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JP2002512361A - アデノウイルスの効率的精製 - Google Patents

アデノウイルスの効率的精製

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Publication number
JP2002512361A
JP2002512361A JP2000544773A JP2000544773A JP2002512361A JP 2002512361 A JP2002512361 A JP 2002512361A JP 2000544773 A JP2000544773 A JP 2000544773A JP 2000544773 A JP2000544773 A JP 2000544773A JP 2002512361 A JP2002512361 A JP 2002512361A
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JP
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adenovirus
solution
chromatography resin
resin
anion exchange
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Application number
JP2000544773A
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イー． キャリオン、ミゲル
メンガー、マリリン
コウベスディ、イムリ
Original Assignee
ジェンベク、インコーポレイティッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ジェンベク、インコーポレイティッド filed Critical ジェンベク、インコーポレイティッド
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Abstract

(57)【要約】 アデノウイルス溶液を濃厚にする方法であって、アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの生体分子とを含有する混合溶液を、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチル、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチルからなる群から選択される結合部分を含む陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程と、このクロマトグラフィー樹脂からアデノウイルスを溶出する工程とを包含する方法。アデノウイルスに感染した細胞からアデノウイルスを精製する方法もまた提供され、当該方法は、そのような細胞を溶解する工程と、その溶解物を単一のクロマトグラフィー樹脂に付与する工程と、アデノウイルスをそのクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、３回ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスと実質的に同等に純粋なアデノウイルスを含有する画分を収集する工程とを包含する。本方法はさらに、アデノウイルス溶液中のアデノウイルス粒子数を正確に定量する方法を提供し、当該方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に、アデノウイルスサンプル溶液を付与し、そしてそこからアデノウイルスサンプル溶液を溶出する工程と、そのアデノウイルスサンプル溶液の吸光度とアデノウイルス標準溶液の吸光度とを比較する工程と、サンプル溶液中のアデノウイルス粒子数を定量する工程とを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、アデノウイルスの効率的精製に関する。
【０００２】 （発明の背景） 伝統的に、アデノウイルス粒子は、密度勾配精製プロトコールの使用により（
例えば、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配の使用により）単離されてきた。密度勾
配精製は、小規模調製に適当であるが、これは退屈でありかつ時間がかかるもの
であり、容易に規模を拡大することはできない。従って、このプロセスは商業的
には望ましくないとしばしば考えられている。
【０００３】 アデノウイルスを精製するための代替方法は、カラムクロマトグラフィーまた
はバッチクロマトグラフィーの使用である。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
クロマトグラフィー樹脂を用いるクロマトグラフィー技術によってウイルス粒子
を単離するという初期の試みが、１９５９年から１９６１年までに最初に報告さ
れた。Ｈａｒｕｎａら（Virology 13: 264-267 (1961)）は、ＤＥＡＥイオン交
換クロマトグラフィーを使用した、１型、３型、および８型アデノウイルスの精
製を報告したが、ＫｌｅｍｐｅｒｅｒおよびＰｅｒｅｉｒａ（Virology 9: 536-
545 (1959)）ならびにＰｈｉｌｉｐｓｏｎ（Virology 10: 459-465 (1960)）は
、他の型のアデノウイルスの場合に同様の方法を用いて困難性を報告した。これ
らの技術は、十中八九、クロマトグラフィーマトリクスが使用の間に崩壊する傾
向があるという結果、１９６５年以降広く用いられていなかった。さらに、当時
利用可能なクロマトグラフィー樹脂の選択性が、ウイルスのクロマトグラフィー
精製を密度勾配精製技術に及ばないものとした。
【０００４】 近年、クロマトグラフィーによるウイルス精製に対する関心が再び起きてきて
いる。例えば、Ｓｈａｂｒａｍら（WO 96/27677）およびＨｕｙｇｈｅら（Human
Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)）は、クロマトグラフィー樹脂を使用して
ウイルスを精製する方法を開示している。クロマトグラフィー用のより新しい充
填材料もまた、最近１５年間で開発されてきている。これらの充填材料は、４つ
のグループに分類することができる：（ｉ）均質な架橋多糖類（これには、良好
な捕集容量(capacity)を有するが分解能が低くかつ圧縮される傾向にある軟質ゲ
ル（例えば、アガロース）が挙げられる）；（ｉｉ）合成ポリマーに基づくマク
ロ孔質ポリマー（これには、より良好な拡散率を許容し、カラム効率、速度、お
よび分解能を向上するよう導く、大きな「スルーポア」を有するパーフュージョ
ンクロマトグラフィー樹脂が挙げられる）；（ｉｉｉ）「触手のある」吸着剤（
これは、タンパク質とのより速い相互作用のために設計された触手を有する）（
例えば、フラクトゲル）；ならびに（ｉｖ）堅い殻中の軟質ゲルに基づく材料（
これは、軟質ゲルの高い捕集容量および複合材料の堅さを利用する）（例えば、
Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）（Boschetti, J. Chromatogr. 658: 207
(1994); Rodriguez, J. Chromatogr. 699: 47-61 (1997)を参照のこと）。
【０００５】 これらの従来技術の、速度、使用の容易さ、および精製の効率、特に、大規模
な商業的精製、を増大することが望ましい。本発明は、アデノウイルス精製のた
めのそのようなプロセスを提供する。本発明のこれらのおよび他の利点ならびに
さらなる発明的特徴は、本明細書中に与えられる本発明の説明から明らかとなる
であろう。
【０００６】 （発明の簡単な要旨） 本発明は、アデノウイルス溶液を濃厚にする方法を提供する。本方法は、（ｉ
）アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの生体分子とを含有する
