JP2002502607A

JP2002502607A - 新規な腫瘍壊死因子レセプター相同体及びそれをコードする核酸

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Publication number: JP2002502607A
Application number: JP2000530610A
Authority: JP
Inventors: ジェー．アシュケナジ，アヴィ; エル．ガーニー，オースティン; エー．マースターズ，スコット; エム．ピッティ，ロバート; アイ．ウッド，ウィリアム; ゴッダード，オードリー
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1998-02-09
Filing date: 1999-02-09
Publication date: 2002-01-29
Also published as: WO1999040196A1; US20060141573A1; US20100010195A1; CA2319236A1; AU2591599A; EP1053321A1; US20050069983A1; US20020150993A1; IL137409A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有する新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。また、ここで、それらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体、及び本発明のポリペプチドを製造する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、一般に、新規なＤＮＡの同定及び単離、並びに、ここに「ＰＲＯ３
６４」ポリペプチと命名する腫瘍壊死因子に相同性を有する新規ポリペプチドの
組換え生産に関する。

【０００２】（発明の背景）哺乳動物における細胞数のコントロールは、一部は細胞増殖と細胞死のバラン
スにより決定されると考えられている。壊死性細胞死と称されることもある細胞
死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病
理的形態として特徴付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロール
された状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的
又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば
、Barr等, Bio/Technology, 12：487-493 (1994); Steller等, Science, 267: 1
445-1449 (1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itoh等, Ce
ll, 66：233-243(1991)］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、ヘルペスウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Thompson, Sc
ience, 267：1456-1462(1995)］。アポトーシス細胞死のレベルの増加は、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側方硬化症、多発性硬化症
、色素性網膜炎、小脳変性、再生不良性貧血、心筋梗塞、発作、再灌流障害、及
び毒素誘発肝疾患を含む様々な他の病理学的状態を伴う［Thompson, 上掲］。

【０００３】アポトーシス性細胞死には、典型的には、細胞内における一又は複数の特徴的
な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、
核の断片化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な
外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹
起又は誘発すると考えられている［Raff, Nature, 356：397-400(1992)；Stelle
r, 上掲; Sachs等, Blood, 82：15(1993)］。例えば、それらは、ホルモンの刺
激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の
成長因子の退薬により惹起され得る［Watanabe-Fukunaga等, Nature, 356：314-
317(1992)］。また、幾つかの同定された発癌遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサーは、ｐ５３と同様に、アポトーシスの誘発に
おいてある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びあ
る種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている
［Thompson, 上掲］。

【０００４】様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「Ｔ
ＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β（「ＬＴ-β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、及びＡｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＬＩとも称される）が、サイ
トカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定された［
例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995); Pitti等, J. Biol. Ch
em., 271: 12687-12690 (1996); Wiley等, Immunity, 3: 673-682 (1995); Brow
ning等, Cell, 72: 847-856 (1993); Armitage等, Nature, 357: 80-82 (1992),
1997年1月16日発行のWO 97/01633; 1997年7月17日発行のWO 97/25428参照］。これらの分子の中でも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、及びＡｐｏ-２リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に含まれていることが報告されている。ＴＮＦ-αとＴＮＦ-βの両方
とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性の死を誘発することが報告されて
いる［Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83：1881(1986)；Dealtry等, Eur.
J. Immunol., 17：689(1987)］。ゼング(Zheng)等は、ＴＮＦ-αがＣＤ８ポジテ
ィブＴ細胞の刺激後アポトーシスに含まれることを報告している［Zheng等, Nat
ure, 377：348-351(1995)］。他の研究者らは、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠落に関与していることを報告している［Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要
約集、第10巻、(1995)］。

【０００５】マウスのＦａｓ／Ａｐｏ-１レセプター又はリガンド遺伝子(各々ｌｐｒ及びｇ
ｌｄと呼称される)における変異が幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ-１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン欠落の調節においてある役割を担っていることを示している［Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6：279-
289(1994)； Nagata等, Science, 267：1449-1456(1995)］。また、Ａｐｏ-１リ
ガンドは、ＣＤ４-ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球において刺激後アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなっ
た際の活性化リンパ球の除去に関与している［Krammer等, 上掲； Nagata等, 上
掲］。Ａｐｏ-１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ-αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Yonehara等, J. Exp. Med., 169：1747-1756(1989)］。

【０００６】このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応の誘発
は、それらが特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えら
れている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦ-Ｒ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦ-Ｒ２)の２つの異
なるＴＮＦレセプターが同定されており［Hohman等, J. Biol. Chem., 264：149
27-14934(1989)；Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)
；1991年3月20日に公開されたEP417,563］、双方のレセプター型に対応するヒト
及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴付けされている［Loetscher等, Cell, 61 ：351(1990)；Schall等, Cell, 61：361(1990)；Smith等, Science, 248：1019-
1023(1990)；Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwi
n等, Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。双方のＴＮＦレセプター遺伝
子には広範な多型性が不随している［例えば、Takao等, Immunogenetics, 37：1
99-203(1993)を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む
細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分
は、可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Nophar, Y等, EMBO
J., 9：3269(1990)；及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：83
31(1990)］。さらに最近になって、組換え可溶性ＴＮＦレセプターのクローニン
グがヘイル(Hale)等により報告されている［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991,
p.113(P424)］。

【０００７】１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ_２末端から出発して、１〜４と呼称される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Scha
ll等, 上掲；Loetscher等, 上掲；Smith等, 上掲；Nophar等, 上掲；Kohno等, 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである
：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７まで
のアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３
９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５
４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３
は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９まで
のアミノ酸を含む［Banner等, Cell, 73：431-435(1993)］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割は前掲のバナー(Banner)等により記載されてい
る。

【０００８】ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［
Johnson等, Cell, 47：545(1986)；Radeke等, Nature, 325: 593(1987)］、Ｂ細
胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic等, EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet等, EMBO J., 9:1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66: 233-243 (1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパ
ク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Up
ton等, Virology, 160：20-29(1987)；Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commu
n., 176：335(1991)；Upton等, Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを
示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタ
ースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研
究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher, A.A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 ：159-163(1991)］又はこのドメインにおける５-アミノ酸の挿入［Yan. H及びCh
ao, M.V., J. Biol. Chem., 266：12099-12104(1991)］は、ＮＧＦ結合に殆ど又
は全く影響を持たないことが示されている［Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。ｐ
７５ＮＧＦＲは、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリン
に富んだ伸展を含み、それはＮＧＦ結合に関与しない［Peetre, C.等, Eur. J.
Hematol.,41：414-419(1988)；Seckinger, P.等, J. Biol. Chem., 264：11966-
11973(1989)；Yan. H及びChao, M.V., 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１には見られない。

【０００９】今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、リンホトキシン- αを除き、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これ
に対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーの
殆どのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガ
ンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定さ
れた相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。
ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサ
イトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；各場合
に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ
三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通
常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る
可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。

【００１０】最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定された。これら新た
に同定されたＴＮＦＲファミリーのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステ
オプロテゲリン(osteotrotegerin)（ＯＰＧ）を含む［Brojatsch等, Cell, 87:
845-855 (1996); Montgomery等, Vell, 87: 427-436 (1996); Marsters等, J. B
iol. Chem., 272: 14029-14032 (1997); Simonet等, Cell, 89, 309-319 (1997)
］。他の知られたＴＮＦＲ様分子とは異なり、上掲のシモネット(Simonet)等は、ＯＰＧが疎水性膜貫通配列を含まないと報告している。

【００１１】さらに、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにお
いて同定され、レセプターは、「糖質コルチコイド誘発腫瘍壊死因子レセプター
ファミリー関連遺伝子」に対して「ＧＩＴＲ」と命名された［Nocentini等, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216-6221 (1997)］。マウスＧＩＴＲレセプター
は２２８アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質であり、胸腺、脾臓及びリンパ節から
の正常マウスＴリンパ球において発現される。マウスＧＩＴＲレセプターの発現
は、抗-ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ又はホルボール１２-ミリステート１３-アセテートでの活性化の際にＴリンパ球で誘発される。筆者は、ＧＩＴＲレセプターがＴ
細胞レセプター媒介細胞死の調節に関与していると考えている。

【００１２】マースターズ(Marsters)等、Curr. Biol., 6：750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復においてＴＮＦＲファミリーに対して類似性
を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ている
、Ａｐｏ-３と称されるヒトのポリペプチド全長天然配列を開示している［Marst
ers等,Curr. Biol., 6：1669(1996)も参照されたい］。他の研究者によれば、Ａ
ｐｏ-３は、ＤＲ３、ｗｓｌ-１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Chinnaiyan等
, Science, 274：990(1996)；Kitson等, Nature, 384：372(1996)；Bodmer等, I
mmunity, 6：79(1997)］。

【００１３】パン(pan)等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan等, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞
自殺器を活動させることにできる細胞内死亡ドメインを含むと報告された。パン
等は、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られるリガンドのレセプターであると考えられることを開示している。シェリダン(Sheridan)等, Science, 277: 818-821 (1997)及びパン等, Scienc
e, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対するレセプターと思われる他の分子が記載されている。この分子は、ＤＲ５と呼ば
れる（あるいは、Ａｐｏ-２とも呼ばれる）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞内死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている
。上掲のシェリダン等において、ＤｃＲ１（又はＡｐｏ-２ＤｃＲ）と呼ばれるレセプターが、Ａｐｏ-２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対する潜在的デコイレセプターであるとして開示されている。シェリダン等は、ＤｃＲ１がインビトロでＡ
ｐｏ-２リガンドの機能を阻害できることを報告している。また、ＴＲＩＤと呼ばれるデコイレセプターに関する開示は上掲のパン等を参照のこと。サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプター類の概説については
、上掲のGruss及びDowerを参照されたい。

【００１４】現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な要
素−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含み；線虫(C. elegans)において、
これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ-４、Ｃｅｄ-９及びＣｅｄ-３によりコードされている［Steller, Science, 267：1445(1995)；Chinnaiyan等, S
cience, 275：1122-1126(1997); Wnag等, Cell, 90: 1-20 (1997)］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ(ＣＤ９５)は、
アポトーシス性細胞死を活性化し得る［Chinnaiyan及びDixit, Current Biology
, 6：555-562(1996)；Fraser及びEvan, Cell, 85：781-784(1996)］。また、ＴＮＦＲ１は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を媒介することも知られている［Tar
taglia等, Cell, 74：845-853(1993)；Hsu等, Cell, 84：299-308(1996)］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとし
て知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ＩＣＤ)での相同性を共有
する［Tartaglia, 上掲；Nagata, Cell, 88：355(1997)］。また、死亡ドメイン
はアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク質、すなわちＦＡＤＤ／
ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称されるショウジョウバエタンパク質、リ
ーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Cleavela
nd及びIhle, Cell, 81：479-482(1995)］。

