または３−ブテニル等が
挙げられる。
【００２８】 "アルキニル"基は，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−
炭素三重結合から構成される，本明細書において定義されるアルキル基を表し，
例えば，アセチレン，エチニル，プロピニル，ブチニル，またはペンチニルおよ
び上で記載されるその構造異性体が挙げられる。
【００２９】 "アリール"基は，６−１２個の環原子を有し，完全に共役したパイ電子系を有
する，全炭素単環または縮合多環（すなわち，隣接する炭素原子対を共有する環
）を表す。アリール基の例としては，限定されないが，フェニル，ナフタレニル
およびアントラセニルが挙げられる。アリール基は置換されていても置換されて
いなくてもよい。置換されている場合には，置換基は，好ましくは，ハロ，トリ
ハロメチル，アルキル，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト
，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ニトロ，カルボニル，チオカルボニル
，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チ
オカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，スルフィニル，
スルホニル，アミノおよび−ＮＲ13Ｒ14（ここで，Ｒ13およびＲ14は上で定義し
たとおりである）からなる群より独立して選択される，１またはそれ以上，より
好ましくは１，２または３個の置換基である。好ましくは，置換基は，クロロ，
フルオロ，ブロモ，メチル，エチル，プロピル（すべての異性体を含む），ブチ
ル（すべての異性体を含む），ヒドロキシ，メトキシ，フェノキシ，チオ，メチ
ルチオ，フェニルチオ，シアノ，ニトロ，カルボキシ，メトキシカルボニル，ま
たはアミノから独立して選択される。
【００３０】 "ヘテロアリール"基は，５−９個の環原子を有し，１，２，３または４個の環
原子が窒素，酸素およびイオウからなる群より選択され，残りが炭素である，単
環または縮合環（すなわち，隣接する１対の原子を共有する複数の環）の芳香族
環を表す。ヘテロアリール基の例としては，限定されないが，ピロール，フラン
，チオフェン，イミダゾール，オキサゾール，チアゾール，ピラゾール，テトラ
ゾール，ピリジン，ピリミジン，キノリン，イソキノリン，プリンおよびカルバ
ゾールが挙げられる。ヘテロアリール基は，置換されていても置換されていなく
てもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，シクロアル
キル，ハロ，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メル
カプト，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ニトロ，カルボニル，チオカル
ボニル，スルホンアミド，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，スルフィニル，ス
ルホニル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカ
ルバミル，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，アミノおよび−ＮＲ13Ｒ14（ここで，Ｒ13 およびＲ14は上で定義したとおりである）からなる群より独立して選択される１
またはそれ以上，より好ましくは１または２個の置換基である。好ましくは，置
換基は，クロロ，フルオロ，ブロモ，メチル，エチル，プロピル（すべての異性
体を含む），ブチル（すべての異性体を含む），ヒドロキシ，メトキシ，フェノ
キシ，チオ，メチルチオ，フェニルチオ，シアノ，ニトロ，カルボキシ，メトキ
シカルボニル，またはアミノからなる群より独立して選択される。
【００３１】 "ヘテロ脂環式"基は，環中に，窒素，酸素および−Ｓ（Ｏ）n（ｎは０−２で
ある）からなる群より選択される１個，２個または３個の複素原子を含み，残り
の環原子が炭素である，４−９個の環原子を有する単環または縮合環を表す。環
はさらに１またはそれ以上の二重結合を有していてもよい。しかし，環は完全に
共役したパイ電子系を有しない。ヘテロ脂環式基の例としては，限定されないが
，ピロリジン，ピペリジン，ピペラジン，モルホリン，イミダゾリジン，テトラ
ヒドロピリダジン，テトラヒドロフラン，チオモルホリン，テトラヒドロピリジ
ン等が挙げられる。ヘテロ脂環式環は，置換されていても置換されていなくても
よい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，アルキル，シクロアルキル
，ハロ，トリハロメチル，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプ
ト，アルキルチオ，アリールチオ，シアノ，ニトロ，カルボニル，チオカルボニ
ル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−
チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，スルフィニル，スルホニル，Ｃ−アミド
，Ｎ−アミド，アミノおよび−ＮＲ13Ｒ14（ここでＲ13およびＲ14は上で定義し
たとおりである）からなる群より独立して選択される１またはそれ以上，より好
ましくは１，２または３個の置換基である。好ましくは，置換基は，クロロ，フ
ルオロ，ブロモ，メチル，エチル，プロピル（すべての異性体を含む），ブチル
（すべての異性体を含む），ヒドロキシ，メトキシ，フェノキシ，チオ，メチル
チオ，フェニルチオ，シアノ，ニトロ，カルボキシ，メトキシカルボニル，また
はアミノからなる群より独立して選択される。
【００３２】 "ヒドロキシ"基は，−ＯＨ基を表す。
【００３３】 "アルコキシ"基は，本明細書において定義される，−Ｏ−未置換アルキル，−
Ｏ−置換アルキルおよび−Ｏ−未置換シクロアルキル基を表す。例としては，限
定されないが，メトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキシ，シクロプロピルオ
キシ等が挙げられ，好ましくはメトキシである。
【００３４】 "アリールオキシ"基は，本明細書において定義される，−Ｏ−アリールおよび
−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を表す。例としては，限定されないが，フェノキ
シ，ナフチルオキシ，ピリジルオキシ，フラニルオキシ等が挙げられる。
【００３５】 "メルカプト"基は，−ＳＨ基を表す。
【００３６】 "アルキルチオ"基は，本明細書において定義される−Ｓ−アルキルおよび−Ｓ
−シクロアルキル基の両方を表す。例としては，限定されないが，メチルチオ，
エチルチオ等が挙げられる。
【００３７】 "アリールチオ"基は，本明細書において定義される−Ｓ−アリールおよび−Ｓ
−ヘテロアリール基の両方を表す。例としては，限定されないが，フェニルチオ
，ナフチルチオ，ピリジルチオ，フラニルチオ等が挙げられる。
【００３８】 "スルフィニル"基は，−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は，以下の定
義に加えて，ヒドロキシ基であってもよく，例えば，メチルスルフィニル，フェ
ニルスルフィニル等が挙げられる。
【００３９】 "スルホニル"基は，−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は，以下の定義
に加えて，ヒドロキシ基であってもよく，例えば，メチルスルホニル，エチルス
ルホニル，フェニルスルホニル等が挙げられる。
【００４０】 "トリハロメチル"基は，−ＣＸ3基を表し，ここで，Ｘは，本明細書において
定義されるハロ基であり，例えば，トリフルオロメチル，トリクロロメチル，ト
リブロモメチル，ジクロロフルオロメチル等が挙げられる。
【００４１】 "トリハロメタンスルホニル"基は，Ｘ3ＣＳ（＝Ｏ）2−基を表し，ここでＸは
上で定義したとおりであり，例えば，トリフルオロメチルスルホニル，トリクロ
ロメチルスルホニル，トリブロモメチルスルホニル等が挙げられる。
【００４２】 "トリハロメタンスルホニルアミド"基は，−ＮＨ−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ基を表し，
ここで，Ｒは上で定義されるトリハロメチルである。
【００４３】 "カルボニル"および"アシル"は，本明細書において互換的に用いられ，−Ｃ（
＝Ｏ）−Ｒ"基を表す。ここで，Ｒ"は，本明細書で定義される，水素，アルキル
，シクロアルキル，アリール，ヘテロアリール（環炭素を介して結合）およびヘ
テロ脂環式（環炭素を介して結合）からなる群より選択される。代表例としては
，限定されないが，アセチル，プロピオニル，ベンゾイル，ホルミル，シクロプ
ロピルカルボニル，ピリジニルカルボニル，ピロリジン−１−イルカルボニル等
が挙げられる。
【００４４】 "アルデヒド"基は，Ｒ"が水素であるカルボニル基を表す。
【００４５】 "チオカルボニル"基は，−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は本明細書
において定義されるとおりである。
【００４６】 "Ｃ−カルボキシ"基は，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は本明細
書において定義されるとおりであり，例えば，−ＣＯＯＨ，メトキシカルボニル
，エトキシカルボニル，ベンジルオキシカルボニル等が挙げられる。
【００４７】 "Ｏ−カルボキシ"基は，−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は本明細書
において定義されるとおりであり，例えば，メチルカルボニルオキシ，フェニル
カルボニルオキシ，ベンジルカルボニルオキシ等が挙げられる。
【００４８】 "エステル"基は，−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ"基を表し，ここで，Ｒ"は本明細書にお
いて定義されるとおりであるが，ただしＲ"は水素ではなく，例えば，メトキシ
カルボニル，ベンジルオキシカルボニル等が挙げられる。
【００４９】 "アセチル"基は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ3基を表す。
【００５０】 "カルボン酸"基は，Ｒ"が水素であるＣ−カルボキシ基を表す。
【００５１】 "ハロ"基は，フッ素，塩素，臭素またはヨウ素を表す。
【００５２】 "シアノ"基は−Ｃ≡Ｎ基を表す。
【００５３】 "ニトロ"基は，−ＮＯ2基を表す。
【００５４】 "メチレンジオキシ"基は，−ＯＣＨ2Ｏ−基を表し，ここで２つの酸素原子は
隣接する炭素原子と結合している。
【００５５】 "エチレンジオキシ"基は，−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−を表し，ここで２つの酸素原子
は隣接する炭素原子と結合している。
【００５６】 "Ｓ−スルホンアミド"基は，−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ13Ｒ14基を表し，Ｒ13および
Ｒ14は本明細書において定義されるとおりである。代表例には，限定されないが
，ジメチルアミノスルホニル，アミノスルホニル，フェニルメチルアミノスルホ
ニル，フェニルアミノスルホニル等が含まれる。
【００５７】 "Ｎ−スルホンアミド"基は，−ＮＲ13Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ14基を表し，Ｒ13および
Ｒ14は本明細書において定義されるとおりであり，例えば，メチルスルホニルア
ミノ，エチルスルホニルアミノ，フェニルスルホニルアミノ，ベンジルスルホニ
ルアミノ等が挙げられる。
【００５８】 "Ｏ−カルバミル"基は，−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ13Ｒ14基を表し，Ｒ13およびＲ14 は本明細書において定義されるとおりである。
【００５９】 "Ｎ−カルバミル"基は，Ｒ14ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ13−基を表し，Ｒ13およびＲ14 は本明細書において定義されるとおりである。
【００６０】 "Ｏ−チオカルバミル"基は，−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ13Ｒ14基を表し，Ｒ13および
Ｒ14は本明細書において定義されるとおりである。
【００６１】 "Ｎ−チオカルバミル"基は，Ｒ14ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ13−基を表し，Ｒ13および
Ｒ14は本明細書において定義されるとおりである。
【００６２】 "アミノ"基は，−ＮＲ13Ｒ14基を表し，ここで，Ｒ13およびＲ14は，独立して
，水素または未置換低級アルキルであり，例えば−ＮＨ2，ジメチルアミノ，ジ
エチルアミノ，エチルアミノ，メチルアミノ等が挙げられる。
【００６３】 "Ｃ−アミド"基は，−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ13Ｒ14基を表し，Ｒ13およびＲ14は本明
細書において定義されるとおりである。好ましくは，Ｒ13は水素または未置換低
級アルキルであり，Ｒ14は，水素，または，ヘテロ脂環式，ヒドロキシまたはア
ミノで任意に置換されていてもよい低級アルキルである。例えば，Ｃ（＝Ｏ）Ｎ
Ｒ13Ｒ14は，アミノカルボニル，ジメチルアミノカルボニル，ジエチルアミノカ
ルボニル，ジエチルアミノエチルアミノカルボニル，エチルアミノエチルアミノ
カルボニル，２−モルホリノエチルアミノカルボニル，３−モルホリノプロピル
アミノカルボニル，３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロピルアミノカルボニル
等である。
【００６４】 "Ｎ−アミド"基は，Ｒ14Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ13−基を表し，Ｒ13およびＲ14は本明
細書において定義されるとおりであり，例えば，アセチルアミノ等である。
【００６５】 "アンモニウム"基は，−+ＮＲ15Ｒ16Ｒ17基を表し，ここで，Ｒ15およびＲ16
は，独立して，アルキル，シクロアルキル，アリール，およびヘテロアリールか
らなる群より選択され，およびＲ17は，水素，アルキル，シクロアルキル，アリ
ール，およびヘテロアリールからなる群より選択される。
【００６６】 "アミジノ"基は，Ｒ15Ｒ16ＮＣ（＝ＮＲ17）−基を表し，ここで，Ｒ15，Ｒ16 およびＲ17は本明細書において定義されるとおりである。
【００６７】 "モルホリノ"基は，次の化学構造を有する基を表す：
【化８】
【００６８】 "ピペラジニル"基は，次の化学構造を有する基を表す：
【化９】
【００６９】 "インドリノン"，"２−インドリノン"および"インドリン−２−オン"との用語
は，化学構造：
【化１０】 を有する分子を表すために本明細書において互換的に用いられる。
【００７０】 "ピロール"とは，化学構造：
【化１１】 を有する分子を表す。
【００７１】 "ピロール−置換２−インドリノン"および"３−ピロール−１−イル−２−イ
ンドリノン"は，式ＩＩ：
【化１２】 に示される一般構造を有する化学化合物を表すために本明細書において互換的に
用いられる。
【００７２】 "プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に変換される薬剤を表す。プロドラッ
グは，場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有
用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが
，親薬剤はそうではない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改
良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグは，酵素的方法および代謝
的加水分解等の種々のメカニズムにより，親薬剤に変換される（以下の文献を参
照されたい：Ｈａｒｐｅｒ，"Ｄｒｕｇ Ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ"，Ｊｕｃｋ
ｅｒ，ｅｄ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２２
１−２９４（１９６２）；Ｍｏｒｏｚｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，"Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ"，Ｅ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．Ｄｅ
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Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．２８：４９７−５０７（１９８９））。
【００７３】 本発明の化合物は，１またはそれ以上の不斉中心を有するかもしれない。した
がって，そのような化合物は，出発物質の個々の立体異性体または立体異性体の
混合物が用いられるか否かにより，個々の立体異性体として，またはそれらの混
合物として製造することができる。特に記載しない限り，特定の化合物の記述ま
たは命名は，個々のエナンチオマーおよびその混合物（ラセミまたはそれ以外）
の両方を含むことが意図される。立体異性体の立体化学の決定および分離の方法
は当該技術分野においてよく知られている（"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉ
ｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２の第４節の考察
を参照）。
【００７４】 本明細書に記載される化学式は，互変異性および構造的異性の現象を示すかも
しれない。例えば，本明細書に記載される化合物は，２−インドリノン成分をピ
ロール成分につなぐ二重結合のまわりにＥまたはＺコンフィギュレーションをと
ることができるか，またはＥおよびＺの混合物でありうる。本発明は，すべての
互変異性および構造的異性型およびそれらの混合物を包含する。
【００７５】 "方法"とは，所与の作業を遂行するための様式，手段，技術，および手順を表
し，限定されないが，化学，薬理学，生物学，生化学，および医学的技術の従業
者には周知の，あるいは該従業者によって既知の様式，手段，技術，および手順
から容易に開発される様式，手段，技術，および手順を含む。
【００７６】 本明細書において用いる場合，"調節"または"調節する"との用語は，ＲＴＫ，
ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が変化することを表す。特に，調節するとはＲＴ
Ｋ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化されることを表し，好ましくは，Ｒ
ＴＫ，ＣＴＫまたはＳＴＫが暴露される化合物または塩の濃度に依存してＲＴＫ
，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化または阻害され，またはより好ましく
は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が阻害されることを表す。
【００７７】 本明細書において用いる場合，"触媒活性"との用語は，ＲＴＫおよび／または
ＣＴＫの直接的または間接的な影響下におけるチロシンのリン酸化の速度，また
はＳＴＫの直接的または間接的な影響下におけるセリンおよびトレオニンのリン
酸化の速度を表す。
【００７８】 本明細書において用いる場合，"接触させる"との用語は，本発明の化合物と標
的ＰＫとを，当該化合物がＰＫの触媒活性を直接に，すなわちキナーゼ自体と相
互作用することによるか，または間接に，すなわち当該キナーゼの触媒活性が依
存している別の分子と相互作用することにより，影響することが可能な様式で一
緒に合わせることを表す。このような"接触させる"ことは，インビトロで，すな
わち試験管，ペトリ皿等において行うことができる。試験管内では，接触させる
ことは，化合物と目的とするＰＫのみが関与してもよく，あるいは全細胞が関与
してもよい。細胞は培養皿中で維持または成長させ，その環境において化合物と
接触させることができる。この文脈においては，特定の化合物がＰＫ関連疾患に
影響を及ぼす能力，すなわち当該化合物のＩＣ50（以下に定義される）を，より
複雑な生体を用いてのインビボでの使用を試みる前に測定することが可能である
。生体の外の細胞については，ＰＫを当該化合物と接触させるための多様な方法
が存在し，かつ当業者には周知であり，例えば，限定されないが，直接の細胞マ
イクロインジェクションおよび多数の貫膜担体技術を含む。
【００７９】 "インビトロ"とは，人工的環境，例えば，限定されないが，試験管または培養
培地中で行われる手順を表す。当業者は，例えば，単離されたＰＫをインビトロ
環境中で調節剤と接触させることができることを理解するであろう。あるいは，
単離された細胞をインビトロ環境中で調節剤と接触させることができる。
【００８０】 本明細書において用いる場合，"インビボ"とは，生きている生物，例えば，限
定されないが，マウス，ラット，ウサギ，有蹄動物，ウシ，ウマ，ブタ，イヌ，
ネコ，霊長類，またはヒトの中で行われる手順を表す。
【００８１】 本明細書において用いる場合，"ＰＫ関連疾患"，"ＰＫ推進性疾患"，および"
異常なＰＫ活性"とは，すべて不適切な，すなわち不完全な，あるいはより一般
的には過剰な，ＰＫ触媒活性によって特徴づけられる状態を表し，ここで特定の
ＰＫはＲＴＫ，ＣＴＫ，またはＳＴＫでありうる。不適切な触媒活性は；（１）
正常にはＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現，（２）望ましくない細胞増
殖，分化および／または成長に導くＰＫ発現の増加，または（３）細胞増殖，分
化および／または成長の望ましくない減少に導くＰＫ発現の減少，のいずれかの
結果として生じることができる。ＰＫの過剰な活性は，細胞増殖，分化および／
または成長と相関しうる，特定のＰＫをコードしている遺伝子の増幅またはある
レベルのＰＫ活性の産生を表す（すなわち，ＰＫのレベルが増加すると，細胞性
障害による１またはそれ以上の症状の激しさが増す）。低い活性は，もちろんそ
の逆であり，ＰＫ活性のレベルが低下すると，細胞性障害による１またはそれ以
上の症状の激しさが増加する。
【００８２】 "生物"との用語は少なくとも１つの細胞からなる任意の生きているものを表す
。生物は，１つの真核生物細胞程度の単純なものであってもよく，ヒトを含む哺
乳動物等の複雑なものであってもよい。
【００８３】 本明細書において用いる場合，"治療上有効量"との用語は，治療される疾患の
１またはそれ以上の症状をある程度緩和するであろう，投与される化合物の量を
表す。癌の治療に関しては，治療上有効量は，（１）腫瘍の大きさを減少させる
，（２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停
止する），（３）腫瘍の成長をある程度阻害する（すなわち速度をある程度減じ
る，好ましくは停止する），および／または（４）癌に関連した１またはそれ以
上の症状をある程度緩和する（または，好ましくは除去する）という効果を有す
る量を表す。
【００８４】 "薬学的に許容しうる塩"とは，遊離塩基の生物学的効力および特性を保持して
おり，無機または有機酸，例えば，塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸，メ
タンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，サリチル酸，リ
ンゴ酸，クエン酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸などとの反応により得られる
塩を表す。
【００８５】 "医薬組成物"とは，本明細書に記載される化合物またはその薬学的に許容しう
る塩の１またはそれ以上と，他の化学成分，例えば，生理学的に許容しうる担体
および賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は，化合物の生物への投与を
容易にすることである。
【００８６】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる担体"とは，生物に有意な
刺激を引き起こさず，投与された化合物の生物学的活性および特性を排除しない
担体または希釈剤を表す。
【００８７】 "賦形剤"とは，医薬組成物に添加して化合物の投与をさらに容易にする不活性
物質を表す。賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシ
ウム，種々の糖および各種のデンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油お
よびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８８】 疾病を"治療する"または"治療"には，疾病の素因を有するが疾病の症状をまだ
経験または示していない動物において疾病が生ずることを防止する（予防的治療
），疾病を阻害する（その発達を遅らせるかまたは停止させる），疾病の症状ま
たは副作用の軽減を提供する（緩和治療を含む），および疾病を軽減する（疾病
の退行を引き起こす）ことが含まれる。癌に関しては，これらの用語は単に，癌
に罹患した個体の予測生存率が増加するか，または疾病の１またはそれ以上の症
状が軽減することを意味する。
【００８９】 "モニターする"とは，化合物を特定のＰＫを発現する細胞と接触させる影響を
観察または検出することを意味する。観察されるまたは検出される影響は，細胞
表現型の変化，ＰＫの触媒活性，またはＰＫと天然の結合パートナーとの相互作
用の変化でありうる。そのような影響を観察または検出する手法は当該技術分野
においてよく知られている。例えば，ＰＫの触媒活性は，標的分子のリン酸化の
速度または量を決定することにより観察することができる。本発明の最後の観点
において，上述の影響は，細胞表現型の変化または無変化，前記蛋白質キナーゼ
の触媒活性の変化または無変化，または前記蛋白質キナーゼと天然の結合パート
ナーとの相互作用の変化または無変化から選択される。
【００９０】 "細胞表現型"とは，細胞もしくは組織の外観または細胞もしくは組織の生物学
的機能を表す。細胞表現型の例は，限定されないが，細胞サイズ，細胞増殖，細
胞分化，細胞生存，アポトーシス，および栄養の取り込みおよび利用である。そ
のような細胞表現型の特徴は，当該技術分野においてよく知られる手法により容
易に測定することができる。
【００９１】 "天然の結合パートナー"とは，細胞内で特定のＰＫに結合するポリペプチドを
表す。天然の結合パートナーは，ＰＫ媒介性シグナル伝達プロセスにおいてシグ
ナルを伝播する役割を果たすことができる。天然の結合パートナーとＰＫとの相
互作用の変化は，ＰＫ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少と
して，およびその結果，ＰＫがシグナル伝達を媒介する能力の観察可能な変化と
して現れることができる。
【００９２】現在好ましい化合物 発明の概要においては本発明の最も広い定義が記載されるが，本発明のある種
の化合物が現在好ましい。
【００９３】 本発明の現在好ましい化合物は，以下の式（Ｉ）の化合物である： 式中，Ｒ3，Ｒ5，およびＲ6は，独立して，水素，アルキル，トリハロアルキル
，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール，ヘテ
ロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチ
オ，アリールチオ，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スル
ホンアミド，トリハロメタン−スルホンアミド，カルボニル，Ｃ−カルボキシ，
Ｏ−カルボキシ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，シアノ，ニトロ，ハロ，Ｏ−カルバ
ミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，アミノ，お
よび−ＮＲ11Ｒ12からなる群より選択され，ここで，Ｒ11およびＲ12は，独立し
て，水素，アルキル，シクロアルキル，アリール，カルボニル，アセチル，スル
ホニル，トリフルオロメタンスルホニルからなる群より選択されるか，または，
Ｒ11およびＲ12は，これらが結合している窒素と一緒になって，５員または６員
のヘテロ脂環式環を形成し； 特に，Ｒ3，Ｒ5およびＲ6は水素であり； Ｒ7は水素であり； Ｒ4は水素またはハロ，特に水素，フルオロ，またはクロロ，特に水素またはフ
ルオロであり； Ｒ1'は水素またはメチル，特に水素であり； Ｒ8およびＲ10は，独立して，未置換低級アルキル，特にメチルであり； Ｒ9は水素，Ｃ−カルボキシまたは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ12（式中，Ｒ12はアミノ
またはヘテロ脂環式で置換された低級アルキルであり，任意にヒドロキシで置換
されていてもよい）で置換された低級アルキルであり；Ｒ9は最も好ましくは水
素，３−カルボキシプロピル，（２−ジエチルアミノエチル）アミノカルボニル
，（２−エチルアミノエチル）アミノカルボニル，３−（モルホリン−４−イル
）プロピルアミノカルボニル，３−（モルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシ
プロピルアミノカルボニル，特に水素，３−カルボキシプロピル，（２−ジエチ
ルアミノエチル）アミノカルボニル，または（２−エチルアミノエチル）アミノ
カルボニルであり；および Ｒ3'およびＲ4'は，ヒドロキシで任意に置換されていてもよい低級アルキル，特
にメチル，エチル，２−ヒドロキシエチルであり；またはＲ3'およびＲ4'は，こ
れらが結合している窒素原子と一緒になって，ピロリジン−１−イル，２−（Ｓ
）−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−カルボキシ−ピロリ
ジン−１−イル，ピペラジン−１−イル，または４−メチルピペラジン−１−イ
