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CN110325203A - 与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的模式化给药 - Google Patents

与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的模式化给药 Download PDF

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CN110325203A
CN110325203A CN201880013424.8A CN201880013424A CN110325203A CN 110325203 A CN110325203 A CN 110325203A CN 201880013424 A CN201880013424 A CN 201880013424A CN 110325203 A CN110325203 A CN 110325203A
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CN
China
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post dose
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CN201880013424.8A
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English (en)
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彼得·伊雷因斯基
塔卡什·凯·基什莫托
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Silicota Biotechnology Co
Original Assignee
Silicota Biotechnology Co
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Publication date
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Abstract

本文中提供了用于施用病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体的方法和相关组合物。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物实现了改善的转基因表达和/或免疫应答降低，例如下调的IgM和/或IgG免疫应答。

Description

与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的模式化给药
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119要求2017年1月7日提交的美国临时申请号62/443,658、2017年1月12日提交的美国临时申请号62/445,637和2017年8月14日提交的美国临时申请号62/545,412的优先权权益，其各自的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
本发明至少部分地涉及用于施用病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体的方法和相关组合物。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物实现了提高的转基因表达和/或降低的针对病毒载体的免疫应答，例如下调的IgM和/或IgG免疫应答。
发明概述
在一个方面，提供了一种方法，其包括：向对象共施用第一轮病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体，以及在第一轮共施用之前和/或之后的一个或更多个时间点施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体，其中包含免疫抑制剂之合成纳米载体的之前和/或之后施用分别在第一轮共施用之前或之后1个月、2周、1周、1天、12小时、6小时、1小时、30分钟或15分钟内进行。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括向所述对象共施用第二轮病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体，以及在第二轮共施用之前和/或之后的一个或更多个时间点施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体，其中包含免疫抑制剂之合成纳米载体的之前和/或之后施用分别在第二轮共施用之前或之后1个月、2周、1周、1天、12小时、6小时、1小时、30分钟或15分钟内进行。
在一个方面，提供了一种方法，其包括：向对象共施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体和病毒载体，以及在没有病毒载体的情况下向所述对象施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体的至少一个前剂量和/或至少一个后剂量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，向所述对象施用至少一个前剂量和至少一个后剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，向所述对象施用至少两个前剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，向所述对象施用至少两个后剂量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，在所述对象中重复共施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对于每个重复的共施用步骤，在没有病毒载体的情况下向所述对象施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体的至少一个前剂量和/或至少一个后剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少一个前剂量和至少一个后剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少两个前剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少两个后剂量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1个月内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2周内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1周内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后3天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后12小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后6小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后30分钟内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后15分钟内进行。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量和/或后剂量在共施用步骤的3天内施用。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量和/或后剂量在共施用步骤的2天内施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个后剂量在共施用步骤之后每两周一次地施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量的免疫抑制剂的量与每个共施用步骤的免疫抑制剂的量相同。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个后剂量的免疫抑制剂的量与每个共施用步骤的免疫抑制剂的量相同。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量、后剂量和/或共施用步骤通过静脉内施用。
在一个方面，提供了一种方法，其包括：对于第一对象，(1)共施用(a)包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的剂量和(b)病毒载体的剂量，以及(2)在没有病毒载体的剂量的情况下，施用(c)包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的前剂量和/或后剂量，其中(a)和(c)的免疫抑制剂的量一起等于(d)的免疫抑制剂的量，(d)为包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的剂量，当在没有与合成纳米载体偶联的免疫抑制剂的前剂量或后剂量的情况下与病毒载体共施用时，其在第二对象中降低针对病毒载体的免疫应答或提高病毒载体的转基因表达。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，(c)的前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量不超过(d)的量的一半。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，(c)的前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量是(d)的量的一半。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，在(c)中向第一对象施用前剂量和后剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，(c)的前剂量和后剂量的免疫抑制剂的量相同。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，(a)的免疫抑制剂的量与(c)的前剂量或后剂量的量相同。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，在(c)中向第一对象施用至少两个前剂量。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，在(c)中向第一对象施用至少两个后剂量。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，重复(1)和(2)。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1个月内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2周内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1周内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后3天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1天内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后12小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后6小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1小时内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后30分钟内进行。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后15分钟内进行。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量和/或后剂量在共施用步骤的3天内施用。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量和/或后剂量在共施用步骤的2天内施用。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个后剂量在共施用步骤之后每两周一次地施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，每个前剂量、后剂量和/或共施用步骤通过静脉内施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，病毒载体包含一个或更多个表达控制序列。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，一个或更多个表达控制序列包含肝特异性启动子。在提供的任一种方法的一个实施方案中，一个或更多个表达控制序列包含组成型启动子。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括在一个或更多个时间点评估所述对象中针对病毒载体的IgM和/或IgG应答。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，评估IgM和/或IgG应答的时间点中的至少一个在共施用之后。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，将病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体混合用于每次共施用。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，腺相关病毒载体是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11腺相关病毒载体。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，共施用和/或前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂是NF-κB途径的抑制剂。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，共施用和/或前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂是mTOR抑制剂。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，mTOR抑制剂是雷帕霉素。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，免疫抑制剂包封在合成纳米载体中。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，共施用和/或前剂量和/或后剂量的合成纳米载体包含：脂质纳米粒、聚合物纳米粒、金属纳米粒、基于表面活性剂的乳剂、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，合成纳米载体包含聚合物纳米粒。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，聚合物纳米粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基唑啉或聚乙烯亚胺。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，聚合物纳米粒包含聚酯或与聚醚连接的聚酯。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，聚合物纳米粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，使用动态光散射获得的合成纳米载体群体的颗粒尺寸分布的平均值为直径大于110nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径大于150nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径大于200nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径大于250nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于5μm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于4μm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于3μm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于2μm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于1μm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于750nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于500nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于450nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于400nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于350nm。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，直径小于300nm。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，基于合成纳米载体之间的平均值，合成纳米载体中包含的免疫抑制剂的负载为0.1％至50％(重量/重量)。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，负载为0.1％至25％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，负载为1％至25％。在所提供的任一种方法的一个实施方案中，负载为2％至25％。
在所提供的任一种方法的一个实施方案中，合成纳米载体群体的纵横比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
在一个方面，提供了药盒(kit)，其包含一个或更多个本文中提供的任一种前剂量或一个或更多个本文中提供的任一种后剂量，各自例如如权利要求中任一项所述，以及用于与病毒载体共施用的本文中提供的任一种包含免疫抑制剂之合成纳米载体的剂量。
在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，所述药盒还包含本文中提供的任一种病毒载体的剂量。
在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，所述药盒包含一个或更多个本文中提供的任一种前剂量和一个或更多个本文中提供的任一种后剂量。
在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，所述药盒还包含使用说明书。在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，使用说明书包含用于实施本文中提供的任一种方法的说明书。
在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，用于与病毒载体共施用的包含免疫抑制剂之合成纳米载体是本文中提供的(例如，如权利要求中任一项所述的)任一种包含免疫抑制剂之合成纳米载体。
在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，病毒载体是本文中提供的(例如，如权利要求中任一项所述的)任一种病毒载体。
在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，包含免疫抑制剂之合成纳米载体的之前和/或之后施用不包括施用病毒载体。
在另一个方面，提供了包含本文中提供的任一种方法的合成纳米载体中的任一种或组合的药盒。在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，所述药盒还包含本文中提供的任一种方法的病毒载体。在所提供的任一种药盒的一个实施方案中，所述药盒还包含本文中提供的任一种方法的一个或更多个前剂量和/或后剂量。
附图简述
图1A和1B示出了在有和没有含雷帕霉素之合成纳米载体的情况下的SEAP活性和AAV IgG抗体水平。
图2A和2B分别示出了在d19和d75的SEAP活性。图2C示出了d19和d75二者的AAVIgG抗体水平。
图3A示出了SEAP表达动态。图3B示出了在d12和d19的AAV IgG抗体水平。
图4A和4B示出了AAV和含雷帕霉素之合成纳米载体的体积尺寸分布。
图5A示出了在AAV施用之后d5和d10的血清AAV IgM。图5B示出了d7、d12、d19和d89的血清AAV IgM。
图6示出了d7的AAV IgM相对于纵轴AAV驱动的SEAP表达。
图7示出了d7、d12、d19和d33的AAV IgG抗体水平。
图8示出了SEAP表达动态(d7至d47)。
图9示出了d5和d13的AAV IgM抗体水平。
图10示出了d9、d13和d20的AAV IgG抗体水平。
图11A是示出了在用AAV-SEAP±含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])的初始AAV接种之后在特定时间的SEAP表达动态的图。图11B是示出了在用AAV-SEAP±含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])的初始AAV接种之后在不同时间点的AAV IgG形成的图。
图12是示出了在用AAV-SEAP±含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])注射之后在特定时间的SEAP表达动态的图。
图13A是示出了AAV8预免疫的小鼠中特定时间的AAV驱动的SEAP表达动态的图。图13B是示出了利用SVP[Rapa]施用的不同组合和方案时不同时间点的AAV IgG形成的图。
图14A是示出了具有低AAV IgG的小鼠中并且在含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])的两个剂量之后的SEAP表达动态的图。图14B是示出了d139的SEAP表达的图，其比较了在AAV加强(d92)时接受含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])零个或一个剂量的组和在AAV加强(d92)时接受含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])的两个剂量的组。图14C是示出了在AAV-(RFP/SEAP)施用之后的特定时间点的AAV IgG动态的图。图14D是示出了d153的AAV IgG和SEAP活性之间的负相关性的图。
图15A是示出了根据不同SVP[Rapa]施用方案在第一次AAV注射之后的血清SEAP动态的图。图15B是示出了在AAV载体和含雷帕霉素之合成纳米载体(SVP[Rapa])共注射之后进行不同SVP[Rapa]施用方案之后的AAV IgG的图。
图16示出了在用AAV和SVP[Rapa]共注射然后用不同的SVP[Rapa]方案处理的组中d116的AAV IgG测量。