【００１５】リガンド結合及びレセプター集団化に際して、ＴＮＦＲ１及びＣＤ９５はＦＡ
ＤＤを死亡誘導シグナル伝達複合体に補充すると考えられる。ＣＤ９５はＦＡＤ
Ｄに直接結合するが、ＴＮＦＲ１はＦＡＤＤにＴＲＡＤＤを介して間接的に結合
するとされている［Chinnaiyan等, Cell, 81: 505-512 (1995); Boldin等, J. B
iol. Chem., 270: 387-391 (1995); Hsu等, 上掲; Chynnaiyan等, J. Biol. Che
m., 271: 4961-5965 (1996)］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ-３-関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ（カスパーゼ８）を死亡シグナル伝達複合体に補充するア
ダプタータンパク質として提供されると報告されている［Boldin等, Cell, 85:
803-815 (1996); Nuzio等, Cell, 85: 8170827 (1996)］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、インターロイキン-１β変換酵素（ＩＣＥ）及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを作動させるトリガーであるこ
とがわかり、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実行させ得る［Fraser及
びEvan, 上掲］。

【００１６】プログラムされた細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ-３、及び哺乳動物のＩＬ-１-変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーメン
バーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａ
ｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害さ
れ得る［Ray等, Cell, 69：597-604(1992)；Tewari等, Cell, 81：801-809(1995
)］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１-及びＣＤ９５-誘発細胞死を阻害し得ることが示されている［Enari等, Nature, 375：78-81(1995)；Tewari等, J
. Biol. Chem., 270：3255-3260(1995)］。

【００１７】テワリ(Tewari)等により最近概説されているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２
及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ-κＢの活性化を通して、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調
する［Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6：39-44(1996)］。ＮＦ-κＢは
、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含有する二量体転写因子のファミリーの
原型である［Verma等, Genes Develop., 9：2723-2735(1996)；Baldwin, Ann. R
ev. Immunol., 14：649-681(1996)］。その潜伏形態において、ＮＦ-κＢはＩκ
Ｂ阻害剤ファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩκＢ
の不活性化の際に、放出されたＮＦ-κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。

【００１８】（発明の概要）本出願人は、上記腫瘍壊死因子レセプタータンパク質に所定の配列同一性を有
する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定し、当該ポリペプ
チドは本出願において「ＰＲＯ３６４」と命名される。一実施態様では、本発明は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを
含む単離された核酸分子を提供する。特定の態様では、単離された核酸は、Ｆｉ
ｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２４１、２６〜２４１、１〜１６１
又は２６〜１６１を有するＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む
か、又はそのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度、場合に
よっては高い厳密性条件下で安定に結合したままである。単離された核酸配列は
、ＰＲＯ３６４をコードする核酸配列を含む1997年11月7日にＡＴＣＣ２０９４３６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物を含んでもよい。

【００１９】他の実施態様では、本発明はＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを
含むベクターを提供する。また、そのようなベクターを含む宿主細胞も提供され
る。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であってよい。さら
に、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの製造方法も提供され、宿主細胞をＰＲＯ３６４
の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からＰＲＯ３６４を回収することを含
む。他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチドを提供する
。特に、本発明は天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドを提供し、一実施態様では
Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２４１を含むアミノ酸配列を含
む。本発明のさらなる実施態様は、Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）に示したアミノ
酸配列のアミノ酸１−１６１、２６−１６１又は２６−２４１を含む単離された
ＰＲＯ３６４ポリペプチドの細胞外ドメイン配列、又はその断片に係る。場合に
よっては、ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、1997年11月7日にＡＴＣＣ２０９４３６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされるポリペプチドの発
現によって得られ又は得られうる。

【００２０】他の実施態様では、本発明は異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰ
ＲＯ３６４ポリペプチド又は細胞外ドメイン配列又はその他の断片を含んでなる
キメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は
免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む。他の実施態様では、本発明はＰＲＯ３６４ポリペプチド又はその細胞外ドメイ
ンに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル
抗体である。さらなる実施態様では、本発明はＰＲＯ３６４ポリペプチド又はＰＲＯ３６４
ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる診断又は治療方法を提供する。

【００２１】（好適な実施態様の詳細な説明）Ｉ．定義ここで使用される際の「ＰＲＯ３６４ポリペプチド」及び「ＰＲＯ３６４」と
いう用語は、天然配列ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３６４ポリペプチド変異体（ここ
で更に詳細に定義する）を含む。ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、ヒト組織型又は
他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によ
って調製してもよい。

【００２２】「天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチド」は、天然由来のＰＲＯ３６４ポリペプ
チドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然
配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又
は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチド
」という用語には、特に、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの自然に生じる切断又は分
泌形態(例えば、可溶化形態、例えば細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形
態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びＰＲＯ３６４ポリペプチド
の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天
然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、Ｆｉｇ２Ａ(配列番号：３)のアミノ酸１〜
２４１を含有する成熟又は全長天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドである。さら
なる実施態様では、ＰＲＯ３６４ポリペプチドはＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）の
アミノ酸２６〜２４１を含む。本発明のさらに他の実施態様では、天然配列ＰＲ
Ｏ３６４ポリペプチドは全長ＰＲＯ３６４タンパク質の細胞外ドメイン配列であ
り、全長ＰＲＯ３６４タンパク質の推定膜貫通ドメインはＦｉｇ２Ａ（配列番号
：３）に示した配列のアミノ酸１６２〜１８０を含む。即ち、本発明のさらなる
実施態様は、Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）に示したアミノ酸配列のアミノ酸１〜
１６１又は２６〜１６１を含むポリペプチドに係る。場合によっては、ＰＲＯ３
６４ポリペプチドは、1997年11月7日にＡＴＣＣ２０９４３６として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入物ＤＮＡ４７３６５−１２０６にコードされるポリペプ
チドの発現によって得られ又は得られうる。

【００２３】「ＰＲＯ３６４細胞外ドメイン」又は「ＰＲＯ３６４ＥＣＤ」は、ＰＲＯ３６
４ポリペプチドの膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯ３６４ポ
リペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯ３６４ＥＣＤは、それらの膜貫通及
び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％
未満しか持たない。場合によっては、ＰＲＯ３６４ポリペプチドＥＣＤは、Ｆｉ
ｇ２Ａ(配列番号：３)のアミノ酸残基１〜１６１を含む。Ｎ-又はＣ-末端から一
又は複数のアミノ酸が欠失した全長又はＥＣＤの欠失変異体又は断片も含まれる
。好ましくは、そのような欠失変異体又は断片は、ここに記載するような所定の
活性を具備する。本発明のＰＲＯ３６４ポリペプチドについて同定された任意の
膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において
日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ド
メインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末
端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドＥＣＤは、場合によってはＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸ＹからＸを
含み、ここでＹはＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２６の任意の
一つであり、Ｘはアミノ酸残基１５７〜１６７の任意の一つである。

【００２４】「ＰＲＯ３６４変異体」とは、以下に定義されるように、全長天然配列ＰＲＯ
３６４ポリペプチド又はＰＲＯ３６４ＥＣＤ配列についてＦｉｇ２Ａ（配列番号
：３）に示した推定アミノ酸配列を有するＰＲＯ３６４ポリペプチドと少なくと
も約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＰＲＯ３６４ポリペプチドを意味する
。このようなＰＲＯ３６４ポリペプチド変異体には、例えば、Ｆｉｇ２Ａ(配列番号：３)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯ３６４ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯ３６４
ポリペプチド変異体は、Ｆｉｇ２Ａのアミノ酸配列(配列番号：３)と、少なくと
も約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらによ
り好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、またさらに好ましくは
９８％のアミノ酸配列同一性を有している。

【００２５】ＰＲＯ３６４アミノ酸配列に対してここで同定されている「パーセント(％)ア
ミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るた
めに必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えな
いとした、ＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中の
アミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を
決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法
、例えばALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコン
ピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、
比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任
意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを
決定することができる。

【００２６】ここで同定されるＰＲＯ３６４配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性
」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間
隙を導入し、ＰＲＯ３６４配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレ
オチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目
的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばALIG
N又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフ
トウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配
列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリ
ズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定すること
ができる。

【００２７】「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したＰＲＯ３６４ポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んで
なるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得る
エピトープ、又は幾つかの多の試薬によって同定できるエピトープを提供するに
十分な数の残基を有しているが、その長さはＰＲＯ３６４ポリペプチドの活性を
阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他
のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグ
ポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０の
アミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。

【００２８】「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの
診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び
他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様におい
て、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することに
より、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な
ほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還
元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの自然環境の少なくとも１
つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる
。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程
により調製される。

【００２９】「単離された」ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され
、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少な
くとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯ３
６４ポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定
以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする
核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核
酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチドをコード
する核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置に
あるＰＲＯ３６４ポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯ３６４ポリ
ペプチドをコードする核酸分子を含む。

【００３０】「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズに
あることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない
。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位
が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。

【００３１】「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に抗-ＰＲＯ３６４ポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ３６４抗体組成物を包含して
いる。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な
抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可
能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯ３
６４ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯ３６４の
形態を意味する。このような活性は、例えば哺乳動物細胞におけるアポトーシス
、炎症誘発性又は自己粘液性反応を（アゴニスト的又はアンタゴニスト的のいず
れかの方法で）変調させる能力を含む。アゴニスト活性は、活性を刺激又は促進
する能力を含み、アンタゴニスト活性は、活性を阻止、抑制又は中和する能力を
含む。

【００３２】ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」とは、治癒的療法、
予防的療法及び防止的療法を称する。「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典
型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の断片化、染色体ＤＮＡ
の分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴
う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この
活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法等、
全て従来から知られている方法により決定し測定することができる。「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成
長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には
、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び
白血病を含む癌腫である。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキン
リンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌(hepatic carci
noma)及び肝細胞腫(hepatoma)等の肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、
黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭
部及び頸部の癌が含まれる。ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネ
コを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。本発明の好ましい実施態
様においては、哺乳動物はヒトである。

【００３３】ＩＩ. 本発明の組成物と方法Ａ．全長ＰＲＯ３６４ポリペプチド本発明は、本出願においてＰＲＯ３６４と称されるポリペプチドをコードする
、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施
例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを同定し単離した。（初期パラメータに設定された）ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔ
Ａ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６４ポリペプ
チドの一部が腫瘍壊死因子レセプターファミリーの種々のメンバーと或る程度の
配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示され
るＰＲＯ３６４ポリペプチドがポリペプチドの腫瘍壊死因子レセプターファミリ
ーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。