混合溶液を得る工程と、（ｉｉ）この混合溶液を、ジメチルアミノプロピル、ジ
メチルアミノブチル、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチ
ルからなる群から選択される結合部分を含む陰イオン交換クロマトグラフィー樹
脂に付与する工程と；（ｉｉｉ）この精製クロマトグラフィー樹脂から溶離液を
用いてアデノウイルスを溶出する工程とを包含する。本方法は、アデノウイルス
を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する前に、アデノウイルスと少な
くとも１つの所望でないタイプの生体分子とを含有する混合溶液を陰イオン交換
プレ樹脂に付与する工程をさらに包含してもよい。
【０００７】 本発明の方法はまた、アデノウイルスに感染した細胞からアデノウイルスを精
製する方法を提供する。本方法は、アデノウイルスに感染した細胞を溶解する工
程と、その溶解物を単一のクロマトグラフィー樹脂に付与する工程と、アデノウ
イルスをそのクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、アデノウイルス（こ
こで、アデノウイルスは３回ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスと実質的
に同等に純粋である）を含有する画分を収集する工程とを包含する。
【０００８】 本発明はさらに、アデノウイルス溶液（例えば、アデノウイルスに感染した細
胞由来の粗溶解物から得られる溶液）中のアデノウイルス粒子数を正確に定量す
る方法を提供し、当該方法は、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチル
、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチルからなる群から選
択される結合部分を含む陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に、アデノウイル
スサンプル溶液を付与し、そしてそこからアデノウイルスサンプル溶液を溶出す
る工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィー樹脂から溶出したアデノウイルスサンプ
ル溶液の吸光度およびアデノウイルス標準溶液の吸光度を測定する工程と、（ｉ
ｉｉ）クロマトグラフィー樹脂から溶出されたアデノウイルスサンプル溶液の吸
光度とアデノウイルス標準溶液の吸光度とを比較し、サンプル溶液中のアデノウ
イルス粒子数を定量する工程とを包含する。
【０００９】 本発明は、添付の図面および以下の好ましい実施態様の詳細な説明を参照して
最もよく理解されるであろう。
【００１０】 （好ましい実施態様の説明） 本発明は、アデノウイルスを含有する溶液を濃厚にする方法に関する。「アデ
ノウイルス」とは、天然アデノウイルスおよび組み換えアデノウイルスを意味し
、ここで、組み換えアデノウイルスは、感染性であっても非感染性であってもよ
い。本方法は、アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの生体分子
とを含有する混合溶液を得る工程を包含する。「生体分子」とは、任意の巨大分
子（例えば、任意のタンパク質、炭水化物、脂質または核酸（例えば、ＤＮＡお
よびＲＮＡ）など）ならびにそれらのフラグメントを意味する。本明細書中で用
いる「溶液」は、当該分野で通常それに帰される意味であり、細胞溶解物を包含
することがまた意図される。アデノウイルスを含有するいかなる溶液も、本発明
の方法により濃厚にすることができる。アデノウイルスの混合溶液は、通常、真
核細胞を本明細書中で定義されるアデノウイルスに感染させ、アデノウイルス粒
子数を増幅するのに十分な時間この細胞を維持し、感染した細胞を収集し、緩衝
化溶液中にてそれらを溶解する（壊して開く(break open)）ことによって得られ
る。
【００１１】 「濃厚にする」および「精製する」ならびに「濃厚にした」および「精製した
」は、所定の容量の溶液中のアデノウイルス濃度が増加しているまたは増加した
ことをそれぞれ示すべく、本明細書中で相互交換可能に用いられる。望ましくは
、濃厚にしたまたは精製したアデノウイルス溶液は、３回ＣｓＣｌ密度勾配精製
したアデノウイルスと実質的に同等に純粋である。
【００１２】 感染した細胞（すなわち、真核細胞）からウイルスを精製する場合、ウイルス
自体が細胞溶解を起こす時点まで感染を続けさせないことが好ましい。というの
は、これらの条件下では、個々の細胞が、実質的に異なる時点で溶解し、溶解し
た細胞から放出される分解性酵素が放出されたウイルスを攻撃し始めるであろう
からである。さらに、アデノウイルスが仲介する細胞溶解の直前の細胞代謝にお
いて、該株は、ウイルス複製の正確さという点で低減を引き起こし得る。それゆ
え、アデノウイルスが仲介する溶解よりも前に、細胞を溶解することが好ましい
。
【００１３】 溶解に適したいかなる方法も使用することができる。例えば、細胞および培養
培地を遠心分離し、強力な界面活性剤および他の添加剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ TM Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはデオキシコール
酸）の溶液によりこの培地を交換することができ、適当な期間のインキュベーシ
ョン後、サンプルをさらなる処理のために収集することができる。あるいは、細
胞を穏やかな遠心分離により収集して細胞ペレットを形成し、３回の凍結融解に
より溶解することができる。好ましい代替技術は、フレンチプレス、またはさら
により好ましくは、マイクロフリューダイザーの使用である。フレンチプレスお
よびマイクロフリューダイザーは、剪断力を付与して細胞膜を破裂させることに
よって、真核細胞を効率的に溶解する。この剪断力処理は、細胞（すなわち、真
核細胞）の感染した集団からアデノウイルスを含有する溶液を得るにあたり他の
適当な方法よりも、さらに迅速であり再現性がある。従って、本発明の方法によ
る精製または濃厚化のための、アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタ
イプの生体分子とを含有する混合溶液は、アデノウイルスに感染した細胞集団を
微流動化（microfluidize）することによって得ることができる。
【００１４】 アデノウイルスがそこから精製されるべき溶液が一旦得られたら、それを必要
に応じて清澄化することができる。所望であれば、そのような清澄化は、中程度
に穏やかな遠心分離工程により行われ、非常に大きな細胞デブリスおよびより大
きな破裂していない細胞小器官（もしあれば）を取り除くことができる。また、
細胞溶解物を濾過によって清澄化することができる。特に、接線流れ濾過（tang
ential flow filtration（ＴＦＦ））により、当該分野で公知の方法に従って、
細胞溶解物を清澄化および濃縮することができる。次いで、この溶液を、必要に
応じて、ＤＮＡおよびＲＮＡを消化し得る酵素（「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ」）
により処理して、アデノウイルス粒子内に含まれない、清澄化した細胞溶解物中
のいずれのＤＮＡまたはＲＮＡをも取り除くことができる。
【００１５】 細胞溶解物を清澄化した後、それを、必要に応じて、精製前に、陰イオン交換
プレ樹脂のクロマトグラフィーに付すことができる。任意の適切な陰イオン交換
クロマトグラフィー樹脂をプレ樹脂に使用できる。好ましくは、プレ樹脂に使用
すべき陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、第三級または第四級アミンで誘
導体化した表面基（例えば、ジエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチル、
またはトリメチルアミノプロピル）を有する。この表面基を、当該分野で公知の