图17A是示出了在不同时间点(AAV初免剂量之后的天数)的SEAP动态(AAV-SEAP，1×1010VG；d0/125)的图。图17B是示出ELISA结果的图。该图示出了不同处理方案之后的AAVIgG水平(在d7、d12、d19、d47和d75)。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于特别示例的材料或工艺参数，因为其当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，并且不旨在限制使用替代术语来描述本发明。
本文(无论是上文还是下文)中引用的所有出版物、专利和专利申请，均通过引用整体并入本文以用于所有目的。通过引用的此类并入并不旨在承认本文中引用的任何并入的出版物、专利和专利申请构成现有技术。
除非另有明确规定，否则本说明书和所附权利要求中使用的没有数量词修饰的名词包括复数指示物。例如，提及“聚合物”包括两种或更多种这样的分子的混合物或不同分子量的单一聚合物种类的混合物，提及“合成纳米载体”包括两种或更多种这样的合成纳米载体的混合物或多种这样的合成纳米载体，提及“DNA分子”包括两种或更多种这样的DNA分子的混合物或多种这样的DNA分子，提及“免疫抑制剂”包括两种或更多种这样的免疫抑制剂分子的混合物或多种这样的免疫抑制剂分子等。
本文中使用的术语“包括”或其变化形式如“包含”或“含有”应解读为表示包括任何所列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/过程步骤或限制)的组，但不排除任何其他的整体或整体的组。因此，本文中使用的术语“包括”是包括性的，并且不排除另外的未列举的整体或方法/过程步骤。
在本文中提供的任一种组合物和方法的实施方案中，“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”代替。短语“基本上由...组成”在本文中用于要求指定的整体或步骤以及不会实质性影响要求保护之发明的特征或功能的那些。本文中使用的术语“由...组成”用于表示只存在列举的整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/加工步骤或限制)或整体(例如特征、要素、特性、属性、方法/加工步骤或限制)的组。
A.介绍
病毒载体，例如基于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的那些，已经在治疗应用(例如基因治疗)中显示出巨大的潜力。然而，由于病毒抗原暴露导致的免疫原性，病毒载体在基因治疗和其他应用中的使用受到限制。暴露于病毒载体的对象通常表现出免疫应答，并且最终结果是获得对病毒载体的抗性和/或面临显著的炎性反应。针对病毒载体的细胞免疫应答和体液免疫应答两者均可降低效力和/或降低使用此类治疗的能力，例如在重复施用的情况下。这些免疫应答包括抗体、B细胞和T细胞应答，并且可以对病毒载体的病毒抗原(例如病毒衣壳或外壳蛋白或其肽)具有特异性。
本发明人已令人惊讶地发现，包含包含免疫抑制剂之合成纳米载体的前剂量和/或后剂量与合成纳米载体和病毒载体的共施用的组合可以实现改善的免疫应答降低和/或改善的转基因表达。相比于仅共施用合成纳米载体和病毒载体(没有前剂量或后剂量)，这样的改善是显著的。例如，如实施例中所示，证明了在未免疫()动物和AAV免疫动物中，在与含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的嗜肝AAV8载体的注射之前和/或之后另外地施用含雷帕霉素之合成纳米载体在初始和随后注射之后均保持最高和最稳定的转基因表达水平。这与最低的AAV抗体应答相结合。
此外，还令人惊讶地发现，与单独的共施用步骤(没有前剂量或前剂量)相比，通过前剂量或后剂量，共施用步骤的免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)的量可降低。因此，在本文中提供的任一种治疗方案中，免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)的量可以“分成”前剂量和/或后剂量和共施用剂量。例如，实施例证明了，相对于将相同总剂量的免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)简单地与AAV载体共注射，将免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)的剂量分成两部分并在AAV载体与第二半剂量共注射之前施用第一半剂量在转基因表达和对抗病毒IgG的抑制作用两方面都是有益的。
另外，已令人惊讶地发现，病毒载体施用可能在病毒载体施用之后不久导致强烈的IgM免疫应答。还已发现，在一些实施例中，包含免疫抑制剂并且在相对于病毒载体施用的时间施用的合成纳米载体以IgM依赖性的方式诱导升高的转基因表达。具体地，发现合成纳米载体下调对腺相关病毒载体的IgM免疫应答的诱导，并且早期IgM水平与转基因表达呈负相关，病毒载体施用之后的高的IgM抗体水平与低水平的转基因表达相关，反之亦然。此外，发现这种相关性在另外施用病毒载体之后仍然存在。在这些发现之前，发现包含免疫抑制剂之合成纳米载体下调针对许多抗原(包括可溶性蛋白质和病毒颗粒)的IgG抗体应答。然而，对于病毒载体施用，其他免疫应答(例如IgM抗体应答)在某些情况下对于例如转基因表达同样重要。
因此，本发明人已令人惊讶和出人意料地发现上述问题和限制可以通过实施本文中公开的本发明来克服。提供了方法和组合物，其给出了有效使用病毒载体进行治疗的前述障碍的解决方案。本文中提供了用以下来治疗对象的方法和组合物：与无数不同给药方案中的包含免疫抑制剂之合成纳米载体结合、特别是与包含免疫抑制剂之合成纳米载体的前剂量和/或后剂量结合的包含本文中提供的任一种病毒载体构建体的病毒载体。所提供的方法和相关组合物可以允许改善的病毒载体的使用并且可以使不期望的免疫应答(例如IgM和/或IgG免疫应答)降低，和/或得到改善的效力，例如通过提高的转基因表达。
现在将在下文更详细地描述本发明。
B.定义
“施用”意指以药理学有用的方式向对象提供或分配物质。该术语旨在包括“导致施用(causing to be administered)”。“导致施用”意指直接或间接地导致、督促、鼓励、协助、诱导或指导另一方施用所述物质。除非另有说明，否则当涉及施用之间的时期时，该时期是施用的开始之间的时间。
本文中使用的“共施用”是指在同一时间或基本上在同一时间施用，其中临床医生将考虑施用之间对期望的治疗结果的影响几乎为零或可忽略不计的任何时间。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，共施用是同时施用。“同时”意指施用彼此在5、4、3、2、1或更少的分钟内开始。在一些实施方案中，在一种组合物的施用结束和另一组合物的施用开始之间，经过不超过5、4、3、2、1或更少的分钟。在另一些实施方案中，在一种组合物的施用开始和另一组合物的施用开始之间，经过不超过5、4、3、2、1或更少的分钟(例如，当在不同的位置和/或通过不同的方式提供两种组合物时)。在一些实施方案中，同时意指施用在同一时间开始。在另一些实施方案中，将组合物混合并提供给对象。包含免疫抑制剂之合成纳米载体可与病毒载体重复地共施用，例如2、3、4、5或更多次。
在所提供的任一种方法的一些实施方案中，在共施用病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体之前和/或之后，在没有病毒载体的情况下施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体(分别为包含免疫抑制剂之合成纳米载体的前剂量或后剂量)。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，在共施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体和病毒载体之前1、2或3天施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体的前剂量。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，在共施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体和病毒载体之后1、2或3天施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体的后剂量。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，对于每次共施用，施用多于一个的前剂量和/或后剂量。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，当重复共施用时，每个重复剂量之前是1或2或更多个前剂量。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，当重复共施用时，每个重复剂量之后是1或2或更多个后剂量。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，当对于每次共施用施用多于一个后剂量时，对于每次共施用，每两周一次地施用后剂量。
本文中使用的“混合”是指将两种或更多种组分混合，使得两种或更多种组分一起存在于组合物中，并且施用所述组合物向对象提供了所述两种或更多种组分。本文中提供的任一种方法的任一种共施用可以作为混合物施用。
在如本文中所提供的用于施用于对象的组合物的情况下，“有效量”是指在该对象中产生一种或更多种期望的结果(例如，降低或消除针对病毒载体的免疫应答(例如IgM和/或IgG免疫应答)和/或有效或提高的转基因表达)的组合物的量。有效量可用于体外或体内目的。对于体内目的，该量可以是临床医生认为对于可能由于施用病毒载体而经历不期望的免疫应答的对象可能具有临床益处的量。在本文中提供的任一种方法中，所施用的组合物可以是本文中提供的任一种有效量。
有效量可涉及降低不期望的免疫应答的水平，尽管在一些实施方案中，其涉及完全阻止不期望的免疫应答。有效量还可以涉及延迟不期望的免疫应答的发生。有效量也可以是导致期望的治疗终点或期望的治疗结果的量。在所提供的任一种组合物和方法的一些实施方案中，有效量是其中期望的免疫应答(例如降低或消除针对病毒载体的免疫应答，例如IgM和/或IgG应答)和/或有效或提高的转基因表达的产生在对象中持续至少1个月的量。可以局部或全身地测量这种降低或消除或有效或提高的表达。可以通过常规方法来监测前述任一项的实现。
当然，有效量将取决于所治疗的特定对象；病症、疾病或障碍的严重程度；个体患者参数包括年龄、身体状况、尺寸和体重；治疗的持续时间；并行治疗(如果有的话)的性质；具体施用途径以及在健康从业者的知识和专业之内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员公知的并且仅用常规实验就可解决。
有效量可指单一物质的组分的剂量，或者其可指多种物质的组分的剂量。例如，当提及免疫抑制剂的有效量时，该量可指包含免疫抑制剂的物质的单个剂量或者包含免疫抑制剂的相同或不同物质的多个剂量。因此，如本文中使用的，在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，免疫抑制剂的有效量可以是本文中提供的共施用步骤中免疫抑制剂的量，而没有另外地施用免疫抑制剂。然而，在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，免疫抑制剂的量是一组施用的免疫抑制剂的总量，例如与本文中提供的前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂的量结合的本文中提供的共施用的免疫抑制剂的总量。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，免疫抑制剂的量在一组施用中“分开”，并且总量可以基于根据另一方案(例如当与包含免疫抑制剂之合成纳米载体共施用而没有前剂量或后剂量的施用时)被确定为实现降低的免疫应答或病毒载体的有效或提高的转基因表达的量。该免疫抑制剂的总量可以根据本文中提供的方案分布在作为前剂量和/或后剂量提供的免疫抑制剂的量以及作为共施用步骤提供的免疫抑制剂的量中施用。因此，在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂的量与共施用的剂量结合等于该总量。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量不超过该总量的一半。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量是该总量的一半。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂的量可以与共施用步骤的免疫抑制剂的量相同。
“评估免疫应答”是指体外或体内免疫应答的水平、存在或不存在、降低、提高等的任何测量或确定。这样的测量或确定可以对获自对象的一个或更多个样品进行。这样的评估可以用本文中提供的任一种方法或本领域中已知的其他方法(包括基于ELISA的测定)进行。评估可以是评估例如来自对象的样品中抗体(例如IgM和/或IgG抗体，例如对病毒载体具有特异性那些)的数量或百分比。评估还可以是评估与免疫应答相关的任何作用，例如测量细胞因子、细胞表型等的存在或不存在。本文中提供的任一种方法可包括或进一步包括评估针对病毒载体或其抗原的免疫应答的步骤。评估可直接或间接进行。所述术语旨在包括导致、督促、鼓励、协助、诱导或指导另一方评估免疫应答的行为。
除非另有说明，否则本文中使用的“平均”是指算术平均值。
“偶联”或“偶联的”(等)意指一个实体(例如部分)与另一实体化学地缔合。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，偶联是共价的，意指在两个实体之间存在共价键的情况下发生连接。在一些非共价实施方案中，非共价偶联由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用(host-guest interaction)、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，包封是偶联的一种形式。
“剂量”是指用于以给定时间施用于对象的药理学和/或免疫学活性物质的特定量。通常，除非另有提供，否则在本发明的方法和组合物(包括药盒)中，包含免疫抑制剂之合成纳米载体和/或病毒载体的剂量是指合成纳米载体中包含的免疫抑制剂的量和/或病毒载体的量。或者，在提及包含免疫抑制剂之合成纳米载体的剂量的情况下，所述剂量可以基于提供期望的免疫抑制剂的量的合成纳米载体的数量来施用。当在重复给药的情况下使用剂量时，剂量是指每个重复剂量的量，其可相同或不同。本文中使用的“前剂量”是指在施用另一物质或一组物质之前施用的物质或一组物质。本文中使用的“后剂量”是指在施用另一物质或一组物质之后施用的物质或一组物质。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，前剂量或后剂量的物质可与另外施用的物质相同或不同。优选地，如本文所提供的，前剂量或后剂量的物质包含包含免疫抑制剂之合成纳米载体但不包含病毒载体。
“包封”意指将物质的至少一部分封装在合成纳米载体中。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，物质完全封装在合成纳米载体中。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，包封的物质中的大部分或全部不暴露于合成纳米载体外部的局部环境。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，不超过50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于局部环境。包封不同于吸收，吸收是将物质的大部分或全部置于合成纳米载体的表面上，并使物质暴露于合成纳米载体外部的局部环境。
“表达控制序列”是可以影响表达的任何序列，并且可以包括启动子，增强子和操纵子。载体内的表达控制序列或控制元件可以促进合适的核酸转录、翻译、病毒包装等。通常，控制元件顺式地起作用，但它们也可以反式地起作用。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，表达控制序列是启动子，例如组成型启动子或组织特异性启动子。“组成型启动子”，也称为普遍存在(ubiquitous)或混杂(promiscuous)启动子，是被认为通常具有活性并且对某些细胞不具有排他性或优先性的那些。“组织特异性启动子”是在特定细胞类型或组织中具有活性的那些，这样的活性可以是特定细胞类型或组织独有的。在本文中提供的任一种核酸或病毒载体中，启动子可以是本文中提供的任一种启动子。
“针对病毒载体的免疫应答”等是指针对病毒载体的任何不期望的免疫应答，例如抗体(例如，IgM或IgG)或细胞应答。在一些实施方案中，不期望的免疫应答是针对病毒载体或其抗原的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答对病毒载体的病毒抗原具有特异性。在另一些实施方案中，免疫应答对由病毒载体的转基因编码的蛋白质或肽具有特异性。在一些实施方案中，免疫应答对病毒载体的病毒抗原具有特异性，而对由病毒载体的转基因编码的蛋白质或肽没有特异性。
在一些实施方案中，对象中的降低的抗病毒载体应答包括：相比于在没有如本文中所提供的施用的情况下将病毒载体施用于另一对象(例如测试对象)之后使用获自所述另外的对象的生物样品所测量的抗病毒载体免疫应答，在如本文中所提供的施用之后使用获自该对象的生物样品所测量的降低的抗病毒载体免疫应答。在一些实施方案中，所述抗病毒载体免疫应答是：相比于在没有如本文中所提供的施用的情况下将病毒载体施用于另一对象(例如测试对象)之后对获自所述另外的对象的生物样品进行病毒载体体外攻击之后所检测的抗病毒载体免疫应答，在如本文中所提供的施用之后对该对象的生物样品进行随后的病毒载体体外攻击之后获自该对象的生物样品中的降低的抗病毒载体免疫应答。在另一些实施方案中，可以在另一对象中(例如在来自测试对象的样品中)评估免疫应答，其中预期具有或不具有成比例改变(scaling)的其他对象的结果将指示所讨论的对象中正在发生或已经发生的状况。在一些实施方案中，对象中的降低的抗病毒载体应答包括：相比于使用在不同的时间点(例如在没有如本文中所提供的施用的时间，例如在如本文中所提供的施用之前)获自该对象的生物样品所测量的抗病毒载体免疫应答，在如本文中所提供的施用之后使用获自该对象的生物样品所测量的降低的抗病毒载体免疫应答。
“免疫抑制剂”意指可以引起致耐受性作用的化合物，优选通过其对APC的作用。致耐受性作用通常是指APC或其他免疫细胞全身和/或局部的调节，其以持久的方式降低、抑制或防止针对抗原的不期望免疫应答。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，免疫抑制剂是引起APC促进一种或更多种免疫效应细胞中的调节性表型的免疫抑制剂。例如，调节性表型的特征可以是：抑制抗原特异性CD4+T细胞或B细胞的产生、诱导、刺激或募集；抑制抗原特异性抗体的产生，Treg细胞(例如，CD4+CD25highFoxP3+Treg细胞)的产生、诱导、刺激或募集等。这可以是CD4+T细胞或B细胞转化为调节性表型的结果。这也可以诱导是其他免疫细胞(例如CD8+T细胞、巨噬细胞和iNKT细胞)中FoxP3的结果。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，免疫抑制剂是在APC处理抗原之后影响APC的应答的免疫抑制剂。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，免疫抑制剂不是干扰抗原处理的免疫抑制剂。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，免疫抑制剂不是凋亡信号传导分子。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，免疫抑制剂不是磷脂。
免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)或雷帕霉素类似物(即，rapalog)；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素A(TrichostatinA)；皮质类固醇；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮(rotenone)；P38抑制剂；NF-κβ抑制剂，例如6Bio、地塞米松(Dexamethasone)、TCPA-1、IKKVII；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂(PGE2)，例如米索前列醇(Misoprostol)；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4)，例如咯利普兰(Rolipram)；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；PI3KB抑制剂，例如TGX-221；自噬抑制剂，例如3-甲基腺嘌呤；芳烃受体抑制剂；蛋白酶体抑制剂I(PSI)；和氧化的ATP，例如P2X受体阻断剂。免疫抑制剂还包括：IDO、维生素D3、视黄酸、环孢素例如环孢素A、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇(resveratrol)、硫唑嘌呤(Aza)、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、FK506、萨菲菌素A、沙美特罗、霉酚酸酯(MMF)、阿司匹林和其他COX抑制剂、尼氟酸、雌三醇和雷公藤内酯。另一些示例性免疫抑制剂包括但不限于：小分子药物、天然产物、抗体(例如抗CD20、CD3、CD4的抗体)、基于生物制剂的药物、基于碳水化合物的药物、RNAi、反义核酸、适配体、甲氨蝶呤、NSAID；芬戈莫德(fingolimod)；那他珠单抗(natalizumab)；阿仑单抗(alemtuzumab)；抗CD3；他克莫司(FK506)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)等。本文中使用的“Rapalog”是指在结构上与雷帕霉素(西罗莫司)(的类似物)相关的分子。Rapalog的实例包括但不限于：坦罗莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、地磷莫司(AP-23573)和佐他莫司(ABT-578)。Rapalog的一些另外的实例可见于例如WO公开WO 1998/002441和美国专利号8,455,510，其Rapalog通过引用整体并入本文。其他免疫抑制剂是本领域技术人员已知的，并且本发明不限于此方面。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，免疫抑制剂可包含本文中提供的任一种试剂，例如前述的任一种。
“提高转基因表达”是指提高对象中病毒载体的转基因表达水平，所述转基因由病毒载体递送。在一些实施方案中，可通过测量对象中多种感兴趣的组织或系统中的转基因蛋白质浓度来确定转基因表达的水平。或者，当转基因表达产物是核酸时，可通过转基因核酸产物来测量转基因表达的水平。可以例如通过测量获自对象的样品中转基因表达的量并将其与先前样品进行比较来确定提高的转基因表达。样品可以是组织样品。在一些实施方案中，可使用流式细胞术测量转基因表达。在另一些实施方案中，可以在另一对象(例如在来自测试对象的样品)中评估提高的转基因表达，其中预期具有或不具有成比例改变的其他对象的结果将指示所讨论的对象中正在发生或已经发生的状况。本文中提供的任一种方法可以导致提高的转基因表达。