【００３４】ＰＲＯ３６４レセプターは、マウスＧＩＴＲのヒトオーソログであると考えら
れる。比較的低いレベルでのＰＲＯ３６４ｍＲＮＡの発現が観察され、それは主
にリンパ組織である。しかし、末梢血液Ｔ細胞は刺激に際して大量のＰＲＯ３６
４を発現し、それはＰＲＯ３６４がＴ細胞機能において役割を果たしていること
を示唆した。下記の実施例に示すように、ＤＮＡ１９３５５−１１５０ヌクレオ
チド配列にコードされたポリペプチドはＰＲＯ３６４ポリペプチドレセプターの
リガンドとなりうる。ＰＲＯ３６４レセプター及びＤＮＡ１９３５５リガンドの
同時形質移入がヒトのジャーカットＴ細胞をＡＩＣＤから保護することが見出さ
れた。これらの結果は、ＰＲＯ３６４レセプター及びリガンドが、末梢組織にお
けるＴリンパ球生存及び哺乳動物における炎症誘発性反応を変調させることを示
唆している。また、ＤＮＡ１９３５５リガンド／ＰＲＯ３６４相互作用によるＮ
Ｆ-ＫＢの活性化も、哺乳動物細胞におけるアポトーシス変調、炎症誘発性及び自己免疫性反応におけるその役割を示唆している。例えば、ＰＲＯ３６４イムノ
アドヘシン分子（例えば、ＰＲＯ３６４ＥＣＤ-Ｉｇ作成物）は、ＤＮＡ１９３５５リガンドによるＮＦ-ＫＢ活性化をアンタゴニスト的方法で阻止するのに使用できると考えられる。

【００３５】Ｂ．ＰＲＯ３６４変異体ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドに加えて、ＰＲＯ３６
４変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ３６４変異体は、ＰＲＯ３６４をコ
ードするＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望
のＰＲＯ３６４ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリ
コシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化
がＰＲＯ３６４ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろ
う。天然全長配列ＰＲＯ３６４又はここに記載したＰＲＯ３６４ポリペプチドの種
々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことがで
きる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯ３６４と比較してＰＲＯ３６４ポリペ
プチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするコドン
の置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つの
アミノ酸のＰＲＯ３６４ポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミ
ノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えるこ
となく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの配列
を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなさ
れるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、
一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した
結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることが
できる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とするこ
とができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を
系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイ
の任意のもので活性について試験することにより決定される。

【００３６】変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発［Carter等, Nu
cl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1
987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315］、制限的選択突然変
異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等
のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をク
ローニングしたＤＮＡに実施して、ＰＲＯ３６４コード化変異体ＤＮＡを作成す
ることもできる。また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的
小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、
セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し
変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャ
ンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため
典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られ
ることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Choth
ia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じ
ない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。

【００３７】Ｃ．ＰＲＯ３６４の修飾ＰＲＯ３６４ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共
有結合的修飾の一型は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドを標的とするアミノ酸残基を
、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応でき
る有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例
えばＰＲＯ３６４を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ＰＲＯ３６４抗体の精
製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いら
れる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジド
サリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイ
ミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。

【００３８】他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86
(1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。

【００３９】本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ３６４ポリペプチドの共有結合的修飾の他の
型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシ
ル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯ３６４ポリ
ペプチドに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は天然配列ＰＲ
Ｏ３６４ポリペプチドに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味
する。ＰＲＯ３６４ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変
更を伴う。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然
配列ＰＲＯ３６４ポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯ３６４アミノ酸配列は、場合によっては、Ｄ
ＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを予
め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成
させることを通して変更されてもよい。

【００４０】ＰＲＯ３６４ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グ
リコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、
この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及び
Aplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。ＰＲＯ３６４ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵
素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードす
るコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は
、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys.,
259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等,
Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエ
キソグリコシダーゼを用いることにより達成される。

【００４１】ＰＲＯ３６４の共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯ３６４ポリぺプチドの、種
々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレン
グリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,33
7号に記載された方法での結合を含む。また、本発明のＰＲＯ３６４ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミ
ノ酸配列に融合したＰＲＯ３６４ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法
で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選
択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ３６４ポリペ
プチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯ３６４ポリペプ
チドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検
出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトー
プタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって
ＰＲＯ３６４ポリペプチドを容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様
において、キメラ分子はＰＲＯ３６４ポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グ
ロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価の形態には、このよう
な融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。場合によっては、キメラ分子は、Ｉ
ｇＧ分子のＦｃ領域に融合したＰＲＯ３６４ＥＣＤ配列を含む。

【００４２】種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている
。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン
（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fiel
d等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８
Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular an
d Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タン
パク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):54
7-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等,
BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等,
Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinn
er等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパ
ク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393
-6397 (1990)］を含む。本発明のＰＲＯ３６４ポリペプチドは、ロイシンジッパーに融合したＰＲＯ３
６４ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。種々のロ
イシンジッパーポリペプチドがこの分野で記載されている。例えば、Landschulz
等, Science, 240: 1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe等, FEBS Letters, 344:
1991 (1994); Maniatis等, Nature, 341: 24 (1989)を参照。ＰＲＯ３６４ポリペプチドに融合したロイシンジッパーの使用は、溶液中の可溶性ＰＲＯ３６４ポ
リペプチドの二量体化又は三量体化を助けると考えられる。当業者は、ロイシン
ジッパーがＰＲＯ３６４分子のＮ-又はＣ-末端のいずれかに融合することを認め
るであろう。

【００４３】Ｄ．ＰＲＯ３６４の調製以下の説明は、主として、ＰＲＯ３６４ポリペプチドコード化核酸を含むベク
ターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯ３６４を生
産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を
用いてＰＲＯ３６４ポリペプチドを調製することはできると考えられる。例えば
、ＰＲＯ３６４配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によ
って生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.
H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合
成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプ
チド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯ３６４ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的
又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯ３６４ポリペプチドを生産しても
よい。

【００４４】１．ＰＲＯ３６４をコードするＤＮＡの単離ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＰＲＯ３６４ｍＲＮＡを保
有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された
任意のｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯ３６４コ
ード化ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮ
Ａライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ３６４コード化遺伝子は
、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計された(ＰＲＯ３６４ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ
のスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ３６４をコードする遺
伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；D
ieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, 1995)］。

【００４５】下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している
。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性
が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、ス
クリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能で
あるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良
く知られており、^３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化ある
いは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブ
リッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genban
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決
定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）
配列同一性は、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュ
ータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定すること
ができる。タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生
成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来
のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスク
リーニングすることにより得られる。

【００４６】２．宿主細胞の選択及び形質転換宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ３６４ポリペプチド生成のための発現又は
クローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質
転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変
性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は
、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の
生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Ce
ll Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び
Sambrook等, 上掲に見出すことができる。

【００４７】形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ_４及びエレクトロポレーションは当業者に
知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公
開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan de
r Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact.,
130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、
例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、
又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々
の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び
Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。

【００４８】ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な
宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物
は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物
体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能
であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６
（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,6
35）である。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ３６４を
コードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロ
ミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。

【００４９】グリコシル化ＰＲＯ３６４の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導さ
れる。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳ
ｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例
は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な
例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 16
51);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293
細胞、Grahamほか, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵
巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:
4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-25
1 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065);
及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。

【００５０】３．複製可能なベクターの選択及び使用所望のＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例
えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることが
できる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に
、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に
挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではない
が、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エ
ンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分
の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライ
ゲーション技術を用いる。

【００５１】所望のＰＲＯ３６４ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだ
けではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末
端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融
合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分である
か、ベクターに挿入されるＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡの一部である。シグナル
配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安
定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であ
ってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母菌インベルターゼリ
ーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシ
ス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載
されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開された
WO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由
来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に
使用してもよい。

【００５２】発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【００５３】哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジン
キナーゼのように、ＰＲＯ３６４コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分
を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主
細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株
化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ
７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；K
ingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ
１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカー
を提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。

【００５４】発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ３６４コード化核酸配列に作
用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿
主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での
使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［C
ahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、ア
ルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nuclei
c Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、
例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-2
5 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を
有する。酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。

【００５５】他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ３６４転写は、例えば、ポ
リオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、
アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィ
ルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィ
ルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺
乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモー
ター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このような
プロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。

【００５６】より高等の真核生物によるＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードしているＤＮＡ
の転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る
。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用して
その転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くの
エンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、 α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウ
ィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期
側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期
プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びア
デノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ３６４コード化
配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプ
ロモーターから５’位に位置している。

【００５７】また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これ
らの領域は、ＰＲＯ３６４をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニ
ル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯ３６４ポリペプチドの合成に適応化するの
に適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625
(1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058 に記載されている。

【００５８】４．遺伝子増幅／発現の検出遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッ
ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ
二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもで
きる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は
表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合
した抗体の存在を検出することができる。あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯ３６４
ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペ
プチドに対して、又はＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトー
プをコードする外因性配列に対して調製され得る。

【００５９】５．ポリペプチドの精製ＰＲＯ３６４の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる
。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ３６４の発現に用いられる細胞は
、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化
学的又は物理的手段によって破壊することができる。ＰＲＯ３６４を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望
ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオ
ン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交
換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用い
るゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯ３６４ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化
カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology
, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Spr
inger-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生
産されるＰＲＯ３６４ポリペプチドの性質に依存する。

【００６０】Ｅ．ＰＲＯ３６４の用途ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハ
イブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体
及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成にお
いて種々の用途を有している。また、ＰＲＯ３６４コード化核酸は、ここに記載
される組み換え技術によるＰＲＯ３６４ポリペプチドの調製にも有用であろう。全長ＤＮＡ４７３６５−１２０６ヌクレオチド配列（配列番号：１）又は全長
天然配列ＰＲＯ３６４（配列番号：２）ヌクレオチド配列、又はその一部は、全
長ＰＲＯ３６４遺伝子の単離又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたＰＲＯ
３６４ヌクレオチド配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例え
ば、ＰＲＯ３６４の天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯ３６４をコードする
もの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして
使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハ
イブリッド形成プローブは、Ｆｉｇ１に示した配列番号：１のＵＮＱ３１９（Ｄ
ＮＡ４７３６５−１２０６）核酸配列から、又は天然配列ＰＲＯ３６４コード化
ＤＮＡのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から
誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯ３６４遺伝子のコード化領
域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成
することを含む。ハイブリッド形成プローブは、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の放射性ヌ
クレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアル
カリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰ
ＲＯ３６４遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ
、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラ
リーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用で
きる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。

【００６１】また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯ３６４配列の
同定のための配列のプールを作成することができる。また、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸配列は、そのＰＲＯ３６４
ポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個
体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができ
る。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体
マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニ
ング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングするこ
とができる。

【００６２】ＰＲＯ３６４のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコード
する場合（例えば、ＰＲＯ３６４ポリペプチドがレセプターとして機能する場合
）、ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、結合性相互作用に含まれる他のタンパク質又
は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法によって、レ
セプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このよう
な結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合
性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプ
ターＰＲＯ３６４ポリペプチドは、下記の実施例２に記載するリガンド以外の他
の関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲ
Ｏ３６４又はＰＲＯ３６４のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発
見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラ
リーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特
に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。ア
ッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結
合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッ
セイを含む種々の型式で実施される。

