KR20180082563A - 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr)에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents
글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (gitr)에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 또한, 암의 치료와 같은 치료 용도에서의 이들 단백질의 용도가 제공된다. 추가로, 항체를 생산하는 세포, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 각각 2015년 11월 19일 및 2016년 3월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/257,599 및 62/303,990에 대한 우선권을 주장한다. 상기 언급된 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다. 2017년 11월 17일에 작성된 상기 ASCII 카피는 2016-11-15_MXI-547PC_ST25.txt로 명명되고, 1,011,555 바이트 크기이다.
TNFRSF18, AITR, CD357, 및 GITR-D로도 공지되어 있는 공동-자극 분자인 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR)은 덱사메타손으로 처리된 뮤린 T 세포주에서 최초로 확인된 TNF 수용체 패밀리의 구성원이다 (Nocentini et al., PNAS 1997;94:6216-21). TNF 수용체 패밀리의 다른 관련 구성원은 CD40, CD27, 4-1BB, 및 OX40을 포함한다. GITR 발현은 나이브 CD4+ 및 CD8+ 세포에서는 낮지만, 조절 T 세포에서는 구성적으로 발현된다 (Tone et al., PNAS 2003;100:15059-64). 그러나, 그의 발현이 이펙터 T 세포에서 유도되면, GITR 맞물림은 그의 활성화, 증식 및 시토카인 생산을 촉진한다 (Watts, Annual Reviews in Immunology 2005;23:23-68). CD4+CD25+ 조절 T 세포 (Treg)와 관련하여, 시미즈(Shimizu)는 혼합 배양 억제 검정을 사용하여 GITR 맞물림이 그의 기능을 억제한다는 것을 보고하였다 (Shimizu et al., Nature Immunology 2002;3:135-42). 그러나, 스테판스(Stephans) 등에 의한 후속 연구 (JI 2004 15;173(8):5008-20)는 T이펙터 (Teff) 세포 상에서의 GITR 맞물림이 그를 Treg 억제에 대해 덜 감수성이도록 한다는 것을 결정하였고, 이는 Treg-Teff 세포 공동-배양에서 관찰되는 감소된 억제를 설명한다. DTA-1 (래트 항-마우스 GITR) 항체-매개 GITR 자극은 다중 종양 모델에서 항종양 면역을 촉진한다.
GITR에 대한 리간드인 GITR-L은 항원-제시 세포 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포)에서 낮은 수준으로 발현되지만, 예를 들어 바이러스 감염에 의해 활성화되면 이들 세포에서 일시적으로 상향조절된다 (Suvas et al., J Virol. 2005;79:11935-42).
암과 같은 질환을 표적화하기 위한 개선된 전략에 대한 계속적인 필요가 증진된 면역 반응, 특히 T 세포 반응으로부터 이익을 얻는다는 것을 고려하면, GITR 활성을 조정하는 신규 작용제 및 방법은 매우 바람직하다.
GITR에 특이적으로 결합하고 바람직한 기능적 특성을 갖는 단리된 항체, 예컨대 모노클로날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체가 본원에 제공된다. 이들 특성은 인간 GITR에 결합하고, 원숭이 GITR (예를 들어, 시노몰구스 GITR)에 결합하는 높은 친화도, 및 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 포함한다. 본원에 기재된 항체는, 예컨대 종양-보유 또는 바이러스-보유 (바이러스-감염된) 대상체에서 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하고, 샘플에서 GITR 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, GITR에 결합하고, (1) 서열식별번호(SEQ ID NO): 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아니다. 특정 실시양태에서, 항체는 하기 특성 중 적어도 1종을 나타낸다:
(a) 가용성 인간 GITR에 결합함;
(b) 막 결합된 인간 GITR에 결합함;
(c) 막 결합된 시노몰구스 GITR에 결합함;
(d) T 세포 활성화, 예를 들어, 항원 특이적 T 세포 활성화를 유도하거나 증진시킴;
(e) GITR 리간드가 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 억제함;
(f) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(g) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프에 결합함;
(h) O-연결 및 N-글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(i) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(j) 인간 GITR에의 결합에 대해 항체 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및 6G10 중 1종 이상과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 항종양 면역 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응을 자극한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 GITR-발현 T 세포에서 시토카인 생산 (예를 들어, IL-2 및/또는 IFN-γ)을 증가시키고/거나 T 세포 증식을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 Fc 수용체에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 1종 이상의 FcγR, 예를 들어 활성화 또는 억제 FcγR에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 비아코어에 의해 측정 시 10 nM 이하의 KD로 가용성 인간 GITR에 결합하고/거나, 스캐차드에 의해 측정 시 1 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 GITR에 결합하고/거나, FACS에 의해 측정 시 1 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 인간 GITR에 결합하고/거나, FACS에 의해 측정 시 10 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 시노몰구스 GITR에 결합하고/거나, 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포, 예를 들어 Teff 세포 활성화를 유도 또는 증진시키고/거나, FACS에 의해 측정 시 1 μg/mL 이하의 EC50으로 GITR 리간드가 GITR에 결합하는 것을 억제하고/거나, 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 영역 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내에 결합한다.
GITR에 특이적으로 결합하고,
(a) 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 서열식별번호: 335 및 336
으로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 포함하고,
(1) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아니다.
GITR에 결합하고,
(a) 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 33, 34, 및 35를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 36, 37, 및 38을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 또는
(c) 각각 서열식별번호: 46, 47, 및 48을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 49, 50, 및 51을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 65, 66, 및 67을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 68, 69, 및 70을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 78, 79, 및 80을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 81, 82, 및 83을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 91, 92, 및 93을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 94, 95, 및 96을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 109, 110, 및 111을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 112, 113, 및 114를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 122, 123, 및 124를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 125, 126, 및 127을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 141, 142, 및 143을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 144, 145, 및 146을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 또는
(m) 각각 서열식별번호: 342, 343, 및 344를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 345, 346, 및 347을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열
을 포함하고,
(1) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아니다.
GITR에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
GITR에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
GITR에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한, 예를 들어 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다:
(a) 각각 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 각각 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 각각 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 각각 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 각각 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 각각 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 각각 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 각각 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 각각 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 각각 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 각각 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 각각 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 각각 서열식별번호: 335 및 336.
GITR에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다:
(a) 각각 서열식별번호: 15 및 16;
(b) 각각 서열식별번호: 17 및 19;
(c) 각각 서열식별번호: 18 및 19;
(d) 각각 서열식별번호: 28 및 29;
(e) 각각 서열식별번호: 30 및 32;
(f) 각각 서열식별번호: 31 및 32;
(g) 각각 서열식별번호: 41 및 42;
(h) 각각 서열식별번호: 43 및 45;
(i) 각각 서열식별번호: 44 및 45;
(j) 각각 서열식별번호: 55 및 56;
(k) 각각 서열식별번호: 55 및 57;
(l) 각각 서열식별번호: 58 및 60;
(m) 각각 서열식별번호: 59 및 60;
(n) 각각 서열식별번호: 58 및 61;
(o) 각각 서열식별번호: 59 및 61;
(p) 각각 서열식별번호: 73 및 74;
(q) 각각 서열식별번호: 75 및 77;
(r) 각각 서열식별번호: 76 및 77;
(s) 각각 서열식별번호: 86 및 87;
(t) 각각 서열식별번호: 88 및 90;
(u) 각각 서열식별번호: 89 및 90;
(v) 각각 서열식별번호: 102 및 104;
(w) 각각 서열식별번호: 103 및 104;
(x) 각각 서열식별번호: 100 및 101;
(y) 각각 서열식별번호: 100 및 371;
(z) 각각 서열식별번호: 102 및 105;
(za) 각각 서열식별번호: 103 및 105;
(zb) 각각 서열식별번호: 117 및 118;
(zc) 각각 서열식별번호: 119 및 121;
(zd) 각각 서열식별번호: 120 및 121;
(ze) 각각 서열식별번호: 131 및 132;
(zf) 각각 서열식별번호: 134 및 136;
(zg) 각각 서열식별번호: 135 및 136;
(zh) 각각 서열식별번호: 131 및 133;
(zi) 각각 서열식별번호: 134 및 137;
(zj) 각각 서열식별번호: 135 및 137;
(zk) 각각 서열식별번호: 337 및 338;
(zl) 각각 서열식별번호: 339 및 341; 및
(zm) 각각 서열식별번호: 340 및 341.
특정 실시양태에서, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 (a) 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 및/또는 6G10과 GITR 상의 동일한 에피토프에 결합하고, (b) 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및/또는 6G10이 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 억제한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 영역 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 및 시노몰구스 GITR 둘 다에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체, 또는 그의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 무이펙터 IgG1 Fc, 예를 들어 하기 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 갖는 무이펙터 IgG1 Fc를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은, 예를 들어 야생형 IgG1 Fc에 비해, 활성화 FcγR에 결합하거나 또는 그에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 CDR 영역 내 메티오닌 잔기는 산화를 겪지 않은 아미노산 잔기로 치환된다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 인간 또는 인간화 항체이다.
GITR에 결합하고 IgG2 힌지 및 IgG2 이소형의 것이 아닌 CH1, CH2 및 CH3 중 적어도 1개를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며, 여기서 항-GITR 항체는 비-IgG2 힌지를 갖는 것을 제외하고는 동일한 항-GITR 항체에 비해 증진된 효능제 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362의 아미노산 서열과 최대 10개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄를 포함한다.
특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, 및 371의 아미노산 서열과 최대 10개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄를 포함한다.
제2 결합 특이성을 갖는 분자에 연결된 항-GITR 항체를 포함하는 이중특이적 분자가 본원에 제공된다.
항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산, 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 발현 벡터로 형질전환된 세포가 본원에 제공된다.
작용제에 연결된, 본원에 기재된 항-GITR 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 제공된다.
항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 담체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다.
세포에서 항-GITR 항체를 발현시키고, 항체를 세포로부터 단리하는 것을 포함하는, 항-GITR 항체를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 T 세포를 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다.
세포, 예를 들어 이펙터 T 세포를 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 CD3과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 이펙터 T 세포가 활성화 또는 공동-자극되는 것인, T 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포를 활성화 또는 공동-자극하는 방법이 본원에 제공된다.
T 세포를 유효량의 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 T 세포의 증식을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 항-GITR 항체를 포함하는 이중특이적 분자 또는 접합체, 또는 항-GITR 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여 T 세포로부터 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체에서 T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
유효량의 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 접합체를 투여하여, T 조절 세포의 수의 감소 또는 고갈을 필요로 하는 대상체의 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소시키는 것을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 이펙터 또는 증진된 이펙터 기능을 갖는 것인, 상기 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소 또는 고갈시키는 방법이 본원에 제공된다.
대상체에서 면역 반응이 자극되도록 유효량의 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 갖고, 종양에 대한 면역 반응이 자극된다.
대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 본원에 제공된다.
암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 항-GITR 항체를 포함하는 이중특이적 분자 또는 접합체, 또는 항-GITR 항체를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 예를 들어 면역요법에 의해 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 배세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 및 바이러스-관련 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 항-GITR 항체와 함께 1종 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 항-PD1 항체, LAG-3 항체, CTLA-4 항체, 및/또는 PD-L1 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
샘플을 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 GITR 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 GITR의 존재를 검출하는 방법이 본원에 제공된다.
암을 치료하고/거나, 대상체에서 면역 반응을 자극하고/거나, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하고/거나, T 세포를 활성화 또는 공동-자극하고/거나, IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 T 세포의 증식을 증가시키고/거나, 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소 또는 고갈시키고/거나, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한, 본원에 기재된 항-GITR 항체의 용도가 본원에 제공된다. 또한, 대상체에서 면역 반응을 자극하고/거나, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하고/거나, T 세포를 활성화 또는 공동-자극하고/거나, IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 T 세포의 증식을 증가시키고/거나, 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소 또는 고갈시키고/거나, 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 항-GITR 항체의 용도가 본원에 제공된다.
본 개시내용의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이고, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1은 모노클로날 항체 28F3 (각각 서열식별번호: 13 및 14), 18E10 (각각 서열식별번호: 39 및 40), 및 19D3 (각각 서열식별번호: 26 및 27)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여준다. 28F3의 VH 및 VL CDR은 밑줄표시된다.
도 2a는 28F3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 147) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 13)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 20), CDR2 (서열식별번호: 21) 및 CDR3 (서열식별번호: 22) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 2b는 28F3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 148) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 14)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 23), CDR2 (서열식별번호: 24), 및 CDR3 (서열식별번호: 25) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 3a는 18E10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 158) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 39)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 46), CDR2 (서열식별번호: 47), 및 CDR3 (서열식별번호: 48) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 3b는 18E10 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 159) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 40)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 49), CDR2 (서열식별번호: 50), 및 CDR3 (서열식별번호: 51) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 4a는 19D3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 154) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 26)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 33), CDR2 (서열식별번호: 34), 및 CDR3 (서열식별번호: 35) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 4b는 19D3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 155) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 27)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 36), CDR2 (서열식별번호: 37), 및 CDR3 (서열식별번호: 38) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5a는 3C3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 162) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 52)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 62), CDR2 (서열식별번호: 63), 및 CDR3 (서열식별번호: 64) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5b는 3C3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 163) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 53)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 65), CDR2 (서열식별번호: 66), 및 CDR3 (서열식별번호: 67) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5c는 3C3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 164) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 54)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 68), CDR2 (서열식별번호: 69), 및 CDR3 (서열식별번호: 70) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 6a는 2G6 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 168) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 71)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 78), CDR2 (서열식별번호: 79), 및 CDR3 (서열식별번호: 80) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 6b는 2G6 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 169) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 72)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 81), CDR2 (서열식별번호: 82), 및 CDR3 (서열식별번호: 83) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 7a는 8A6 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 172) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 84)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 91), CDR2 (서열식별번호: 92), 및 CDR3 (서열식별번호: 93) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 7b는 8A6 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 173) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 85)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 94), CDR2 (서열식별번호: 95), 및 CDR3 (서열식별번호: 96) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8a는 9G7 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 176) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 97)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 106), CDR2 (서열식별번호: 107), 및 CDR3 (서열식별번호: 108) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8b는 9G7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 177) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 98)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 109), CDR2 (서열식별번호: 110), 및 CDR3 (서열식별번호: 111) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8c는 9G7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 178) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 99)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 112), CDR2 (서열식별번호: 113), 및 CDR3 (서열식별번호: 114) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 9a는 14E3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 182) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 115)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 122), CDR2 (서열식별번호: 123), 및 CDR3 (서열식별번호: 124) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 9b는 14E3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 183) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 116)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 125), CDR2 (서열식별번호: 126), 및 CDR3 (서열식별번호: 127) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10a는 19H8 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 186) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 128)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 138), CDR2 (서열식별번호: 139), 및 CDR3 (서열식별번호: 140) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10b는 19H8 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 187) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 129)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 141), CDR2 (서열식별번호: 142), 및 CDR3 (서열식별번호: 143) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10c는 19H8 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 188) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 130)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 144), CDR2 (서열식별번호: 145), 및 CDR3 (서열식별번호: 146) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 11a는 6G10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 353) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 335)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 342), CDR2 (서열식별번호: 343), 및 CDR3 (서열식별번호: 344) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 11b는 6G10 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 354) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 336)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 345), CDR2 (서열식별번호: 346), 및 CDR3 (서열식별번호: 347) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 12는 28F3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 13)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 193, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 13는 28F3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 14)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 14는 18E10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 39)과 인간 배선 VH 3-33, 6-19, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 199, 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 15는 18E10의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 40)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 16는 19D3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 26)과 인간 배선 VH 3-33, 3-16, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 200, 및 198)의 정렬을 보여준다.
도 17는 19D3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 27)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 18은 3C3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 52)과 인간 배선 VH 4-34 및 JH3 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 201 및 202)의 정렬을 보여준다.
도 19a는 3C3의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 53)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 19b는 3C3의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 54)과 인간 배선 Vk L20 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 208 및 206)의 정렬을 보여준다.
도 20는 2G6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 71)과 인간 배선 VH 3-33 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 21는 2G6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 72)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 22는 8A6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 84)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 193, 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 23는 8A6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 85)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 24는 9G7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 97)과 인간 배선 VH 3-15, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 203, 194, 및 198)의 정렬을 보여준다.
도 25a는 9G7의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 98)과 인간 배선 Vk A27 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 209 및 210)의 정렬을 보여준다.
도 25b는 9G7의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 99)과 인간 배선 Vk A27 및 JK5 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 209 및 212)의 정렬을 보여준다.
도 26는 14E3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 115)과 인간 배선 VH 4-34 및 JH3 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 201 및 202)의 정렬을 보여준다.
도 27는 14E3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 116)과 인간 배선 Vk L15 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 211)의 정렬을 보여준다.
도 28는 19H8의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 128)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 195, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 29a는 19H8의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 129)과 인간 배선 Vk L18 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 211)의 정렬을 보여준다.
도 29b는 19H8의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 130)과 인간 배선 Vk L6 및 JK4 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 213 및 214)의 정렬을 보여준다.
도 30는 6G10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 335)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 195, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 31는 6G10의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 336)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 32는 FACS에 의해 평가된 바와 같은, 활성화된 인간 T 세포에 대한 다양한 항-GITR 항체의 결합 친화도 (nM)를, 항체 부재, IgG1 및 hIgG2 항체 대조군과 함께 보여준다.
도 33은 FACS에 의해 평가된 바와 같은, 활성화된 시노몰구스 T 세포에 대한 다양한 항-GITR 항체의 결합 친화도 (nM)를, 대조군으로서 항체 부재 및 hIgG1 및 hIgG2 항체와 함께 보여준다.
도 34a 및 34b는 GITR 리간드 (GITR-L)의 GITR 3A9 세포에 대한 결합을 억제하는 다양한 항-GITR 항체의 능력을, 대조군으로서 hIgG1, hIgG2, 항체 부재, 및 세포 단독과 함께 보여준다.
도 34c는 재조합 GITR-L의 활성화된 인간 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 결합을 보여준다.
도 34d는 GITR-L이 28F3-hIgG1의 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 대한 결합을 부분적으로 차단한다는 것을 보여준다. 0.5 μg/mL의 고정 농도에서의 28F3-hIgG1의 활성화된 T 세포에 대한 결합은 사전-결합된 GITR-L에 의해 0.0024 μg/mL의 IC50으로 부분적으로 차단되었다.
도 34e는 28F3-hIgG1이 0.6 μg/ml의 GITR-L이 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 것을 차단하지 않는다는 것을 보여준다. GITR-L이 CD4+ T 세포에 대략 90% 포화인 0.6 mg/mL로 첨가된 경우에, 사전-결합된 28F3-hIgG1은 100 mg/mL 내지 0.00056 mg/mL의 범위에서 GITR-L을 차단할 수 없었다.
도 34f는 28F3-hIgG1이 0.02 μg/ml의 GITR-L이 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 것을 부분적으로 차단한다는 것을 보여준다. 20 ng/mL의 고정 농도에서의 GITR-L의 활성화된 T 세포에 대한 결합은 사전-결합된 28F3-hIgG1에 의해 0.075 μg/mL의 IC50으로 부분적으로 차단되었다.
도 35a는 항-GITR 항체 28F3이 천연 인간 GITR에는 결합하지만, 변성된 인간 GITR에는 결합하지 않고, 결합은 N-연결된 글리코실화의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증하는 웨스턴 블롯을 보여준다. "+" 부호는 N-연결된 글리코실화를 제거하기 위해 PNGase F로 처리된 샘플을 나타낸다.
도 35b는 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮기기 전에 모든 형태의 인간 GITR의 존재를 보여주는 쿠마시 블루 염색된 겔이다.
도 36a-36b는 엔도프로테이나제 Arg-C (1), 엔도프로테이나제 Lys-C (2), 트립신 (3), 엔도프로테이나제 Glu-C (4), 또는 엔도프로테이나제 Asp-N(5)에 의한 소화에 의해 생성된 천연 GITR 단편에 대한 28F3 및 3C3 항체의 결합을 보여준다.
도 37은 28F3 항체가 결합하는 에피토프의 위치 (박스 영역)를 확인시켜주는, 엔도프로테이나제 Glu-C 및 트립신 ("Glu-C 및 트립신"), 엔도프로테이나제 Arg-C ("Arg-C"), 엔도프로테이나제 Lys-C 및 트립신 ("Lys-C 및 트립신"), 트립신, 또는 엔도프로테이나제 Asp-N 및 엔도프로테이나제 Glu-C ("AspN 및 GluC")에 의한 천연 인간 GITR 단백질의 소화로부터 생성된 인간 GITR 펩티드 단편에 결합한 항-GITR 항체 28F3의 열 지도 도면을 보여준다. 인간 GITR의 성숙 세포외 도메인의 아미노산 서열은 암회색으로 도시되고, 그에 C-말단 연결된 마우스 Fc의 서열은 담회색으로 도시된다.
도 38a는 천연 인간 GITR의 트립신 소화로부터 생성된 펩티드에 대한 28F3 코팅된 비드의 인큐베이션 후, 관통 분획 내의 펩티드를 보여준다.
도 38b는 2종의 주요 28F3 결합된 펩티드를 보여준다 (별표로 표시됨).
도 38c는 제시된 서열을 갖고 O-연결된 글리코실화가 결여된 N-말단 펩티드에 상응하는, 도 34b에서의 2개의 피크 중 첫번째 것의 LC-MS에 의한 확인을 보여준다.
도 38d는 제시된 서열을 갖고 T20 상에 O-연결된 글리코실화를 갖는 N-말단 펩티드에 상응하는, 도 34b에서의 2개의 피크 중 두번째 것의 LC-MS에 의한 확인을 보여준다.
도 38e는 28F3과 함께 인큐베이션된 보다 긴 펩티드의 엔도프로테이나제 Asp-N에 의한 계내 소화 후 남아있는 GITR 펩티드를 보여준다.
도 39a는 GITR의 N-말단 영역에 대해 86%의 서열 적용범위를 달성한, 재조합 인간 GITR/Fc 및 재조합 인간 GITR/Fc와 28F3 IgG1의 단백질 복합체에 대한 펩신분해 펩티드의 목록을 보여준다.
도 39b는 28F3 IgG1 mAb ("GITR.6")의 부재/존재 하에서의 HDX 질량 분광측정법 (MS)에 의한 중수소 흡수 수준을 보여준다.
도 39c는 HDX MS에 의해 결정된 바와 같은, 28F3에 의해 결합된 성숙 인간 GITR 내의 2개의 영역을 도시한다.
도 40은 플레이트-결합된 항-CD3 항체 존재 하에서의 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 다양한 효능제 항-GITR 항체의 효과를 보여준다.
도 41a는 특정 항원에 의해 활성화된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 18E10, 13H2 (28F3과 동일), 및 28F3의 효과를 보여준다.
도 41b는 특정 항원에 의해 활성화된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 3C3 ("GITR.3"으로 제시됨), 28F3, 19D3, 및 18E10의 효과를 보여준다.
도 42a는 CHO-OKT3 세포 (즉, OKT3 scfv를 발현하는 CHO 세포)에 의해 자극된 T 세포에 의한 인터페론 감마 (IFN-γ) 분비에 대한 다양한 효능제 항-GITR HuMab 항체의 효과를 보여준다.
도 42b는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제1 공여자로부터의 것이다.
도 42c는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제1 공여자로부터의 것이다.
도 42d는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제2 공여자로부터의 것이다.
도 42e는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제2 공여자로부터의 것이다.
도 43은 HEL48-63 펩티드 존재 하에 LK35.2 세포에 의해 자극된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3 (IgG2), 28F3-F(ab')2 단편, 및 28F3-Fab의 효과를 보여준다.
도 44는 모노클로날 항체 28F3-FITC에 의한 인간 편도 시편의 면역조직화학을 보여준다.
도 45a-45d는 MC38 결장 선암종 모델에서 래트 항-마우스 GITR 항체, DTA-1의 상이한 이소형으로 처리된 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 항종양 활성에 대한 이들 이소형의 효과를 보여준다: (도 45a) 대조군 마우스 IgG1 항체 (10 mg/kg); (도 45b) DTA-1 래트 IgG2b (10 mg/kg); (도 45c) DTA-1 마우스 IgG1 (10 mg/kg); (도 45d) DTA-1 마우스 IgG2a (10 mg/kg). 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 무종양 (TF) 마우스의 수가 제시된다.
도 46a 및 46b는 상이한 이소형의 DTA-1 항체 (10 mg/kg)로 처리된 마우스 군에서의 MC38 종양의 평균 (도 46a) 및 중앙 종양 부피 (도 46b)의 변화를 보여준다.
도 47a-47f는 표시된 상이한 항-GITR (DTA-1) 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형 및 대조군 항체로 처리된 MC38 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 47a-47c) 및 종양 침윤 림프구 (TIL) (도 47d-47f)의 유동 세포측정 분석을 보여준다. (도 47a) 비장에서의 CD8+ T 세포의 백분율; (도 47b) 비장에서의 CD4+ 세포의 백분율; (도 47c) 비장에서의 또한 Foxp3+이기도 한 CD4+ 세포의 백분율; (도 47d) TIL에서의 CD8+ T 세포의 백분율; (도 47e) TIL에서의 CD4+ 세포의 백분율; (도 47f) TIL에서의 또한 Foxp3+이기도 한 CD4+ 세포의 백분율.
도 48a-48f는 MC38 모델에서 응집을 최소화하도록 재조작된 래트 항-마우스 GITR 항체, DTA-1 ("mGITR.7"로 지칭됨)의 상이한 이소형으로 처리된 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, 항종양 활성에 대한 이들 이소형의 효과를 보여준다: (도 48a) 대조군 마우스 IgG1 항체; (도 48b) mGITR.7 mIgG1; (도 48c) mGITR.7 mIgG1-D265A; (도 48d) mGITR.7 mIgG2a; (도 48e) mGITR.7 mIgG2b; (도 48f) mGITR.7 래트 IgG2b. 9마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 TF 마우스의 수가 제시된다.
도 49a 및 49b는 상이한 이소형의 재조작된 DTA-1 항체로 처리된 마우스의 군에서의 MC38 종양의 평균 (도 49a) 및 중앙 종양 부피 (도 49b)의 변화를 보여준다.
도 50a 및 50b는 MC38 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 50a) 및 TIL (도 50b)에서의 Foxp3+/CD4+ Treg에 대한 상이한 DTA-1 (재조작된 "mGITR" DTA-1 또는 최초로 조작된 "DTA-1" 항체) 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형의 효과의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 51a-51e는 상이한 마우스 DTA-1 이소형으로 처리된 개별 마우스의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, Sa1N 섬유육종 마우스 모델에서의 이들 이소형의 항종양 활성을 보여준다: (도 51a) 대조군 마우스 IgG1 항체; (도 51b) DTA-1 마우스 IgG2a; (도 51c) DTA-1 래트 IgG2b; (도 51d) DTA-1 마우스 IgG1; (도 51e) DTA-1 마우스 IgG1-D265A. 최대 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 TF 마우스의 수가 제시된다.
도 52a 및 52b는 상이한 이소형의 DTA-1 항체로 처리된 마우스의 군에서의 Sa1N 종양의 평균 (도 52a) 및 중앙 종양 부피 (도 52b)의 변화를 보여준다.
도 53a 및 53b는 Sa1N 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 53a) 및 TIL (도 53b)에서의 Foxp3+/CD4+ Treg에 대한 상이한 DTA-1 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형의 효과를 보여준다.
도 54a-54d는 병기결정된 MC38 결장 선암종 모델을 사용한, 종양 부피에 대한 래트 항-GITR 항체, DTA-1의 효과를 보여준다. 마우스를 (도 54a) 대조군 mIgG1, (도 54b) mIgG + DTA-1, (도 54c) mIgG + PD-1, 및 (도 54d) PD-1 + DTA-1로 제7일, 제10일 및 제14일에 처리하였다. 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 무종양 (TF) 마우스의 수가 제시된다.
도 55a 및 55b는 3A9-hGITR 세포에의 결합에 대한 항-GITR 항체 28F3의 VH CDR3에서의 다양한 돌연변이 조합의 효과를 보여준다.
도 56a-56f는 플레이트 결합된 항-CD3의 존재 하의 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비 수준에 대한 항-GITR 항체 28F3의 VH CDR3에서의 다양한 돌연변이 조합의 효과를 보여준다.
도 57은 활성화된 T 세포에 대한 표시된 항-GITR 항체의 결합 친화도를 보여준다. 시험된 항체는 하기 중쇄 불변 영역 중 하나를 포함하였다: IgG1 불변 영역 ("항-GITR.g1f"), 무이펙터 IgG1 불변 영역 ("항-GITR.g1.1f"), IgG2 불변 영역 ("항-GITR-G2"), IgG2 힌지 및 IgG1 Fc 도메인 ("항-GITR.G2.G1f"), 및 IgG2 힌지 및 무이펙터 IgG1 Fc 도메인 ("항-GITR.G2.G1.1f").
도 58a-58c는 상이한 중쇄 불변 영역을 갖는 가용성 항-인간 GITR 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IFN-γ 및 IL-2의 분비를 보여준다. 도 58a는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 IgG2-IgG1 불변 영역을 갖는 항-인간 GITR 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IFN-γ 분비를 보여준다. 도 58b는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 IgG2-IgG1 하이브리드 중쇄 불변 도메인에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IL-2 분비를 보여준다. 도 58c는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 도 55a 및 b에서의 무이펙터 버전 (IgG1.1)의 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IL-2 분비를 보여준다.
도 59는 플레이트 결합된 항-CD3의 존재 하의 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비에 대한 표시된 항-GITR 항체의 비교를 보여준다.
도 60a-60d는 Treg 및 Teff 세포의 증식에 대한 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1의 효과를 보여준다.
도 61a-61f는 2명의 상이한 공여자로부터의 활성화된 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 Treg-풍부화 세포의 NK 세포 유도된 용해에 대한 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 62a-62c는 MC38 종양의 성장에 대한 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 (항-GITR IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 63a 및 63b는 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 ("항-GITR IgG1.1")로 처리된 마우스에서의 MC38 종양의 평균 부피 및 중앙 부피를 각각 보여준다.
도 64a 및 64b는 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 ("항-GITR IgG1.1")로 처리된 MC38 종양을 갖는 마우스의 평균 % 체중 변화 및 중앙 % 체중 변화를 각각 보여준다.
도 65는 MC38 종양 모델에서의 Treg 세포의 고갈에 대한, 이소형 대조군 대비 28F3.IgG1 ("GITR IgG1")의 효과를 보여준다.
도 66은 MC38 종양 모델에서의 CD8+ T 세포의 백분율에 대한, 이소형 대조군 대비 28F3.IgG1 ("GITR IgG1")의 효과를 보여준다.
도 67은 CHO-OKT3 및 CHO-OKT3-CD32a 세포와 공동-배양한 경우 T 세포로부터의 IFN-γ 분비에 대한 가용성 및 가교된 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 68은 CHO-OKT3 및 CHO-OKT3-CD32a 세포와 공동-배양한 경우 T 세포 증식에 대한 가용성 및 가교된 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 69는 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다.
도 70은 항-his Fab 포획된 FcγR-his 단백질에 대한 항체 결합을 보여준다. 결합 반응은 1:1 mAb:FcγR 결합 화학량론을 가정하여 이론적 Rmax의 백분율로서 플롯팅된다. 각각의 항체에 대한 막대는 슬라이드 하단의 색상 범례에 제공된 순서대로 제시된다.
도 71은 항-his Fab 포획된 FcgR-his 단백질에 대한 항체 결합을 보여준다. 결합 반응은 1:1 mAb:FcγR 결합 화학량론을 가정하여 이론적 Rmax의 백분율로서 플롯팅된다. 각각의 항체에 대한 막대는 슬라이드 하단의 색상 범례에 제공된 순서대로 제시된다.
도 72는 항-GITR 항체의 내재화 시간 경과 분석을 보여준다.
도 73a는 0 시점에서의 GITR 및 초기 엔도솜 마커 EEA2 공동-국재화 분석을 보여준다.
도 73b는 30분 및 120분 시점에서의 GITR 및 초기 엔도솜 마커 EEA2 공동-국재화 분석을 보여준다.
도 73c는 총 염색 대비 공동국재화된 픽셀 강도의 비로서 플롯팅된, 도 73a 및 73b에 제시된 엔도솜 공동-국재화의 정량화 결과를 보여준다.
도 74a는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD8+ T 세포에서의 NFkB 신호전달 활성화를 보여준다.
도 74b는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD4+ T 세포에서의 NFkB 신호전달 활성화를 보여준다.
도 75는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD4+ T 세포에서의 P38 활성화를 보여준다.
도 76a는 상이한 농도의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다.