任意の適当なリンカー基を介してマトリクス支持体に連結することができる。ア
クリル酸ポリマーリンカーは、本発明において使用に適したリンカーの１つであ
る。支持マトリクスは任意の適切な材料から構成され得るが、マトリクス支持体
が「堅い殻中の軟質ゲル」という概念に基づく材料であることが好ましい。この
「ゲルで満たされた」クロマトグラフィー樹脂により、軟質ゲル（例えば、アガ
ロース）の高い捕集容量および高流速用複合材料の堅さ、圧縮または縮小に対す
る耐性の増大、および媒体の膨潤（軟質ゲルの共通の特徴）という利点を利用し
得る。これらの「ゲルで満たされた」クロマトグラフィー樹脂は当該分野で周知
であり、例えば、米国特許第５，２６８，０９７号および同第５，６７２，２７
６号に記載されている。
【００１６】 本発明において望ましいプレ樹脂陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｑ
Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ（BioSepra, Villeneuve-La-Garenne, F
ranceから市販されている）である。Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ
は、官能化可撓性親水性ヒドロゲルで充填された高多孔性セラミック(ceramized
)ビーズ材料から構成され、平均ビーズサイズは５０μ（粒子は２５〜７５μの
範囲）である。Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆの動的捕集容量は、５
０％ブレークスルーの２００ｃｍ／ｈｒで牛血清アルブミン（ＢＳＡ）少なくと
も８５ｍｇ／ｍｌ、５０％ブレークスルーの６００ｃｍ／ｈｒでＢＳＡ少なくと
も８０ｍｇ／ｍｌである。Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆのゲルで満
たされた性質により、古典的な多孔性媒体（この場合、典型的には少なくとも粒
子外部の５０％が孔入口から構成されていて、ここで結合は起きない）と比較し
て結合に利用できるより大きな外部表面積がある。結果として、Ｑ Ｃｅｒａｍ
ｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆの全外部表面積の１００％が結合に寄与する。この特
徴により、このクロマトグラフィー樹脂は好ましいプレ樹脂材料となる。
【００１７】 あるいは、細胞溶解物を、必要に応じて、膨潤床(expanded bed)吸着陰イオン
交換プレ樹脂のクロマトグラフィーに付すことができる。例えば、第四級アミン
（例えば、トリメチルアミノメチルまたはＤＥＡＥ）で誘導体化された結合部分
を有する膨潤床吸着陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が使用できる。膨潤床
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、より大きなビーズサイズ（例えば、直
径３０μよりも大きな）により特徴付けられるが、通常、直径５００μを超えな
い。この大きなビーズサイズにより、細胞デブリスおよび全（溶解されていない
）細胞の大きなフラグメントは、クロマトグラフィー樹脂（およびその適切なサ
イズのフリット）を通って自由に流れることができる。適当な膨潤床吸着クロマ
トグラフィー樹脂には、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ（登録商標）（Pharmaci
a, Uppsala, Sweden）およびＤＥＡＥ Ｃｅｌｌｔｈｒｕ−Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ TM （Sterogene, Carlsbad, CAまたはUpFront Chromatography, Copenhagen, Den
markから得られる同等物）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】 細胞溶解物を、陰イオン交換プレ樹脂クロマトグラフィー樹脂から、任意の適
当な溶離液（例えば、６００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出する。この溶液を、もし必
要であれば、溶出緩衝液中の溶出剤または他の試剤の濃度を低くするために、適
当に希釈する。次いで、半精製し濃縮した細胞溶解物溶液を、精製に適した陰イ
オン交換クロマトグラフィー樹脂に付与し得る。
【００１９】 上記に鑑みて、本発明は、溶液をアデノウイルスについて濃厚にする方法を提
供する。本方法は、（ｉ）アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプ
の生体分子とを含有する混合溶液を得る工程と；（ｉｉ）この混合溶液を陰イオ
ン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程と；（ｉｉｉ）アデノウイルスを
クロマトグラフィー樹脂から溶離液を用いて溶出して、濃厚にしたアデノウイル
ス溶液を得る工程とを包含する。さらに、上記アデノウイルスの混合溶液を、必
要に応じて、接線流れ濾過によって清澄化してもよい。さらに、清澄化したアデ
ノウイルス混合溶液を、必要に応じて、陰イオン交換プレ樹脂を用いてクロマト
グラフィーを行うことができる。
【００２０】 この点で、本発明はまた、アデノウイルスに感染した細胞からアデノウイルス
を精製する方法を提供する。この方法は、アデノウイルスに感染した細胞を溶解
する工程と、この溶解物を単一のクロマトグラフィー樹脂に付与することによっ
て、アデノウイルスを上記クロマトグラフィー樹脂に結合させる工程と、アデノ
ウイルスをクロマトグラフィー樹脂から溶出する工程と、アデノウイルスを含有
する画分を収集する工程とを包含する。上記画分中のアデノウイルスは、３回Ｃ
ｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスと実質的に同等に純粋である。
【００２１】 任意の適当な単一クロマトグラフィー樹脂が、細胞溶解物からのアデノウイル
スの精製に使用できる。ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチル、ジメ
チルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチルからなる群から選択され
る表面基を有する任意の適当な陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が、アデノ
ウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの生体分子とを含有する混合溶液
から、アデノウイルスを精製するのに使用できる。この表面基は、好ましくは、
ジメチルアミノプロピルである。この表面基を、当該分野で公知の任意の適当な
リンカー基を介してマトリクス支持体に連結することができる。スルホンアミド
リンカーおよびアクリレートリンカーは、本発明において適当なリンカーの１つ
である。このマトリクス支持体は任意の適当な支持体から構成され得るが、マト
リクス支持体が、粒子内物質移動が最適化されるようなパーフュージョン陰イオ
ン交換クロマトグラフィー樹脂であるのが好ましい。
【００２２】 典型的パーフュージョンクロマトグラフィー樹脂は、その粒子を横断する大き
な（例えば、６，０００〜８，０００Å）孔を有する。より小さな孔のネットワ
ーク（これにより、拡散経路長が制限される）は、大きな孔直径の表面積を増大
させる。一つには孔サイズの二峰性分布により、移動相およびアデノウイルスは
、対流および拡散の両輸送を利用して、クロマトグラフィー樹脂粒子を通って入
り流れる。このようなパーフュージョンクロマトグラフィー樹脂は当該分野で周
知であり、例えば、Ａｆｅｙａｎら（J. Chromatogr. 519: 1-29 (1990)、およ