当免疫抑制剂包含在合成纳米载体中时，例如当与其偶联时，“负载”是基于整个合成纳米载体中物质的总干配方重量的合成纳米载体中免疫抑制剂的量(重量/重量)。通常来说，这样的负载计算为合成纳米载体群体的平均值。在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，合成纳米载体的平均负载为0.1％至99％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，负载为0.1％至50％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，负载为0.1％至20％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，负载为0.1％至10％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，负载为1％至10％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，负载为7％至20％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在任一种上述实施方案的一些实施方案中，合成纳米载体群体的平均负载不超过25％。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，如本领域中已知的那样计算负载。
“合成纳米载体的最大尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最大尺寸。“合成纳米载体的最小尺寸”意指沿合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体的最小尺寸。例如，对于球形合成纳米载体，合成纳米载体的最大尺寸和最小尺寸将基本上相同，并且将是其直径的尺寸。类似地，对于立方形合成纳米载体，合成纳米载体的最小尺寸将是其高度、宽度或长度中的最小者，而合成纳米载体的最大尺寸将是其高度、宽度或长度中的最大者。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸等于或大于100nm。在一个实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最大尺寸等于或小于5μm。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸大于110nm、更优选大于120nm、更优选大于130nm并且更优选还大于150nm。合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可根据实施方案而变化。例如，合成纳米载体的最大尺寸与最小尺寸的纵横比可以是1∶1至1,000,000∶1、优选1∶1至100,000∶1、更优选1∶1至10,000∶1、更优选1∶1至1000∶1、还更优选1∶1至100∶1并且还更优选1∶1至10∶1不等。优选地，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最大尺寸等于或小于3μm、更优选等于或小于2μm、更优选等于或小于1μm、更优选等于或小于800nm、更优选等于或小于600nm并且更优选还等于或小于500nm。在一些优选的实施方案中，基于样品中合成纳米载体的总数，该样品中合成纳米载体中的至少75％、优选至少80％、更优选至少90％的最小尺寸等于或大于100nm、更优选等于或大于120nm、更优选等于或大于130nm、更优选等于或大于140nm，并且更优选还等于或大于150nm。在一些实施方案中，可通过将合成纳米载体悬浮在液体(通常为水性)介质中并使用动态光散射(dynamiclight scattering，DLS)(例如，使用Brookhaven ZetaPALS仪器)来获得合成纳米载体尺寸(例如，有效直径)的测量。例如，可将合成纳米载体的悬浮液从水性缓冲液稀释到纯水中，以实现约0.01至0.1mg/mL的最终合成纳米载体悬浮液浓度。经稀释的悬浮液可直接在合适的吸收池内制备或转移到合适的吸收池中用于DLS分析。然后，可以将吸收池放置在DLS中，使其平衡至受控温度，并随后基于介质黏度和样品折射率的合适输入扫描足够的时间以获得稳定且可再现的分布。然后，报告有效直径或分布的平均值。确定高纵横比或非球形合成纳米载体的有效尺寸可能需要放大技术(例如电子显微术)以获得更准确的测量。合成纳米载体的“尺寸”或“大小”或“直径”意指例如使用动态光散射获得的颗粒尺寸分布的平均值。
“可药用赋形剂”或“可药用载体”意指与药理学活性物质一起使用以配制组合物的药理学惰性物质。可药用赋形剂包括本领域中已知的多种物质，包括但不限于糖类(例如葡萄糖、乳糖等)、防腐剂(例如抗微生物剂)、重构助剂、着色剂、盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)和缓冲剂。
“重复剂量”或“重复给药”等意指在物质或一组物质的较早剂量或给药之后向对象施用相同物质的至少一个额外剂量或给药。虽然物质可以相同，但是重复剂量或给药中的物质的量可以不同。
“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类；禽类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物；等。本文中使用的对象可以是需要本文中提供的任一种方法或组合物的对象。本文中提供的“第二对象”或“另一对象”是指与不同于向其提供施用的对象的另一对象。该对象可以是任何其他对象，例如测试对象，该对象可以是相同或不同的物种。优选地，该第二对象是在未接受包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的前剂量或后剂量的情况下通过共施用包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂和病毒载体已经实现了针对病毒载体的降低的免疫应答或病毒载体的有效或提高的转基因表达的对象。因此，在所提供的任一种方法的-些实施方案中，第二对象或另一对象仅接受共施用以实现降低的免疫应答或提高的转基因表达。该共施用的免疫抑制剂的量可用于确定用于根据任一种所述方法使用或在本文中所提供的任一种组合物中使用的本文中提供的剂量。该量可以分布在前剂量和/或后剂量和共施用的剂量中以实现类似或更大的效果。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，当第二对象或其他对象是不同物种时，该量可以成比例改变为适合于对象物种接受施用，该经成比例改变的量可用作如本文中所提供的总量。例如，可使用异速成比例改变或其他成比例改变方法。可以使用本领域普通技术人员已知或本文中其他地方提供的常规方法来评估第二对象或其他对象中的免疫应答以及转基因表达。本文中提供的任一种方法可包括或进一步包括确定本文中所述的第二对象或其他对象中的这些量的一种或更多种。
“合成纳米载体”意指在自然界中未发现并且具有至少小于或等于5微米大小的一个尺寸的离散物体。一般来说包含白蛋白纳米粒作为合成纳米载体，然而在某些实施方案中，合成纳米载体不包含白蛋白纳米粒。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含壳聚糖。在另一些实施方案中，合成纳米载体不是基于脂质的纳米粒。在另外的实施方案中，合成纳米载体不包含磷脂。
合成纳米载体可以是但不限于以下一种或多种：基于脂质的纳米粒(在本文中也称为脂质纳米粒，即构成其结构的大部分物质是脂质的纳米粒)、聚合物纳米粒、金属纳米粒、基于表面活性剂的乳剂、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒(即主要由病毒结构蛋白构成但不具有感染性或感染性低的颗粒)、基于肽或蛋白质的颗粒(在本文中也称为蛋白质颗粒，即构成其结构的大部分物质是肽或蛋白质的颗粒)(例如白蛋白纳米粒)和/或使用纳米材料的组合产生的纳米粒(例如脂质-聚合物纳米粒)。合成纳米载体可以是多种不同的形状，包括但不限于球形、立方形、棱锥形、长方形、圆柱形、环形等。根据本发明的合成纳米载体包含一个或更多个表面。可适用于本发明实践的示例性合成纳米载体包括：(1)Gref等的美国专利5,543,158中公开的生物可降解纳米粒，(2)Saltzman等的公开的美国专利申请20060002852的聚合物纳米粒，(3)DeSimone等的公开的美国专利申请20090028910的光刻法构建的纳米粒，(4)von Andrian等的WO 2009/051837的公开内容，(5)Penades等的公开的美国专利申请2008/0145441中公开的纳米粒，(6)de los Rios等的公开的美国专利申请20090226525中公开的蛋白质纳米粒，(7)Sebbel等的公开的美国专利申请20060222652中公开的病毒样颗粒，(8)Bachmann等的公开的美国专利申请20060251677中公开的核酸连接的病毒样颗粒，(9)WO2010047839A1或WO2009106999A2中公开的病毒样颗粒，(10)P.Paolicelli et al.，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles thatcan Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)中公开的纳米沉淀纳米粒，(11)美国公开2002/0086049中公开的凋亡细胞、凋亡小体或者合成或半合成模拟物，或(12)Look et al.，Nanogel-based delivery ofmycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mice”J.ClinicalInvestigation 123(4)：1741-1749(2013)的那些。
最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含具有激活补体之羟基的表面，或者作为替代包含基本上由不是激活补体之羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含显著激活补体的表面，或者作为替代包含基本上由不会显著激活补体的部分组成的表面。在一个更优选的实施方案中，最小尺寸等于或小于约100nm、优选等于或小于100nm的根据本发明的合成纳米载体不包含激活补体的表面，或者作为替代包含基本上由不会激活补体的部分组成的表面。在一些实施方案中，合成纳米载体排除病毒样颗粒。在一些实施方案中，合成纳米载体的纵横比可大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或大于1∶10。
“病毒载体的转基因”或“转基因”等是指使用病毒载体转运到细胞中的核酸物质，并且一旦在细胞中，其被表达以分别产生蛋白质或核酸分子，例如用于如本文中所述的治疗应用。“表达的”或“表达”等是指在转基因转导入细胞并由转导细胞加工之后，合成功能性(即，对于期望目的具有生理活性)基因产物。这样的基因产物在本文中也称为“转基因表达产物”。因此，表达的产物是由转基因编码的所得蛋白质或核酸，例如反义寡核苷酸或治疗性RNA。
“病毒载体”意指基于病毒的递送系统，其可以将或将有效负载(例如核酸)递送至细胞。通常来说，该术语是指具有病毒组分(例如衣壳和/或外壳蛋白)的病毒载体构建体，其可以包含还或者还包含有效负载(并且已经如此适应)。在一些实施方案中，有效负载编码转基因。在一些实施方案中，转基因是编码本文中提供的蛋白质(例如治疗性蛋白质、DNA结合蛋白质或内切核酸酶)的转基因。在另一些实施方案中，转基因编码指导RNA、反义核酸、snRNA、RNAi分子(例如，dsRNA或ssRNA)、miRNA或三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotide，TFO)等。在另一些实施方案中，有效负载是核酸，其本身是治疗剂，并且不需要表达所递送的核酸。例如，核酸可以是siRNA，例如合成的siRNA。
在一些实施方案中，有效负载还可以编码其他组分，例如末端反向重复(invertedterminal repeat，ITR)、标志物等。有效负载还可包含表达控制序列。表达控制DNA序列包括启动子、增强子和操纵子，并且一般基于其中利用表达构建体的表达系统进行选择。在一些实施方案中，选择启动子和增强子序列用于提高基因表达的能力，同时可选择操纵子序列用于调节基因表达的能力。在一些实施方案中，有效负载还可包含有利于并优选促进宿主细胞中的同源重组的序列。
示例性表达控制序列包括启动子序列，例如巨细胞病毒启动子；劳斯肉瘤病毒启动子；和猿猴病毒40启动子；以及在本文中其他地方公开或本领域中已知的任何其他类型的启动子。通常来说，启动子有效地连接编码期望的表达产物的序列的上游(即5’)。有效负载还可包含可操作地连接编码序列的下游(即3’)的合适的多腺苷酸化序列(例如，SV40或人生长激素基因多腺苷酸化序列)。
通常来说，使病毒载体工程化以能够将一种或更多种期望核酸转导入细胞。此外，应理解，对于本文中提供的治疗应用，病毒载体优选是复制缺陷型的。病毒载体可以基于但不限于：逆转录病毒(例如，鼠逆转录病毒、禽逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV))、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、甲病毒等。其他实例在本文中其他地方提供或是本领域中已知的。病毒载体可基于病毒的天然变体、毒株或血清型，例如本文中所提供的那些的任一种。病毒载体也可基于通过分子进化选择的病毒(参见，例如，J.T.Koerber et al，Mol.Ther.17(12)：2088-2095和美国专利号6,09,548)。病毒载体可以基于但不限于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，例如AAV8或AAV2。病毒载体还可以基于Anc80。因此，本文中提供的AAV载体或Anc80载体分别是基于AAV或Anc80的病毒载体，并且具有病毒组分(例如衣壳和/或外壳蛋白)，因此其可以包装用于递送核酸物质。AAV载体的其他实例包括但不限于：基于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8或其变体的那些。病毒载体还可以是工程化的载体、重组载体、突变体载体或杂交体载体。产生此类载体的方法对于本领域普通技术人员而言是明显的。在一些实施方案中，病毒载体是“嵌合病毒载体”。在这样的一些实施方案中，这意味着病毒载体由源自多于一种病毒或病毒载体的病毒组分构成。参见，例如，PCT公开WO01/091802和WO14/168953，以及美国专利号6,468,771。这样的病毒载体可以是，例如，AAV8/Anc80或AAV2/Anc80病毒载体。
另外的病毒载体元件可以顺式或反式地起作用。在一些实施方案中，病毒载体包含：载体基因组，其还包含靶(供体)序列的5’或3’端侧翼的一个或更多个末端反向重复序列(ITR)；促进转录的表达控制元件(例如，启动子或增强子)；内含子序列；填充(stuffer)/填充(filler)多核苷酸序列(通常，惰性序列)；和/或位于靶(供体)序列的3’端的poly(A)序列。
C.用于本发明方法的组合物
重要的是，本文中提供的方法和组合物通过施用病毒载体提供了改善的效果。因此，本文中提供的方法和组合物可用于用病毒载体治疗对象。这样的病毒载体可用于递送核酸用于多种目的，包括用于基因治疗等。如上所述，针对病毒载体的免疫应答可不利地影响其效力并且还可干扰其再次施用。重要的是，已经发现本文中提供的方法和组合物通过实现改善的转基因表达和/或降低针对病毒载体的免疫应答克服了前述障碍。本发明人已令人惊讶地发现，包含包含免疫抑制剂之合成纳米载体的前剂量和/或后剂量与合成纳米载体和病毒载体的共施用的组合的给药方案可以实现改善的免疫应答降低和/或转基因表达。此外，还令人惊讶地发现，与单独的共施用步骤相比，通过前剂量或后剂量可降低共施用步骤的免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)的量。因此，在本文中提供的任一种治疗方案中，免疫抑制剂(当包含在合成纳米载体中时)的量可以“分成”前剂量和/或后剂量和共施用剂量。
同样如上所述，已发现，病毒载体施用可能在病毒载体施用之后不久导致IgM免疫应答。还已发现，包含免疫抑制剂并且在相对于病毒载体的时间施用的合成纳米载体可以以IgM依赖性的方式诱导升高的转基因表达。
转基因
病毒载体的有效负载可以是转基因。例如，转基因可以编码期望的表达产物，例如多肽、蛋白质、蛋白质混合物、DNA、cDNA、功能性RNA分子(例如RNAi、miRNA)、mRNA、RNA复制子或其他感兴趣的产物。
例如，转基因的表达产物可以是对对象(例如患有疾病或病症的对象)有益的蛋白质或其部分。蛋白质可以是胞外、胞内或膜结合蛋白质。例如，转基因可以编码酶、血液衍生物、激素、淋巴因子(例如白介素和干扰素)、促凝剂、生长因子、神经递质、肿瘤抑制剂、载脂蛋白、抗原和抗体。对象可能患有或怀疑患有疾病或病症，其中对象的内源性形式的蛋白质有缺陷或以有限量产生或完全不产生。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，转基因的表达产物可以是对对象有益的基因或其部分。
治疗性蛋白质的实例包括但不限于：可输注或可注射的治疗性蛋白质、酶、酶辅因子、激素、血液或凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、脂肪因子等。
可输注或可注射的治疗性蛋白质的实例包括：例如，托珠单抗(Roche/)、α-1抗胰蛋白酶(Kamada/AAT)、(Affymax和Takeda，合成肽)、白蛋白干扰素α-2b(Novartis/ZalbinTM)、(Pharming Group，C1抑制剂替代治疗)、替莫瑞林(tesamorelin)(Theratechnologies/Egrifta，合成生长激素释放因子)、ocrelizumab(Genentech，Roche和Biogen)、belimumab(GlaxoSmithKline/)、培戈洛酶(pegloticase)(Savient Pharmaceuticals/KrystexxaTM)、他利苷酶α(taliglucerase α)(Protalix/Uplyso)、阿力口糖酶α(Shire/)和维拉苷酶α(Shire)。
酶的实例包括溶菌酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、胶原酶、透明质酸酶、肝素酶、类肝素酶、激酶、磷酸酶、溶素和连接酶。酶的另一些实例包括用于酶替代治疗的那些，包括但不限于：伊米苷酶(imiglucerase)(例如，CEREZYMETM)、α-半乳糖苷酶A(α-gal A)(例如，阿加糖酶β，FABRYZYMETM)、酸性α-葡糖苷酶(GAA)(例如，葡糖苷酶α，LUMIZYMETM，MYOZYMETM)和芳基硫酸酯酶B(例如，拉罗尼酶(laronidase)，ALDURAZYMETM，艾杜硫酶(idursulfase)，ELAPRASETM，芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B)，NAGLAZYMETM)。
激素的实例包括褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)、5-羟色胺(Serotonin)、甲状腺素(或四碘甲腺原氨酸)(一种甲状腺激素)、三碘甲腺原氨酸(一种甲状腺激素)、肾上腺素(Epinephrine或adrenaline)、去甲肾上腺素(Norepinephrine或noradrenaline)、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗缪勒氏管激素(antimullerian hormone)(或缪勒氏管抑制因子或激素)、脂连蛋白、促肾上腺皮质激素(或促肾上腺皮质素)、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(或升压素、精氨酸升压素)、心房钠尿肽(或心房肽)、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、食欲刺激素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1)、GIP、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(或生长调节素)、瘦素、促黄体激素、黑素细胞刺激激素、食欲肽、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、孕酮、骨化三醇(1,25-二羟基维生素D3)、骨化二醇(25-羟基维生素D3)、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、催乳素释放激素、促脂解素、脑钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽。
血液或凝血因子的实例包括：因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(前加速素，不稳定因子)、因子VII(稳定因子，前转化素)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(克雷司马斯因子或血浆促凝血酶原激酶组分)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子Xa、因子XI、因子XII(Hageman因子)、因子XIII(纤维蛋白稳定因子)、von Willebrand因子、von Heldebrant因子、前激肽释放因子(Fletcher因子)、高分子量激肽原(HMWK)(Fitzgerald因子)、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶(例如抗凝血酶III)、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(protein Z-related proteaseinhibitot，ZPI)、纤溶酶原、α2-纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogenactivator，tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(plasminogen activator inhibitor-2，PAI2)、癌症促凝剂和依伯汀α(Epogen，Procrit)。
细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素和趋化因子、1型细胞因子(例如IFN-γ、TGF-β)和2型细胞因子(例如IL-4、IL-10和IL-13)。
生长因子的实例包括：肾上腺髓质素(Adrenomedullin，AM)、血管生成素(Angiopoietin，Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)、胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growth differentiationfactor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、肝癌源性生长因子(Hepatoma-derived growth factor，HDGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growthfactor，IGF)、迁移刺激因子、肌生成抑制蛋白(GDF-8)、神经生长因子(Nerve growthfactor，NGF)以及其他神经营养因子、血小板源性生长因子(Platelet-derived growthfactor，PDGF)、血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、转化生长因子α(Transforminggrowth factor alpha，TGF-α)、转化生长因子β(Transforming growth factor beta，TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、Wnt信号传导途径、胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)、[(胎牛促生长素)](Foetal Bovine Somatotrophin，FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
脂肪因子的实例包括瘦素和脂连蛋白。
治疗性蛋白质的另外的实例包括但不限于：受体、信号传导蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、转录因子、结构蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、结合蛋白、核蛋白、分泌蛋白、高尔基蛋白、内质网蛋白、线粒体蛋白和囊泡蛋白等。