도 76b는 5 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
도 76c는 1.25 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
도 76d는 0.313 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
도 2a는 28F3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 147) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 13)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 20), CDR2 (서열식별번호: 21) 및 CDR3 (서열식별번호: 22) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 2b는 28F3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 148) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 14)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 23), CDR2 (서열식별번호: 24), 및 CDR3 (서열식별번호: 25) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 3a는 18E10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 158) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 39)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 46), CDR2 (서열식별번호: 47), 및 CDR3 (서열식별번호: 48) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 3b는 18E10 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 159) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 40)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 49), CDR2 (서열식별번호: 50), 및 CDR3 (서열식별번호: 51) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 4a는 19D3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 154) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 26)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 33), CDR2 (서열식별번호: 34), 및 CDR3 (서열식별번호: 35) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 4b는 19D3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 155) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 27)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 36), CDR2 (서열식별번호: 37), 및 CDR3 (서열식별번호: 38) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5a는 3C3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 162) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 52)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 62), CDR2 (서열식별번호: 63), 및 CDR3 (서열식별번호: 64) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5b는 3C3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 163) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 53)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 65), CDR2 (서열식별번호: 66), 및 CDR3 (서열식별번호: 67) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 5c는 3C3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 164) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 54)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 68), CDR2 (서열식별번호: 69), 및 CDR3 (서열식별번호: 70) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 6a는 2G6 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 168) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 71)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 78), CDR2 (서열식별번호: 79), 및 CDR3 (서열식별번호: 80) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 6b는 2G6 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 169) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 72)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 81), CDR2 (서열식별번호: 82), 및 CDR3 (서열식별번호: 83) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 7a는 8A6 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 172) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 84)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 91), CDR2 (서열식별번호: 92), 및 CDR3 (서열식별번호: 93) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 7b는 8A6 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 173) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 85)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 94), CDR2 (서열식별번호: 95), 및 CDR3 (서열식별번호: 96) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8a는 9G7 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 176) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 97)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 106), CDR2 (서열식별번호: 107), 및 CDR3 (서열식별번호: 108) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8b는 9G7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 177) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 98)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 109), CDR2 (서열식별번호: 110), 및 CDR3 (서열식별번호: 111) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 8c는 9G7 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 178) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 99)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 112), CDR2 (서열식별번호: 113), 및 CDR3 (서열식별번호: 114) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 9a는 14E3 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 182) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 115)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 122), CDR2 (서열식별번호: 123), 및 CDR3 (서열식별번호: 124) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 9b는 14E3 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 183) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 116)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 125), CDR2 (서열식별번호: 126), 및 CDR3 (서열식별번호: 127) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10a는 19H8 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 186) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 128)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 138), CDR2 (서열식별번호: 139), 및 CDR3 (서열식별번호: 140) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10b는 19H8 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK1)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 187) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 129)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 141), CDR2 (서열식별번호: 142), 및 CDR3 (서열식별번호: 143) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 10c는 19H8 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역 (VK2)의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 188) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 130)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 144), CDR2 (서열식별번호: 145), 및 CDR3 (서열식별번호: 146) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 11a는 6G10 인간 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 353) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 335)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 342), CDR2 (서열식별번호: 343), 및 CDR3 (서열식별번호: 344) 영역이 설명되고, V, D 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 11b는 6G10 인간 모노클로날 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 354) 및 아미노산 서열 (서열식별번호: 336)을 보여준다. CDR1 (서열식별번호: 345), CDR2 (서열식별번호: 346), 및 CDR3 (서열식별번호: 347) 영역이 설명되고, V 및 J 배선 유래부분이 표시된다.
도 12는 28F3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 13)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 193, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 13는 28F3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 14)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 14는 18E10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 39)과 인간 배선 VH 3-33, 6-19, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 199, 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 15는 18E10의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 40)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 16는 19D3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 26)과 인간 배선 VH 3-33, 3-16, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 200, 및 198)의 정렬을 보여준다.
도 17는 19D3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 27)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 18은 3C3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 52)과 인간 배선 VH 4-34 및 JH3 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 201 및 202)의 정렬을 보여준다.
도 19a는 3C3의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 53)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 19b는 3C3의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 54)과 인간 배선 Vk L20 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 208 및 206)의 정렬을 보여준다.
도 20는 2G6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 71)과 인간 배선 VH 3-33 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 21는 2G6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 72)과 인간 배선 Vk L15 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 22는 8A6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 84)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 193, 및 197)의 정렬을 보여준다.
도 23는 8A6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 85)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 24는 9G7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 97)과 인간 배선 VH 3-15, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 203, 194, 및 198)의 정렬을 보여준다.
도 25a는 9G7의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 98)과 인간 배선 Vk A27 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 209 및 210)의 정렬을 보여준다.
도 25b는 9G7의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 99)과 인간 배선 Vk A27 및 JK5 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 209 및 212)의 정렬을 보여준다.
도 26는 14E3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 115)과 인간 배선 VH 4-34 및 JH3 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 201 및 202)의 정렬을 보여준다.
도 27는 14E3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 116)과 인간 배선 Vk L15 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 207 및 211)의 정렬을 보여준다.
도 28는 19H8의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 128)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 195, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 29a는 19H8의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 129)과 인간 배선 Vk L18 및 JK1 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 211)의 정렬을 보여준다.
도 29b는 19H8의 경쇄 가변 영역 (VK2)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 130)과 인간 배선 Vk L6 및 JK4 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 213 및 214)의 정렬을 보여준다.
도 30는 6G10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 (서열식별번호: 335)과 인간 배선 VH 3-33, 3-10, 및 JH6 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 192, 195, 및 196)의 정렬을 보여준다.
도 31는 6G10의 경쇄 가변 영역 (VK1)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 336)과 인간 배선 Vk L18 및 JK2 아미노산 서열 (각각 서열식별번호: 204 및 205)의 정렬을 보여준다.
도 32는 FACS에 의해 평가된 바와 같은, 활성화된 인간 T 세포에 대한 다양한 항-GITR 항체의 결합 친화도 (nM)를, 항체 부재, IgG1 및 hIgG2 항체 대조군과 함께 보여준다.
도 33은 FACS에 의해 평가된 바와 같은, 활성화된 시노몰구스 T 세포에 대한 다양한 항-GITR 항체의 결합 친화도 (nM)를, 대조군으로서 항체 부재 및 hIgG1 및 hIgG2 항체와 함께 보여준다.
도 34a 및 34b는 GITR 리간드 (GITR-L)의 GITR 3A9 세포에 대한 결합을 억제하는 다양한 항-GITR 항체의 능력을, 대조군으로서 hIgG1, hIgG2, 항체 부재, 및 세포 단독과 함께 보여준다.
도 34c는 재조합 GITR-L의 활성화된 인간 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 결합을 보여준다.
도 34d는 GITR-L이 28F3-hIgG1의 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 대한 결합을 부분적으로 차단한다는 것을 보여준다. 0.5 μg/mL의 고정 농도에서의 28F3-hIgG1의 활성화된 T 세포에 대한 결합은 사전-결합된 GITR-L에 의해 0.0024 μg/mL의 IC50으로 부분적으로 차단되었다.
도 34e는 28F3-hIgG1이 0.6 μg/ml의 GITR-L이 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 것을 차단하지 않는다는 것을 보여준다. GITR-L이 CD4+ T 세포에 대략 90% 포화인 0.6 mg/mL로 첨가된 경우에, 사전-결합된 28F3-hIgG1은 100 mg/mL 내지 0.00056 mg/mL의 범위에서 GITR-L을 차단할 수 없었다.
도 34f는 28F3-hIgG1이 0.02 μg/ml의 GITR-L이 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 것을 부분적으로 차단한다는 것을 보여준다. 20 ng/mL의 고정 농도에서의 GITR-L의 활성화된 T 세포에 대한 결합은 사전-결합된 28F3-hIgG1에 의해 0.075 μg/mL의 IC50으로 부분적으로 차단되었다.
도 35a는 항-GITR 항체 28F3이 천연 인간 GITR에는 결합하지만, 변성된 인간 GITR에는 결합하지 않고, 결합은 N-연결된 글리코실화의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 입증하는 웨스턴 블롯을 보여준다. "+" 부호는 N-연결된 글리코실화를 제거하기 위해 PNGase F로 처리된 샘플을 나타낸다.
도 35b는 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮기기 전에 모든 형태의 인간 GITR의 존재를 보여주는 쿠마시 블루 염색된 겔이다.
도 36a-36b는 엔도프로테이나제 Arg-C (1), 엔도프로테이나제 Lys-C (2), 트립신 (3), 엔도프로테이나제 Glu-C (4), 또는 엔도프로테이나제 Asp-N(5)에 의한 소화에 의해 생성된 천연 GITR 단편에 대한 28F3 및 3C3 항체의 결합을 보여준다.
도 37은 28F3 항체가 결합하는 에피토프의 위치 (박스 영역)를 확인시켜주는, 엔도프로테이나제 Glu-C 및 트립신 ("Glu-C 및 트립신"), 엔도프로테이나제 Arg-C ("Arg-C"), 엔도프로테이나제 Lys-C 및 트립신 ("Lys-C 및 트립신"), 트립신, 또는 엔도프로테이나제 Asp-N 및 엔도프로테이나제 Glu-C ("AspN 및 GluC")에 의한 천연 인간 GITR 단백질의 소화로부터 생성된 인간 GITR 펩티드 단편에 결합한 항-GITR 항체 28F3의 열 지도 도면을 보여준다. 인간 GITR의 성숙 세포외 도메인의 아미노산 서열은 암회색으로 도시되고, 그에 C-말단 연결된 마우스 Fc의 서열은 담회색으로 도시된다.
도 38a는 천연 인간 GITR의 트립신 소화로부터 생성된 펩티드에 대한 28F3 코팅된 비드의 인큐베이션 후, 관통 분획 내의 펩티드를 보여준다.
도 38b는 2종의 주요 28F3 결합된 펩티드를 보여준다 (별표로 표시됨).
도 38c는 제시된 서열을 갖고 O-연결된 글리코실화가 결여된 N-말단 펩티드에 상응하는, 도 34b에서의 2개의 피크 중 첫번째 것의 LC-MS에 의한 확인을 보여준다.
도 38d는 제시된 서열을 갖고 T20 상에 O-연결된 글리코실화를 갖는 N-말단 펩티드에 상응하는, 도 34b에서의 2개의 피크 중 두번째 것의 LC-MS에 의한 확인을 보여준다.
도 38e는 28F3과 함께 인큐베이션된 보다 긴 펩티드의 엔도프로테이나제 Asp-N에 의한 계내 소화 후 남아있는 GITR 펩티드를 보여준다.
도 39a는 GITR의 N-말단 영역에 대해 86%의 서열 적용범위를 달성한, 재조합 인간 GITR/Fc 및 재조합 인간 GITR/Fc와 28F3 IgG1의 단백질 복합체에 대한 펩신분해 펩티드의 목록을 보여준다.
도 39b는 28F3 IgG1 mAb ("GITR.6")의 부재/존재 하에서의 HDX 질량 분광측정법 (MS)에 의한 중수소 흡수 수준을 보여준다.
도 39c는 HDX MS에 의해 결정된 바와 같은, 28F3에 의해 결합된 성숙 인간 GITR 내의 2개의 영역을 도시한다.
도 40은 플레이트-결합된 항-CD3 항체 존재 하에서의 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 다양한 효능제 항-GITR 항체의 효과를 보여준다.
도 41a는 특정 항원에 의해 활성화된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 18E10, 13H2 (28F3과 동일), 및 28F3의 효과를 보여준다.
도 41b는 특정 항원에 의해 활성화된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 3C3 ("GITR.3"으로 제시됨), 28F3, 19D3, 및 18E10의 효과를 보여준다.
도 42a는 CHO-OKT3 세포 (즉, OKT3 scfv를 발현하는 CHO 세포)에 의해 자극된 T 세포에 의한 인터페론 감마 (IFN-γ) 분비에 대한 다양한 효능제 항-GITR HuMab 항체의 효과를 보여준다.
도 42b는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 효능제 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제1 공여자로부터의 것이다.
도 42c는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제1 공여자로부터의 것이다.
도 42d는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제2 공여자로부터의 것이다.
도 42e는 OKT3 발현 CHO 세포에 의해 자극된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3의 효과를 보여주며, 여기서 T 세포는 제2 공여자로부터의 것이다.
도 43은 HEL48-63 펩티드 존재 하에 LK35.2 세포에 의해 자극된 3A9-hGITR 세포에 의한 IL-2 분비에 대한 항-GITR 항체 28F3 (IgG2), 28F3-F(ab')2 단편, 및 28F3-Fab의 효과를 보여준다.
도 44는 모노클로날 항체 28F3-FITC에 의한 인간 편도 시편의 면역조직화학을 보여준다.
도 45a-45d는 MC38 결장 선암종 모델에서 래트 항-마우스 GITR 항체, DTA-1의 상이한 이소형으로 처리된 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 항종양 활성에 대한 이들 이소형의 효과를 보여준다: (도 45a) 대조군 마우스 IgG1 항체 (10 mg/kg); (도 45b) DTA-1 래트 IgG2b (10 mg/kg); (도 45c) DTA-1 마우스 IgG1 (10 mg/kg); (도 45d) DTA-1 마우스 IgG2a (10 mg/kg). 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 무종양 (TF) 마우스의 수가 제시된다.
도 46a 및 46b는 상이한 이소형의 DTA-1 항체 (10 mg/kg)로 처리된 마우스 군에서의 MC38 종양의 평균 (도 46a) 및 중앙 종양 부피 (도 46b)의 변화를 보여준다.
도 47a-47f는 표시된 상이한 항-GITR (DTA-1) 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형 및 대조군 항체로 처리된 MC38 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 47a-47c) 및 종양 침윤 림프구 (TIL) (도 47d-47f)의 유동 세포측정 분석을 보여준다. (도 47a) 비장에서의 CD8+ T 세포의 백분율; (도 47b) 비장에서의 CD4+ 세포의 백분율; (도 47c) 비장에서의 또한 Foxp3+이기도 한 CD4+ 세포의 백분율; (도 47d) TIL에서의 CD8+ T 세포의 백분율; (도 47e) TIL에서의 CD4+ 세포의 백분율; (도 47f) TIL에서의 또한 Foxp3+이기도 한 CD4+ 세포의 백분율.
도 48a-48f는 MC38 모델에서 응집을 최소화하도록 재조작된 래트 항-마우스 GITR 항체, DTA-1 ("mGITR.7"로 지칭됨)의 상이한 이소형으로 처리된 개별 마우스에서의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, 항종양 활성에 대한 이들 이소형의 효과를 보여준다: (도 48a) 대조군 마우스 IgG1 항체; (도 48b) mGITR.7 mIgG1; (도 48c) mGITR.7 mIgG1-D265A; (도 48d) mGITR.7 mIgG2a; (도 48e) mGITR.7 mIgG2b; (도 48f) mGITR.7 래트 IgG2b. 9마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 TF 마우스의 수가 제시된다.
도 49a 및 49b는 상이한 이소형의 재조작된 DTA-1 항체로 처리된 마우스의 군에서의 MC38 종양의 평균 (도 49a) 및 중앙 종양 부피 (도 49b)의 변화를 보여준다.
도 50a 및 50b는 MC38 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 50a) 및 TIL (도 50b)에서의 Foxp3+/CD4+ Treg에 대한 상이한 DTA-1 (재조작된 "mGITR" DTA-1 또는 최초로 조작된 "DTA-1" 항체) 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형의 효과의 유동 세포측정 분석을 보여준다.
도 51a-51e는 상이한 마우스 DTA-1 이소형으로 처리된 개별 마우스의 종양 부피 변화에 의해 측정된 바와 같은, Sa1N 섬유육종 마우스 모델에서의 이들 이소형의 항종양 활성을 보여준다: (도 51a) 대조군 마우스 IgG1 항체; (도 51b) DTA-1 마우스 IgG2a; (도 51c) DTA-1 래트 IgG2b; (도 51d) DTA-1 마우스 IgG1; (도 51e) DTA-1 마우스 IgG1-D265A. 최대 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 TF 마우스의 수가 제시된다.
도 52a 및 52b는 상이한 이소형의 DTA-1 항체로 처리된 마우스의 군에서의 Sa1N 종양의 평균 (도 52a) 및 중앙 종양 부피 (도 52b)의 변화를 보여준다.
도 53a 및 53b는 Sa1N 종양-보유 마우스로부터의 비장 (도 53a) 및 TIL (도 53b)에서의 Foxp3+/CD4+ Treg에 대한 상이한 DTA-1 및 항-CTLA-4 (9D9) 이소형의 효과를 보여준다.
도 54a-54d는 병기결정된 MC38 결장 선암종 모델을 사용한, 종양 부피에 대한 래트 항-GITR 항체, DTA-1의 효과를 보여준다. 마우스를 (도 54a) 대조군 mIgG1, (도 54b) mIgG + DTA-1, (도 54c) mIgG + PD-1, 및 (도 54d) PD-1 + DTA-1로 제7일, 제10일 및 제14일에 처리하였다. 10마리의 마우스의 각각의 군에 대해 군당 무종양 (TF) 마우스의 수가 제시된다.
도 55a 및 55b는 3A9-hGITR 세포에의 결합에 대한 항-GITR 항체 28F3의 VH CDR3에서의 다양한 돌연변이 조합의 효과를 보여준다.
도 56a-56f는 플레이트 결합된 항-CD3의 존재 하의 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비 수준에 대한 항-GITR 항체 28F3의 VH CDR3에서의 다양한 돌연변이 조합의 효과를 보여준다.
도 57은 활성화된 T 세포에 대한 표시된 항-GITR 항체의 결합 친화도를 보여준다. 시험된 항체는 하기 중쇄 불변 영역 중 하나를 포함하였다: IgG1 불변 영역 ("항-GITR.g1f"), 무이펙터 IgG1 불변 영역 ("항-GITR.g1.1f"), IgG2 불변 영역 ("항-GITR-G2"), IgG2 힌지 및 IgG1 Fc 도메인 ("항-GITR.G2.G1f"), 및 IgG2 힌지 및 무이펙터 IgG1 Fc 도메인 ("항-GITR.G2.G1.1f").
도 58a-58c는 상이한 중쇄 불변 영역을 갖는 가용성 항-인간 GITR 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IFN-γ 및 IL-2의 분비를 보여준다. 도 58a는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 IgG2-IgG1 불변 영역을 갖는 항-인간 GITR 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IFN-γ 분비를 보여준다. 도 58b는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 IgG2-IgG1 하이브리드 중쇄 불변 도메인에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IL-2 분비를 보여준다. 도 58c는 OKT3 발현 CHO 세포 및 다양한 농도의 도 55a 및 b에서의 무이펙터 버전 (IgG1.1)의 항체에 의해 자극된 공여자 CD4 T 세포로부터의 IL-2 분비를 보여준다.
도 59는 플레이트 결합된 항-CD3의 존재 하의 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비에 대한 표시된 항-GITR 항체의 비교를 보여준다.
도 60a-60d는 Treg 및 Teff 세포의 증식에 대한 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1의 효과를 보여준다.
도 61a-61f는 2명의 상이한 공여자로부터의 활성화된 CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 Treg-풍부화 세포의 NK 세포 유도된 용해에 대한 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 62a-62c는 MC38 종양의 성장에 대한 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 (항-GITR IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 63a 및 63b는 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 ("항-GITR IgG1.1")로 처리된 마우스에서의 MC38 종양의 평균 부피 및 중앙 부피를 각각 보여준다.
도 64a 및 64b는 대조군 hIgG1 항체, 28F3.IgG1 ("항-GITR IgG1"), 및 28F3.IgG1.1 ("항-GITR IgG1.1")로 처리된 MC38 종양을 갖는 마우스의 평균 % 체중 변화 및 중앙 % 체중 변화를 각각 보여준다.
도 65는 MC38 종양 모델에서의 Treg 세포의 고갈에 대한, 이소형 대조군 대비 28F3.IgG1 ("GITR IgG1")의 효과를 보여준다.
도 66은 MC38 종양 모델에서의 CD8+ T 세포의 백분율에 대한, 이소형 대조군 대비 28F3.IgG1 ("GITR IgG1")의 효과를 보여준다.
도 67은 CHO-OKT3 및 CHO-OKT3-CD32a 세포와 공동-배양한 경우 T 세포로부터의 IFN-γ 분비에 대한 가용성 및 가교된 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 68은 CHO-OKT3 및 CHO-OKT3-CD32a 세포와 공동-배양한 경우 T 세포 증식에 대한 가용성 및 가교된 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") 및 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1")의 효과를 보여준다.
도 69는 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다.
도 70은 항-his Fab 포획된 FcγR-his 단백질에 대한 항체 결합을 보여준다. 결합 반응은 1:1 mAb:FcγR 결합 화학량론을 가정하여 이론적 Rmax의 백분율로서 플롯팅된다. 각각의 항체에 대한 막대는 슬라이드 하단의 색상 범례에 제공된 순서대로 제시된다.
도 71은 항-his Fab 포획된 FcgR-his 단백질에 대한 항체 결합을 보여준다. 결합 반응은 1:1 mAb:FcγR 결합 화학량론을 가정하여 이론적 Rmax의 백분율로서 플롯팅된다. 각각의 항체에 대한 막대는 슬라이드 하단의 색상 범례에 제공된 순서대로 제시된다.
도 72는 항-GITR 항체의 내재화 시간 경과 분석을 보여준다.
도 73a는 0 시점에서의 GITR 및 초기 엔도솜 마커 EEA2 공동-국재화 분석을 보여준다.
도 73b는 30분 및 120분 시점에서의 GITR 및 초기 엔도솜 마커 EEA2 공동-국재화 분석을 보여준다.
도 73c는 총 염색 대비 공동국재화된 픽셀 강도의 비로서 플롯팅된, 도 73a 및 73b에 제시된 엔도솜 공동-국재화의 정량화 결과를 보여준다.
도 74a는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD8+ T 세포에서의 NFkB 신호전달 활성화를 보여준다.
도 74b는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD4+ T 세포에서의 NFkB 신호전달 활성화를 보여준다.
도 75는 표시된 항-GITR 항체로 처리된 CD4+ T 세포에서의 P38 활성화를 보여준다.
도 76a는 상이한 농도의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다.
도 76b는 5 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
도 76c는 1.25 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
도 76d는 0.313 μg/ml의 표시된 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 존재 하에 CHO-OKT3 세포와 공동-배양된 CD4+ T 세포에 의해 분비된 IL-2의 수준을 보여준다 (도 76a와 동일한 실험).
GITR에 특이적으로 결합함으로써 하류 GITR 신호전달을 활성화하는 단리된 항체, 특히 모노클로날 항체, 예를 들어 인간 모노클로날 항체 ("효능제 항-GITR 항체")가 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 특정한 중쇄 및 경쇄 배선 서열로부터 유래되고/거나, 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특색을 포함한다. 단리된 항체, 이러한 항체, 이러한 항체를 포함하는 면역접합체 및 이중특이적 분자를 제조하는 방법, 및 항체를 함유하도록 제제화된 제약 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 면역 반응 증진을 위해, 단독으로 또는 다른 면역자극제 (예를 들어, 항체) 및/또는 암 요법과 조합하여 항체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는, 예를 들어 종양 성장을 억제하고 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함하는 광범위한 치료 용도에서의 치료에 사용될 수 있다.
정의
본 기재내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
본원에 사용된 용어 "글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체" 또는 "GITR"은 GITR 리간드 (GITR-L)에 결합하는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원인 수용체를 지칭한다. GITR은 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 18 (TNFRSF18), AITR 및 CD357로도 지칭된다. 용어 "GITR"은 세포에 의해 자연 발현되는 GITR의 임의의 변이체 또는 이소형을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 항체는 인간 이외의 종으로부터의 GITR (예를 들어, 시노몰구스 GITR)과 교차-반응할 수 있다. 대안적으로, 항체는 인간 GITR에 대해 특이적일 수 있고, 다른 종과는 어떠한 교차-반응성도 나타내지 않을 수 있다. GITR 또는 그의 임의의 변이체 및 이소형은 이들을 자연 발현하는 세포 또는 조직으로부터 단리될 수 있거나 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술 및/또는 본원에 기재된 것을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다.
인간 GITR의 3종의 이소형이 확인되었고, 이들은 모두 그의 C-말단 부분을 제외하고 동일한 세포외 도메인을 공유한다. 변이체 1 (수탁 번호 NP_004186; 서열식별번호: 1)은 241개의 아미노산으로 이루어지고, 가장 긴 전사체를 나타낸다. 이는 변이체 2와 비교하여 프레임 시프트로 이어지는 여분의 코딩 절편을 함유한다. 생성된 단백질 (이소형 1)은 이소형 2와 비교하여 구별되는 더 짧은 C-말단을 함유한다. 변이체 2 (수탁 번호 NP_683699; 서열식별번호: 2)는 255개의 아미노산으로 이루어진 가장 긴 단백질 (이소형 2)을 코딩하며, 가용성이다. 변이체 3 (수탁 번호 NP_683700; 서열식별번호: 3)은 변이체 2와 비교하여 프레임 시프트로 이어지는 여분의 코딩 절편을 함유한다. 생성된 단백질 (이소형 3)은 이소형 2와 비교하여 구별되는 더 짧은 C-말단을 함유하고, 234개의 아미노산으로 이루어진다.
3종의 공지된 인간 GITR 이소형, 시노 GITR 및 GITR-L의 아미노산 서열이 하기 제시된다.
인간 GITR 이소형 1 (수탁 번호 NP_004186; 서열식별번호: 1; 수탁 번호 NM_004195.2를 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨):
인간 GITR 이소형 2 (수탁 번호 NP_683699.1; 서열식별번호: 2; 수탁 번호 NM_148901.1을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨):
인간 GITR 이소형 3 (수탁 번호 NP_683700.1; 서열식별번호: 3; 수탁 번호 NM_148902.1을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨):
이소형 1-3의 신호 서열은 아미노산 1-25에 상응한다. 따라서, 성숙 이소형 1, 2 및 3은 각각 아미노산 26 내지 241, 255 또는 234로 이루어진다. 성숙 GITR의 세포외 도메인은 아미노산 26-162로 이루어지고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:
시노몰구스 GITR 단백질 서열 (서열식별번호: 5):
인간 GITR-L 단백질 서열 (수탁 번호 NP_005083.2; 서열식별번호: 6):
본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. "항체"는, 한 실시양태에서, 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 특정 자연 발생 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체는 전형적으로, 10-5 내지 10-11 M 또는 그 미만의 해리 상수 (KD)에 의해 반영되는 높은 친화도로 그의 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-4 M 초과의 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본원에 사용된 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 높은 친화도로 결합하지만 (이는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 및 가장 바람직하게는 10-8 M 내지 10-10 M 또는 그 미만의 KD를 갖는 것을 의미함), 비관련 항원에는 높은 친화도로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 항원이 주어진 항원에 대해 고도의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 예를 들어 주어진 항원의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 나타내는 경우에, 이러한 항원은 주어진 항원과 "실질적으로 동일"하다. 예로서, 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 특정 영장류 종으로부터의 GITR 항원 (예를 들어, 시노몰구스 GITR)과 교차-반응성을 가질 수 있지만, 다른 종으로부터의 GITR 항원, 또는 GITR 이외의 항원과는 교차-반응하지 않을 수 있다.
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있다. IgG 이소형은 특정 종에서 하위부류로 분류된다: 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 IgG1 또는 IgG2 하위유형의 것이다. 이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG1은 최대 수개의 아미노산에서 서로 상이한 여러 동종이형으로 존재한다. "항체"는 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체 둘 다, 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분"은 항원 (예를 들어, 인간 GITR)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10 내지 약 50 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 제시된 바 있다. 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항-GITR 항체의 용어 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지된 1가 분자를 형성한다; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)]을 참조한다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이중기능적 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체 또는 모든 항체가 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 디스플레이하는 항체의 조성물을 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 임의적인 불변 영역을 갖는 항체 또는 항체 조성을 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는, 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는, 배선 유전자에 의해 코딩되지만, 예를 들어 항체 성숙 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함하는 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 이용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125] 참조), 가변 영역은, 재배열되어 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하는 다양한 유전자에 의해 코딩된 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 다중 단일 아미노산 변화 (체세포 돌연변이 또는 과다돌연변이로 지칭됨)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대해 추가로 반응하여 변화할 것이다 (즉, 이소형 스위치). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 코딩하는, 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래의 핵산 분자와 서열 동일성을 갖지 않을 수 있지만, 그 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다 (즉, 적어도 80% 동일성을 가짐).
"인간" 항체 (HuMAb)는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본원에 기재된 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 인간화 형태의 항체의 한 실시양태에서, CDR 도메인 외부의 아미노산 중 일부, 대부분 또는 모두는 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 아미노산으로 대체된 반면에, 1개 이상의 CDR 영역 내의 일부, 대부분 또는 모든 아미노산은 변화되지 않는다. 특정한 항원에 결합하는 항체의 능력을 제거하지 않는 한, 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 허용가능하다. "인간화" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"키메라 항체"는, 가변 영역은 한 종으로부터 유래되고, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.
"동종이형"은 특정 이소형 그룹 내의 자연 발생 변이체를 지칭하며, 변이체는 소수의 아미노산에서 상이하다 (예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1] 참조). 본원에 기재된 항체는 임의의 동종이형을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "IgG1f" 또는 "IgG1.1f" 이소형으로 지칭되는 항체는 각각 동종이형 "f"의, 즉 예를 들어 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같이 (표 15의 서열식별번호: 7에서 밑줄표시된 잔기 참조) 카바트(Kabat)에서와 같이 EU 인덱스에 따라 214R, 356E 및 358M을 갖는, IgG1 및 무이펙터 IgG1.1 항체이다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다 (예를 들어, GITR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 GITR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, GITR의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 상이한 종으로부터의 다른 GITR 단백질과 교차-반응성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "GITR-L이 GITR에 결합하는 것을 억제하는" 항체는 관련 기술분야-인식 방법, 예를 들어 본원에 기재된 FACS-기반 결합 검정에서, 예를 들어 3A9-hGITR 세포를 사용한 결합 검정에서 GITR-L이 GITR에 결합하는 것을 약 1 μg/mL 이하, 예컨대 약 0.9 μg/mL 이하, 약 0.85 μg/mL 이하, 약 0.8 μg/mL 이하, 약 0.75 μg/mL 이하, 약 0.7 μg/mL 이하, 약 0.65 μg/mL 이하, 약 0.6 μg/mL 이하, 약 0.55 μg/mL 이하, 약 0.5 μg/mL 이하, 약 0.45 μg/mL 이하, 약 0.4 μg/mL 이하, 약 0.35 μg/mL 이하, 약 0.3 μg/mL 이하, 약 0.25 μg/mL 이하, 약 0.2 μg/mL 이하, 약 0.15 μg/mL 이하, 또는 약 0.1 μg/mL 이하의 EC50으로 억제하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터 발생한 생화학적 사건을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능 예컨대 ADCC 및 항체 의존성 세포-매개 식세포작용 (ADCP), 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한, FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3종의 활성화 (마우스에서 FcγRI, FcγRIII, 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA) 및 1종의 억제 (FcγRIIB) 수용체로 이루어진다. 인간 FcγR의 다양한 특성이 표 1에 요약되어 있다. 대부분의 선천성 이펙터 세포 유형은 1종 이상의 활성화 FcγR 및 억제 FcγRIIB를 공발현하는 반면에, 자연 킬러 (NK) 세포는 1종의 활성화 Fc 수용체 (마우스에서 FcγRIII 및 인간에서 FcγRIIIA)를 선택적으로 발현하지만, 마우스 및 인간에서 억제 FcγRIIB는 발현하지 않는다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고, 그것이 결합하는 활성화 Fc 수용체의 유형과 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등한 것으로 간주된다.
표 1. 인간 FcγR의 특성
"Fc 영역" (결정화가능 단편 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치하는 Fc 수용체 또는 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)에 대한 결합을 포함한, 이뮤노글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인 (예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소형에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 불변 도메인으로부터 유래된, 2개의 동일한 단백질 단편을 포함하고; IgM 및 IgE Fc 영역은 각각의 폴리펩티드 쇄에서 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG의 경우에, Fc 영역은 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 C226 또는 P230에서의 아미노산 잔기 (또는 이들 2종의 아미노산 사이의 아미노산)로부터 중쇄의 카르복시-말단까지의 스트레치로 정의되고, 여기서 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스에 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231로부터 약 아미노산 340까지 연장되는 반면에, CH3 도메인은 Fc 영역의 CH2 도메인의 C-말단 측에 위치하며, 즉, IgG의 약 아미노산 341로부터 약 아미노산 447까지 연장된다. 본원에 사용된 Fc 영역은 임의의 동종이형 변이체를 포함한 천연 서열 Fc, 또는 변이체 Fc (예를 들어, 비-자연 발생 Fc)일 수 있다. Fc는 또한 단리된 상태의 또는 Fc-포함 단백질 폴리펩티드 예컨대 "Fc 융합 단백질" (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)로도 지칭되는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"의 문맥에서의 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc의 다양한 동종이형을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1] 참조).
"힌지", "힌지 도메인" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 지칭하고, 힌지의 상부, 중간 및 하부 부분을 포함한다 (Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083). 힌지는 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 다양한 수준의 가요성을 제공하고, 또한 2개의 중쇄 불변 영역 사이에 분자간 디술피드 결합을 위한 부위를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, 힌지는 모든 IgG 이소형의 경우에 Glu216에서 시작하고 Gly237에서 종결된다 (Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083). 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지의 서열이 표 2 및 9에 제시된다.
표 2.
힌지 영역 아미노산
* CH1 도메인의 C-말단 아미노산 서열.
용어 "힌지"는 야생형 힌지 (예컨대, 표 15에 제시된 것) 뿐만 아니라 그의 변이체 (예를 들어, 비-자연-발생 힌지 또는 변형된 힌지)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "IgG2 힌지"는 표 15에 제시된 바와 같은 야생형 IgG2 힌지, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5개 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 결실 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 예시적인 IgG2 힌지 변이체는 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 시스테인 (C219, C220, C226 및 C229)이 또 다른 아미노산으로 변화된 IgG2 힌지를 포함한다. 구체적 실시양태에서, IgG2는 C219S 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 힌지는 적어도 2개의 이소형으로부터의 서열을 포함하는 하이브리드 힌지이다. 예를 들어, 힌지는 하나의 이소형으로부터의 상부, 중간 또는 하부 힌지, 및 하나 이상의 다른 이소형으로부터의 나머지 힌지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 힌지는 IgG2/IgG1 힌지일 수 있고, 예를 들어 IgG2의 상부 및 중간 힌지 및 IgG1의 하부 힌지를 포함할 수 있다. 힌지는 이펙터 기능을 가질 수 있거나 또는 이펙터 기능이 박탈될 수 있다. 예를 들어, 야생형 IgG1의 하부 힌지가 이펙터 기능을 제공한다.
용어 "CH1 도메인"은 가변 도메인을 중쇄 불변 도메인 내의 힌지에 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, CH1 도메인은 A118에서 시작하고 V215에서 종결된다. 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인 (예컨대 IgG1의 경우에 서열식별번호: 278을 갖고 IgG2의 경우에 서열식별번호: 279를 가짐; 표 15) 뿐만 아니라 그의 변이체 (예를 들어, 비-자연 발생 CH1 도메인 또는 변형된 CH1 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5개 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 결실 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 예시적인 CH1 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예컨대 ADCC, CDC 또는 반감기를 변형시키는 돌연변이를 갖는 CH1 도메인을 포함한다. 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치는 CH1 도메인에 대한 변형이 본원에 제공된다.