【００６３】また、ＰＲＯ３６４ポリペプチド又はその任意の修飾型をコードする核酸は、
トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、
これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジ
ェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動
物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。
導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ
たＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするｃＤ
ＮＡは、確立された技術によりＰＲＯ３６４をコードするゲノムＤＮＡをクロー
ン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯ３６４をコードする
ＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用す
ることができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動
物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,
736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特
異的エンハンサーでのＰＲＯ３６４導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動
物の生殖系列に導入されたＰＲＯ３６４をコードする導入遺伝子のコピーを含む
トランスジェニック動物はＰＲＯ３６４をコードするＤＮＡの増大した発現の影
響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病
理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用で
きる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する
未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治
療的処置の可能性が示される。

【００６４】あるいは、ＰＲＯ３６４の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲ
Ｏ３６４をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯ３６４をコードする内在性遺
伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯ３６４をコードする欠陥又は変更遺
伝子を有するＰＲＯ３６４「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。
例えば、ＰＲＯ３６４をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯ
３６４をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯ３６４を
コードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用す
る選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができ
る。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びC
apecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば
電気穿孔法によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択さ
れた細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメ
ラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells
: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 11
3-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮ
Ａを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞
が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックア
ウト動物は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的
状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。

【００６５】ここで、ＰＲＯ３６４ポリペプチドは、それらのペプチドを、しばしば遺伝子
治療と呼ばれるインビトロでの発現により本発明に従って用いてもよい。核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるため
に：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では
、核酸は、通常はＰＲＯ３６４ポリペプチドが必要とされている部位、例えばＰ
ＲＯ３６４ポリペプチドの合成部位、もし知られているならばＰＲＯ３６４ポリ
ペプチドの生物学的活性が必要とされる部位に、患者に直接注入される。エキソ
ビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し
、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカ
プセル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。

【００６６】核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は
、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にイ
ンビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに
適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス
）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸の細胞への導入を
含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスであ
る。

【００６７】現在インビボ遺伝子移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクタ
ー（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関
連ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な
脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである；例えば、T
onkinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）での形質移入
を含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好
ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである
。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つのプロモー
ター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核ＲＮ
Ａ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制
御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクター
は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする遺伝子の存在下で転写されたとき、
それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として機能する核酸分子を含む。このよ
うなベクター作成物はまた、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、
末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部、及びポジティブ及びネガティブストラン
ドプライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクターに既に存在しない場合
）。さらに、これらのベクターは、典型的には、それらが配置される宿主細胞か
らＰＲＯ３６４ポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、こ
の目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはＰＲＯ３
６４ポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合によっては、ベクター
作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を指向するシグナル及び
翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典型的には５’ＬＴＲ、
ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の開始点、及び
３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクター、例えばカチオン性
脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもできる。

【００６８】幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば
細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、即ち標的細胞上のレセプタ
ーのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合
、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、
ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細
胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行
を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期
を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば
、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Ac
ad. Sci., 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標
識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256
:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用された参考文
献も参照。

【００６９】好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、
米国特許第5,681,746号に見出される。例えば知られた腫瘍壊死因子レセプターに関連するような生物学的活性を有す
る本発明のＰＲＯ３６４ポリペプチドは、治療目的のためにインビボでもインビ
トロデも用いることができる。

【００７０】ＰＲＯ３６４の治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の製薬的
に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Scien
ces, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又
は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、
リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及び
メチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；
ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチ
ル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；
シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１
０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等
のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミ
ン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコ
ース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物
；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソル
ビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ又はポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。

【００７１】このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミ
ニウム、レシチン、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例
えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の
部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸
水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル
シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベー
スの物質、及びプロピレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形
態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類
、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコ
ールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。こ
のような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状、及び除放性製剤を含む。ＰＲＯ３６４ポ
リペプチドは、典型的にはそのような媒体中に約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で処方される。

【００７２】インビボ投与に用いられるＰＲＯ３６４ポリペプチドは無菌でなければならな
い。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって
容易に達成される。ＰＲＯ３６４ポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投
与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、ＰＲＯ３６４
ポリペプチドは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて
処方される。ＰＲＯ３６４ポリペプチドの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無
色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。治療用ＰＲＯ３６４ポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを
具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパ
ーを具備するバイアルに配される。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮
下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内
又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、
例えばEP 257,956参照）。

【００７３】また、ＰＲＯ３６４ポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもでき
る。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性
マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプ
セルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例
えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Ch
em. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたようなポリ(２-ヒドロキシエチル- メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3
,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタメート
のコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、
例えばLupron DepotＴＭ（乳酸−ブリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドか
らなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133
,988）を含む。

【００７４】ＰＲＯ３６４ポリペプチド（又はそれに対する抗体）の治療的有効量は、当然
のことながら、対照とする療法（例えば、アポトーシス、自己免疫性又は炎症誘
発性反応の変調）、治療すべき病理学的状態、投与方法、治療に用いられる化合
物の型、包含される任意の同時治療、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、
医学的履歴などの要因によって変化し、それは担当する医師の技量の範囲内で良
好に決定される。従って、治療者は、最大の治療効果が得られるように、投与量
を滴定し投与経路を修正する必要がある。上記の指針では、有効投与量は、一般的に約０．００１から約１．０ｍｇ／ｋ
ｇの範囲内である。

【００７５】ＰＲＯ３６４ポリペプチド投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋
肉内、脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、
局所又は吸入経路による注射又は注入、あるいは持続放出系による。またＰＲＯ
３６４は腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所
的並びに全身に治療効果を発揮する。疾患を治療するＰＲＯ３６４ポリペプチドの有効性は、活性剤を、その目的の
ために有効な他の薬剤を、同じ組成物中又は別の組成物として、順次又は混合し
て投与することにより向上させてもよい。このような薬剤の例は、細胞毒性、化学治療薬、又は成長阻害剤、及び放射線
治療（照射の包含又は放射性物質の投与）を含む。ＰＲＯ３６４ポリペプチドと組み合わせて投与される治療薬の有効量は、医師
の裁量である。投与用量決定及び調節は、治療すべき状態の最大のマネジメント
を達成するためになされる。

【００７６】Ｆ．抗ＰＲＯ３６４抗体本発明は、さらに抗ＰＲＯ３６４ポリペプチド抗体を提供するものである。抗
体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘ
テロ抱合体抗体が含まれる。１．ポリクローナル抗体本発明の抗ＰＲＯ３６４抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗
体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は
、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射
することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバ
ントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Ｐ
ＲＯ３６４ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化
された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有
用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆
トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロ
イント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ
、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。

【００７７】２．モノクローナル抗体あるいは、抗ＰＲＯ３６４抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノク
ローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されてい
るようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリド
ーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤
により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるい
は生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化するこ
ともできる。

【００７８】免疫化剤は、典型的にはＰＲＯ３６４ポリペプチド又はその融合タンパク質を
含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が
使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリン
パ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用
いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Go
ding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1
986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウ
スの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合
の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地
で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。

【００７９】好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカ
リフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入
手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス
-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (
1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applicat
ions, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。

【００８０】次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリ
ドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又は
ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビト
ロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野にお
いて公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollar
d, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動
法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精
製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。

【００８１】また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567 号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロー
ナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に
換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US.
Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合すること
により修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本
発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結
合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することがで
きる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメイ
ンに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置
換でき、キメラ性二価抗体を生成する。

【００８２】抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイン
トで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換
するか欠失させて架橋を防止する。一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。

【００８３】３．ヒト化抗体本発明の抗ＰＲＯ３６４抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒ
ト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン
鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基
が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する
非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン( レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗
体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列に
も見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは
ほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるい
はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである
、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト
化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロ
ブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-5
25 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op
Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。

【００８４】非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(winter)及び共同研究者［Jo
nes等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (198
8)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類Ｃ
ＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される
。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に
少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,8
16,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によっ
て置換されたヒト抗体である。

【００８５】また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及
びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1
985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。

【００８６】４．二重特異性抗体二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方はＰＲＯ３６４ポリペプチドに対してであり、他方
は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプタ
ーサブユニットに対してである。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3656 (1991)に開示されている。

【００８７】所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。

【００８８】５．ヘテロ抱合体抗体ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結
合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対
してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用
して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド
交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を
作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレー
ト及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980
号に開示されているものが含まれる。

【００８９】Ｇ．抗ＰＲＯ３６４抗体の用途本発明の抗ＰＲＯ３６４抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＰＲＯ
３６４抗体は、上記の技術及び投与法を用いた治療に用いることができる。また
、例えば、抗ＰＲＯ３６４抗体は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの診断アッセイ、
例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合
アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われ
る免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,
CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で
標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しな
ければならない。例えば、検出可能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又
は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン
又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファター
ゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13:
1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Hi
stochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。

【００９０】また、抗ＰＲＯ３６４抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯ３
６４ポリペプチドのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、
ＰＲＯ３６４ポリペプチドに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を
使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定化する。次
に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む試料と接触
させた後、固定された抗体に結合したＰＲＯ３６４ポリペプチド以外の試料中の
物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯ３
６４ポリペプチドを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。

【００９１】Ｈ．製造品ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＰＲＯ３６４ポリペプチド又はそ
の抗体を含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備
する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器
はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の
診断又は治療に有効か組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例え
ば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイ
アルであってよい）。組成物中の活性剤はＰＲＯ３６４又はその抗体である。容
器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用さ
れることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例え
ばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器
をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、
シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場
から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性
剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。

【００９２】以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに
取り込む。（実施例）実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の
使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体
を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、マナッサス、バージニアである。

【００９３】実施例１：ヒトＰＲＯ３６４をコードするｃＤＮＡクローンの単離発現された配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ^ＴＭ、Incyte Ph
armaceuticals、Palo Alto, CA）を検索して、ポリペプチドの腫瘍壊死因子レセ
プター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーとの相同性を示すＥＳＴ（Incyte EST
No. 3003460）を同定した。次いでコンセンサスＤＮＡ配列を、BLAST（Altschul等, Methods in Enzymolo
gy, 266:460-480 (1996)）及び「phrap」（Phil Green, University of Washing
ton, Seattle, http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html）の繰り返しサイクルを用いてＩｎｃｙｔｅ３００３４６０ＥＳＴ及び他のＥＳ
Ｔ配列に対して組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＦｉｇ３Ａ−Ｃの
「(consen01)」と命名する。また、Ｆｉｇ３Ａ−Ｃに示す「(consen01)」コンセ
ンサス配列は、ここで「ＤＮＡ４４８２５」とも命名する（Ｆｉｇ４参照）。

【００９４】Ｆｉｇ３−４に示したＤＮＡ４４８２５及び「(consen1)」コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定
するため、及び２）ＰＲＯ３６４の全長コード化配列のクローンを単離するプロ
ーブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正及び逆のＰＣＲ
プライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１０
０−１０００ｂｐの長さのＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列
は典型的には４０−５５ｂｐの長さである。或る場合には、コンセンサス配列が
約１−１．５ｋｂｐを越えるときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。全
長クローンについての幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブ
ラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current protocols i Molecular Biologyに従
って、ＰＣＲプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。
次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー
対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用し
た。