在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，表达产物可用于破坏、校正/修复或替换靶基因或靶基因的一部分。例如，成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(CRISPR/Cas)系统可用于精确的基因组编辑。在该系统中，可通过指导RNA(短RNA)编程单个CRISPR相关核酸酶(Cas核酸酶)以识别包含含有短碱基序列重复的DNA基因座的特定DNA靶标。每个CRISPR基因座侧翼为源自病毒基因组物质的间隔区DNA的短片段。在最常见的系统II型CRISPR系统中，间隔区DNA与反式激活RNA(tracRNA)杂交，在那里其被加工成CRISPR-RNA(crRNA)，然后与Cas核酸酶缔合，形成启动RNAse III加工并导致外来DNA降解的复合物。靶序列优选在其3’端包含前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列以被识别。该系统可以以多种方式修饰，例如合成的指导RNA可与CRISPR载体融合，并且多种不同的指导RNA结构和元件是可能的(包括发夹和支架序列)。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，转基因序列可以编码CRISPR/Cas系统的任何一种或更多种组分，例如报道序列，其在表达时产生可检测的信号。这样的报道序列的实例包括但不限于：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8)和流感血凝素蛋白。其他报道分子是本领域普通技术人员已知的。
在所提供的任一种方法或组合物的另一个实例中，转基因可以编码RNA产物，例如tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA、siRNA、RNAi、miRNA、小发夹RNA(shRNA)、反式剪接RNA和反义RNA。例如，可以产生特定的RNA序列以抑制或消除对象中靶向的核酸序列的表达。合适的靶序列包括例如肿瘤靶标和病毒疾病。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，转基因序列可编码在表达时产生可检测信号的报道序列，或者转基因序列可编码可用于产生疾病动物模型的蛋白质或功能性RNA。在所提供的任一种方法或组合物的另一个实例中，转基因编码旨在用于研究目的的蛋白质或功能性RNA，例如旨在产生携带转基因的体细胞转基因动物模型，例如以研究转基因产物的功能。在所提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，这样的表达产物旨在用于治疗。转基因的其他用途对于本领域普通技术人员而言是明显的。
转基因的序列还可包含表达控制序列。表达控制序列包括启动子、增强子和操纵子，并且一般基于其中利用表达构建体的表达系统进行选择。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，选择启动子和增强子序列用于提高基因表达的能力，同时可选择操纵子序列用于调节基因表达的能力。通常来说，启动子序列位于编码期望的表达产物的核酸序列的上游(即5’)，并且与邻近序列有效地连接，从而相比于没有启动子的表达的量提高表达的期望产物的量。通常位于启动子序列上游的增强子序列可以进一步提高期望产物的表达。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，增强子序列可位于启动子的下游和/或转基因内。转基因还可包含有利于并优选促进宿主细胞中的同源重组和/或包装的序列。转基因还可包含在宿主细胞中复制所必需的序列。
示例性表达控制序列包括肝特异性启动子序列和组成型启动子序列，例如本文中可提供的任何序列。另一些组织特异性启动子包括眼、视网膜、中枢神经系统、脊髓等。普遍存在或混杂启动子和增强子的实例包括但不限于：巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期启动子/增强子序列、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列、以及在多种哺乳动物细胞类型中有活性的其他病毒启动子/增强子、或在自然界中不存在的合成元件(参见，例如，Boshart et al，Cell，41：521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)启动子、胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(phosphoglycerol kinase，PGK)启动子。
操纵子或可调节元件响应于信号或刺激，这可以提高或降低可操作连接的核酸的表达。诱导型元件是响应于信号或刺激而提高可操作连接的核酸的表达的那些，例如激素诱导型启动子。抑制型元件是响应于信号或刺激而降低可操作连接的核酸的表达的那些。通常来说，抑制型和诱导型元件按比例地响应于存在的信号或刺激的量。在所提供的任一种方法或组合物中转基因可包含这样的序列。
转基因还可包含可操作地连接编码序列的下游(即3’)的合适的多腺苷酸化序列。
递送转基因(例如用于基因治疗)的方法是本领域中已知的(参见，例如，Smith.Int.J.Med.Sci.1(2)：76-91(2004)；Phillips.Methods in Enzymology：GeneTherapy Methods.Vol.346.Academic Press(2002))。本文所述的任一种转基因可以使用本领域中已知的方法并入本文所述的任一种病毒载体中，参见，例如美国专利号7,629,153。
病毒载体
病毒已经进化出了专门的机制以将它们的基因组转运到它们所感染的细胞内；基于这样的病毒的病毒载体可以定制以转导用于特定应用的细胞。可如本文中提供的使用的病毒载体的实例是本领域中已知的或在本文中所述的。合适的病毒载体包括例如：逆转录病毒载体、慢病毒载体、基于单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的载体、基于腺病毒的载体、基于腺相关病毒(AAV)的载体和AAV-腺病毒嵌合载体。
本文中提供的病毒载体可以基于逆转录病毒。逆转录病毒是单链正义RNA病毒。可以操作逆转录病毒载体以使病毒不能复制。因此，认为逆转录病毒载体特别可用于体内稳定的基因转移。逆转录病毒载体的实例可见于例如美国公开号20120009161、20090118212和20090017543，病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
慢病毒载体是可用于产生本文中提供的病毒载体的逆转录病毒载体的实例。慢病毒的实例包括：HIV(人)、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)、猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，FIV)、马感染性贫血病毒(equineinfectious anemia virus，EIAV)和绵羊髓鞘脱落病毒(visna virus)(绵羊慢病毒)。慢病毒载体的实例可见于例如美国公开号20150224209、20150203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008，病毒载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
基于单纯疱疹病毒的病毒载体也适合于本文中提供的用途。许多复制缺陷型HSV载体包含缺失，以去除一个或更多个立即早期基因以阻止复制。对于基于HSV的载体的描述，参见例如美国专利号5,837,532、5,846,782、5,849,572和5,804,413，以及国际专利申请WO 91/02788、WO96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583，其对病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
病毒载体可以基于腺病毒。病毒载体可以基于的腺病毒可以来自任何来源、任何亚组、任何亚型、亚型混合物或任何血清型。例如，腺病毒可以是亚组A(例如，血清型12、18和31)、亚组B(例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚组C(例如，血清型1、2、5和6)、亚组D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48)、亚组E(例如，血清型4)、亚组F(例如，血清型40和41)、未分类的血清组(例如，血清型49和51)或任何其他腺病毒血清型。腺病毒血清型1至51可从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC，Manassas，Va.)获得。非组C腺病毒以及甚至非人腺病毒可用于制备复制缺陷型腺病毒载体。非组C腺病毒载体、产生非组C腺病毒载体的方法和使用非组C腺病毒载体的方法公开于例如，美国专利号5,801,030、5,837,511和5,849,561，以及国际专利申请WO97/12986和WO 98/53087。任何腺病毒、甚至嵌合腺病毒可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。例如，人腺病毒可以用作复制缺陷型腺病毒载体的病毒基因组的来源。腺病毒载体的另一些实例可见于美国公开号20150093831、20140248305、20120283318、20100008889、20090175897和20090088398，其对病毒载体及其制备方法的描述通过引用整体并入。
本文中提供的病毒载体也可以基于腺相关病毒(AAV)。AAV载体对于用于治疗应用(例如本文所述的那些)特别令人感兴趣。对于基于AAV的载体的描述，参见例如美国专利号8,679,837、8,637,255、8,409,842、7,803,622和7,790,449，以及美国公开号20150065562、20140155469、20140037585、20130096182、20120100606和20070036757。AAV载体可以是重组AAV载体。AAV载体还可以是自互补(self-complementary，sc)AAV载体，其描述于例如美国专利公开2007/01110724和2004/0029106，以及美国专利号7,465,583和7,186,699中，其中病毒载体及其制备方法通过引用整体并入。
病毒载体可以基于的腺相关病毒可以是任何血清型或血清型混合物。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。例如，当病毒载体基于血清型的混合物时，病毒载体可以包含取自一种AAV血清型(例如选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)的衣壳信号序列和来自不同血清型(例如选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任一种)的包装序列。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，AAV载体是基于AAV 2/8的载体。在本文中提供的任一种方法或组合物的另一些实施方案中，AAV载体是基于AAV 2/5的载体。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，病毒载体所基于的病毒可以是合成的，例如Anc80。
在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，病毒载体是AAV/Anc80载体，例如AAV8/Anc80载体或AAV2/Anc80载体。
载体可以基于的另一些病毒包括：AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、rh10、rh74或AAV-2i8，以及其变体。
本文中提供的病毒载体也可以基于甲病毒。甲病毒包括：辛德毕斯(Sindbis)(和VEEV)病毒、奥拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴马森林病毒(BarmahForest virus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、沼泽地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒(Getahvirus)、高地J病毒(Highlands J virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、马亚罗病毒病毒(Mayaro virus)、Me Tri病毒(Me Tri virus)、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、奥尼永尼永病毒(O′nyong-nyong virus)、那皮舒纳病毒(Pixunavirus)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、图那特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)、乌纳病毒(Una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)、西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)和瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)。甲病毒载体的实例可见于美国公开号20150050243、20090305344和20060177819；载体及其制备方法通过引用整体并入本文。
本文中提供的任一种病毒载体可用于本文中提供的任一种方法。
免疫抑制剂
免疫抑制剂包括但不限于：他汀类；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物；TGF-β信号传导剂；TGF-β受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂；皮质类固醇；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮；P38抑制剂；NF-κB抑制剂；腺苷受体激动剂；前列腺素E2激动剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂；蛋白酶体抑制剂；激酶抑制剂；G蛋白偶联受体激动剂；G蛋白偶联受体拮抗剂；糖皮质激素；类视黄醇；细胞因子抑制剂；细胞因子受体抑制剂；细胞因子受体激活剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；钙调磷酸酶抑制剂；磷酸酶抑制剂和氧化的ATP。免疫抑制剂还包括：IDO、维生素D3、环孢素A、芳烃受体抑制剂、白藜芦醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素(tripolide)、白介素(例如IL-1、IL-10)、环孢素A、靶向细胞因子或细胞因子受体的siRNA等。
他汀类的实例包括：阿托伐他汀(atorvastatin) 西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)( XL)、洛伐他汀(lovastatin) 美伐他汀(mevastatin)匹伐他汀(pitavastatin)瑞舒伐他汀(rosuvastatin)瑞舒伐他汀和辛伐他汀(simvastatin)
mTOR抑制剂的实例包括：雷帕霉素及其类似物(例如，CCL-779、RAD001、AP23573、C20-甲代烯丙基雷帕霉素(C20-Marap)、C16-(S)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(C16-BSrap)、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(C16-iRap)(Bayle et al.Chemistry&Biology 2006，13：99-107))、AZD8055、BEZ235(NVP-BEZ235)、大黄根酸(大黄酚)、地磷莫司(MK-8669)、依维莫司(RAD0001)、KU-0063794、PI-103、PP242、替西罗莫司、和WYE-354(可从Selleck，Houston，TX，USA获得)。
TGF-β信号传导剂的实例包括：TGF-β配体(例如激活素A、GDF1、GDF11、骨形态发生蛋白、nodal、TGF-β)及其受体(例如ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2、BMPR1A、BMPR1B、TGFβRI、TGFβRII)、R-SMADS/co-SMADS(例如，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5、SMAD8)和配体抑制剂(例如卵泡抑素、头蛋白(noggin)、脊索素(chordin)、DAN、lefty、LTBP1、THBS1、饰胶蛋白聚糖(Decorin))。
线粒体功能抑制剂的实例包括：苍术苷(atractyloside)(二钾盐)、豆氨酸(bongkrekic acid)(三铵盐)、羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)、羧基苍术苷(carboxyatractyloside)(例如来自胶苍术(Atractylis gummifera))、CGP-37157、(-)-鱼藤素(例如来自绢毛萌豆(Munduleasericea))、F16、己糖激酶II VDAC结合结构域肽、寡霉素、鱼藤酮、Ru360、SFK1和缬氨霉素(例如来自灰色链霉菌(Streptomyces fulvissimus))(EMD4Biosciences，USA)。
P38抑制剂的实例包括：SB-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)、SB-239063(反式-1-(4-羟基环己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、SB-220025(5-(2氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑)和ARRY-797。
NF(例如NK-)抑制剂的实例包括：IFRD1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水杨酸、BAY 11-7082、BAY 11-7085、CAPE(咖啡酸苯乙酯)、马来酸二乙酯、IKK-2抑制剂IV、IMD0354、乳胞素、MG-132[Z-Leu-Leu-Leu-CHO]、NFκB激活抑制剂III、NF-κB激活抑制剂II、JSH-23、小白菊内酯(parthenolide)、苯基胂氧化物(PAO)、PPM-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐、QNZ、RO 106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺AL、楝酰胺C、楝酰胺I、楝酰胺J、洛克米兰醇(rocaglaol)、(R)-MG-132、水杨酸钠、雷公藤内酯(PG490)和蟛蜞菊内酯(vedelolactone)。
腺苷受体激动剂的实例包括CGS-21680和ATL-146e。
前列腺素E2激动剂的实例包括E-前列腺素2和E-前列腺素4。
磷酸二酯酶抑制剂(非选择性和选择性抑制剂)的实例包括：咖啡因、氨茶碱、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、茶碱、甲基化黄嘌呤、长春西汀、EHNA(赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷(anagrelide)、依诺昔酮(enoximone)(PERFANTM)、米力农(milrinone)、左西孟旦(levosimendon)、松叶菊碱(mesembrine)、异丁司特(ibudilast)、吡拉米特(piclamilast)、木犀草素(luteolin)、屈他维林(drotaverine)、罗氟司特(rofiumilast)(DAXASTM，DALIRESPTM)、西地那非(sildenafil)他达那非(tadalafil)伐地那非(vardenafil)乌地那非(udenafil)、阿伐那非(avanafil)、淫羊藿苷(icariin)、4-甲基哌嗪和吡唑并嘧啶-7-1。
蛋白酶体抑制剂的实例包括：硼替佐米(bortezomib)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)和盐孢菌酰胺A(salinosporamide A)。
激酶抑制剂的实例包括：贝伐单抗(bevacizumab)、BIBW 2992、西妥昔单抗(cetuximab)伊马替尼(imatinib)曲妥珠单抗(trastuzumab)吉非替尼(gefitinib)雷珠单抗(ranibizumab)哌加他尼(pegaptanib)、索拉非尼(sorafenib)、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、尼罗替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼单抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、E7080、帕唑帕尼(pazopanib)和木利替尼(mubritinib)。
糖皮质激素的实例包括：氢化可的松(皮质醇)、醋酸可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸去氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。
类视黄醇的实例包括：视黄醇、视黄醛、维A酸(视黄酸，RETIN-)、异维A酸阿利维A酸依曲替酯(etretinate)(TEGISONTM)及其代谢物阿曲汀他扎罗汀(tazarotene) 贝沙罗汀(bexarotene)和阿达帕林(adapalene)
细胞因子抑制剂的实例包括：IL1ra、IL1受体拮抗剂、IGFBP、TNF-BF、尿调节素(uromodulin)、α-2-巨球蛋白、环孢素A、喷他脒(Pentamidine)和己酮可可碱
过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂的实例包括：GW9662、PPARγ拮抗剂III、G335和T0070907(EMD4Biosciences，USA)。
过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂的实例包括：吡格列酮(pioglitazone)、环格列酮(ciglitazone)、氯贝特(clofibrate)、GW1929、GW7647、L-165,041、LY 171883、PPARγ激活剂、Fmoc-Leu、曲格列酮(troglitazone)和WY-14643(EMD4Biosciences，USA)。
组蛋白脱乙酰酶抑制剂的实例包括：异羟肟酸(或异羟肟酸盐)例如曲古柳菌素A、环状四肽(cyclic tetrapeptide)(例如trapoxin B)和缩酚酸肽(depsipeptide)，苯甲酰胺，亲电酮(electrophilic ketone)，脂肪酸化合物例如丁酸苯酯和丙戊酸，异羟肟酸例如伏立诺他(vorinostat)(SAHA)、贝利司他(belinostat)(PXD101)、LAQ824和潘比司他(panobinostat)(LBH589)，苯甲酰胺例如恩替诺特(entinostat)(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103)，烟酰胺，NAD的衍生物，二氢香豆素，萘并吡喃酮和2-羟基萘醛。
钙调磷酸酶抑制剂的实例包括：环孢素、吡美莫司(pimecrolimus)、voclosporin和他克莫司(tacrolimus)。