び米国特許第５，３８４，０４２号；同第５，２２８，９８９号；同第５，５５
２，０４１号；同第５，６０５，６２３号；および同第５，０１９，２７０号）
にさらに十分に記載されている。
【００２３】 本発明において適当なパーフュージョン陰イオン交換クロマトグラフィーは、
ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄ（PerSeptive Biosystems, Framingham, Massach
usettsから市販されている）である。ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄの動的捕集
容量は、マクロ孔質のスチレン−ジビニルベンゼンコポリマークロマトグラフィ
ー樹脂であり、これは、５０％ブレークスルーの１００ｃｍ／ｈｒで牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、および５％ブレークスルーの１
０００ｃｍ／ｈｒでＢＳＡ少なくとも８０ｍｇ／ｍｌである。ＰＯＲＯＳ（登録
商標）５０Ｄは、１０ｃｍのクロマトグラフィー樹脂床において１０００ｃｍ／
ｈｒで３ｂａｒ未満の圧力低下を示し、クロマトグラフィー樹脂の公称粒子サイ
ズは、約５０ミクロンである（すなわち、平均粒子サイズは２５ミクロンと１０
０ミクロンとの間である）。
【００２４】 陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、「バッチ」クロマトグラフィー樹脂
、または、好ましくは「フロースルー」構成（好ましくは、カラムの形態の、特
に、パーフュージョンクロマトグラフィー樹脂用）のいずれでも使用できる。さ
らに、本発明は、先行技術の方法とは明確に異なって、完全に秤量可能で、簡便
で、かつ迅速な、クロマトグラフィーを用いるアデノウイルス精製を提供する。
【００２５】 本発明の方法により精製したアデノウイルスは、ＣｓＣｌ密度勾配精製された
アデノウイルスよりも実質的に低い粒子対ｐｆｕ比（ｐｕ／ｐｆｕ）を有さない
。すなわち、この精製したアデノウイルスのｐｕ／ｐｆｕは、ＣｓＣｌ密度勾配
精製したアデノウイルスのものの少なくとも５０％であり、好ましくは、ＣｓＣ
ｌ密度勾配精製したアデノウイルスのものの少なくとも約８５％であり、より好
ましくは、ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスのものの少なくとも約９６
％である。さらに、クロマトグラフィーを行ったアデノウイルスの純度は、好ま
しくは、標準的な先行技術である３回ＣｓＣｌ密度勾配精製により精製したアデ
ノウイルスと分析学的に区別できないアデノウイルスの同一溶液のものを超える
（すなわち、これは、３回ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスと実質的に
同等に純粋であり、例えば、３回ＣｓＣｌ勾配精製したアデノウイルスの、少な
くとも９０％純粋であり、好ましくは、少なくとも９７％純粋であり、より好ま
しくは、少なくとも９９％純粋である）。
【００２６】 アデノウイルスは、実質的にそして適切には、適当な溶離液で陰イオン交換ク
ロマトグラフィー樹脂からそれを溶出することによって、溶液中で濃厚にされる
。典型的な適当な溶離液は、それらがクロマトグラフィー樹脂への結合に関して
アデノウイルスと競合するようイオン性である。この溶離液は、好ましくは、不
連続勾配（すなわち、２以上の段階で）または連続勾配でクロマトグラフィー樹
脂に付与される。このような勾配は、直線状、凹状、または凸状であってもよい
。適当な溶離剤は、緩衝化溶液中塩化ナトリウムである。例えば、アデノウイル
スは、約３６０ｍＭと約４７５ｍＭとの間のＮａＣｌで、より詳細には、約４１
５ｍＭ ＮａＣｌで、Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ Ｄ（登録商標）Ｆクロ
マトグラフィー樹脂から溶出し、また、約３６０ｍＭと約４５０ｍＭとの間のＮ
ａＣｌで、より詳細には、約４００ｍＭ ＮａＣｌで、ＰＯＲＯＳ（登録商標）
５０Ｄクロマトグラフィー樹脂から溶出する。
【００２７】 陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、高い溶出剤濃度で都合よく充填する
ことができる（例えば、アデノウイルスをクロマトグラフィー樹脂から溶出する
ために必要な濃度の少なくとも約７５％、好ましくは、このウイルスをクロマト
グラフィー樹脂から溶出するために必要な濃度の約８５％〜約９０％）。陰イオ
ン交換クロマトグラフィー樹脂を高い溶出剤濃度で充填することにより、特定の
不純物がその樹脂に結合しない。
【００２８】 濃厚にしたアデノウイルスの溶出は、任意の適当な流速で起こり得る。プレ樹
脂に使用される陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に典型的な流速は、約１０
０ｃｍ／ｈｒから約１，０００ｃｍ／ｈｒまで、好ましくは、約２００ｃｍ／ｈ
ｒから約５００ｃｍ／ｈｒまでである。ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミ
ノブチル、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチルからなる
群から選択される結合部分を含む陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の流速の
例は、約１００ｃｍ／ｈｒから約１，５００ｃｍ／ｈｒまで、好ましくは、約５
００ｃｍ／ｈｒから約１，２５０ｃｍ／ｈｒまでである。
【００２９】 いずれのアデノウイルスサンプル溶液（例えば、アデノウイルスに感染した細
胞由来の粗溶解物から得られる溶液）中のアデノウイルス粒子数も正確に定量す
るために、アデノウイルスサンプル溶液を前述したように調製し得る。次いで、
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に前述のアデノウイルスサンプル溶液を付
与し、そこからアデノウイルスサンプル溶液を溶出することによって、アデノウ
イルスサンプル溶液を、濃厚にし精製できる。次いで、クロマトグラフィー樹脂
から溶出したサンプルアデノウイルスの吸光度を測定する。比較のために、アデ
ノウイルス標準溶液（すなわち、既知濃度のアデノウイルス溶液）の吸光度を測
定する。サンプル溶液の吸光度と標準溶液の吸光度との比較により、サンプル溶
液中のアデノウイルス粒子の濃度（すなわち、所定容量中のアデノウイルス粒子
数）を決定する。
【００３０】 標準吸光度は、アデノウイルス濃度の範囲を示す、単一の標準吸光度または一
連のもしくは一群の標準吸光度であってもよい。サンプル吸光度および標準吸光
度は、有用な比較を行うことができる限り、同様のまたは異なる（好ましくは同
様のものであるが）形式、測定法、または単位で表されていてもよい。例えば、
適切な標準吸光度は、本発明の方法によりアデノウイルスサンプル溶液を処理し
たものと同一の方法で処理したアデノウイルス標準溶液から決定される吸光度で
あり得る。
【００３１】 アデノウイルス粒子数の定量は、サンプル吸光度と標準吸光度とを任意の適当
な方法で比較することによって達成される。例えば、サンプル吸光度および標準
吸光度は、吸光度対クロマトグラフ時間において、クロマトグラフィー樹脂から
のウイルス溶出に対応するピーク下面積の標準曲線を計算することによって比較
することができる。異なる既知濃度のアデノウイルスの吸光度をグラフ上にプロ
ットして、標準曲線を作成し得る。次いで、線形回帰分析を用いて、サンプル濃
度を決定し得る。
【００３２】 陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、溶液中濃厚になったアデノ
ウイルスまたはアデノウイルスに感染した細胞から精製されたアデノウイルスは
、高濃度の溶出剤（例えば、ＮａＣｌ）を含有し得る溶液中で得ることができる
。緩衝剤組成物は、任意の所望の緩衝剤（例えば、精製したアデノウイルスの長