【００９５】ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ｆ１）５’-CACAGCACGGGGCGATGGG-３ ’（配列番号：５）正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ｆ２）５’-GCTCTGCGTTTCTGCTCTG-３ ’（配列番号：６）正方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ＧＩＴＲ．ｆ）５’-GGCACAGCACGGGGC
GATGGGCGCGTTT-３’（配列番号：７）逆方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ｒ１）５’-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCA
C-３’（配列番号：８）逆方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ｒ２）５’-CGCTGACCCAGGCTTGAG’（配列番号：９）逆方向ＰＣＲプライマー（４４８２５．ＧＩＴＲ．ｒ）５’-GAAGGTCCCCGAGGC
ACAGTCGATACA-３’（配列番号：１０）さらに、次の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４４８２５配列から合成オリ
ゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを作成した。ハイブリッド形成プローブ（４４８２５．ｐ１）５’-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGG
GACTGCATGTGTGTCCAGC-３’（配列番号：１１）ハイブリッド形成プローブ（４４８２５．ＧＩＴＲ．ｐ）５’-AGCCTGGGTCAGC
GCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-３’（配列番号：１２）

【００９６】全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするため
に、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅し
た。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲ
プライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６４遺伝子をコードするクローンを単離し
た。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織から単離した。ｃ
ＤＮＡクローンを単離するために用いられるｃＤＮＡライブラリーは、Invitrog
en, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって作成し
た。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキ
ナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でお
よそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫ
Ｂ又はｐＲＫＤなど；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆
体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)参照）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。

【００９７】上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３６４の全長ＤＮＡ配
列［ここで、ＵＮＱ３１９（ＤＮＡ４７３６５−１２０６）と命名される］（配
列番号：１）及びＰＲＯ３６４の誘導タンパク質配列を与えた。ＵＮＱ３１９（ＤＮＡ４７３６５−１２０６）の全核酸配列をＦｉｇ１（配列
番号：１）に示す。クローンＵＮＱ３１９（ＤＮＡ４７３６５−１２０６）はＡ
ＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ATCC 209436が付与されている。クローンＵＮＱ３１９（ＤＮＡ４７３６５−１２０６）は、単一の読み取り枠を含み、ヌ
クレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を有し、［Kozak等, 上掲］、ヌクレオチド位置８４４−８４６の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１）。
予測されたポリペプチド前駆体は２４１アミノ酸長である（Ｆｉｇ２Ａ）。Ｆｉ
ｇ２Ａに示した全長ＰＲＯ３６４タンパク質は約２６，０００の見積もられた分
子量及び約６．３４のｐＩを有する。潜在的なＮ-グリコシル化部位は、Ｆｉｇ２Ａに示したアミノ酸配列のアミノ酸１４６と１４９の間に存在する。ヒドロパ
シー分析（示さず）は、Ｉ型膜貫通の類型を示唆し；推定シグナル配列はアミノ
酸１から２５であり潜在的な膜貫通ドメインはＦｉｇ２Ａに示した配列のアミノ
酸１６２と１８０の間に存在する。

【００９８】全長ＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部は腫瘍壊死
因子レセプターファミリーのメンバーと相同性を有し、それによりＰＲＯ３６４
が腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規なメンバーであり得ることを示して
いる。ＰＲＯ３６４の細胞内ドメインは、ＴＲＡＦ２結合に必要であることが示
されたＣＤ３０内、そしてＴＮＦＲ２内にも存在する最小ドメインに類似するモ
チーフ（Ｆｉｇ２Ａのアミノ酸２０７−２１４の領域内）を含む［Lee等, 上掲,
(1996)］。ＴＮＦＲファミリーに特徴的な［Naismith及びSprang, Trends Bioc
hem. sci., 23: 74-79 (1998)］見かけの細胞外システイン富むドメインがあり、その中で第３のＣＲＤは、ＴＮＦＲファミリーにより典型的な４または６個の
システインではなく３つのシステインを有する。マウスＧＩＴＲ（下記）に比較
すると、マウスＧＩＴＲのＣＲＤ１における５つのシステインに対してＰＲＯ３
６４アミノ酸配列はＣＲＤ１に８個のシステインを有し、マウスＧＩＴＲにおけ
る４つの潜在的なＮ-結合グリコシル化部位に比較してＥＣＤに１つの潜在的Ｎ-
結合グリコシル化部位が存在する（Ｆｉｇ２Ｂ参照）。全長ＰＲＯ３６４ポリペプチドの推定アミノ酸配列及びそれをコードする核酸
配列の詳細な検討により、Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216
-6221 (1997)に報告されたマウスＧＩＴＲ（ｍＧＩＴＲ）タンパク質との配列相
同性が明らかとなる。従って、ＰＲＯ３６４はNocentini等によって報告されたマウスＧＩＴＲタンパク質のヒト対応物又は相同分子種を表現することが可能で
ある。ＰＲＯ３６４ポリペプチドとｍＧＩＴＲアミノ酸配列との比較をＦｉｇ２
Ｂに示す。

【００９９】実施例２：ＰＲＯ３６４ポリペプチドの潜在的リガンドの同定ここに記載したＰＲＯ３６４ポリペプチドに結合するリガンドであり得る新規
なポリペプチをコードするｃＤＮＡクローンは以下のように単離された。Klein 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7108-7113 (1996)に記載された方法に以下の修正を加えて用いた。酵母菌形質転換は、複数回形質転換された酵母菌細胞
の数を減らすために制限された量の形質転換ＤＮＡで実施した。上掲のKlein等に記載されたように、酵母菌からのプラスミドの単離に続いて大腸菌を形質転換
するのではなく、単一の酵母菌集団にＰＣＲ分析を実施した。これは、最初のス
クロース陽性コロニーを新たなスクロース培地に再画線して陽性コロニーを精製
することにより達成した。次いで単一の精製コロニーを以下のプライマーを用い
るＰＣＲに使用した：５’-TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCTCAGAGAAACAAGCAAAAC-３’
（配列番号：１３）及び５’-CAGGAAACAGCTATGACCGAAGTGGACCAAAGGTCTATCGCTA- ３’（配列番号：１４）。インベルターゼ遺伝子の挿入物及び小部分を増幅し（
挿入物がインベルターゼの枠内であることの決定を可能にし）、全体の配列プラ
イマー部位に負荷するためにＰＣＲプライマーは二連とした。

【０１００】インベルターゼに融合したヒト臍帯内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞から誘導されたｃ
ＤＮＡ断片のライブラリを酵母菌に形質転換し、形質転換体をＳＣ-ＵＲＡ培地上で選択した。インベルターゼを分泌するクローンを同定するためにＵＲＡ及び
形質転換体をスクロース培地にレプリカプレートした。陽性クローンを再試験し
、ＰＣＲ産物を配列決定した。１つのクローン、ＤＮＡ１８４０の配列をシグナ
ルペプチドコード化配列を含むと同定した。ＤＮＡ１８４０の核酸配列を用いて
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを設計した。ヒト臍静脈内皮細胞か
らのｃＤＮＡの全長プラスミドライブラリを滴定し、約１００，０００ｃｆｕを
９６-ウェル丸底プレートに、５００ｃｆｕ／プールで１９２プールに蒔いた。プールを３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）させながら終夜成長させた。個々の培地
にＤＮＡ１８４０に特異的なプローブを用いてＰＣＲを実施した。アガロースゲ
ル電気泳動を実施し、陽性ウェルを予想されるサイズのバンドの可視化により同
定した。各陽性クローンを、コロニーリフト、次いで^３２Ｐ-標識オリゴヌクレオチドでのハイブリッド形成により得た。これらのクローンをＰＣＲ、制限消化
、及びサザンブロット分析により特徴付けした。

【０１０１】ｃＤＮＡクローン全部を配列させ、ｃＤＮＡクローンの完全配列をＤＮＡ１９
３５５−１１５０と命名した。ＤＮＡ１９３５５−１１５０クローンの核酸配列
をＦｉｇ５Ａ-Ｂ（配列番号：１５）に示す。クローンＤＮＡ１９３５５−１１５０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１−
２３に見かけの翻訳開始部位を有する［Kozak等, 上掲］（Ｆｉｇ５Ａ-Ｂ）。予
測されるポリペプチド前駆体は１７７アミノ酸長さであり（配列番号：１６）、
約２０，３０８ダルトンの計算された分子量を持つ。ヒドロパシー分析により、
推定細胞質領域（アミノ酸１−２５）；膜貫通領域（アミノ酸２６−５１）；及
び細胞外領域（アミノ酸５２−２７７）を持つＩＩ型膜貫通タンパク質の類型が
示唆された。２つの潜在的なＮ-結合グリコシル化部位は、Ｆｉｇ５Ａ-Ｂ（配列
番号：１５）に示す配列の位置１２９（Ａｓｎ）及び位置１６１（Ａｓｎ）に特
定された。クローンＤＮＡ１９３５５−１１５０は、1997年11月18日にＡＴＣＣ
に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４６６が付与されている。ＤＮＡ１９３５
５−１１５０にコードされるポリペプチドは、寄託されたＡＴＣＣ２０９４６６
ベクターのｃＤＮＡ挿入物にコードされる分子を発現させることにより得られ又
は得られうる。ベクターのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素での消化は、１４１１
ｂｐ断片及び６６８ｂｐ断片を生ずるであろう。

【０１０２】細胞外配列の（ALIGNコンピュータプログラムを用いた）BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づくと、ＤＮＡ１９３５５−１１５０は、ＴＮＦサイト
カインファミリーの幾つかのメンバーとアミノ酸配列同一性、特にヒトＡｐｏ- ２Ｌ（１９．８％）、Ｆａｓ／Ａｐｏ１-リガンド（１９．０％）、ＴＮＦ-アル
ファ（２０．６％）及びリンホトキシン-α（１７．５％）を示す（Ｆｉｇ６参照）。ＤＮＡ１９３５５−１１５０核酸配列にコードされるポリペプチドはの分析は
、それがここに記載したヒトＰＲＯ３６４ポリペプチドの潜在的なリガンドであ
ることを示した。

【０１０３】実施例３：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡの使
用以下の方法は、ＰＲＯ３６４をコードする核酸配列のハイブリッド形成プロー
ブとしての使用を記載する。全長ＰＲＯ３６４（Ｆｉｇ１、配列番号：１に示す）の配列のコード化配列を
含むＤＮＡ又はその断片は、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムラ
イブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯ３６４の天然発生変異体をコードするも
のなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は
、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ３６４ポリペプチド誘導プ
ローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード溶液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中
で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び
０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。次いで、全長天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の
配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定で
きる。

【０１０４】実施例４：大腸菌におけるＰＲＯ３６４ポリペプチドの発現この実施例は、大腸菌における組み換え発現による、ＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドの調製を例示する。全長ＰＲＯ３６４をコードするＤＮＡ配列（配列番号：３）又はその断片又は
変異体は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは
、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなけれ
ばならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ
３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であ
り、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクター
は、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベ
クターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロ
モーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈ
ｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ３６４コード領域、
ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。