磷酸酶抑制剂的实例包括：BN82002盐酸盐、CP-91149、花萼海绵诱癌素A(calyculinA)、斑蝥酸(cantharidic acid)、斑蝥素(cantharidin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、乙基-3，4-脱质抑素(ethyl-3，4-dephostatin)、福司曲星钠盐(fostriecin sodium salt)、MAZ51、甲基-3，4-脱质抑素(methyl-3，4-dephostatin)、NSC95397、去甲斑蝥素(norcantharidin)、来自东海原甲藻(prorocentrum concavum)的冈田酸(okadaic acid)铵盐、冈田酸、冈田酸钾盐、冈田酸钠盐、苯基胂氧化物、多种磷酸酶抑制剂混合物、蛋白磷酸酶1C、蛋白磷酸酶2A抑制蛋白、蛋白磷酸酶2Al、蛋白磷酸酶2A2和原钒酸钠。
合成纳米载体
本文中提供的方法包括施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体。通常来说，免疫抑制剂是除构成合成纳米载体结构的物质之外的要素。例如，在所提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，其中合成纳米载体由一种或更多种聚合物构成，免疫抑制剂是除了所述一种或更多种以外的化合物，并且在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，其与所述一种或更多种聚合物连接。在其中合成纳米载体的物质也导致致耐受性作用的一些实施方案中，免疫抑制剂是除导致致耐受性作用的合成纳米载体物质之外还存在的要素。
根据本发明可以使用广泛多种的合成纳米载体。在一些实施方案中，合成纳米载体是球体或球状体。在一些实施方案中，合成纳米载体是平的或片状的。在一些实施方案中，合成纳米载体是立方体或立方体的。在一些实施方案中，合成纳米载体是卵形体或椭圆形体。在一些实施方案中，合成纳米载体是圆柱体、锥体或棱锥形体。
在一些实施方案中，期望使用在大小或形状方面相对均匀的合成纳米载体群体，使得每个合成纳米载体具有相似的特性。例如，基于合成纳米载体的总数，所提供的任一种组合物或方法的合成纳米载体的至少80％、至少90％或至少95％的最小尺寸或最大尺寸落在合成纳米载体的平均直径或平均尺寸的5％、10％或20％内。
合成纳米载体可以是实心的或中空的，并且可包含一个或更多个层。在一些实施方案中，每个层相对于另外的层具有独特的组成和独特的特性。仅给出一个实例，合成纳米载体可具有核/壳结构，其中核是一个层(例如聚合物核)，并且壳是第二层(例如脂质双层或单层)。合成纳米载体可包含多个不同的层。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种脂质。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质体。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质双层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含脂质单层。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含胶束。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如脂质双层、脂质单层等)包围的包含聚合物基质的核。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含由脂质层(例如，脂质双层、脂质单层等)包围的非聚合物的核(例如，金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒、骨颗粒、病毒颗粒、蛋白质、核酸、碳水化合物等)。
在另一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种两亲性实体。在一些实施方案中，两亲性实体可以促进具有提高的稳定性、改善的均一性或提高的黏度的合成纳米载体的产生。在一些实施方案中，两亲性实体可以与脂质膜(例如，脂质双层、脂质单层等)的内表面缔合。本领域中已知的许多两亲性实体适合用于制备根据本发明的合成纳米载体。这样的两亲性实体包括但不限于：磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油基丙基三乙基铵(DOTMA)；二油酰磷脂酰胆碱；胆固醇；胆固醇酯；二酰基甘油；琥珀酸二酰基甘油酯；二磷脂酰甘油(DPPG)；己烷癸醇；脂肪醇例如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂醚；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯；脂肪酸甘油二酯；脂肪酸酰胺；脱水山梨糖醇三油酸酯(85)甘胆酸盐；脱水山梨糖醇单月桂酸酯(20)；聚山梨酯20(20)；聚山梨酯60(60)；聚山梨酯65(65)；聚山梨酯80(80)；聚山梨酯85(85)；聚氧乙烯单硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如脱水山梨醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)；心磷脂；磷脂酸；脑苷脂；磷酸二鲸蜡酯；二棕榈酰磷脂酰甘油；硬脂胺；十二烷基胺；十六烷基胺；乙酰棕榈酸酯；甘油蓖麻油酸酯；硬脂酸十六烷基酯；豆蔻酸异丙酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400单硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性剂性质的合成和/或天然洗涤剂；脱氧胆酸盐；环糊精；离液盐；离子配对剂；及其组合。两亲性实体组分可以是不同的两亲性实体的混合物。本领域技术人员将认识到，这是具有表面活性剂活性的物质的示例性而非全面的列举。任何两亲性实体可用于产生根据本发明使用的合成纳米载体。
在一些实施方案中，合成纳米载体可任选地包含一种或更多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物包括单糖或二糖，其包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，其包括但不限于：短梗霉聚糖(pullulan)、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基纤维素(HC)、甲基纤维素(MC)、葡聚糖、环葡聚糖、糖原、羟乙基淀粉、角叉菜胶、糖基(glycon)、直链淀粉(amylose)、壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、藻胶和藻酸、淀粉、壳多糖、菊粉、魔芋、葡甘露聚糖、石耳葡聚糖、肝素、透明质酸、凝胶多糖和黄原胶。在一些实施方案中，合成纳米载体不包含(或特别排除)碳水化合物，例如多糖。在某些实施方案中，碳水化合物可包括碳水化合物衍生物，例如糖醇，其包括但不限于：甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
在一些实施方案中，合成纳米载体可以包含一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含为非甲氧基封端的普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含为非甲氧基封端的聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些实施方案中，合成纳米载体包含不含普朗尼克聚合物的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的聚合物的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(重量/重量)不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，构成合成纳米载体的所有聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些实施方案中，这样的聚合物可以被涂层(例如脂质体、脂质单层、胶束等)包围。在一些实施方案中，合成纳米载体的要素可以与聚合物连接。
可以通过多种方法中的任一种将免疫抑制剂与合成纳米载体偶联。通常来说，连接可以是免疫抑制剂与合成纳米载体之间结合的结果。这种结合可导致免疫抑制剂与合成纳米载体的表面连接和/或被包含(包封)在合成纳米载体内。然而，在一些实施方案中，由于合成纳米载体的结构，免疫抑制剂被合成纳米载体包封，而不是与合成纳米载体结合。在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物，并且免疫抑制剂与聚合物连接。
当由于免疫抑制剂和合成纳米载体之间的结合而发生连接时，连接可通过偶联部分来发生。偶联部分可以是免疫抑制剂通过其与合成纳米载体结合的任何部分。这样的部分包括使免疫抑制剂与合成纳米载体(共价或非共价地)结合的共价键(例如酰胺键或酯键)以及单独分子。这样的分子包括接头或聚合物或其单元。例如，偶联部分可以包含免疫抑制剂与其静电结合的带电聚合物。作为另一个实例，偶联部分可以包含与其共价结合的聚合物或其单元。
在一些优选的实施方案中，合成纳米载体包含本文中提供的聚合物。这些合成纳米载体可以是完全聚合物，或者其可以是聚合物与其他物质的混合物。
在一些实施方案中，合成纳米载体的聚合物缔合以形成聚合物基质。在这些实施方案的一些中，组分(例如免疫抑制剂)可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物共价缔合。在一些实施方案中，共价缔合由接头介导。在一些实施方案中，组分可以与聚合物基质的一种或更多种聚合物非共价缔合。例如，在一些实施方案中，组分可以包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在整个聚合物基质中。作为替代或补充，组分可通过疏水相互作用、电荷相互作用、范德华力等与聚合物基质中的一种或更多种聚合物缔合。用于由此形成聚合物基质的广泛多种的聚合物和方法是常规已知的。
聚合物可以是天然或非天然(合成)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。就序列而言，共聚物可以是随机的、嵌段的、或包含随机和嵌段序列的组合。通常来说，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
在一些实施方案中，聚合物包含聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其单元。在另一些实施方案中，聚合物包含聚(乙二醇)(PEG)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己内酯、或其单元。在一些实施方案中，优选地，聚合物是生物可降解的。因此，在这些实施方案中，优选地，如果聚合物包含聚醚，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元，则聚合物包含聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，使得聚合物是生物可降解的。在另一些实施方案中，聚合物不仅仅包含聚醚或其单元，例如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其单元。
适用于本发明的聚合物的其他实例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二氧六环-2酮))、聚酸酐(例如聚(癸二酸酐))、聚富马酸丙酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己内酰胺)、聚缩醛、聚醚、聚酯(例如，聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚己内酯、聚羟基酸(例如聚(β-羟基链烷酸酯)))、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、和聚胺、聚赖氨酸、聚赖氨酸-PEG共聚物和聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯亚胺)-PEG共聚物。
在一些实施方案中，根据本发明的聚合物包含已由美国食品和药物管理局(Foodand Drug Administration，FDA)根据21C.F.R.§177.2600批准用于人的聚合物，包括但不限于：聚酯(例如，聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚己内酯、聚戊内酯、聚(1，3-二氧六环-2酮))；聚酸酐(例如，聚(癸二酸酐))；聚醚(例如，聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；和聚氰基丙烯酸酯。
在一些实施方案中，聚合物可以是亲水的。例如，聚合物可包含阴离子基团(例如磷酸根基团、硫酸根基团、羧酸根基团)；阳离子基团(例如季铵基团)；或极性基团(例如，羟基、巯基、胺基)。在一些实施方案中，包含亲水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生亲水性环境。在一些实施方案中，聚合物可以是疏水性的。在一些实施方案中，包含疏水性聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水性环境。聚合物的亲水性或疏水性的选择可对并入合成纳米载体内的物质的性质具有影响。
在一些实施方案中，聚合物可用一个或更多个部分和/或官能团进行修饰。根据本发明可使用多种部分或官能团。在一些实施方案中，聚合物可用聚乙二醇(PEG)、用碳水化合物和/或用来自于多糖的非环状聚缩醛进行修饰(Papisov，2001，ACS SymposiumSeries，786：301)。某些实施方案可使用Gref等的美国专利号5543158或von Andrian等的WO公开WO2009/051837的一般教导来进行。
在一些实施方案中，聚合物可以用脂质或脂肪酸基团修饰。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸或木蜡酸中的一种或更多种。在一些实施方案中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、反型异油酸、亚油酸、α-亚油酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或更多种。
在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包括：包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物和聚(丙交酯-乙交酯)共聚物，在本文中统称为“PLGA”；和包含乙醇酸单元的均聚物，在本文中称为“PGA”，以及包含乳酸单元的均聚物，例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D，L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”。在一些实施方案中，示例性聚酯包括例如：聚羟基酸；PEG共聚物以及丙交酯和乙交酯的共聚物(例如PLA-PEG共聚物、PGA-PEG共聚物、PLGA-PEG共聚物)及其衍生物。在一些实施方案中，聚酯包括例如：聚(己内酯)、聚(己内酯)-PEG共聚物、聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)共聚物、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]及其衍生物。
在一些实施方案中，聚酯可以是PLGA。PLGA是乳酸和乙醇酸的生物相容性和生物可降解的共聚物，并且多种形式的PLGA特征在于乳酸：乙醇酸的比例。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸。PLGA的降解速率可以通过改变乳酸：乙醇酸的比例来调节。在一些实施方案中，根据本发明待使用的PLGA特征在于约85∶15、约75∶25、约60∶40、约50∶50、约40∶60、约25∶75或约15∶85的乳酸∶乙醇酸比例。
在一些实施方案中，聚合物可以是一种或更多种丙烯酸类聚合物。在某些实施方案中，丙烯酸类聚合物包括例如：丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚氰基丙烯酸酯，以及包含一种或更多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。
在一些实施方案中，聚合物可以是阳离子聚合物。通常来说，阳离子聚合物能够缩合和/或保护核酸的带负电荷的链。含胺聚合物例如聚(赖氨酸)(Zauner et al.，1998，Adv.Drug Del.Rev.，30：97；and Kabanov et al.，1995，Bioconjugate Chem.，6：7)、聚(乙烯亚胺)(PEI；Boussif et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1995，92：7297)和聚(酰氨基胺)树枝状聚合物(Kukowska-Latallo et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，93：4897；Tang et al.，1996，Bioconjugate Chem.，7：703；and Haensler et al.，1993，Bioconjugate Chem.，4：372)在生理pH下带正电荷，与核酸形成离子对。在一些实施方案中，合成纳米载体可不包含(或可排除)阳离子聚合物。
在一些实施方案中，聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解聚酯(Putnam etal.，1999，Macromolecules，32：3658；Barrera et al.，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010；Kwon et al.，1989，Macromolecules，22：3250；Lim et al.，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633；和Zhou et al.，1990，Macromolecules，23：3399)。这些聚酯的实例包括：聚(L-丙交酯-L-赖氨酸)共聚物(Barrera et al.，1993，J.Am.Chem.Soc.，115：11010)、聚(丝氨酸酯)(Zhou et al.，1990，Macromolecules，23：3399)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam etal.，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim et al.，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)和聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(Putnam et al.，1999，Macromolecules，32：3658；和Lim et al.，1999，J.Am.Chem.Soc.，121：5633)。
这些和其他聚合物的特性及其制备方法是本领域中公知的(参见例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045和4,946,929；Wang et al.，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：9480；Lim et al.，2001，J.Am.Chem.Soc.，123：2460；Langer，2000，Acc.Chem.Res.，33：94；Langer，1999，J.Control.Release，62：7；和Uhrich et al.，1999，Chem.Rev.，99：3181)。更一般地，用于合成某些合适聚合物的多种方法描述于Concise Encyclopedia of Polymer Science andPolymeric Amines and Ammonium Salts，由Goethals编辑，Pergamon Press，1980；Principles of Polymerization by Odian，John Wiley&Sons，第四版，2004；Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al.，Prentice-Hall，1981；Deming etal.，1997，Nature，390：386；以及美国专利6,506,577、6,632,922、6,686,446和6,818,732中。
在一些实施方案中，聚合物可以是直链或支链聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以基本上彼此交联。在一些实施方案中，聚合物可以基本上不交联。在一些实施方案中，聚合物可以无需进行交联步骤来根据本发明使用。还应理解，合成纳米载体可包含前述任一种嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物和/或加合物以及其他聚合物。本领域技术人员将认识到，本文中列出的聚合物代表可根据本发明使用的聚合物的示例性而非全面的列举。
在一些实施方案中，合成纳米载体不包含聚合物组分。在一些实施方案中，合成纳米载体可包含金属颗粒、量子点、陶瓷颗粒等。在一些实施方案中，非聚合物合成纳米载体是非聚合物组分的聚集体，例如金属原子(例如金原子)的聚集体。
根据本发明的组合物可包含可药用赋形剂，例如防腐剂、缓冲剂、盐水或磷酸盐缓冲盐水。可使用常规药物制造和复配技术制备组合物以获得可用的剂型。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂一起悬浮在无菌注射用盐水溶液中。
D.使用和制备组合物的方法
可以用本领域普通技术人员已知或本文中其他地方描述的方法制备病毒载体。例如，可以使用例如在美国专利号4,797,368和Laughlin et al.，Gene，23，65-73(1983)中所述的方法来构建和/或纯化病毒载体。
例如，可以在补充细胞系(complementing cell line)中以适当的水平产生复制缺陷型腺病毒载体，所述补充细胞系提供不存在于复制缺陷型腺病毒载体中但是病毒繁殖所需的基因功能，从而产生高滴度的病毒载体储液。补充细胞系可补充由早期区、晚期区、病毒包装区、病毒相关RNA区或其组合编码的至少一种复制必需基因功能的缺陷，包括所有腺病毒功能(例如，以使腺病毒扩增子能够增殖)。补充细胞系的构建涉及标准分子生物学和细胞培养技术，例如以下中所述的那些：Sambrook et al.，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons.New York，N.Y.(1994)。
用于产生腺病毒载体的补充细胞系包括但不限于：HEK 293细胞(描述于例如Graham et al.，J.Gen.Virol.，36，59-72(1977))、PER.C6细胞(描述于例如国际专利申请WO 97/00326以及美国专利号5,994,128和6,033,908)和293-ORF6细胞(描述于例如国际专利申请WO 95/34671和Brough et al.，J.Virol.，71，9206-9213(1997))。在一些情况下，互补细胞不会补充所有需要的腺病毒基因功能。可使用辅助病毒以提供不由细胞或腺病毒基因组编码的反式基因功能，以使得能够复制腺病毒载体。可以使用由例如以下中所述的材料和方法来构建、扩增和/或纯化腺病毒载体：美国专利号5,965,358、5,994,128、6,033,908、6,168,941、6,329,200、6,383,795、6,440,728、6,447,995和6,475,757，美国专利申请公开号2002/0034735 A1，以及国际专利申请WO 98/53087、WO 98/56937、WO 99/15686、WO99/54441、WO 00/12765、WO 01/77304和WO 02/29388，以及本文中确定的其他参考文献。可以使用例如美国专利号5,837,511和5,849,561以及国际专利申请WO 97/12986和WO 98/53087中所述的方法来产生非组C腺病毒载体(包括腺病毒血清型35载体)。