용어 "CH2 도메인"은 힌지를 중쇄 불변 도메인 내의 CH3 도메인에 연결하는 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, CH2 도메인은 P238에서 시작하고 K340에서 종결된다. 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인 (예컨대, IgG1의 경우에 서열식별번호: 280을 갖고 IgG2의 경우에 서열식별번호: 297을 가짐; 표 15) 뿐만 아니라 그의 변이체 (예를 들어, 비-자연 발생 CH2 도메인 또는 변형된 CH2 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5개 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 결실 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 예시적인 CH2 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예컨대 ADCC, CDC 또는 반감기를 변형시키는 돌연변이를 갖는 CH2 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, CH2 도메인은 이펙터 기능을 감소시키는 치환 A330S/P331S를 포함한다. 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치는 CH2 도메인에 대한 다른 변형이 본원에 제공된다.
용어 "CH3 도메인"은 중쇄 불변 도메인 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, CH3 도메인은 G341에서 시작하고 K447에서 종결된다. 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인 (예컨대, IgG1의 경우에 서열식별번호: 282를 갖고 IgG2의 경우에 서열식별번호: 298을 가짐; 표 15) 뿐만 아니라 그의 변이체 (예를 들어, 비-자연 발생 CH3 도메인 또는 변형된 CH3 도메인)를 포함한다. 예를 들어, 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인, 및 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5개 및/또는 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 돌연변이, 예를 들어 치환, 결실 또는 부가를 갖는 변이체를 포함한다. 예시적인 CH3 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예컨대 ADCC, CDC 또는 반감기를 변형시키는 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함한다. 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치는 CH3 도메인에 대한 변형이 본원에 제공된다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "천연 서열 Fc"는 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다. 천연 서열 Fc는 Fc의 다양한 동종이형을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1] 참조).
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 이뮤노글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위 (예를 들어, GITR)를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산 (통상적으로 선형 에피토프) 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접 아미노산 (통상적으로 입체형태적 에피토프) 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 항상 그러한 것은 아니지만 전형적으로 변성 용매에의 노출 시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 고유한 공간 입체형태로 포함한다. 어떠한 에피토프가 주어진 항체에 의해 결합되는지 결정하는 방법 (즉, 에피토프 맵핑)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 이뮤노블롯팅 및 면역침전 검정을 포함하고, 여기서 중첩 또는 인접 펩티드 (예를 들어, GITR로부터)는 주어진 항체 (예를 들어, 항-GITR 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 기술 및 본원에 기재된 기술, 예를 들어 X선 결정학, 2-차원 핵 자기 공명 및 HDX-MS를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식을 위한 분자 결정기의 확인 과정을 지칭한다.
2종 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합하다"는 항체가 주어진 방법에 의해 결정 시, 아미노산 잔기의 동일한 절편에 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 본원에 기재된 항체와 "GITR 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석, 및 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항체의 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변경에 대한 결합을 모니터링하는 것이고, 여기서 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑에 대한 컴퓨터 조합 방법을 사용할 수도 있다. 이들 방법은 관심 항체가 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR1, 2 및 3 서열을 갖는 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적에 대한 결합에 대해 또 다른 항체와 경쟁하는" 항체는 다른 항체가 표적에 결합하는 것을 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 항체를 지칭한다. 2종의 항체가 표적에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지 여부, 즉 하나의 항체가 다른 항체가 표적에 결합하는 것을 억제하는지 여부 및 그 정도는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 또 다른 항체가 표적에 결합하는 것과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 경쟁하고, 그의 결합을 억제한다. 억제 또는 경쟁 수준은 항체가 "차단 항체" (즉, 표적과 먼저 인큐베이션되는 콜드 항체)인지에 따라 상이할 수 있다. 경쟁 검정은 예를 들어, 문헌 [Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc ; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 또는 Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접한 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 입체 장애에 의해 입증되는 바와 같음).
다른 경쟁적 결합 검정은 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)] 참조)); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)] 참조); 고체 상 직접 표지 검정, 고체 상 직접 표지 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); I-125 표지를 사용한 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 (i) 예를 들어 미리 결정된 항원, 예를 들어 재조합 인간 GITR을 분석물로서 사용하고 항체를 리간드로서 사용하는 비아코어(BIACORE) 2000 기기에서의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술, 또는 항원 양성 세포에 대한 항체의 결합의 스캐차드 분석에 의해 결정하였을 때, 대략 10-7 M 미만, 예컨대 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 결합하고, (ii) 미리 결정된 항원 또는 밀접하게-관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배 더 큰 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 따라서, "인간 GITR에 특이적으로 결합하는" 항체는 가용성 또는 세포 결합 인간 GITR에 10-7 M 이하, 예컨대 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 KD로 결합하는 항체를 지칭한다. "시노몰구스 GITR과 교차-반응하는" 항체는 10-7 M 이하, 예컨대 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 심지어 그 미만의 KD로 시노몰구스 GITR에 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 종으로부터의 GITR과 교차-반응하지 않는 이러한 항체는 표준 결합 검정에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출가능하지 않은 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "kassoc" 또는 "ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면에, 본원에 사용된 용어 "kdis" 또는 "kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 kd 대 ka의 비 (즉, kd/ka)로부터 수득된 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 이는 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 바이오센서 시스템 예컨대 비아코어® 시스템 또는 유동 세포측정법 및 스캐차드 분석을 사용하는 것에 의한다.
본원에 사용된 IgG 항체에 대한 용어 "높은 친화도"는 표적 항원에 대해 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하 및 보다 더 바람직하게는 10-10 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 이소형의 경우에 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형의 경우에 "높은 친화도" 결합은 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 시험관내 또는 생체내 검정과 관련하여 용어 "EC50"은 최대 반응의 50%, 즉 최대 반응과 기준선 사이의 중간인 반응을 유도하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 농도를 지칭한다.
용어 "고정된 GITR에 결합하다"는 본원에 기재된 항체가, 예를 들어 세포의 표면 상에 발현된 또는 고체 지지체에 부착된 GITR에 결합하는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "교차-반응하다"는 본원에 기재된 항체가 상이한 종으로부터의 GITR에 결합하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 인간 GITR에 결합하는 본원에 기재된 항체는 또한 또 다른 종의 GITR (예를 들어, 시노몰구스 GITR)에도 결합할 수 있다. 본원에 사용된 교차-반응성은 결합 검정 (예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출하거나, 또는 GITR을 생리학상 발현하는 세포에 결합시키거나, 또는 달리 이와 기능적으로 상호작용시킴으로써 측정될 수 있다. 교차-반응성을 결정하는 방법은, 예를 들어 비아코어™ 2000 SPR 기기 (비아코어 아베(Biacore AB), 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석에 의한 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정, 또는 유동 세포측정 기술을 포함한다.
대상에 적용되는 바와 같은 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생이다.
"폴리펩티드"는 쇄의 길이에 대한 상한치 없이, 적어도 2개의 연속적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 쇄를 지칭한다. 단백질 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변형 예컨대, 비제한적으로, 글리코실화, 인산화 또는 디술피드 결합 형성을 함유할 수 있다. "단백질"은 1개 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.
또한, 본원, 예를 들어 표 15, 예컨대 서열식별번호: 13-191에 제시된 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 또는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형이 제공된다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 아미노산 부가 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 표 15, 예컨대 서열식별번호: 13-191에서의 서열에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 항-GITR 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))] 참조). 대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는 항-GITR 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라서 무작위로, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 그에 따라 변형된 항-GITR 항체는 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
핵산의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 핵산 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 뉴클레오티드, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게 적어도 약 98% 내지 99.5%의 뉴클레오티드에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 실질적인 상동성은 절편이 선택적 혼성화 조건 하에 상보적 가닥과 혼성화되는 경우에 존재한다.
폴리펩티드의 경우에, 용어 "실질적 상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 그의 지정된 서열이, 최적으로 정렬되고 비교된 경우에, 적절한 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 적어도 약 80%의 아미노산, 통상적으로 적어도 약 90% 내지 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%의 아미노산에서 동일한 것을 나타낸다.
2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))]의 알고리즘을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
추가로 본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 본원에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본원에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST를 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 사용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
핵산은 전세포 중, 세포 용해물 중에서, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 염색체의 다른 부분) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함한 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수해진다". 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다.
핵산, 예를 들어 cDNA는 유전자 서열을 제공하는 표준 기술에 따라 돌연변이될 수 있다. 코딩 서열의 경우에, 이들 돌연변이는 목적하는 바와 같이 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변, 스위치 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동이거나 또는 그로부터 유래된 DNA 서열이 고려된다 (여기서 "유래된"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또는 이로부터 변형된 것임을 나타냄).
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 등가의 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)가 또한 포함된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 지칭하는 것으로 의도되고, 이는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 임의의 자연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 합텐을 지칭한다. 항원은 GITR 또는 그의 단편일 수 있다. 항원은 또한, 그에 대한 예방적 또는 치료적 면역 반응이 바람직한 종양 항원, 예를 들어 종양 세포에 의해 발현되는 항원일 수 있다 (예를 들어, 항-GITR 항체와 조합된 백신에서). 항원은 암의 예방 또는 치료를 위한 종양-연관 항원을 포함한다. 종양-연관 항원의 예는 βhCG, gp100 또는 Pmel17, HER2/neu, WT1, 메소텔린, CEA, gp100, MART1, TRP-2, 멜란-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), 이디오타입, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, 티로시나제, 텔로머라제, SSX2 및 MUC-1 항원, 및 배세포 유래 종양 항원의 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 종양 연관 항원은 또한 혈액형 항원, 예를 들어 Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2 항원을 포함한다. 대안적으로, 1개 초과의 항원이 구축물에 포함될 수 있다. 예를 들어, MAGE 항원은 GM-CSF 또는 IL-12와 같은 아주반트와 함께 다른 항원, 예컨대 멜라닌 A, 티로시나제 및 gp100과 조합될 수 있고, 항-APC 항체와 연결될 수 있다.
상기 항원의 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, MAGE-3 cDNA 서열의 예는 US 6,235,525 (Ludwig Institute for Cancer Research)에 제공되어 있고; NY-ESO-1 핵산 및 단백질 서열의 예는 US 5,804,381 및 US 6,069,233 (Ludwig Institute for Cancer Research)에 제공되어 있고; 멜란-A 핵산 및 단백질 서열의 예는 US 5,620,886 및 US 5,854,203 (Ludwig Institute for Cancer Research)에 제공되어 있고; NY-BR-1 핵산 및 단백질 서열의 예는 US 6,774,226 및 US 6,911,529 (Ludwig Institute for Cancer Research)에 제공되어 있고, NY-CO-58 핵산 및 단백질 서열의 예는 WO 02090986 (Ludwig Institute for Cancer Research)에 제공되어 있고; HER-2/neu 단백질에 대한 아미노산 서열의 예는 진뱅크® 수탁 번호 AAA58637에서 입수가능하고; 인간 암배아성 항원-유사 1 (CEA-1)에 대한 뉴클레오티드 서열 (mRNA)은 진뱅크® 수탁 번호 NM020219에서 입수가능하다.
"면역 반응"은 외래 작용제에 대한 척추동물 내에서의 생물학적 반응을 지칭하며, 반응은 이들 작용제 및 그에 의해 유발되는 질환에 대해 유기체를 보호한다. 면역 반응은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 표적화, 그에 대한 결합, 그에 대한 손상, 그의 파괴, 및/또는 그의 척추동물 신체로부터의 제거를 발생시키는, 면역계 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구) 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토카인 및 보체 포함)의 작용에 의해 매개된다. 면역 반응은 예를 들어 T 세포, 예를 들어 이펙터 T 세포 또는 Th 세포, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 활성화 또는 억제, 또는 Treg 세포의 억제를 포함한다.
"면역조정제" 또는 "면역조절제"는 면역 반응의 조정, 조절 또는 변형에 수반될 수 있는 작용제, 예를 들어 신호전달 경로의 성분을 지칭한다. 면역 반응의 "조정", "조절" 또는 "변형"은 면역계 세포에서의 또는 이러한 세포 (예를 들어, 이펙터 T 세포)의 활성에서의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조정은 다양한 세포 유형의 개수에서의 증가 또는 감소, 이들 세포의 활성에서의 증가 또는 감소, 또는 면역계 내에서 발생할 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역계의 자극 또는 억제를 포함한다. 억제 및 자극 면역조정제 둘 다가 확인된 바 있고, 이들 중 일부는 종양 미세환경에서 증진된 기능을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 면역조정제는 T 세포의 표면 상에 위치한다. "면역조정 표적" 또는 "면역조절 표적"은 물질, 작용제, 모이어티, 화합물 또는 분자에 의한 결합에 대해 표적화되고, 그의 활성이 결합에 의해 변경되는 면역조정제이다. 면역조정 표적은 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체 ("면역조정 수용체") 및 수용체 리간드 ("면역조정 리간드")를 포함한다.
"면역요법"은 면역 반응을 유도, 증진, 억제, 또는 달리 변형하는 것을 포함하는 방법에 의해 질환을 앓거나, 질환에 걸릴 위험이 있거나, 또는 그의 재발을 겪고 있는 대상체를 치료하는 것을 지칭한다.
"면역자극 요법" 또는 "면역자극성 요법"은, 예를 들어 암을 치료하기 위해, 대상체에서 면역 반응의 증가 (유도 또는 증진)를 발생시키는 요법을 지칭한다.
"내인성 면역 반응을 강화시키는" 것은 대상체에서 기존의 면역 반응의 유효성 또는 효력을 증가시키는 것을 의미한다. 유효성 및 효능에서의 이러한 증가는 예를 들어, 내인성 숙주 면역 반응을 억제하는 메카니즘을 극복함으로써 또는 내인성 숙주 면역 반응을 증진시키는 메카니즘을 자극함으로써 달성될 수 있다.
"T 이펙터" ("Teff") 세포는 세포용해 활성을 갖는 T 세포 (예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포) 뿐만 아니라 시토카인을 분비하여 다른 면역 세포를 활성화시키고 지시하는 T 헬퍼 (Th) 세포를 지칭하지만, 조절 T 세포 (Treg 세포)는 포함하지 않는다. 본원에 기재된 항-GITR 항체는 Teff 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ Teff 세포를 활성화시킨다.
면역 반응 또는 면역계를 자극하는 증가된 능력은 T 세포 공동자극 수용체의 증진된 효능제 활성 및/또는 억제 수용체의 증진된 길항제 활성으로부터 발생할 수 있다. 면역 반응 또는 면역계를 자극하는 증가된 능력은 면역 반응을 측정하는 검정, 예를 들어 시토카인 또는 케모카인 방출, 세포용해 활성 (표적 세포 상에서 직접적으로 또는 CD107a 또는 그랜자임을 검출하는 것을 통해 간접적으로 결정됨) 및 증식에서의 변화를 측정하는 검정에서 EC50의 배수 증가 또는 활성의 최대 수준에 의해 반영될 수 있다. 면역 반응 또는 면역계 활성을 자극하는 능력은 적어도 10%, 30%, 50%, 75%, 2배, 3배, 5배 또는 그 초과만큼 증진될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 동일한 항체에 비해 보다 강력한 효능제 활성을 갖는다. 항체의 증진된 효능제 활성은 예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같이, 예를 들어 항체와 접촉된 T 세포로부터 IFN-γ 또는 IL-2 분비 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 효능제 활성은, 이펙터 T 세포에서 증가된 시토카인 방출 또는 증가된 증식; Treg 상에서의 맞물림이 Treg 기능을 감소시키는 경우 감소된 T 조절 세포 활성; 또는 Treg의 증가된 고갈에 의해 정의되는 바와 같이, 적어도 10%, 30%, 50%, 75%, 2배, 3배, 5배 또는 그 초과만큼 증진될 수 있다. 예를 들어, 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체에 의해 자극된 T 세포로부터 분비되는 IFN-γ 또는 IL-2의 양은 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 동일한 항체에 의해 자극된 T 세포의 것보다 적어도 10%, 30%, 50%, 75%, 2배, 3배, 5배 또는 그를 초과하여 더 많을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 연결은 또한 유전자적일 수 있다 (즉, 재조합적으로 융합됨). 이러한 연결은 관련 기술분야에 인지된 광범위한 기술, 예컨대 화학적 접합 및 재조합 단백질 생산을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 "투여"는 치료제를 포함하는 조성물을, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 항체의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의하는, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다. 또한, 투여는 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T 세포-매개 반응"은 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ 세포) 및 헬퍼 T 세포 (예를 들어, CD4+ 세포)를 포함하는 T 세포에 의해 매개되는 반응을 지칭한다. T 세포 매개 반응은, 예를 들어, T 세포 세포독성 및 증식을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성 T 림프구 (CTL) 반응"은 세포독성 T 세포에 의해 유도되는 면역 반응을 지칭한다. CTL 반응은 주로 CD8+ T 세포에 의해 매개된다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "차단하다" (예를 들어, 세포 상의 GITR에 대한 GITR-L의 결합의 억제/차단을 지칭함)는 상호교환가능하게 사용되고, 부분 및 완전 억제/차단 둘 다를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 항-GITR 항체는 GITR에 대한 GITR-L의 결합을, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 결정 시, 적어도 약 50%, 예를 들어 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-GITR 항체는 GITR에 대한 GITR-L의 결합을, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 결정 시, 50% 이하, 예를 들어 약 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 억제한다.
본원에 사용된 용어 종양의 "성장을 억제하다"는 종양의 성장에서의 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 종양의 성장의 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 99%, 또는 100% 억제를 포함한다.
본원에 사용된 "암"은 신체 내 비정상 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 질환의 광범위한 그룹을 지칭한다. 비조절된 세포 분열은 이웃 조직을 침습하는 악성 종양 또는 세포의 형성을 발생시킬 수 있고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전, 완화, 호전, 억제 또는 지연 또는 예방할 목적으로 대상체에 대하여 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 지칭한다. 치료는 질환을 갖는 대상체 또는 질환을 갖지 않는 대상체 (예를 들어, 예방용)에 대한 것일 수 있다.
"혈액 악성종양"은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 림프성 악성종양, 뿐만 아니라 비장 및 림프절의 암을 포함한다. 예시적인 림프종은 B 세포 림프종 (B-세포 혈액암) 및 T 세포 림프종 둘 다를 포함한다. B-세포 림프종은 호지킨 림프종 및 대부분의 비-호지킨 림프종 둘 다를 포함한다. B 세포 림프종의 비제한적 예는 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종 (만성 림프구성 백혈병과 중첩됨), 외투 세포 림프종 (MCL), 버킷 림프종, 종격동 대 B 세포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종성 육아종증을 포함한다. T 세포 림프종의 비제한적 예는 결절외 T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종을 포함한다. 혈액 악성종양은 또한 백혈병, 예컨대 속발성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 및 급성 림프모구성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 혈액 악성종양은 추가로 골수종, 예컨대 다발성 골수종 및 무증상 다발성 골수종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 혈액 및/또는 B 세포- 또는 T-세포-연관 암은 용어 혈액 악성종양에 포괄된다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 약물의 임의의 양이다. 약물의 치료 유효량 또는 투여량은 "예방 유효량" 또는 "예방 유효 투여량"을 포함하며, 이는 질환이 발생할 위험 또는 질환이 재발할 위험이 있는 대상체에게 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 경우에, 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측케하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 치료제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
예로서, 항암제는 대상체에서 암 퇴행을 촉진하는 약물이다. 바람직한 실시양태에서, 약물의 치료 유효량은 암을 제거하는 지점까지 암 퇴행을 촉진한다. "암 퇴행을 촉진하는" 것은 유효량의 약물을 단독으로 또는 항신생물제와 조합하여 투여하여 환자에서 종양 성장 또는 크기의 감소, 종양의 괴사, 적어도 1종의 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간 증가, 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지, 또는 달리 질환 증상의 호전을 발생시키는 것을 의미한다. 또한, 치료와 관련한 용어 "유효한" 및 "유효성"은 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성 둘 다를 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에게서 암 퇴행을 촉진하는 약물의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 약물의 투여로부터 발생하는 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성의 수준, 또는 다른 유해 생리학적 효과 (유해 효과)를 지칭한다.
종양의 치료에 대한 예로서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 미치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량 또는 투여량의 약물은 세포 성장 또는 종양 성장을 완전히 억제하고 즉, 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 100% 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 하기 기재된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있고, 이러한 억제는 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 본원에 기재된 다른 바람직한 실시양태에서, 종양 퇴행은 적어도 약 20일, 보다 바람직하게는 적어도 약 40일, 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60일의 기간 동안 관찰되고 계속될 수 있다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치유적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 암을 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "ug" 및 "uM"은 "μg" 및 "μM"과 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 기재된 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
I. 항-GITR 항체
특정한 기능적 특색 또는 특성을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 완전 인간 항체가 본원에 기재된다. 예를 들어, 항체는 인간 GITR에 특이적으로 결합한다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비-인간 영장류로부터의 GITR, 예컨대 시노몰구스 GITR과 교차 반응할 수 있다.
가용성 및/또는 막 결합된 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 것에 더하여, 본원에 기재된 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 시노몰구스 GITR에 결합함;
(b) 면역 반응을 자극 또는 증진함;
(c) T 세포를 활성화함 (예를 들어, 증진된 시토카인 분비 및/또는 증식에 의해 입증되는 바와 같음);
(d) GITRL이 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 억제함;
(e) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(f) 인간 GITR의 N-말단 부분의 입체형태적 에피토프에 결합함;
(g) 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함; 및
(h) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴.
바람직하게는, 항-GITR 항체는 GITR에 높은 친화도로, 예를 들어 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 또는 10-9 M 내지 10-7 M의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 가용성 인간 GITR에, 예를 들어 비아코어에 의해 결정 시, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M (1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 예컨대 활성화된 인간 T 세포 상의 결합된 (예를 들어, 세포 막 결합된) 인간 GITR에, 예를 들어 유동 세포측정법 및 스캐차드 플롯에 의해 결정 시, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M (1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-9 M 내지 10-8 M, 10-11 M 내지 10-9 M, 또는 10-10 M 내지 10-9 M의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 예컨대 활성화된 인간 T 세포 상의 결합된 (예를 들어, 세포 막 결합된) 인간 GITR에, 예를 들어 FACS에 의해 결정 시, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M (1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-9 M 내지 10-8 M, 10-11 M 내지 10-9 M, 또는 10-10 M 내지 10-9 M의 EC50으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 가용성 인간 GITR에 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M (1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M, 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로, 및 세포 막 결합된 인간 GITR에 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M (1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-9 M 내지 10-8 M, 10-11 M 내지 10-9 M, 또는 10-10 M 내지 10-9 M의 KD 또는 EC50으로 결합한다.
항-GITR 항체는 시노몰구스 GITR에 결합할 수 있고, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 FACS (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같음)에 의해 측정 시, 예를 들어 100 nM 이하, 10 nM 이하, 100 nM 내지 0.01 nM, 100 nM 내지 0.1 nM, 100 nM 내지 1 nM, 또는 10 nM 내지 1 nM의 EC50으로 결합할 수 있다.
항-GITR 항체는, 예를 들어 종양에서 예를 들어 Teff 세포를 활성화시킴으로써, Treg 세포에 의한 T이펙터 세포의 억제를 제한함으로써, 종양 Treg 세포를 고갈 및/또는 억제함으로써, 및/또는 NK 세포를 활성화시킴으로써 면역 반응을 자극 또는 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는, 예를 들어 증진된 시토카인 (예를 들어, IL-2 및 IFN-γ) 분비 및/또는 증진된 증식에 의해 입증되는 바와 같이, Teff 세포를 활성화 또는 공동자극할 수 있다. 특정 실시양태에서, CD3 자극이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, GITR 항체는 IL-2 분비를, 예를 들어 1차 인간 T 세포 또는 인간 GITR을 발현하는 T 세포에 대해 측정 시 (예를 들어, 실시예에 추가로 기재된 바와 같음) 50%, 100% (즉, 2배), 3배, 4배, 5배 또는 그 초과, 임의로 최대 10배, 30배, 100배 이하의 배율로 증가시킨다. 특정 실시양태에서, GITR 항체는 IFN-γ 분비를, 예를 들어 1차 인간 T 세포 또는 인간 GITR을 발현하는 T 세포에 대해 측정 시 (예를 들어, 실시예에 추가로 기재된 바와 같음) 50%, 100% (즉, 2배), 3배, 4배, 5배 또는 그 초과, 임의로 최대 10배, 30배, 100배 이하의 배율로 증가시킨다.
항-GITR 항체는 인간 GITRL이 세포, 예를 들어 인간 GITR을 발현하는 3A9 세포 상의 인간 GITR에 결합하는 것을, 예를 들어 10 μg/ml 이하, 1 μg/ml 이하, 0.01 μg/ml 내지 10 μg/ml, 0.1 μg/ml 내지 10 μg/ml, 또는 0.1 μg/ml 내지 1 μg/ml의 EC50으로 억제할 수 있다 (실시예 5 참조).
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 인간 GITRL이 세포, 예를 들어 활성화된 T 세포 상의 인간 GITR에 결합하는 것을 최대한 단지 부분적으로만 억제한다 (실시예 5 참조).
항-GITR 항체는, 예를 들어 항체의 인간 GITR의 단편, 예를 들어 인간 GITR의 천연 (즉, 비-변성) 단편에 대한 결합에 의해 결정되는 바와 같이, 에피토프, 예를 들어 인간 GITR의 N-말단 부분의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 성숙 인간 GITR의 아미노산 1 내지 39 내에 위치하는 에피토프에 결합할 수 있다 (실시예 9 참조). 항-GITR 항체는, 예를 들어 항체의 인간 GITR의 단편, 예를 들어 인간 GITR의 천연 (즉, 비-변성) 단편에 대한 결합에 이어 효소적 절단 또는 HDX (각각 실시예 11 및 12 참조)에 의해 결정되는 바와 같이, 성숙 인간 GITR의 아미노산 1 내지 20에 결합할 수 있거나 또는 그 내에 위치한 에피토프에 결합할 수 있다. 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR의 아미노산 3 내지 20 (PTGGPGCGPGRLLLGTGT, 서열식별번호: 217)에 결합할 수 있거나 또는 그 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR의 아미노산 3 내지 20 및 아미노산 33 내지 40, 즉 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합할 수 있거나 또는 그 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 예를 들어 실시예에 제시된 프로토콜을 사용하여 HDX에 의해 결정 시 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합한다.
항-GITR 항체는 GITR에의 결합에 대해 본원에 기재된 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10과 경쟁할 수 있다 (또는 그의 결합을 억제할 수 있다). 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 인간 GITR에 대한 28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제한다. 특정 실시양태에서, 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10은 항-GITR 항체가 인간 GITR에 결합하는 것을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10이 인간 GITR에 결합하는 것을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제하고, 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10은 항-GITR 항체가 인간 GITR에 결합하는 것을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제한다 (예를 들어, 양방향으로 경쟁함).
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 예를 들어 FcR 결합에 대한 필요성의 결여에 의해 결정되는 바와 같이, 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킨다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 다가, 예를 들어 2가이다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 1가가 아니다. F'(ab)2 단편은 T 세포의 활성화에서 Fab 단편보다 더 효과적이라는 것이 본원에서 확인되었다 (실시예 참조).
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 그의 효능제 활성을 위해 Fc 수용체를 통한 가교를 필요로 하지 않지만, Fc 수용체에 대한 가교는 Fc 수용체에 결합하지 않는 동일한 항체에 비해 그의 효능제 활성을 증진시킨다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 하기 특색 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12종을 갖는다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴;
(8) 예를 들어 3A9-hGITR 세포를 사용한 검정에서, FACS에 의해 측정 시 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(9) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(10) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(11) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
항-GITR 항체는 또한 활성화된 T 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 GITR의 내재화를, 예를 들어 10, 30 또는 60분 내에 유도할 수 있고, 후속 신호 전달, 예를 들어 p65 NF-kB 및 p38 MAP키나제의 활성화 (즉, 인산화)를 유도할 수 있다.
따라서, 관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 방법론에 따라 결정된 바와 같은 이들 기능적 특성 (예를 들어, 생화학적, 면역화학적, 세포적, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등) 중 하나 이상을 나타내는 항체는 항체의 부재 시 (예를 들어, 또는 비관련 특이성의 대조군 항체의 존재 시) 관찰되는 것에 비해 특정한 활성에 있어서 통계적으로 유의한 차이와 관련된다는 것이 이해될 것이다. 바람직하게는, 측정된 파라미터 (예를 들어, T 세포 증식, 시토카인 생산)에서의 항-GITR 항체-유도된 증가는 측정된 파라미터의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% (즉, 2배), 3배, 5배 또는 10배의 통계적으로 유의한 증가를 발생시키고, 특정의 바람직한 실시양태에서 본원에 기재된 항체는 측정된 파라미터를 92%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100% (즉, 2배), 3배, 5배 또는 10배를 초과하여 증가시킬 수 있다. 반대로, 측정된 파라미터 (예를 들어, 종양 부피, GITR에 대한 GITR-L 결합, 종양에서의 조절 T 세포의 양)에서의 항-GITR 항체-유도된 감소는 측정된 파라미터의 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 통계적으로 유의한 감소를 발생시키고, 특정의 바람직한 실시양태에서 본원에 기재된 항체는 측정된 파라미터를 92%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하여 감소시킬 수 있다.
다양한 종의 GITR에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함한다. 적합한 검정은 실시예에 상세하게 기재되어 있다. 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)는 또한, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 비아코어 분석에 의해 평가될 수 있다. GITR의 기능적 특성 (예를 들어, 리간드 결합, T 세포 증식, 시토카인 생산)에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정이 하기 및 실시예에서 추가로 상세하게 기재된다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 천연 항체가 아니거나 자연-발생 항체가 아니다. 예를 들어 항-GITR 항체는 예컨대 더 많은, 더 적은, 또는 상이한 유형의 번역-후 변형을 가짐으로써 자연 발생 항체의 것과 상이한 번역-후 변형을 갖는다.
II. 예시적인 항-GITR 항체
본원에 기재된 특정한 항체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특징화된, 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 갖는 항체, 예를 들어 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 그의 가변 영역 또는 CDR 서열과 적어도 80% 동일성 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 항체이다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2), 및 6G10의 VH 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VL 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336에 제시된다.
따라서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제공된다.
하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다:
(a) 각각 서열식별번호: 13 및 14를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 26 및 27을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(c) 각각 서열식별번호: 39 및 40을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 52 및 53을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 52 및 54를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 71 및 72를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 84 및 85를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 97 및 98을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 97 및 99를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 115 및 116을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 128 및 129를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 128 및 130을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(m) 각각 서열식별번호: 335 및 336을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열.
항-GITR 항체는 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2), 및 6G10의 VH CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2), 및 6G10의 VH CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2), 및 6G10의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VL CDR1의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VL CDR2의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VL CDR3의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347에 제시된다. CDR 영역은 카바트 시스템 (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)을 사용하여 서술된다.
이들 항체 각각이 GITR에 결합하고 항원 결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"되어 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만, 각 항체는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하여야 함) 다른 본원에 기재된 항-GITR 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 GITR 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 시험될 수 있다. 바람직하게는, VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 바람직하게는, 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 신규 VH 및 VL 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 개시된 모노클로날 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10에 대한 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생성될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
(a) 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공되며;
여기서 항체는 인간 GITR에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역은
(a) 서열식별번호: 20-22;
(b) 서열식별번호: 33-35;
(c) 서열식별번호: 46-48;
(d) 서열식별번호: 62-64;
(e) 서열식별번호: 78-80;
(f) 서열식별번호: 91-93;
(g) 서열식별번호: 106-108;
(h) 서열식별번호: 122-124;
(i) 서열식별번호: 138-140; 또는
(j) 서열식별번호: 342-344
를 포함하며;
여기서 항체는 인간 GITR에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역은
(a) 서열식별번호: 23-25;
(b) 서열식별번호: 36-38;
(c) 서열식별번호: 49-51;
(d) 서열식별번호: 65-67;
(e) 서열식별번호: 68-70;
(f) 서열식별번호: 81-83;
(f) 서열식별번호: 94-96;
(g) 서열식별번호: 109-111;
(h) 서열식별번호: 112-114;
(i) 서열식별번호: 125-127;
(j) 서열식별번호: 141-143;
(k) 서열식별번호: 144-146; 또는
(l) 서열식별번호: 345-347
을 포함하며;
여기서 항체는 인간 GITR에 특이적으로 결합한다.
특정한 실시양태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 20-22를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 23-25를 포함하거나;
(b) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 33-35를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 36-38을 포함하거나;
(c) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 46-48을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 49-51을 포함하거나;
(d) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 62-64를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 65-67을 포함하거나;
(e) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 62-64를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 68-70을 포함하거나;
(f) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 78-80을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 81-83을 포함하거나;
(g) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 91-93을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 94-96을 포함하거나;
(h) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 106-108을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 109-111을 포함하거나;
(i) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 106-108을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 112-114를 포함하거나;
(j) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 122-124를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 125-127을 포함하거나;
(k) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 138-140을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 141-143을 포함하거나;
(l) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 138-140을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 144-146을 포함하거나; 또는
(m) 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 342-344를 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열식별번호: 345-347을 포함하며;
여기서 항체는 인간 GITR에 특이적으로 결합한다.
본원에 기재된 VH 도메인, 또는 그의 1개 이상의 CDR은 중쇄, 예를 들어 전장 중쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 VL 도메인, 또는 그의 1개 이상의 CDR은 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장 중쇄 (C-말단 리신 (K) 제외 또는 C-말단 글리신 및 리신 (GK) 제외, 이는 부재할 수 있음) 및 전장 경쇄는 조합되어 전장 항체를 형성한다.
본원에 기재된 VH 도메인은, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이 자연 발생이거나 또는 변형된 인간 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, VH 도메인은 하기 인간 IgG1 아미노산 서열에 융합된, 본원에 기재된 임의의 VH 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
인간 IgG1 불변 도메인은 또한 동종이형 변이체의 것일 수 있다. 예를 들어, IgG1의 동종이형 변이체는 R107K, E189D 및 M191L (상기에서 밑줄표시되고, 서열식별번호: 7에서의 것에 따라 넘버링됨)을 포함한다. 전장 중쇄 영역 내에서, 이들 아미노산 치환은 R214K, E356D 및 M358L로 넘버링된다.
본원에 기재된 VL 도메인은 인간 카파 또는 람다 경쇄의 불변 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 하기 인간 IgG1 카파 경쇄 아미노산 서열에 융합된, 본원에 기재된 임의의 VL 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
특정 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 C-말단에 리신 또는 또 다른 아미노산을 포함하고, 예를 들어 하기 마지막 아미노산을 포함한다: 중쇄의 경우에 LSPGK (서열식별번호: 220). 특정 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 결여되어 있고, 예를 들어 C-말단 서열 LSPG (서열식별번호: 276) 또는 LSP를 갖는다.