ル，特にピロリジン−１−イルを形成し；または Ｒ3'およびＲ4'は，これらが結合している窒素原子と一緒になって，ヘテロアリ
ール環，好ましくはピロロ−１−イル，ピリジン−１−イル，オキサゾール−３
−イル，イソオキサゾール−２−イル，ピラジン−１−イル，ピラジジン−１−
イル，キノリン−１−イル，イミダゾール−１−イル，より好ましくはピリジン
−１−イルを形成する。
【００９４】 上で多数の異なる好ましい化合物を記載し，これらの好適性のいずれか１つに
したがうことにより，そのような特定の好適性にしたがわない化合物より現在好
ましい本発明の化合物を得ることができる。しかし，これらの好適性は一般に独
立的（いくつかの（代替的）好適性は相互に排他的であるが），かつ付加的であ
る。これらの好適性の２以上にしたがうことにより，より少ない好適性にしたが
う化合物より現在より好ましい化合物を得ることができる。
【００９５】 本発明の現在好ましい種類の化合物には，以下のものが含まれる： （ａ）Ｒ1'，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，およびＲ9は水素であり；Ｒ8およびＲ1 0 は未置換低級アルキル，特にメチルであり；およびＲ3'およびＲ4'は，これら
が結合している窒素原子と一緒になって，ピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−
ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−カルボキシピロリジン−
１−イル，ピペラジン−１−イル，または４−メチルピペラジン−１−イル，特
にピロリジン−１−イルを形成する。
【００９６】 （ｂ）Ｒ1'，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，およびＲ7は水素であり；Ｒ8およびＲ10は
未置換低級アルキル，特にメチルであり；Ｒ9はＣ−カルボキシで置換された低
級アルキル，特に３−カルボキシプロピルであり；およびＲ3'およびＲ4'は，こ
れらが結合している窒素原子と一緒になって，ピロリジン−１−イル，２−（Ｓ
）−ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−カルボキシピロリジ
ン−１−イル，ピペラジン−１−イル，または４−メチルピペラジン−１−イル
，特にピロリジン−１−イルを形成する。
【００９７】 （ｃ）Ｒ1'，Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6，およびＲ7は水素であり；Ｒ4はハロ，特にフル
オロであり，Ｒ8およびＲ10は未置換低級アルキル，特にメチルであり；Ｒ9は−
Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ13（式中，Ｒ13はアミノまたはヘテロ脂環式環で置換され，任
意にヒドロキシで置換されていてもよい低級アルキルである）であり，特に（２
−ジエチルアミノエチル）−アミノカルボニル，（２−エチルアミノエチル）−
アミノカルボニル−３−（モルホリン−４−イル）プロピルアミノカルボニル．
３−（モルホリン−４−イル）−２−ヒドロキシプロピルアミノカルボニルであ
り，特に（２−ジエチルアミノエチル）アミノカルボニルまたは（２−エチルア
ミノエチル）−アミノカルボニルであり；およびＲ3'およびＲ4'は，これらが結
合している窒素原子と一緒になって，ピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−ヒド
ロキシメチルピロリジン−１−イル，２−（Ｓ）−カルボキシピロリジン−１−
イル，ピペラジン−１−イル，または４−メチルピペラジン−１−イル，特にピ
ロリジン−１−イルを形成する。
【００９８】 （ｄ）Ｒ1'，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7およびＲ9は水素であり；Ｒ8およびＲ1 0 は未置換低級アルキル，特にメチルであり；およびＲ3'およびＲ4'はこれらが
結合している窒素原子と一緒になってヘテロアリール環，好ましくは，ピロール
−１−イル，ピリジン−１−イル，オキサゾール−３−イル，イソオキサゾール
−２−イル，ピラジン−１−イル，ピリダジン−１−イル，キノリン−１−イル
，イミダゾール−１−イル，より好ましくはピリジン−１−イルを形成する。
【００９９】 本発明の現在好ましい化合物には以下のものが含まれる： （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−（１−ピロリジニルメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール
］−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル］−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリ
デン］−１−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−１，３−ジヒドロ−
２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデン
］−１−［２（Ｓ）−ヒドロキシメチル−１−ピロリジニルメチル）−１，３−
ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−［２（Ｓ）−カルボキシ−１−ピロリジニルメチル）−１，３−ジヒ
ドロ−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（２−ジエチルアミノエチルアミノ
カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メチリデン｝−１−（１−ピロリ
ジニルメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（２−エチルアミノエチルアミノカ
ルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メチリデン｝−１−（１−ピロリジ
ニルメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン；および （３Ｚ）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イル−２−
ヒドロキシプロピルアミノカルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メチリ
デン｝−１−（１−ピロリジニルメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドー
ル−２−オン。
【０１００】一般的合成スキーム これらの化合物を製造するために用いられる出発物質および試薬は，Ａｌｄｒ
ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．），Ｂａ
ｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆ．），またはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，Ｍｏ．）等の商業的供給元から入手可能であるか，または，Ｆｉｅｓｅ
ｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙａｎｄ
Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂ
ｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−５ およびＳｕｐｐｌｅｍｅ
ｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９
８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１−４０（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１），Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａ
ｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ
ｎｄ Ｓｏｎｓ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）およびＬａｒｏｃｋ’ｓ Ｃｏｍｐ
ｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣ
Ｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９）等の文献に記載される方法に
したがって，当業者に知られる方法により製造する。これらのスキームは本発明
の化合物を合成することができるいくつかの方法の例示にすぎず，当業者はこの
開示を参照して，これらのスキームに種々の改変を加えることが可能であり，示
唆されるであろう。反応の出発物質および中間体は，所望の場合には，一般的な
手法，例えば，限定されないが，濾過，蒸留，結晶化，クロマトグラフィーなど
を用いて単離し精製することができる。このような物質は，慣用的な手段，例え
ば，物理学的定数およびスペクトルデータを用いて特性決定することができる。
特記しない限り，本明細書に記載される反応は，大気圧下で，約−７８℃から約
１５０℃の温度範囲内，より好ましくは約０℃から約１２５℃，最も好ましくは
ほぼ室温（周囲温度），例えば約２０℃で実施する。
【０１０１】 Ｒ3'およびＲ4'が，独立してアルキルであるか，または一緒になってヘテロ脂
環式環を形成する式（Ｉ）の化合物は，以下に図解および記載されるようにして
製造することができる：
【化１３】
【０１０２】 Ｒ3−Ｒ10およびＲ1'，Ｒ3'およびＲ4'が発明の概要に記載されたものである
式（Ｉ）の化合物は，式（ＩＩ）の化合物をアルデヒド，例えばホルムアルデヒ
ド，アセトアルデヒド等，および適当なアミンと反応させることにより製造する
ことができる。
【０１０３】 反応を実施する溶媒は，プロトン性溶媒であっても非プロトン性溶媒であって
もよく，好ましくは，アルコール（例えばメタノールまたはエタノール）または
水性アルコールなどのプロトン性溶媒である。反応は，室温より高い温度で行う
ことができる。温度は一般に約２０℃−約１００℃，好ましくは，約４０℃−約
８０℃である。"約"とは，温度範囲が，好ましくは示される温度の１０℃以内，
より好ましくは示される温度の５℃以内，最も好ましくは示される温度の２℃以
内であることを意味する。すなわち，例えば，"約６０℃"とは，６０℃±１０℃
，好ましくは６０℃±５℃，最も好ましくは６０℃±２℃である。
【０１０４】 適当なアミンには，非環状および環状の第２アミンが含まれる。これらのアミ
ンは，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｉｇｍａ等から市販されているか，または当該技術分
野においてよく知られる方法により製造することができる。第２アミンの例には
，ジメチルアミン，ジエチルアミンおよびビス（２−ヒドロキシエチル）アミン
が含まれる。環状第２アミンの例には，Ｎ−アルキルピペラジン，ピロリジン，
プロリン，２−ヒドロキシメチルピロリジン，３，５−ジメチルピペラジン，２
−メチルピロリジン，およびモルホリンが含まれる。
【０１０５】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になってヘテロアリール環を形成する式（Ｉ）の化合物
は，親である３−ピロリジニル−２−インドリノン（ＩＩ）を適当なアルデヒド
と反応させて，（ＩＩ）の中間体Ｎ−ヒドロキシアルキル誘導体を得，この中間
体をオキシ塩化リンおよび適当なヘテロアリール，例えばピリジン，ピロール，
オキサゾリル，イミダゾリル等と反応させることにより製造することができる。
反応は，室温より低い温度で行うことができる。温度は一般に約−２０℃−約２
０℃，好ましくは，約−１０℃−約１０℃である。"約"とは，温度範囲が，好ま
しくは示される温度の１０℃以内，より好ましくは示される温度の５℃以内，最
も好ましくは示される温度の２℃以内であることを意味する。すなわち，例えば
，"約０℃"とは，０℃±１０℃，好ましくは０℃±５℃，最も好ましくは０℃±
２℃である。
【０１０６】 式（ＩＩ）の化合物は当該技術分野においてよく知られる方法により製造する
ことができる。例えば，Ｒ3−Ｒ6，Ｒ7，およびＲ9が水素であり，Ｒ8およびＲ1 0 がメチルである化合物（ＩＩ）は，米国特許５，７９２，７８３，カラム２２
，６０−６７行に記載される方法にしたがって製造することができる（この開示
を本明細書の一部としてここに引用する）。式（ＩＩ）の他の化合物は，米国特
許５，７９２，７８３，ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６１４２２，および米国特許出願
０９／７８３，２６４（２００１年２月１５日出願，表題"ＰＹＲＲＯＬＥ Ｓ
ＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ ２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥ ＡＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｋ
ＩＮＡＳＥＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ"）（これらの開示を本明細書の一部としてこ
こに引用する）に記載されるようにして製造することができる。
【０１０７】 式（Ｉ）の化合物の製造は，さらに保護基を除去する工程を含んでいてもよい
。"保護基"とは，その基を除去するまで反応性成分を不活性にするために用いら
れる基を表す。反応性成分は当業者にはよく知られている。好ましい反応性成分
には，反応性窒素，酸素，イオウ，カルボキシルおよびカルボニル基が含まれる
。窒素保護基の例には，限定されないが，ベンジル，ベンジルオキシカルボニル
，ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル，シリル基（例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリル），９−フルオレニルメトキシカルボニル，９−フェニル−９−フルオレ
ニルおよびアリールスルホニル基（例えばトルエンスルホニル）が含まれる。酸
素保護基の例には，限定されないが，アリルオキシカルボニル，ベンゾイル，ベ
ンジル，ｔｅｒｔ−ブチル，シリル基（例えばｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
），２−エトキシエチル，ｐ−メトキシベンジル，メトキシメチル，ピバロイル
，テトラヒドロピラン−２−イルおよびトリチルが含まれる。カルボキシル保護
基の例には，限定されないが，メチル，アリル，ベンジル，シリル基（例えばｔ
ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）およびｐ−ニトロベンジルが含まれる。カルボ
ニル保護基の例には，限定されないが，アセチル基（例えばＯ，Ｏ−アセタール
）が含まれる。
【０１０８】 保護基は，文献から知られる方法を用いて除去することができる。例えば，窒
素保護基の除去については，Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｔ
ｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２
ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．３０
９−４０５およびＫｏｃｉｅｎｓｋｉ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒ
ｏｕｐｓ，Ｔｈｉｅｍｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２４３を参照。特定
の保護基を除去する方法は本明細書中に例示される。
【０１０９】用途 その触媒活性が本発明の化合物により調節されるＰＫには，蛋白質チロシンキ
ナーゼが含まれ，これには２つのタイプがある：レセプターチロシンキナーゼ（
ＲＴＫ）および細胞性チロシンキナーゼ（ＣＴＫ），およびセリン−トレオニン
キナーゼ（ＳＴＫ）である。ＲＴＫに媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因
子（リガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプターが二量化し
，固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され，リン酸化する。この
ことにより，内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され，種々の細胞質シグ
ナリング分子との複合体の形成につながり，これは，適切な細胞応答（例えば，
細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等）を促進する。Ｓｃｈｌｅｓｓ
ｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−
３９１を参照。
【０１１０】 成長因子レセプターのチロシンリン酸化部位がシグナリング分子のＳＨ２（ｓ
ｒｃホモロジー）ドメインの高親和性結合部位として機能することが示されてい
る（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４２３，
Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
４：２７７７−２７８５），Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅ
ｌｌ７２：７６７−７７８，およびＫｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８）。ＲＴＫと会合するいくつかの細胞内基質
蛋白質が同定されている。それらは二つの主要なグループに分けられる：（１）
触媒ドメインを有する基質，および（２）そのようなドメインを欠くが，アダプ
ターとして働き，触媒活性のある分子と会合する基質（Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８）。レセプターとその基質
のＳＨ２ドメインとの間の相互作用の特異性は，リン酸化されたチロシン残基を
直接取囲んでいるアミノ酸残基によって決定される。ＳＨ２ドメインと，特定の
レセプターのホスホチロシン残基を取り囲んでいるアミノ酸配列との間の結合親
和性の差異は，それらの基質リン酸化のプロファイルに見られる差異と一致して
いる（Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７
７８）。これらの知見は，各々のＲＴＫの機能が，その発現パターンならびにリ
ガンド利用可能性によるのみならず，特定のレセプターによって活性化される下
流の一連のシグナル伝達経路によっても決定されることを示唆している。したが
って，リン酸化は特異的な成長因子レセプター，ならびに分化因子レセプターに
よってリクルートされる，シグナリング経路の選択性を決定する重要な段階を提
供する。
【０１１１】 ＳＴＫは，本来細胞質ゾル性であり，しばしばＰＴＫ事象についての下流方向
の応答として，細胞内部の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは，細胞増殖に導くＤ
ＮＡ合成とそれに続く細胞分裂とを開始する，シグナリング過程に関与すること
が示唆されている。
【０１１２】 したがって，ＰＫシグナル伝達は，種々の応答の中で特に，細胞増殖，分化，
成長，および代謝をもたらす。異常な細胞増殖は，癌腫，肉腫，神経膠芽細胞腫
，および血管腫等の新生物，白血病，乾癬，動脈硬化症，関節炎，および糖尿病
性網膜炎等の疾患，および制御されない新脈管形成および／または脈管形成に関
連する他の疾患を含む，広い範囲の疾患および疾病という結果をもたらしうる。
【０１１３】 別の観点においては，本発明の化合物と接触させることによりその触媒活性が
調節される蛋白質キナーゼは，蛋白質チロシンキナーゼであり，より詳細には，
レセプター蛋白質チロシンキナーゼである。本発明の化合物またはその塩により
その触媒活性を調節することができるレセプター蛋白質チロシンキナーゼには，
限定されないが，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ
，ＩＲＲ，ＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ
，Ｆｌｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ
，ＦＧＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３ＲおよびＦＧＦＲ−４Ｒが含まれる。
【０１１４】 本発明の化合物またはその塩と接触させることによりその触媒活性が調節され
る蛋白質チロシンキナーゼはまた，非レセプターまたは細胞性蛋白質チロシンキ
ナーゼ（ＣＴＫ）であってもよい。すなわち，ＣＴＫ，例えば，限定されないが
，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆ
ａｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，Ｆ
ｇｒおよびＹｒｋの触媒活性は，本発明の化合物または塩と接触させることによ
り調節することができる。
【０１１５】 本発明の化合物と接触させることによりその触媒活性が調節されるＰＫのさら
に別の群は，セリン−トレオニン蛋白質キナーゼ，例えば，限定されないが，Ｃ
ＤＫ２およびＲａｆである。
【０１１６】 別の観点においては，本発明は，治療上有効量の本発明の化合物またはその塩
を生物に投与することによりＰＫ関連疾患を治療または予防する方法に関する。
【０１１７】 ＰＫ関連疾患の治療または予防の目的で本発明の化合物またはその塩を含む医
薬組成物を生物に投与することもまた本発明の１つの観点である。
【０１１８】 したがって，本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫの酵素活性に影
響を与え，このことによりそのような蛋白質により伝達されるシグナルを妨害す
ることによりＰＫシグナル伝達を調節する化合物に関する。より詳細には，本発
明は，多くの種類の固形腫瘍，例えば，限定されないが，癌腫，肉腫，例えばカ
ポジ肉腫，赤芽球腫，神経膠芽細胞腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫および筋原
細胞腫を治癒するための治療方法として，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫ
に媒介されるシグナル伝達経路を調節する化合物に関する。非固形腫瘍癌，例え
ば白血病の治療又は予防もまた本発明により企図される。適応症には，限定され
ないが，脳癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，肺癌および骨
癌が含まれる。
【０１１９】 本明細書に記載される化合物がその予防，治療および研究に有用であろう，不
適切なＰＫ活性に関連する疾患のタイプのさらなる例には，限定されないが，細
胞増殖性疾患，繊維性疾患，代謝性疾患および感染性疾病が含まれる。
【０１２０】 本発明により予防，治療またはさらに研究することができる細胞増殖性疾患に
は，癌，血管増殖性疾患およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。
【０１２１】 血管増殖性疾患とは，異常な脈管形成（血管の形成）および新脈管形成（血管
の拡散）に関連する疾患を表す。脈管形成および新脈管形成は胚発生，黄体形成
，創傷治癒，および臓器再生等の種々の正常な生理学的過程において重要な役割
を果たすが，それらはまた腫瘍を生かしておくために必要な新しい毛細血管をそ
れらが形成させる癌の発生においても中枢的な役割を演じる。血管増殖疾患の他
の例は，新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎，および糖尿病
性網膜炎のように，網膜内の新しい毛細血管が硝子体に侵入し，出血させ，さら
に失明を引起す眼性疾患を含む。
【０１２２】 高い親和性をもってＶＥＧＦに結合する２つの構造的に関連するＲＴＫが同定
されている：ｆｍｓ様チロシン１（ｆｉｔ−１）レセプター（Ｓｈｉｂｕｙａ
ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：５１９−５２４；ＤｅＶｒｉ
ｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：９８９−９９１）お
よびＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプター（ＶＥＧＦ−Ｒ２としても知られる）。血管
内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は，インビトロ内皮細胞成長促進活性を有する内皮細
胞特異的有糸分裂促進物質であることが報告されている（Ｆｅｒｒａｒａ＆Ｈｅ
ｎｚｅｌ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｉｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
，１６１：８５１−８５８；Ｖａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１９４６１−１９５６６）。米国特許出願０８／
１９３，８２９，０８／０３８，５９６および０７／９７５，７５０に記載され
る情報は，ＶＥＧＦが内皮細胞増殖の原因となるのみならず，正常および病的な
新脈管形成の主要な調節剤であることを強く示唆する。一般に，Ｋｌａｇｓｂｕ
ｒｎ＆Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１０）６
９９−７０２；Ｈｏｕｃｋ， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６７：２６０３１−２６０３７を参照。
【０１２３】 正常な脈管形成および新脈管形成は，種々の生理学的プロセス，例えば，胚発
生，創傷治癒，臓器再生等の種々の生理学的過程，および排卵期の黄体における
濾胞形成と妊娠後の胎盤の成長等の女性の生殖過程において重要な役割を果たし
ている（Ｆｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ，１９９２，Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ
ｈｅｍ．，２６７（１６）：１０９３１−３４）。制御されない脈管形成および
／または新脈管形成は，糖尿病等の疾病ならびに成長が血管形成に依存する悪性
固形腫瘍に関連づけられてきた（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ＆Ｓｏｋｅｒ，１９９３，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１０）：６９９−７０２；Ｆｏｌｋｈａ
ｍ，１９９１，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２：４−６；Ｗｅ
ｉｄｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３
２４：１−５）。
【０１２４】 現在理解されているところによれば，新脈管形成および脈管形成の間の内皮細
胞増殖および移動におけるＶＥＧＦの役割は，これらのプロセスにおけるＫＤＲ
／ＦＬＫ−１レセプターの重要な役割を示す。糖尿病（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８
，ＸＩｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅ
ｍｏｓｔａｓｉｓ（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔａ， ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ
．５８３−５９６，Ｌｅｕｖｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕ
ｖｅｎ）および関節炎等の疾病，ならびに悪性腫瘍成長は，制御されない新脈管
形成により引き起こされうる。例えば，Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１，Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２８５：１１８２−１１８６を参照。ＶＥＧＦが特異的に結
合するレセプターは，脈管形成および／または新脈管形成，およびそのようなプ
ロセスにより引き起こされる異常な細胞成長が関与する種々の重症の疾病の制御
および調節の重要かつ強力な治療標的である（Ｐｌｏｗｍａｎ， ｅｔ ａｌ．
，１９９４，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９）。より詳細には，血管新生
におけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターの高度に特異的な役割のため，これは，
血管の制御されない形成が関与する癌および他の疾病の治療に対する治療方法の
選択すべき標的であろう。
【０１２５】 すなわち，本発明の１つの観点は，新脈管形成および／または脈管形成を阻害
または促進するために，チロシンキナーゼシグナル伝達，例えばＫＤＲ／ＦＬＫ
−１レセプターシグナル伝達を制御および／または調節しうる化合物，すなわち
，ＶＥＧＦ等のリガンドにより活性化されたときにＫＤＲ／ＦＬＫ−１により伝
達されるシグナルを阻害，妨害または干渉する化合物に関する。本発明の化合物
はレセプターまたはチロシンキナーゼシグナル伝達経路に沿った他の成分に作用
すると考えられるが，これらはまた，制御されない新脈管形成に起因する腫瘍細
胞に直接作用することができる。
【０１２６】 一般的な"ｆｌｋ−１"レセプターの，ヒトおよびマウスの同等物の命名は異な
るが，それらは多くの点において交換可能である。マウスのレセプターＦｌｋ−
１と，ヒトにおけるその同等物であるＫＤＲは，細胞内ドメインのうちの９３．