期保存に適した賦形剤（安定化剤および凍結保存剤(cryopreservant)）を含有す
る、哺乳動物への注入用の滅菌等張緩衝剤（例えば、乳酸リンゲル液））に、任
意の適当な技術によって容易に変更することができる。緩衝剤組成物を変えるの
に適した技術には、透析、ダイアフィルトレーション、およびサイズ排除クロマ
トグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。適切なサイズ排除クロマ
トグラフィーマトリクスには、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−４０ＣおよびＴｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ＨＷ４０Ｆ（TosoHaas, Montgomeryville, PA）；Ｕｎｉｆｌｏ
ｗTM、ＳｕｐｅｒｆｌｏｗTM、およびＵｌｔｒａｆｌｏｗTM（Sterogene, Carls
bad, CA）；ＳｈｏｄｅｘTM（Thomson Instruments, Chantilly, VA）；ならび
にＢｉｏ−ＳｉｌTMおよびＢｉｏ−ＧｅｌTM（Bio-Rad, Hercules, CA）が挙げ
られる。これらのクロマトグラフィー樹脂の各々は、適当に低いタンパク質結合
性を有する。
【００３３】 本発明を、以下の実施例にさらに詳細に記載する。これらの実施例は、本発明
を例示するためだけに働き、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意
図するものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１ 本実施例に、粗細胞溶解物からのアデノウイルスの精製について示す。精製は
、細胞溶解物をまず清澄化し、その細胞溶解物を陰イオン交換プレ樹脂に付与し
、そしてそこから細胞溶解物を溶出し、最後に、ジメチルアミノプロピル、ジメ
チルアミノペンチル、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノペンチ
ルからなる群から選択される結合部分を含む陰イオン交換樹脂に、上記細胞溶解
物を付与し、そして当該陰イオン交換樹脂から細胞溶解物を溶出することにより
行った。
【００３５】 ＡｄＳＥＡＰおよびＡｄＶＥＧＦ121は遺伝子発現カセットを含むアデノウイ
ルスゲノムのＥ１およびＥ３領域に欠失を有するアデノウイルスベクターであり
、この場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが、アデノウイルス
ゲノムのＥ１領域で、例えば、分泌アルカリフォスファターゼ（ＡｄＳＥＡＰ）
または血管内皮増殖因子１２１（ＡｄＶＥＧＦ121）といった外来遺伝子（導入
遺伝子）に機能的に連結している。増殖培地中、血清の存在または非存在下、約
１０5〜１０6 ２９３細胞／ｍｌを含む、スピナーフラスコ、ローラーボトル、
シェーカーボトル、またはバイオリアクター内で、ＡｄＳＥＡＰおよびＡｄＶＥ
ＧＦ121を増殖した。
【００３６】 これらの細胞および培地を、どのクロマトグラフィーの前にも以下の２つの方
法のいずれかで処理した：（ａ）細胞を遠心分離により濃縮し、ＤＮａｓｅ／Ｒ
Ｎａｓｅの最適な活性に適当な緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．８，
７５ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁し、取扱説明書に従
ってマイクロフリューダイザー（Microfluidics, Newton, Massachusetts）中で
溶解し、そして濾過により清澄化した；あるいは（ｂ）細胞を取扱説明書に従っ
てマイクロフリューダイザー中で直接溶解し、濾過によって清澄化し、そして接
線流れ濾過（ＴＦＦ）により上記の適当な緩衝液中に濃縮してダイアフィルトレ
ーションを行った。両方法において、次いで、清澄化した細胞溶解物を、取扱説
明書に従って、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商
標）（Nycomed Pharma A/S, Denmark）で処理して、そして陰イオン交換プレ樹
脂に適した緩衝液中に希釈した。
【００３７】 次いで、この細胞溶解物をＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆカラムに
付与し、３６０〜４７５ｍＭ ＮａＣｌの段階勾配により溶出した。図１は、
第四級アミンクロマトグラフィー樹脂（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM
Ｆカラム）から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフであり
、これは、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ工程を行わなかった場合の、陰イオン交換プ
レカラム（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）からのアデノウイルスの
溶出を示す。濃縮し部分的に精製したウイルスのピークは、３６０、４５０、お
よび１０００ｍＭ ＮａＣｌの段階勾配で溶出した場合、約４１５ｍＭ ＮａＣ
ｌで溶出し、これは、５１分付近の１画分に含まれていた。図２は、接線流れ濾
過により清澄化し、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅで処理し、第四級アミンクロマトグ
ラフィー樹脂から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフであ
り、これは、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））を使
用した場合の、陰イオン交換プレカラム（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）からのアデノウイルスの溶出を示す。ウイルスピークの後に溶出する核酸
ピークの大きさにおける顕著な減少が観察された。
【００３８】 次いで、陰イオン交換プレカラムからの溶離液を約３０％希釈した（これは溶
出剤（この場合ＮａＣｌ）をジメチルアミノプロピルパーフュージョンクロマト
グラフィー（ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄ）カラム（これは、粗細胞溶解物か
らのアデノウイルス精製を完了するために使用した）用の溶出濃度未満の濃度ま
で希釈するのに必要である）。ＰＯＲＯＳ（登録商標）５ＯＤカラムを、３００
ｍＭ ＮａＣｌの濃度で充填した。次いで、このカラムを塩化ナトリウムの段階
勾配（３６０ｍＭ〜４５０ｍＭ）で溶出した。
【００３９】 接線流れ濾過により清澄化し、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅで処理し、第四級アミ
ンクロマトグラフィーカラムおよびジメチルアミノプロピルパーフュージョンク
ロマトグラフィーカラムから溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマト
グラフは、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄカラムからのアデノウイルスの溶出を
示す。実質的に、およそ３５分の位置で１つの鋭いピークのみが得られた。精製
したアデノウイルスの分析学的特徴付けは、アデノウイルスの純度が３回ＣｓＣ
ｌ密度勾配精製したアデノウイルスと実質的に区別できないことを示した。
【００４０】 それゆえ、細胞溶解物を濾過し、細胞溶解物を第四級アミンカラム陰イオン交
換プレカラムに付与し、細胞溶解物をそこから溶出し、最後に、細胞溶解物をジ
メチルアミノプロピル結合部分を含む陰イオン交換カラムに付与し、そしてそこ
から溶出することによって、アデノウイルスを粗細胞溶解物から精製した。
【００４１】 実施例２ 本実施例に、粗細胞溶解物からのアデノウイルスの精製について示す。まず細