【０１０５】ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用い
た選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレー
トで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。
プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。
次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた
細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化Ｐ
ＲＯ３６４ポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に
結合させる条件下で精製した。

【０１０６】実施例５：哺乳動物細胞におけるＰＲＯ３６４ポリペプチドの発現この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＰＲＯ３６４ポリペ
プチドの調製を例示する。発現ベクターとしてｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ
５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯ３６
４と呼ばれる。

【０１０７】一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては
滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレー
トにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ３６４ＤＮＡ
を約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 3
1:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ_２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μ
ｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭ
のＮａＰＯ_４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し
、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌ
のＰＢＳ中２０％グリセロールを３０分間添加した。２９３細胞は、次いで血清
無し培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。

【０１０８】形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μ
Ｃｉ／ｍｌ^３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ^３５Ｓ−メチオニンを含
む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し
、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾
燥させ、ＰＲＯ３６４ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィ
ルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを
施し（血清無し培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。これに換わる技術において、ＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡは、Somparyac等, P
roc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最
大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ３６４ＤＮＡを添加する。
細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した
。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。
細胞を２０％グリセロールで９０分間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養
培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリ
ンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離し
て濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯ３６４ポリペプ
チドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択し
た方法によって精製した。

【０１０９】他の実施態様では、ＰＲＯ３６４ポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させること
ができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯ３６４ベクターは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキ
ストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上
記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は^３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ３６４ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。
好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次
いで、発現されたＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方
法にとって精製することができる。また、エピトープタグＰＲＯ３６４ポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において
発現させてもよい。ＰＲＯ３６４クローン化ＤＮＡはｐＲＫ５ベクターからサブ
クローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウ
イルス発現ベクター中のｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳ
Ｖ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０
誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記の
ように標識化を行ってもよい。発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ^２＋−キレートアフィニティ
クロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。

【０１１０】実施例６：酵母菌でのＰＲＯ３６４ポリペプチドの発現以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ３６４ポリペプチドの組換え発現を記載す
る。第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ３６４ポリペプチド
の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。対象とするＰＲ
Ｏ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプ
ロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ３６４
ポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモー
ターをコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及
び（必要ならば）ＰＲＯ３６４ポリペプチドの発現のためのリンカー配列ととも
にクローニングすることができる。

【０１１１】酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリ
クロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシー
ブルー染色でゲルの染色をすることができる。続いて組み換えＰＲＯ３６４ポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵
母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃
縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む濃縮
物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい
。

【０１１２】実施例７：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ３６４ポリペプチドの発現以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯ３６４ポリペ
プチドの組換え発現を記載する。ＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエ
ピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３
９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ３６４コード化
ＤＮＡ又はＰＲＯ３６４コード化ＤＮＡの所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外
ドメインをコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーで
のＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵
素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化さ
れ、発現ベクターにサブクローニングされる。組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold^ＴＭウイルスＤ
ＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL
1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４から５日インキュベートした後、放出されたウ
イルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'
Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford:
Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。

【０１１３】次に、発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグＰＲＯ３６４ポリペプチドは、例えばＮｉ^２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製され
る。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、
ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗
浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５
ｍＭＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％Ｎ
Ｐ−４０；０．４ＭＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理し
た。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン
酸塩、３００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈
し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム（
Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬ
の負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラ
ムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ_２８０のベースラインま
で負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶
離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭＮａＣｌ、１０％
グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ_２８０のベースラインに再度到達し
た後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展
開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホス
ファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ^２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分
析した。溶離したＨｉｓ_１０−タグＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む分画をプー
ルし、負荷バッファーで透析した。あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ３６４ポリペプチドの精製は、
例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知の
クロマトグラフィー技術を用いて実施できる。

【０１１４】実施例８：ＰＲＯ３６４ポリペプチドに結合する抗体の調製この実施例は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナ
ル抗体の調製を例示する。モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ３６４ポリペプチド、ＰＲＯ３６４ポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換
えＰＲＯ３６４ポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が
過度の実験をすることなくなすことができる。

【０１１５】Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ３６４免疫原で免疫化する
。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Rese
arh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的
免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免
疫する。抗ＰＲＯ３６４ポリペプチド抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで
試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採
取してもよい。適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ＰＲＯ３６４ポリ
ペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを
屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコール
を用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．
１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドー
マ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチ
ミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハ
イブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。

【０１１６】ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ３６４ポリペプチドに対する反応性についての
ＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望のＰＲＯ３６４ポリペプチドに対する
モノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識
の範囲内である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＰＲ
Ｏ３６４ポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、
ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させること
もできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム
沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。ある
いは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティク
ロマトグラフィーを用いることもできる。

【０１１７】実施例９：ヒト細胞及び組織におけるＰＲＯ３６４ｍＲＮＡの発現を検出するア
ッセイ正常ヒト組織及び癌株化細胞におけるＰＲＯ３６４ｍＲＮＡの発現を試験する
アッセイを実施した。ＰＲＯ３６４転写物の検出のために種々のヒト組織及び癌株化細胞（Clontech
）をノーザンブロットハイブリッド形成により試験したが、全く検出されなかっ
た。定量的逆転写酵素ＰＣＲを用いて、ＰＲＯ３６４ｍＲＮＡを、ＰＢＬ、脳、
骨髄、脾臓、胸腺及び肺で、そして腎臓、心臓、小腸及び肝臓組織では比較的低
レベルで検出した（Ｆｉｇ７参照）。相対的ｍＲＮＡ発現レベルを、以下のＰＲ
Ｏ３６４特異的プライマー及び蛍光発生プローブ： DNA47365.tm.f - CCACTGAAACCTTGGACAGA（配列番号：２０） DNA47365.tm.p - CCCAGTTCGGGTTTTCTCACTGTGTTCC（配列番号：２１） DNA47365.tm.r - ACAGCGTTGTGGGTCTTGTTC（配列番号：２２）を用いて、Heid等, Genome Res., 6: 986-94 (1994)に本質的に記載されているＴａｑｍａｎ装置（ABI）を用いた定量的ＰＣＲで決定した。ＰＣＲ産物の信頼性は、対応するｃＤＮＡに対するサザンブロットハイブリッド形成により確認し
た。発現レベルは小腸組織に対して規格化した。

【０１１８】別のアッセイにおいて、一次ヒトＴ細胞（Ｔ細胞富化カラム（R & D Systems ）を用いてドナー全血から単離）及び単球／マクロファージ（組織培養フラスコ
への接着によりドナー全血から単離）を、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭグルタミン
を添加したＲＰＭＩ中に保持した。次いで細胞を、ＰＨＡ（１マイクログラムｍ
ｌ；Sigma）、抗ＣＤ３抗体（１マイクログラム／ｍｌ；Pharmagen）、ＬＰＳ（
１マイクログラム／ｍｌ；Sigma）、ＴＮＦ-アルファ（１マイクログラム／ｍｌ
；Pennica等, Nature, 312: 724-729 (1984)に記載されたように調製）、又は可
溶性ＤＮＡ１９３５５リガンド（５マイクログラム／ｍｌ；下記の実施例１０に
記載するように調製）で２４時間処理した。次いで相対的ｍＲＮＡ発現レベルを
上述のＴａｑｍａｎ手法によって分析した。発現レベルは、バッファー処理した
Ｔ細胞に対して規格化した。結果をＦｉｇ８に示す。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）又は抗ＣＤ３抗体で
刺激した後、単離した血液Ｔ細胞においてＰＲＯ３６４ｍＲＮＡの実質的アップ
レギュレーションが観察された。高レベルの発現は単離した単球／マクロファー
ジで観察され、この発現はＬＰＳによってさらに増大した（Ｆｉｇ８参照）。

【０１１９】実施例１０：ＤＮＡ１９３５５のＰＲＯ３６４レセプターに対する結合特異性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド（上記実施例２に記載）が、Nocentini等, Pro
c. Natl. Acad. Sci., 94: 6216-6221 (1997)に記載されたマウスＧＩＴＲ（ｍＧＩＴＲ）ポリペプチドのヒト相同分子種であると信じられているＰＲＯ３６４
と相互作用し特異的に結合するか否かを決定するためのアッセイを実施した。結合性を試験するために、ＰＲＯ３６４細胞外ドメイン（Ｆｉｇ２Ａのアミノ
酸１−１６１参照）を含む可溶性免疫グロブリン融合タンパク質（イムノアドヘ
シン）を昆虫細胞で発現させた。ＰＲＯ３６４ＥＣＤは、バキュロウイルスを用
いて昆虫細胞においてＣ-末端ＩｇＧ-Ｆｃタグ形態として発現させた（実施例７
に記載）。

【０１２０】可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、大腸菌におけるＥＣＤの発現により
調製した。ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドの細胞外領域（Ｆｉｇ５Ａ-Ｂのアミノ酸５２〜１７７；配列番号：１６）をコードするＤＮＡ配列を、各々隣接する
ＮｇｅＩ及びＸｂａＩ制限部位を含むプライマー：正：5'- GAC GAC AAG CAT AT
G TTA GAG ACT GCT AAG GAG CCC TG -3'（配列番号：１７）；逆：5'- TAG CAG
CCG GAT CCT AGG AGA TGA ATT GGG GATT -3'（配列番号：１８）とともに増幅し
た。ＰＣＲ産物を消化し、（プラスミドから誘導された）１２アミノ酸のエンテ
ロキナーゼ切断部位に続くMet Gly His10配列： Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp
Asp Asp Asp Lys His Met （配列番号：１９）の下流かつ枠内で、プラスミドｐ
ＥＴ１９Ｂ（Novagen）のＮｄｅＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドを、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて、大腸菌
株ＪＭ１０９（ATCC 53323）を形質転換するのに用いた。形質転換体をＰＣＲで同定した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析及びＤＮＡ配列分析に
より確認した。選択したクローンを抗生物質添加の液体培養培地ＬＢ中で終夜成長させた。続
いて、終夜培地を、より大規模な培養を接種するのに用いた。細胞を所定の光学
密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。

【０１２１】細胞をさらに数時間培養した後、遠心分離により細胞を収集した。遠心分離で
得た細胞ペレットを、０．１Ｍトリス、０．２ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０を含むバッファー中にマイクロフリューダイザーを用いて可溶化
した。可溶化したＤＮＡ１９３５５タンパク質は、ニッケル−セファロースのア
フィニティクロマトグラフィを用いて精製した。ＤＮＡ１９３５５タンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、次いでニッケル複合セイヨウワサビペルオキシダーゼでのウェスタンブロット、次いでＥＣＬ検
出（boehringer Mannheim）をした。３つの優勢なバンドが検出され、それらはタンパク質の単量体、同種二量体、及び同種三量体形態のサイズに相当する。こ
の結果に基づいて、可溶性ＤＮＡ１９３５５タンパク質が、その天然形態で、Ｓ
ＤＳ変性無しに同種三量体を形成できると考えられる。