４％の配列相同性を共有している。同様に，マウスＦｌｋ−１は，マウスＶＥＧ
Ｆと同じ親和性をもってヒトＶＥＧＦと結合し，したがっていずれの種に由来す
るリガンドによっても活性化される。Ｍｉｌｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９
３，Ｃｅｌｌ，７２：８３５−８４６；Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７５３３−７５３７。
Ｆｌｋ−１はまた，２９３細胞（ヒト胚性腎臓の線維芽細胞）において同時発現
された場合，ヒトＲＴＫの基質（例えばＰＬＣ−γまたはｐ８５）と結合し，続
いてチロシンをリン酸化する。
【０１２７】 したがって，Ｆｌｋ−１レセプターに依存したモデルは，ＫＤＲレセプターの
理解に直接適用することができる。例えば，マウスのシグナル伝達経路を調節す
る化合物を同定する方法においてマウスＦｌｋ−１レセプターを使用することは
，ヒトのシグナル伝達経路を調節するために用いることができる化合物，すなわ
ちＫＤＲレセプターに関連した活性を調節する化合物の同定に直接適用すること
ができる。すなわち，インビトロにおいてＫＤＲ／ＦＬＫ−１の阻害剤として同
定された化学的化合物は，適当なインビボのモデルにおいて確認することが可能
である。インビボでのマウスおよびラット双方の動物モデルは，ＫＤＲ／ＦＬＫ
−１に誘導されるシグナル伝達経路に作用する薬剤の，臨床上の潜在能力を調べ
るために優れた価値があることが証明されている。
【０１２８】 すなわち，１つの観点においては，本発明は，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプター
の酵素活性を変化させ，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１により伝達されるシグナルを妨害す
ることにより脈管形成および／または新脈管形成を制御，調節および／または阻
害する化合物に関する。別の観点においては，本発明は，多くの種類の固形腫瘍
，例えば，限定されないが，神経膠芽細胞腫，黒色腫およびカポジ肉腫，および
卵巣，肺，乳，前立腺，膵臓，結腸および類表皮癌腫を治療するための治療方法
として，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１に媒介されるシグナル伝達経路を制御，調節および
／または阻害する化合物に関する。さらに，データは，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１媒介
性シグナル伝達経路を阻害する化合物の投与はまた，血管腫，再狭窄，および糖
尿病性網膜症の治療にも用いられることを示唆する。
【０１２９】 本発明のさらに別の観点は，他のレセプターが媒介する経路，例えば，ｆｌｔ
−１レセプターを含む経路による脈管形成および新脈管形成の阻害に関する。
【０１３０】 レセプターチロシンキナーゼに媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因子（
リガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプターが二量化し，固
有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され，自己リン酸化する。この
ことにより，内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され，種々の細胞質シグ
ナリング分子との複合体の形成につながり，これは，適切な細胞応答（例えば，
細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等）を促進する。Ｓｃｈｌｅｓｓ
ｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：１−２０
を参照。
【０１３１】 ＫＤＲ／ＦＬＫ−１の細胞内領域と，ＰＤＧＦ−βレセプターの細胞内領域（
５０．３％の相同性），および／または関連するｆｌｔ−１レセプターとの緊密
な相同性は，重複したシグナル伝達経路の誘導を示している。例えばＰＤＧＦ−
βレセプターについては，ｓｒｃファミリーのメンバー（Ｔｗａｍｌｅｙ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：
７６９６−７７００），ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ（Ｈｕ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：９８１−９９０
），ホスホリパーゼｃγ（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎ＆Ｃｏｏｐｅｒ，１９９３，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：４９−５１），ｒａｓ−ＧＴＰａｓｅ活性化
蛋白質（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎら，１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１：１３７３
−１３８２），ＰＴＰ−ＩＤ／ｓｙｐ（Ｋａｚｕｌａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９０：６９
３９−６９４３），Ｇｒｂ２（Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：６７１５−６７２６），およびアダプタ
ー分子ＳｈｃおよびＮｕｋ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１３：６８８９−６８９６）が，異なる自己リン
酸化部位に関与する領域に結合することが示されている。全般的には，Ｃｌａｅ
ｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｓ．，５：３７−５４参照のこと。したがって，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１により活
性化されるシグナル伝達経路は，ｒａｓ経路（Ｒｏｚａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，
１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３６０：６８９−６９２），ＰＩ−３’−キナーゼ，
ｓｒｃ介在性，およびｐｌｃγ介在性の経路を含むと考えられる。これらの経路
の各々は，内皮細胞におけるＫＤＲ／ＦＬＫ−１の新脈管形成および／または脈
管形成効果において，重要な役割を果たすかもしれない。したがって本発明のさ
らなる観点は，本明細書に記載される有機化合物を，新脈管形成および脈管形成
を調節するべく用いることに関するが，それはかかる過程がこれらの経路によっ
て調節されるためである。
【０１３２】 逆に，再狭窄などの，血管の収縮，狭窄，または閉鎖に関連した疾患にも関与
することが示唆されており，本発明の方法により治療または予防することができ
る。
【０１３３】 繊維性疾患とは，細胞外マトリックスの異常な形成を表す。繊維性疾患の例に
は，肝硬変およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。肝硬変は，肝臓瘢痕
の形成を引き起こす細胞外マトリックスの組成の増加を特徴とする。肝臓瘢痕を
引き起こす細胞外マトリックスの増加はまた，肝炎ウイルス等のウイルス感染に
起因する。脂肪細胞は，肝硬変において主要な役割を果たすようである。示唆さ
れている他の繊維性疾患には，アテローム性動脈硬化症が含まれる。
【０１３４】 メサンギウム細胞増殖疾患とは，メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起
こされる疾患を表す。メサンギウム増殖疾患には，種々のヒト腎臓疾病，例えば
，糸球体腎炎，糖尿病性ネフロパシー，悪性腎硬化症，ならびに血栓性細小血管
症候群，移植拒絶，および糸球体症が含まれる。ＲＴＫ ＰＤＧＦ−Ｒは，メサ
ンギウム細胞増殖の維持に関与することが示唆されている（Ｆｌｏｅｇｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４７
Ｓ−５４Ｓ）。
【０１３５】 多くの癌は細胞増殖性疾患であり，先に記載されるように，ＰＫは細胞増殖性
疾患と関連づけられてきた。すなわち，ＰＫ，例えば，ＲＴＫファミリーのメン
バーが癌の発達と関連づけられてきたことも驚くべきことではない。ＥＧＦＲ（
Ｔｕｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７−
２３３，Ｔｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＰＭＩＳ １００：７１３−７
１９），ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：７０７−７１２），およびＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：６２７−６３３）等のこれらのレ
セプターのいくつかは多くの腫瘍において過剰発現され，および／またはオート
クリンループにより持続的に活性化される。事実，ほとんどの一般的かつ重症の
癌においては，これらのレセプターの過剰発現（Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕ
ｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ
．，１１１：１１９−１３３，Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ．６１：２４９−２７３，Ｋｏｒｃ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，１３５２−１３６
０），およびオートクリンループ（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，１９９
２，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：１０５７−１０７０，Ｋｏｒｃ ｅｔ
ａｌ．，前掲，Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ
ａｌ．，前掲）が示されている。例えば，ＥＧＦＲは扁平上皮癌，星状細胞腫
，神経芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌，および膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ
２は乳，卵巣，胃，肺，膵臓，および膀胱の癌と関連づけられている。ＰＤＧＦ
−Ｒは神経芽細胞腫，黒色腫，ならびに肺，卵巣および前立腺の癌と関連づけら
れている。ＲＴＫｃ−ｍｅｔはまた，悪性腫瘍形成と関連づけられている。例え
ば，ｃ−ｍｅｔは，他の癌の中でも特に，結腸直腸，甲状腺，膵臓，胃および造
血細胞癌腫およびリンパ腫と関連づけられている。さらに，ｃ−ｍｅｔは白血病
と結びつけられている。ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はまた，ホジキン病および
バーキット病を有する患者において検出されている。
【０１３６】 ＩＧＦ−ＩＲは，栄養上の支持およびＩＩ型糖尿病に関係づけられていること
に加えて，いくつかの型の癌に関係づけられている。例えば，ＩＧＦ−Ｉはいく
つかの型の腫瘍，例えばヒト乳癌の癌腫細胞（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８−１４２３），および
小細胞肺腫瘍（Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，５０：２５１１−２５１７）のオートクリン成長刺激因子として示唆さ
れている。さらに，ＩＧＦ−Ｉは神経系の正常な成長および分化に完全に関与し
ており，ヒトの神経膠腫のオートクリン刺激因子であるように見える。Ｓａｎｄ
ｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５３：２４７５−２４７８。細胞増殖におけるＩＧＦ−ＩＲとそのリガンド
の重要性は，培養されている多くの細胞型（線維芽細胞，上皮細胞，平滑筋細胞
，Ｔリンパ球，骨髄性細胞，軟骨細胞，および骨芽細胞（骨髄の幹細胞）がＩＧ
Ｆ−Ｉによって成長するよう刺激されるという事実によってさらに支持される。
Ｇｏｌｄｒｉｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，１９９１，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１：３０１−３２６。Ｂａｓｅｒｇａは
，最近の一連の発表において，ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の機構において中心的な
役割を果たしていること，またそれ自体がヒトの広範囲の悪性腫瘍に対する治療
的介入のための好ましい標的となり得ることを示唆している。Ｂａｓｅｒｇａ，
１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２４９−２５２，Ｂａｓｅｒｇａ，
１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：９２７−９３９，Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４５８８−４５９５。
【０１３７】 ＳＴＫは，特に乳癌を含む多くの型の癌に関与することが示唆されている（Ｃ
ａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：５７１−７７（１
９９３））。
【０１３８】 異常なＰＫ活性と疾病との関連性は，癌に限られない。例えば，ＲＴＫは，疾
病，例えば，乾癬，糖尿病，子宮内膜症，新脈管形成，じゅく状斑の発達，アル
ツハイマー疾病，フォン・ヒッペル−リンダウ症候群，表皮過増殖および神経変
性性疾病，加齢性黄斑変性および血管腫と関連づけられている。例えば，ＥＧＦ
Ｒは，角膜および皮膚の創傷治癒における関与が示唆されている。タイプＩＩ糖
尿病においてインスリン−ＲおよびＩＧＦ−１Ｒの欠陥が示されている。特定の
ＲＴＫとその治療適応症との間のより完全な相関はＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９４，ＤＮ＆Ｐ７：３３４−３３９に記載されている。
【０１３９】 先に記載されているように，ＲＴＫのみならず，ＣＴＫ，例えば，限定されな
いが，ｓｒｃ，aｂｌ，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆｙｎ，ｌｙｎ，ｌｃｋ，ｂｌｋ，ｈ
ｃｋ，ｆｇｒおよびｙｒｋ（Ｂｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＡＳＥＢ
Ｊ．，６：３４０３−３４０９により概説）もまた，増殖および代謝性シグナ
ル伝達経路に関与しており，したがって，本発明にかかる多くのＰＴＫ媒介性疾
患に関与することが予測され，このことが実際に示されている。例えば，変異し
たｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は，トリにおいて発癌蛋白質（ｐｐ６０v-src）である
ことが示されている。さらに，その細胞性ホモログであるプロトオンコジンｐｐ
６０c-srcは，多くのレセプターの発癌シグナルを伝達する。腫瘍におけるＥＧ
ＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は，悪性細胞に特徴的であるが正常細胞
では見られないｐｐ６０c-srcの構成的活性化につながる。一方，ｃ−ｓｒｃの
発現に欠陥を有するマウスは大理石骨病的表現型を示し，このことは，ｃ−ｓｒ
ｃが破骨細胞機能において鍵となるよう関与していること，および関連する疾患
に関与している可能性を示唆する。
【０１４０】 同様に，Ｚａｐ７０は，自己免疫疾患に関連するかもしれないＴ−細胞シグナ
リングにおける関与が示唆されている。
【０１４１】 ＳＴＫは，炎症，自己免疫疾患，免疫応答，および過増殖疾患，例えば再狭窄
，繊維症，乾癬，変形性関節症および慢性関節リウマチと関連づけられている。
【０１４２】 ＰＫはまた，胚着床における関与も示唆されている。すなわち，本発明の化合
物は，そのような胚着床を防止する有効な方法を提供することができ，したがっ
て，産児調節剤として有用であろう。
【０１４３】 さらに別の観点においては，本発明の化合物はまた抗感染症剤として用いるこ
とができる。例えば，インドリノン化合物は，抗菌および抗真菌活性を示すこと
が知られている。例えば，Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｊｈａ（１９８９）"Ｉｎｄｏ
ｌｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，"Ｚｅｒａ，Ｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．１
４４（２）：１０５−１０９を参照。さらに，インドリノン化合物は，有意な抗
ウイルス活性を示すことが報告されている。例えば，Ｍａａｓｓ ｅｔ ａｌ．
（１９９３）"Ｖｉｒａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｔｈｉａｚ
ｏｌｏ−ｉｓｏ−ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅｓ，ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｎ
ｏｎｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍ
ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ．３７（１２）：２６１２−２６１７を参照。
【０１４４】 最後に，現在，ＲＴＫおよびＣＴＫの両方とも過剰免疫疾患に関与しているこ
とが疑われている。
【０１４５】 上で議論される蛋白質キナーゼの１またはそれ以上の触媒活性を調節する化学
化合物を同定する方法は本発明の別の観点である。該方法は，所望の蛋白質キナ
ーゼを発現する細胞を本発明の化合物（またはその塩）と接触させ，化合物が及
ぼす影響について細胞をモニターすることを含む。影響は，裸眼または装置を使
用して観察可能な細胞表現型の変化または無変化でありうる。モニターされる細
胞表現型の変化または無変化は，例えば，限定されないが，細胞内における蛋白
質キナーゼの触媒活性の変化または無変化，または蛋白質キナーゼと天然の結合
パートナーとの相互作用の変化または無変化でありうる。
【０１４６】医薬組成物および投与 本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩は，そのままでヒト患者に，
または，上述の物質が適当な担体または賦形剤と混合されている医薬組成物中で
投与することができる。薬剤の処方および投与の手法は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，の最新版に見いだすことが
できる。
【０１４７】投与経路 本明細書において用いる場合，"投与する"または"投与"とは，本発明の化合物
または塩，または本発明の化合物または塩を含む医薬組成物を，ＰＫ関連疾患の
予防または治療の目的で生物に輸送することを表す。
【０１４８】 適当な投与経路には，限定されないが，経口，直腸内，経粘膜，または腸内投
与，または筋肉内，皮下，骨髄内，鞘内，直接心室内，静脈内，硝子体内，腹腔
内，鼻腔内，または眼内注射が含まれる。好ましい投与経路は経口および非経口
である。
【０１４９】 あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固形癌内に
直接，しばしばデポ剤または持続放出処方中で注射することにより投与してもよ
い。
【０１５０】 さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソ
ームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０１５１】組成／処方 本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，慣
用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，凍結乾
燥法またはスプレー乾燥により製造することができる。
【０１５２】 本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使
用することができる製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む
，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で処方す
ることができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０１５３】 注射用には，本発明の化合物を水性溶液，好ましくは生理学的に適合性の緩衝
液中で処方することができ，このような緩衝液は低濃度の界面活性剤を含んでい
ても含まなくてもよく，あるいは生理学的食塩水緩衝液中で処方することができ
る。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そ
のような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０１５４】 経口投与のためには，活性化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的
に許容しうる担体と混合することにより化合物を処方することができる。そのよ
うな担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，
丸薬，トローチ剤，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁
液等として処方することを可能とする。経口で使用するための医薬製剤は，固体
賦形剤を用いて，得られた混合物を任意にすりつぶし，所望の場合には適当な助
剤を加えた後に，顆粒の混合物を加工して，錠剤または糖衣錠コアを得ることが
できる。適当な賦形剤には，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，または
ソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，お
よびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メ
チルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセル
ロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤
などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，
寒天，またはアルギン酸等の崩壊剤を加えてもよい。その塩，例えばアルギン酸
ナトリウムを用いてもよい。
【０１５５】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合
せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加し
てもよい。
【０１５６】 経口で使用することができる医薬組成物は，ゼラチンから作成されるプッシュ
フィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可
塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性
成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクお
よびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に
含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィ
ン，液体ポリエチレングリコールクレモフォア，カプマル，中鎖または長鎖モノ
−，ジ−またはトリ−グリセリド等の適当な液体中に溶解または懸濁することが
できる。これらの処方にはさらに安定剤を添加してもよい。
【０１５７】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，加圧されたパッ
クまたはネブライザーおよび適当な噴射剤，例えば，限定されないが，ジクロロ
ジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン
，または二酸化炭素を用いて，エアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。
加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられ
たバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用
するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と
，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することがで
きる。
【０１５８】 化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方する
ことができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは
添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性ま
たは水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることがで
き，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。
【０１５９】 非経口投与用の薬剤処方は，活性化合物の水溶性の形態，例えば，限定さない
が，塩の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，親油性ベヒクル中に
製造することができる。適切な親油性ベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイ
ン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等
の物質を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム
，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含
んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能に
する，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤および／または薬剤を含ん
でいてもよい。
【０１６０】 あるいは，活性成分は粉体の形態であって，適当なベヒクル，例えば滅菌され
た発熱物質を含まず，追加の界面活性剤または共溶媒，例えばポリソルベート８
０，クレモフォア，シクロデキストリンスルホブチルエチル，プロピレンブリコ
ール，またはポリエチレングリコール，例えばＰＥＧ−３００またはＰＥＧ４０
０，を含むか含まない滅菌水を用いて，使用前に構成することができる。
【０１６１】 化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤
を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０１６２】 上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。
そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によ
るか，または筋肉内注射により投与することができる。本発明の化合物は，この
投与経路用に，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤
中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導
体として，処方することができる。
【０１６３】 本発明の疎水性化合物のための薬学的担体の非限定的例は，ベンジルアルコー
ル，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系，例
えばＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８
％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０（登録商標），および６５％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液で
ある。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水
溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解
し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，そのような共溶媒系の
比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることがで
きる。さらに，共溶媒成分の種類も変化させることができる。例えば，他の低毒
性非極性界面活性剤をポリソルベート８０（登録商標）の代わりに用いることが
でき，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性
ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用
いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることが
できる。
【０１６４】 あるいは，疎水性の医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソー
ムおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく
知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた
用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。
【０１６５】 さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの
準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が確
立されており，当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性
質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の
化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用い
てもよい。
【０１６６】 本明細書に記載される医薬組成物は，適当な固体またはゲル相の担体または賦
形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されない
が，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，デンプン，セルロース誘導
体，ゼラチン，およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
【０１６７】 本発明のＰＫ調節化合物の多くは，本発明の化合物が負にまたは正に荷電した
種を形成する，生理学的に許容しうる塩として提供することができる。化合物が
正に荷電した成分を形成する塩の例には，限定されないが，四級アンモニウム（
本明細書において定義される），四級アンモニウム基の窒素原子が適切な酸と反
応させた本発明の選択された化合物の窒素である塩，例えば，塩酸，硫酸，炭酸
，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハク酸の塩が含まれる。本発明の化合物が負に
荷電した種を形成している塩には，限定されないが，化合物中のカルボン酸基を
適当な塩基（例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ），水酸化カリウム（ＫＯＨ）
，水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）2）等）と反応させることにより形成される
ナトリウム，カリウム，カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。
【０１６８】投与量 本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図され
る目的，例えば，ＰＫ活性の調節またはＰＫ関連疾患の治療または予防を達成す
るのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。
【０１６９】 より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するの
に，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味す
る。式Ｉの化合物の治療上有効量は，約１０／ｍ2−４００／ｍ2の範囲であるこ
とができ，好ましくは５０／ｍ2−３００／ｍ2，より好ましくは１００／ｍ2−
２２０／ｍ2，さらに好ましくは１９５／ｍ2である。
【０１７０】 本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な量また
は用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。次に，動物モデ
ルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちＰＫ活性の最大阻害
の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量
を処方することができる。次にそのような情報を用いてヒトにおける有用な用量
をさらに正確に決定することができる。
【０１７１】 本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験
動物における標準的な薬理学的方法により，例えば対象化合物についてＩＣ50お
よびＬＤ50（いずれも本明細書において議論される）を決定することにより，決
定することができる。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデ
ータは，ヒトにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方するために用いるこ
とができる。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により様々であり
うる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考
慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"
Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１７２】 投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十
分な血漿レベルを与えるよう調節することができる。このような血漿レベルは最
小有効濃度（ＭＥＣ）と称される。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，イン
ビトロのデータ，例えば，本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの
５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥ
Ｃを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろ
う。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を決定することが
できる。
【０１７３】 投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−
９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の
時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである
。局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度
とは関係ないであろう。当該技術分野において知られる他の方法を用いて，正確
な投与量および間隔を決定することができる。
【０１７４】 投与される組成物の量は，もちろん，治療中の患者，苦痛の激しさ，投与方法
，および担当医師の判断等に依存するであろう。
【０１７５】包装 組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置，例えばＦＤＡに認可された
キット中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの
金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装
置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置
はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された
形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまた
は獣医学的投与用の化合物の形状の当該機関による承認を反映するものである。
そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認さ
れたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適
合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され
，適当な容器内に配置され，さらに指示された状態の治療のためにラベルを付す
ことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形
成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０１７６】 本発明の１つの観点においては，上述した疾病および疾患の治療のために，本
明細書に記載される化合物またはその塩またはプロドラッグを他の化学療法剤と
組み合わせることができる。例えば，本発明の化合物または塩は，アルキル化剤
，例えば，フルオロウラシル（５−ＦＵ）単独で，またはさらにロイコボリンと
組み合わせて；または，他のアルキル化剤，例えば，限定されないが，他のピリ
ミジン類似体，例えば，ＵＦＴ，カペシタビン，ゲムシタビンおよびシタラビン
，アルキルスルホネート，例えばブルスファン（慢性顆粒球性白血病の治療に用
いられる），イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類，例えば
ベンゾデパ，カルボコン，メツレデパおよびウレデパ；エチレンイミン類および
メチルメラミン類，例えばアルトレタミン，トリエチレンメラミン，トリエチレ
ンホスホルアミド，トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラ
ミン，およびナイトロジェンマスタード類，例えばクロラムブシル（慢性リンパ
性白血病，原発性マクログロブリン血症および非ホジキンリンパ腫の治療におい
て用いられる），シクロホスファミド（ホジキン病，多発性骨髄腫，神経芽細胞
腫，乳癌，卵巣癌，肺癌，ウイルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療において用い
られる），エストラムスチン，イフォスファミド，ノベムブリチン，プレドニム
スチンおよびウラシルマスタード（原発性血小板増加症，非ホジキンリンパ腫，
ホジキン病および卵巣癌用）；およびトリアジン類，例えばダカルバジン（軟組
織肉腫用）と組み合わせることができる。
【０１７７】 同様に，本発明の化合物または塩はまた，他の抗代謝化学療法剤，例えば，限
定されないが，葉酸類似体（例えば，メトトレキセート（急性リンパ性白血病，
絨毛癌腫，菌状息肉腫，乳癌，頭頸部癌および肺癌，骨形成性肉腫の治療に用い
られる）およびプテロプテリン），プリン類似体，例えばメルカプトプリンおよ
びチオグアニン（急性顆粒球性白血病，急性リンパ性白血病および慢性顆粒球性
白血病の治療に用いられる）と組み合わせて用いることができる。
【０１７８】 さらに，本発明の化合物または塩は，天然産物化学療法剤，例えば，限定され
ないが，ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン（乳癌および精巣癌に用い
られる），ビンクリスチン，ビンデシン），エピポドフィロトキシン類（例えば
エトポシド，テニポシド（両方とも精巣癌およびカポジ肉腫の治療に用いられる
）），抗生物質化学療法剤（例えばダウノルビシン，ドキソルビシン，エピルビ
シン，マイトマイシン（胃癌，子宮頸癌，結腸癌，乳癌，膀胱癌および膵臓癌に
用いられる），ダクチノマイシン，テモゾロミド，プリカマイシン，ブレオマイ
シン（皮膚癌，食道癌および尿生殖器管癌に用いられる）および酵素的化学療法
剤，例えばＬ−アスパラギナーゼと組み合わせて用いることができる。
【０１７９】 上述に加えて，本発明の化合物または塩は，白金配位錯体（例えばシスプラチ
ン），置換尿素（例えばヒドロキシウレア），メチルヒドラジン誘導体（例えば
プロカルバジン），副腎皮質抑制剤（例えばミトーテン，アミノグルテチミド）
，ならびにホルモンおよびアンタゴニスト，例えばアドレノコルチコステロイド
（例えばプレドニゾン），プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンカプ
ロネート），エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール），抗エストロ
ゲン（例えばタモキシフェン）およびアンドロゲン（例えばテストステロンプロ
ピオネート），およびアロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール）と組み合
わせて用いることができる。
【０１８０】 最後に，本発明の化合物の組み合わせは，カンプトサール（登録商標），グリ
ーベック（登録商標），ハーセプチン（登録商標），エンドスタチン（登録商標
），Ｃｏｘ−２阻害剤，ミトザントロン（登録商標）またはパクリタキセル（登
録商標）との組み合わせにおいて，固形腫瘍癌または白血病，例えば，限定され
ないが，急性骨髄性（非リンパ球）白血病の治療に特に有効であることが予測さ
れる。
【０１８１】実施例 以下の製造例および実施例は，当業者が本発明をより明確に理解し，これを実
施することを可能とする。これらの実施例は，本発明の範囲を限定するものと解
釈すべきではなく，単に例示的なものであり，本発明の代表例である。
【０１８２】 一般に，ＨＰＬＣデータは，Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ
ＩＤｘ７．５ｃｍ）を用いて，１０％アセトニトリル／水，０．１％ＴＦＡ（溶
媒Ａ）から９０％アセトニトリル／水（溶媒Ｂ）まで流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで
運転するようプログラムしたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒシリーズ２００ポンプで
得た。溶媒Ａで０．１分後，溶媒Ｂへの５分間の直線プログラムを走らせ，次に
溶媒Ｂで３分間，次に再び溶媒Ａ（２分間）。検出は，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒダイオードアレイ検出器を用い，２１５および２８０ｎｍで記録した。ＮＭＲ
スペクトルはＢｒｕｋｅｒ装置を用いて３００ＭＨｚで記録した。
【０１８３】合成例 実施例１ （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−［１−（４−メチルピペラジニルメチル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ
−インドール−２−オンの合成 Ｎ−メチルピペラジン（１０ｇ，１００ｍｍｏｌ）を，水性ホルムアルデヒド
（３８％溶液を１０ｇ，１００ｍｍｏｌ）および３−（３，５−ジメチル−１Ｈ
−ピロール−２−イルメチリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン
（ＵＳＰ５，７９２，７８３）（２．３８ｇ，１０ｍｍｏｌ）のメタノール（１
００ｍＬ）中の撹拌溶液に加えた。溶液を６０℃で１時間加熱し，濃縮して少量
にし，沈殿物を濾別し，メタノールで洗浄し，乾燥して，２．３８ｇの表題化合
物を得た。ｍｐ１６０−１６４℃。ＨＰＬＣ Ｒｔ４．７２分。1Ｈ−ＮＭＲ（
ＣＤＣｌ3）δ２．２６（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，
３Ｈ），２．４３（ｂｒｓ，４Ｈ），２．７０（ｂｒｓ，４Ｈ），４．５９（ｓ
，２Ｈ），５．９６（ｄ，１Ｈ），７．０２−７．０８（ｍ，２Ｈ），７．１５
（ｄｄ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｄｄ，１Ｈ）および１３．
０（ｂｒｓ，１Ｈ）．計算値：Ｃ21Ｈ26Ｎ4Ｏ：Ｃ，７１．９７；Ｈ，７．４８
；Ｎ，１５．９９．実測値：Ｃ，７１．７５；Ｈ，７．４６；Ｎ，１５．８７．
【０１８４】 次に，（３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−
メチリデン］−１−［１−（４−メチルピペラジニル）メチル］−１，３−ジヒ
ドロ−２Ｈ−インドール−２−オンを二塩酸塩に変換した。
【０１８５】実施例２ （３Ｚ）−３［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデン
］−１−（１−ピロリジニルメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−
２−オンの合成 ピロリジン（４５０ｍｇ，６．３ｍｍｏｌ）を，水性ホルムアルデヒド（３８
％溶液を５００ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ）および３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−
ピロール−２−イルメチリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（
９００ｍｇ，３．８ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）中の撹拌溶液に加えた
。１５分後，溶液を０℃に冷却し，沈殿物を濾別し，水で洗浄し，乾燥して，１
．０８ｇの表題化合物を得た。ｍｐ１２９−１３２℃。ＨＰＬＣ Ｒｔ４．８７
分。1Ｈ−ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］δ１．６５（ｍ，４Ｈ），２．３２（ｓ，
３Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ）
６．０７（ｄ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），７．６
１（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｄ，２Ｈ）および１３．１（ｂｒｓ，１Ｈ）．計算
値Ｃ20Ｈ23Ｎ3Ｏ：Ｃ，７４．７４；Ｈ，７．２１；Ｎ，１３．０７．実測値：
Ｃ，７４．６１；Ｈ，７．２５；Ｎ，１３．０３．
【０１８６】 上述の方法にしたがい，ピロリジンを２−ヒドロキシメチルピロリジン，２−
メチルピロリジン，２−メトキシメチルピロリジン，プロリン，３，５−ジメチ
ルピペラジンおよびビス−（２−メトキシエチル）アミンで置き換えて，それぞ
れ以下の化合物を得た： （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−ｌ−（２−ヒドロキシピロリジン−１−イルメチル）−１，３−ジヒドロ
−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−（２−メチルピロリジン−１−イルメチル）−１，３−ジヒドロ−２
Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−（２−メトキシメチル−ピロリジン−１−イルメチル）−１，３−ジ
ヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−（２−カルボキシピロリジン−１−イルメチル）−１，３−ジヒドロ
−２Ｈ−インドール−２−オン； （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−（３，５−ジメチルピペラジン−１−イルメチル）−１，３−ジヒド
ロ−２Ｈ−インドール−２−オン；および （３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデ
ン］−１−［ビス（２−メトキシエチルアミノメチル）］−１，３−ジヒドロ−
２Ｈ−インドール−２−オン。
【０１８７】実施例３ １−（｛（３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−
メチリデン］−２−オキソ−１，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝
メチル）ピリジン塩酸塩の合成 水性ホルムアルデヒド（３８％溶液を１５．０ｇ，１９０ｍｍｏｌ）を，ジメ
チルホルムアミド（２００ｍＬ）中の３（Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１
Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドー
ル−２−オン（２３．８ｇ，１００ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１５．
０ｇ，１５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。１時間後，溶液を水で希釈し，沈
殿物を濾別し，水で洗浄し，乾燥して，２６．４ｇの（Ｚ）−３−［（３，５−
ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メチリデン］−１−（ヒドロキシメチ
ル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オンを得た。ｍｐ１９６−２
００℃。ＨＰＬＣ Ｒｔ５．７１分。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２．３４（ｓ
，６Ｈ），３．１４（ｔ，１Ｈ），５．４４（ｄ，２Ｈ），５．９８（ｄ，１Ｈ
），７．０８（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），７．３６（ｓ，１Ｈ），７
．４８（ｄｄ，１Ｈ）および１３．０（ｂｒｓ，１Ｈ）．計算値Ｃ16Ｈ16Ｎ2Ｏ2 ：Ｃ，７１．６２；Ｈ，６．０１；Ｎ，１０．４４．実測値：Ｃ，７１．３３；
Ｈ，６．０９；Ｎ，１０．４３．
【０１８８】 オキシ塩化リン（３．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を０℃でピリジン（２０ｍＬ）中
の（３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチリデ
ン］−１−（ヒドロキシメチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−
オン（２．６８ｇ，１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。１３０分後，溶液を水
（２０ｍＬ）でゆっくり希釈し，沈殿物を濾別し，水で洗浄し，乾燥して，３．
３ｇの表題化合物を得た。ｍｐ＞２８０℃。ＨＰＬＣ Ｒｔ４．７８分。1Ｈ−
ＮＭＲ［（ＣＤ3ＯＤ］δ２．３５（ｓ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），６．
０７（ｄ，１Ｈ），６．７１（ｓ，２Ｈ），７．１２−７．３２（ｍ，３Ｈ），
７．６２（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄｄ，１Ｈ），８．１７，（ｍ，２Ｈ），８
．６７（ｍ，１Ｈ），９．３（ｄ，１Ｈ），および１３．１（ｂｒｓ，１Ｈ）．
計算値Ｃ21Ｈ20ＣｌＮ3Ｏ：Ｃ，６８．９４；Ｈ，５．５１；Ｃｌ，９．６９；
Ｎ，１１．４８．実測値：Ｃ，６８．６３；Ｈ，５．５３；Ｃｌ，９．５３；Ｎ
，１１．４５。
【０１８９】 式（ＩＩ）の他の化合物，例えば，５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２
−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１
Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）アミドは，以下
のようにして製造することができる： ヒドラジン水和物（５５％，３０００ｍＬ）および５−フルオロイサチン（３０
０ｇ）を１００℃に加熱した。追加の５−フルオロイサチン（５００ｇ）を１２
０分間かけて撹拌しながら少しずつ（１００ｇ）加えた。混合物を１１０℃に加
熱し，４時間撹拌した。混合物を室温に冷却し，固体を真空濾過により回収して
，粗（２−アミノ−５−フルオロ−フェニル）−酢酸ヒドラジド（７４８ｇ）を
得た。ヒドラジドを水（７００ｍＬ）に懸濁し，混合物のｐＨを１２Ｎ塩酸で＜
ｐＨ３に調節した。混合物を室温で１２時間撹拌した。固体を真空濾過により回
収し，水で２回洗浄した。生成物を真空下で乾燥して，５−フルオロ−１，３−
ジヒドロ−インドール−２−オン（６００ｇ，７３％収率）を茶色粉体として得
た。1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）δ３．４６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2
），６．７５，６．９５，７．０５（３ｘｍ，３Ｈ，芳香族），１０．３５（ｓ
，１Ｈ，ＮＨ）．ＭＳ ｍ／ｚ １５２［Ｍ＋１］．
【０１９０】 ３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２，４−ジカルボン酸２−ｔｅｒｔ−ブ
チルエステル ４−エチルエステル（２６００ｇ）およびエタノール（７８００
ｍＬ）を激しく撹拌しながら１０Ｎ塩酸（３６５０ｍＬ）をゆっくり加えた。温
度は２５℃から３５℃に上昇し，ガスが発生し始めた。混合物を５４℃に暖め，
さらに加熱しながら１時間撹拌し，この間の温度は６７℃であった。混合物を５
℃に冷却し，撹拌しながら３２Ｌの氷および水をゆっくり加えた。固体を真空濾
過により回収し，水で３回洗浄した。固体を一定重量となるまで風乾して，２，
４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（１４１８ｇ，
８７％収率）をピンク色がかった固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスル
ホキシド−ｄ6）δ２．１０，２．３５（２ｘｓ，２ｘ３Ｈ，２ｘＣＨ3），４．
１３（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2），６．３７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），１０．８５（ｓ，１
Ｈ，ＮＨ）．ＭＳ ｍ／ｚ １６７［Ｍ＋１］．
【０１９１】 ジメチルホルムアミド（３２２ｇ）およびジクロロメタン（３７００ｍＬ）を
氷浴中で４℃に冷却し，オキシ塩化リン（６８４ｇ）を撹拌しながら加えた。固
体２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（６７０
ｇ）を１５分間かけて少しずつ加えた。達した最高温度は１８℃であった。混合
物を１時間加熱還流し，氷浴中で１０℃に冷却し，激しく撹拌しながら１．６Ｌ
の氷水を急速に加えた。温度は１５℃に上昇した。激しく撹拌しながら１０Ｎ塩
酸（１．６Ｌ）を加えた。温度は２２℃に上昇した。混合物を３０分間放置し，
層を分離させた。温度は最高４０℃に達した。水性層を，添加の間温度が５５℃
に達しその温度で維持されるような速度で，１０Ｎ水酸化カリウム（３．８Ｌ）
でｐＨ１２−１３に調節した。添加が完了した後，混合物を１０℃に冷却し，１
時間撹拌した。固体を真空濾過により回収し，水で４回洗浄して，５−ホルミル
−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（７７８
ｇ，１００％収率）を黄色固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１
．２５（ｔ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４４，２．４８（２ｘｓ，２ｘ３Ｈ，２ｘＣ
Ｈ3），４．１６（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2），９．５９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），１２．
１５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ）．ＭＳ ｍ／ｚ １９５［Ｍ＋１］．
【０１９２】 ５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエ
ステル（８０６ｇ），水酸化カリウム（５４８ｇ），水（２４００ｍＬ）および
メタノール（３００ｍＬ）を撹拌しながら２時間還流し，次に８℃に冷却した。
混合物をジクロロメタンで２回抽出した。１０００ｍＬの１０Ｎ塩酸で温度を１
５℃以下に維持しながら水性層をｐＨ４に調節した。水を加えて撹拌を容易にし
た。固体を真空濾過により回収し，水で３回洗浄し，真空下で５０℃で乾燥して
，５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（６４５
ｇ，９３．５％収率）を黄色固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ
２．４０，２．４３（２ｘｓ，２ｘ３Ｈ，２ｘＣＨ3），９．５７（ｓ，１Ｈ，
ＣＨＯ），１２．０７（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ＋ＣＯＯＨ）．ＭＳ ｍ／ｚ １６
８［Ｍ＋１］．
【０１９３】 ５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１２０
４ｇ）および６０２０ｍＬのジメチルホルムアミドを室温で撹拌しながら，１−
（３−ジメチル−アミノプロピル−３−エチルカルボジイミド塩酸（２０７１ｇ
），ヒドロキシベンゾトリアゾール（１４６０ｇ），トリエチルアミン（２０１
６ｍＬ）およびジエチルエチレンジアミン（１２１５ｍＬ）を加えた。混合物を
室温で２０時間撹拌した。混合物を３０００ｍＬの水，２０００ｍＬのブライン
および３０００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で希釈し，１０Ｎ水酸化ナト
リウムでｐＨを１０以上に調節した。混合物を各５０００ｍＬの１０％メタノー
ル／ジクロロメタンで２回抽出し，抽出物を合わせ，無水硫酸マグネシウムで乾
燥し，回転蒸発乾固させた。混合物を１９５０ｍＬのトルエンで希釈し，再び回
転蒸発乾固させた。残渣を３：１ヘキサン：ジエチルエーテル（４０００ｍＬ）
中で砕いた。固体を真空濾過により回収し，４００ｍＬの酢酸エチルで２回洗浄
し，真空下で３４℃で２１時間乾燥して，５−ホルミル−２，４−ジメチル−１
Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド（８１
９ｇ，４３％収率）を淡茶色固体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキ
シド−ｄ6）δ０．９６（ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．３１，２．３８（２ｘｓ
，２ｘＣＨ3），２．５１（ｍ，６Ｈ，３ｘＣＨ2），３．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2 ），７．３４（ｍ，１Ｈ，アミドＮＨ），９．５６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），１
１．８６（ｓ，１Ｈ，ピロールＮＨ）．ＭＳ ｍ／ｚ ２６６［Ｍ＋１］．
【０１９４】 ５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジ
エチルアミノエチル）−アミド（８０９ｇ），５−フルオロ−１，３−ジヒドロ
−インドール−２−オン（４３８ｇ），エタノール（８０００ｍＬ）およびピロ
リジン（１３ｍＬ）を７８℃で３時間加熱した。混合物を室温に冷却し，固体を
真空濾過により回収し，エタノールで洗浄した。固体をエタノール（５９００ｍ
Ｌ）とともに７２℃で３０分間撹拌した。混合物を室温に冷却した。固体を真空
濾過により回収し，エタノールで洗浄し，真空下で５４℃で１３０時間乾燥して
，５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）
−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２
−ジエチルアミノ−エチル）アミド（１０１３ｇ，８８％収率）をオレンジ色固
体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ジメチルスルホキシド−ｄ6）δ０．９８（ｔ，６
Ｈ，２ｘＣＨ3），２．４３，２．４４（２ｘｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3），２．５０
（ｍ，６Ｈ，３ｘＣＨ2），３．２８（ｑ，２Ｈ，ＣＨ2），６．８４，６．９２
，７．４２，７．７１，７．５０（５ｘｍ，５Ｈ，芳香族，ビニル，ＣＯＮＨ）
，１０．８８（ｓ，１Ｈ，ＣＯＮＨ），１３．６８（ｓ，１Ｈ，ピロールＮＨ）
．ＭＳ ｍ／ｚ ３９７［Ｍ−１］．
【０１９５】 式（ＩＩ）のさらに別の化合物，例えば，５−（５−フルオロ−２−オキソ−
１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン−メチル）−２，４−ジメチル−
１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロ
ピル）−アミドは，以下のようにして製造することができる： ２−クロロメチルオキシラン（９５ｇ，１．０３ｍｏｌｅ）に，水（３．０８ｇ
，０．１７ｍｏｌｅ）およびジエチルアミン（１０６．２ｍＬ，１．０３ｍｏｌ
ｅ）の混合物を３０℃で加えた。次に反応混合物を２８−３５℃で６時間撹拌し
，２０−２５℃に冷却して，１−クロロ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−
オールを得た。
【０１９６】 ７８ｍＬの水中の水酸化ナトリウム（４７．９ｇ，１．２ｍｏｌｅ）の溶液を
１−クロロ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オールに加えた。得られた溶
液を２０−２５℃で１時間撹拌し，１７８ｍＬの水で希釈し，エーテルで２回抽
出した。合わせたエーテル溶液を固体水酸化カリウムで乾燥し，蒸発させて，１
３５ｇの粗生成物を得，これを分画蒸留により精製して，純粋なグリシジルジエ
チルアミン（９８ｇ，７６％）を油状物として得た。
【０１９７】 ２５％（ｗ／ｗ）水酸化アンモニウムの氷冷溶液（２５ｍＬ，１５９ｍｍｏｌ
ｅ）に，グリシジルジエチルアミン（３．２ｇ，２４．８ｍｍｏｌ）を１０分間
かけて滴加した。反応混合物を０−５℃で１時間，室温で１４時間撹拌した。得
られた反応混合物を蒸発させ，蒸留して（８４−９０℃，５００−６００ｍＴ）
，１−アミノ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オール（３．３ｇ，９２％
）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １４７（［Ｍ＋１］+）．
【０１９８】 １．０ｍＬのＤＭＦ中の５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸（１００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ），ＥＤＣ（１２２．７ｍｇ，
０．６４ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（８６．５ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）の溶液
に，１−アミノ−３−ジエチルアミノ−プロパン−２−オール（９３．２ｍｇ，
０．６４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応溶液を室温で一夜撹拌し，蒸発させ
た。残渣を１０ｍＬの水に懸濁し，濾過した。固体を飽和炭酸水素ナトリウムお
よび水で洗浄し，高真空オーブンで一夜乾燥して，粗生成物を得，これをカラム
クロマトグラフィーで精製し，トリエチルアミンを含む６％メタノール−ジクロ
ロメタン（２滴／１００ｍＬの６％メタノール−ジクロロメタン）で溶出して，
５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチ
ルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アミド（６２ｍｇ，３４％）を黄色固
体として得た。1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．７０（ｓ
，１Ｈ，ＮＨ−１’），１０．９０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−１），７．７６（ｄｄ，
Ｊ＝２．３８，９．３３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），７．７２（ｓ，１Ｈ，ビニル−
Ｈ），７．６０（ｍ，ｂｒ，１Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2Ｎ（Ｃ2
Ｈ5）2−４’），６．９３（ｄｔ，Ｊ＝２．３８，８．９９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５
），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝４．５５，８．９９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６），３．８３
（ｍ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），３．３３（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｍ，ｂｒ，５Ｈ
），２．４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．０４（
ｍ，ｂｒ，６Ｈ，ＣＨ3ｘ２）．ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度，％）４２７（［Ｍ＋
１］+，１００）．
【０１９９】 式（ＩＩ）の上述の化合物は，上述の実施例１および２に記載される方法にし
たがい，ただし，３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチリデ
ン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを５−（５−フルオロ−２−オ
キソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，４−ジメチ
ル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシ−
プロピル）−アミドまたは５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ
−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロー
ル−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミドで置き換えて，Ｒ1 が水素であり，Ｒ3'およびＲ4'がメチルであるか，または一緒になってピロリ
ジンを形成する式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【０２００】 式（ＩＩ）の他の化合物は，本出願人の米国特許出願６０／２６８，６８３（
２００１年２月１５日出願，表題"３−（４−ＡＭＩＤＯＰＹＲＲＯＬ−２−Ｙ
ＬＭＥＴＨＹＬＩＤＥＮＥ）−２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶ
ＥＳ−ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＯＴＯＲＳ"）および米国特
許出願０９／７８３，２６４（２００１年２月１５日出願，表題"ＰＹＲＲＯＬ
ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ ２−ＩＮＤＯＬＩＮＯＮＥ ＡＳ ＰＲＯＴＥＩＮ
ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ"（これらの開示を本明細書の一部とし
てここに引用する）に記載されるようにして製造することができる。
【０２０１】生物学的評価 任意の一連の化合物において，ある範囲の生物学的活性が観察されるであろう
ことは理解されるであろう。現在好ましい態様においては，本発明は，蛋白質キ
ナーゼ活性を調節，制御および／または阻害しうる３−ピロリジニル−２−イン
ドリノンをインビボで生成することができる新規な１−置換−３−ピロリジニル
−２−インドリノンに関する。以下のアッセイを用いて，最適な程度の所望の活
性を示す化合物を選択することができる。アッセイ方法 以下のインビトロアッセイを用いて，活性のレベルおよび本発明の種々の化合
物が１またはそれ以上のＰＫに及ぼす影響を決定することができる。任意のＰＫ
について，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて同じように同様のア
ッセイを設計することができる。
【０２０２】 本明細書に記載されるアッセイのいくつかは，ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソ
ルベントサンドイッチアッセイ）フォーマットで行う（Ｖｏｌｌｅｒ， ｅｔ
ａｌ．，１９８０，"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ
ｔ Ａｓｓａｙ，"Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，２ｄｅｄ．，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．３５９
−３７１）。一般的方法は以下のとおりである：試験キナーゼを発現する（天然
にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試
験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られ
ているリガンドを加える。細胞を溶解させ，溶解物を酵素的リン酸化反応の基質
を認識する特定の抗体で予め被覆したＥＬＩＳＡプレートのウエルに移す。細胞
溶解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で基質
上のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触していない対照細胞と比較する。
【０２０３】 特定のＰＫについてのＥＬＩＳＡ実験を実施するための現在好ましいプロトコ
ルを以下に記載する。しかし，他のＲＴＫ，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対す
る化合物の活性を決定するためにこれらのプロトコルを適合させることは，十分
に当業者の技術の範囲内である。本明細書に記載される他のアッセイは試験キナ
ーゼの活性化に応答して生成されたＤＮＡの量を測定するものであり，これは増
殖性応答の一般的尺度である。このアッセイの一般的方法は以下のとおりである
：試験キナーゼを発現する（天然にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，
選択された時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセ
プターを活性化することが知られているリガンドを加える。少なくとも一夜イン
キュベートした後，ＤＮＡ標識試薬，例えば５−ブロモデオキシウリジン（Ｂｒ
ｄＵ）またはＨ3−チミジンを加える。抗ＢｒｄＵ抗体を用いて，または放射活
性を測定することにより標識ＤＮＡの量を検出し，試験化合物と接触していない
対照細胞と比較する。
【０２０４】ＧＳＴ−ＦＬＫ−１バイオアッセイ このアッセイは，ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）ペプチドにおけるＧＳＴ−Ｆｌｋ１
のチロシンキナーゼ活性を分析する。
【０２０５】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
Ｎｏ．２５８０５−９６）． ２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，凍結乾燥物（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２
７５）。滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ ３．ＰＢＳ緩衝液：１Ｌにつき，０．２ｇＫＨ2ＰＯ4，１．１５ｇＮａ2ＨＰＯ4 ，０．２ｇＫＣｌおよび８ｇＮａＣｌを約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。
すべての試薬が溶解したとき，ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。ｄＨ2Ｏで総
容量を１Ｌとする。 ４．ＰＢＳＴ緩衝液：１ＬのＰＢＳ緩衝液に１．０ｍｌＴｗｅｅｎ２０を加える
。 ５．ＴＢＢ−ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１．２１ｇＴＲＩＳ，８．７７
ｇＮａＣｌ，１ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。
ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。１０ｇＢＳＡを加え，撹拌して溶解させる。
ｄＨ2Ｏで総容量を１Ｌとする。濾過して粒子状物質を除去する。 ６．１％ＢＳＡ，ＰＢＳ中：１０ｇＢＳＡを約９９０ｍｌのＰＢＳ緩衝液に加え
，撹拌して溶解させる。ＰＢＳ緩衝液で総容量を１Ｌに調節し，濾過して，粒子
状物質を除去する。 ７．５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５． ８．ｓｆ９組換えバキュロウイルストランスフォーメーションから精製したＧＳ
Ｔ−Ｆｌｋｌ ｃｄ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）。 ９．４％ＤＭＳＯ，ｄＨ2Ｏ中 １０．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中 １１．４０ｍＭ ＭｎＣｌ2 １２．キナーゼ希釈緩衝液（ＫＤＢ）：１０ｍｌ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），
１ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ，４０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムお
よび０．４ｍｌの５％ＢＳＡ（ｄＨ2Ｏ中）を８８．５６ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合
する。 １３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２ １４．ＥＤＴＡ：１４．１２ｇエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を約７０ｍ
ｌｄＨ2Ｏに混合する。ＥＤＴＡが溶解するまで１０ＮＮａＯＨを加える。ｐＨ
を８．０に調節する。ｄＨ2Ｏで総容量を１００ｍｌに調節する。 １５．一次および二次抗体希釈緩衝液：１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡを
８９．５ｍｌのＴＢＳＴと混合する。 １６．抗ホスホチロシンウサギポリクローナル抗血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） １７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート １８．ＡＢＳＴ溶液：約９００ｍｌのｄＨ2Ｏに，１９．２１ｇのクエン酸およ
び３５．４９ｇのＮａ2ＨＰＯ4を加える。リン酸でｐＨを４．０に調節する。２
，２’−アジノビス（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−硫酸を加える（ＡＢ
ＴＳ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８）。約２時間放置し，濾過する
。 １９．３０％過酸化水素 ２０．ＡＢＳＴ／Ｈ2Ｏ2：３μｌのＨ2Ｏ2を１５ｍｌのＡＢＳＴ溶液に加える。 ２１．０．２ＭＨＣｌ
【０２０６】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌのＰＢＳ中の
２μｇのポリＥＹペプチド／ウエルで被覆する。室温で２時間または４℃で一夜
放置する。蒸発を防止するためにプレートをカバーする。 ２．プレートを逆さにすることにより未結合液体をウエルから除去する。ＴＢＳ
Ｔで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を
除去する。 ３．１００μｌの１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室
温で１時間インキュベートする。 ４．工程２を繰り返す。 ５．ウエルを５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５，１５０μｌ／ウエル）に浸漬す
る。 ６．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でｄＨ2Ｏ／４％ＤＭ
ＳＯで所望の最終アッセイ濃度の４倍に希釈する。 ７．２５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに加える。対照
ウエルには，２５μｌのｄＨ2Ｏ／４％ＤＭＳＯを加える。 ８．ＧＳＴ−Ｆｌｋ１をＫＤＢで０．００５μｇ（５ｎｇ）／ウエルに希釈する
。 ９．５０μｌの希釈酵素を各ウエルに加える。 １０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。 １１．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ2および４ｘＡＴＰ（２μＭ）をすべてのウ
エルに加える。（各ウエル中，１００μｌの最終容量，０．５μＭのＡＴＰ最終
濃度） １２．振盪しながら室温で１５分間インキュベートする。 １３．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを各ウエルに加えることにより反応を停止
する。 １４．ＴＢＳＴで３回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰
の液体を除去する。 １５．抗体希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した抗ホスホチロシン抗血清
を１００μｌ／ウエルで加える。振盪しながら室温で９０分間インキュベートす
る。 １６．工程１４と同様に洗浄する。 １７．１００μｌ／ウエルのヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート（抗体希釈緩衝
液中１：６，０００）を加える。振盪しながら室温で９０分間インキュベートす
る。 １８．工程１４と同様に洗浄する。 １９．１００μｌの室温ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 ２０．振盪しながら室温で１５−３０分間インキュベートする。 ２１．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌを各ウエルに加えることにより
反応を停止する。 ２２．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ
４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭで結果を読む。
【０２０７】ＰＹＫ２ＢＩＯアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいて，ＨＡエピトープタグ付
け全長ｐｙｋ２（ＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ）のインビトロキナーゼ活性を測定する
。
【０２０８】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート． ２．１２ＣＡ５モノクローナル抗ＨＡ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１
３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，８．７６６ｇＮａＣｌ，６．０５７ｇＴＲＩ
Ｓおよび１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を約９００ｍｌｄＨ2Ｏ中で
混合する。ｐＨを７．２に調節し，容量を１Ｌとする。 ５．ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇ１０％ＢＳＡ，１２．１ｇ１０
０ｍＭＴＲＩＳ，５８．４４ｇ１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＬの１％ＴＷＥＥＮ２
０を混合する。 ６．ｓｆ９細胞溶解物からのＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． ７．４％ＤＭＳＯ，ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ2Ｏ中 ８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中 ９．１ＭＭｎＣｌ2． １０．１ＭＭｇＣｌ2． １１．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）． １２．１０Ｘキナーゼ緩衝液リン酸化：５．０ｍｌ１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５
），０．２ｍｌ１ＭＭｎＣｌ2，１．０ｍｌ１ＭＭｇＣｌ2，１．０ｍｌ１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を２．８ｍｌｄＨ2Ｏ中で混合する。使用直前に０．１ｍ
ｌ１ＭＤＴＴを加える。 １３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート． １４．５００ｍＭＥＤＴＡ，ｄＨ2Ｏ中 １５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳおよび１
ｍＬ１０％Ｔｗｅｅｎ−２０を８８ｍＬＴＢＳ中で混合する。 １６．ＨＲＰ−コンジュゲート化抗ＰｔｙｒＰＹ９９），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
ＢｉｏｔｅｃｈＣａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−７０２０． １７．ＡＢＴＳ，Ｍｏｓｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢＳＴ−２０００． １８．１０％ＳＤＳ．
【０２０９】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中の０．
５μｇ／ウエルの１２ＣＡ５抗ＨＡ抗体で被覆する。４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにすることにより未結合ＨＡ抗体をウエルから除去する。プ
レートをｄＨ2Ｏで洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過
剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 ４．プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（１．５μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。 ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。 ７．工程４と同様に洗浄する。 ８．５０μｌの２Ｘキナーゼ緩衝液を捕捉ｐｙｋ２−ＨＡを含むＥＬＩＳＡプレ
ートに加える。 ９．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中４００μＭ試験化合物を各ウエルに加える。対照
ウエルには４％ＤＭＳＯのみを用いる。 １０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。 １１．２５μｌの２０ｐＭＡＴＰをすべてのウエルに加える。振盪しながら１０
分間インキュベートする。 １２．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加える
ことにより反応を停止する。 １３．工程４と同様に洗浄する。 １４．１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｐｔｙｒ（１：６０００に希釈，
抗体希釈緩衝液中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベ
ートする。 １５．プレートをＴＢＳＴで３回，ＰＢＳで１回洗浄する。 １６．１００μｌのＡＢＳＴ溶液を各ウエルに加える。 １７．必要ならば，２０μｌの１０％ＳＤＳを各ウエルに加えることにより発色
反応を停止する。 １８．ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎ
Ｍでプレートを読む。
【０２１０】ＦＧＦＲ１バイオアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイでＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナ
ーゼ活性を測定する。
【０２１１】材料および試薬： １．Ｃｏｓｔａｒ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃
３３６９）． ２．ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５）． ３．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ） ４．５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液溶液． ５．ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）． ６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ７．キナーゼ希釈緩衝液：５００μｌの１ＭＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ），２０μ
ｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，１０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムお
よび５０μｌの５ＭＮａＣｌを混合する。 ８．１０ｍＭＡＴＰ ９．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化ミックス：２０μｌのＡＴＰ，４００μｌの１
ＭＭｎＣｌ2および９．５６ｍｌのｄＨ2Ｏを混合する。 １０．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２）． １１．０．５ＭＥＤＴＡ． １２．０．０５％ＴＢＳＴ ５００μｌのＴＷＥＥＮを１リットルのＴＢＳに加える。 １３．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． １４．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ，カタログ＃ＡＬＩ０４０４）． １５．ＡＢＴＳ溶液． １６．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液．
【０２１２】方法： １．Ｃｏｓｔａｒ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ウエルの１００μｌ
ＰＢＳ中ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）で被覆する。４℃で一夜保存する。 ２．被覆したプレートをＰＢＳで１回洗浄する。 ３．１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。
振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 ４．プレートをＰＢＳで２回，次に５０ｍＭＨｅｐｅｓで１回洗浄する。プレー
トをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。 ５．２５μｌの０．４ｍＭ試験化合物（４％ＤＭＳＯ中），または４％ＤＭＳＯ
単独（対照）をプレートに加える。 ６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１を希釈緩衝液（５μキナーゼ／５０μｌＫＤＢ／ウ
エル）で希釈する。 ７．５０μｌの希釈キナーゼを各ウエルに加える。 ８．２５μｌ／ウエルの新たに調製したＡＴＰ／Ｍｎ＋＋（０．４ｍｌ１ＭＭｎ
Ｃｌ2，４０μｌ１０ｍＭＡＴＰ，９．５６ｍｌｄＨ2Ｏ，新たに調製）を加える
ことによりキナーゼ反応を開始する ９．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることにより反応を停止する。 １０．プレートを新たなＴＢＳＴで４回洗浄する。 １１．抗体希釈緩衝液を作成する：５０ｍｌにつき，５ｍｌの５％ＢＳＡ，２５
０μｌの５％ミルクおよび５０μｌの１００ｍＭバナジン酸ナトリウムを混合し
，０．０５％ＴＢＳＴで最終容量とする。 １２．１００μｌ／ウエルの抗ホスホチロシン（１：１００００希釈，ＡＤＢ中
）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 １３．工程１０と同様に洗浄する。 １４．１００μｌ／ウエルのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシ
ダーゼコンジュゲート（１：６０００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら
室温で１時間インキュベートする。 １５．工程１０と同様に洗浄し，次にＰＢＳで洗浄して泡および過剰のＴＷＥＥ
Ｎを除去する。 １６．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 １７．振盪しながら１０−２０分間インキュベートする。泡を除去する。 １８．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００Ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２１３】ＥＧＦＲバイオアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＧＦＲのインビトロキ
ナーゼ活性を測定する。
【０２１４】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート． ２．ＳＵＭＯ１モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． ３．ＰＢＳ ４．ＴＢＳＴ緩衝液 ５．ブロッキング緩衝液：１００ｍｌにつき，５．０ｇカーネーション（登録商
標）インスタント無脂ミルクを１００ｍｌＰＢＳと混合する。 ６．Ａ４３１細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． ７．ＴＢＳ緩衝液： ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ：１Ｌにつき，１．５１４ｇＴＲＩＳ，２．１９２
ｇＮａＣｌおよび２５ｍｌＤＭＳＯを混合物し，ｄＨ2Ｏで総容量１リットルと
する。 ９．ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸，ウマ筋肉，ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ
．Ａ−５３９４），１．０ｍＭ溶液，ｄＨ2Ｏ中。この試薬は，使用直前に作成
し氷上に保持しなければならない。 １０．１．０ｍＭＭｎＣｌ2． １１．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化ミックス：１０ｍｌを作成するには，３００
μｌの１ｍＭＡＴＰ，５００μｌのＭｎＣｌ2および９．２ｍｌのｄＨ2Ｏを混合
する。使用直前に調製し，氷上に保持する。 １２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート． １３．ＥＤＴＡ． １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）． １６．ＡＢＴＳ． １７．３０％過酸化水素 １８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2． １９．０．２ＭＨＣｌ．
【０２１５】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰ
ＢＳ中の０．５μｇのＳＵＭ０１で被覆する。４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合ＳＵＭＯ１をウエル
から除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くた
たいて，過剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（７μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。 ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。 ７．プレートを上述の４と同様に洗浄する。 ８．１２０μｌのＴＢＳを捕捉ＥＧＦＲを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。 ９．試験化合物をＴＢＳ中に１：１０で希釈し，ウエル中に入れる。 １０．１３．５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに入れる。対照ウエ
ルには１０％ＤＭＳＯ中１３．５μｌのＴＢＳを加える。 １１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １２．１５μｌのリン酸化ミックスを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに加
える。最終ウエル容量は約１５０μｌであり，各ウエル中３μＭＡＴＰ／５ｍＭ
ＭｎＣｌ2の最終濃度となるはずである。振盪しながら５分間インキュベートす
る。 １３．振盪しながら１６．５μｌのＥＤＴＡ溶液を加えることにより反応を停止
させる。さらに１分間振盪する。 １４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。 １５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳ
Ｔ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。 １６．上述の４と同様に洗浄する。 １７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しな
がら室温で３０分間インキュベートする。 １８．上述の４と同様に洗浄する。 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 ２０．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。 ２１．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌ／ウエルを加えることにより反
応を停止させる。 ２２．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む：試
験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭ。
【０２１６】ＰＤＧＦＲバイオアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰＤＧＦＲのインビトロ
キナーゼ活性を測定する。
【０２１７】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート ２．２８Ｄ４Ｃ１０モノクローナル抗ＰＤＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
． ３．ＰＢＳ． ４．ＴＢＳＴ緩衝液． ５．ブロッキング緩衝液（ＥＧＦＲバイオアッセイと同じ）． ６．ＰＤＧＦＲ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． ７．ＴＢＳ緩衝液． ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ． ９．ＡＴＰ． １０．ＭｎＣｌ2． １１．キナーゼ緩衝液リン酸化ミックス：１０ｍｌにつき，２５０μｌ１ＭＴＲ
ＩＳ，２００μｌ５ＭＮａＣｌ，１００μｌ１ＭＭｎＣｌ2および５０μｌ１０
０ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００を十分なｄＨ2Ｏ中で混合して，１０ｍｌとする
。 １２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート． １３．ＥＤＴＡ． １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）． １６．ＡＢＴＳ． １７．過酸化水素，３０％溶液． １８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2． １９．０．２ＭＨＣｌ．
【０２１８】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌの
ＰＢＳ中０．５μｇ２８Ｄ４Ｃ１０で被覆し，４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合２８Ｄ４Ｃ１０をウ
エルから除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽
くたたいて過剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。 ５．溶解物をＨＮＴＧ中で希釈する（１０μｇ溶解物／１００μｌＨＮＴＧ）． ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。 ７．プレートを工程４に記載されるように洗浄する。 ８．８０μｌの作業キナーゼ緩衝液ミックスを捕捉ＰＤＧＦＲを含むＥＬＩＳＡ
プレートに加える。 ９．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳ中で１：１０
に希釈する。 １０．１０μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエルに
は，１０μｌのＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える。振盪しながら室温で３０分間
インキュベートする。 １１．１０μｌのＡＴＰを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加える（
最終ウエル容量は約１００μｌであり，各ウエルは２０μＭＡＴＰであるはずで
ある）。振盪しながら３０分間インキュベートする。 １２．１０μｌのＥＤＴＡ溶液を各ウエルに加えることにより反応を停止する。 １３．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。 １４．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳ
Ｔ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。 １５．工程４と同様に洗浄する。 １６．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しな
がら室温で３０分間インキュベートする。 １７．工程４と同様に洗浄する。 １８．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 １９．振盪しながら１０−３０分間インキュベートする。泡を除去する。 ２０．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより反
応を停止させる。 ２１．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２１９】細胞性ＨＥＲ−２キナーゼアッセイ このアッセイを用いて，全細胞におけるＨＥＲ−２キナーゼ活性をＥＬＩＳＡ
フォーマットで測定する。
【０２２０】材料および試薬： １．ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１１９６５−０９２）． ２．ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯカタログ＃１６０００−０４４），水浴
中で５６℃で３０分間熱不活性化する。 ３．トリプシン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５２００−０５６）． ４．Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５０３０−０８１） ５．ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１５６３０−０８０）． ６．成長培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，５５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥ
ＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合する。 ７．血清飢餓培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，２．５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍ
ｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合物する。 ８．ＰＢＳ． ９．平底９６−ウエル組織培養マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタ
ログ＃２５８６０）． １０．１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃０８７５７１４８）． １１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート． １２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート． １３．Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジ，Ｔｒａｎｓｔａｒ９６（Ｃｏ
ｓｔａｒカタログ＃７６１０）用 １４．ＳＵＭＯ１：モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． １５．ＴＢＳＴ緩衝液． １６．ブロッキング緩衝液：５％カーネーション（登録商標）インスタントミル
ク，ＰＢＳ中 １７．ＥＧＦリガンド：ＥＧＦ−２０１，Ｓｈｉｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊ
ａｐａｎ．。粉体を１００μｌの１０ｍＭＨＣｌに懸濁する。１００μｌの１０
ｍＭＮａＯＨを加える。８００μｌのＰＢＳを加え，エッペンドルフチューブに
移し，使用するまで−２０℃で保存する。 １８．ＨＮＴＧ溶解緩衝液：保存５ＸＨＮＴＧ用には，２３．８３ｇＨｅｐｅｓ
，４３．８３ｇＮａＣｌ，５００ｍｌグリセロールおよび１００ｍｌＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００および十分なｄＨ2Ｏを混合して１Ｌの溶液とする。１ＸＨＮＴＧ
＊用には，２ｍｌＨＮＴＧ，１００Ｌ０．１ＭＮａ3ＶＯ4，２５０μｌ０．２Ｍ
Ｎａ4Ｐ2Ｏ7および１００μｌＥＤＴＡを混合する。 １９．ＥＤＴＡ． ２０．Ｎａ３ＶＯ４．保存溶液を作成するためには，１．８４ｇＮａ３ＶＯ４を
９０ｍｌｄＨ2Ｏと混合する。ｐＨを１０に調節する。電子レンジで１分間沸騰
させる（溶液は透明になる）。室温に冷却する。ｐＨを１０に調節する。ｐＨが
１０で安定するまで加熱／冷却のサイクルを繰り返す。 ２１．２００ｍＭＮａ４Ｐ２Ｏ７． ２２．ホスホチロシン特異的ウサギポリクローナル抗血清（抗Ｐｔｙｒ抗体，Ｓ
ＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）． ２３．アフィニティー精製抗血清，ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体，ペルオキシダーゼ
コンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅカタログ＃ＡＬＩ０４０４）． ２４．ＡＢＴＳ溶液． ２５．３０％過酸化水素溶液． ２６．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2． ２７．０．２ＭＨＣｌ．
【０２２１】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１．０μｇ／ウエ
ルのＳＵＭ０１で被覆する。最終容量１００μｌ／ウエル。４℃で一夜保存する
。 ２．使用の日に，被覆緩衝液を除去し，プレートをｄＨ2Ｏで３回，ＴＢＳＴ緩
衝液で１回洗浄する。このアッセイにおいては，特に記載しない限り，すべての
洗浄はこのように行う。 ３．１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しな
がら室温で３０分間インキュベートする。使用直前にプレートを洗浄する。 ４．このアッセイにはＥＧＦｒ／ＨＥＲ−２キメラ／３Ｔ３−Ｃ７細胞株を用い
る。 ５．８０−９０％コンフルエントの皿を選択する。トリプシン処理により細胞を
回収し，１０００ｒｐｍで室温で５分間遠心分離する。 ６．細胞を血清飢餓培地に懸濁し，トリパンブルーで計数する。９０％より高い
生存度が必要である。細胞を血清飢餓培地に２，５００細胞／ウエルの密度で，
９０μｌ／ウエルで９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した
細胞を３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。 ７．播種の２日後にアッセイを開始する。 ８．試験化合物を４％ＤＭＳＯに溶解する。次に試料をプレート上で直接血清飢
餓ＤＭＥＭでさらに希釈する。典型的には，この希釈は１：１０またはそれより
高い。次にすべてのウエルを細胞プレートにさらに１：１０希釈して加える（１
０μｌの試料および培地を９０μｌの血清飢餓培地に加える。最終ＤＭＳＯ濃度
は１％以下でなければならない。標準的連続希釈を用いてもよい。 ９．５％ＣＯ2，３７℃で２時間インキュベートする。 １０．保存ＥＧＦ（１６．５μＭ）を暖めたＤＭＥＭで１５０ｎＭに希釈するこ
とによりＥＧＦリガンドを調製する。 １１．１００μｌ／ウエルに十分な量のＨＮＴＧ＊を新たに調製する。氷上に置
く。 １２．試験化合物とともに２時間インキュベートした後，調製したＥＧＦリガン
ドを細胞に５０μｌ／ウエルで加える。最終濃度は５０ｎＭである。陽性対照ウ
エルには同量のＥＧＦを加える。陰性対照にはＥＧＦを加えない。３７℃で１０
分間インキュベートする。 １３．試験化合物，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで１回洗
浄する。 １４．ＨＮＴＧ＊を細胞に１００μｌ／ウエルで移す。氷上に５分間置く。この
間にブロッキング緩衝液をＥＬＩＳＡプレートから除去し，洗浄する。 １５．細胞をマイクロピペッターでプレートから掻き取り，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝
液を繰り返し吸引分配することにより細胞材料をホモジナイズする。溶解物を，
被覆しブロッキングし洗浄したＥＬＩＳＡプレートに移す。 １６．振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 １７．溶解物を除去し，洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体（１：３００
０，ＴＢＳＴ中）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。 １８．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １９．抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，洗浄する。新たに希釈したＢＩＯＳＯＵＲＣＥ
抗体をＥＬＩＳＡプレートに加える（１：８０００，ＴＢＳＴ中，１００μｌ／
ウエル）。 ２０．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ２１．ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体を除去し，洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／
Ｈ2Ｏ2溶液をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。 ２２．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。 ２３．１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停止する。 ２４．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタセッ
ト４１０ｎＭおよび参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２２２】ＣＤＫ２／サイクリンＡアッセイ このアッセイを用いて，シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ
）におけるヒトｃｄｋ２／サイクリンＡのインビトロセリン／トレオニンキナー
ゼ活性を測定する。
【０２２３】材料および試薬： １．Ｗａｌｌａｃ９６−ウエルポリエチレンテレフタレート（ｆｌｅｘｉ）プレ
ート（Ｗａｌｌａｃカタログ＃１４５０−４０１）． ２．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒｅｄｉｖｕｅ［γ33Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍカ
タログ＃ＡＨ９９６８）． ３．Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ
（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＲＰＮＱ０００７）。ビーズはＰＢＳ中でマグネ
シウムまたはカルシウムなしで２０ｍｇ／ｍｌで再構成しなければならない。 ４．Ｓｆ９細胞から精製した活性化ｃｄｋ２／サイクリンＡ酵素複合体（ＳＵＧ
ＥＮ，Ｉｎｃ．）． ５．ビオチニル化ペプチド基質（Ｄｅｂｔｉｄｅ）．ペプチドビオチン−Ｘ−Ｐ
ＫＴＰＫＫＡＫＫＬをｄＨ2Ｏに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。 ６．２０％ＤＭＳＯ，ｄＨ2Ｏ中 ７．キナーゼ緩衝液：１０ｍｌにつき，９．１ｍｌのｄＨ2Ｏ，０．５ｍｌのＴ
ＲＩＳ（ｐＨ７．４），０．２ｍｌの１ＭＭｇＣｌ2，０．２ｍｌの１０％ＮＰ
４０を混合し，使用直前に０．０２ｍｌの１ＭＤＴＴを新たに加える。 ８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中 ９．１ＭＴｒｉｓ，ＨＣｌでｐＨを７．４に調節する。 １０．１ＭＭｇＣｌ2． １１．１ＭＤＴＴ． １２．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１４１９０−１４４）． １３．０．５ＭＥＤＴＡ． １４．停止溶液：１０ｍｌにつき，９．２５ｍｌのＰＢＳ，０．０５ｍｌの１０
ｍＭＡＴＰ，０．１ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ，０．１ｍｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ１００および１．５ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌＳＰＡビーズを混合する。
【０２２４】方法： １．試験化合物の溶液を５％ＤＭＳＯ中に所望の最終濃度の４倍で調製する。１
０μｌを各ウエルに加える。陽性および陰性対照については，ウエル中１０μｌ
の２０％ＤＭＳＯのみを用いる。 ２．ペプチド基質（ｄｅｂ−ｔｉｄｅ）をｄＨ2Ｏで１：２５０に希釈して，最
終濃度０．０２ｍｇ／ｍｌとする。 ３．２４μｌの０．１ｍＭＡＴＰを２４μＣｉγ33Ｐ−ＡＴＰおよび十分量のｄ
Ｈ2Ｏと混合して６００μｌとする。 ４．希釈ペプチドおよびＡＴＰ溶液を１：１で混合する（６００μｌ＋６００μ
ｌ／プレート）。１０μｌのこの溶液を各ウエルに加える。 ５．５μｌのｃｄｋ２／ｃｙｃｌｉｎＡ溶液を２．１ｍｌの２ｘキナーゼ緩衝液
（プレートあたり）中に希釈する。２０μｌ／ウエルの酵素を加える。陰性対照
には，２０μｌの２ｘキナーゼ緩衝液を加え，酵素を加えない。 ６．プレート振盪器で軽く混合し，６０分間インキュベートする。 ７．２００μｌ／ウエルの停止溶液を加える。 ８．少なくとも１０分間放置する。 ９．プレートを約２３００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離する。 １０．リーダーでプレートを計数する。
【０２２５】ＭＥＴトランスリン酸化アッセイ このアッセイを用いて，基質のｍｅｔトランスリン酸化のアゴニスト／アンタ
ゴニストを同定する手段として，ポリ（グルタミン酸：チロシン（４：１））基
質のホスホチロシンレベルを測定する。
【０２２６】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート，Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
＃２５８０５−９６． ２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ；Ｐ０２７５． ３．ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ ４．５０ｍＭＨＥＰＥＳ ５．ブロッキング緩衝液：２５ｇのウシ血清アルブミン，ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎ
ｏＡ−７８８８，を５００ｍｌＰＢＳに溶解し，４μｍフィルターを通して濾過
する。 ６．Ｍｅｔキナーゼドメインを含む精製ＧＳＴ融合蛋白質，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
． ７．ＴＢＳＴ緩衝液． ８．１０％水性（ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ2Ｏ）ＤＭＳＯ． ９．１０ｍＭ水性（ｄＨ2Ｏ）アデノシン−５’−三リン酸，ＳｉｇｍａＣａｔ
．Ｎｏ．Ａ−５３９４． １０．２Ｘキナーゼ希釈緩衝液：１００ｍｌにつき，１０ｍＬ１ＭＨＥＰＥＳ，
ｐＨ７．５，０．４ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．２ｍＬ０．１Ｍオルトバナジ
ン酸ナトリウムおよび１ｍＬ５Ｍ塩化ナトリウムを８８．４ｍＬｄＨ2Ｏ中で混
合する。 １１．４ＸＡＴＰ反応混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンお
よび０．０２ｍＬ０．１ＭＡＴＰを９．５６ｍＬｄＨ2Ｏ中で混合する。 １２．４Ｘ陰性対照混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンを９
．６ｍＬｄＨ2Ｏ中に混合する。 １３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃Ｓ−７２０９２ １４．５００ｍＭＥＤＴＡ． １５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．
５ｍＬ５％カーネーション（登録商標）インスタントミルク，ＰＢＳ中，および
０．１ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを８８．４ｍＬＴＢＳＴ中で混
合する。 １６．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ． １７．ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体，Ｂｉｏ
ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ． １８．ＡＢＴＳ溶液：１Ｌにつき，１９．２１ｇクエン酸，３５．４９ｇＮａ２
ＨＰＯ4および５００ｍｇＡＢＴＳを十分なｄＨ2Ｏ中で混合し，１Ｌとする。 １９．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2：１５ｍＬＡＢＳＴ溶液と２μｌＨ2Ｏ2を使用の５分前
に混合する。 ２０．０．２ＭＨＣｌ
【０２２７】方法： １．ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中２μｇのポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）
で被覆し，４℃で一夜保存する。 ２．プレートを１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳで６０分間ブロッキングする。 ３．プレートをＰＢＳで２回，次に，５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．４で
１回洗浄する。 ４．５０μｌの希釈キナーゼをすべてのウエルに加える。 （精製キナーゼはキナーゼ希釈緩衝液中で希釈する。最終濃度は１０ｎｇ／ウエ
ルとなるはずである）。 ５．２５μｌの試験化合物（４％，ＤＭＳＯ中）または対照にはＤＭＳＯ単独（
４％，ｄＨ2Ｏ中）をプレートに加える。 ６．キナーゼ／化合物混合物を１５分間インキュベートする。 ７．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ2を陰性対照ウエルに加える。 ８．２５μｌのＡＴＰ／ＭｎＣｌ2混合物を他のすべてのウエル（陰性対照を除