可以使用重组方法产生病毒载体，例如AAV载体。例如，所述方法可包括培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因；由AAV末端反向重复序列(ITR)和转基因构成的重组AAV载体；和足够的辅助功能，以允许将重组AAV载体包装到AAV衣壳蛋白中。在一些实施方案中，病毒载体可以包含选自以下的AAV血清型的末端反向重复序列(ITR)：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及其变体。
待在宿主细胞中培养以在衣壳中包装病毒载体的组分可以反式地提供给宿主细胞。或者，可以由稳定的宿主细胞提供任一种或更多种所需的组分(例如，重组AAV载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，所述稳定宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法被工程化以包含一种或更多种所需组分。最合适地，这样的稳定的宿主细胞可包含在诱导型启动子的控制下的所需组分。然而，所需组分也可以在组成型启动子的控制下。可以使用任何合适的遗传元件来将产生病毒载体所需的重组病毒载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送到包装宿主细胞。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法(包括本文中所述的那些)递送。其他方法对于核酸操作技术人员是已知的，并且包括遗传工程、重组工程和合成技术。参见例如，Sambrook et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y。类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，K.Fisher et al，J.Virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。
在一些实施方案中，可以使用三重转染方法(例如，如美国专利号6,001,650、美国专利号6,593，123、以及X.Xiao et al，J.Virol.72：2224-2232(1998)和T.Matsushita etal，Gene Ther.5(7)：938-945(1998)中详细描述的，其涉及三重转染方法的内容通过引用并入本文)来产生重组AAV转移载体。例如，通过用待包装入AAV颗粒的重组AAV转移载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体转染宿主细胞可以产生重组AAV。一般来说，AAV辅助功能载体编码AAV辅助功能序列(rep和cap)，其反式地作用于多产的AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体产生，而不产生任何可检出的野生型AAV病毒粒子(即，包含功能rep和cap基因的AAV病毒粒子)。附属功能载体可以编码用于非AAV来源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，AAV依赖于所述功能以复制。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以来源于任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。
用于产生病毒载体的其他方法是本领域中已知的。此外，病毒载体可商购获得。
关于与免疫抑制剂偶联的合成纳米载体，将组分连接至合成纳米载体的方法可能是有用的。
在一些实施方案中，用于将组分连接至例如合成纳米载体的方法可能是有用的。在某些实施方案中，连接可以是共价接头。在一些实施方案中，根据本发明的免疫抑制剂可以通过由叠氮化物基团与包含炔基团的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应或通过炔与包含叠氮化物基团的免疫抑制剂的1，3-偶极环加成反应所形成的1，2，3-三唑接头共价连接至外表面。这样的环加成反应优选在Cu(I)催化剂以及合适的Cu(I)-配体和还原剂的存在下进行以将Cu(II)化合物还原为催化活性Cu(I)化合物。这种Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成(Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)也可以称为点击反应。
另外地，共价偶联可包含共价接头，包括酰胺接头、二硫接头、硫醚接头、腙连接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头和磺酰胺接头。
酰胺接头通过一种组分(例如免疫抑制剂)上的胺与第二组分(例如纳米载体)上的羧酸基团之间的酰胺键来形成。接头中的酰胺键可以使用任何常规的酰胺键形成反应用适当保护的氨基酸和活化羧酸(例如N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯)来制备。
二硫接头通过在例如R1-S-S-R2形式的两个硫原子之间形成二硫(S-S)键来制备。二硫键可以通过包含巯基/硫醇基团(-SH)的组分与另一活化的巯基或者包含巯基/硫醇基团的组分与包含活化巯基的组分的巯基交换而形成。
三唑接头(特别是其中R1和R2可以是任何化学实体的形式的1，2，3-三唑)通过连接到第一组分的叠氮化物与连接到第二组分(例如免疫抑制剂)的末端炔的1，3-偶极环加成反应来制备。1，3-偶极环加成反应在具有或不具有催化剂下(优选具有Cu(I)-催化剂下)进行，其通过1，2，3-三唑官能团连接两种组分。该化学由Sharpless et al.，Angew.Chem.Int.Ed.41(14)，2596，(2002)和Meldal，et al，Chem.Rev.，2008，108(8)，2952-3015详细描述，并且通常被称为“点击”反应或CuAAC。
硫醚接头通过形成例如R1-S-R2形式的硫-碳(硫醚)键来制备。硫醚可以通过用第二组分上的烷基化基团(例如卤化物或环氧化物)使一种组分上的巯基/硫醇(-SH)基团烷基化来制备。硫醚接头也可以通过一种组分上的巯基/硫醇基团与包含作为迈克尔受体的马来酰亚胺基团或乙烯基砜基团的第二组分上的缺电子烯基团的迈克尔加成(Michaeladdition)形成。在另一种方式中，硫醚接头可以通过一种组分上的巯基/硫醇基团与第二组分上的烯基的自由基巯基-烯反应来制备。
腙接头通过一种组分上的酰肼基团与第二组分上的醛/酮基团的反应来制备。
酰肼接头通过一种组分上的肼基团与第二组分上的羧酸基团的反应形成。这样的反应通常使用类似于形成酰胺键的化学进行，其中羧酸用活化试剂活化。
亚胺或肟接头通过一种组分上的胺或N-烷氧基胺(或氨氧基)基团与第二组分上的醛基或酮基的反应形成。
脲或硫脲接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的异氰酸酯或硫代异氰酸酯基团的反应来制备。
脒接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的酰亚胺酯基团的反应来制备。
胺接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的烷基化基团(例如卤化物、环氧化物或磺酸酯基)的烷基化反应来制备。或者，胺接头也可以通过用合适的还原剂(例如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠)将一种组分上的胺基与第二组分上的醛基或酮基还原胺化来制备。
磺酰胺接头通过一种组分上的胺基与第二组分上的磺酰卤(例如磺酰氯)基团的反应来制备。
砜接头通过亲核试剂与乙烯基砜的迈克尔加成制备。乙烯基砜或亲核试剂可以在纳米载体的表面上或与组分连接。
组分也可以通过非共价缀合方法缀合。例如，带负电荷的免疫抑制剂可以通过静电吸附与带正电荷的组分缀合。包含金属配体的组分也可以通过金属-配体配合物与金属配合物缀合。
在一些实施方案中，在组装合成纳米载体之前，组分可以与聚合物(例如聚乳酸嵌段-聚乙二醇)连接，或者合成纳米载体可以在其表面上形成具有反应性或可活化基团。在后一种情况下，组分可以制备有与合成纳米载体的表面所呈递的连接化学物质相容的基团。在另一些实施方案中，可以使用合适的接头使肽组分与VLP或脂质体连接。接头是能够使两个分子偶联在一起的化合物或试剂。在一个实施方案中，接头可以是如Hermanson2008中所述的同双官能或异双官能试剂。例如，可以在EDC的存在下用同双官能接头己二酸二酰肼(ADH)处理表面上包含羧基的VLP或脂质体合成纳米载体，以形成具有ADH接头的相应合成纳米载体。然后使所得的ADH连接的合成纳米载体通过纳米载体上的ADH接头的另一端与包含酸基团的肽组分缀合，以产生相应的VLP或脂质体肽缀合物。
在一些实施方案中，制备了在聚合物链末端包含叠氮化物或炔基团的聚合物。然后以多个炔或叠氮化物基团位于纳米载体表面的方式用该聚合物制备合成纳米载体。或者，合成纳米载体可以通过其他途径制备，并且随后用炔或叠氮化物基团官能化。在炔(如果聚合物包含叠氮化物)或叠氮化物(如果聚合物包含炔)的存在下制备组分。然后使组分在有或者没有催化剂的情况下通过1，3-偶极环加成反应与纳米载体反应，所述催化剂通过1，4-二取代的1，2，3-三唑接头使组分与颗粒共价连接。
如果组分是小分子，则在组装合成纳米载体之前使组分与聚合物连接可能是有利的。在一些实施方案中，还可能有利的是制备具有表面基团的合成纳米载体，其用于通过使用这些表面基团使组分与合成纳米载体连接，而不是使组分与聚合物连接然后在合成纳米载体的构建中使用该聚合物缀合物。
对于可用的缀合方法的详细描述，参见Hermanson G T“BioconjugateTechniques”，第二版Academic Press，Inc.出版，2008。除了共价连接之外，组分可以通过吸附连接至预先形成的合成纳米载体，或者其可以在形成合成纳米载体期间通过包封连接。
可使用本领域中已知的广泛多种方法制备合成纳米载体。例如，合成纳米载体可通过例如以下的方法形成：纳米沉淀、使用流体通道的流聚焦、喷雾干燥、单和双乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、研磨、微乳化操作、微米制造、纳米制造、牺牲层、简单和复杂的凝聚、以及本领域普通技术人员公知的其他方法。作为替代或补充，已经描述了用于单分散半导体、传导性、磁性、有机和其他纳米材料的水性和有机溶剂合成(Pellegrino et al.，2005，Small，1：48；Murray et al.，2000，Ann.Rev.Mat.Sci.，30：545；和Trindade et al.，2001，Chem.Mat.，13：3843)。在文献中已经描述了另外的方法(参见例如Doubrow，Ed.，“Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy，”CRC Press，BocaRaton，1992；Mathiowitz et al.，1987，J.Control.Release，5：13；Mathiowitz et al.，1987，Reactive Polymers，6：275；和Mathiowitz et al.，1988，J.Appl.Polymer Sci.，35：755；美国专利5578325和6007845；P.Paolicelli et al.，“Surface-modified PLGA-basedNanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-likeParticles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010))。
可使用多种方法如所期望地将物质包封到合成纳米载体中，所述方法包括但不限于：C.Astete et al.，“Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles”J.Biomater.Sci.Polymer Edn，Vol.17，No.3，pp.247-289(2006)；K.Avgoustakis“Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide)Nanoparticles：Preparation，Properties and Possible Applications in Drug Delivery”CurrentDrug Delivery 1：321-333(2004)；C.Reis et al.，“Nanoencapsulation I.Methods forpreparation of drug-loaded polymeric nanoparticles”Nanomedicine 2：8-21(2006)；P.Paolicelli et al.，“Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that canEfficiently Associate and Deliver Virus-like Particles”Nanomedicine.5(6)：843-853(2010)。可使用适合于将物质包封到合成纳米载体中的其他方法，包括但不限于2003年10月14日授权的Unger的美国专利6,632,671中公开的方法。
在某些实施方案中，合成纳米载体通过纳米沉淀法或喷雾干燥制备。可改变用于制备合成纳米载体的条件以产生期望尺寸或特性(例如，疏水性、亲水性、外部形态、“黏性”、形状等)的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件(例如，溶剂、温度、浓度、空气流量等)可取决于待与合成纳米载体连接的物质和/或聚合物基质的组成。
如果通过任何上述方法制备的合成纳米载体的尺寸范围在所期望范围之外，则可以例如使用筛子对合成纳米载体的尺寸进行调整。
合成纳米载体的要素可以例如通过一个或更多个共价键与整个合成纳米载体连接，或者可以通过一个或更多个接头连接。合成纳米载体官能化的其他方法可以修改自Saltzman等的公开美国专利申请2006/0002852、DeSimone等的公开美国专利申请2009/0028910或Murthy等的公开国际专利申请WO/2008/127532A1。
作为替代或补充，合成纳米载体可以通过非共价相互作用直接或间接地连接至组分。在一些非共价实施方案中，非共价连接由非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用、亲和相互作用、金属配位、物理吸附、主客体相互作用、疏水相互作用、TT堆积相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用、磁性相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、和/或其组合。这样的连接可布置在合成纳米载体的外表面或内表面上。在一些实施方案中，包封和/或吸收是连接形式。
本文中提供的组合物可包含无机或有机缓冲剂(例如，磷酸、碳酸、乙酸或柠檬酸的钠盐或钾盐)和pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾、柠檬酸盐或乙酸盐、氨基酸及其盐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、α-生育酚)、表面活性剂(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、脱氧胆酸钠)、溶液和/或冷冻/冻干稳定剂(例如，蔗糖、乳糖、甘露糖醇、海藻糖)、渗透调节剂(例如，盐或糖)、抗菌剂(例如，苯甲酸、酚、庆大霉素)、消泡剂(例如，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilozone))、防腐剂(例如，硫柳汞、2-苯氧基乙醇、EDTA)、聚合物稳定剂和黏度调节剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆488、羧甲基纤维素)和共溶剂(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。
根据本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可使用常规药物制造和复配技术制备组合物以获得可用的剂型。适用于实施本发明的技术可见于Handbook of IndustrialMixing：Science and Practice，Edward L.Paul编辑，Victor A.Atiemo-Obeng，和SuzanneM.Kresta，2004John Wiley&Sons，Inc.；和Pharmaceutics：The Science of Dosage FormDesign，2nd Ed.M.E.Auten编辑，2001，Churchill Livingstone。在一个实施方案中，将组合物与防腐剂悬浮在无菌注射用盐水溶液中。
应理解，本发明的组合物可以以任何合适的方式制备，并且本发明决不限于可以使用本文中所述的方法产生的组合物。选择合适的制造方法可能需要注意相关的特定部分的特性。
在一些实施方案中，组合物在无菌条件下制备或者在最终进行灭菌。这可以确保所得组合物是无菌且非感染性的，因此当与非无菌组合物相比时提高安全性。这提供了有价值的安全措施，尤其是当接受组合物的对象具有免疫缺陷、患有感染和/或易感于感染时。
根据本发明的施用可以通过多种途径，包括但不限于：皮下、静脉内、肌内和腹膜内途径。本文中提及的组合物可以制造和制备以用于使用常规方法施用，在一些实施方案中共施用。
本发明的组合物可以以有效量(例如本文中其他地方描述的有效量)施用。剂型可以以多种频率施用。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，在有或没有病毒载体的情况下，进行包含免疫抑制剂之合成纳米载体的重复施用。
本发明的一些方面涉及确定本文中提供的施用方法的方案。可以通过至少改变例如根据所提供的施用方案的包含免疫抑制剂之合成纳米载体和/或病毒载体的频率、剂量并评估期望或不期望的免疫应答或转基因表达来确定方案。用于实施本发明的优选方案降低针对病毒载体或其病毒抗原的免疫应答和/或促进转基因表达。所述方案至少包括例如根据本文中提供的任一种施用方案的包含免疫抑制剂之合成纳米载体和/或病毒载体的施用频率和剂量。本文中提供的任一种方法可包括确定方案的步骤或根据所确定的方案进行施用步骤以实现本文中提供的任一种或更多种期望结果。
本公开内容的另一方面涉及药盒。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，药盒包含本文中提供的任一种或更多种组合物。优选地，组合物是提供本文中提供的任一种或更多种剂量的量。组合物可在药盒中的一个容器中或多于一个容器中。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，容器是小瓶或安瓿。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，组合物各自以冻干形式在单独的容器中或在同一容器中，使得其可在随后的时间重构。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，药盒还包含用于重构、混合、施用等的说明书。在所提供的任一种药盒的一些实施方案中，说明书包含本文中所述的任一种方法的描述。说明书可以是任何合适的形式，例如印刷插页或标签。在本文中提供的任一种药盒的一些实施方案中，药盒还包含一个或更多个注射器或者可将组合物体内递送至对象的其他装置。
实施例
实施例1：包含雷帕霉素的合成纳米载体
材料
雷帕霉素购自TSZ CHEM(185Wilson Street，Framingham，MA 01702；产品目录#R1017)。具有76％丙交酯和24％乙交酯含量且特性黏度为0.69dL/g的PLGA购自SurModicsPharmaceuticals(756Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211.产品代码7525 DLG 7A)。具有约5,000Da的PEG嵌段和约40,000Da的PLA嵌段的PLA-PEG嵌段共聚物购自SurModicsPharmaceuticals(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100DL mPEG50005CE)。聚乙烯醇(85％至89％水解)购自EMD Chemicals(产品号1.41350.1001)。
方法
溶液如下制备：
溶液1：二氯甲烷中75mg/mLPLGA和25mg/mLPLA-PEG。通过将PLGA和PLA-PEG溶解在纯二氯甲烷中制备该溶液
溶液2：二氯甲烷中100mg/mL雷帕霉素。通过将雷帕霉素溶解在纯二氯甲烷中制备该溶液。
溶液3：100mM pH 8磷酸盐缓冲液中50mg/mL聚乙烯醇。
使用水包油乳剂制备纳米载体。通过在小压力管中合并溶液1(1mL)、溶液2(0.1mL)和溶液3(3mL)并且使用Branson Digital Sonifier250以30％振幅进行声处理60秒来制备O/W乳剂。将O/W乳剂添加至包含70mM pH 8磷酸盐缓冲溶液(30mL)的烧杯中，并在室温下搅拌2小时，以使二氯甲烷蒸发并且形成纳米载体。通过将纳米载体悬浮液转移到离心管中并在75,000×g和4℃下离心35分钟，除去上清液，并将沉淀重悬在磷酸盐缓冲盐水中来洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，并将沉淀重悬于磷盐酸缓冲盐水中，得到约10mg/mL的最终纳米载体分散体。
通过动态光散射确定纳米载体尺寸。通过HPLC分析确定纳米载体中雷帕霉素的量。通过重量法确定每mL悬浮液的总干纳米载体质量。
有效直径(nm) 雷帕霉素含量(％w/w)
227 6.4
实施例2：包含GSK1059615的合成纳米载体
材料
GSK1059615购自MedChem Express(11 Deer Park Drive，Suite 102D MonmouthJunction，NJ 08852)，产品代码HY-12036。丙交酯∶乙交酯比例为1∶1且特性黏度为0.24dL/g的PLGA购自Lakeshore Biomaterials(756Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211)，产品代码5050DLG 2.5A。具有约5,000Da的甲基醚封端的PEG嵌段且总特性黏度为0.26DL/g的PLA-PEG-OMe嵌段共聚物购自Lakeshore Biomaterials(756 Tom Martin Drive，Birmingham，AL 35211；产品代码100 DL mPEG 5000 5K-E)。Cellgro磷酸盐缓冲盐水1X pH7.4(PBS 1X)购自Corning(9345 Discovery Blvd.Manassas，VA 20109)，产品代码21-040-CV。
方法
溶液如下制备：
溶液1：将PLGA(125mg)和PLA-PEG-OMe(125mg)溶解在10mL丙酮中。溶液2：10mg的GSK1059615在1mL N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中制备。
通过在小玻璃压力管中合并溶液1(4mL)和溶液2(0.25mL)并在搅拌下将混合物逐滴添加至包含20mL超纯水的250mL圆底烧瓶来制备纳米载体。将烧瓶安装在旋转蒸发装置上，并在减压下除去丙酮。通过将纳米载体悬浮液转移到离心管中并在75,600rcf和4℃下离心50分钟，除去上清液，并将沉淀重悬在PBS 1X中来洗涤一部分纳米载体。重复洗涤过程，并将沉淀重悬于PBS 1X中，以获得基于聚合物的标称浓度为10mg/mL的纳米载体悬浮液。然后使用来自Pall的1.2μm PES膜注射器过滤器(部件号4656)过滤经洗涤的纳米载体溶液。如上制备相同的纳米载体溶液，并在过滤步骤之后与第一次的合并。将均匀悬浮液在-20℃下冷冻储存。