胞溶解物を清澄化し、細胞溶解物を膨潤床吸着陰イオン交換プレカラムに付与し
、細胞溶解物をそこから溶出し、最後に細胞溶解物を、ジメチルアミノプロピル
、ジメチルアミノペンチル、ジメチルアミノイソブチル、およびジメチルアミノ
ペンチルからなる群から選択される結合部分を含む陰イオン交換カラムに付与し
、そしてそこから溶出することによって、精製を行った。
【００４２】 ＡｄＳＥＡＰ（実施例１で記載したアデノウイルスベクター）を、約１０5〜
１０6 ２９３細胞／ｍｌを含むスピナーフラスコ中で増殖させた。これらの細
胞および培地を取扱説明書に従って、マイクロフリューダイザー中で溶解した。
その細胞溶解物をＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ（登録商標）Ｅｘｐａｎｄｅｄ
Ｂｅａｄ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ陰イオン交換プレカラム（Pharmacia, Uppsa
la, Sweden）に付与した（大きなデブリスおよび溶解していない細胞を取り除く
ため）。Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ（登録商標）カラムはまた、アデノウイ
ルスを精製し濃縮するために部分的に機能した。図３は、膨潤床吸着クロマトグ
ラフィー樹脂から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフであ
り、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ（登録商標）カラムからのアデノウイルスの
溶出を示す。ウイルスのピークは、約６００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分１４
（１画分／分）に含まれていた。Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ（登録商標）カ
ラムからの溶離液を約１：２に希釈した。この希釈は、ＰＯＲＯＳ（登録商標）
５０Ｄカラム（これは次で使用した）用の溶出濃度未満の濃度にまで、溶出剤（
この場合ＮａＣｌ）を希釈するために必要であった。
【００４３】 アデノウイルスを完全に精製するためにＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄカラム
を使用した。ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄを３００ｍＭ ＮａＣｌの濃度で充
填した。次いで、このカラムを塩化ナトリウムの直線勾配（３６０ｍＭ〜４５０
ｍＭ）で溶出した（ここで、アデノウイルスはＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄカ
ラムから溶出した）。膨潤床吸着クロマトグラフィー樹脂およびジメチルアミノ
プロピルパーフュージョンクロマトグラフィー樹脂から溶出したアデノウイルス
感染細胞溶解物のクロマトグラフは、３６０ｍＭから４５０ｍＭまでのＮａＣｌ
の直線勾配で溶出した場合、およそ１５分の位置で実質的に１つの鋭いピークの
みを示し、ウイルスは、約４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。精製したアデノウ
イルスの分析学的特徴付けは、アデノウイルスの純度が実質的に３回ＣｓＣｌ密
度勾配精製したアデノウイルスとは区別できないことを示した（図４を参照のこ
と）。
【００４４】 それゆえ、細胞溶解物を濾過し、その細胞溶解物を膨潤床陰イオン交換プレカ
ラムに付与し、そしてそこから細胞溶解物を溶出し、最後に、細胞溶解物をジメ
チルアミノプロピル結合部分を含む陰イオン交換カラムに付与しそしてそこから
細胞溶解物を溶出することによって、アデノウイルスを精製した。
【００４５】 実施例３ 本実施例に、従来技術の方法とは全く異なり、単一のクロマトグラフィーカラ
ムによる粗細胞溶解物からのアデノウイルスの精製について示す。ここでこの精
製は、３回ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスの少なくとも９５％純粋で
あった。さらに、この技術は、粗溶解物中の全ウイルス粒子数を定量するための
迅速で正確な方法を提供する。
【００４６】 ＡｄＳＥＡＰ（実施例１に記載のアデノウイルスベクター）を、実施例１、方
法（ａ）でのようにして増殖させ溶解した。全細胞溶解物を３６０ｍＭ ＮａＣ
ｌ中ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄカラムに付与した。このカラムを実施例１に
示したようにして溶出し、図６に示される吸光度（２６０ｎｍおよび２８０ｎｍ
）対時間（分）のクロマトグラフを得た。ピーク画分の分析学的特徴付けは、こ
の精製が３回ＣｓＣｌ密度勾配精製したアデノウイルスと区別できないことを示
した（図５および６）。図中、上部の水平線は、実際のＮａＣｌ濃度を示す導電
率のインライン測定である。実質的重なりおよび２８０ｎｍでのピーク吸光度（
クロマトグラフの下の方のトレース）に対する２６０ｎｍでのピーク吸光度（ク
ロマトグラフの上の方のトレース）の比は、１．２７（１．２５±０．０８が、
純粋なウイルスの経験的に決定された比であった）であり、これは、このウイル
スが実質的に純粋であることを示していた。重なっていないピーク（すなわち二
次ピーク）が存在しないこともまた、このウイルスが実質的に純粋であることを
示していた。
【００４７】 既知濃度のアデノウイルスの様々な溶液を３６０ｍＭ ＮａＣｌ中ＰＯＲＯＳ
（登録商標）５０Ｄカラムに付与した。このカラムを実施例１に示したようにし
て溶出し、吸光度（２６０および２８０ｎｍ）対溶出時間（分）をクロマトグラ
フした。アデノウイルス溶出に対応するピーク下面積をそれぞれの異なる濃度に
ついて測定し、面積対アデノウイルス濃度のグラフとしてプロットした。アデノ
ウイルス溶出に対応する図５のＡｄＳＥＡＰクロマトグラフの曲線下面積を計算
し、線形回帰を用いて標準曲線と比較し、そして粗溶解物が４．６４×１０10ｐ
ｕ／ｍＬを含有することを決定した。
【００４８】 このように、本発明は、アデノウイルスを全細胞溶解物から精製するための単
一工程の方法を提供する。それゆえ、アデノウイルス（これは、３回ＣｓＣｌ密
度勾配精製したアデノウイルスの少なくとも９５％純粋であった）を、単一のク
ロマトグラフィーカラムにより、粗細胞溶解物から精製した。さらに、粗細胞溶
解物中の全アデノウイルス数を、迅速かつ正確に定量した。
【００４９】 実施例４ 本実施例に、陰イオン交換カラムから単離されるアデノウイルスの緩衝剤組成
物を容易に変更することができることを示す（例えば、高塩濃度から低塩濃度に
）。
【００５０】 実施例１で単離したアデノウイルス含有溶液の約０．１カラム容量（０．０１
カラム容量〜約０．２５カラム容量）を、哺乳動物への注入用であって精製した
アデノウイルスの長期保存に適した賦形剤（安定剤および凍結保存剤）を含有す
る適当な滅菌等張緩衝液（例えば、乳酸リンゲル液）で平衡化したＴｏｙｏｐｅ
ａｒｌ ＨＷ−４０ＣカラムまたはＵｎｉｆｌｏｗ ４カラムに付与した。アデ
ノウイルスを含有するカラム画分を、インライン分光法により同定し、保持した
。精製したウイルスは、約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．８）、７５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、および種々の安定剤を含有する緩衝液に含まれていた。
【００５１】 本明細書中で引用される、特許、特許出願、および刊行物を含むすべての参考
文献は、参照することによりその全体が本明細書中に援用される。
【００５２】 好ましい実施態様を強調して本発明を記載してきたが、好ましい実施態様の変
更を用い得ること、本明細書中で具体的に記載したもの以外で本発明を実施し得
ることが意図されることは当業者に明らかであろう。従って、本発明は、付帯す