く）に加える。５分間インキュベートする。 ９．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。 １０．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。 １１．抗体希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した１００μｌのウサギポリ
クローナル抗Ｐｔｙｒを各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。 １２．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。 １３．ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体を抗体．希釈緩
衝液中に１：６，０００で希釈する。１００μｌ／ウエルを加え，振盪しながら
室温で１時間インキュベートする。 １４．プレートをＰＢＳで１回洗浄する。 １５．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 １６．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより発
色反応を停止させる。 １７．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでプレートを読む。
【０２２８】ＩＧＦ−１トランスリン酸化アッセイ このアッセイを用いて，基質のｇｓｔ−ＩＧＦ−１トランスリン酸化のアゴニ
スト／アンタゴニストを同定するために，ポリ（グルタミン酸：チロシン）（４
：１）中のホスホチロシンレベルを測定する。
【０２２９】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート． ２．ポリ（Ｇｌｕ−ｔｙｒ）（４：１），ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ｐ０２７５
． ３．ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ． ４．５０ｍＭＨＥＰＥＳ５．ＴＢＢブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇ
ＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．５），５８．４４ｇ塩化ナトリウムおよ
び１０ｍＬ１％ＴＷＥＥＮ−２０を混合する。 ６．ＩＧＦ−１キナーゼドメインを含む精製ＧＳＴ融合蛋白質（Ｓｕｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．） ７．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，６．０５７ｇＴｒｉｓ，８．７６６ｇ塩化ナ
トリウムおよび０．５ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を混合し，ｄＨ2Ｏで１リットルと
する。 ８．４％ＤＭＳＯ，Ｍｉｌｌｉ−ＱＨ2Ｏ中． ９．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中． １０．２Ｘキナーゼ希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ１ＭＨＥＰＥＳ（
ｐＨ７．５），０．４ｍＬ５％ＢＳＡ，ｄＨ2Ｏ中，０．２ｍＬ０．１Ｍオルト
バナジン酸ナトリウムおよび１ｍＬ５Ｍ塩化ナトリウムを混合し，ｄＨ2Ｏで１
００ｍＬとする。 １１．４ＸＡＴＰ反応混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１ＭＭｎＣｌ2およ
び０．００８ｍＬ０．０１ＭＡＴＰおよび９．５６ｍＬｄＨ2Ｏを混合する。 １２．４Ｘ陰性対照混合物：０．４ｍＬの１Ｍ塩化マンガンを９．６０ｍＬｄＨ2 Ｏと混合する。 １３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート． １４．５００ｍＭＥＤＴＡ，ｄＨ2Ｏ中． １５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中），
０．５ｍＬ５％カーネーションインスタント無脂ミルク（ＰＢＳ中）および０．
１ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを８８．４ｍＬＴＢＳＴと混合する
。 １６．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ． １７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート化抗体，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ． １８．ＡＢＴＳ溶液． ２０．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2：使用の５分前に１５ｍＬＡＢＴＳを２μｌＨ2Ｏ2と混
合する。 ２１．０．２ＭＨＣｌｄＨ2Ｏ中．
【０２３０】方法： １．ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中の２．０μｇ／ウエルのポリ（Ｇ
ｌｕ，Ｔｙｒ）４：１（ＳｉｇｍａＰ０２７５）で被覆する。プレートを４℃で
一夜保存する。 ２．プレートをＰＢＳで１回洗浄する。 ３．１００μｌのＴＢＢブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振
盪しながら室温で１時間インキュベートする。 ４．プレートをＰＢＳで１回，５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７．５で２回洗浄
する。 ５．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中の試験化合物（１０ｍＭ試験化合物の１００％Ｄ
ＭＳＯ中の保存溶液をｄＨ2Ｏで希釈することにより得る）をプレートに加える
。 ６．１０．０ｎｇのｇｓｔ−ＩＧＦ−１キナーゼ（５０μｌキナーゼ希釈緩衝液
中）をすべてのウエルに加える。 ７．２５μｌの４ＸＡＴＰ反応混合物をすべての試験ウエルおよび陽性対照ウエ
ルに加えることによりキナーゼ反応を開始させる。２５μｌの４Ｘ陰性対照混合
物をすべての陰性対照ウエルに加える。振盪しながら室温で１０分間インキュベ
ートする。 ８．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加える。 ９．プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄する。 １０．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清を，１００μｌの抗体希釈
緩衝液中１：１０，０００の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温
で１時間インキュベートする。 １１．プレートを工程９と同様に洗浄する。 １２．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅ抗ウサギＨＲＰを抗体希釈緩衝液中１：
１０，０００の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温で１時間イン
キュベートする。 １３．プレートを工程９と同様に洗浄し，さらにＰＢＳで１回洗浄して，泡およ
び過剰のＴｗｅｅｎ−２０を減少させる。 １４．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2を各ウエルに加えることにより発色させる
。 １５．約５分後，試験フィルタ４１０ｎｍ，参照フィルタ６３０ｎｍでＥＬＩＳ
Ａリーダーを読む。
【０２３１】ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 以下のアッセイは，選択されたレセプターを発現するよう遺伝子工学的に改変
された細胞を使用して，ＤＮＡ中へのＢｒｄＵ取り込みを決定することにより，
リガンド−誘導性ＤＮＡ合成の活性に及ぼす目的化合物の影響を評価する。 以下の材料，試薬および方法は，以下のＢｒｄＵ取り込みアッセイのそれぞれに
ついて一般的である。特定のアッセイにおける変更は特に記載される。
【０２３２】一般的材料および試薬： １．適当なリガンド． ２．工学的に改変した適当な細胞． ３．ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ
） ４．ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ） ５．抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：マウスモノクローナル抗体，ペルオキシダーゼとコ
ンジュゲート化（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ） ６．ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，即使用可，Ｒｏｃｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
，ＩＮ） ７．ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４． ８．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）．
【０２３３】一般的方法： １．細胞を８０００細胞／ウエルで，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ，ＤＭＥＭ中で
９６ウエルプレートに播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2で一夜インキュベー
トする。 ２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳＤＭＥＭ，
０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 ３．第３日に，適当なリガンドおよび試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対
照ウエルには無血清ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞には
リガンドを加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中で
リガンドとともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃
度とする。 ４．リガンド活性化の１８時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＤＭＥ
Ｍ中，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）ととも
に１．５時間インキュベートする。 ５．標識試薬とともにインキュベートした後，デカントし逆さにしたプレートを
ペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶
液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５分間イ
ンキュベートする。 ６．デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより
ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ミルク（５％脱水ミルク，ＰＢＳ中，２
００μｌ／ウエル）をブロッキング溶液としてを加え，プレートをプレート振盪
器で室温で３０分間インキュベートする。 ７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回
洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：２００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ
，５０μｌ／ウエル）を加え，プレートをプレート振盪器で室温で９０分間イン
キュベートする。 ８．デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートを
除去し，プレートを逆さにし，ペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥す
る。 ９．ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２
０分間，発色が光学的検出に十分となるまでインキュベートする。 １０．試料の吸収をＤｙｎａｔｅｃｈＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍ
で測定する（"デュアル波長"モード，参照波長として４９０ｎｍでフィルターを
読む）。
【０２３４】ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）． ２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２３５】ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−２−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）． ２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ２／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−２キナー
ゼドメイン）． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２３６】ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−４−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）． ２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ４／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−４キナー
ゼドメイン）． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２３７】ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．ヒトＰＤＧＦＢ／Ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）． ２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２３８】ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）． ２．３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２３９】ＩＧＦ１−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．ヒト，組換え（Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ） ２．３Ｔ３／ＩＧＦｌｒ． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２４０】インスリン−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．インスリン，結晶，ウシ，亜鉛（１３００７，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）
． ２．３Ｔ３／Ｈ２５． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２４１】ＨＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬： １．組換えヒトＨＧＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２４９−ＨＧ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，
Ｉｎｃ．ＵＳＡ）． ２．ＢｘＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６８７）． その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。
【０２４２】方法： １．細胞をＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中で９６ウエルプレートに９０００細胞／ウエ
ルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2中で一夜インキュベートする ２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に１００μｌの無血清培地（ＲＰＭ
Ｉ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 ３．第３日に，リガンド（１μｇ／ｍｌでＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ中で調製；
最終ＨＧＦ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および試験化合物を含有する２５μｌを細胞
に加える。陰性対照ウエルには２５μｌの無血清ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡのみ
を加える。陽性対照細胞にはリガンド（ＨＧＦ）を加えるが試験化合物は加えな
い。試験化合物は，９６ウエルプレートで，リガンドを含む無血清ＲＰＭＩ中で
その最終濃度の５倍で調製し，一連の希釈を作成して７種類の試験濃度とする。
典型的には，試験化合物の最高最終濃度は１００μＭであり，１：３希釈を用い
る（すなわち，最終試験化合物濃度範囲は０．１３７−１００μＭである）。 ４．リガンド活性化の１８時間後，１２．５μｌの希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：
１００，ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）を各ウエルに加え，細胞をＢｒｄＵ（最終
濃度は１０ｐＭ）とともに１時間インキュベートする。 ５．一般的方法と同じ。 ６．一般的方法と同じ。 ７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回
洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：１００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ
）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で９０分間
インキュベートする。 ８．一般的方法と同じ。 ９．一般的方法と同じ。 １０．一般的方法と同じ。
【０２４３】指数関数的ＢｒｄＵ取り込みアッセイ このアッセイを用いて指数関数的に成長しているＡ４３１細胞の増殖（ＤＮＡ
合成）を測定する。このアッセイは，細胞サイクル進行を阻害する化合物のスク
リーニングに用いる。材料および試薬： 健康な成長しているＡ４３１細胞。その他の材料および試薬は一般的プロトコ
ルの節に記載されるものと同じである。
【０２４４】方法： １．Ａ４３１細胞を，１０％ＦＢＳ，２ｍＭＧｌｎ／ＤＭＥＭ中で，９６ウエル
プレートに８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2で一夜
インキュベートする。 ２．第２日に，試験化合物を９６ウエルプレート上で同じ成長培地中で連続的に
希釈して７種類の試験濃度とし，次に９６ウエル組織培養プレート上の細胞に加
える。 ３．２０−２４時間インキュベートした後，希釈したＢｒｄＵ標識試薬（１：１
００，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ
）とともに２時間インキュベートする。 一般的方法の工程５−１０を用いてアッセイを完了する。
【０２４５】ＺｅｎＳｒｃアッセイ このアッセイを用いて，チロシンキナーゼＳｒｃの阻害剤をスクリーニングす
る。材料および試薬： １．被覆緩衝液：アジ化ナトリウム（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ ２．ＰＢＳ中１％ｗ／ｖＢＳＡ ３．洗浄緩衝液：０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ）を含
むＰＢＳ，４．５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４ ５．蒸留水中，ＡＴＰ（４０μＭ）＋ＭｇＣｌ2（８０ｍＭ） ６．蒸留水中，ＭｇＣｌ2（８０ｍＭ）（ＡＴＰなしのブランク用） ７．試験化合物，ＤＭＳＯ中１０ｍＭ ８．アッセイ緩衝液：１００ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２ｍＭＤＴＴ，０．
２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび０．２ｍｇｓ／ｍｌＢＳＡを含む ９．部分的に精製された組換えヒトＳｒｃ（ＵＢＩ（１４−１１７）） １０．抗ホスホチロシン（ＳＵＧＥＮウサギポリクローナル抗ＰＹ） １１．ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ ＃６４３０） １２．ＨＲＰ基質ＡＢＴＳまたはＰｉｅｒｃｅペルオキシダーゼ基質 １３．Ｃｏｒｎｉｎｇ ＥＬＩＳＡプレート
【０２４６】方法： １．０．０１％アジ化ナトリウムを含む１００μｌの２０μｇ／ｍｌポリ（Ｇｌ
ｕ−Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ０２７５）でプレートを被覆する
。４℃で一夜保存する。 ２．１００μｌ／ウエルの１％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングする。 ３．試験化合物（１０ｍＭ，ＤＭＳＯ中）を，ｄＨ2Ｏで希釈し反応プレートに
プレーティングしうるＣｏｓｔａｒプレートに２μｌ／ウエルで加える。 ４．Ｓｒｃキナーゼを反応緩衝液中で１：１０，０００に希釈する。以下のよう
にして，５枚のプレート用に２５ｍｌを作成する：２．５ｍｌの１ＭＨＥＰＥＳ
，ｐＨ７．４（無菌的に４℃で保存），２１．８５ｍｌの蒸留水，０．１ｍｌの
５％ＢＳＡ，０．５ｍｌの１０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（無菌的に４℃
で保存），５０μｌの１．０ＭＤＴＴ（−２０℃で凍結保存），および２．５μ
ｌのＳｒｃキナーゼ（−８０℃で凍結保存）。 ５．希釈プレート中の２μｌの各化合物に４８μｌの蒸留水を加え，次にその２
５μｌ／ウエルを反応プレートに加える。 ６．５０μｌのＨＲＰを各反応緩衝液ウエルに加え，次に２５μｌのＡＴＰ−Ｍ
ｇＣｌ2／ウエル（ＡＴＰなしブランクにはＭｇＣｌ2のみ）を加える。プレート
振盪器上で室温で１５分間インキュベートする。２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを
各ウエルに加えることにより反応を停止させる。 ７．ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回洗浄する。 ８．１００μｌの抗ホスホチロシン（１：１０，０００の抗−ｐＴｙｒ血清また
は１：３，０００の１０％グリセロール希釈ＰＡ−アフィニティー精製抗体）を
，０．５％ＢＳＡ，０．０２５％無脂粉ミルクおよび１００μＭオルトバナジン
酸ナトリウムを含むＰＢＳ−ＴＷＥＥＮに加える。連続的に撹拌しながら室温で
１時間インキュベートする。 ９．プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回洗浄する。 １０．０．５％ＢＳＡ，０．０２５％無脂粉ミルク，１００Ｍオルトバナジン酸
ナトリウムを含むＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ中の１００μｌのＨＲＰ結合Ｉｇ（１：５
，０００）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 １１．プレートをＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回洗浄し，次にＰＢＳで１回洗浄する
。 １２．ＡＢＴＳまたは他のペルオキシダーゼ基質を用いてプレートを発色させる
。
【０２４７】細胞サイクル分析： 標準的成長培地中のＡ４３１細胞を所望の濃度の試験化合物に３７℃で２０−
２４時間暴露する。次に細胞を回収し，ＰＢＳに懸濁し，７０％氷冷メタノール
で固定し，ヨウ化プロピジウムで染色する。次にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメ
ータを用いてＤＮＡ含量を測定する。次に，ＣｅｌｌＦＩＴソフトウエア（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞サイクル期の分布を概算すること
ができる。
【０２４８】ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ このアッセイを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａＦＧＦまた
はＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然に発現され
ている）に対する化合物の活性を測定する。
【０２４９】第０日 １． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）
を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約
１ｍｌ／１０ｃｍ2組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で
０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシン
は，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５
２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／
２５−３０ｃｍ2組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細
胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分
離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６
）に移す。 ２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約
３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸
引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細
胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ2のアッセイ培地に再懸濁する。アッ
セイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−
０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕ
ｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細
胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０5細胞／ｍｌの
濃度とする。 ３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．
０ｘ１０4細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベー
トする。
【０２５０】第１日 １． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に
，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる
。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）
で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保
存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％Ｄ
ＭＳＯを含む。 したがって，ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッ
セイ培地中（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，
試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに
６０μｌ／ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試
験化合物希釈物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混
合する。このウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μ
ｌと混合し，２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが
混合されたとき，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄す
る。最後のウエルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を