通过动态光散射确定纳米载体尺寸。通过在351nm的UV吸收确定纳米载体中GSK1059615的量。通过重量法确定每mL悬浮液的总干纳米载体质量。
有效直径(nm) GSK1059615含量(％w/w)
143 1.02
实施例3：如果AAV和与雷帕霉素偶联之合成纳米载体预混合，则体内早期AAV编码 的转基因表达不受影响
在标准雄性小鼠AAV转导模型中，如果AAV和与雷帕霉素偶联之合成纳米载体(SVP[Rapa])(在这种情况下为包封的雷帕霉素)预混合，则体内早期AAV编码的转基因表达不受影响；如果在AAV之后立即施用SVP[Rapa]，则转基因表达较差；发现这种效果不依赖于IgG抗体形成。
具体地，在有或没有SVP包封的雷帕霉素(在该实施例中为SVP[Rapa])的情况下，用AAV-SEAP注射(i.v.，尾静脉)6至12只雄性C57BL/6小鼠的组，所述SVP包封的雷帕霉素与AAV混合然后施用，或者在AAV-SEAP之后立即注射(15分钟间隔内；标记为“未混合”)。在指定的时间(第19天)，将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。然后使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的测定试剂盒测量血清中的SEAP水平。简单地说，将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，然后冷却至室温，平板接种至96孔格式，添加测定缓冲液(5分钟)，然后添加底物(20分钟)并且将板在光度计(477nm)上读取。
单独地，在ELISA测定法中测量针对AAV的IgG抗体：96孔板用AAV涂覆过夜，在第二天洗涤并封闭，然后将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育；然后洗涤板，添加山羊抗小鼠IgG特异性-HRP，并在再一次孵育和洗涤之后，通过添加TMB底物并以570nm的参比波长测量450nm的吸光度来检测针对AAV的IgG抗体的存在(表示为最高光密度(optical density，OD)的信号强度与样品中IgG抗体的量成正比)。
虽然混合的SVP[Rapa]在此时间点不影响SEAP表达，但是在依次注射AAV-SEAP然后注射SVP[Rapa]的小鼠中SEAP表达下调(图1A)。这种效果不依赖于针对AAV的IgG抗体的诱导，因为在该时间点用SVP[Rapa]处理的所有小鼠均显示出针对AAV的IgG抗体的下调(图1B)。
实施例4：无论施用顺序如何，未混合的与雷帕霉素偶联之合成纳米载体导致AAV 驱动的转基因表达的早期下调
在该实验中，发现无论施用顺序如何，未混合的SVP[Rapa]导致AAV驱动的转基因表达的早期下调。发现在接受了与SVP[Rapa]组合的AAV的小鼠中转基因表达水平随时间提高；这种效果与通过SVP[Rapa]的IgG抗体下调无关。
具体地，在有或没有SVP[Rapa]的情况下，用AAV-SEAP i.v.注射5至6只雄性C57BL/6小鼠的组，所述SVP[Rapa]与AAV混合，或者在AAV-SEAP之前或之后间隔15分钟或1小时分开注射。在指定的时间(d19和d75)测量小鼠血清中SEAP活性和针对AAV的IgG抗体。
AAV-SEAP和SVP[Rapa]的分开施用导致在第19天SEAP的较低表达(图2A)。以1小时间隔处理的小鼠比以15分钟间隔注射的那些表现出稍低的表达。施用混合的AAV-SEAP和SVP[Rapa]的小鼠与仅注射AAV-SEAP的那些具有相同的SEAP表达水平(图2A)。值得注意的是，在接受SVP[Rapa]的所有小鼠中SEAP表达的水平随时间增长，并且到第75天，接受混合的AAV-SEAP和SVP[Rapa]的那些小鼠表达的SEAP水平高于仅接受AAV-SEAP的那些，而接受未混合的AAV-SEAP和SVP[Rapa]的小鼠的组产生的SEAP水平与仅接受AAV-SEAP那些相似(图2B)。这种现象与IgG抗体下调无关，IgG抗体下调在接受SVP[Rapa]的所有组中均可见(图2C)。
实施例5：如论IgG抗体应答如何，混合的与雷帕霉素偶联之合成纳米载体和AAV- SEAP导致转基因表达的立即升高
在该实验中，发现如论IgG抗体应答如何，向雌性小鼠施用与AAV-SEAP一起的SVP[Rapa]导致转基因表达的立即升高。
从实施例3和4可以看出，未混合的SVP[Rapa]和AAV在短期内可能具有较差的效果。然而，这种现象在早期时间点(例如第19天)可能被AAV的有效转导所掩盖，这是雄性C57BL/6小鼠中常见的。单独地，在有或没有SVP[Rapa]的情况下，用两种不同剂量的AAV-SEAP i.v.接种C57BL/6雌性小鼠的组，在第12天和第19天测量血清中的SEAP活性和AAVIgG抗体。发现在接受了混合AAV-SEAP和SVP[Rapa]的所有小鼠中，在AAV接种之后，立即发生SEAP表达水平升高，平均升高2倍(图3A)。值得注意的是，这是在非常早的时间点(例如第12天)观察到的，在该时间点观察到最小的IgG抗体诱导(图3B)。此外，所述组之间SEAP表达的相对水平在给定的时间间隔内(注射之后12至19天)保持相同，而在SVP[Rapa]-未处理的组中IgG抗体水平在相同时间内增长(图3B)。
这些结果证实了携带转基因的AAV与SVP[Rapa]一起施用导致体内转基因表达的水平更高，这在不太适合AAV转导的系统中尤为明显，并且这种现象与通过SVP[Rapa]的AAVIgG抗体下调无关。
实施例6：体外AAV和与雷帕霉素偶联之合成纳米载体的混合导致其在15分钟内完 全吸附
具体地，将在1mL PBS中的2.5×1011VG的AAV或SVP[Rapa]颗粒分别地(图4A)或者在混合之后(AAV∶SVP[Rapa]颗粒比例为100∶1)立即或孵育15分钟之后(图4B)添加至石英比色皿并通过DLS测量。
在AAV与SVP[Rapa]混合之后立即时(图4B)，观察到两个独立的峰，其对应于分别测量的AAV和SVP[Rapa]的尺寸(图4A；对应地为25和150nm)。将SVP[Rapa]与AAV混合之后15分钟时，仅观察到单个峰(图4B)，其对应于纳米载体的尺寸，指示AAV完全吸附至SVP[Rapa]。
实施例7：通过施用与雷帕霉素偶联之合成纳米载体和病毒载体，早期AAV IgM诱 导下调
在有或没有SVP包封的雷帕霉素(在该实施例中为SVP[Rapa])或对照仅聚合物(在该实施例中为SVP[Empty])的情况下，用1×101病毒基因组(viral genome，VG)的AAV-SEAP注射(i.v.，尾静脉)5只雌性C57BL/6小鼠的组，所述SVP包封的雷帕霉素与AAV混合然后施用，或者在AAV-SEAP立即之前注射(15分钟间隔内；标记为“未混合”)。在指定的时间(A中第5天和第10天，B中第6天、第12天、第19天和第89天)，将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。单独地，用ELISA测定法测量针对AAV的IgM抗体：96孔板用AAV涂覆过夜，在第二天洗涤并封闭，然后将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育；然后洗涤板，添加山羊抗小鼠IgM特异性-HRP，并在再一次孵育和洗涤之后，通过添加TMB底物并以570nm的参比波长测量450nm的吸光度来检测针对AAV的IgM抗体的存在(表示为最高光密度(OD)的信号强度与样品中IgM抗体的量成正比)。
与AAV混合和未混合施用的SVP[Rapa]均在AAV注射之后第5天(图5A)和第7天(图5B)强烈下调IgM的早期诱导至接近正常血清基线(虚线)的水平。在第10天仍然观察到这种效果(图5A)，但是到第12天和更久(图5B)时不太明显，在该时间点未处理小鼠中的IgM水平逐渐降低。在用对照SVP[Empty]纳米载体处理的组中没有观察到IgM下调活性。
实施例8：AAV施用之后针对AAV衣壳的早期IgM水平与转基因表达水平负相关
在有或没有SVP[Rapa]或有SVP[Empty]的情况下，用AAV-SEAP(1×1010VG)i.v.注射8组4至5只雌性C57BL/6小鼠，所述SVP[Rapa]与AAV混合，或者在AAV-SEAP立即之前分开注射。在指定的时间(d7至d89)测量SEAP活性和AAV IgM水平(图6)。在第92天，用与初免相同量的AAV-SEAP加强所有动物，并进行相同的处理。使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的测定试剂盒测量血清中的SEAP水平。简单地说，将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，然后冷却至室温，平板接种至96孔格式，添加测定缓冲液(5分钟)，然后添加底物(20分钟)并且将板在光度计(477nm)上读取。
在AAV施用之后第7天，此时血清中SEAP的总体水平通常较低，d7的IgM水平显示出与血清SEAP水平极其强烈且统计学上显著的负相关(图中所示的p值)。在初始AAV和SVP[Rapa]施用之后，这种相关性维持近三个月。此外，在第92天AAV-SEAP加强之后，最初具有低AAV IgM水平的那些动物以更有益的方式(即通过将转基因表达提高至更高水平)响应加强，而具有最初高IgM水平的那些动物以较弱的方式(即转基因表达的较少升高)响应。结果，在加强之后(d99和d104或者加强之后第7天和第12天)，初始(第7天)AAV IgM水平与加强之后血清SEAP水平之间的负相关变得更强。
实施例9：在合成纳米载体和病毒载体之前施用与雷帕霉素偶联之合成纳米载体 (预测)
用SVP[Rapa]i.v.注射对象的组，并在30天内，用AAV-SEAP(1×1010VG)和SVP[Rapa](其混合或不混合，但同时施用)i.v.注射对象。在指定的时间测量SEAP活性和AAVIgM水平。
实施例10：进一步施用与雷帕霉素偶联之合成纳米载体和病毒载体(预测)
在实施例9的对象的第二次施用的30天内，用SVP[Rapa]再次i.v.注射对象。在另一个30天内，用AAV-SEAP(1×101VG)和SVP[Rapa](其混合或不混合，但同时施用)i.v.注射对象。在指定的时间再次测量SEAP活性和AAV IgM水平。
实施例11：IgG抑制
用1×1010病毒基因组(VG)的AAV-SEAP单独或与SVP包封的雷帕霉素(在该实施例中(SVP[Rapa]))或对照仅聚合物(在该实施例中(SVP[Empty]))(i.v.，尾静脉)一起注射5只雌性C57BL/6小鼠的组，所述SVP包封的雷帕霉素与AAV混合然后施用，或者在AAV-SEAP之前注射(15分钟内；标记为“未混合”)。在指定的时间将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。
在ELISA测定法中测量针对AAV的IgG抗体：96孔板用AAV涂覆过夜，在第二天洗涤并封闭，然后将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育；然后洗涤板，添加山羊抗小鼠IgG特异性-HRP，并在再一次孵育和洗涤之后，通过添加TMB底物并以570nm的参比波长测量450nm的吸光度来检测针对AAV的IgG抗体的存在(表示为最高光密度(OD)的信号强度与样品中IgG抗体的量成比例)。使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的测定试剂盒测量SEAP水平。将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，冷却至室温，平板接种至96孔格式，添加测定缓冲液(5分钟)，然后添加底物(20分钟)并且将板在光度计(477nm)上读取。
混合和未混合的SVP[Rapa]均抑制针对AAV的IgG的早期诱导(图7)。无论SVP[Rapa]是与AAV混合还是在AAV注射之前单独施用，这种效果都很强。
与AAV混合和未混合的SVP[Rapa]均促进血清中SEAP表达的早期和一致升高(图8)。两种SVP[Rapa]处理组中的SEAP表达均为未处理的组中SEAP表达的2.5至3.0倍，也为对照SVP[Empty]处理的组中SEAP表达的2.5至3.0倍。在第7天观察到这种差异并且持续至少7周。
实施例12：IgM和IgG抑制
用1×1010病毒基因组(VG)的AAV单独或与SVP包封的雷帕霉素(在该实施例中为SVP[Rapa])一起注射(i.v.，尾静脉)5只雌性C57BL/6小鼠的组，所述SVP包封的雷帕霉素与AAV混合然后施用(第0天)，在AAV之前一天(第-1天)分开注射，或者在AAV之前一天分开注射和混合注射两者(第-1天、第0天)。在指定的时间将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。如上所述确定针对AAV的IgM和IgG水平。
虽然SVP[Rapa]与AAV混合导致AAV IgM(图9)和IgG(图10)二者的抑制，但是如果SVP[Rapa]在AAV之前一天分开施用，观察到类似的效果。值得注意的是，这两组中的AAVIgM(到第13天，图9)和IgG(到第20天，图10)都在稍后的时间点开始变高，尽管它们的水平保持低于未处理的小鼠。同时，用在AAV注射之前一天的SVP[Rapa]和混合的SVP[Rapa]两者处理(第-1天、第0天)的小鼠在第5天显示最低的AAV IgM水平(到第13天微小升高，图9)并且直至第20天没有AAV IgG发展(图10)。因此，在第-1天和第0天接受SVP[Rapa]处理的小鼠中，AAV IgM和IgG抗体的产生被更强烈地抑制。
实施例13：包含免疫抑制剂之合成纳米载体
包含免疫抑制剂(例如雷帕霉素)的合成纳米载体可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法制备。优选地，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，包含免疫抑制剂之合成纳米载体通过美国公开号US 2016/0128986 A1和美国公开号US2016/0128987 A1中的任一种方法制备，所述的这样的制备方法和所得的合成纳米载体通过引用整体并入本文。在本文中提供的任一种方法或组合物中，包含免疫抑制剂之合成纳米载体是这样并入的合成纳米载体。含雷帕霉素之合成纳米载体用至少类似于这些并入方法的方法制备并用于以下实施例中。
实施例14：包含免疫抑制剂之合成纳米载体的分开剂量
发现相对于与AAV载体共注射的相同累积剂量的雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)，将雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)的剂量分成两部分并且在AAV载体与雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)剂量的第二半共注射之前施用第一半在转基因表达(图11A)及其对抗病毒IgG的抑制作用(图11B)两方面都是有益的。
在第0天和第92天用1×1010病毒基因组(VG)的AAV-SEAP注射(静脉内，i.v.，尾静脉)5只雌性C57BL/6小鼠的组，所述AAV-SEAP为单独的(AAV-SEAP)，或者具有含雷帕霉素之合成纳米载体(AAV-SEAP+含雷帕霉素之合成纳米载体，100μg，d0，92)，或者具有在AAV注射之前两天递送和与AAV注射一起递送的含雷帕霉素之合成纳米载体(50μg雷帕霉素)(AAV-SEAP+含雷帕霉素之合成纳米载体，d-2，0，90，92)。在图11A中指定的时间(第7天、第19天、第75天、第99天、第104天和第111天)将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。
使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的测定试剂盒测量血清中的SEAP水平。简单地说，将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，然后冷却至室温，平板接种至96孔格式，用测定缓冲液孵育(5分钟)，然后添加底物(20分钟)，并且使用光度计(477nm)读取板。
单独地，使用ELISA测量针对AAV的IgG抗体。96孔板用AAV涂覆过夜，然后在第二天洗涤并封闭。将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育。然后洗涤板，添加山羊抗小鼠IgG特异性-HRP。在再一次孵育和洗涤之后，通过添加TMB底物并以570nm的参比波长测量450nm的吸光度来检测针对AAV的IgG抗体的存在(图11B中，表示为最高光密度(OD)的信号强度与样品中IgG抗体的量成正比)。
在共施用与AAV-SEAP混合的含雷帕霉素之合成纳米载体(50μg)之前2天施用含雷帕霉素之合成纳米载体(50μg)导致SEAP表达的立即升高(图11A)，其在某些时间点为没有SVP的几乎两倍高。在图上方示出了每组中每个时间点相比于第19天(d19)时未处理小鼠中的表达(100％)的相对表达。同时，相同的总100μg剂量(含雷帕霉素之合成纳米载体与AAV混合并共施用)对转基因表达没有有益效果。在第92天加强(由箭头指示)之后观察到相似的效果。值得注意的是，含雷帕霉素之合成纳米载体的两种施用方案在初免和加强之后同样地抑制针对AAV的IgG应答的形成(图11B)。
实施例15：包含免疫抑制剂之合成纳米载体以至少两部分给药
发现以两部分递送雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)剂量导致稳定升高的转基因表达，其中在AAV与剂量的第二半共注射之前两天施用第一部分(图12)。
在第0天用1×1010VG的AAV-SEAP注射(i.v.，尾静脉)9至10只雌性C57BL/6小鼠的组，所述AAV-SEAP为单独的(AAV-SEAP)，或者具有在AAV注射之前两天递送和与AAV注射一起递送的50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)(AAV-SEAP+含雷帕霉素之合成纳米载体，d-2，0)。在指定的时间(第7、12、19、33、48和77天)将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。如实施例14中所述测量血清中的SEAP水平。
在共施用与AAV-SEAP混合的另外50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)之前2天施用50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)导致SEAP表达的立即升高，其通常为没有合成纳米载体的2倍高(并且在AAV施用之后7天早期为3倍高)。这种差异是稳定的并且在所有连续时间点保持(在图上方示出了每个组中每个时间点相比于d19时的未处理小鼠中的表达(取100％)的相对表达)。
实施例16：包含免疫抑制剂之合成纳米载体的另外剂量
发现在AAV载体与雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)共注射之前，将雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)的另外剂量递送到AAV免疫小鼠中导致升高的转基因表达。
由于预先施用50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)显示对于AAV初免之后的转基因表达是有益的，因此检查了其在先前暴露于AAV的动物中是否也是有益的。在第0天用1×1010VG的AAV-RFP单独地或与50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)混合注射(i.v.，尾静脉)5只雌性C57BL/6小鼠的组，然后用相同剂量的AAV-SEAP进行加强，该AAV-SEAP为单独的，或者与雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)混合，或者具有与AAV-SEAP混合的和在AAV-SEAP之前三天预先注射的雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)。在指定的时间将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。如实施例14中所述测量血清中的SEAP水平和针对AAV的IgG。
未用含雷帕霉素之合成纳米载体处理的动物(AAV-RFP/AAV-SEAP)未显示出有意义的SEAP转基因表达(图13A)。仅在AAV-RFP初免时施用50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)(AAV-RFP+含雷帕霉素之合成纳米载体/AAV-SEAP)显示出了低水平的转基因表达(通常，为未预先注射AAV-RFP的未免疫小鼠的10％至13％)。通过在初免和加强两个时间施用含雷帕霉素之合成纳米载体(AAV-RFP/AAV-SEAP；含雷帕霉素之合成纳米载体，d0，86)实现了转基因表达的进一步提高，其有时超过20％并保持在15％至24％的区间内。相比之下，在AAV加强之前3天施用另外的含雷帕霉素之合成纳米载体导致SEAP表达升高得更高，其有时超过未免疫小鼠的50％并保持在34％至52％范围内(在图上方示出了每个组中每个时间点相比于未初免小鼠中每个时间点的表达(取作100％)的相对表达)。
该转基因表达排序密切且相反地对应于AAV IgG的存在，其中未用含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠显示立即的IgG产生，IgG产生然后通过加强(如图13B中的箭头所示)进一步升高。仅在初免时用含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠在加强之后不久产生AAV IgG，而在初免和加强时均处理的那些显示延迟数周的加强之后的抗体发展。值得注意的是，在AAV加强之前用含雷帕霉素之合成纳米载体另外地处理的小鼠大部分在研究期间保持抗体阴性，仅单个小鼠在加强之后7周示出了可检测的IgG抗体(图13B)。
实施例17：包含免疫抑制剂之合成纳米载体的另外剂量
发现在AAV载体和含雷帕霉素之合成纳米载体共注射之前，将含雷帕霉素之合成纳米载体的另外剂量递送到具有低的预先存在的AAV IgG水平(并且在初始初免剂量时未用含雷帕霉素之合成纳米载体处理)的小鼠中对加强之后的转基因表达是必要的。
由于预先施用另外的50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)显示对于在先前暴露于AAV但也在初始初免时用含雷帕霉素之合成纳米载体处理的动物中AAV加强之后的转基因表达是有益的，因此检查了在没有含雷帕霉素之合成纳米载体共施用的情况下通过AAV免疫进行AAV预暴露的动物中是否发现类似的益处。在第0天用2×109VG的AAV-RFP注射(i.v.，尾静脉)5至7只雌性C57BL/6小鼠的组，然后选择具有低水平AAV IgG(在初免之后第75天最高OD≤0.3)的那些小鼠，并在第92天用1×1010VG的AAV-SEAP进行加强，该AAV-SEAP为单独的，或者与含雷帕霉素之合成纳米载体混合，或者具有与AAV-SEAP混合的和在AAV-SEAP之前两天预先注射的含雷帕霉素之合成纳米载体二者。在指定的时间将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。如
实施例14中所述测量血清中的SEAP水平和针对AAV的IgG。
在加强时未用含雷帕霉素之合成纳米载体处理或接受单次含雷帕霉素之合成纳米载体施用(AAV-RFP/SEAP；含雷帕霉素之合成纳米载体≤1)的动物显示出了非常少的SEAP转基因表达(图14A)。转基因表达通常在5％至9％区间内(与未免疫小鼠中100％的表达相比)并且是由于五只小鼠中的单个小鼠表现出有意义的表达水平(参见图14B中的左列)。相比之下，来自在AAV加强之前2天和在加强时施用50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)的组的小鼠(AAV-RFP/SEAP；含雷帕霉素之合成纳米载体＝2)显示出了明显得多的SEAP表达，其与未免疫小鼠的表达相比通常保持在34％至40％范围内(对于每个组中每个时间点的相对表达示出在图14A中)。值得注意的是，在该组中七只小鼠中的五只显示出了可检测的SEAP表达(参见图14B中的右列)，这导致实验组之间统计学上显著不同的SEAP表达水平(图14B)。