【０１２２】次いで、可溶性ＤＮＡ１９３５５ＥＣＤ分子を、そのＰＲＯ３６４イムノアド
ヘシンと相互作用する能力を試験するために^１２５Ｉで標識した。比較のため、
以下のＴＮＦレセプターファミリーメンバー：ＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮ
ＦＲ１、ＴＮＦＲ２、及びＡｐｏ-３のイムノアドヘシン作成物も製造した。ＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、及びＡｐｏ-３イムノアドヘシンは、ＴＮＦＲ１について既に記載されているように［Ashkenazi等, Proc.
Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991)］、各レセプターのＥＣＤをヒトＩｇＧのヒンジ又はＦｃ部分に融合させることにより調製した。個々のＴＮＦレ
セプターファミリーメンバーは、発明部分の背景（及び引用した関連参考文献）
に記載されている。同時沈殿アッセイのために、各イムノアドヘシン（５マイクログラム）を^１２ ^５Ｉ標識可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド（１マイクログラム）とともに２
４℃で１時間インキュベートした後、氷上で３０分間プロテインＡ−セファロー
スをした。反応混合物を遠心沈殿させ、ＰＢＳで数回洗浄し、２０ｍＭジチオト
レイトールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに再溶解してオートラジオグラフィを行った。

【０１２３】結果をＦｉｇ９に示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置を図に示した。ＰＲ
Ｏ３６４-ＩｇＧ結合は放射性ヨウ素化可溶性ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに結合した。しかしながら、ＰＲＯ３６４-ＩｇＧは、ＣＤ９５、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、及びＡｐｏ-３のイムノアドヘシン作成物には結合しなかった。他のアッセイにおいて、ヒト２９３細胞を全長ＤＮＡ１９３５５で一過的に形
質移入し、ＰＲＯ３６４、ＴＮＦＲ１、ＨＶＥＭ、及びＤｃＲ１のレセプターイ
ムノアドヘシン作成物のこれらの形質移入細胞に結合する能力をＦＡＣＳ分析で
決定した。２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、
１００マイクログラム／ｍｌペニシリン、及び１００マイクログラム／ｍｌスト
レプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ培地中に維持した。形質移入細
胞（１ｘ１０^５）を、１マイクログラムの各レセプター又はリガンドイムノアド
ヘシンを含む２００マイクロリットルのＦＢＳ／ＰＢＳ中、４℃で６０分間イン
キュベートした。次いで、細胞を２％のＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、Ｒ-フィコエリスリン抱合ヤギ抗ヒト抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）で染
色した。次に、細胞をＦＡＣＳで分析した。個々のイムノアドヘシンの一過性形
質移入細胞への結合性を試験するために、ＣＤ４の発現ベクター（ｐＲＫ５-ＣＤ４；Smith等, Science, 328: 1704-1707 (1987)）をＤＮＡ１９３５５発現ベクター（上記参照）と同時形質移入した。次いで、ＦＡＣＳ分析における形質移
入細胞集団を同定しゲートするために、ＦＩＴＣ抱合抗ＣＤ４（Pharmingen, Sa
n Diego, CA）を用いた。

【０１２４】Ｆｉｇ１０Ａに示すように、ＰＲＯ３６４-ＩｇＧは、全長ＤＮＡ１９３５５をコードする発現プラスミドで形質移入した細胞表面に特異的に結合した。この
ような結合は、ＴＮＦＲ１、ＨＶＥＭ又はＤｃＲ１イムノアドヘシンのいずれに
も観察されなかった。ＰＲＯ３６４-ＩｇＧは対照プラスミドで形質移入した細胞には結合しなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドとＰＲＯ３６４との特異的結
合性相互作用、及びＤＮＡ１９３５５ポリペプチドが試験した他のＴＮＦレセプ
ターファミリーメンバーのいずれとも相互作用しないことを示している。

【０１２５】ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ライブ
ラリで同定され、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチド転写物はＲＴ-ＰＣＲによってＨＵＶＥＣにおいて容易に検出可能であった（データは示さず）。ＰＲＯ３６４
-ＩｇＧの特異的結合がＦＡＣＳ分析によりＨＵＶＥＣで示されるか否かを試験するためにＦＡＣＳ分析アッセイを実施した。ＨＵＶＥＣはCell System（Kirkl
and, WA）から購入し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、１０ｍＭ
のＨｅｐｅｓ、及び１０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦを含有するＨａｍ’ｓＦ１２
と低グルコースＤＭＥＭ培地との５０：５０混合物中で成長させた。細胞を、一
次抗体としてＰＢＳ、ＰＲＯ３６４-ＩｇＧ、ＴＮＦＲ１-ＩｇＧ又はＦａｓ-ＩｇＧでＦＡＣＳ選別し、ヤギ抗ヒトＦ(ａｂ’)２をフィコエリスリン（CalTag,
Burlingame, Ca）に抱合させた。ＰＲＯ３６４-ＩｇＧはＨＵＶＥＣに特異的に結合することが見出された。（Ｆｉｇ１０Ｂ参照）。Ｆａｓ-ＩｇＧもＴＮＦＲ１-ＩｇＧも内皮細胞に対する特
異的結合性を示さなかった。

【０１２６】実施例１１：ＤＮＡ１９３５５によるＮＦ-κＢの活性化Ｅ-セレクチン遺伝子からのＮＦ-κＢ応答配列を含むピロモーターに制御され
るレポーター遺伝子の発現を分析することにより、ＤＮＡ１９３５５／ＰＲＯ３
６４がＮＦ-κＢを活性化させるか否かを決定するためのアッセイを行った。ヒト２９３細胞（２ｘ１０^５）（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００マ
イクログラム／ｍｌペニシリン、及び１００マイクログラムのストレプトマイシ
ンを添加したＨＧ-ＤＭＥＭ中に保持）を、０．５マイクログラムのホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３．
ＥＬＡＭ．ｔｋ［Yang等, Nature, 395: 284-288 (1998)］及び０．０５マイクログラムのRenillaルシフェラーゼレポータープラスミド（内部形質移入対照物として）、並びにＤＮＡ１９３５５及びＰＲＯ３６４について示した付加的発現
ベクター（上記）（０．１マイクログラムＰＲＯ３６４；ＤＮＡ１９３５５発現
ベクター及び以下に参照する他の発現ベクターについては０．５マイクログラム
）、及びキャリアプラスミドｐＲＫ５Ｄでリン酸カルシウム形質移入により一過
的に形質移入し、形質移入の間で一定のＤＮＡを維持した。２４時間後、形質移
入細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を製造者（Pharmacia）に推奨されたように検定した。活性（３つのウェルの平均）を、ホタルルシフェラーゼ活性をReni
llaルシフェラーゼの活性で除すことにより形質移入効率の相違について規格化し、付加した発現ベクターが無い場合に見られる活性に相対する活性として表現
した。

【０１２７】Ｆｉｇ１１に示すように、ＰＲＯ３６４の過剰発現は有意なレポーター遺伝子
活性化をもたらし、観察された結果はＤＮＡ１９３５５とＰＲＯ３６４の同時発
現によって向上した。ＰＲＯ３６４ポリペプチドシグナル伝達の潜在的メディエータを試験するため
に、ＴＮＦ-アルファ、ＩＬ-１、又はＬＰｓ-ＴｏｌｌによるＮＦ-ＫＢ活性化の
経路に含まれる或る種の細胞内シグナル伝達分子のドミナントネガティブ変異体
を試験した。２９３細胞を、ｐＧＬ３．ＥＬＡＭ．ｔｋ及び発現ベクターで（上記のように
）一過的に形質移入した。さらに、以下のドミナントネガティブ形態をコードす
る哺乳動物発現ベクターＭｙＤ８８-ＤＮ（ａａ１５２−２９６）；ＴＲＡＦ２-
ＤＮ（ａａ８７−５０１）；ＴＲＡＦ６−ＤＮ（ａａ２８９−５２２）；ＩＲＡ
Ｋ-ＤＮ（ａａ１−９６）；ＩＲＡＫ２-ＤＮ（ａａ１−９６）；ＲＩＰ１-ＤＮ（ａａ５５９−６７１）；ＲＩＰ２-ＤＮ；及びＮＩＫ-ＤＮ［Cao等, Science,
271: 1128-1131 (1996); Malinin等, Nature, 385: 540-544 (1997); Muzio等,
Science, 278: 1612-1615 (1997); Rothe等, Science, 269: 1424-1427 (1995);
Ting等, EMBO J., 15: 6189-6196 (1996); Wesche等, Immunity, 7: 837-847 (
1997)に記載］で細胞を形質移入した。ルシフェラーゼ活性は上述のように発現させて測定した。

【０１２８】結果をＦｉｇ１２に示す。ＴＮＦ-アルファ（Malinin等, Nature, 385: 540-5
44 (1997)）、ＩＬ-１（Malinin等, 上掲）、及びＬＰｓ-Ｔｏｌｌ（Yang等, Na
ture, 395: 284-288 (1998)）のドミナントインヒビターとして作用するＮＩＫのキナーゼ不活性変異体の同時形質移入は、ＰＲＯ３６４を介するＮＦ-ＫＢ活性化を実質的に阻害した。また、Ｎ-末端欠失を有するドミナントネガティブＴＲＡＦ２（Rothe等, Sience, 269: 1424-1427 (1995); Rothe等, Cell: 78: 681
-692 (1994)）もＮＦ-ＫＢ活性化を減弱させた。これに対して、ＲＩＰ１（Stan
ger等, Cell, 81: 513-523 (1995)）及びＲＩＰ２（McCarthy等, J. Biol. Chem
., 273: 16968-75 (1998)）ドミナントネガティブ変異体（ＲＩＰ１-ＤＮ及びＲ
ＩＰ２-ＤＮ）は、ＰＲＯ３６４を介するＮＦ-ＫＢ仮性かを阻止しなかった。Ｉ
Ｌ-１（Adachi等, Immunity, 9: 143-150 (1998); Burns等, J. Biol. Chem., 2
73: 12203-12209 (1998); Cao等, Science, 271: 1128-1131 (1996); Muzio等,
J. Exp. med., 187: 2097-2101 (1997)）及び／又はＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１及びＩＲＡＫ２及びＴＲＡＦ６（Medzhitov等, Mol. Cell., 2: 253-258 (1998)）
を含むＴｏｌｌ類によるＮＦ-ＫＢの活性化に含まれる幾つかの分子のドミナントネガティブ形の過剰発現は、ＮＦ-ＫＢのＰＲＯ３６４活性化を阻止しなかった。ＩＲＡＫ１-ＤＮ（ＩＲＡＬ１のＮ-末端９６アミノ酸からなる）は、ＬＰｓ
-誘発ＮＦ-ＫＢ活性化を実質的に阻害した類似の実験（Yang等, 上掲）とは対照
的に、ＰＲＯ３６４を介するＮＦ-ＫＢの活性化の増加をもたらした。従って、ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドは、ＴＮＦ-アルファがＴＮＦＲ２を介して関与する経路と同様に、ＴＲＡＦ２及びＮＩＫを含む経路に関与することによりＰＲ
Ｏ３６４レセプターを活性化させうる。