る特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲内に包含されるすべ
ての改変を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、第四級アミンクロマトグラフィー樹脂（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐ
ｅｒＤTM Ｆ）から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフで
ある。ここで、ｙ軸は吸光度（２６０および２８０ｎｍ）を示し、ｘ軸は溶出時
間（分）を示し、平行なｙ軸（右側）は導電率（破線；ｍｓ）により測定された
カラム中の溶出剤を示す。
【図２】 図２は、接線流れ濾過により清澄化し、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ（Ｂｅｎｚｏ
ｎａｓｅ（登録商標））で処理し、第四級アミンクロマトグラフィー樹脂（Ｑ
Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）から溶出したアデノウイルス感染細胞溶
解物のクロマトグラフである。ここで、ｙ軸は吸光度（２６０および２８０ｎｍ
）を示し、ｘ軸は溶出時間（分）を示し、平行なｙ軸（右側）は導電率（破線；
ｍｓ）により測定したカラム中の溶出剤を示す。
【図３】 図３は、膨潤床吸着クロマトグラフィー樹脂（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ
（登録商標））から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフで
ある。ここで、ｙ軸は吸光度（２６０および２８０ｎｍ）を示し、ｘ軸は溶出時
間（分）を示し、平行なｙ軸（右側）は、導電率（破線）、ミリジーメンス（ｍ
ｓ）により測定されるカラム中の溶出剤を示す。
【図４】 図４は、３回ＣｓＣｌ勾配遠心分離により精製し、ジメチルアミノプロピルパ
ーフュージョン（ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０Ｄ）分析スケールカラムを用いて
定量したアデノウイルス感染細胞溶解物のクロマトグラフである。ここで、ｙ軸
は吸光度（２６０および２８０ｎｍ）を示し、ｘ軸は溶出時間（分）を示す。
【図５】 図５は、膨潤床吸着クロマトグラフィー樹脂（Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＱＸＬ
（登録商標））から溶出し、ジメチルアミノプロピルパーフュージョンクロマト
グラフィー樹脂（ＰＯＲＯＳ（登録商標）５ＯＤ）から２回溶出したアデノウイ
ルス感染細胞溶解物のクロマトグラフである。ここで、ｙ軸は吸光度（２６０お
よび２８０ｎｍ）を示し、ｘ軸は溶出時間（分）を示す。
【図６】 図６は、ジメチルアミノプロピルパーフュージョンクロマトグラフィー樹脂（
ＰＯＲＯＳ（登録商標）５ＯＤ）から溶出したアデノウイルス感染細胞溶解物の
クロマトグラフである。ここで、ｙ軸は吸光度（２６０および２８０ｎｍ）を示
し、ｘ軸は溶出時間（分）を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月２０日（２０００．７．２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】 アデノウイルスを精製するための代替方法は、カラムクロマトグラフィーまた
はバッチクロマトグラフィーの使用である。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
クロマトグラフィー樹脂を用いるクロマトグラフィー技術によってウイルス粒子
を単離するという初期の試みが、１９５９年から１９６１年までに最初に報告さ
れた。Ｈａｒｕｎａら（Virology 13: 264-267 (1961)）は、ＤＥＡＥイオン交
換クロマトグラフィーを使用した、１型、３型、および８型アデノウイルスの精
製を報告したが、ＫｌｅｍｐｅｒｅｒおよびＰｅｒｅｉｒａ（Virology 9: 536-
545 (1959)）ならびにＰｈｉｌｉｐｓｏｎ（Virology 10: 459-465 (1960)）は
、他の型のアデノウイルスの場合に同様の方法を用いて困難性を報告した。これ
らの技術は、十中八九、クロマトグラフィーマトリクスが使用の間に崩壊する傾
向があるという結果、１９６５年以降広く用いられていなかった。さらに、当時
利用可能なクロマトグラフィー樹脂の選択性が、ウイルスのクロマトグラフィー
精製を密度勾配精製技術に及ばないものとした。Ｂｉｇｗｏｏｄら（EP 0213719 ）は、２〜４個のメチレン基で分けられた２〜４個のアミン基を含むポリアミン で官能化したクロマトグラフィー樹脂を教示している。しかし、Ｂｉｇｗｏｏｄ らは、ウイルスまたは他の生物学的物質を精製するためにそのような樹脂を使用 することを教示していない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】 近年、クロマトグラフィーによるウイルス精製に対する関心が再び起きてきて
いる。例えば、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅら（WO 98/00524）、Ｓｈａｂｒａｍら（Hum an Gene Therapy 8: 453-65 (1997)）、 Ｓｈａｂｒａｍら（WO 96/27677）およ
びＨｕｙｇｈｅら（Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)）は、クロマトグ
ラフィー樹脂を使用してウイルスを精製する方法を開示している。クロマトグラ
フィー用のより新しい充填材料もまた、最近１５年間で開発されてきている。こ
れらの合成ポリマー（これには、より良好な拡散率を許容し、カラム効率、速度
、および分解能を向上するよう導く、大きな「スルーポア」を有するパーフュー
ジョンクロマトグラフィー樹脂が挙げられる）；（ｉｉｉ）「触手のある」吸着
剤（これは、タンパク質とのより速い相互作用のために設計された触手を有する
）（例えば、フラクトゲル）；ならびに（ｉｖ）堅い殻中の軟質ゲルに基づく材
料（これは、軟質ゲルの高い捕集容量および複合材料の堅さを利用する）（例え
ば、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）（Boschetti, J. Chromatogr. 658:
207 (1994); Rodriguez, J. Chromatogr. 699: 47-61 (1997)を参照のこと）。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月２３日（２０００．１０．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】 近年、クロマトグラフィーによるウイルス精製に対する関心が再び起きてきて
いる。例えば、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅら（WO 98/00524）、Ｓｈａｂｒａｍら（Hum
an Gene Therapy 8: 453-65 (1997)）、Ｓｈａｂｒａｍら（WO 96/27677）およ
びＨｕｙｇｈｅら（Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)）は、クロマトグ
ラフィー樹脂を使用してウイルスを精製する方法を開示している。クロマトグラ
フィー用のより新しい充填材料もまた、最近１５年間で開発されてきている。こ
れらの充填材料は、４つのグループに分類することができる：（ｉ）均質な架橋 多糖類（これには、良好な捕集容量(capacity)を有するが分解能が低くかつ圧縮 される傾向にある軟質ゲル（例えば、アガロース）が挙げられる）；（ｉｉ） 合
成ポリマーに基づくマクロ孔質ポリマー（これには、より良好な拡散率を許容し