AAV免疫小鼠中的这种加强之后的转基因表达活性密切且相反地对应于针对AAV的回忆性应答的发展，如通过在接受少于两次含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠中AAV IgG的升高以及在AAV加强之前和AAV加强时接受两次含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠中这种应答的抑制所证明的(图14C，用箭头示出加强)。用少于两个剂量的含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠早在加强之后7天就显示出了强烈的AAV IgG加强应答(图14C)，因为五只小鼠中除了一只小鼠之外都变成强烈的AAV IgG阳性。同时，用含雷帕霉素之合成纳米载体处理两次的小鼠显示出低得多的AAV回忆性抗体应答，其早在第92天加强(图14C中的d99)之后7天变得统计学上不同，因为7只小鼠中仅有两只变为强烈的AAV IgG阳性。值得注意的是，该组中的抗体水平始终低于在第92天第一次暴露于AAV的未免疫小鼠(图14A和14C中的参考对照组)。毫不奇怪，正是这些小鼠(接受少于两次含雷帕霉素之合成纳米载体处理的组中的一只以及接受两次含雷帕霉素之合成纳米载体处理的组中的五只)是始终显示出了有意义的SEAP表达的小鼠，导致两个实验组中AAV IgG和血清SEAP水平之间的统计学显著的负相关(图14D)。
实施例18：包含免疫抑制剂之合成纳米载体和病毒载体的给药
发现在AAV载体和含雷帕霉素之合成纳米载体共注射之后施用的含雷帕霉素之合成纳米载体剂量为转基因表达和AAV抗体抑制提供了另外的益处。
尽管含雷帕霉素之合成纳米载体与AAV的共施用显示为AAV驱动的转基因表达提供立即益处并有效抑制针对AAV的抗体，但是检查了另外的含雷帕霉素之合成纳米载体注射是否将提供另外的益处。在第0天和第88天用1×1010VG的AAV-SEAP单独或与50μg雷帕霉素混合(当包含在合成纳米载体中时)注射(i.v.，尾静脉)5只雌性C57BL/6小鼠的组，并且一组然后在初免和加强之后(d14，28，102和116)均用两次另外的每两周一次的含雷帕霉素之合成纳米载体注射进行处理。在指定的时间将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。如实施例14中所述测量血清中的SEAP水平和针对AAV的IgG。
如前所示，施用与AAV-SEAP混合的50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)导致SEAP表达的立即升高(图15A)，其在某些时间点为没有合成纳米载体的组的4倍高。然而，另外的含雷帕霉素之合成纳米载体处理提供了甚至更明显的益处，其中所得到的表达水平为未处理的小鼠的6至7倍高。在第88天加强之后观察到甚至进一步的升高(由箭头指示；示出了每个组中每个加强之后时间点相对于加强之前d75 SEAP水平的相对表达)。尽管在加强时施用含雷帕霉素之合成纳米载体提供了些许额外益处，其中所得的转基因表达与未处理的小鼠相比稳定在5倍过量，但是另外的含雷帕霉素之合成纳米载体处理的益处继续升高至在第108天的8倍差异。这对应于用另外的含雷帕霉素之合成纳米载体给药的小鼠中更明显的AAV IgG抑制，而在仅用与AAV混合的含雷帕霉素之合成纳米载体处理的小鼠中的IgG应答抑制是明显的，但是不完全，尤其是在加强之后(图15B)。
实施例19：包含免疫抑制剂之合成纳米载体的另外剂量
发现另外的含雷帕霉素之合成纳米载体为长期AAV抗体抑制提供了最高潜力。
尽管含雷帕霉素之合成纳米载体与AAV共施用及其进一步应用显示有效地抑制针对AAV的抗体，但是这种抑制并不总是达到100％水平。因此，检查了在初免时另外的含雷帕霉素之合成纳米载体注射与含雷帕霉素之合成纳米载体的随后施用的结合是否提供组合的协同益处。在第0天和第83天用1×1010VG的AAV-SEAP单独或与50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)混合注射(i.v.，尾静脉)6至9只雌性C57BL/6小鼠的组，其中一组另外在初免和加强之前2天(d-2和d81)用含雷帕霉素之合成纳米载体处理，另一组在初免和加强之后(d14，28，97和116)均用两次另外的每两周一次的含雷帕霉素之合成纳米载体注射进行处理，并且最后一组用那些的组合进行处理(d-2，12，28，81，97和116)。如实施例14中所述测量针对AAV的IgG。
如先前所示，施用与AAV-SEAP混合的50μg雷帕霉素(当包含在合成纳米载体中时)并结合预免疫含雷帕霉素之合成纳米载体处理(组2；d-2，0，81，83)导致突出的AAV IgG抑制并且没有加强之前的转化，因为9只小鼠中仅有2只在第90天(加强之后立即)显示出了可检测的IgG水平(如通过最高OD确定的)。到第116天(加强之后33天)，9只中仅3只(并且三只中仅一只强烈地)是IgG阳性的。在该研究中，用含雷帕霉素之合成纳米载体的随后(d14和d28)处理是如加强之前施用一样有效的(无转化)。然而，到第116天，数只小鼠开始加强之后的转化(9只中的5只；5只中的4只强烈地)，变为阳性。因此，两种含雷帕霉素之合成纳米载体施用方案的组合是最有效的，因为直至第116天(加强之后33天)没有观察到转化(图16)。
实施例20：AAV驱动的转基因表达
已经表明，在标准的雌性小鼠AAV转导模型中，存在SVP[Rapa]与AAV共施用的益处，其导致体内更高的转基因表达。另外的SVP[Rapa]施用进一步增强了这种效果。在该实施例中，证明了在初免和加强时单次SVP[Rapa]与AAV共施用以剂量依赖性方式改善了转基因表达，并且这种作用至少部分地与AAV抗体发展负相关。此外，如果将能够强烈升高AAV驱动的转基因表达的SVP[Rapa]的高剂量均匀地分成三部分，其中只有一部分与AAV共施用，并且另外的两部分分别在AAV注射之前和之后施用，则SVP[Rapa]对转基因表达的有益作用和SVP[Rapa]介导的AAV抗体发展的抑制不会降低。
具体地，在不具有或具有SVP[Rapa]的情况下下，用1×1010VG的AAV8-SEAP注射(静脉内(i.v.)，尾静脉)4组10只雌性C57BL/6小鼠。使用以下SVP[Rapa]剂量：单个50μg剂量(与AAV混合并共施用)；单个150μg剂量(与AAV混合并共施用)；和150μg剂量，其分为三个50μg注射(一个与AAV混合并共施用，两个分别在AAV注射之前2天和AAV注射之后2天施用)。
在指定的时间(第7、12、19、47和75天)将小鼠放血，从全血中分离血清并储存在-20±5℃下直至分析。然后，使用ELISA测量针对AAV的IgG抗体。96孔板用AAV涂覆过夜，在第二天洗涤并封闭，然后将稀释的血清样品(1∶40)添加至板并孵育。在孵育之后，洗涤板并添加山羊抗小鼠IgG特异性-HRP。将板孵育并再次洗涤，然后通过添加TMB底物并以570nm的参比波长测量450nm的吸光度下的信号来检测针对AAV的IgG抗体的存在。表示为最高光密度(OD)的信号强度与样品中IgG抗体的量成正比。
单独地，使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)的测定试剂盒测量血清中分泌的碱性磷酸酶(SEAP)水平。简单地说，将血清样品和阳性对照在稀释缓冲液中稀释，在65℃下孵育30分钟，然后冷却至室温，平板接种在96孔板中，然后用测定缓冲液孵育(5分钟)，然后用底物(20分钟)。然后将板在光度计上在477nm下读取。
在初始(初免之后)AAV IgG和SEAP检测和分析之后，使小鼠休息，然后在第117天再次放血并在第125天使用与初免相同的AAV和SVP[Rapa]剂量用AAV-SEAP加强，即第一组未接受SVP[Rapa]，以下组在加强时接受50μg的SVP[Rapa]，在加强时接受150μg的SVP[Rapa]以及接受三次50μg的SVP[Rapa]：加强之前2天、加强时(与AAV混合并共施用)、和加强之后2天。然后在第132和138天(加强之后7和13天)将小鼠放血并如上所述确定SEAP血清水平。
与未处理的小鼠中的那些相比，用SVP[Rapa]处理的所有组在初免之后立即显示出提高的SEAP水平(图17A，组1对比于组2至4)，这些差异具有统计学意义(****-p＜0.0001)并持续数月。在大多数早期时间点，用150μgSVP[Rapa](作为单次剂量或分开剂量；组3和4)处理的组中的SEAP水平高于用较低的50μg剂量(组2)处理的组中的SEAP水平，虽然从长期看(d75至117)，所有这些水平变得相等。在某种程度上，这与用150μgSVP[Rapa]处理的组中的小鼠中AAV IgG发展的早期动态相关，其直至并且包括第75天没有显示出IgG转化的(图17B，组3和4)，而用较低的50μg剂量处理的组中的一些小鼠(图17B，组2)在第19天显示出了可检测的抗体，其中十只中的四只(40％)到第75天时转化(图17B)。值得注意的是，在没有SVP[Rapa]的情况下用AAV注射的所有小鼠迅速变为AAV IgG阳性的(图17B，组1)。
在第125天加强之后(图17A中的箭头所示)，SVP[Rapa]处理的和未处理的组之间的差异变得甚至更加明显(图17A，第132和138天)。值得注意的是，在加强之后立即(d132)，未用SVP[Rapa]处理的小鼠中没有SEAP升高(加强之后SEAP表达与第117天的加强之前表达的比例示出为图17A中顶部的线)，而所有SVP[Rapa]处理的组均示显出了立即升高(图17A，组2至4，d132)。有趣的是，未处理的组和用低的50μg剂量SVP[Rapa]处理的组中的SEAP水平以相似的方式进展至第138天，其中他们的相对表达(示出为图17A中较低的线，未处理的组1中的水平指定为数量‘100’)保持相同(50μg处理组始终具有～3.5倍高的SEAP)。同时，用较高(150μg)剂量的SVP[Rapa]处理的两组小鼠中的SEAP水平具有从第132天至第138天进一步升高的转基因表达，即从为未处理的小鼠～4倍高变为～4.5倍高，并且在一个实例中，甚至变得与用较低(50μg)剂量SVP[Rapa]处理的小鼠的那些统计学上不同(图17A，组2对组4；第138天；p＜0.05)。
因此，发现AAV驱动的转基因表达通过在初免和加强时共施用混合的SVP[Rapa]以剂量依赖性方式升高。这种效应与针对AAV的抗体的抑制负(尽管不是完全的)相关，但不依赖于作为与AAV混合的单剂量或者作为其中一些与AAV混合并且一些单独施用的分开剂量递送的SVP[Rapa]剂量。

Claims (98)

1.方法，其包括：
向对象共施用包含免疫抑制剂之合成纳米载体和病毒载体，以及
在没有所述病毒载体的情况下向所述对象施用所述包含免疫抑制剂之合成纳米载体的至少一个前剂量和/或至少一个后剂量。
2.权利要求1所述的方法，其中向所述对象施用至少一个前剂量和至少一个后剂量。
3.权利要求1或2所述的方法，其中向所述对象施用至少两个前剂量。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述对象施用至少两个后剂量。
5.权利要求1所述的方法，其中在所述对象中重复所述共施用。
6.权利要求5所述的方法，其中对于每个重复的共施用步骤，在没有所述病毒载体的情况下向所述对象施用所述包含免疫抑制剂之合成纳米载体的至少一个前剂量和/或至少一个后剂量。
7.权利要求6所述的方法，其中对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少一个前剂量和至少一个后剂量。
8.权利要求6或7所述的方法，其中对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少两个前剂量。
9.权利要求6至8中任一项所述的方法，其中对于每个重复的共施用步骤，向所述对象施用至少两个后剂量。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1个月内进行。
11.权利要求10所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2周内进行。
12.权利要求11所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1周内进行。
13.权利要求12所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后3天内进行。
14.权利要求13所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2天内进行。
15.权利要求14所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1天内进行。
16.权利要求15所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后12小时内进行。
17.权利要求16所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后6小时内进行。
18.权利要求17所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1小时内进行。
19.权利要求18所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后30分钟内进行。
20.权利要求19所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后15分钟内进行。
21.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中每个前剂量和/或后剂量在所述共施用步骤的3天内施用。
22.权利要求21所述的方法，其中每个前剂量和/或后剂量在所述共施用步骤的2天内施用。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中每个后剂量在所述共施用步骤之后每两周一次地施用。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个前剂量的免疫抑制剂的量与每个共施用步骤的免疫抑制剂的量相同。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个后剂量的免疫抑制剂的量与每个共施用步骤的免疫抑制剂的量相同。
26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个前剂量、后剂量和/或共施用步骤通过静脉内施用。
27.方法，其包括：
对于第一对象，(1)共施用(a)包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的剂量和(b)病毒载体的剂量，以及(2)在没有所述病毒载体的剂量的情况下，施用(c)所述包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的前剂量和/或后剂量，
其中(a)和(c)的所述免疫抑制剂的量一起等于(d)的免疫抑制剂的量，(d)为所述包含在合成纳米载体中的免疫抑制剂的剂量，当在没有与合成纳米载体偶联的所述免疫抑制剂的前剂量或后剂量的情况下与所述病毒载体共施用时，其在第二对象中降低针对所述病毒载体的免疫应答或提高所述病毒载体的转基因表达。
28.权利要求27所述的方法，其中(c)的所述前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量不超过(d)的所述量的一半。
29.权利要求27或28所述的方法，其中(c)的所述前剂量或后剂量的免疫抑制剂的量是(d)的所述量的一半。
30.权利要求27至29中任一项所述的方法，其中在(c)中向所述第一对象施用前剂量和后剂量。
31.权利要求30所述的方法，其中(c)的所述前剂量和后剂量的所述免疫抑制剂的量相同。
32.权利要求27至31中任一项所述的方法，其中(a)的所述免疫抑制剂的量与(c)的所述前剂量或后剂量的量相同。
33.权利要求27至32中任一项所述的方法，其中在(c)中向所述第一对象施用至少两个前剂量。
34.权利要求27至33中任一项所述的方法，其中在(c)中向所述第一对象施用至少两个后剂量。
35.权利要求27至34中任一项所述的方法，其中重复(1)和(2)。
36.权利要求27至35中任一项所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1个月内进行。
37.权利要求36所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2周内进行。
38.权利要求37所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1周内进行。
39.权利要求38所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后3天内进行。
40.权利要求39所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后2天内进行。
41.权利要求40所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1天内进行。
42.权利要求41所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后12小时内进行。
43.权利要求42所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后6小时内进行。
44.权利要求43所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后1小时内进行。
45.权利要求44所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后30分钟内进行。
46.权利要求45所述的方法，其中所述前剂量和/或后剂量的施用分别在共施用之前或之后15分钟内进行。
47.权利要求27至35中任一项所述的方法，其中每个前剂量和/或后剂量在所述共施用步骤的3天内施用。
48.权利要求47所述的方法，其中每个前剂量和/或后剂量在所述共施用步骤的2天内施用。
49.权利要求27至48中任一项所述的方法，其中每个后剂量在所述共施用步骤之后每两周一次地施用。
50.权利要求27至49中任一项所述的方法，其中每个前剂量、后剂量和/或共施用步骤通过静脉内施用。
51.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含一个或更多个表达控制序列。
52.权利要求51所述的方法，其中所述一个或更多个表达控制序列包含肝特异性启动子。
53.权利要求52所述的方法，其中所述一个或更多个表达控制序列包含组成型启动子。
54.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在一个或更多个时间点评估所述对象中针对所述病毒载体的IgM应答。
55.权利要求54所述的方法，其中评估IgM应答的时间点中的至少一个在共施用之后。
56.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述病毒载体和包含免疫抑制剂之合成纳米载体混合用于每次共施用。
57.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。
58.权利要求57所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体。
59.权利要求58所述的方法，其中所述腺相关病毒载体是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11腺相关病毒载体。
60.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共施用和/或前剂量和/或后剂量的免疫抑制剂是NF-κB途径的抑制剂。
61.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共施用和/或前剂量和/或后剂量的所述免疫抑制剂是mTOR抑制剂。
62.权利要求61所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。
63.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂与所述合成纳米载体偶联。
64.权利要求62所述的方法，其中所述免疫抑制剂包封在所述合成纳米载体中。
65.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述共施用和/或前剂量和/或后剂量的合成纳米载体包含：脂质纳米粒、聚合物纳米粒、金属纳米粒、基于表面活性剂的乳剂、树枝状聚合物、巴基球、纳米线、病毒样颗粒或者肽或蛋白质颗粒。
66.权利要求65所述的方法，其中所述合成纳米载体包含聚合物纳米粒。
67.权利要求66所述的方法，其中所述聚合物纳米粒包含聚酯、与聚醚连接的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚缩醛、聚缩酮、多糖、聚乙基唑啉或聚乙烯亚胺。
68.权利要求67所述的方法，其中所述聚合物纳米粒包含聚酯或与聚醚连接的聚酯。
69.权利要求67或68所述的方法，其中所述聚酯包含聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己内酯。
70.权利要求67至69中任一项所述的方法，其中所述聚合物纳米粒包含聚酯和与聚醚连接的聚酯。
71.权利要求67至70中任一项所述的方法，其中所述聚醚包含聚乙二醇或聚丙二醇。
72.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用动态光散射获得的合成纳米载体群体的颗粒尺寸分布的平均值为直径大于110nm。
73.权利要求72所述的方法，其中所述直径大于150nm。
74.权利要求73所述的方法，其中所述直径大于200nm。
75.权利要求74所述的方法，其中所述直径大于250nm。
76.权利要求72至75中任一项所述的方法，其中所述直径小于5μm。
77.权利要求76所述的方法，其中所述直径小于4μm。
78.权利要求77所述的方法，其中所述直径小于3μm。
79.权利要求78所述的方法，其中所述直径小于2μm。
80.权利要求79所述的方法，其中所述直径小于1μm。
81.权利要求80所述的方法，其中所述直径小于750nm。
82.权利要求81所述的方法，其中所述直径小于500nm。
83.权利要求82所述的方法，其中所述直径小于450nm。
84.权利要求50所述的方法，其中所述直径小于400nm。
85.权利要求84所述的方法，其中所述直径小于350nm。
86.权利要求85所述的方法，其中所述直径小于300nm。
87.前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所述合成纳米载体之间的平均值，所述合成纳米载体中包含的免疫抑制剂的负载为0.1％至50％(重量/重量)。
88.权利要求87所述的方法，其中所述负载为0.1％至25％。
89.权利要求88所述的方法，其中所述负载为1％至25％。
90.权利要求89所述的方法，其中所述负载为2％至25％。
91.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合成纳米载体群体的纵横比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。
92.药盒，其包含：
一个或更多个前剂量或者一个或更多个后剂量，各自如前述权利要求中任一项所述，以及
用于与病毒载体共施用的包含免疫抑制剂之合成纳米载体的剂量。
93.权利要求92所述的药盒，其还包含病毒载体的剂量。
94.权利要求92或93所述的药盒，其中所述药盒包含一个或更多个前剂量和一个或更多个后剂量。
95.权利要求92至94中任一项所述的药盒，其还包含使用说明书。
96.权利要求95所述的药盒，其中所述使用说明书包含用于实施权利要求1至91中任一项所述的方法的说明书。
97.权利要求92至96中任一项所述的药盒，其中用于与病毒载体一起施用的所述包含免疫抑制剂之合成纳米载体如权利要求1至91中任一项所述。
98.权利要求92至97中任一项所述的药盒，其中所述病毒载体如权利要求1至91中任一项所述。
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