예시적인 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 15에 제시되고, 이는 중쇄의 경우에 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362 및 경쇄의 경우에 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, 및 371에 상응한다.
표 15에 제시된 중쇄 또는 경쇄 중 임의의 것 (또는 그의 가변 영역), 예를 들어 서열식별번호: 13-19, 26-32, 40-45, 52-61, 71-77, 84-90, 97-105, 116-121, 128-137, 227-275, 337-341, 348-352, 361, 362, 및 371과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄가 목적하는 특징, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 것을 갖는 항-인간 GITR 항체를 형성하는데 사용될 수 있다. 예시적인 변이체는, 예를 들어 불변 도메인에서의 동종이형 변이, 및/또는 가변 또는 불변 영역에서의 돌연변이, 예컨대 본원에 개시된 돌연변이를 포함하는 것이다. 표 15에 제시된 중쇄 또는 경쇄 중 임의의 것 (또는 그의 가변 영역)과 최대 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산이 상이한 (치환, 부가 또는 결실에 의함) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄가 목적하는 특징, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 것을 갖는 항-인간 GITR 항체를 형성하는데 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 상기 기재된 항체는 하기 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종, 또는 모두를 나타낸다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) FACS에 의해 측정 시, GITR 리간드가 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 결합하는 것을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(8) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(9) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(10) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(11) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
이러한 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 글리코실화 (예를 들어, N-연결 또는 O-연결된 글리코실화) 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 입체형태적 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR 이소형 1, 2 또는 3 (서열식별번호: 4)의 아미노산 잔기 1-39에 상응하는, 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 하기 영역 내의 아미노산 잔기에 결합한다:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (서열식별번호: 215).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR 이소형 1, 2 또는 3 (서열식별번호: 4)의 아미노산 잔기 1-20에 상응하는, 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 하기 영역 내의 아미노산 잔기에 결합한다:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 216).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 하기 영역 내의 아미노산 잔기에 결합한다:
PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218).
변형된 중쇄 불변 도메인
본원에 추가로 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 항-GITR 항체의 중쇄 불변 영역은 임의의 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 것, 또는 그의 조합 및/또는 그의 변형일 수 있다. 항-GITR 항체는 이펙터 기능을 가질 수 있거나, 또는 감소된 이펙터 기능을 가질 수 있거나, 또는 이펙터 기능을 전혀 갖지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 항체에 증진된 특성을 제공하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, IgG2 힌지를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체는 비-IgG2 힌지를 갖는 것을 제외하고는 동일한 가변 영역을 갖는 항체에 비해 보다 강력한 효능제이다. 예를 들어, IgG2 힌지, IgG1 이소형의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체는, 이펙터 기능의 존재 또는 부재에 관계 없이, 항체와 인큐베이션된 T 세포로부터의 IFN-γ 및 IL-2의 증진된 분비에 의해 측정되는 바와 같은 증진된 효능제 활성을 갖는다. 특정 작용 메커니즘에 제한되는 것을 원하지는 않지만, IgG2 힌지를 갖는 항-GITR 항체가 보다 큰 항체/항원 복합체를 형성하고 보다 효과적으로 내재화됨으로써, 증가된 효능제 활성을 발생시키는 것으로 가설화된다. 큰 복합체의 형성은 다른 이소형 (예를 들어, IgG1, IgG3 및 IgG4)의 힌지에 비해 IgG2 힌지의 보다 큰 강성으로 인한 것으로 생각된다. 실시예에 추가로 기재되어 있는 바와 같이, 증진된 효능제 활성은 항체의 보다 높은 또는 보다 낮은 친화도와 연관있는 것으로 보이지 않는다. 따라서, 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체가 본원에 제공되며, 여기서 항-GITR 항체는 증진된 효능제 활성을 갖고, 여기서 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 항체의 친화도는 상이한 중쇄 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 가변 영역과 유사한 친화도로 GITR에 결합한다.
따라서, 비-IgG2 힌지를 갖는 항-GITR 항체를 제공하고, 비-IgG2 힌지를 IgG2 힌지로 대체하는 것을 포함하는, 항-GITR 항체의 효능제 활성을 증진시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 이러한 변형으로부터 이점을 얻을 수 있는 항체는 임의의 항-GITR 항체, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 것, 예를 들어 WO2006/105021에 기재된 바와 같은 항체 6C8 또는 6C8의 CDR을 갖는 인간화 항체; WO2011/028683, JP2008278814, KR20080105674, US20040072566, US2001472565, US20140065152 또는 WO2015/031667에 기재된 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG2 이소형의 힌지 ("IgG2 힌지"), 및 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG2 힌지, 및 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 CH1, CH2 및 CH3 도메인 중 적어도 하나는 IgG2 이소형의 것이 아니다. IgG2 힌지는 야생형 IgG2 힌지, 예를 들어 야생형 인간 IgG2 힌지 (예를 들어, ERKCCVECPPCPAPPVAG; 서열식별번호: 291) 또는 그의 변이체일 수 있으나, 단 IgG2 힌지는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 항체에 비해 증진된 활성을 항체에 부여하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, IgG2 힌지 변이체는 야생형 IgG2 힌지의 것과 유사한 강성 또는 강직을 보유한다. 힌지의 강성은 힌지를 포함하는 항체의 회전 반경을 측정 또는 비교하는, 예를 들어 컴퓨터 모델링, 전자 현미경검사, 분광분석법, 예컨대 핵 자기 공명 (NMR), X선 결정학 (B-인자), 또는 침강 속도 분석용 초원심분리 (AUC)에 의해 결정될 수 있다. 힌지를 포함하는 항체가 이전 문장에 기재된 시험 중 하나로부터 수득한 값이, 상이한 힌지, 예를 들어 IgG1 힌지를 갖는 동일한 항체의 값과 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 미만으로 상이한 값을 갖는 경우에, 힌지는 또 다른 힌지와 유사한 또는 그보다 높은 강성을 가질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 시험으로부터 이들 시험의 결과를 해석함으로써 힌지가 또 다른 힌지의 것과 적어도 유사한 강성을 갖는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 예시적인 인간 IgG2 힌지 변이체는 4개의 시스테인 잔기 (즉, C219, C220, C226 및 C229) 중 1개 이상을 또 다른 아미노산으로 치환시킨 것을 포함하는 IgG2 힌지이다. 시스테인은 세린으로 대체될 수 있다. 예시적인 IgG2 힌지는 C219X 돌연변이 또는 C220X 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2 힌지이며, 여기서 X는 세린을 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, IgG2 힌지는 C219X 치환 및 C220X 치환 둘 다를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, IgG2 힌지는 C219S 또는 C220S를 포함하지만, C219S 및 C220S 둘 다는 포함하지 않는다 (예를 들어, ERKSCVECPPCPAPPVAG; 서열식별번호: 292). 사용될 수 있는 다른 IgG2 힌지 변이체는 C220, C226 및/또는 C229 치환, 예를 들어 C220S, C226S 또는 C229S 돌연변이 (이는 C219S 돌연변이와 조합될 수 있음)를 포함하는 인간 IgG2 힌지를 포함한다. IgG2 힌지는 또한 힌지의 부분이 또 다른 이소형의 것인 IgG2 힌지일 수 있고 (즉, 키메라 또는 하이브리드 힌지), 단 키메라 힌지의 강성은 야생형 IgG2 힌지의 것과 적어도 유사하다. 예를 들어, IgG2 힌지는 하부 힌지 (표 2에 정의된 바와 같음)가 IgG1 이소형의 것이고, 예를 들어 야생형 IgG1 하부 힌지인 IgG2 힌지일 수 있다. IgG2 힌지에 사용될 수 있는 추가의 IgG2 힌지 돌연변이는 SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF 및 GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) 돌연변이를 포함한다.
"하이브리드" 또는 "키메라" 힌지는 힌지의 연속 아미노산의 절반 초과가 특정 이소형으로부터의 것인 경우에, 그러한 이소형의 것으로 지칭된다. 예를 들어, IgG2의 상부 및 중간 힌지, 및 IgG1의 하부 힌지를 갖는 힌지는 IgG2 하이브리드 힌지인 것으로 간주된다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 하기 서열
(여기서 X는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산임)
중 하나, 또는 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산이 아미노산 잔기 CVE와 CPP 사이에 삽입된 임의의 상기 서열을 포함하는, IgG2 힌지를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, THT 또는 GGG가 삽입된다. 특정 실시양태에서, 1, 1-2, 또는 1-3개의 아미노산이 힌지와 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, 글리신이 힌지와 CH2 도메인 사이에 삽입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 447, 448, 449, 450, 또는 451을 포함하며, 여기서 1, 2, 3개 또는 모든 4개의 아미노산 P233, V234, A235 및 G237 (C-말단 4개의 아미노산 "PVAG" (서열식별번호: 472)에 상응함)은 결실되거나 또는 또 다른 아미노산, 예를 들어 IgG1 힌지의 C-말단의 아미노산 (ELLG (서열식별번호: 473) 또는 ELLGG (서열식별번호: 474))으로 치환된다. 특정 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 447, 448, 449, 450, 또는 451을 포함하며, 여기서 V234, A235 및 G237은 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 특정 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 447, 448, 449, 450, 또는 451을 포함하며, 여기서 A235 및 G237은 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 특정 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 447, 448, 449, 450, 또는 451을 포함하며, 여기서 G237은 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 특정 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 447, 448, 449, 450, 또는 451을 포함하며, 여기서 V234 및 A235는 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 예를 들어 상기 제시된 하이브리드 힌지를 수득하기 위해 IgG2 내의 PVAG (서열식별번호: 472)를 IgG1 힌지의 상응하는 아미노산, 즉 ELLG (서열식별번호: 473) 또는 ELLGG (서열식별번호: 474)로 치환하는 것은, IgG2 힌지의 이점 및 IgG1 힌지의 이펙터 기능을 갖는 힌지를 제공한다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 상기 제시된 서열 중 하나, 예를 들어 서열식별번호: 447-471 중 어느 하나로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지고, 특정 실시양태에서 추가의 힌지 아미노산 잔기를 포함하지 않는 힌지를 포함한다.
특정 실시양태에서 항-CD73 항체는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 힌지는 1-10개의 아미노산의 결실을 포함한다. 실시예에 제시된 바와 같이, 아미노산 잔기 SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 및 T225; 서열식별번호: 475)가 결여된 IgG1 항체는 야생형 IgG1 불변 영역을 갖는 동일한 항체보다 더 효과적으로 항체 매개된 CD73 내재화를 부여하였다. 유사하게, IgG2 항체와 관련하여, 아미노산 잔기 CCVE (C219, C220, V222, 및 E224; 서열식별번호: 476)가 결여된 IgG2 항체는 야생형 IgG1 불변 영역을 갖는 동일한 항체보다 더 효과적으로 항체 매개된 CD73 내재화를 부여하였다. 따라서, 힌지가, IgG1 항체의 경우에 잔기 S219, C220, D221, K222, T223, H224 및 T225로부터 선택되고 IgG2 항체의 경우에 잔기 C219, C220, V222, 및 E224로부터 선택된, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역이 본원에 제공된다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG2 이소형의 야생형 CH1 도메인인 CH1 도메인 (각각 "IgG1 CH1 도메인" 또는 "IgG2 CH1 도메인")을 포함한다. 이소형 IgG3 및 IgG4의 CH1 도메인 (각각 "IgG3 CH1 도메인 및 "IgG2 CH1 도메인")이 또한 사용될 수 있다. CH1 도메인은 또한, 야생형 CH1 도메인의 변이체, 예를 들어 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH1 도메인의 변이체일 수 있다. CH1 도메인의 예시적인 변이체는 A114C 및 T173C 및/또는 C131, 예를 들어, C131S를 포함한다.
CH1 도메인, 예를 들어, IgG2 CH1 도메인은 치환 C131S를 포함할 수 있으며, 이러한 치환은 IgG2 항체, 또는 IgG2 CH1 및 힌지를 갖는 항체에 B 형태 (또는 입체형태)를 부여한다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG2 이소형의 것인 CH1 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, CH1 도메인은, 예를 들어 아미노산 서열:
를 갖는 야생형 IgG2 CH1 도메인이다. 특정 실시양태에서, CH1 도메인은 서열식별번호: 477의 변이체이고, 서열식별번호: 477 대비 1-10, 1-5, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 실시예에 추가로 기재된 바와 같이, IgG2 CH1 도메인 또는 그의 변이체는 IgG1 항체에 비해 항-GITR 항체에 증진되거나 변경된 내재화 특성을 부여하고, 항체가 또한 IgG2 힌지를 포함하는 경우에는 훨씬 더 증진되거나 변경된 내재화를 부여하는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 특정 실시양태에서, IgG2 CH1 변이체는 하기 아미노산 잔기: C131, R133, E137 및 S138 중 1개 이상에서 아미노산 치환 또는 결실을 포함하지 않고, 아미노산 잔기는 상기 제시된 서열식별번호: 477에서 볼드체 및 밑줄로 표시된다. 예를 들어, 변형된 중쇄 불변 영역은 R133, E137 및 S138 중 어떠한 것도 또 다른 아미노산으로 치환되지 않거나 결실되지 않거나, 또는 C131, R133, E137 및 S138 중 어떠한 것도 또 다른 아미노산으로 치환되지 않거나 결실되지 않는 IgG2 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, C131은 또 다른 아미노산, 예를 들어 C131S로 치환되며, 치환은 항체가 입체형태 B를 채택하도록 촉발한다. 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 입체형태 A 및 입체형태 B 항체 둘 다는, IgG1 불변 영역을 갖는 동일한 항체에 비해 증진된 활성을 갖는 것으로 본원에서 밝혀졌다.
특정 실시양태에서, N192 및/또는 F193 (상기 제시된 서열식별번호: 477에서 이탤릭체 및 밑줄표시된 잔기로 제시됨)은 또 다른 아미노산, 예를 들어, IgG1 내의 상응하는 아미노산, 즉, N192S 및/또는 F193L로 치환된다.
특정 실시양태에서, IgG2 CH1 도메인의 1개 이상의 아미노산 잔기는 IgG4 내의 상응하는 아미노산 잔기로 치환된다. 예를 들어, N192는 N192S일 수 있고/거나; F193은 F193L일 수 있고/거나; C131은 C131K일 수 있고/거나; T214는 T214R일 수 있다.
항체는 IgG2 CH1 도메인 또는 그의 변이체 및 IgG2 힌지 또는 그의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 힌지 및 CH1 도메인은 본원에 기재된 임의의 IgG2 힌지 및 IgG2 CH1 도메인의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG2 CH1 및 힌지는 하기 아미노산 서열
, 또는 최대 1-10개의 아미노산에서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 변이체는 상기 힌지 및 CH1 도메인에 대해 기재된 바와 같다.
특정 실시양태에서, 항체는 적어도 IgG2 힌지, 및 임의로 또한 IgG2 CH1 도메인, 또는 힌지 및/또는 CH1 도메인의 단편 또는 유도체를 포함하고, 항체는 형태 (또는 입체형태) A를 채택하였다 (예를 들어, 문헌 [Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755] 참조). 특정 실시양태에서, 항-CD73 항체는 적어도 IgG2 힌지, 및 임의로 또한 IgG2 CH1 도메인, 또는 힌지 및/또는 CH1 도메인의 단편 또는 유도체를 포함하고, 항체는 형태 B를 채택하였다 (예를 들어, 문헌 [Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755] 참조).
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 야생형 CH2 도메인인 CH2 도메인 (각각 "IgG1 CH2 도메인", "IgG2 CH2 도메인", "IgG3 CH2 도메인" 또는 "IgG4 CH2 도메인")을 포함한다. CH2 도메인은 또한, 야생형 CH2 도메인의 변이체, 예를 들어 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH2 도메인의 변이체일 수 있다. CH2 도메인의 예시적인 변이체는 항체의 Fc 영역의 생물학적 활성, 예컨대 ADCC 또는 CDC를 조정하거나 또는 항체의 반감기 또는 그의 안정성을 조정한 변이체를 포함한다. 한 실시양태에서, CH2 도메인은 A330S 및 P331S 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인이며, 여기서 CH2 도메인은 돌연변이를 갖지 않는 동일한 CH2 돌연변이에 비해 감소된 이펙터 기능을 갖는다. CH2 도메인은 증진된 이펙터 기능을 가질 수 있다. CH2 도메인은 하기 돌연변이: SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF 및 GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) 중 1개 이상 및/또는 하기 아미노산: E233, G237, P238, H268, P271L328 및 A330에서 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 돌연변이가 본원의 다른 곳에 추가로 제시된다.
특정 실시양태에서, 변형된 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 야생형 CH3 도메인인 CH3 도메인 (각각 "IgG1 CH3 도메인", "IgG2 CH3 도메인", "IgG3 CH3 도메인" 또는 "IgG4 CH3 도메인")을 포함한다. CH3 도메인은 또한, 야생형 CH3 도메인의 변이체, 예를 들어 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH3 도메인의 변이체일 수 있다. CH3 도메인의 예시적인 변이체는 항체의 Fc 영역의 생물학적 활성, 예컨대 ADCC 또는 CDC를 조정하거나 또는 항체의 반감기 또는 그의 안정성을 조정한 변이체를 포함한다.
일반적으로, CH1, 힌지, CH2 또는 CH3 도메인의 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 돌연변이, 및/또는 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이, 또는 1-10 또는 1-5개의 돌연변이를 포함할 수 있거나, 또는 상응하는 야생형 도메인 (각각 CH1, 힌지, CH2, 또는 CH3 도메인)의 것과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 단 특정 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역은 필수 생물학적 활성을 보유한다.
표 3은 인간 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 예시적인 인간 중쇄 불변 영역을 제시하며, 여기서 각각의 도메인은 야생형 도메인, 또는 중쇄 불변 영역에 목적하는 생물학적 활성을 제공하는 그의 변이체이다. 표 3에서 비어있는 셀은 도메인이 존재하거나 또는 존재하지 않고, 존재하는 경우에는 임의의 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 것일 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 표 3 내의 중쇄 불변 영역 1을 포함하는 항체는 적어도 IgG2 힌지를 포함하고, 또한 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있으며, 존재하는 경우에 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다. 표 3의 이해를 위한 또 다른 예로서, 중쇄 불변 영역 8을 포함하는 항체는 IgG1 CH1 도메인, 및 IgG2 힌지, IgG1 CH2 도메인을 포함하고, 또한 CH3 도메인을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있으며, 존재하는 경우에 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 것일 수 있는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다.
표 3. 인간 중쇄 불변 영역의 예시적인 구성
* 변형된 중쇄 불변 영역
특정 실시양태에서, 표 3에 제시된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체는 특정 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하는 동일한 항체에 비해 또는 IgG1 불변 영역을 포함하는 동일한 항체에 비해 증진된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 비-IgG2 힌지 및/또는 비-IgG2 CH1 도메인을 포함하는 GITR 항체의 생물학적 활성을 개선시키는 방법은 비-IgG2 힌지 및/또는 비-IgG2 CH1 도메인을 포함하는 항-GITR 항체를 제공하고, 비-IgG2 힌지 및 비-IgG2 CH1 도메인을 각각 IgG2 힌지 및 IgG2 CH1 도메인으로 대체하는 것을 포함한다. 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 GITR 항체의 생물학적 활성을 개선시키는 방법은, 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하지 않는 항-GITR 항체를 제공하고, 그의 중쇄 불변 영역을 변형된 중쇄 불변 영역으로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
항-GITR 가변 영역, 예를 들어 본원에 기재된 것에 연결될 수 있는 예시적인 변형된 중쇄 불변 영역이 표 4에 제공되고, 이는 각각의 도메인의 아이덴티티를 제시한다.
표 4: 예시적인 변형된 중쇄 불변 영역
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 서열식별번호: 291, 292, 293, 294, 및 447-471 중 어느 하나를 포함하는 IgG2 힌지 또는 그의 변이체, 예컨대 (i) 서열식별번호: 291, 292, 293, 294, 및 447-471 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이한 아미노산 서열; (ii) 서열식별번호: 291, 292, 293, 294, 또는 447-471 중 어느 하나와 최대 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이한 아미노산 서열; (iii) 서열식별번호: 291, 292, 293, 294, 또는 447-471 중 어느 하나와 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이한 아미노산 서열 및/또는 (iv) 서열식별번호: 291, 292, 293, 294, 또는 447-471 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 IgG2 힌지를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 것에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 여기서 변형된 중쇄 불변 영역은 또 다른 중쇄 불변 영역, 예를 들어 비-IgG2 힌지를 포함하는 중쇄 불변 영역에 비해 또는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 변형된 중쇄 불변 영역에 비해 증진된 효능제 활성을 항-GITR 항체에 제공한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 서열식별번호: 278을 포함하는 IgG1 CH1 도메인, 또는 서열식별번호: 279를 포함하는 IgG2 CH1 도메인, 또는 서열식별번호: 278 또는 279의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체는 (i) 서열식별번호: 278 또는 279와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (ii) 서열식별번호: 278 또는 279와 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (iii) 서열식별번호: 278 또는 279와 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나 (iv) 서열식별번호: 278 또는 279와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 것에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 여기서 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-GITR 항체는 또 다른 중쇄 불변 영역, 예를 들어 비-IgG2 힌지를 포함하는 중쇄 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체의 것에 비해 또는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 변형된 중쇄 불변 영역에 비해 증진된 효능제 활성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 서열식별번호: 280 또는 281, 또는 서열식별번호: 280 또는 281의 변이체를 포함하는 IgG1 CH2 도메인을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체는 (i) 서열식별번호: 280 또는 281과 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (ii) 서열식별번호: 280 또는 281과 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (iii) 서열식별번호: 280 또는 281과 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나 (iv) 서열식별번호: 280 또는 281과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 것에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 여기서 변형된 중쇄 불변 영역은 또 다른 중쇄 불변 영역, 예를 들어 비-IgG2 힌지를 포함하는 중쇄 불변 영역의 것에 비해 또는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 변형된 중쇄 불변 영역에 비해 증진된 효능제 활성을 항-GITR 항체에 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 서열식별번호: 282, 또는 서열식별번호: 282의 변이체를 포함하는 IgG1 CH3 도메인을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체는 (i) 서열식별번호: 282와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (ii) 서열식별번호: 282와 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (iii) 서열식별번호: 282와 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나 (iv) 서열식별번호: 282와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 것에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 여기서 변형된 중쇄 불변 영역은 또 다른 중쇄 불변 영역, 예를 들어 비-IgG2 힌지를 포함하는 중쇄 불변 영역의 것에 비해 또는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 변형된 중쇄 불변 영역에 비해 증진된 효능제 활성을 제공한다.
변형된 중쇄 불변 영역은 또한, 상기 기재된 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체는 (i) 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (ii) 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543 중 어느 하나와 최대 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나; (iii) 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543 중 어느 하나와 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10, 또는 5-10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실에서 상이하고/거나 (iv) 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543으로부터 선택된 서열과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 임의의 것에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고 변형(들)은 서열식별번호: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 및 480-543에서 그러한 위치에서 야생형 아미노산과 상이한 아미노산에서 일어나지 않고; 여기서 변형된 중쇄 불변 영역은 또 다른 중쇄 불변 영역, 예를 들어 비-IgG2 힌지를 포함하는 중쇄 불변 영역의 것에 비해 또는 비-IgG2 힌지를 포함하는 동일한 변형된 중쇄 불변 영역에 비해 증진된 효능제 활성을 제공한다.
변형된 중쇄 불변 영역은 (i) 야생형 중쇄 불변 영역과 유사하거나, 그에 비해 감소 또는 증가된 이펙터 기능 (예를 들어, FcγR에의 결합) 및/또는 (ii) 야생형 중쇄 불변 영역과 유사하거나, 그에 비해 감소 또는 증가된 반감기 (또는 FcRn 수용체에의 결합)를 가질 수 있다.
III. 특정한 배선 서열을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 특정한 배선 중쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정한 배선 경쇄 이뮤노글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 인간 배선 VH 3-33 유전자, VH 3-10 유전자, VH 3-15 유전자, VH 3-16, VH JH6b 유전자, VH 6-19 유전자, VH 4-34 유전자, 및/또는 VH JH3b 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, GITR에 특이적인 인간 항체가 제조되었다. 따라서, VH 3-33, VH 3-10, VH 3-15, VH 3-16, VH JH6b, VH 6-19, VH 4-34, 및/또는 VH JH3b로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 VH 배선 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
인간 배선 VK L6 유전자, VK L18 유전자, VK L15 유전자, VK L20 유전자, VK A27 유전자, VK JK5 유전자, VK JK4 유전자, VK JK2 유전자, 및 VK JK1 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 GITR에 특이적인 인간 항체가 제조되었다. 따라서, VK L6, VK L18, VK L15, VK L20, VK A27, VK JK5, VK JK4, VK JK2, 및 VK JK1로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 VK 배선 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 바람직한 항체는 도 2-11에 제시된 바와 같은, 상기-열거된 인간 배선 VH 유전자 중 하나의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 상기-열거된 인간 배선 VK 유전자 중 하나의 생성물이거나 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나, 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열과 서열 면에서 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 배선 서열과 비교 시 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로, 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교하였을 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 수 있다.
IV. 상동 항체
본원에 기재된 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체가 본원에 제공되고, 여기서 항체는 본원에 기재된 항-GITR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 단리된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서:
(a) 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 항체는 GITR에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종 또는 모두를 나타낸다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) FACS에 의해 측정 시 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(8) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(9) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(10) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(11) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴;
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
다양한 실시양태에서, 항체는 상기 (1) 내지 (12)에 열거된 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종, 10종, 11종, 또는 모두를 나타낼 수 있다. 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
단리된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서:
(a) 중쇄는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 단 특정 실시양태에서, 서열이 무이펙터 중쇄의 것이면, 중쇄를 무이펙터로 만드는 돌연변이는 변형되지 않고 (즉, A234, E235, A237, S330 및 S331에서 어떠한 변형도 이루어지지 않음);
(b) 경쇄는 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) 항체는 GITR에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종 또는 모두를 나타낸다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) FACS에 의해 측정 시 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(8) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(9) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(10) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(11) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
또한, 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10의 상응하는 CDR과 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 또는 1-5개의 아미노산 변화 (즉, 아미노산 치환, 부가 또는 결실)에서 상이한 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및/또는 VLCDR3을 포함하는 항-GITR 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10 내 상응하는 서열에 비해 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 각각에서 1-5개의 아미노산 변화를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10 내 CDR에 비해 모든 CDR에 걸쳐 총 1-5개의 아미노산 변화를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 28F3의 것으로 이루어진 VH 및 VL CDR을 포함하며, 여기서 1개 이상의 CDR에서 아미노산 중 1개 이상은 본원에 개시된 다른 항-GITR 항체 중 하나의 것이다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 SYGMH (서열식별번호: 20)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VHCDR1을 포함하고, 예를 들어 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
SYGXH (서열식별번호: 372), 여기서 X는 임의의 아미노산, 예를 들어, M 또는 F임;
X1YGX2H, 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, S,N 또는 D이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, M 또는 F임; 및
X1YGX2X3, 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, S,N 또는 D이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, M 또는 F이고, X3은 임의의 아미노산, 예를 들어, H 또는 Q임.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 VIWYEGSNKYYADSVKG (서열식별번호: 21)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VHCDR2를 포함하고, 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
VIWYX1GSNKX2YADSVKG (서열식별번호: 373), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, E 또는 A이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, Y 또는 F임; 및
VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG (서열식별번호: 374), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, E, A, G 또는 D이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, Y 또는 F이고; X3은 임의의 아미노산, 예를 들어, A 또는 V임.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 GGSMVRGDYYYGMDV(서열식별번호: 22)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VHCDR3을 포함하고, 예를 들어 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
GGSX1VRGDYYYGMDV (서열식별번호: 375), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, M 또는 V, L, I 또는 A임.
GGSX1VRGX2YYYGMDV (서열식별번호: 376), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, M 또는 V, L, I 또는 A이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, D 또는 E임. X1 및 X2의 특정한 조합이 실시예에 제시된다.
GG (6-7aa) MDVWYYX1MDVW (서열식별번호: 377), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, G, S 또는 V임. 특정 실시양태에서, 6-7개의 아미노산은 본원에 개시된 항-GITR 항체의 VHCDR3 서열 내 그 위치에서의 아미노산에 상응한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 RASQGISSALA (서열식별번호: 23)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VLCDR1을 포함하고, 예를 들어 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
RASQGISSXLA (서열식별번호: 378), 여기서 X는 임의의 아미노산, 예를 들어, A 또는 W (또는 A, W 또는 Y)임; 및
RASQG (2-3 aa) SX1LA (서열식별번호: 379), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, W, Y 또는 A이고, 2-3개의 아미노산은 임의의 아미노산, 예를 들어, GI, SVS 또는 SVT임.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 DASSLES (서열식별번호: 24)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VLCDR2를 포함하고, 예를 들어 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
DASSLXS (서열식별번호: 380), 여기서 X는 임의의 아미노산, 예를 들어, E 또는 Q임; 및
X1ASSX2X3X4, 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, A, D 또는 G이고; X4는 임의의 아미노산, 예를 들어, L 또는 R이고; X3은 임의의 아미노산, 예를 들어, Q, E 또는 A이고; X4는 임의의 아미노산, 예를 들어, S 또는 T임.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 QQFNSYPYT (서열식별번호: 25)에 비해 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 VLCDR3을 포함하고, 예를 들어 하기 축중성 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
QQXNSYPYT (서열식별번호: 381), 여기서 X는 임의의 아미노산, 예를 들어, F 또는 Y임; 및
QQX1X2SX3PX4T (서열식별번호: 382), 여기서 X1은 임의의 아미노산, 예를 들어, F 또는 Y이고; X2는 임의의 아미노산, 예를 들어, N 또는 G이고; X3은 임의의 아미노산, 예를 들어, Y 또는 S이고; X4는 임의의 아미노산, 예를 들어, Y, W, I, P 또는 Q임.
28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10의 것과 상동성인 서열, 예를 들어 각각 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335, 및 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336의 VH 및 VL 영역, 또는 각각 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 및 337, 및 서열식별번호: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 및 338의 중쇄 및 경쇄, 또는 CDR을 갖는 항체는, 서열식별번호: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186, 353 및/또는 서열식별번호: 148, 155, 159, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188, 354 또는 서열식별번호: 149, 151, 152, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189, 355 및/또는 서열식별번호: 150, 153, 157, 161, 166, 171, 175, 180, 185, 190, 191, 356을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능 (즉, 상기 (1) 내지 (12)에 제시된 기능)에 대해 코딩된 변경된 항체를 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
V. 보존적 변형을 갖는 항체
항-GITR 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 바람직한 항체 (예를 들어, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10)에 기초하여 명시된 아미노산 서열, 또는 그의 보존적 변형을 포함하고, 여기서 항체는 본원에 기재된 항-GITR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 단리된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 여기서:
(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고;
(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고;
(c) 항체는 GITR에 특이적으로 결합하고,
(d) 항체는 하기 기능적 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종 또는 모두를 나타낸다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) FACS에 의해 측정 시 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(8) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(9) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(10) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(11) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하고; 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 변형, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 항체는 상기 (1) 내지 (12)에 열거된 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종, 또는 모두를 나타낼 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 또한, CDR 이외의, 또는 CDR에 더하여, 항체의 부분들에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변형은 프레임워크 영역에서 또는 Fc 영역에서 이루어질 수 있다. 가변 영역 또는 중쇄 또는 경쇄는 본원에 제공된 항-GITR 항체 서열에 비해, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 또는 1-50개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 보존적 및 비-보존적 아미노산 변형의 조합을 포함한다.
VI. 본원에 기재된 항체와 GITR 상의 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 GITR에의 결합에 대해 경쟁하는 항체
또한, GITR에의 결합에 대해 본원에 기재된 특정한 항-GITR 항체 (예를 들어, 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10)와 경쟁하는 항체가 본원에 제공된다. 이러한 경쟁 항체는 표준 GITR 결합 검정에서 모노클로날 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10 중 1종 이상의 GITR에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 GITR 단백질을 플레이트 상에 고정시키고, 다양한 농도의 비표지된 제1 항체를 첨가하고, 플레이트를 세척하고, 표지된 제2 항체를 첨가하고, 표지의 양을 측정하는, 표준 ELISA 검정 또는 경쟁적 ELISA 검정이 사용될 수 있다. 증가하는 농도의 비표지된 (제1) 항체 ("차단 항체"로도 지칭됨)가 표지된 (제2) 항체의 결합을 억제하는 경우에, 제1 항체는 플레이트 상의 표적에 대한 제2 항체의 결합을 억제한다고 언급되거나, 또는 제2 항체의 결합과 경쟁한다고 언급된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 비아코어 분석을 사용하여 항체가 경쟁하는 능력을 평가할 수 있다. 본원에 기재된 항-GITR 항체의 GITR에 대한 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 GITR에의 결합에 대해 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증한다.
따라서, 예를 들어 ELISA 또는 FACS에 의해, 예컨대 하기 단락에 기재된 검정을 사용하여 측정 시, 세포, 예를 들어 활성화된 T 세포 상의 GITR에 대한 본원에 기재된 항-GITR 항체의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 억제하고/거나, 세포, 예를 들어 활성화된 T 세포 상의 GITR에 대한 결합이 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%만큼 억제되는 항-GITR 항체가 본원에 제공된다.