【０１２９】実施例１２：ＰＲＯ３６４のＴ細胞ＡＩＣＤを阻害する能力を決定するアッセイ外因性Ｆａｓリガンドの機能を含む（Nagata等, 上掲）Ｔ細胞活性化に誘発さ
れる細胞死（ＡＩＣＤ）に対するＰＲＯ３６４の影響を決定するためにインビト
ロアッセイを実施した。ヒトジャーカットＴ白血病細胞（ＡＴＣＣ）（２ｘ１０^６）を、ＤＮＡ１９３
５５又はＰＲＯ３６４プラスミドのいずれか（上記の通り；５マイクログラム）
又は両方を持つSuperfect（Qiagen）によって形質移入した。約２４時間後、ＰＢＳバッファー又は抗ＣＤ３抗体（Pharmingen）を予め被覆した培養プレートウ
ェルに蒔き、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。１８時間後、Marste
rs等, Current Biology, 上掲に既に記載されているように、アネキシン結合のＦＡＣＳ分析によりアポトーシスについて細胞をアッセイした。結果をＦｉｇ１３に示す。ＤＮＡ１９３５５又はＰＲＯ３６４でのジャーカッ
ト細胞の形質移入はＡＩＣＤ応答を阻害し、リガンド及びレセプター分子両方の
同時発現はＡＩＣＤに対する殆ど完全な保護を与えた。これらの結果は、ＰＲＯ
３６４がＴ細胞生存の調節に含まれ、よってＰＲＯ３６４はＴ細胞機能を変調さ
せうることを示唆している。

【０１３０】材料の寄託次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 Univers
ity Boulevard., Manassas, VA, USA(ATCC)に寄託した：材料寄託日 ATCC寄託番号 DNA47365-1206 1997年11月7日 ATCC 209436 DNA19355-1150 1997年11 月7日 ATCC 209466

【０１３１】この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。

【０１３２】

【０１３３】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ１】天然配列ＰＲＯ３６４ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１２１−８４
３）の核酸配列（配列番号：２）を含む核酸配列（配列番号：１）を示す図であ
り、核酸配列（配列番号：１）は、ここで「ＵＮＱ３１９」及び／又は「ＤＮＡ
４７３６５−１２０６」と命名されるクローンである。また、イニシエータメチ
オニン残基の位置を示し、並びに「４７３６５．ｔｍ．ｆ」、「４７３６５．ｔ
ｍ．ｐ」及び「４７３６５．ｔｍ．ｒ」と命名される３つのオリゴヌクレオチド
プライマーは下線で示した。タンパク質の推定膜貫通ドメインは図のヌクレオチ
ド６０４−６６０でコードされる。

【Ｆｉｇ２Ａ】Ｆｉｇ１に示した核酸配列のヌクレオチド１２１−８４３
から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３）を示す図である。潜在的な膜貫通
ドメインは図のアミノ酸１６２と１８０の間に存在しそれらを含む。

【Ｆｉｇ２Ｂ】ＰＲＯ３６４のアミノ酸配列とマウスＧＩＴＲとのアライ
ンメントを示す図である。推定ＣＲＤを推定膜貫通ドメイン（ＴＭ）と同様に示
した。同一の残基を囲み、潜在的Ｎ-結合グリコシル化部位を黒丸で示した。

【Ｆｉｇ３】「(consen01)」と命名されるコンセンサス核酸配列を示す図
である。

【Ｆｉｇ４】本発明でＤＮＡ４４８２５（配列番号：４）と命名されるＦ
ｉｇ３に示した「(consen01)」コンセンサス核酸配列を示す図である。また、「
４４８２５．ＧＩＴＲ．ｆ」、「４４８２５．ｆ１」、「４４８２５．ＧＩＴＲ
．ｐ」、「４４８２５．ｒ２」、「４４８２５．ｐ１」、「４４８２５．ＧＩＴ
Ｒ．ｒ」、「４４８２５．ｆ２」及び「４４８２５．ｒ１」の位置を下線で示し
た。

【Ｆｉｇ５Ａ】ここでＤＮＡ１９３５５−１１５０と命名されるｃＤＮＡ
クローンのコード核酸配列（配列番号：１５）及び推定アミノ酸配列（配列番号
：１６）を示す図である。

【Ｆｉｇ５Ｂ】ここでＤＮＡ１９３５５−１１５０と命名されるｃＤＮＡ
クローンのコード核酸配列（配列番号：１５）及び推定アミノ酸配列（配列番号
：１６）を示す図である。

【Ｆｉｇ６】ＤＮＡ１９３５５−１１５０によってコードされたポリペプ
チドのアミノ酸配列と、Ａｐｏ-２Ｌ、Ｆａｓ／Ａｐｏ１-リガンド、ＴＮＦ-アルファ及びリンホトキシン-αを含むＴＮＦサイトカインファミリーの幾つかのメンバーとの比較を示す図である。

【Ｆｉｇ７】定量的逆転写ＰＣＲで決定した場合の、種々のヒト細胞及び
組織におけるＰＲＯ３６４の相対的ｍＲＮＡ発現を示す図である。

【Ｆｉｇ８】定量的逆転写ＰＣＲで決定した場合の、（抗-ＣＤ３抗体、ＰＨＡ又はＬＰＳで処理した）一次ヒトＴ細胞及び単球におけるＰＲＯ３６４の
相対的ｍＲＮＡ発現を示す図である。

【Ｆｉｇ９】上記の実施例１０に記載した同時沈殿アッセイの結果を示す
図である。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフは、ＰＲＯ３６４−ＩｇＧ分子が放射性ヨウ素化ＤＮＡ１９３５５ポリペプチドに結合したことを明示し
た。結合は、表示した他のイムノアドヘシン作成物では観察されなかった。

【Ｆｉｇ１０Ａ】同定したレセプター又はリガンドイムノアドヘシン作成
物への結合性について検定された形質移入２９３細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す
図である。

【Ｆｉｇ１０Ｂ】同定したイムノアドヘシン作成物への結合性について検
定されたＨＵＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す図である。

【Ｆｉｇ１１】ＤＮＡ１９３５５リガンド／ＰＲＯ３６４レセプターによ
るＮＦ-ＫＢ活性化を示すために実施したルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である。

【Ｆｉｇ１２】ＤＮＡ１９３５５リガンド／ＰＲＯ３６４レセプターによ
るＮＦ-ＫＢ活性化における或る種の細胞内シグナル伝達分子の役割を示すために実施したルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である。

【Ｆｉｇ１３】ヒトジャーカットＴ細胞系のＡＩＣＤに対するＰＲＯ３６
４／ＤＮＡ１９３５５リガンドの影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １０７ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 19/00 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マースターズ，スコットエー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94070，サンカーロス，チェリーストリート 990 (72)発明者ピッティ，ロバートエム．アメリカ合衆国カリフォルニア 94530，エルチェリート，リバティーストリート 1110 (72)発明者ウッド，ウィリアムアイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94010，ヒルスボロー，サウスダウンコート 35 (72)発明者ゴッダード，オードリーアメリカ合衆国カリフォルニア 94131，サンフランシスコ，コンゴストリート 110

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２４
１の配列を含むＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）
（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮ
Ａを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】前記ＤＮＡが、配列番号：１又はその補体の核酸配列を含む
請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】前記ＤＮＡが、配列番号：１の核酸配列のヌクレオチド１２
１−８４３を含む請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３６のｃＤＮＡ（ＤＮＡ４
７３６５−１２０６）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配
列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項５】（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３６のｃＤＮＡ（ＤＮＡ４
７３６５−１２０６）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ分子を含む請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜Ｘの
配列を含むＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ
）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを
含んでなり、ＸがＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１５７−１６７の
いずれかである単離された核酸分子。
【請求項７】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜２
４１の配列を含むＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ
）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤ
ＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項８】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜Ｘ
の配列を含むＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（
ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡ
を含んでなり、ＸがＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１５７−１６７
のいずれかである単離された核酸分子。
【請求項９】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜２
４１を含むＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と少なくとも８０
％の配列同一性を有するＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡに厳密な条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ配列；（ｃ）遺伝暗号の縮重により（ａ）のＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡからなる群からのＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１０】請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる
ベクター。
【請求項１１】当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコン
トロール配列に作用可能に結合した請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】請求項１０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１３】前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１２に記載の宿主細胞
。
【請求項１４】前記細胞が大腸菌細胞である請求項１２に記載の宿主細胞
。
【請求項１５】前記細胞が酵母菌細胞である請求項１２に記載の宿主細胞
。
【請求項１６】請求項１２に記載の宿主細胞を、前記ＰＲＯ３６４ポリペ
プチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から前記ＰＲＯ３６４ポリペプ
チドを回収することを含んでなるＰＲＯ３６４ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜２４１を
含んでなる単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチド。
【請求項１８】ＡＴＣＣ登録番号２０９４３６として寄託されたベクター
のｃＤＮＡ挿入物（ＤＮＡ４７３６５−１２０６）にコードされる単離されたＰ
ＲＯ３６４ポリペプチド。
【請求項１９】Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１〜Ｘを含ん
でなり、ＸがＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１５７−１６７のいず
れかである単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチド。
【請求項２０】Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜２４１
を含んでなる単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチド。
【請求項２１】Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜Ｘを含
んでなり、ＸがＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１５７−１６７のい
ずれかである単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチド。
【請求項２２】（ａ）Ｆｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基２６〜
Ｘを含んでなり、ＸがＦｉｇ２Ａ（配列番号：３）のアミノ酸残基１５７−１６
７のいずれかであるＰＲＯ３６４ポリペプチド；及び（ｂ）（ａ）の断片であり、前記断片が生物学的に活性なポリペプチドである
断片からなる群から選択されるポリペプチドを含んでなる単離されたＰＲＯ３６４ポ
リペプチド。
【請求項２３】異種アミノ酸配列に融合したＰＲＯ３６４ポリペプチドを
含んでなるキメラ分子。
【請求項２４】前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項
２３に記載のキメラ分子。
【請求項２５】前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である
請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２６】ＰＲＯ３６４ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２７】前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２６に記載の
抗体。
【請求項２８】請求項１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のいずれ
か一項に記載の単離されたＰＲＯ３６４ポリペプチドと担体とを含んでなる組成
物。
【請求項２９】前記担体が製薬的に許容可能な担体である請求項２８に記
載の組成物。
【請求項３０】哺乳動物細胞を有効量のＰＲＯ３６４ポリペプチドに暴露
することを含んでなる哺乳動物細胞におけるアポトーシスを変調させる方法。
【請求項３１】哺乳動物細胞を有効量のＰＲＯ３６４ポリペプチドに暴露
することを含んでなる哺乳動物細胞におけるＮＦ-ＫＢ活性化を変調させる方法。
【請求項３２】哺乳動物細胞を有効量のＰＲＯ３６４ポリペプチドに暴露
することを含んでなる哺乳動物細胞における炎症誘発又は自己免疫反応を変調さ
せる方法。