、カラム効率、速度、および分解能を向上するよう導く、大きな「スルーポア」
を有するパーフュージョンクロマトグラフィー樹脂が挙げられる）；（ｉｉｉ）
「触手のある」吸着剤（これは、タンパク質とのより速い相互作用のために設計
された触手を有する）（例えば、フラクトゲル）；ならびに（ｉｖ）堅い殻中の
軟質ゲルに基づく材料（これは、軟質ゲルの高い捕集容量および複合材料の堅さ
を利用する）（例えば、Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤTM Ｆ）（Boschetti, J
. Chromatogr. 658: 207 (1994); Rodriguez, J. Chromatogr. 699: 47-61 (199
7)を参照のこと）。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月７日（２００１．３．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コウベスディ、イムリ アメリカ合衆国、メリーランド州 20855、 ロックヴィル、ウォーブラー レイン 7713 Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BA20 BB12 CB21 DA77 FA27 FB06 GC10 4B065 AA95X BD14 CA46 【要約の続き】 イルスサンプル溶液を溶出する工程と、そのアデノウイ ルスサンプル溶液の吸光度とアデノウイルス標準溶液の 吸光度とを比較する工程と、サンプル溶液中のアデノウ イルス粒子数を定量する工程とを包含する。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 溶液をアデノウイルスについて濃厚にする方法であって、 （ｉ）アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの生体分子とを含有
    する混合溶液を得る工程と、 （ｉｉ）ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチル、ジメチルアミノイソ
    ブチル、およびジメチルアミノペンチルからなる群から選択される結合部分を含
    む陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に該混合溶液を付与することにより、該
    アデノウイルスが該クロマトグラフィー樹脂に結合する工程と、 （ｉｉｉ）溶離液により該アデノウイルスを該クロマトグラフィー樹脂から溶出
    することにより、濃厚にしたアデノウイルス溶液を得る工程 とを包含する方法。
  2. 【請求項２】 前記結合部分がジメチルアミノプロピルである、請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 前記溶離液が連続または非連続勾配の溶離液である、請求項
    １または２のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記溶離液が、塩化ナトリウムの勾配を含む勾配溶離液であ
    る、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂がパーフュージョ
    ン陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である、請求項１〜４のいずれかに記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 前記アデノウイルスと少なくとも１つの所望でないタイプの
    生体分子とを含有する混合溶液が、アデノウイルスに感染した細胞集団を微流動
    化することによって得られるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 前記方法が、（ｉ’）前記アデノウイルスと少なくとも１つ
    の所望でないタイプの生体分子とを含有する混合溶液を陰イオン交換プレ樹脂に
    付与し、該アデノウイルスを該プレ樹脂から溶出し、次いで、工程（ｉｉ）にお
    いて、該混合溶液を付与するかわりに、該プレ樹脂から溶出された該アデノウイ
    ルスを前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に付与する工程、をさらに包含
    する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記陰イオン交換プレ樹脂が第四級アミン樹脂である、請求
    項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記陰イオン交換プレ樹脂が平面吸着樹脂または膨潤床吸着
    樹脂である、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記アデノウイルスを前記陰イオン交換クロマトグラフィ
    ー樹脂から溶出するのに必要とされる溶出剤濃度の少なくとも約７５％の溶出剤
    を含有する溶液において工程（ｉｉ）が行われる、請求項１〜９のいずれかに記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記混合溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に接
    触させる工程が、前記アデノウイルスを該陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂
    から溶出するのに必要とされる溶出剤濃度の約８５％〜約９０％の溶出剤を含有
    する溶液において行われるものである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 サンプル溶液中のアデノウイルス粒子数を正確に定量する
    方法であって、 （ｉ）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法に従ってアデノウイルスサンプル
    溶液を濃厚にする工程と； （ｉｉ）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法に従って濃厚にしたサンプル溶
    液の吸光度およびアデノウイルス標準溶液の吸光度を測定する工程と； （ｉｉｉ）該サンプル溶液の吸光度と該標準溶液の吸光度とを比較する工程と；
    （ｉｖ）該サンプル溶液中のアデノウイルス粒子数を定量する工程 とを包含する方法。
  13. 【請求項１３】 前記サンプル溶液がアデノウイルスに感染した細胞の粗細
    胞溶解物から調製されるものである、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 アデノウイルスに感染した細胞からアデノウイルスを精製
    する方法であって、該細胞を溶解する工程と、当該溶解物を単一のクロマトグラ
    フィー樹脂に付与することによって、該アデノウイルスを該クロマトグラフィー
    樹脂に結合させる工程と、該アデノウイルスを該クロマトグラフィー樹脂から溶
    出する工程と、該アデノウイルス（ここで、該アデノウイルスは３回ＣｓＣｌ密
    度勾配精製したアデノウイルスと実質的に同等の純度である）を含有する画分を
    収集する工程とを包含する方法。
  15. 【請求項１５】 サンプル溶液中のアデノウイルス粒子数を正確に定量する
    方法であって、 （ｉ）請求項１４に記載の方法に従ってアデノウイルスサンプル溶液を精製する
    工程と； （ｉｉ）請求項１４に記載の方法に従って精製したサンプル溶液の吸光度および
    アデノウイルス標準溶液の吸光度を測定する工程と； （ｉｉｉ）該サンプル溶液の吸光度と該標準溶液の吸光度とを比較する工程と；
    （ｉｖ）該サンプル溶液中のアデノウイルス粒子数を定量する工程 とを包含する方法。
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