예를 들어 제1 항체가 제2 항체의 결합을 차단하는지 (즉, "그와 경쟁하는지") 여부를 결정하기 위한 예시적인 경쟁 실험은 하기와 같이 수행될 수 있다: 활성화된 인간 T 세포를 하기와 같이 제조한다: 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜 구배를 사용하여 인간 전혈로부터 단리하고 10μg/mL 피토헤마글루티닌 (PHA-L) (유에스바이올(USBiol)#P3370-30) 및 200IU/mL 재조합 IL-2 (페프로테크(Peprotech)#200-02)로 3일 동안 활성화시킨다. 활성화된 T 세포를 FACS 완충제 (5% 태아 소 혈청이 함유된 PBS)에 재현탁시키고 96 웰 플레이트에 샘플 웰당 105개의 세포로 시딩한다. 플레이트를 얼음 위에 둔 다음 비접합된 제1 항체를 0으로부터 50 μg/mL까지의 범위의 농도로 첨가한다 (50 μg/mL의 최고 농도로부터 시작하는 3-배 적정). 비관련 IgG가 제1 항체에 대한 이소형 대조군으로서 사용될 수 있고 이것을 동일한 농도로 첨가한다 (50μg/mL의 최고 농도로부터 시작하는 3-배 적정). 50μg/mL 비표지된 제2 항체와 사전-인큐베이션된 샘플이 완전 차단 (100% 억제)에 대한 양성 대조군으로서 포함될 수 있고, 1차 인큐베이션에서 항체가 존재하지 않는 샘플이 음성 대조군 (경쟁 없음; 0% 억제)으로서 사용될 수 있다. 30분 인큐베이션 후에, 표지된, 예를 들어 비오티닐화된 제2 항체를 세척 없이 웰당 2μg/mL의 농도로 첨가한다. 샘플을 다시 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한다. 세포를 FACS 완충제로 세척함으로써 비결합된 항체를 제거한다. 세포-결합된, 표지된 제2 항체를 표지를 검출하는 작용제, 예를 들어 비오틴을 검출하기 위한 PE 접합된 스트렙타비딘 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그#S21388)을 사용하여 검출한다. 샘플을 FACS 칼리버 유동 세포측정기 (BD, 산호세) 상에서 획득하고 플로우조 소프트웨어 (트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc.), 오레곤주 앳슈랜드)로 분석한다. 결과는 % 억제 (즉, 각각의 농도에서의 표지의 양을 차단 항체의 부재 하에 수득된 표지의 양으로 나누어 100%에서 뺌)로서 나타내어질 수 있다. 전형적으로, 반대로, 즉 제1 항체를 제2 항체로 및 제2 항체를 제1 항체로 하여 동일한 실험을 이어서 수행한다. 특정 실시양태에서, 하나의 항체 또는 다른 항체가 제1 항체인 경우에 억제가 발생하는지 여부에 관계없이, 항체는 다른 항체가 표적, 예를 들어 인간 GITR 또는 그의 부분에 결합하는 것을 적어도 부분적으로 (예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%) 또는 완전히 (100%) 차단한다. 제1 및 제2 항체는 항체가 서로 둘 다의 방식으로, 즉 제1 항체가 제1로 첨가되는 경쟁 실험에서 및 제2 항체가 제1로 첨가되는 경쟁 실험에서 경쟁하는 경우 표적에 대한 서로의 결합을 "교차-차단"한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 예를 들어 주어진 에피토프 맵핑 기술에 의해 결정 시, 본원에 기재된 항-GITR 항체 (예를 들어, 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10)의 것과 동일한 에피토프에 결합한다. 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 28F3 항체는 인간 GITR의 QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (서열식별번호: 215) 내의 영역에서 결합한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 아미노산 잔기 1-39에 상응하는, 영역 QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (서열식별번호: 215) 내의 아미노산 잔기와 결합한다. 한 실시양태에서, 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR의 영역 QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 216) 내의 아미노산 잔기에 결합한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 성숙 인간 GITR의 영역 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 아미노산 잔기에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 예를 들어 실시예에 제시된 프로토콜을 사용하여 HDX에 의해 결정 시, 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합한다.
본원에 기재된 항체와 "GITR 상의 동일한 에피토프"에 결합하는 항체를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 해상도를 제공하는 항원:항체 복합체의 결정의 X선 분석을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이체에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 것으로, 항원 서열 내의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실은 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법이 또한 사용될 수 있다. 방법은 또한 조합 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드 (천연 3차원 형태 또는 변성된 형태)를 친화도 단리하는 관심 항체의 능력에 의존할 수 있다. 이어서, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 항체에 상응하는 에피토프를 정의하기 위한 리드로서 간주된다. 에피토프 맵핑을 위해 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되어 있고, 이는 입체형태적 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 제시된 바 있다.
본원에 기재된 항-GITR 항체와 결합에 대해 경쟁하거나, 또는 그와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 마우스를 본원에 기재된 바와 같은 인간 GITR로 면역화하고, 하이브리도마를 생산하고, 생성된 모노클로날 항체를 GITR에의 결합에 대해 본원에 기재된 항체와 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 마우스는 또한 항체가 결합하는 에피토프를 함유하는 GITR의 보다 작은 단편으로 면역화될 수 있다. 에피토프 또는 에피토프를 포함하는 영역은, 예를 들어 GITR에 걸쳐있는 일련의 중첩 펩티드에 대한 결합을 스크리닝함으로써 국재화될 수 있다. 대안적으로, 문헌 [Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994]의 방법을 사용하여 본원에 기재된 항-GITR 항체와 동일한 에피토프를 갖고 따라서 유사한 특성을 갖는 항체의 선택을 가이드할 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하여, 먼저 항-GITR 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 레퍼토리와 쌍형성되게하여 GITR-결합 항체를 선택하고, 이어서 새로운 경쇄를 (바람직하게는 인간) 중쇄의 레퍼토리와 쌍형성되게하여 본원에 기재된 항-GITR 항체와 동일한 에피토프 또는 에피토프 영역을 갖는 (바람직하게는 인간) GITR-결합 항체를 선택한다. 대안적으로, 본원에 기재된 항체의 변이체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
또한 GITR에서 아미노산 잔기의, 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 또는 일부 다른 형태의 점 돌연변이유발을 사용하여 항-GITR 항체를 위한 기능적 에피토프를 결정할 수 있다. 그러나, 돌연변이유발 연구는 또한 GITR의 전체 3차원 구조에 있어서는 중요하지만, 항체-항원 접촉에 직접적으로 수반되지 않는 아미노산 잔기를 제시할 수 있으므로, 이 방법을 사용하여 결정된 기능적 에피토프를 확인하기 위해 다른 방법이 필요할 수 있다.
또한 특이적 항체에 의해 결합되는 에피토프 또는 에피토프 영역 ("에피토프 영역"은 에피토프를 포함하거나 또는 에피토프와 중첩되는 영역임)은 GITR의 단편, 예를 들어 비-변성 또는 변성된 단편을 포함하는 펩티드에 대한 항체의 결합을 평가함으로써 결정될 수 있다. GITR (예를 들어, 인간 GITR)의 서열을 포괄하는 일련의 중첩 펩티드가 합성될 수 있고, 예를 들어 직접 ELISA, 경쟁적 ELISA (여기서, 펩티드는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 결합된 GITR에 대한 항체의 결합을 방지하는 그의 능력에 대해 평가됨)에서, 또는 칩 상에서 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 펩티드 스크리닝 방법은 일부 비연속 기능적 에피토프, 즉 GITR 폴리펩티드 쇄의 1차 서열을 따라서 연속적이지 않은 아미노산 잔기를 수반하는 기능적 에피토프는 검출하지 못할 수 있다.
에피토프는 또한 MS-기반 단백질 풋프린팅, 예컨대 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 및 단백질의 급속 광화학적 산화 (FPOP)에 의해 확인될 수 있다. HDX-MS는 예를 들어 실시예 및 문헌 [Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95]에 추가로 기재된 바와 같이 수행될 수 있고, 이 방법은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. FPOP는 예를 들어 문헌 [Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있고, 이 방법은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
항-GITR 항체가 결합하는 에피토프는 또한, 유리 상태인 경우 및 관심 항체와 복합체로 결합된 경우에 GITR 내의 불안정성 아미드 수소의 H-D 교환율의 NMR 결정을 포함한 구조적 방법, 예컨대 X선 결정 구조 결정 (예를 들어, WO2005/044853), 분자 모델링 및 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법에 의해 결정될 수 있다 (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
X선 결정학과 관련하여, 결정화는 마이크로배치 (예를 들어 문헌 [Chayen (1997) Structure 5:1269-1274]), 행잉-드롭 증기 확산 (예를 들어 문헌 [McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303]), 시딩 및 투석을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어 Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23) 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다. 적어도 약 1 mg/mL, 및 바람직하게는 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 농도를 갖는 단백질 제제를 사용하는 것이 바람직하다. 결정화는 폴리에틸렌 글리콜 1000-20,000 (PEG; 약 1000 내지 약 20,000 Da 범위의 평균 분자량), 바람직하게는 약 5000 내지 약 7000 Da, 보다 바람직하게는 약 6000 Da을 함유하는 침전제 용액 중 약 10% 내지 약 30% (w/v) 범위의 농도에 의해 가장 잘 달성될 수 있다. 또한, 단백질 안정화제, 예를 들어 글리세롤을 약 0.5% 내지 약 20% 범위의 농도로 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 염, 예컨대 염화나트륨, 염화리튬 또는 시트르산나트륨이 또한, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1000 mM 범위의 농도로 침전제 용액에서 바람직할 수 있다. 침전제는 바람직하게는 약 3.0 내지 약 5.0, 바람직하게는 약 4.0의 pH로 완충된다. 침전제 용액에 유용한 특정 완충제는 달라질 수 있고 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York). 유용한 완충제의 예는 HEPES, 트리스, MES 및 아세테이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 결정은 2℃, 4℃, 8℃ 및 26℃를 포함한 광범위한 온도에서 성장할 수 있다.
항체:항원 결정은 널리 공지된 X선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 X-PLOR (예일대학교, 1992, 몰리큘러 시뮬레이션즈, 인크.(Molecular Simulations, Inc.) 배포; 예를 들어, 문헌 [Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press]; 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0014194 참조), 및 BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)을 사용하여 정밀화될 수 있으며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항-GITR 항체는 에피토프 맵핑 기술, 예컨대 본원에 기재된 기술에 의해 결정 시, 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 임의의 항-GITR 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
VII. 조작 및 변형된 항체
VH 및 VL 영역
또한, 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있는 조작 및 변형된 항체가 제공되며, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된, 특정 자연 발생 항체로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본원에 기재된 또 다른 실시양태는 각각 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342, 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343, 및 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345, 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346, 및 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하고, 이들 항체로부터의 상이한 프레임워크 서열을 여전히 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공중 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 상 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있고; 그의 각각의 내용은 명확하게 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 항체에 사용하기에 바람직한 프레임워크 서열은 본원에 기재된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교 시 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
본원에 기재된 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대한 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체가 또한 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 관심 항체의 1종 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키기 위한 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 기능적 관심 특성이 본원에 기재되고 실시예에 제공된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또한 (a) 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1 영역; (e) 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2 영역; 및 (f) 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-GITR 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 제공된다.
항체의 CDR에서 메티오닌 잔기는 산화되어, 항체의 효력에서 잠재적인 화학적 분해 및 결과적인 환원을 발생시킬 수 있다. 따라서, 중쇄 및/또는 경쇄 CDR에서 산화성 분해를 겪지 않은 아미노산 잔기로 대체된 1개 이상의 메티오닌 잔기를 갖는 항-GITR 항체가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 항체 28F3, 18E10, 19D3, 및 6G10의 CDR에서의 메티오닌 잔기는 산화성 분해를 겪지 않은 아미노산 잔기로 대체된다.
유사하게, 탈아미드화 부위가 항-GITR 항체로부터, 특히 CDR에서 제거될 수 있다.
Fc 및 변형된 Fc
본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은 Fc, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc에 연결 (예를 들어, 공유 연결 또는 융합)될 수 있고, 이는 임의의 동종이형 또는 이소동종이형, 예를 들어 IgG1의 경우에: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); IgG2의 경우에: G2m, G2m23(n); IgG3의 경우에: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); 및 K의 경우에: Km, Km1, Km2, Km3일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1] 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은 1종 이상의 활성화 Fc 수용체 (FcγI, FcγIIa 또는 FcγIIIa)에 결합하는 Fc에 연결되고, 이는 ADCC를 자극하고 T 세포 고갈을 유발할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은 고갈을 유발하는 Fc에 연결된다. 실시예 (실시예 16 및 17)에 추가로 기재된 바와 같이, 마우스 IgG2a 및 래트 IgG2b 이소형 (마우스 활성화 FcR에의 결합에서 마우스 IgG2a의 등가물)은 여러 마우스 종양 모델에서 종양 성장의 최대 억제를 유도하였다. 항-GITR mG2a, mG2b 및 rG2b 이소형은 주변부에서 Treg 집단에 대해 거의 효과를 갖지 않거나 또는 약간의 증가를 유도하는데 반해, 종양 환경에서는 유의한 Treg 고갈을 유도하였고, 이는 종양 성장 억제와 상관되었다. 반대로, mIgG2a 이소형은 종양 부위에서 CD8+ 세포의 백분율을 증가시킨 반면에, mIgG1 및 래트 IgG2b는 CD8+ 세포의 백분율을 전혀 증가시키지 않거나 또는 단지 미미하게 증가시켰다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc에 연결되고, 즉 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소형이다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 고갈 항체이고, 특히 이는 종양 미세환경에 있는 Treg 세포는 고갈시키지만 (이에 따라 항종양 활성이 증진됨), 종양 미세환경에 있는 Teff 세포는 유의하게 고갈시키지 않아 항종양 효과를 매개하고/거나, 종양 외부, 예를 들어 주변부 내에 있는 Treg 및 Teff 세포는 유의하게 고갈시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 종양 부위에서 Treg 세포 고갈 또는 제거 및 Teff 세포의 병행 활성화를 자극하는 (자연 발생 또는 비-자연 발생 (예를 들어, 돌연변이(들) 포함)) 이소형인 이소형의 것이다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 종양 부위에서 강력한 항종양 활성을 나타내는 상승된 Teff 대 Treg 비를 생성하고, 바람직하게는 종양 외부, 예를 들어 주변부 내에서는 Treg 및 Teff 세포를 유의하게 고갈시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 Treg의 면역억제 활성을 차단한다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 FcR 결합을 갖지 않는, 또는 감소된 FcR 결합, 예를 들어 활성화 FcR에 대한 감소된 결합을 갖는 Fc 수용체를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 FcRIIb에 결합하거나 또는 FcRIIb에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 가지며, 이는 증진된 효능작용을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 내인성 면역 반응을 강화하는 항-GITR 항체의 효력은, 항체의 Fc 영역의 활성화 Fc 수용체에 대한 결합이 증진되도록 상기 Fc 영역을 선택, 설계 또는 변형하는 것을 포함하는 방법에 의해 증진되거나, 최적화되거나, 또는 최대화된다. 한 실시양태에서, 항-GITR 항체는 TRX-518이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은 무이펙터 또는 거의 무이펙터 Fc, 예를 들어 IgG2 또는 IgG4에 연결된다.
본원에 기재된 항-GITR 가변 영역은, 예컨대 종양 환경에서 Treg 고갈을 증진시키기 위해 비-자연 발생 Fc 영역, 예를 들어 무이펙터 Fc, 또는 1종 이상의 활성화 Fc 수용체 (FcγI, FcγIIa 또는 FcγIIIa)에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc에 연결될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 가변 영역은, 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 1종 이상의 변형을 포함하는 Fc에 연결될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 항체는 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
Fc 영역은 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함하는, 이뮤노글로불린, 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 도메인을 포괄한다. 적합한 이뮤노글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 다른 부류, 예컨대 IgA, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. 이뮤노글로불린의 불변 영역은 이뮤노글로불린 C-말단 영역과 상동인 자연 발생 또는 합성 제조된 폴리펩티드로서 정의되고, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH4 도메인을 개별적으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
이뮤노글로불린의 불변 영역은 Fc 수용체 (FcR) 결합 및 보체 고정을 포함한 많은 중요한 항체 기능을 담당한다. IgA, IgG, IgD, IgE, IgM으로 분류되는, 중쇄 불변 영역의 5종의 주요 부류가 존재하며, 각각은 이소형에 의해 지정된 특징적인 이펙터 기능을 갖는다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 공지된 4종의 하위부류로 분류된다.
Ig 분자는 세포 수용체의 다중 부류와 상호작용한다. 예를 들어 IgG 분자는 항체의 IgG 부류에 특이적인 Fcγ 수용체 (FcγR)의 3종의 부류, 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII과 상호작용한다. IgG가 FcγR 수용체에 결합하는데 중요한 서열은 CH2 및 CH3 도메인에 위치하는 것으로 보고된 바 있다. 항체의 혈청 반감기는 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 항체의 능력에 의해 영향을 받는다.
특정 실시양태에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역, 예를 들어 바람직한 구조적 특색 및/또는 생물학적 활성을 제공하기 위해 모 Fc 서열 (예를 들어, 변이체를 생성하기 위해 후속 변형되는 비변형된 Fc 폴리펩티드)에 비해 변형된 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의함) Fc 서열이다.
예를 들어, (a) 증가 또는 감소된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), (b) 증가 또는 감소된 보체 매개 세포독성 (CDC), (c) 증가 또는 감소된 C1q에 대한 친화도 및/또는 (d) 모 Fc에 비해 Fc 수용체에 대한 증가 또는 감소된 친화도를 갖는 Fc 변이체를 생성하기 위해 Fc 영역에서 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 Fc 영역 변이체는 일반적으로 Fc 영역에서 적어도 1개의 아미노산 변형을 포함할 것이다. 아미노산 변형의 조합이 특히 바람직한 것으로 생각된다. 예를 들어, 변이체 Fc 영역은 그 안에, 예를 들어 본원에서 확인된 특정 Fc 영역 위치의 2, 3, 4, 5개 등의 치환을 포함할 수 있다.
변이체 Fc 영역은 또한 디술피드 결합 형성에 수반되는 아미노산이 제거되거나 또는 다른 아미노산으로 대체되는 서열 변경을 포함할 수 있다. 이러한 제거는 본원에 기재된 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포에 존재하는 다른 시스테인-함유 단백질과의 반응을 피할 수 있다. 시스테인 잔기가 제거된 경우에도, 단일 쇄 Fc 도메인은 여전히 비-공유적으로 함께 유지되는 이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역은 선택된 숙주 세포와 보다 상용성이도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 소화 효소, 예컨대 프롤린 이미노펩티다제에 의해 인식될 수 있는, 전형적인 천연 Fc 영역의 N-말단 근처의 PA 서열을 제거할 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인 내 1개 이상의 글리코실화 부위가 제거될 수 있다. 전형적으로 글리코실화되는 잔기 (예를 들어, 아스파라긴)는 세포용해 반응을 부여할 수 있다. 이러한 잔기는 결실되거나 비글리코실화된 잔기 (예를 들어, 알라닌)로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 보체와의 상호작용에 수반되는 부위, 예컨대 C1q 결합 부위가 Fc 영역으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 EKK 서열을 결실시키거나 치환할 수 있다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합에 영향을 미치는 부위, 바람직하게는 샐비지 수용체 결합 부위 이외의 부위가 제거될 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역은 ADCC 부위가 제거되도록 변형될 수 있다. ADCC 부위는 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어, IgG1 내 ADCC 부위에 관한 문헌 [Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992)]을 참조한다. 변이체 Fc 도메인의 구체적 예는, 예를 들어, WO 97/34631 및 WO 96/32478에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, Fc의 힌지 영역은 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. Fc의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄와 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 한 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내에 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은, 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것에 의해 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력이 변경된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역을 하기 위치의 1개 이상의 아미노산을 변형시키는 것에 의해 변형하여 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시킬 수 있고/거나 Fcγ 수용체에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 또는 439. 예시적인 치환은 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, 및 332E를 포함한다. 예시적인 변이체는 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, 및 267E/268F/324T를 포함한다. FcyR 및 보체 상호작용을 증진시키기 위한 다른 변형은 치환 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I, 및 396L을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에서 검토되어 있다.
Fcγ 수용체에 대한 결합을 증가시키는 Fc 변형은 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 1개 이상에서의 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같은 EU 인덱스의 것이다 (WO00/42072).
Fc에 대해 이루어질 수 있는 다른 Fc 변형은 FcγR 및/또는 보체 단백질에 대한 결합을 감소 또는 제거하여, Fc-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및 CDC를 감소 또는 제거하는 것이다. 예시적인 변형은 위치 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 및 328에서의 치환, 삽입 및 결실을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 예시적인 치환은 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, 및 328R을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. Fc 변이체는 236R/328R을 포함할 수 있다. FcyR 및 보체 상호작용을 감소시키기 위한 다른 변형은 치환 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, 및 234V, 뿐만 아니라 돌연변이적 또는 효소적 수단에 의한 또는 단백질을 글리코실화하지 않는 유기체, 예컨대 박테리아에서의 생산에 의한 위치 297에서의 글리코실화의 제거를 포함한다. 이들 및 다른 변형은 문헌 [Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691]에 검토되어 있다.
임의로, Fc 영역은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 추가의 및/또는 대안적 위치에서의 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 6,194,551; 7,317,091; 8,101,720; PCT 특허 공개 WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 및 WO 06/020114 참조).
억제 수용체 FcyRllb에 대한 친화도를 증진시키는 Fc 변이체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어 B 세포 및 단핵구를 포함한 FcyRllb+ 세포와 관련된 면역조정 활성을 갖는 Fc 융합 단백질을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 변이체는 1종 이상의 활성화 수용체에 비해 FcyRllb에 대해 선택적으로 증진된 친화도를 제공한다. FcyRllb에 대한 결합을 변경시키기 위한 변형은 EU 인덱스에 따라 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 및 332로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서의 1종 이상의 변형을 포함한다. FcyRllb 친화도를 증진시키기 위한 예시적인 치환은 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, 및 332E를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 치환은 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, 및 328Y를 포함한다. FcyRllb에 대한 결합을 증진시키기 위한 다른 Fc 변이체는 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, 및 267E/328F를 포함한다.
Fc 영역의 그의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은 관련 기술분야에 공지된 다양한 시험관내 검정 방법 (생화학적 또는 면역학적 기반 검정)에 의해 결정될 수 있고, 이는 평형 방법 (예를 들어, 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 방사선면역검정 (RIA)) 또는 동역학적 (예를 들어, 비아코어 분석), 및 다른 방법, 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 억제 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 방법은 검사되는 성분 중 1종 이상에 대한 표지를 이용할 수 있고/거나, 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화도 및 동역학의 상세한 설명은 문헌 [Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘다.
특정 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 이는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같이, 하기 잔기 중 1개 이상 또는 그 초과가 돌연변이 될 수 있다: 252, 254, 256, 433, 435, 436. 구체적인 예시적 치환은 하기 중 1개 이상을 포함한다: T252L, T254S 및/또는 T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증가시키고/거나 약동학적 특성을 개선시키는 다른 예시적인 변이체는 위치 259, 308, 428, 및 434에서의 치환을 포함하고, 이는 예를 들어 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y, 및 434M을 포함한다. FcRn에 대한 Fc 결합을 증가시키는 다른 변이체는 하기를 포함한다: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 31 1 S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). FcRn 결합을 조정하기 위한 다른 변형은 문헌 [Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671]에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 특정한 생물학적 특징을 갖는 하이브리드 IgG 이소형이 사용될 수 있다. 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG1 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 IgG3으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG3 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 그에 따라, 1개 이상의 치환, 예를 들어 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, 및 436F를 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다. 본원에 기재된 다른 실시양태에서, CH2 및/또는 CH3 영역 내 IgG2 위치를 2종의 이소형이 상이한 위치에서의 IgG1으로부터의 아미노산으로 치환함으로써 IgG1/IgG2 하이브리드 변이체를 구축할 수 있다. 따라서 1개 이상의 치환, 예를 들어 하기 아미노산 치환: 233E, 234L, 235L, -236G (위치 236에서의 글리신의 삽입을 지칭함) 및 327A 중 1개 이상을 포함하는 하이브리드 변이체 IgG 항체가 구축될 수 있다.
또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있으며, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, 하기의 조합 돌연변이체: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A가 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 증진된 FcγRIIIa 결합 및 ADCC 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Shields et al., 2001). 시노몰구스 원숭이에서 FcγRIIIa에 대한 친화도의 최대 증가, FcγRIIb 결합의 감소, 및 강력한 세포독성 활성을 보이는, S239D/I332E 및 S239D/I332E/A330L 돌연변이를 갖는 변이체를 포함한, FcγRIIIa에 대해 강력하게 증진된 결합을 갖는 다른 IgG1 변이체가 확인되었다 (Lazar et al., 2006). 알렘투주맙 (CD52-특이적), 트라스투주맙 (HER2/neu-특이적), 리툭시맙 (CD20-특이적), 및 세툭시맙 (EGFR-특이적)과 같은 항체에의 삼중 돌연변이의 도입은 시험관내에서 매우 증진된 ADCC 활성으로 해석되었고, S239D/I332E 변이체는 원숭이에서 B 세포를 고갈시키는 증진된 능력을 나타내었다 (Lazar et al., 2006). 또한, B 세포 악성종양 및 유방암 모델에서, 인간 FcγRIIIa를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 FcγRIIIa에 대한 증진된 결합 및 병행 증진된 ADCC 활성을 나타내는 L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L 돌연변이를 함유하는 IgG1 돌연변이체가 확인된 바 있다 (Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011). 사용될 수 있는 다른 Fc 돌연변이체는 S298A/E333A/L334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L, 및 M428L/N434S를 포함한다.
특정 실시양태에서, FcγR에 대해 감소된 결합을 갖는 Fc가 선택된다. 감소된 FcγR 결합을 갖는 예시적인 Fc, 예를 들어 IgG1 Fc는 하기 3개의 아미노산 치환: L234A, L235E 및 G237A를 포함한다.
특정 실시양태에서, 감소된 보체 고정을 갖는 Fc가 선택된다. 감소된 보체 고정을 갖는 예시적인 Fc, 예를 들어 IgG1 Fc는 하기의 2개의 아미노산 치환: A330S 및 P331S를 갖는다.
특정 실시양태에서, 이펙터 기능을 본질적으로 갖지 않는, 즉 FcγR에 대해 감소된 결합 및 감소된 보체 고정을 갖는 Fc가 선택된다. 무이펙터인 예시적인 Fc, 예를 들어, IgG1 Fc는 하기 5개의 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 포함한다. 이들 돌연변이를 포함하는 예시적인 중쇄가 표 15에 제시된다.
IgG4 불변 도메인을 사용하는 경우에, IgG1의 힌지 서열을 모방함으로써 IgG4 분자를 안정화하는 치환 S228P를 포함시키는 것이 통상적으로 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화된 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내에 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 발생시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 행하여 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
불변 영역의 N297 상에서의 글리코실화는 N297 잔기를 또 다른 잔기로, 예를 들어, N297A로 돌연변이시킴으로써 및/또는 인접한 아미노산, 예를 들어 298을 돌연변이시켜 N297 상의 글리코실화를 감소시킴으로써 방지될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본원에 기재된 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hanai et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착시키는 능력이 감소되어, 또한 숙주 세포에서 발현된 항체를 저푸코실화시키는 변이체 CHO 세포주, Lec13 세포를 기재한다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내고 이는 항체의 증가된 ADCC 활성을 발생시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
본원에 기재된 항체의 또 다른 변형은 PEG화이다. 항체는 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편은 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응된다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
VIII. 항체 물리적 특성
본원에 기재된 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 1개 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 변경되는 항원 결합으로 인해 항체의 증가한 면역원성 또는 항체의 pK 변경을 발생시킬 수 있다 (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 일어나는 것으로 공지되어 있다. 일부 경우에, 가변 영역 글리코실화를 함유하지 않는 항-GITR 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 가변 영역 내에 글리코실화 모티프를 함유하지 않는 항체를 선택하거나, 또는 글리코실화 영역 내의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다. 아스파라긴의 탈아미드화는 N-G 또는 D-G 서열 상에서 일어날 수 있고, 이는 폴리펩티드 쇄 내에 킹크를 도입하고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 발생시킨다 (이소아스파르트산 효과).
각각의 항체는 고유한 등전점 (pI)을 가질 것이고, 이는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 해당한다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위에 해당하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위에 해당한다. 정상 범위를 벗어난 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에 약간의 언폴딩 및 불안정성을 가질 수 있다는 의견이 존재한다. 따라서, 정상 범위에 해당하는 pI 값을 함유하는 항-GITR 항체를 갖는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택하거나 또는 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
각각의 항체는 특징적인 용융 온도를 가질 것이고, 용융 온도가 높을수록 생체내에서 보다 큰 전체적인 안정성을 나타낸다 (Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 일반적으로, TM1 (초기 언폴딩 온도)은 60℃ 초과, 바람직하게는 65℃ 초과, 보다 더 바람직하게는 70℃ 초과인 것이 바람직하다. 항체의 융점은 시차 주사 열량측정 (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) 또는 원형 이색성 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 사용하여 측정될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체가 선택된다. 항체의 분해는 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)를 사용하여 측정될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 원치않는 면역 반응 및/또는 변경된 또는 바람직하지 않은 약동학적 특성의 촉발로 이어질 수 있는 응집 효과를 최소로 갖는 항체가 선택된다. 일반적으로, 응집이 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 더 바람직하게는 15% 이하, 보다 더 바람직하게는 10% 이하, 및 보다 더 바람직하게는 5% 이하인 항체가 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 광 산란을 포함한 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.
IX. 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 VH 및 VL 서열을 갖는 항-GITR 항체는 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 항-GITR 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10의 구조적 특색은 본원에 기재된 항체의 적어도 1종의 기능적 특성, 예컨대 인간 GITR 및 시노몰구스 GITR에 대한 결합을 보유하는 구조적으로 관련된 항-GITR 항체를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10의 1개 이상의 CDR 영역 또는 그의 돌연변이는, 상기 논의된 바와 같이 본원에 기재된 추가의, 재조합적으로-조작된 항-GITR 항체를 생성하기 위해 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합될 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 1개 이상 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 다음, "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서,
(a) (i) 서열식별번호: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, 및 342로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열식별번호: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, 및 343으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열식별번호: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 (ii) 서열식별번호: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, 및 345로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열식별번호: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, 및 346으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열식별번호: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, 및 347로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계;
(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서 적어도 1개의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 1개의 변경된 항체 서열을 생성하는 단계; 및
(c) 변경된 항체 서열을 단백질로 발현시키는 단계
를 포함하는 항-GITR 항체를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는, 하기를 포함하는, 본원에 기재된 항-GITR 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이다:
(1) 예를 들어 비아코어에 의해 측정 시, 가용성 인간 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 KD로 결합함;
(2) 예를 들어 스캐차드에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 KD로 결합함;
(3) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 막 결합된 인간 GITR에 예를 들어 1 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 1 nM)의 EC50으로 결합함;
(4) 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 시노몰구스 GITR에, 예를 들어 막 결합된 시노몰구스 GITR에 예를 들어 10 nM 이하 (예를 들어, 0.01 nM 내지 10 nM)의 EC50으로 결합함;
(5) (i) GITR-발현 T 세포에서의 증가된 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산 및/또는 (ii) 증진된 T 세포 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 예컨대 CD3 맞물림의 존재 하에 (예를 들어, 준최적 항-CD3 농도의 존재 하에) T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(6) 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도 또는 증진시킴;
(7) FACS에 의해 측정 시 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 대한 GITR 리간드의 결합을, 예를 들어 1 μg/ml 이하의 EC50으로 억제함;
(8) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(9) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프, 예를 들어 아미노산 서열 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218) 내의 비연속 에피토프에 결합함;
(10) O-연결 및 N-연결된 글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(11) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(12) 인간 GITR에의 결합에 대해 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및/또는 6G10과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
변경된 항체는 상기 (1) 내지 (12)에서와 같이 제시된 기능적 특성 중 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 또는 모두를 나타낼 수 있다. 변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 이용가능하고/거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 제시된 것 (예를 들어, ELISA, FACS)을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 기재된 항체를 조작하는 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이가 항-GITR 항체 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라서 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 변형된 항-GITR 항체는 본원에 기재된 바와 같이 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용한 방법을 기재한다.
X. 핵산 분자
본원에 기재된 또 다른 측면은 본원에 기재된 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 (예를 들어, 다른 염색체 DNA, 예를 들어 자연에서 단리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게 된다". 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본원에 기재된 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본원에 기재된 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우에, 하이브리도마에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득될 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득되는 항체의 경우에 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술 사용), 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본원에 기재된 바람직한 핵산 분자는 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 것이다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10의 VH 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열이 각각 서열식별번호: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186, 및 353에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 VL 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열은 각각 서열식별번호: 148, 155, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188, 및 354에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2), 및 6G10의 중쇄 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열은 각각 서열식별번호: 149, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189, 및 355에 제시된다. 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 경쇄 서열을 코딩하는 예시적인 DNA 서열은 각각 서열식별번호: 150, 157, 161, 166, 167, 171, 175, 181, 180, 185, 190, 191, 및 356에 제시된다.
28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 (동일한 가변 영역) 항체의 성숙 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 예시적인 핵산은 각각 서열식별번호: 147 및 148에 제시된다. 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 항체의 성숙 중쇄를 코딩하는 예시적인 핵산은 각각 서열식별번호: 151 및 152에 제시되고, 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 항체의 성숙 경쇄를 코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호: 153에 제시된다.
신호 펩티드를 갖는 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 (동일한 가변 영역) 항체의 예시적인 VH 및 VL 도메인은 각각 서열식별번호: 357 및 358에 제시되고, 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 359 및 360에 제시된다.
신호 펩티드를 갖는 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 항체의 예시적인 중쇄는 각각 서열식별번호: 361 및 362에 제시되고, 이들을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 서열식별번호: 363 및 364에 제시된다. 신호 펩티드를 갖는 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1 항체의 예시적인 경쇄는 서열식별번호: 365에 제시되고, 이를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 366에 제시된다.
28F3.IgG1을 제조하는 방법은 신호 펩티드를 갖는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 각각 서열식별번호: 363 및 365를 포함하는 세포주에서 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 28F3.IgG1.1을 제조하는 방법은 신호 펩티드를 갖는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 각각 서열식별번호: 364 및 366을 포함하는 세포주에서 중쇄 및 경쇄를 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포는 본원에 포괄된다.
VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (힌지, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예를 들어 IgG1 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결하여, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조).
또한, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10 모노클로날 항체의 것과 상동인 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 예시적인 핵산 분자는 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10 모노클로날 항체의 VH 및 VL 서열을 코딩하는 핵산 분자와 적어도 70% 동일한, 예를 들어 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 서열을 코딩한다. 또한, 예를 들어 코돈 최적화를 위해, 보존적 치환 (즉, 핵산 분자의 번역시 생성되는 아미노산 서열을 변경시키지 않는 치환)을 갖는 핵산 분자가 본원에 제공된다.