加える。以下のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つの
カラムを作成する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入
手，カタログＮｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸
性線維芽細胞成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３
９６００）；または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。
ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。 ２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ
細胞０．８−１．０ｘ１０4細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセ
イプレートに移し，３７oＣ，５％ＣＯ2で約２時間インキュベートする。 ３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試
験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物につ
いては，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのア
ッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ2で約２４
時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの
成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエル
とする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および
成長因子は１倍となる。
【０２５１】第２日 １． 3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を
１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した
１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ2で約
２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カ
タログＮｏ．１１８７５−０５１第３日 １． プレートを−２０℃で一夜凍結する。第４日 １． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖ
ｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮ
ｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商
標）液体シンチレーション計数機で計数する。
【０２５２】血管透過性アッセイ 腫瘍依存性新脈管形成における血管透過性の増加は，血管内皮細胞成長因子（
ＶＥＧＦ）に応答したギャップジャンクションの喪失に起因する。本発明の化合
物がインビボでＶＥＧＦ誘導性血管透過性を阻害する能力を評価するために，血
管透過性のマイルスアッセイ（Ｍｉｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ，Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．１１８：２２８−２５７（１９５２））を無胸腺マウスに適用した。
【０２５３】一般的方法： 試験化合物またはベヒクルを，ＶＥＧＦ注入の前（典型的には４時間前）に投
与する。１００μｌのＰＢＳ中０．５％エバンスブルー染料を２７ゲージ針を用
いて尾部血管側面注射により静脈内に注射する。６０分後，イソフルオラン吸入
を用いて動物を麻酔する。麻酔後，各動物の背面のグリッドパターンに，ＶＥＧ
Ｆ（１００ｎｇのＶＥＧＦ，２０μｌのＰＢＳ中）を２つのスポットにＰＢＳ（
２０μｌ）を２つのスポットに経皮的に注射する。ＶＥＧＦ注射の１時間後まで
の所定の時間に，動物をＣＯ2で安楽死させ，皮膚パッチを切開して写真撮影す
る。発表されている報告に基づいて（Ａｌｉｃｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ ４：９１５−９１４（１９９９）），皮膚パッチからの染料の溶出
にしたがって，マウス皮膚中へのＶＥＧＦ依存性染料漏出の定量的評価を行うこ
とができる。
【０２５４】インビボ動物モデル 異種移植片動物モデル ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植
片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに
有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な
異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐ
ａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，
多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，乳房，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神
経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に
成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性
および効果のレベルを決定することができる。３種類の一般的アッセイ，すなわ
ち細胞／触媒，細胞／生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用で
ある。細胞／触媒アッセイの目的は，ＴＫが細胞中の既知の基質上のチロシンを
リン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞／生物学的
アッセイの目的は，細胞中でＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物
の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は，特定の疾患，例えば
癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。
【０２５５】 皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣＣ
＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ４
３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，Ａ
ＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），お
よびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過剰
発現するように遺伝子工学処理されたＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ３Ｔ３
線維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うこと
ができる。
【０２５６】 雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手する。すべての動物は，クリ
ーンルーム条件下で，マイクロアイソレーターケージでアルファドライ敷きわら
で維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。
【０２５７】 細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，また
はＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグ
ルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，お
よびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細胞
は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ2の湿潤環境下で３７℃で成長させ
る。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉ
ｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。
【０２５８】 細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン−
ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌ＰＢ
Ｓまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１群
あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０6細胞／動物）の後側腹部内に移
植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。腫
瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ値
は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤（
ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日か
ら初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。
【０２５９】腫瘍侵襲モデル 以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを選
択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために
用いることができる。
【０２６０】方法 ８週齢のヌードマウス（雌）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｉｎｃ．）を実験動物とし
て用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キ
シラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキ
シラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５
ｃｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０7個の腫瘍細胞を注入する。細胞
は，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０
絹連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観
察する。
【０２６１】分析 動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器
（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイ
ズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定等
）。
【０２６２】追加のアッセイ 本発明の化合物を評価するために用いることができる追加のアッセイには，限
定されないが，ｂｉｏ−ｆｌｋ−１アッセイ，全細胞におけるＥＧＦレセプター
−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ，ｂｉｏ−ｓｒｃアッセイ，ｂｉｏ−ｌｃ
ｋアッセイおよびｒａｆのリン酸化機能を測定するアッセイが含まれる。これら
のアッセイのそれぞれのプロトコルは，米国特許出願０９／０９９，８４２（図
面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に見いだすことができる。さら
に，米国特許５，７９２，７８３（１９９６年６月５日出願）および米国特許出
願０９／３２２，２９７（１９９９年５月２８日出願）は，本明細書に完全に記
載されているように本明細書の一部としてここに引用する。
【０２６３】細胞毒性の測定 治療用化合物は，細胞毒性効果を示すよりもレセプターチロシンキナーゼ活性
においてより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は
，治療指数，すなわち，ＩＣ50／ＬＤ50を決定することにより得ることができる
。ＩＣ50（５０％の阻害を達成するのに必要な用量）は，本明細書に記載される
もの等の標準的な手法を用いて測定することができる。ＬＤ50（５０％の毒性を
もたらす用量）もまた，放出されるＬＤＨの量を測定することにより（Ｋｏｒｚ
ｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３，Ｄｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ
−Ｍａｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１５：
６１），または動物モデルにおける致死用量を測定することにより，標準的な手
法により測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３）。より大きい治療指数を有する化合物
が望ましい。治療指数は，２より高くあるべきであり，好ましくは少なくとも１
０，より好ましくは少なくとも５０である。
【０２６４】血漿安定性試験： プロドラッグである（３Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−
２−イル）−メチリデン］−１−（１−ピロリジニルメチル）−１，３−ジヒド
ロ−２Ｈ−インドール−２−オンを２ｍｇ／ｍＬでイヌに静脈内投与した。プロ
ドラッグおよび薬剤（３（Ｚ）−３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−
２−イル）−メチリデン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン）
のレベルを血漿のＨＰＬＣ分析により投与後４時間追跡した。この実験は，プロ
ドラッグが薬剤に変換される半減期は７．３分間であることを示した。薬剤濃度
対時間のプロットから，曲線の下の面積は，プロドラッグの８０％が薬剤に変換
されたことを示した。
【０２６５】処方例 評価した処方は表１および２に示され，以下に説明される： ［Ａ］再構成して安定な注入剤とすべき固体処方（表１）： （１）凍結乾燥処方： （ａ）カプチゾル系：この処方はカプチゾルおよび酸性試薬を用いてｐＨ１．５
−２．０で化合物のインシトゥー塩を形成し，濃度２０．０−２５．０ｍｇ／ｍ
Ｌの薬剤溶液を凍結乾燥する。凍結乾燥ケークをＩＶ液で再構成して，ｐＨ３で
２ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の安定な注入剤を得る。 （ｂ）非カプチゾル系：この処方は少量の界面活性剤，例えばポリソルベート−
８０またはクレモフォアＥＬおよび酸性試薬を用いて，ｐＨ１．５−２．０で化
合物のインシトゥー塩を形成し，濃度２０．０−２５．０ｍｇ／ｍＬの薬剤溶液
を凍結乾燥する。凍結乾燥ケークを共溶媒−界面活性剤系水性希釈剤，例えば，
ＰＥＧ−３００−ポリソルベート８０またはＰＥＧ−３００−クレモフォアＥＬ
で再構成して，ｐＨ３で２ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の安定な注入剤を得る （２）滅菌ＡＰＩフィル： 薬剤は無菌粉体フィルとして容器中に充填し，特定の共溶媒−界面活性剤系水
性希釈剤で再構成して，ｐＨ３で２ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の薬剤の安定な注
入剤を得る。
【０２６６】 ［Ｂ］希釈して安定な注入剤とすべき溶液濃縮物（表２）： 薬剤は，水性希釈剤で希釈して安定な注入剤を作成することができるよう，共
溶媒および界面活性剤の非水性混合物中に高濃度で溶解する。注入剤中の薬剤の
濃度は，ｐＨ３で２ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上である。共溶媒の合計のレベルは
１５％未満であり，界面活性剤のレベルは０．５％未満である。
【０２６７】
【表１】
【０２６８】
【表２】
【０２６９】 表２ 溶液処方の組成
【表３】
【０２７０】 本発明は，例示される態様によってその範囲を制限されない。例示される態様
は，本発明の１つの観点の例示であることが意図され，機能的に同等のいかなる
クローン，ＤＮＡまたはアミノ酸配列も本発明の範囲内である。実際，当業者に
は，上述の記載および図面から，本明細書の開示に加えられる本発明の種々の改
変が明らかとなるであろう。そのような改変は特許請求の範囲の範囲内に含まれ
ることが意図される。
【０２７１】 本明細書に引用されるすべての参考文献はその全体を本明細書の一部としてこ
こに引用する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 7/02 7/02 9/08 9/08 9/10 １０１ 9/10 １０１ １０３ １０３ 13/12 13/12 17/02 17/02 17/06 17/06 19/02 19/02 25/28 25/28 29/00 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 403/06 Ｃ０７Ｄ 403/06 403/14 403/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ファーマシア・アンド・アップジョン・カ ンパニー アメリカ合衆国・ミシガン・49001・カラ マズー・ヘンリエッタ・ストリート・301 (72)発明者 ムーン，マルコム・ウィルソン アメリカ合衆国 49004 ミシガン州 カ ラマズー，ローズメア ストリート 3750 (72)発明者 モロゾウィッチ，ウォルター アメリカ合衆国 49004 ミシガン州 カ ラマズー，シカディー 5300 (72)発明者 ガオ，ピン アメリカ合衆国 49024 ミシガン州 ポ ータージ，クラウン ポイント 7191 (72)発明者 タン，ペン・チョウ アメリカ合衆国 94556 カリフォルニア 州 モラガ，カミノ リカルド 827 Ｆターム(参考） 4C063 AA01 AA03 BB03 CC06 CC34 DD03 DD04 DD06 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 BC13 BC17 BC50 GA07 GA08 GA12 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA02 ZA15 ZA36 ZA39 ZA40 ZA45 ZA54 ZA81 ZA89 ZA96 ZB08 ZB11 ZB26 ZC20 ZC35

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 ［式中， Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6は，独立して，水素，アルキル，トリハロアルキル，シ
    クロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール，ヘテロ脂
    環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，
    アリールチオ，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スルホン
    アミド，トリハロメタン−スルホンアミド，カルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−
    カルボキシ，Ｃ−アミド，Ｎ−アミド，シアノ，ニトロ，ハロ，Ｏ−カルバミル
    ，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，アミノおよび−
    ＮＲ11Ｒ12からなる群より選択され，ここで，Ｒ11およびＲ12は，独立して，水
    素，アルキル，シクロアルキル，アリール，カルボニル，アセチル，スルホニル
    ，およびトリフルオロメタンスルホニルからなる群より選択され，またはＲ11お
    よびＲ12は，これらが結合している窒素原子と一緒になって５員または６員のヘ
    テロ脂環式環を形成し，ただし，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6の少なくとも２つは水
    素であり；または Ｒ3およびＲ4，Ｒ4およびＲ5，またはＲ5およびＲ6は，一緒になって，６員のア
    リール環，メチレンジオキシ基またはエチレンジオキシ基を形成してもよく； Ｒ7は，水素，アルキル，シクロアルキル，アルケニル，アルキニル，アリール
    ，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，
    カルボニル，アセチル，Ｃ−アミド，Ｃ−チオアミド，アミジノ，Ｃ−カルボキ
    シ，Ｏ−カルボキシ，スルホニルおよびトリハロメタンスルホニルからなる群よ
    り選択され； Ｒ8，Ｒ9およびＲ10は，独立して，水素，アルキル，トリハロアルキル，シクロ
    アルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式
    ，ヒドロキシ，アルコキシ，アリールオキシ，メルカプト，アルキルチオ，アリ
    ールチオ，スルフィニル，スルホニル，Ｓ−スルホンアミド，Ｎ−スルホンアミ
    ド，カルボニル，Ｃ−カルボキシ，Ｏ−カルボキシ，シアノ，ニトロ，ハロ，Ｏ
    −カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，Ｃ
    −アミド，Ｎ−アミド，アミノおよび−ＮＲ11Ｒ12からなる群より選択され，こ
    こで，Ｒ11およびＲ12は上で定義したとおりであり； Ｒ1'は水素またはアルキルであり；および Ｒ3'およびＲ4'は，独立して，アルキルであるか，または一緒になってヘテロ脂
    環式環またはヘテロアリール環を形成し，ただし，ヘテロ脂環式環はピペリジン
    −１−イルまたはモルホリン−４−イルではない］ の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
  2. 【請求項２】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になってヘテロ脂環式環を形成する，
    請求項１記載の化合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になって，ピロリジン−１−イル，２
    −ヒドロキシメチルピロリジン−１−イル，２−カルボキシピロリジン−１−イ
    ル，または４−メチルピペラジン−１−イルを形成する，請求項１記載の化合物
    。
  4. 【請求項４】 Ｒ3'およびＲ4'が，独立して，ヒドロキシ基で任意に置換さ
    れていてもよい低級アルキルである，請求項１記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ3'およびＲ4'が２−ヒドロキシエチルである，請求項１記
    載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｒ1'およびＲ7が水素である，請求項２，３，４，または５
    のいずれかに記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，およびＲ9が水素であり，Ｒ8お
    よびＲ10が未置換低級アルキルであり；およびＲ3'およびＲ4'が一緒になってヘ
    テロ脂環式環を形成する，請求項１記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ8およびＲ10がメチルであり，およびＲ1'が水素である，
    請求項７記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｒ8およびＲ10がメチルであり，Ｒ1'が水素であり，および
    Ｒ3'およびＲ4'が一緒になって，２−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル
    または２−カルボキシ−ピロリジン−１−イルを形成する，請求項７記載の化合
    物。
  10. 【請求項１０】 Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，およびＲ7が水素であり，およびＲ8 およびＲ10が未置換低級アルキルである，請求項１記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｒ9がＣ−アミド，またはカルボキシで置換された低級ア
    ルキルであり，Ｒ1'およびＲ7が水素である，請求項１０記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 Ｒ8およびＲ10がメチルであり，およびＲ3'およびＲ4'が
    一緒になってヘテロ脂環式環を形成する，請求項１１記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になってピロリジン−１−イルを形
    成する，請求項１２記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 化合物が 【化２】 である，請求項１記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 化合物が 【化３】 である，請求項１記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になってヘテロアリール環を形成す
    る，請求項１記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｒ3'およびＲ4'が一緒になってピリジン１−イル環を形成
    する，請求項１記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6およびＲ7が水素であり，およびＲ8お
    よびＲ10が未置換低級アルキルである，請求項１７記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 Ｒ8およびＲ10がメチルである，請求項１８記載の化合物
    。
  20. 【請求項２０】 薬学的に許容しうる担体または賦形剤および請求項１記載
    の化合物を含む医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 薬学的に許容しうる担体または賦形剤および請求項１５記
    載の化合物を含む医薬組成物。
  22. 【請求項２２】 前記組成物が非経口的に投与される，請求項２０記載の医
    薬組成物。
  23. 【請求項２３】 前記組成物が非経口的に投与される，請求項２１記載の医
    薬組成物。
  24. 【請求項２４】 蛋白質キナーゼ阻害剤を投与することにより治療しうる疾
    病を有するヒトを治療する方法であって，そのヒトに治療上有効量の請求項１記
    載の化合物を投与することを含む方法。
  25. 【請求項２５】 蛋白質キナーゼ阻害剤を投与することにより治療しうる疾
    病を有するヒトを治療する方法であって，そのヒトに治療上有効量の請求項１５
    記載の化合物を投与することを含む方法。
  26. 【請求項２６】 前記疾病が，癌，血管増殖性疾患，繊維性疾患，メサンギ
    ウム細胞増殖性疾患，代謝性疾病および感染性疾病からなる群より選択される 請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 癌が，結腸直腸癌，カポジ肉腫および肺癌からなる群より
    選択される，請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 血管増殖性疾患が，関節炎および再狭窄からなる群より選
    択される，請求項２６記載の方法。
  29. 【請求項２９】 繊維性疾患が，肝硬変およびアテローム性動脈硬化症から
    なる群より選択される，請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 メサンギウム細胞増殖性疾患が，糸球体腎炎，糖尿病性ネ
    フロパシー，悪性腎硬化症，血栓性細小血管症候群，移植拒絶および糸球体症か
    らなる群より選択される，請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 代謝性疾病が，乾癬，糖尿病，創傷治癒，炎症および神経
    変性性疾病からなる群より選択される，請求項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 式（Ｉ）の化合物を製造する方法であって，式（ＩＩ）： 【化４】 の化合物を，式Ｒ1'ＣＨＯのアルデヒドの存在下で式−ＮＲ3'Ｒ4'のアミンと反
    応させる ［ここで，Ｒ1'，Ｒ3'およびＲ4'は請求項１において定義されるとおりである］
    ことを含む方法。
  33. 【請求項３３】 式（ＩＩ）の化合物のＲ3−Ｒ10基のいずれかを修飾する
    ことをさらに含む，請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 式（ＩＩ）の化合物の酸付加塩を製造することをさらに含
    む，請求項３２記載の方法。
  35. 【請求項３５】 アルデヒドがホルムアルデヒドであり，およびアミンがピ
    ロリジンである，請求項３１記載の方法。
  36. 【請求項３６】 Ｒ3−Ｒ7およびＲ9が水素であり，およびＲ8およびＲ10が
    メチルである，請求項３１記載の方法。
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