XI. 항체 생산
본원에 기재된 모노클로날 항체는 다양한 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 표준 체세포 혼성화 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙적으로는, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환, 인간 항체 유전자의 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술이 또한 이용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하는데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본원에 기재된 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조)).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 모노클로날 항체이다. GITR에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로 지칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 거쳐 높은 친화도의 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌; 문헌 [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMab 마우스의 제조 및 용도, 및 이러한 마우스가 보유하는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 이들 모두의 내용은 구체적으로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가로 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성된다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안의 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본원에 기재된 항-GITR 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고 본원에 기재된 항-GITR 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 추가로, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있고 (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), 본원에 기재된 항-GITR 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
인간 항체, 예를 들어 인간 항-GITR 항체를 생성하기 위한, 관련 기술분야에 기재된 추가의 마우스 시스템은 (i) 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역이, 상동 재조합을 통해, 내인성 마우스 불변 영역에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 대체되어, 키메라 항체 (인간 V/마우스 C)가 마우스에서 생성되고, 이어서 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 완전 인간 항체로 후속 전환되는, 벨로크이뮨(VelocImmune)® 마우스 (레게네론 파마슈티칼스, 인크.(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)); 및 (ii) 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 및 단일 재배열된 인간 공통 경쇄 가변 영역을 함유하는 마우스인 메모(MeMo)® 마우스 (메루스 바이오파마슈티칼스, 인크.(Merus Biopharmaceuticals, Inc.))를 포함한다. 이러한 마우스, 및 항체를 생성하기 위한 그의 용도가, 예를 들어, WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 및 US 2012/0073004에 기재되어 있다.
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
면역화
GITR에 대한 완전 인간 항체를 생성하기 위해, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스 (예를 들어, HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)는, 다른 항원에 대해 예를 들어 문헌 [Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 WO 98/24884]에 기재된 바와 같이, GITR 항원 및/또는 GITR 또는 그의 단편을 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부화된 제제로 면역화될 수 있다. 대안적으로, 마우스는 인간 GITR 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입 시 6-16주령일 것이다. 예를 들어, 재조합 GITR 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제 (5-50 μg)가 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시키는데 사용될 수 있다. GITR 항원의 정제된 또는 풍부화된 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않는 사건에서, 마우스는 또한 면역 반응을 촉진하기 위해 GITR을 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화될 수 있다. 예시적인 세포주는 GITR-과다발현 안정한 CHO 및 Raji 세포주를 포함한다.
다양한 항원을 사용한 누적 경험은 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 리비(Ribi) 아주반트 중의 항원에 의해 복강내로 (IP) 또는 피하로 (SC) 초기 면역화된 다음, 격주로 리비 아주반트 중의 항원에 의해 IP/SC 면역화 (최대 총 10회)되는 경우에 최상으로 반응한다는 것을 제시한 바 있다. 면역 반응은 안와후 채혈에 의해 수득되는 혈장 샘플을 사용하여 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장은 ELISA 및 FACS (하기 기재된 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있고, 충분한 역가의 항-GITR 인간 이뮤노글로불린을 갖는 마우스가 융합을 위해 사용될 수 있다. 마우스는 희생 및 비장 및 림프절 제거 3일 전에 항원으로 정맥내로 부스팅될 수 있다. 각각의 면역화를 위해 2-3회 융합이 수행될 필요가 있을 수 있는 것으로 예상된다. 각각의 항원에 대해 전형적으로 6 내지 24마리의 마우스를 면역화한다. 통상적으로, HCo7, HCo12, 및 KM 계통이 사용된다. 또한, HCo7 및 HCo12 둘 다의 트랜스진이 2종의 상이한 인간 중쇄 트랜스진을 갖는 단일 마우스로 함께 교배될 수 있다 (HCo7/HCo12).
GITR에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본원에 기재된 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성되는 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을 50% PEG를 갖는 Sp2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581)에 융합시킬 수 있다. 세포를 대략 2 x 105개로 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고, 이어서 10% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마)를 함유하는 선택 배지에서 2주 인큐베이션한다. 대략 2주 후에, HAT를 HT로 대체한 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10-14일 후에 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 한계 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에 특징화를 위한 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.
GITR에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
항체는, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나 또는 둘 다의 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터(들) 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
예시적 실시양태에서, 인간 항체 중쇄 및 경쇄로부터의 하기 신호 펩티드가 사용될 수 있다:
항-GITR 항체의 중쇄 및 경쇄는 이들이 클로닝된 하이브리도마에서 각각의 쇄에 연결된 각각의 신호 서열과 함께 발현될 수 있다. 이들이 클로닝된 하이브리도마에 존재하는 다양한 항-GITR 항체의 신호 서열이 하기 제시되고, 신호 서열은 동일한 항체 또는 또 다른 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다:
28F3 VH 신호 서열:
28F3 VL 신호 서열:
18E10 VH 신호 서열:
18H10 VL 신호 서열:
19D3 VH 신호 서열:
19D3 VL 신호 서열:
3C3 VH 신호 서열:
3C3 VL1 신호 서열:
3C3 VL2 신호 서열:
8A6 VH 신호 서열:
8A6 VL 신호 서열:
9G7 VH 신호 서열:
9G7 VL1 및 VL2 신호 서열:
14E3 VH 신호 서열:
14E3 VL 신호 서열:
19H8VH 신호 서열:
19H8 VL1 신호 서열:
19H8 VL2 신호 서열:
6G10 VH 신호 서열:
6G10 VL 신호 서열:
신호 서열 MRAWIFFLLCLAGRALA (서열식별번호: 367)는 중쇄 및 경쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다.
중쇄 및 경쇄 또는 그의 부분, 예컨대 표 15에 제공된 것은 본원에 제공된 신호 서열에 연결될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 서열식별번호: 13, 15, 17, 또는 18을 포함하는 28F3 중쇄 또는 그의 가변 영역은 MEFGLSWVFLVALLRGVQC (서열식별번호: 315) 또는 MRAWIFFLLCLAGRALA (서열식별번호: 367)를 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩티드에 연결 또는 융합될 수 있다. 예를 들어 서열식별번호: 14, 16, 또는 19를 포함하는 28F3 경쇄 또는 그의 가변 영역은 MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (서열식별번호: 317) 또는 MRAWIFFLLCLAGRALA (서열식별번호: 367)를 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩티드에 연결 또는 융합될 수 있다.
항체 쇄 유전자에 더하여, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대 SV40초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRα 프로모터 시스템으로 구성된다 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서의 사용을 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것은 이론상 가능하지만, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 바람직하며, 이는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 높은 수율의 활성 항체의 생산에 비효과적인 것으로 보고된 바 있다 (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본원에 기재된 재조합 항체의 발현을 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한, 또 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입한 경우에, 항체는, 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하는데, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하는데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
XII. 검정
본원에 기재된 항체는 GITR에 대한 결합에 대해, 예를 들어 표준 ELISA에 의해 시험될 수 있다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트를 정제된 GITR으로 PBS 중 1-2 μg/ml로 코팅한 다음, PBS 중 5% 소 혈청 알부민으로 차단한다. 항체의 희석액 (예를 들어, GITR-면역화된 마우스로부터의 혈장의 희석액)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세척한 다음, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 2차 시약 (예를 들어, 인간 항체의 경우에 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약)과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척한 후, 플레이트를 ABTS 기질 (모스 인크.(Moss Inc.), 제품: ABTS-1000)로 발색시키고 OD 415-495에서 분광광도계에 의해 분석한다. 이어서, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 유동 세포측정법에 의해 GITR을 발현하지 않는 대조 세포주가 아닌, 인간 GITR을 발현하는 세포주에 대한 결합에 대해 추가로 스크리닝한다. 간략하게, 항-GITR 항체의 결합은 GITR 발현 CHO 세포를 항-GITR 항체와 1:20 희석으로 인큐베이션함으로써 평가된다. 세포를 세척하고 결합을 PE-표지된 항-인간 IgG Ab로 검출한다. 유동 세포측정 분석은 FACScan 유동 세포측정법 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 캘리포니아주 산호세)을 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 최고 역가를 발생시킨 마우스가 융합을 위해 사용될 것이다.
상기 기재된 ELISA 검정을 사용하여 GITR 면역원과의 양성 반응성을 제시하는 항체, 및 그에 따라 항체를 생산하는 하이브리도마가 스크리닝될 수 있다. 이어서 바람직하게는 높은 친화도로 GITR에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 서브클로닝하고 추가로 특징화할 수 있다. 이어서 (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 1종의 클론이 세포 은행의 제조를 위해, 및 항체 정제를 위해 선택될 수 있다.
항-GITR 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용리된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 체크할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환하고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고, -80℃에서 저장할 수 있다.
선택된 항-GITR 모노클로날 항체가 고유한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드)을 사용하여 비오티닐화할 수 있다. 비오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 비표지된 모노클로날 항체 및 비오티닐화된 모노클로날 항체를 사용하는 경쟁 연구를 상기 기재된 바와 같이 GITR 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 특정한 이소형의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체의 이소형을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 1 μg/ml의 항-인간 이뮤노글로불린으로 4℃에서 밤새 코팅시킬 수 있다. 1% BSA로 차단시킨 후, 플레이트를 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 1 μg /mL 이하의 시험 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 발색시키고 분석한다.
모노클로날 항체가 GITR을 발현하는 살아있는 세포에 결합하는 것을 시험하기 위해, 유동 세포측정법을 실시예에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 간략하게, 막-결합된 GITR을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장됨)를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 4℃에서 1시간 동안 혼합한다. 세척한 후, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항- IgG 항체와 반응시킨다. 단세포에 대해 게이팅하기 위해 광 및 측방 산란 특성을 사용하여 FACScan 기기에 의해 샘플을 분석할 수 있고 표지된 항체의 결합이 결정된다. 형광 현미경검사를 사용한 대안적 검정이 유동 세포측정 검정(에 더하여 또는 그 대신에) 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색되고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 이러한 방법은 개별 세포의 가시화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 감수성을 가질 수 있다.
항-GITR 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 GITR 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, GITR을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 20% 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙할 것이다. IgG 결합은 항-IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 켐. 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.
다양한 항-GITR 항체의 결합 친화도, 교차-반응성, 및 결합 동역학을 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예를 들어 비아코어™ 2000 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기기 (비아코어 아베, 스웨덴 웁살라)를 사용하는 비아코어™ SPR 분석을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 인간 GITR의 세포외 영역에 특이적으로 결합한다. 항체는 GITR의 세포외 도메인 내의 특정한 도메인 (예를 들어, 기능적 도메인)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항체는 GITR-L이 결합하는 GITR 상의 부위에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 GITR의 세포외 영역 및 시노몰구스 GITR의 세포외 영역에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 인간 GITR에 높은 친화도로 결합한다.
XIII. 면역접합체, 항체 유도체 및 진단
본원에 기재된 항체는 샘플 시험 및 생체내 영상화를 포함한 진단 목적에 사용될 수 있고, 이러한 목적을 위해 항체 (또는 그의 결합 단편)를 적절한 검출가능한 작용제에 접합시켜 면역접합체를 형성할 수 있다. 진단 목적을 위한 적절한 작용제는 전신 영상화를 위한 방사성동위원소, 및 샘플 시험을 위한 방사성동위원소, 효소, 형광 표지 및 다른 적합한 항체 태그를 포함하는 검출가능한 표지이다.
검출가능한 표지는, 금속 졸, 예컨대 콜로이드성 금, 동위원소 예컨대 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 유형의 펩티드성 킬레이트화제와 함께 제공되는 I125 또는 Tc99, 형광 마커, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함한 발색단을 포함한 미립자 표지, 뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환시키는 효소 표지, 및 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 증폭 후에 나타나는 폴리뉴클레오티드 태그를 포함하는, 시험관내 진단학 분야에서 현재 사용되는 임의의 다양한 유형일 수 있다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2 디옥세탄 기질 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄 (AMPPD), 디소듐 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일) 페닐 포스페이트 (CSPD), 뿐만 아니라 CDP 및 CDP-스타(CDP-star)® 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 적합한 란타나이드 예컨대 테르븀(III) 및 유로퓸(III)의 킬레이트의 전환 후에 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는, 효소 알칼리성 포스파타제일 수 있다. 검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그의 반응 생성물의 출현은 표지가 미립자이고 적절한 수준으로 축적된 경우에는 육안을 사용하여, 또는 분광광도계, 발광측정기, 형광계 등과 같은 기기를 모두 표준 관례에 따라 사용하여 달성할 수 있다.
바람직하게는, 접합 방법은 실질적으로 (또는 거의) 비-면역원성인 연결, 예를 들어 펩티드- (즉 아미드-), 술피드-, (입체 장애), 디술피드-, 히드라존-, 및 에테르 연결을 발생시킨다. 이들 연결은 거의 비-면역원성이고, 혈청 내에서 합리적인 안정성을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244]; WO 2009/059278; WO 95/17886 참조).
모이어티 및 항체의 생화학적 성질에 따라, 상이한 접합 전략이 사용될 수 있다. 모이어티가 50 내지 500개 아미노산의 자연 발생 또는 재조합인 경우에, 단백질 접합체의 합성을 위한 화학을 기재한 텍스트 북에 표준 절차가 존재하고, 이는 통상의 기술자가 용이하게 따를 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074] 참조). 한 실시양태에서, 말레인이미도 모이어티와 항체 또는 모이어티 내의 시스테인 잔기의 반응이 사용된다. 이는, 예를 들어 항체의 Fab 또는 Fab'-단편이 사용되는 경우에, 특히 적합한 커플링 화학이다. 대안적으로 한 실시양태에서, 항체 또는 모이어티의 C-말단 단부에의 커플링이 수행된다. 예를 들어 Fab-단편의 단백질의 C-말단 변형이 예를 들어 기재된 바와 같이 수행될 수 있다 (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).
일반적으로, 부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 천연 아미노산을, 존재하는 다른 관능기의 반응성과 직교하는 반응성을 갖는 아미노산으로 변환하는 것에 기초한다. 예를 들어, 드문 서열 맥락 내의 특정 시스테인은 알데히드에서 효소적으로 전환될 수 있다 (문헌 [Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427] 참조). 또한, 주어진 서열 맥락에서 천연 아미노산과 함께 특정 효소의 특이적 효소 반응성을 사용함으로써 목적하는 아미노산 변형을 수득하는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136] 참조; 문헌 [Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403]에는 프로테아제-촉매된 C--N 결합의 형성이 사용됨).
부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 또한 말단 아미노산과 적절한 변형 시약의 선택적 반응에 의해 달성될 수 있다.
N-말단 시스테인과 벤조니트릴의 반응성 (문헌 [Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662] 참조)을 사용하여 부위-특이적 공유 커플링을 달성할 수 있다.
천연 화학적 라이게이션은 또한 C-말단 시스테인 잔기에 의존할 수 있다 (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).
EP 1 074 563은 양으로 하전된 아미노산의 스트레치에 위치하는 시스테인보다 음으로 하전된 아미노산의 스트레치 내의 시스테인의 보다 신속한 반응에 기초한 접합 방법을 기재한다.
모이어티는 또한 합성 펩티드 또는 펩티드 모방체일 수 있다. 폴리펩티드가 화학적으로 합성되는 경우에, 직교 화학적 반응성을 갖는 아미노산이 이러한 합성 동안 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295] 참조). 매우 다양한 직교 관능기가 존재하고 합성 펩티드 내로 도입될 수 있기 때문에, 이러한 펩티드의 링커에의 접합은 표준 화학이다.
단일-표지된 폴리펩티드를 수득하기 위해, 1:1 화학량론을 갖는 접합체를 크로마토그래피에 의해 다른 접합 부산물로부터 분리할 수 있다. 이러한 절차는 염료 표지된 결합 쌍 구성원 및 하전된 링커를 사용함으로써 용이해질 수 있다. 전하 및 분자량의 차이가 분리를 위해 사용될 수 있기 때문에, 이러한 종류의 표지되고 고도로 음으로 하전된 결합 쌍 구성원을 사용함으로써, 단일 접합된 폴리펩티드는 비-표지된 폴리펩티드 및 1개 초과의 링커를 보유하는 폴리펩티드로부터 용이하게 분리된다. 형광 염료는 표지된 1가 결합제와 같이, 비-결합 성분으로부터 복합체를 정제하는데 유용할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-GITR 항체에 부착되는 모이어티는 결합 모이어티, 표지 모이어티, 및 생물학적 활성 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 항체는 또한 치료제에 접합되어 면역접합체, 예컨대 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항대사물, 알킬화제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 쇼크 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제 및 항유사분열제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 절단가능한 링커, 예컨대 펩티딜, 디술피드, 또는 히드라존 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 펩티딜 링커, 예컨대 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 219), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu이다. ADC는 미국 특허 번호 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공개 20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
항-GITR 항체, 예를 들어 본원에 기재된 것은 또한 GITR, 예컨대 인간 GITR, 예를 들어 조직 또는 조직 샘플 내 인간 GITR을 검출하는데 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 세포, 예를 들어 조직 내 세포와, 특이적 결합이 발생하는 적절한 시간 동안 접촉되고, 이어서 시약, 예를 들어 항-GITR 항체를 검출하는 항체가 첨가된다. 예시적인 검정이 실시예에 제공된다. 항-GITR 항체는 완전 인간 항체일 수 있거나, 또는 키메라 항체, 예컨대 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 갖는 항체 또는 그의 부분일 수 있다. 샘플 (세포 또는 조직 샘플)에서 GITR, 예를 들어 인간 GITR을 검출하는 예시적인 방법은 (i) 샘플을 항-GITR 항체와, 샘플에서 항-GITR 항체의 GITR에 대한 특이적 결합을 허용하는 충분한 시간 동안 접촉시키고, (2) 샘플을 검출 시약, 예를 들어 항-GITR 항체, 예컨대 항-GITR 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜, 항-GITR 항체에 의해 결합된 GITR을 검출하는 것을 포함한다. 세척 단계가 항체 및/또는 검출 시약과의 인큐베이션 후에 포함될 수 있다. 별개의 검출 작용제가 사용될 수 있기 때문에, 이들 방법에 사용하기 위한 항-GITR 항체는 표지 또는 검출 작용제에 연결되어야 하는 것은 아니다.
예를 들어 단독요법 또는 조합 요법으로서 항-GITR 항체의 다른 용도가 본원의 다른 곳에, 예를 들어 조합 치료에 관한 섹션에 제공된다.
XIV. 이중특이적 분자
본원에 기재된 항체는 이중특이적 분자를 형성하는데 사용될 수 있다. 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 조합 치료를 위한 잠재적 표적으로서 사용될 수 있는 임의의 단백질, 예컨대 본원에 기재된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 scFv에 연결될 수 있다 (예를 들어, PD-1, PD-L1, 또는 LAG-3에 대한 항체). 본원에 기재된 항체는 실제로, 1종 초과의 다른 기능적 분자로 유도체화되거나 또는 이에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본원에 기재된 항체는 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 그 이외의 것에 의함) 이중특이적 분자를 발생시킬 수 있다.
따라서, GITR에 대한 적어도 1종의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 본원에 제공된다. 이중특이적 분자가 다중특이적인 본원에 기재된 한 실시양태에서, 분자는 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 적어도 1종의 항체, 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv (scFv)를 포함한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있고, 그의 내용은 명확하게 참조로 포함된다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본원에 기재된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본원에 기재된 이중특이적 분자는 구성성분 결합 특이체를 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC이며, 둘 다는 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)로부터 입수가능하다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이들을 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합을 통해 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 둘 다의 결합 특이체가 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 이중특이적 항체는 각각의 중쇄의 C-말단에 scFv를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은 관련 기술분야-인식 방법, 예컨대 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
XV. 조성물
제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 기재된 항-GITR 항체 중 1종 또는 그의 조합 또는 다른 표적에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들)과의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물이 추가로 제공된다. 이러한 조성물은 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 항체 중 1종 또는 그의 조합, 또는 본원에 기재된 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 또는 상보적 활성을 갖는 항체 (또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조성물은 항-GITR 항체를 적어도 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml, 또는 100-300 mg/ml의 농도로 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 1종의 다른 항암제 및/또는 T-세포 자극제 (예를 들어, 활성화제)와 조합된 본원에 기재된 항-GITR 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법으로 사용될 수 있는 치료제의 예는 본원에 기재된 항체의 용도에 관한 하기 섹션에서 보다 상세하게 기재된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 조성물은 암 치료에 사용되는 다른 화합물, 약물, 및/또는 작용제를 포함할 수 있다. 이러한 화합물, 약물 및/또는 작용제는, 예를 들어 화학요법 약물, 소분자 약물, 또는 주어진 암에 대한 면역 반응을 자극하는 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 조성물은 예를 들어 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-OX40 (또한 CD134, TNFRSF4, ACT35 및/또는 TXGP1L로도 공지됨) 항체, 항-CD137 항체, 또는 항-LAG-3 항체 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본원에 기재된 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본원에 기재된 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한, 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기의 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수를 달성할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본원에 기재된 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 제약 조성물은 보존제를 포함할 수 있거나, 보존제가 없을 수 있다. 보충 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로, 제작 및 저장 조건 하에 멸균이고 안정적이어야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써, 주사가능한 조성물의 지속 흡수를 달성할 수 있다.
적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 혼입시킨 다음, 멸균 마이크로여과함으로써, 멸균 주사가능한 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 본원에 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 플러스 이전의 그의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료하고자 하는 대상체, 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100 퍼센트 중에서, 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99 퍼센트의 범위, 바람직하게는 활성 성분 약 0.1% 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 시간의 경과에 따라 투여할 수 있거나 또는 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각 단위는 목적하는 제약 담체와 연합하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본원에 기재된 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감수성을 처리하기 위해 이러한 활성 화합물의 배합 기술분야에 내재된 제한사항에 의해 좌우되고 직접적으로 그에 의존한다.
항체를 투여하는 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 5 또는 10 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중, 또는 1-10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 수반한다. 본원에 기재된 항-GITR 항체에 대한 바람직한 투여 요법은 정맥내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하며, 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 투여량 동안 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중.
항-GITR 항체는 균일 용량으로 투여될 수 있다 (균일 용량 요법).
일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 이 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 표시된 범위 내에 속한다. 항체는 통상적으로 다중 투여된다. 단일 투여 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 제시되는 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 약 1-1000 μg/ml의 혈장 항체 농도 및 일부 방법에서 약 25-300 μg/ml를 달성하도록 투여량이 조정된다.
항-GITR 항체는 다른 항체의 투여 요법에 또 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 항-PD-1 항체, 예컨대 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO))과 함께, 질환 진행 또는 허용되지 않는 독성이 발생할 때까지 2주마다 60분에 걸쳐서 i.v. 주입으로서 투여될 수 있다. 항-GITR 항체는 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA))과 함께, 질환 진행 또는 허용되지 않는 독성이 발생할 때까지 3주마다 30분에 걸쳐서 i.v. 주입으로서 투여될 수 있다.
항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이러한 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 제시하고, 이어서 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서는, 비교적 적은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 여생 동안 계속 치료받는다. 치료적 적용에서는, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 제시할 때까지 비교적 짧은 간격으로의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법이 투여될 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 아니면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 본원에 기재된 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 다른 인자를 포함한 다양한 약동학적 인자에 의존할 것이다.
본원에 기재된 항-GITR 항체의 "치료 유효 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 증상 부재 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 발생시킨다. 암과 관련해서, 치료 유효 용량은 바람직하게는 증가된 생존, 및/또는 암과 연관된 신체 증상의 추가 악화의 방지를 발생시킨다. 암의 증상은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 비통상적 모반 특색, 비대칭, 경계, 색상 및/또는 직경을 포함한 모반의 외관에서의 변화, 새롭게 착색된 피부 영역, 비정상적 모반, 손발톱 아래의 거무스름한 영역, 유방 종괴, 유두 변화, 유방 낭, 유방 통증, 사망, 체중 감소, 쇠약, 지나친 피로, 섭식 곤란, 식욕 상실, 만성 기침, 호흡곤란 악화, 객혈, 혈뇨, 혈변, 오심, 구토, 간 전이, 폐 전이, 골 전이, 복부 포만감, 복부팽창, 복막액, 질 출혈, 변비, 복부 팽만, 결장 천공, 급성 복막염 (감염, 열, 통증), 통증, 토혈, 다한, 열, 고혈압, 빈혈, 설사, 황달, 어지럼증, 오한, 근육 연축, 결장 전이, 폐 전이, 방광 전이, 간 전이, 골 전이, 신장 전이, 및 췌장 전이, 삼킴 곤란 등을 포함한다.
치료 유효 용량은 암의 발병을 방지 또는 지연시킬 수 있고, 예컨대 질환의 초기 또는 예비 징후가 존재하는 경우에 바람직할 수 있다. 암을 진단하는데 사용되는 실험실 시험은 화학 (GITR 수준의 측정 포함), 혈액학, 혈청학 및 방사선학을 포함한다. 따라서, 상기 중 임의의 것을 모니터링하는 임의의 임상적 또는 생화학적 검정을 사용하여, 특정한 치료가 암을 치료하기 위한 치료 유효 용량인지 여부를 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도, 및 선택된 특정한 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 1종 이상을 사용하여 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 항체에 대한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 경장 및 국소 투여 이외의, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본원에 기재된 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은 화합물의 급속 방출을 방지할 담체와 함께, 예컨대 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법이 특허되었거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 관련 기술분야에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 항-GITR 항체와 함께 사용하기 위한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 의약을 제어된 속도로 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참조로 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 생체 내에서 적당한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본원에 기재된 치료 화합물이 (경우에 따라, 예를 들어 뇌암의 경우에) BBB를 가로지르기 위해서는, 이들을, 예를 들어 리포솜에 제제화시킬 수 있다. 리포솜을 제작하는 방법에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1종 이상의 모이어티를 포함할 수 있으므로, 표적화된 약물 전달을 증강시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 엽산 또는 비오틴 [예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조]; 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
XVI. 용도 및 방법
본원에 기재된 항체, 항체 조성물 및 방법은, 예를 들어 GITR 신호전달을 활성화시키는 것에 의한 면역 반응의 증진 또는 GITR의 검출을 수반하는, 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 시험관내 또는 생체외에서 배양물 내의 세포에 투여되거나, 또는 예를 들어 생체내에서 인간 대상체에 투여되어, 다양한 질환에서 면역을 증진시킬 수 있다. 따라서, 대상체에서 면역 반응이 변형되도록 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 변형시키는 방법이 본원에 제공된다. 바람직하게는, 반응은 증진, 자극 또는 상향-조절된다.
바람직한 대상체는 면역 반응의 증진이 바람직할 인간 환자를 포함한다. 방법은 면역 반응 (예를 들어, T-세포 매개 면역 반응, 예를 들어 항원 특이적 T 세포 반응)을 증대시킴으로써 치료될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 특정한 실시양태에서, 방법은 생체내 암의 치료에 특히 적합하다. 면역의 항원-특이적 증진을 달성하기 위해, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 관심 항원과 함께 투여될 수 있거나 또는 항원이 치료할 대상체 (예를 들어, 종양-보유 또는 바이러스-보유 대상체)에 이미 존재할 수 있다. GITR에 대한 항체가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우에, 2종은 개별적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
또한, 샘플 및 대조군 샘플을 인간 GITR에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 예를 들어 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 항체 또는 그의 부분과 인간 GITR 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 인간 GITR 항원의 존재를 검출하는 방법, 또는 인간 GITR 항원의 양을 측정하는 방법이 포괄된다. 이어서, 복합체의 형성이 검출되며, 여기서 대조군 샘플과 비교 시 샘플 사이의 복합체 형성에서의 차이는 샘플 중 인간 GITR 항원의 존재를 나타낸다. 또한, 본원에 기재된 항-GITR 항체를 사용하여 면역친화성 정제를 통해 인간 GITR을 정제할 수 있다.
본원에 기재된 항-GITR 항체가 T 세포 반응, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 반응을 자극 또는 공동-자극하는 능력을 고려하여, 항원-특이적 T 세포 반응, 예를 들어 항종양 T 세포 반응을 자극, 증진 또는 상향조절하기 위해 본원에 기재된 항체를 시험관내 및 생체내 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, CD3 자극이 또한 제공되며 (예를 들어, 막 CD3을 발현하는 세포와의 공동인큐베이션에 의함), 자극은 항-GITR 항체에 의한 자극과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 제공될 수 있다. 예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 상기 T 세포를 본원에 기재된 항-GITR 항체, 및 임의로 항-CD3 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 항원-특이적 T 세포 반응의 임의의 적합한 지표가 항원-특이적 T 세포 반응을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 적합한 지표의 비제한적 예는 항체의 존재 하의 증가된 T 세포 증식 및/또는 항체의 존재 하의 시토카인 생산의 증가를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항원-특이적 T 세포에 의해 인터류킨-2 및/또는 인터페론-γ 생산이 자극된다.
항-GITR 항체에 의해 증진 또는 공동-자극될 수 있는 T 세포는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. T 세포는 Teff 세포, 예를 들어 CD4+ Teff 세포, CD8+ Teff 세포, T헬퍼 (Th) 세포 및 T 세포독성 (Tc) 세포일 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 항-GITR 항체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)이 자극되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응)을 자극하는 방법이 포괄된다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 종양-보유 대상체이고, 종양에 대한 면역 반응이 자극된다. 종양은 고형 종양 또는 액상 종양, 예를 들어, 혈액학적 악성 종양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양은 면역원성 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 비-면역원성이다. 특정 실시양태에서, 종양은 PD-L1 양성이다. 특정 실시양태에서, 종양은 PD-L1 음성이다. 대상체는 또한 바이러스-보유 대상체일 수 있고 바이러스에 대한 면역 반응이 자극된다.
본원에 기재된 항-GITR 항체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 대상체에서 바이러스 감염이 치료되도록 본원에 기재된 항-GITR 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
또한, 종양 미세환경에서 Treg 세포의 고갈을 자극하는 Fc를 포함하는 본원에 기재된 항-GITR 항체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양, 예를 들어 암성 종양을 갖는 대상체의 종양 미세환경으로부터 Treg 세포를 고갈시키는 방법이 본원에 포괄된다. Fc는 예를 들어, 이펙터 기능 또는 증진된 이펙터 기능, 예컨대 1종 이상의 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 또는 그에 대한 증진된 결합을 갖는 Fc일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, Treg 고갈은 종양 미세환경에서 Teff의 유의한 고갈 또는 억제 없이, 및 종양 미세환경 외부, 예를 들어 주변부에서 Teff 세포 및 Treg 세포의 유의한 고갈 또는 억제 없이 발생한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 예를 들어 종양 미세환경에서 Teff 세포 상에서보다 Treg 세포 상에서 보다 높은 수준의 GITR을 갖는다.
특정 실시양태에서, 대상체는 효능작용을 증진시키는, 예를 들어 억제 FcRIIb에 결합하거나 그에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 갖는 항-GITR 항체에 의해 치료된다. 1종 이상의 활성화 FcR에 결합하지 않거나 또는 그에 대해 감소된 결합을 갖는 Fc를 갖는 항-GITR 항체에 의해 특정 치료가 수행된다. 항-GITR 항체는 종양에서 Treg 및/또는 종양 침윤 림프구 (TIL)에서 Treg을 고갈시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 보조 요법으로서 대상체에게 제공된다. 암을 갖는 대상체를 항-GITR 항체로 치료하는 것은 현행 표준 관리에 비해 연장된 생존, 예를 들어 장기간 지속적인 반응; 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 1, 2, 3, 4, 5, 10년 또는 그 초과의 장기간 생존, 또는 적어도 3개월, 6개월, 9개월, 1, 2, 3, 4, 5 또는 10년 또는 그 초과의 무재발 생존으로 이어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 암을 갖는 대상체를 항-GITR 항체로 치료하는 것은 암의 재발을 방지하거나 또는 암의 재발을, 예를 들어 3개월, 6개월, 9개월, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10년 또는 그 초과만큼 지연시킨다. 항-GITR 치료는 1차, 2차 또는 3차 치료로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 유의하게 독성이 아니다. 예를 들어, GITR 항체는, 예를 들어 임상 시험에서 결정하였을 때 인간의 기관에 대해, 예를 들어 간, 신장, 뇌, 폐 및 심장 중 하나 이상에 대해 유의하게 독성이 아니다. 특정 실시양태에서, GITR 항체는 바람직하지 않은 면역 반응, 예를 들어 자가면역 또는 염증을 유의하게 촉발시키지 않는다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 효능제 (예를 들어, 항-GITR 항체)에 의한 대상체의 치료는 대상체의 면역계가 이후 대상체 자신을 공격하거나 (예를 들어, 자가면역 반응) 또는 예를 들어 아나필락시스를 발생시키는 정도로 면역계의 과다자극을 발생시키지 않는다. 따라서, 항-GITR 항체는 바람직하게는 아나필락시스를 유발하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체에 의한 대상체의 치료는 유의한 염증 반응, 예를 들어 면역-매개 폐장염, 면역-매개 결장염, 면역-매개 간염, 면역-매개 신염 또는 신장 기능장애, 면역-매개 뇌하수체염, 면역-매개 갑상선기능저하증 및 갑상선기능항진증, 또는 다른 면역-매개 유해 반응을 유발하지 않는다. 특정 실시양태에서, 28F3의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-GITR 항체는 다른 항-GITR 항체보다 더 적은 염증 반응, 예를 들어 면역-매개 폐장염, 면역-매개 결장염, 면역-매개 간염, 면역-매개 신염 또는 신장 기능장애, 면역-매개 뇌하수체염, 면역-매개 갑상선기능저하증 및 갑상선기능항진증, 아나필락시스 또는 다른 면역-매개 유해 반응을 유발한다. 다른 면역-매개 유해 반응은 심장 장애, 예를 들어 심실성 부정맥; 눈 장애, 예를 들어 홍채모양체염; 주입-관련 반응; 증가된 아밀라제, 증가된 리파제; 신경계 장애, 예를 들어 어지럼증, 말초 및 감각 신경병증; 피부 및 피하 조직 장애, 예를 들어 발진, 소양증, 박탈성 피부염, 다형성 홍반, 백반증 또는 건선; 호흡, 흉부 및 종격 장애, 예를 들어 기침; 피로; 오심; 식욕 감소; 변비; 관절통; 및 설사를 포함한다.
특정 실시양태에서, GITR 항체는 또 다른 암 요법, 예컨대 면역계를 자극하는 화합물 (예를 들어, 면역-종양학 작용제), 예를 들어 본원에 기재된 화합물 또는 본원에 기재된 표적을 조정하는 화합물과 조합되어 상승작용적 항종양 효과를 제공한다.
본원에 기재된 이들 및 다른 방법이 하기에 추가로 상세히 논의된다.
암
항-GITR 항체에 의한 GITR의 활성화는 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 암을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-GITR 항체를 투여하여, 이러한 대상체를 치료하도록 하는, 예를 들어 암성 종양의 성장이 억제 또는 감소되고/거나 종양이 퇴행하고/거나 연장된 생존이 달성되도록 하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 항-GITR 항체를 단독으로 사용하여 암성 종양의 성장을 억제할 수 있다. 대안적으로, 항-GITR 항체를 또 다른 작용제, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은, 또 다른 면역원성 작용제, 표준 암 치료, 또는 또 다른 항체와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3.IgG1 또는 28F3.IgG1.1 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어 이러한 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제함으로써 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 항체는 인간 항-GITR 항체 (예컨대, 본원에 기재된 인간 항-인간 GITR 항체 중 임의의 것)일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3 또는 본원에 기재된 다른 항-GITR 항체의 서열을 포함하는 키메라 또는 인간화 항-GITR 항체일 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 암은 전형적으로 면역요법에 대해 반응성인 암, 및 전형적으로 면역요법에 대해 반응성이지 않은 것을 포함한다. 암은 고형 종양 또는 혈액 악성종양 (액상 종양)을 갖는 암일 수 있다. 치료하기 위한 암의 비-제한적 예는 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 편평 비소세포 폐암 (NSCLC), 비 편평 NSCLC, 신경교종, 위장암, 신장암 (예를 들어 투명 세포 암종), 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암 (예를 들어, 신세포 암종 (RCC)), 전립선암 (예를 들어 호르몬 불응성 전립선 선암종), 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 교모세포종 (다형성 교모세포종), 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암 (또는 암종), 위암, 생식 세포 종양, 소아 육종, 비부비동 자연 킬러, 흑색종 (예를 들어, 전이성 악성 흑색종, 예컨대 피부 또는 안내 악성 흑색종), 골암, 피부암, 자궁암, 항문 영역의 암, 고환암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연질 조직의 육종, 요도의 암, 남근의 암, 소아기 고형 종양, 수뇨관의 암, 신우의 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관형성, 척추 종양, 뇌암, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유표피암, 편평 세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암 (석면에 의해 유도된 암 포함), 바이러스-관련 암 또는 바이러스 기원의 암 (예를 들어, 인간 유두종 바이러스 (HPV-관련 또는 -기원 종양)), 및 2종의 주요 혈액 세포 계통 중 어느 하나, 즉 골수 세포주 (과립구, 적혈구, 혈소판, 대식세포 및 비만 세포를 생산함) 또는 림프성 세포주 (B, T, NK 및 형질 세포를 생산함)로부터 유래된 혈액 악성종양, 예컨대 모든 유형의 백혈병, 림프종 및 골수종, 예를 들어, 급성, 만성, 림프구성 및/또는 골수성 백혈병, 예컨대 급성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 만성 골수성 백혈병 (CML), 미분화된 AML (M0), 골수모구성 백혈병 (M1), 골수모구성 백혈병 (M2; 세포 성숙화를 수반함), 전골수구성 백혈병 (M3 또는 M3 변이체 [M3V]), 골수단핵구성 백혈병 (M4 또는 호산구 증가증을 동반한 M4 변이체 [M4E]), 단핵구성 백혈병 (M5), 적백혈병 (M6), 거핵모구성 백혈병 (M7), 단리된 과립구성 육종, 및 녹색종; 림프종, 예컨대 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), B 세포 혈액 악성종양, 예를 들어 B-세포 림프종, T-세포 림프종, 림프혈장세포양 림프종, 단핵구 모양 B-세포 림프종, 점막 관련 림프계 조직 (MALT) 림프종, 악성 (예를 들어, Ki 1+) 대형 세포 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병, 외투 세포 림프종, 혈관 면역모구성 T-세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장내 T-세포 림프종, 원발성 종격 B-세포 림프종, 전구체 T-림프모구성 림프종, T-림프모구성; 및 림프종/백혈병 (T-Lbly/T-ALL), 말초 T-세포 림프종, 림프모구성 림프종, 이식후 림프증식성 장애, 진성 조직구성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출 림프종, B 세포 림프종, 림프모구성 림프종 (LBL), 림프 계통의 조혈 종양, 급성 림프모구성 백혈병, 확산성 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 확산성 조직구성 림프종 (DHL), 면역모세포성 대형 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 피부 T-세포 림프종 (CTLC) (균상 식육종 또는 세자리 증후군으로도 지칭됨), 및 발덴스트롬 매크로글로불린혈증을 동반한 림프혈장세포양 림프종 (LPL); 골수종, 예컨대 IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비-분비성 골수종, 억제할 수 없는 골수종 (무통성 골수종으로도 지칭됨), 고립성 형질세포종, 및 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 림프종; 골수 계열의 조혈 종양, 중간엽 기원의 종양 (섬유육종 및 횡문근육종 포함); 정상피종, 기형암종, 중추 및 말초 신경의 종양 (성상세포종, 신경초종 포함); 중간엽 기원의 종양 (섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종 포함); 및 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암 및 기형암종, 림프 계열의 조혈 종양, 예를 들어 T-세포 및 B-세포 종양 [T-세포 장애, 예컨대 T-전림프구성 백혈병 (T-PLL) (소세포 및 대뇌모양의 세포 유형 포함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다]; 바람직하게 T-세포 유형의 대형 과립상 림프구 백혈병 (LGL); a/d T-NHL 간비장 림프종; 말초/흉선 후 T 세포 림프종 (다형성 및 면역모세포성 하위유형); 혈관중심성 (비내) T-세포 림프종; 두경부암, 신장암, 직장암, 갑상선암; 급성 골수성 림프종 뿐만 아니라 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 방법은 또한, 전이성 암, 절제불가능한 암 및/또는 불응성 암 (예를 들어, 기존의 면역요법에 대해, 예를 들어 차단 CTLA-4 또는 PD-1 또는 PD-L1 항체에 의해 불응성인 암), 및 재발 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR Ab는 선행 치료, 예를 들어 면역-종양학 약물에 의한 선행 치료에 대해 불충분한 반응을 나타내는 암을 갖는 환자, 또는 내인성 불응성 또는 저항성 (예를 들어, PD-1 경로 길항제에 대해 불응성)이거나 또는 저항성 또는 불응성 상태가 후천적인, 불응성 또는 저항성인 암을 갖는 환자에게 투여된다. 예를 들어, 제1 요법에 대해 반응성이지 않거나 충분히 반응성이지 않은 대상체 또는 치료, 예를 들어 항-PD-1 치료 후에 질환 진행이 관찰되는 대상체는 항-GITR 항체 단독 또는 또 다른 요법과의 (예를 들어, 항-PD-1 요법과의) 조합의 투여에 의해 치료될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 면역-종양학 작용제, 예를 들어 PD-1 경로 길항제를 이전에 제공받지 (즉, 그에 의해 치료받지) 않은 환자에게 투여된다.
항-GITR 항체는 표준 관리 치료와 함께 투여될 수 있다. 항-GITR 항체는 유지 요법, 예를 들어 종양의 발생 또는 재발을 방지하기 위해 의도되는 요법으로서 투여될 수 있다.
항-GITR 항체는 또 다른 치료, 예를 들어 방사선, 수술 또는 화학요법과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체 보조 요법은 미세전이가 존재할 수 있는 위험이 있을 때 및/또는 재발의 위험을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
항-GITR 항체는 단독요법으로서 또는 유일한 면역자극 요법으로서 투여될 수 있다. GITR에 대한 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항-GITR 항체는 또한 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다 (하기 추가로 논의됨).
인간에서, 일부 종양 예컨대 흑색종은 면역원성인 것으로 제시된 바 있다. GITR 활성화를 통해 T 세포 활성화의 역치를 낮춤으로써, 숙주에서의 종양 반응이 활성화되어, 비-면역원성 종양 또는 제한된 면역원성을 갖는 것의 치료를 가능하게 할 수 있다.
GITR 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항-GITR 항체는 백신접종 프로토콜과 조합될 수 있다. 종양에 대한 백신접종을 위한 많은 실험적 전략이 고안되었다 (문헌 [Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738] 참조; 또한 문헌 [Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition] 참조). 이들 전략들 중 하나에서, 자가 또는 동종이계 종양 세포를 사용하여 백신을 제조한다. 이들 세포성 백신이, 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 형질도입되는 경우에 가장 유효한 것으로 밝혀졌다. GM-CSF는 종양 백신접종을 위한 항원 제시의 강력한 활성화제인 것으로 밝혀졌다 (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).
다양한 종양에서 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴에 관한 연구 결과, 소위 종양 특이적 항원에 관하여 정의하게 되었다 (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). 많은 경우에 있어서, 이들 종양 특이적 항원은 종양에서 발현된 분화 항원 및 그로부터 종양이 발생되는 세포에서 발현된 분화 항원, 예를 들어 멜라닌 세포 항원 gp100, MAGE 항원, 및 Trp-2이다. 보다 중요하게, 이들 항원 중 많은 수가 숙주에서 발견된 종양 특이적 T 세포의 표적인 것으로 밝혀질 수 있다. GITR 활성화를 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 집합과 함께 사용하여, 이들 단백질에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 이들 단백질은 정상적으로, 면역 체계에 의해 자기 항원으로서 보여지므로, 그들에 대해 내성이 있다. 종양 항원은 염색체의 텔로미어의 합성에 필요하고 인간 암의 85% 초과에서 발현되며 제한된 수의 체세포 조직에서만 발현되는 단백질 텔로머라제를 포함할 수 있다 (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). 종양 항원은 또한, 단백질 서열을 변경시키거나 또는 2개의 무관한 서열 (즉, 필라델피아 염색체 내의 bcr-abl) 또는 B 세포 종양의 이디오타입 간에 융합 단백질을 생성하는 체세포 돌연변이 때문에 암 세포에서 발현된 "신생 항원"일 수 있다.
다른 종양 백신은 인간 암과 관련된 바이러스, 예컨대 인간 유두종 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스 (KHSV)로부터의 단백질을 포함할 수 있다. GITR 활성화와 함께 사용될 수 있는 또 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체로부터 단리된 정제된 열 쇼크 단백질 (HSP)이다. 이들 열 쇼크 단백질은 종양 세포로부터의 단백질의 단편을 함유하고, 이들 HSP는 종양 면역을 유도시키기 위해 항원 제시 세포에 전달하는데 고도로 효율적이다 (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
수지상 세포 (DC)는 항원-특이적 반응을 프라이밍하기 위해 사용될 수 있는 강력한 항원 제시 세포이다. DC는 생체외에서 생성될 수 있고, 다양한 단백질 및 펩티드 항원뿐만 아니라 종양 세포 추출물이 부하될 수 있다 (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC는 또한, 이들 종양 항원을 또한 발현하는 유전적 수단에 의해 형질도입될 수 있다. DC는 또한, 면역을 위해 종양 세포에 직접적으로 융합되어 왔다 (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). 백신접종의 방법으로서, DC 면역을 GITR 활성화와 효과적으로 조합하여 더 강력한 항종양 반응을 활성화시킬 수 있다.
GITR 활성화는 또한 표준 암 치료 (예를 들어, 수술, 방사선 및 화학요법)과 조합될 수 있다. GITR 활성화는 화학요법적 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에, 투여되는 화학요법 시약의 용량을 감소시키는 것이 가능할 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 항-GITR 항체와 흑색종 치료를 위한 데카르바진의 조합이다. 이러한 조합의 또 다른 예는 항-GITR 항체와 흑색종 치료를 위한 인터류킨-2 (IL-2)의 조합이다. GITR 활성화와 화학요법의 조합 사용 배후의 과학적 근거는 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제시 경로에서 증가된 수준의 종양 항원을 발생시킬 것이라는 것이다. 세포 사멸을 통해 GITR 활성화와 상승작용을 발생시킬 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술 및 호르몬 고갈이다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관신생 억제제가 또한 GITR 활성화와 조합될 수 있다. 혈관신생의 억제는 종양 세포 사멸로 이어지고, 이는 숙주 항원 제시 경로 내로 종양 항원을 공급할 수 있다.
본원에 기재된 항-GITR 항체는 또한, Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 이펙터 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합되어 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체를 사용하여 2개의 별도의 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들어 항-Fc 수용체/항종양 항원 (예를 들어, Her-2/neu) 이중특이적 항체는 대식세포를 종양 부위로 표적화하는데 사용된다. 이러한 표적화는 종양 특이적 반응을 보다 효과적으로 활성화시킬 수 있다. 이들 반응의 T 세포 부문은 GITR의 활성화에 의해 증대될 것이다. 대안적으로, 종양 항원 및 수지상 세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중특이적 항체를 사용함으로써, 항원을 DC에 직접적으로 전달할 수 있다.
종양은 광범위한 메카니즘에 의해 숙주의 면역 감시를 피한다. 많은 이들 메카니즘은 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 불활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들은 특히, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 이들 엔티티 각각에 대한 항체를 항-GITR 항체와 조합하여 사용하여, 면역억제제의 효과를 상쇄시키고 숙주에 의한 종양 면역 반응을 선호할 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키는 다른 항체를 항-GITR 항체와 조합하여 사용할 수 있다. 이들은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화시키는 수지상 세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼 활성을 효과적으로 대체할 수 있고 (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478), 항-GITR 항체와 함께 사용될 수 있다. T 세포 공동자극 분자, 예컨대 CTLA-4 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,811,097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)에 대한 활성화 항체가 또한, 증가된 수준의 T 세포 활성화를 제공할 수 있다. PD1 또는 PD-L1의 억제제를 또한, 항-GITR 항체와 함께 사용할 수 있다.
골수 이식은 조혈계 기원의 다양한 종양의 치료를 위해 현재 사용되고 있다. 이식편 대 숙주 질환은 이러한 치료의 결과이지만, 이식편 대 종양 반응으로부터 치료 이익이 수득될 수 있다. 공여자 생착 종양 특이적 T 세포의 유효성을 증가시키기 위해 GITR 활성화가 사용될 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포의 생체외 활성화 및 확장, 및 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위한 이들 세포의 수용자 내로의 입양 전달을 수반하는 여러 실험적 치료 프로토콜이 존재한다 (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). 또한, 이들 방법은 감염원 예컨대 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 항-GITR 항체의 존재 하에서의 생체외 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 수 있다.
감염성 질환
본원에 기재된 방법은 또한 특정한 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 또 다른 측면은 대상체의 감염성 질환이 치료되도록 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 종양에 대한 그의 적용과 유사하게, 항체-매개된 GITR 활성화는 병원체, 독소, 및 자기-항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 단독으로 또는 아주반트로서 백신과 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 치료 접근법이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 통상적인 백신의 효과가 덜 완전한 병원체를 포함한다. 이들은 HIV, 간염 (A, B, & C), 인플루엔자(Influenza), 헤르페스(Herpes), 지아르디아(Giardia), 말라리아(Malaria), 리슈마니아(Leishmania), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. GITR 활성화는 감염 과정에 걸쳐 변경된 항원을 제시하는 작용제, 예컨대 HIV에 의해 확립된 감염에 대해 유용할 수 있다. 이들 신규 에피토프는 항-인간 GITR 항체 투여 시 외래물질로서 인식되어, 강력한 T 세포 반응이 유발된다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염 (A, B 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스를 포함한다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 일부 예는 클라미디아(chlamydia), 리케치아 박테리아(rickettsial bacteria), 미코박테리아(mycobacteria), 스타필로코쿠스(staphylococci), 스트렙토코쿠스(streptococci), 뉴모노코쿠스(pneumonococci), 메닝고코쿠스(meningococci) 및 고노코쿠스(gonococci), 클레브시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 바실루스(bacilli), 콜레라(cholera), 파상풍, 보툴리눔독소증, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증 및 라임병 박테리아를 포함한다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 진균의 일부 예는 칸디다(Candida) (알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스(Aspergillus) (푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등), 뮤코랄레스(Mucorales) 속 (뮤코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 쉔크키이(Sporothrix schenkii), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료가능한 감염을 유발하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아포울레리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba) 종, 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 모든 방법에서, GITR 활성화는 다른 형태의 면역요법 예컨대 시토카인 치료 (예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 증진된 제시를 제공하는 이중특이적 항체 요법과 조합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
자가면역 반응
항-GITR 항체는 자가면역 반응을 일으키고 증폭시킬 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩티드 백신을 사용한 항종양 반응의 유도로 많은 항종양 반응이 항-자가 반응성을 수반하는 것으로 밝혀졌다 (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4). 따라서, 질환 치료를 위해 자기 단백질에 대한 면역 반응을 효율적으로 생성하는 백신접종 프로토콜을 고안하기 위해 다양한 이들 자기 단백질과 함께 항-GITR 항체를 사용하는 것이 고려될 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병은 뇌에서의 아밀로이드 침착물에 Aβ 펩티드의 부적절한 축적을 수반하고; 아밀로이드에 대한 항체 반응은 이들 아밀로이드 침착물을 제거할 수 있다 (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).
알레르기 및 천식의 치료를 위한 IgE, 및 류마티스 관절염을 위한 TNFc와 같은 다른 자기 단백질이 또한 표적으로서 사용될 수 있다. 마지막으로, 다양한 호르몬에 대한 항체 반응이 항-GITR 항체의 사용에 의해 유도될 수 있다. 생식 호르몬에 대한 중화 항체 반응은 피임을 위해 사용될 수 있다. 특정한 종양의 성장을 위해 필요한 호르몬 및 다른 가용성 인자에 대한 중화 항체 반응이 또한 가능한 백신접종 표적으로서 고려될 수 있다.
항-GITR 항체의 용도에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방법이 다른 자기-항원, 예컨대 알츠하이머병에서의 Aβ를 포함한 아밀로이드 침착물, 시토카인, 예컨대 TNFα, 및 IgE의 부적절한 축적을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료적 자가면역 반응의 유도를 위해 사용될 수 있다.
백신
본원에 기재된 항-GITR 항체는 항-GITR 항체와 관심 항원 (예를 들어, 백신)의 공투여에 의해 항원-특이적 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. 따라서, 대상체에게 (i) 항원; 및 (ii) 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하여 대상체에서 항원에 대한 면역 반응이 증진되도록 하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법이 본원에 제공된다. 항체는 인간 항-인간 GITR 항체 (예컨대 본원에 기재된 임의의 인간 항-GITR 항체)일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 항원은 예를 들어 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체로부터의 항원일 수 있다. 이러한 항원의 비제한적 예는 상기 섹션에서 논의된 것, 예컨대 상기 논의된 종양 항원 (또는 종양 백신), 또는 바이러스, 박테리아 또는 상기 기재된 다른 병원체로부터의 항원을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 융합 단백질이 항-GITR 항체 대신, 또는 이에 더하여 백신으로서 사용된다.
본원에 기재된 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 적합한 생체내 및 시험관내 투여 경로는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사에 의해 (예를 들어, 정맥내 또는 피하) 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 의존할 것이다.
이전에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 항-GITR 항체는 1종 이상의 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 공동투여될 수 있다. 항체는 작용제에 연결될 수 있거나 (면역-복합체로서), 또는 작용제와 별개로 투여될 수 있다. 후자의 경우에 (별개의 투여), 항체는 작용제 전에, 그 후에 또는 그와 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 공지된 요법, 예를 들어 항암 요법, 예를 들어 방사선과 공동-투여될 수 있다. 이러한 치료제는 특히 항신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 다카르바진 및 시클로포스파미드 히드록시우레아를 포함하며, 이는 그 자체로 환자에게 독성 또는 준독성인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주마다 1회 100 mg/ml 용량으로 정맥내로 투여되고 아드리아마이신은 21일마다 1회 60-75 mg/ml 용량으로 정맥내로 투여된다. 본원에 기재된 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공-투여는 상이한 메카니즘을 통해 작동하여 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 생성하는 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공-투여는 약물에 대한 저항성의 발생, 또는 항체와 비반응성이 되게 할 종양 세포의 항원성에서의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 본원에 기재된 범주 내에 포함된다. 키트는 적어도 1종의 추가의 시약, 또는 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와 구분되는 GITR 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도되는 용도를 지시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다.
조합 요법
상기 제공된 조합 요법에 더하여, 항-GITR 항체, 예를 들어 본원에 기재된 것은 또한 하기 기재된 바와 같이, 예를 들어 암을 치료하기 위한 조합 요법에 사용될 수 있다.
항-GITR 항체를 면역 반응을 자극하는데 효과적인 1종 이상의 추가의 작용제, 예를 들어, 소분자 약물, 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 공투여함으로써, 대상체에서 면역 반응을 추가로 증진시키거나, 자극하거나, 또는 상향조절하는 조합 요법의 방법이 본원에 제공된다. 실시예에 제시된 바와 같이, 마우스에의 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 항-PD-1 항체의 투여는 종양 성장을 억제하는데 있어서 상승작용적 효과를 가졌다.
일반적으로, 예를 들어 본원에 기재된 항-GITR 항체는 면역 세포, 예컨대 T 세포 상의 (i) 자극 (예를 들어, 공동-자극) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 효능제 및/또는 (ii) 억제 신호 또는 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 길항제와 조합될 수 있고, 이는 둘 다 면역 반응, 예컨대 항원-특이적 T 세포 반응의 증폭을 발생시킨다. 특정 측면에서, 면역-종양학 작용제는 선천성 면역에 수반되는 세포, 예를 들어 NK 세포 상의 (i) 자극 (공동-자극 포함) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 효능제 또는 (ii) 억제 (공동-억제 포함) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 길항제이고, 여기서 면역-종양학 작용제는 선천성 면역을 증진시킨다. 이러한 면역-종양학 작용제는 종종 면역 체크포인트 조절제, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 체크포인트 자극제로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 (IgSF)의 구성원인 자극 또는 억제 분자를 표적화하는 작용제와 함께 투여된다. 예를 들어, 예를 들어 본원에 기재된 항-GITR 항체는 면역 반응을 증가시키기 위해 IgSF 패밀리의 구성원을 표적화하는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-GITR 항체는 B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), 및 B7-H6을 포함하는 막-결합된 리간드의 B7 패밀리의 구성원을 표적화하는 (또는 이에 특이적으로 결합하는) 작용제 또는 B7 패밀리 멤버에 특이적으로 결합하는 공동-자극 또는 공동-억제 수용체와 함께 투여될 수 있다.
항-GITR 항체는 또한 분자 (리간드 또는 수용체)의 TNF 및 TNFR 패밀리의 구성원, 예컨대 CD40 및 CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, 림프독소 α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림프독소 α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, 및 NGFR을 표적화하는 작용제와 함께 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1] 참조).
T 세포 반응은 본원에 기재된 항-GITR 항체, 예를 들어 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1, 및 하기 작용제 중 1종 이상의 조합에 의해 자극될 수 있다:
(1) 상기 기재된 바와 같은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, 및 LAG-3과 같은 T 세포 활성화를 억제하는 단백질 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제), 및 하기 단백질 중 임의의 것: TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 갈렉틴-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, 및 TIM-4의 길항제 (억제제 또는 차단제); 및/또는
(2) B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H와 같은 T 세포 활성화를 자극하는 단백질의 효능제.
상기 단백질 중 1종을 조정하고, 암을 치료하기 위해 효능제 항-GITR 항체, 예를 들어 본원에 기재된 것과 조합될 수 있는 예시적인 작용제는 예르보이(Yervoy)™ (이필리무맙) 또는 트레멜리무맙 (CTLA-4에 대한 것), 갈릭시맙 (B7.1에 대한 것), BMS-936558 (PD-1에 대한 것), MK-3475 (PD-1에 대한 것), AMP224 (B7DC에 대한 것), BMS-936559 (B7-H1에 대한 것), MPDL3280A (B7-H1에 대한 것), MEDI-570 (ICOS에 대한 것), AMG557 (B7H2에 대한 것), MGA271 (B7H3에 대한 것), IMP321 (LAG-3에 대한 것), BMS-663513 (CD137에 대한 것), PF-05082566 (CD137에 대한 것), CDX-1127 (CD27에 대한 것), 항-OX40 (프로비던스 헬스 서비시즈(Providence Health Services)), huMAbOX40L (OX40L에 대한 것), 아타시셉트 (TACI에 대한 것), CP-870893 (CD40에 대한 것), 루카투무맙 (CD40에 대한 것), 다세투주맙 (CD40에 대한 것), 무로모납-CD3 (CD3에 대한 것), 이필리무맙 (CTLA-4에 대한 것)을 포함한다.
항-GITR 항체는 또한 피딜리주맙 (CT-011)과 함께 투여될 수 있지만, PD-1 결합에 대한 그의 특이성은 의문이다.
암의 치료를 위해 효능제 항-GITR 항체와 조합될 수 있는 다른 분자는 NK 세포 상의 억제 수용체의 길항제 또는 NK 세포 상의 활성화 수용체의 효능제를 포함한다. 예를 들어, 항-GITR 효능제 항체는 KIR의 길항제 (예를 들어, 리릴루맙)와 조합될 수 있다.
T 세포 활성화는 또한 가용성 시토카인에 의해 조절되고, 항-GITR 항체는 T 세포 활성화를 억제하는 시토카인의 길항제 또는 T 세포 활성화를 자극하는 시토카인의 효능제와 함께, 예를 들어 암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는 면역 반응을 자극하기 위해, 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해, (i) T 세포 활성화를 억제하는 IgSF 패밀리 또는 B7 패밀리 또는 TNF 패밀리의 단백질의 길항제 (또는 억제제 또는 차단제) 또는 T 세포 활성화를 억제하는 시토카인 (예를 들어, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF; "면역억제 시토카인")의 길항제 및/또는 (ii) T 세포 활성화를 자극하는 IgSF 패밀리, B7 패밀리 또는 TNF 패밀리의 자극 수용체의, 또는 시토카인의 효능제와 조합되어 사용될 수 있다.
조합 요법을 위한 다른 작용제는 RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) 또는 FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357)을 포함한 CSF-1R 길항제 항체와 같은 CSF-1R 길항제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대식세포 또는 단핵구를 억제 또는 고갈시키는 작용제를 포함한다.
항-GITR 항체는 또한 TGF-β 신호전달을 억제하는 작용제와 함께 투여될 수 있다.
항-GITR 항체와 조합될 수 있는 추가의 작용제는 종양 항원 제시를 증진시키는 작용제, 예를 들어 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오티드 및 이미퀴모드, 또는 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 요법 (예를 들어, 안트라시클린)을 포함한다.
항-GITR 항체와 조합될 수 있는 또 다른 요법은 Treg 세포를 고갈 또는 차단시키는 요법, 예를 들어 CD25에 특이적으로 결합하는 작용제를 포함한다.
항-GITR 항체와 조합될 수 있는 또 다른 요법은 대사 효소, 예컨대 인돌아민 디옥시게나제 (IDO), 디옥시게나제, 아르기나제, 또는 산화질소 신테타제를 억제하는 요법이다.
항-GITR 항체와 함께 사용될 수 있는 작용제의 또 다른 부류는 아데노신의 형성을 억제하거나 또는 아데노신 A2A 수용체를 억제하는 작용제를 포함한다.
암을 치료하기 위해 항-GITR 항체와 조합될 수 있는 다른 요법은 T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는 요법 및 선천성 면역 활성화 및/또는 종양 부위에서의 염증을 촉발하는 요법을 포함한다.
항-GITR 항체는 1종 초과의 면역-종양학 작용제와 조합될 수 있고, 예를 들어 면역 경로의 다중 요소를 표적화하는 조합 접근법, 예컨대 하기 중 하나 이상과 조합될 수 있다: 종양 항원 제시를 증진시키는 요법 (예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드); 예를 들어 CTLA-4 및/또는 PD1/PD-L1/PD-L2 경로의 억제 및/또는 Treg 또는 다른 면역 억제 세포의 고갈 또는 차단에 의해 음성 면역 조절을 억제하는 요법; 예를 들어 CD-137, OX-40, 및/또는 GITR 경로를 자극하고/거나 T 세포 이펙터 기능을 자극하는 효능제로 양성 면역 조절을 자극하는 요법; 항종양 T 세포의 빈도를 전신에서 증가시키는 요법; 예를 들어 CD25의 길항제 (예를 들어, 다클리주맙)를 사용하거나 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의해 Treg, 예컨대 종양에서의 Treg을 고갈 또는 억제하는 요법; 종양에서의 억제 골수 세포의 기능에 영향을 미치는 요법; 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 요법 (예를 들어, 안트라시클린); 유전자 변형된 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 세포 (CAR-T 요법)를 포함하는 입양 T 세포 또는 NK 세포 전달; 대사 효소, 예컨대 인돌아민 디옥시게나제 (IDO), 디옥시게나제, 아르기나제 또는 산화질소 신테타제를 억제하는 요법; T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는 요법; 선천성 면역 활성화 및/또는 종양 부위에서의 염증을 촉발하는 요법; 면역 자극 시토카인의 투여; 또는 면역 억제 시토카인의 차단.
본원에 기재된 효능제 항-GITR 항체는 양성 공동자극 수용체를 라이게이션하는 효능작용제, 억제 수용체, 길항제 및 항종양 T 세포의 빈도를 전신에서 증가시키는 1종 이상의 작용제를 통해 신호전달을 감쇠시키는 차단제, 종양 미세환경 내에서의 별개의 면역 억제 경로를 극복하는 (예를 들어, 억제 수용체 맞물림 (예를 들어, PD-L1/PD-1 상호작용)을 차단, Treg를 고갈 또는 억제 (예를 들어, 항-CD25 모노클로날 항체 (예를 들어, 다클리주맙)의 사용 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의함), 대사 효소, 예컨대 IDO를 억제, 또는 T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는) 작용제 및 선천성 면역 활성화 및/또는 종양 부위에서의 염증을 촉발시키는 작용제 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GITR 항체는, 대상체가 BRAF V600 돌연변이 양성인 경우에, BRAF 억제제와 함께 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 또 다른 면역자극 항체와 함께 투여되는 항-GITR 항체는 본원에 기재된 항체이다. 특정 실시양태에서, 또 다른 면역자극 항체와 함께 투여되는 항-GITR 항체는 6C8의 CDR 서열을 갖는 항체, 예를 들어 WO2006/105021에 기재된 바와 같은 6C8의 CDR을 갖는 인간화 항체; WO2011/028683에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체; JP2008278814에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체, WO2015/031667에 기재된 항-GITR 항체, 또는 본원에 기재되었거나 언급된 다른 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체이다.
대상체에게 효능제 항-GITR 분자, 예를 들어 항체, 및 1종 이상의 추가의 면역자극 항체, 예컨대 항-PD-1 길항제, 예를 들어 길항제 항체, 항-PD-L1 길항제, 예를 들어 길항제 항체, 길항제 항-CTLA-4 길항제, 예를 들어 길항제 항체 및/또는 항-LAG3 길항제, 예를 들어 길항제 항체를 투여하여, 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 하여 예를 들어 종양 성장을 억제하거나 또는 항바이러스 반응을 자극하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 항-PD-1 항체가 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 항-PD-L1 항체가 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체에게 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 항-CTLA-4 항체가 투여된다. 한 실시양태에서, 항-GITR 항체는 인간 항체, 예컨대 본원에 기재된 항체이다. 대안적으로, 항-GITR 항체는, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체 (예를 들어, 마우스 항-GITR mAb로부터 제조된 것), 예컨대 본원에 추가로 기재된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 추가의 면역자극 항체 (예를 들어, 길항제 항-PD-1, 길항제 항-PD-L1, 길항제 항-CTLA-4 및/또는 길항제 항-LAG3 항체)는 인간 항체이다. 대안적으로, 적어도 1종의 추가의 면역자극 항체는, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체 (예를 들어, 마우스 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA-4 및/또는 항-LAG3 항체로부터 제조됨)일 수 있다.
대상체에게 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 PD-1 항체를 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-1 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 또한, 대상체에게 항-GITR 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-1 항체를 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제에 의한 과다증식성 질환의 치료와 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 항-GITR 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 기재된 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어, 28F3.IgG1 또는 28F3.IgG1.1) 또는 본원에 기재된 또 다른 효능제 항-GITR 항체이다.
본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 PD-1 길항제는, 비제한적으로, 리간드, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 및 이중특이적 항체), 및 다가 작용제를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 융합 단백질, 예를 들어 Fc 융합 단백질, 예컨대 AMP-244이다. 한 실시양태에서, PD-1 길항제는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체이다.
예시적인 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (BMS-936558), 또는 WO 2006/121168에 기재된 항체 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 및 4A11 중 하나의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PD1 항체는 WO2012/145493에 기재된 MK-3475 (람브롤리주맙); 및 WO2012/145493에 기재된 AMP-514이다. 추가로 공지된 PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제는 WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, 미국 특허 번호 7,635,757 및 8,217,149, 및 미국 특허 공개 번호 2009/0317368에 기재된 것을 포함한다. WO2013/173223에 개시된 항-PD-1 항체 중 임의의 것이 또한 사용될 수 있다. 이들 항체 중 1종과 결합에 대해 경쟁하고/거나 이와 PD-1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체가 또한 조합 치료에 사용될 수 있다. PD-1 수용체를 표적화하는 또 다른 접근법은 AMP-224로 불리는 IgG1의 Fc 부분에 융합된 PD-L2 (B7-DC)의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질이다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 5x10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 1x10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 5x10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 1x10-8M 내지 1x10-10 M 또는 그 미만의 KD로 인간 PD-1에 결합한다.
대상체에게 효능제 항-GITR 항체 및 길항제 PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-L1 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 대상체에게 항-GITR 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-L1 항체를 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제에 의한 과다증식성 질환의 치료와 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 항-GITR 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 기재된 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 및 6G10의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어, 28F3.IgG1 또는 28F3.IgG1.1) 또는 본원에 기재된 또 다른 효능제 항-GITR 항체이다.
한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559 (WO 2007/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743에서 12A4로 지칭됨), 또는 PCT 공개 WO 07/005874 및 미국 특허 번호 7,943,743에 기재된 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 및 13G4의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 MEDI4736 (항-B7-H1로도 공지됨), MPDL3280A (RG7446으로도 공지됨), MSB0010718C (WO2013/79174), 또는 rHigM12B7이다. WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, 미국 특허 번호 7,635,757 및 8,217,149 및 미국 공개 번호 2009/145493에 개시된 항-PD-L1 항체 중 임의의 것이 또한 사용될 수 있다. 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하고/거나 이와 동일한 에피토프에 결합하는 항-PD-L1 항체가 또한 조합 치료에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 5x10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 1x10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 5x10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 또는 1x10-8M 내지 1x10-10 M 또는 그 미만의 KD로 인간 PD-L1에 결합한다.
대상체에게 본원에 기재된 항-GITR 항체 및 CTLA-4 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-GITR 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-CTLA-4 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 대상체에게 항-GITR 항체 및 치료 용량 미만의 항-CTLA-4 항체를 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제에 의한 과다증식성 질환의 치료와 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 예르보이™ (이필리무맙 또는 항체 10D1, PCT 공개 WO 01/14424에 기재됨), 트레멜리무맙 (이전에 티실리무맙, CP-675,206), 모노클로날 또는 하기 공개물 중 임의의 것에 기재된 항-CTLA-4 항체: WO 98/42752; WO 00/37504; 미국 특허 번호 6,207,156; 문헌 [Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304]로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다. WO2013/173223에 개시된 항-CTLA-4 항체 중 임의의 것이 또한 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-CTLA-4 항체는 5x10-8 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 1x10-8 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 5x10-9 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 또는 1x10-8M 내지 1x10-10 M 또는 그 미만의 KD로 인간 CTLA-4에 결합한다.
대상체에게 항-GITR 항체 및 항-LAG-3 항체를 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 추가 실시양태에서, 항-GITR 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-LAG-3 항체가 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 대상체에게 항-GITR 항체 및 치료 용량 미만의 항-LAG-3 항체를 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제에 의한 과다증식성 질환의 치료와 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간 서열 모노클로날 항체이고, 항-GITR 항체는 인간 서열 모노클로날 항체, 예컨대 본원에 기재된 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 또는 6G10의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체 (예를 들어, 28F3.IgG1 또는 28F3.IgG1.1) 또는 본원에 기재된 또 다른 효능제 항-GITR 항체이다. 항-LAG3 항체의 예는 미국 특허 공개 번호 US2011/0150892, WO10/19570 및 WO2014/008218에 기재된 항체 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 또는 17E5의 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 BMS-986016이다. 사용될 수 있는 다른 관련 기술분야 인식 항-LAG-3 항체는, US 2011/007023, WO08/132601, 및 WO09/44273에 기재된 IMP731 및 IMP-321을 포함한다. 이들 항체 중 임의의 것과 경쟁하고/거나 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-LAG-3 항체가 또한 조합 치료에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-LAG-3 항체는 5x10-8 M 이하의 KD로 인간 LAG-3에 결합하거나, 1x10-8 M 이하의 KD로 인간 LAG-3에 결합하거나, 5x10-9 M 이하의 KD로 인간 LAG-3에 결합하거나, 또는 1x10-8M 내지 1x10-10 M 또는 그 미만의 KD로 인간 LAG-3에 결합한다.
본원에 기재된 항-GITR 항체, 및 1종 이상의 제2 표적 항원, 예컨대 LAG-3 및/또는 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1에 대한 길항제, 예를 들어 길항제 항체의 투여는 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 본 개시내용의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 암은 전형적으로 면역요법에 대해 반응성인 암 및 전형적으로 면역요법에 대해 반응성이지 않은 것을 포함한다. 본 개시내용의 조합 요법을 사용하여 치료하기 위한 암의 대표적인 예는 본원에 열거된 암을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 논의된 치료 항체의 조합은 제약상 허용되는 담체 중의 단일 조성물로서 공동으로 투여될 수 있거나, 또는 제약상 허용되는 담체 중에 각각의 항체를 갖는 개별 조성물로서 공동으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 치료 항체의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및 항-GITR 항체가 순차적으로 투여될 수 있고, 예컨대 항-CTLA-4 항체가 제1로 투여되고 항-GITR 항체가 제2로 투여되거나, 또는 항-GITR 항체가 제1로 투여되고 항-CTLA-4 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-1 항체 및 항-GITR 항체가 순차적으로 투여될 수 있고, 예컨대 항-PD-1 항체가 제1로 투여되고 항-GITR 항체가 제2로 투여되거나, 또는 항-GITR 항체가 제1로 투여되고 항-PD-1 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-PD-L1 항체 및 항-GITR 항체가 순차적으로 투여될 수 있고, 예컨대 항-PD-L1 항체가 제1로 투여되고 항-GITR 항체가 제2로 투여되거나, 또는 항-GITR 항체가 제1로 투여되고 항-PD-L1 항체가 제2로 투여된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 항-LAG-3 항체 및 항-GITR 항체가 순차적으로 투여될 수 있고, 예컨대 항-LAG-3 항체가 제1로 투여되고 항-GITR 항체가 제2로 투여되거나, 또는 항-GITR 항체가 제1로 투여되고 항-LAG-3 항체가 제2로 투여된다.
또한, 하나 초과의 용량의 조합 요법이 순차적으로 투여되는 경우에, 순차적 투여의 순서는 각각의 투여 시점에 역전되거나 또는 동일한 순서로 유지될 수 있거나, 순차적 투여는 공동 투여와 조합될 수 있거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 조합 항-CTLA-4 항체 및 항-GITR 항체의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 순차적으로, 항-CTLA-4 항체가 제1이고 항-GITR 항체가 제2일 수 있고, 제3 투여는 순차적으로, 항-GITR 항체가 제1이고 항-CTLA-4 항체가 제2일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조합 항-PD-1 항체 및 항-GITR 항체의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 순차적으로, 항-PD-1 항체가 제1이고 항-GITR 항체가 제2일 수 있고, 제3 투여는 순차적으로, 항-GITR 항체가 제1이고 항-PD-1 항체가 제2일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조합 항-PD-L1 항체 및 항-GITR 항체의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 순차적으로, 항-PD-L1 항체가 제1이고 항-GITR 항체가 제2일 수 있고, 제3 투여는 순차적으로, 항-GITR 항체가 제1이고 항-PD-L1 항체가 제2일 수 있는 등이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 조합 항-LAG-3 항체 및 항-GITR 항체의 제1 투여는 공동일 수 있고, 제2 투여는 순차적으로, 항-LAG-3 항체가 제1이고 항-GITR 항체가 제2일 수 있고, 제3 투여는 순차적으로, 항-GITR 항체가 제1이고 항-LAG-3 항체가 제2일 수 있는 등이다. 또 다른 대표적인 투여 계획은 순차적으로, 항-GITR이 제1이고 항-CTLA-4 항체 (및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 항-LAG-3 항체)가 제2인 제1 투여를 수반할 수 있고, 후속 투여는 공동일 수 있다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 CD137 (4-1BB) 효능제, 예컨대 효능작용 CD137 항체이다. 적합한 CD137 항체는, 예를 들어, 우렐루맙 또는 PF-05082566 (WO12/32433)을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 OX40 효능제, 예컨대 효능작용 OX40 항체이다. 적합한 OX40 항체는, 예를 들어, MEDI-6383, MEDI-6469 또는 MOXR0916 (RG7888; WO06/029879)을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 CD40 효능제, 예컨대 효능작용 CD40 항체이다. 특정 실시양태에서, 면역-종양학 작용제는 CD40 길항제, 예컨대 길항작용 CD40 항체이다. 적합한 CD40 항체는, 예를 들어, 루카투무맙 (HCD122), 다세투주맙 (SGN-40), CP-870,893 또는 카이 롭(Chi Lob) 7/4를 포함한다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 CD27 효능제, 예컨대 효능작용 CD27 항체이다. 적합한 CD27 항체는, 예를 들어, 바를리루맙 (CDX-1127)을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 MGA271 (B7H3에 대한 것) (WO11/109400)이다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 KIR 길항제, 예컨대 리릴루맙이다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 IDO 길항제이다. 적합한 IDO 길항제는, 예를 들어, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), 인독시모드, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237) 또는 F001287을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 톨-유사 수용체 효능제, 예를 들어 TLR2/4 효능제 (예를 들어, 바실루스 칼메트-게랭(Bacillus Calmette-Guerin)); TLR7 효능제 (예를 들어, 힐토놀 또는 이미퀴모드); TLR7/8 효능제 (예를 들어, 레시퀴모드); 또는 TLR9 효능제 (예를 들어, CpG7909)이다.
한 실시양태에서, 면역계의 자극으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체는 항-GITR 항체 및 면역-종양학 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 의해 치료되고, 여기서 면역-종양학 작용제는 TGF-β 억제제, 예를 들어 GC1008, LY2157299, TEW7197, 또는 IMC-TR1이다.
한 측면에서, 항-GITR 항체는 제2 작용제, 예를 들어 면역-종양학 작용제의 투여 전에 순차적으로 투여된다. 한 측면에서, 항-GITR 항체는 제2 작용제, 예를 들어 면역-종양학 작용제와 공동으로 투여된다. 한 측면에서, 항-GITR 항체는 제2 작용제의 투여 후에 순차적으로 투여된다. 2종의 작용제의 투여는 예를 들어 30분, 60분, 90분, 120분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 5일, 7일, 또는 1주 이상 이격된 시간에 시작될 수 있거나, 또는 제2 작용제의 투여는 제1 작용제가 투여되고 예를 들어 30분, 60분, 90분, 120분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 5일, 7일, 또는 1주 초과 후에 시작될 수 있다.
특정 측면에서, 항-GITR 항체 및 제2 작용제, 예를 들어 면역-종양학 작용제는 환자에게 동시에 투여되고, 예를 들어 동시에, 예를 들어 30 또는 60분의 기간에 걸쳐 주입된다. 항-GITR 항체는 제2 작용제, 예를 들어 면역-종양학 작용제와 공동-제제화될 수 있다.
임의로, 단독 면역요법제로서의 항-GITR 항체, 또는 항-GITR 항체와 1종 이상의 추가의 면역요법 항체 (예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 차단)의 조합은 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극성 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 추가로 조합될 수 있다 (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MART1 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포 (하기에 추가로 논의됨)를 포함한다. 조합된 GITR 활성화 및 1종 이상의 추가의 항체 (예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단)는 또한, 표준 암 치료와 추가로 조합될 수 있다. 예를 들어, 조합된 GITR 활성화 및 1종 이상의 추가의 항체 (예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단)는 화학요법적 요법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에, 본 개시내용의 조합과 함께 투여되는 다른 화학요법 시약의 용량은 감소될 수 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 흑색종을 치료하기 위한 데카르바진과 추가로 조합된, 추가의 항체, 예컨대 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 항-LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하의 항-GITR 효능제 항체의 조합이다. 또 다른 예는 흑색종 치료를 위한 인터류킨-2 (IL-2)와 추가로 조합된, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하의 항-GITR 항체의 조합이다. GITR 활성화 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 화학요법과의 조합 사용의 배후의 과학적 근거는 대부분의 화학요법 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제시 경로에서 증가된 수준의 종양 항원을 발생시킬 것이라는 것이다. 세포 사멸을 통해 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 존재 또는 부재 하에 조합된 GITR 활성화와 함께 상승작용을 발생시킬 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술 및 호르몬 고갈을 포함한다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관신생 억제제가 또한 조합된 GITR 활성화 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단과 조합될 수 있다. 혈관신생의 억제는 종양 세포 사멸로 이어지고, 이는 숙주 항원 제시 경로 내로 공급되는 종양 항원의 공급원일 수 있다.
단독 면역요법제로서 항-GITR 효능제 항체, 또는 GITR 효능작용 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단 항체의 조합은 또한, Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 이펙터 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합되어 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체를 사용하여 2개의 별도의 항원을 표적화할 수 있다. 이들 반응의 T 세포 부문은 조합된 GITR 활성화 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 사용에 의해 증대될 것이다.
또 다른 예에서, 단독 면역요법제로서 항-GITR 효능제 항체, 또는 항-GITR 항체 및 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 및/또는 LAG-3 작용제, 예를 들어 항체의 조합은 항신생물성 항체, 예컨대 리툭산(Rituxan)® (리툭시맙), 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙), 벡사르(Bexxar)® (토시투모맙), 제발린(Zevalin)® (이브리투모맙), 캄파트(Campath)® (알렘투주맙), 림포사이드(Lymphocide)® (에프르투주맙), 아바스틴(Avastin)® (베바시주맙), 및 타르세바(Tarceva)® (에를로티닙) 등과 함께 사용될 수 있다. 예로서 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 항암 항체 또는 독소에 접합된 항암 항체를 사용한 치료는 암 세포 (예를 들어, 종양 세포) 사멸로 이어질 수 있고, 이는 면역자극제, 예를 들어 GITR, CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 LAG-3 작용제, 예를 들어 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 강화할 것이다. 예시적인 실시양태에서, 과다증식성 질환 (예를 들어, 암 종양)의 치료는 항암제, 예를 들어 항체를, 항-GITR 및 임의로 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예를 들어 항체와 공동으로 또는 순차적으로 또는 그의 임의의 조합으로 조합하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 숙주에 의한 항종양 면역 반응을 강화할 수 있다.
종양은 광범위한 메카니즘에 의해 숙주의 면역 감시를 피한다. 이들 메카니즘 중 많은 부분이 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 불활성화에 의해 극복될 수 있다. 이들은 특히, TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)를 포함한다. 이들 엔티티 각각에 대한 항체를, 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예컨대 항체의 존재 또는 부재 하에 항-GITR 항체와 추가로 조합하여, 면역억제제의 효과를 상쇄시키고 숙주에 의한 항종양 면역 반응을 선호할 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키기 위해 사용될 수 있는 다른 작용제, 예를 들어 항체는 추가의 면역자극제, 예컨대 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하에 항-GITR 항체와 조합하여 추가로 사용될 수 있다. 이들은 DC 기능 및 항원 제시를 활성화시키는 수지상 세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체 (Ridge et al., 상기 문헌)가, 항-GITR 항체 및 임의로 추가의 면역자극제, 예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예를 들어, 항체와 함께 사용될 수 있다. T 세포 공동자극 분자 (Weinberg et al., 상기 문헌, Melero et al., 상기 문헌, Hutloff et al., 상기 문헌)에 대한 다른 활성화 항체가 또한 증가된 수준의 T 세포 활성화를 제공할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 조혈 기원의 다양한 종양을 치료하기 위해 현재 골수 이식이 사용되고 있다. 항-GITR 면역요법을 단독으로 사용하거나 또는 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단과 조합하여 사용하여 공여자 생착된 종양 특이적 T 세포의 유효성을 증가시킬 수 있다.
여러 실험적 치료 프로토콜은 항원 특이적 T 세포를 생체외 활성화 및 확장하고 이들 세포를 수용자 내로 입양 전달하여, 종양에 대항한 항원-특이적 T 세포를 활성화시키는 것을 포함한다 (Greenberg & Riddell; 상기 문헌). 이들 방법은 또한, 감염체, 예컨대 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 추가의 면역자극 요법, 예를 들어 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체의 존재 또는 부재 하에, 항-GITR의 존재 하에서의 생체외 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 작용제, 예를 들어 항체의 존재 또는 부재 하에 항-GITR 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극제를 사용하여 과다증식성 질환 (예를 들어, 암)의 치료와 연관된 유해 사건을 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 비흡수성 스테로이드를 환자에게 투여함으로써, 면역자극성 치료 항체-유도된 결장염 또는 설사의 발병률을 저하시키는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, "비-흡수성 스테로이드"는 간에서의 대사 후, 스테로이드의 생체내 이용 효율이 낮도록, 즉 약 20% 미만이 되도록 광범위한 1차 통과 대사를 나타내는 글루코코르티코이드이다. 본원에 기재된 한 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드는 부데소니드이다. 부데소니드는 경구 투여 후, 주로 간에 의해 광범위하게 대사되는, 국소적으로 작용하는 글루코코르티코스테로이드이다. 엔토코르트 EC(ENTOCORT EC)® (아스트라-제네카(Astra-Zeneca))는 회장 및 결장 전체에 대한 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소니드의 pH- 및 시간-의존성 경구 제형이다. 엔토코르트 EC®는 회장 및/또는 상행 결장과 관련된 경도 내지 중등도의 크론병의 치료를 위해 미국에서 승인되었다. 크론병의 치료를 위한 엔토코르트 EC®의 통상적인 경구 투여량은 6 내지 9 mg/일이다. 엔토코르트 EC®는 흡수되기 전에 장에서 방출되고 소화관 점막에 보유된다. 일단 소화관 점막 표적 조직을 관통하면, 엔토코르트 EC®는 간에서의 시토크롬 P450 시스템에 의해 광범위하게 대사되어, 무시할만한 수준의 글루코코르티코이드 활성을 지닌 대사물로 된다. 따라서, 생체내 이용 효율은 낮다 (약 10%). 이러한 부데소니드의 낮은 생체내 이용 효율은 덜 광범위한 1차 통과 대사를 수반한 다른 글루코코르티코이드와 비교해서 개선된 치료 비를 초래한다. 부데소니드는 전신-작용 코르티코스테로이드보다, 더 낮은 시상하부-뇌하수체 억제를 포함하여, 더 적은 유해 사건을 발생시킨다. 그러나, 엔토코르트 EC®를 만성적으로 투여하면, 전신 글루코코르티코이드 효과, 예컨대 부신피질 항진증 및 부신 억제가 초래될 수 있다. 문헌 [PDR 58th ed. 2004; 608-610]을 참조한다.
추가 실시양태에서, 비-흡수성 스테로이드와 함께, CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 및/또는 LAG-3 차단의 존재 또는 부재 하의 GITR 활성화 (즉, 면역자극 치료 항체 항-GITR 및 임의로 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체)가 살리실레이트와 추가로 조합될 수 있다. 살리실레이트는 5-ASA 작용제, 예컨대, 예를 들어: 술파살라진 (아줄피딘(AZULFIDINE)®, 파마시아 & 업존(Pharmacia & UpJohn)); 올살라진 (디펜툼(DIPENTUM)®, 파마시아 & 업존); 발살라지드 (콜라잘(COLAZAL)®, 살릭스 파마슈티칼스, 인크.(Salix Pharmaceuticals, Inc.)); 및 메살라민 (아사콜(ASACOL)®, 프록터 & 갬블 파마슈티칼스(Procter & Gamble Pharmaceuticals); 펜타사(PENTASA)®, 샤이어 유에스(Shire US); 카나사(CANASA)®, 악스칸 스칸디파마, 인크.(Axcan Scandipharm, Inc.); 로와사(ROWASA)®, 솔베이(Solvay))을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 따라, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 LAG-3 항체 및 비-흡수성 스테로이드의 존재 또는 부재 하에 항-GITR과 조합되어 투여되는 살리실레이트는 면역자극 항체에 의해 유도된 결장염의 발병률을 저하시킬 목적으로 살리실레이트와 비-흡수성 스테로이드의 임의의 중복 또는 순차적 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 면역자극 항체에 의해 유도된 결장염의 발병률을 저하시키는 방법은 살리실레이트와 비-흡수성 스테로이드를 공동으로 또는 순차적으로 투여하거나 (예를 들어, 비-흡수성 스테로이드 투여 6시간 후에 살리실레이트를 투여함), 또는 그의 임의의 조합으로 투여하는 것을 포괄한다. 추가로, 살리실레이트와 비-흡수성 스테로이드는 동일한 경로에 의해 (예를 들어, 둘 다 경구로 투여됨) 또는 상이한 경로에 의해 (예를 들어, 살리실레이트는 경구로 투여되고, 비-흡수성 스테로이드는 직장으로 투여됨) 투여될 수 있고, 이는 항-GITR 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 및/또는 항-LAG-3 항체를 투여하기 위해 사용된 경로(들)와 상이할 수 있다.
본원에 기재된 항-GITR 항체 및 조합 항체 요법은 또한, 치료하고자 하는 적응증 (예를 들어, 암)에 대한 그의 특정한 유용성에 대해 선택되는, 다른 널리 공지된 요법과 함께 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항-GITR 항체의 조합은 공지된 제약상 허용되는 작용제(들)와 순차적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 항-GITR 항체 및 조합 항체 요법은 추가의 치료, 예컨대 방사선 조사, 화학요법 (예를 들어, 캄프토테신 (CPT-11), 5-플루오로우라실 (5-FU), 시스플라틴, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라틴, 파클리탁셀, 카르보플라틴-파클리탁셀 (탁솔), 독소루비신, 5-fu, 또는 캄프토테신 + apo2l/TRAIL (6X 콤보)을 사용함), 1종 이상의 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉 또는 MG132), 1종 이상의 Bcl-2 억제제 (예를 들어, BH3I-2' (bcl-xl 억제제), 인돌아민 디옥시게나제-1 억제제 (예를 들어, INCB24360, 인독시모드, NLG-919, 또는 F001287), AT-101 (R-(-)-고시폴 유도체), ABT-263 (소분자), GX-15-070 (오바토클락스), 또는 MCL-1 (골수성 백혈병 세포 분화 단백질-1) 길항제), iAP (아폽토시스 단백질의 억제제) 길항제 (예를 들어, smac7, smac4, 소분자 smac 모방체, 합성 smac 펩티드 (문헌 [Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15] 참조), ISIS23722 (LY2181308), 또는 AEG-35156 (GEM-640)), HDAC (히스톤 데아세틸라제) 억제제, 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙), 혈관형성 억제제 (예를 들어, 베바시주맙), VEGF 및 VEGFR을 표적화하는 항혈관형성제 (예를 들어, 아바스틴), 합성 트리테르페노이드 (문헌 [Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808] 참조), c-FLIP (세포성 FLICE-억제성 단백질) 조정제 (예를 들어, PPARγ (퍼옥시솜 증식자-활성화 수용체 γ)의 자연 및 합성 리간드, 5809354 또는 5569100), 키나제 억제제 (예를 들어, 소라페닙), 트라스투주맙, 세툭시맙, 템시롤리무스, mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 및 템시롤리무스, 보르테조밉, JAK2 억제제, HSP90 억제제, PI3K-AKT 억제제, 래날릴도미드, GSK3β 억제제, IAP 억제제 및/또는 유전자독성 약물과 조합하여 (예를 들어, 동시에 또는 별도로) 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항-GITR 항체 및 조합 항체 요법은 1종 이상의 항증식 세포독성제와 조합하여 추가로 사용될 수 있다. 항증식 세포독성제로서 사용될 수 있는 화합물 부류는 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다:
알킬화제 (질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠을 포함하나 이에 제한되지는 않음): 우라실 머스타드, 클로르메틴, 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™ 포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 데카르바진, 및 테모졸로미드.
항대사제 (엽산 길항제, 피리미딘 동족체, 퓨린 동족체 및 아데노신 데아미나제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않음): 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 및 젬시타빈.
효능제 항-GITR 항체와 조합하는데 적합한 항증식제: 관련 기술분야에 공지된 다른 마이크로투불린 안정화제에 더하여, 비제한적으로, 탁산, 파클리탁셀 (파클리탁셀은 탁솔(TAXOL)™로서 상업적으로 입수가능함), 도세탁셀, 디스코데르몰리드 (DDM), 딕티오스타틴 (DCT), 펠로루시드 A, 에포틸론, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 에포틸론 C, 에포틸론 D, 에포틸론 E, 에포틸론 F, 푸라노에포틸론 D, 데스옥시에포틸론 Bl, [17]-데히드로데스옥시에포틸론 B, [18]데히드로데스옥시에포틸론 B, C12,13-시클로프로필-에포틸론 A, C6-C8 브릿지된 에포틸론 A, 트랜스-9,10-데히드로에포틸론 D, 시스-9,10-데히드로에포틸론 D, 16-데스메틸에포틸론 B, 에포틸론 B10, 디스코데로몰리드, 파투필론 (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (디스코데르몰리드), TZT-1027 (소블리도틴), ILX-651 (타시도틴 히드로클로라이드), 할리콘드린 B, 에리불린 메실레이트 (E-7389), 헤미아스테를린 (HTI-286), E-7974, 크립토피신, LY-355703, 마이탄시노이드 면역접합체 (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (이스피네십), SB-743921, MK-0731, STA-5312, 엘레우테로빈, 17베타-아세톡시-2-에톡시-6-옥소-B-호모-에스트라-1,3,5(10)-트리엔-3-올, 시클로스트렙틴, 이소라울리말리드, 라울리말리드, 4-에피-7-데히드록시-14,16-디데메틸-(+)-디스코데르몰리드, 및 크립토틸론 1.
본원에 기재된 항-GITR 항체를 사용한 치료와 함께 또는 그 전에, 비정상적으로 증식하는 세포를 휴지기로 만드는 것이 바람직한 경우에는, 호르몬 및 스테로이드 (합성 동족체 포함), 예컨대 17a-에티닐에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 프레드니손, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메게스트롤아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메틸-테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 메드록시프로게스테론아세테이트, 류프롤리드, 플루타미드, 테레미펜, 졸라덱스(ZOLADEX)™를 환자에게 투여할 수 있다. 본원에 기재된 방법 또는 조성물을 이용하는 경우에는, 임상 환경에서 종양 성장 또는 전이를 조정하는데 사용된 다른 작용제, 예컨대 항모방제를 목적하는 만큼 투여할 수도 있다.
화학요법제를 안전하고 유효하게 투여하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 또한, 그의 투여가 표준 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 많은 화학요법제의 투여가 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR), e.g., 1996 edition (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)]에 기재되어 있고; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법은 관련 기술분야에 널리 공지된 치료 프로토콜에 따라서 투여될 수 있다.
화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법의 투여는 치료하고자 하는 질환 및 이러한 질환에 대한 화학요법제(들) 및/또는 방사선 요법의 공지된 효과에 따라서 다양할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 또한, 통상의 기술자의 지식에 따라서, 치료 프로토콜 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간)은 환자에 대하여 관찰된, 투여된 치료제의 효과의 관점에서, 및 투여된 치료제에 대하여 관찰된, 질환의 반응의 관점에서 다양할 수 있다.
예시적 실시양태
1. 인간 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기 특성을 나타내는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 가용성 인간 GITR에 결합함;
(b) 막 결합된 인간 GITR에 결합함;
(c) 막 결합된 시노몰구스 GITR에 결합함;
(d) T 세포 활성화를 유도하거나 증진시킴;
(e) GITR 리간드가 3A9-hGITR 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 억제함;
(f) GITR 리간드가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 최대한 부분적으로 억제함;
(g) 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4) 상의 입체형태적 에피토프에 결합함;
(h) O-연결 및 N-글리코실화 및 비글리코실화된 인간 GITR 둘 다에 결합함;
(i) Fc 수용체에의 결합의 부재 하에 효능제 활성을 갖지만, Fc 수용체에의 결합은 효능제 활성을 추가로 증진시킴; 및
(j) 인간 GITR에의 결합에 대해 항체 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, 및 6G10 중 1종 이상과 어느 하나의 방향 또는 양방향으로 경쟁함.
2. 실시양태 1에 있어서, 항체가 항종양 면역 반응을 자극하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 항체가 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
4. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 GITR-발현 T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 T 세포 증식을 증가시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 Fc 수용체에 결합하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
7. 실시양태 1-5 중 어느 하나에 있어서, 항체가 1개 이상의 활성화 FcγR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
8. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 비아코어에 의해 측정 시 10 nM 이하의 KD로 가용성 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
9. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 스캐차드에 의해 측정 시 1 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
10. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 1 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
11. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 10 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 시노몰구스 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도하거나 증진시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 1 μg/mL 이하의 EC50으로 GITR 리간드가 GITR에 결합하는 것을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
15. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 서열식별번호: 335 및 336.
16. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 33, 34, 및 35를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 36, 37, 및 38을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(c) 각각 서열식별번호: 46, 47, 및 48을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 49, 50, 및 51을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 65, 66, 및 67을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 68, 69, 및 70을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 78, 79, 및 80을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 81, 82, 및 83을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 91, 92, 및 93을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 94, 95, 및 96을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 109, 110, 및 111을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 112, 113, 및 114를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 122, 123, 및 124를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 125, 126, 및 127을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 141, 142, 및 143을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 144, 145, 및 146을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 또는
(m) 각각 서열식별번호: 342, 343, 및 344를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 345, 346, 및 347을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열.
17. 실시양태 16에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
18. 실시양태 16에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 33, 34, 및 35를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 36, 37, 및 38을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
19. 실시양태 16에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 46, 47, 및 48을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 49, 50, 및 51을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
20. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
21. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
22. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 각각 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 각각 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 각각 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 각각 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 각각 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 각각 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 각각 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 각각 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 각각 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 각각 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 각각 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 각각 서열식별번호: 335 및 336.
23. 실시양태 22에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
24. 실시양태 23에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
25. 실시양태 24에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
26. 실시양태 25에 있어서, 항체가 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
27. 실시양태 25에 있어서, 항체가 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
28. 실시양태 25에 있어서, 항체가 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
29. 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 15 및 16;
(b) 각각 서열식별번호: 17 및 19;
(c) 각각 서열식별번호: 18 및 19;
(d) 각각 서열식별번호: 28 및 29;
(e) 각각 서열식별번호: 30 및 32;
(f) 각각 서열식별번호: 31 및 32;
(g) 각각 서열식별번호: 41 및 42;
(h) 각각 서열식별번호: 43 및 45;
(i) 각각 서열식별번호: 44 및 45;
(j) 각각 서열식별번호: 55 및 56;
(k) 각각 서열식별번호: 55 및 57;
(l) 각각 서열식별번호: 58 및 60;
(m) 각각 서열식별번호: 59 및 60;
(n) 각각 서열식별번호: 58 및 61;
(o) 각각 서열식별번호: 59 및 61;
(p) 각각 서열식별번호: 73 및 74;
(q) 각각 서열식별번호: 75 및 77;
(r) 각각 서열식별번호: 76 및 77;
(s) 각각 서열식별번호: 86 및 87;
(t) 각각 서열식별번호: 88 및 90;
(u) 각각 서열식별번호: 89 및 90;
(v) 각각 서열식별번호: 102 및 104;
(w) 각각 서열식별번호: 103 및 104;
(x) 각각 서열식별번호: 100 및 101;
(y) 각각 서열식별번호: 100 및 371;
(z) 각각 서열식별번호: 102 및 105;
(za) 각각 서열식별번호: 103 및 105;
(zb) 각각 서열식별번호: 117 및 118;
(zc) 각각 서열식별번호: 119 및 121;
(zd) 각각 서열식별번호: 120 및 121;
(ze) 각각 서열식별번호: 131 및 132;
(zf) 각각 서열식별번호: 134 및 136;
(zg) 각각 서열식별번호: 135 및 136;
(zh) 각각 서열식별번호: 131 및 133;
(zi) 각각 서열식별번호: 134 및 137;
(zj) 각각 서열식별번호: 135 및 137;
(zk) 각각 서열식별번호: 337 및 338;
(zl) 각각 서열식별번호: 339 및 341; 및
(zm) 각각 서열식별번호: 340 및 341.
30. 실시양태 29에 있어서, 중쇄 및 경쇄가 (a)-(zm)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
31. 실시양태 30에 있어서, 항체가 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
32. 실시양태 30에 있어서, 항체가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
33. (a) 실시양태 25의 항체와 GITR 상의 동일한 에피토프에 결합하고, (b) 실시양태 25의 항체가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 FACS에 의해 측정 시 적어도 90%만큼 억제하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
34. 실시양태 15-33 중 어느 하나에 있어서, 항체가 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
35. 실시양태 15-34 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간 및 시노몰구스 GITR 둘 다에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
37. 실시양태 36에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
38. 실시양태 36에 있어서, 항체가 무이펙터 IgG1 Fc를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
39. 실시양태 38에 있어서, 하기 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 포함하는 무이펙터 IgG1 Fc를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
40. 실시양태 36에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 활성화 FcγR에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 포함하는 것인 항체.
41. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, CDR 영역 내 메티오닌 잔기가 산화를 겪지 않은 아미노산 잔기로 치환된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
42. 실시양태 15-41 중 어느 하나에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
43. 제2 결합 특이성을 갖는 분자에 연결된, 상기 실시양태 중 어느 하나의 항체를 포함하는 이중특이적 분자.
44. 실시양태 1-42 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
45. 실시양태 44의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
46. 실시양태 45의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
47. 작용제에 연결된, 실시양태 1-42 중 어느 하나에 따른 항체를 포함하는 면역접합체.
48. 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체, 및 담체를 포함하는 조성물.
49. 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 이중특이적 분자, 또는 면역접합체, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
50. 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 실시양태 46의 세포에서 발현시키고, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 세포로부터 단리하는 것을 포함하는, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
51. 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 T 세포를 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법.
52. 이펙터 T 세포를 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체, 및 CD3과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 이펙터 T 세포가 활성화 또는 공동-자극되는 것인, 이펙터 T 세포를 활성화 또는 공동-자극하는 방법.
53. T 세포를 유효량의 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 방법.
54. T 세포를 유효량의 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식을 증가시키는 방법.
55. 유효량의 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여 T 세포로부터 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체에서 T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 방법.
56. 유효량의 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여, T 조절 세포의 수의 감소 또는 고갈을 필요로 하는 대상체의 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소시키는 것을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 이펙터 또는 증진된 이펙터 기능을 갖는 것인, 상기 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소 또는 고갈시키는 방법.
57. 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
58. 실시양태 57에 있어서, 대상체가 종양을 갖고, 종양에 대한 면역 반응이 자극되는 것인 방법.
59. 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
60. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 1-43 및 47 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
61. 실시양태 60에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 배세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 및 바이러스-관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
62. 실시양태 60 또는 61에 있어서, 암이 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암인 방법.
63. 실시양태 56-62 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
64. 실시양태 63에 있어서, 추가의 요법이 항-PD1 항체, LAG-3 항체, CTLA-4 항체 또는 PD-L1 항체인 방법.
65. 샘플을 실시양태 1-42 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR) 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 GITR의 존재를 검출하는 방법.
66. IgG2 힌지 및 IgG2 이소형의 것이 아닌 CH1, CH2 및 CH3 중 적어도 1개를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 항-GITR 항체이며, 여기서 항-GITR 항체가 비-IgG2 힌지를 갖는 것을 제외하고는 동일한 항-GITR 항체에 비해 증진된 효능제 활성을 갖는 것인 단리된 항-GITR 항체.
67. 실시양태 66에 있어서, 변형된 중쇄 불변 영역이 서열식별번호: 223-226 및 283-290으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 서열식별번호: 223-226 및 283-290의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 단리된 항-GITR 항체.
68. 실시양태 67에 있어서, 중쇄가 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362의 아미노산 서열과 최대 10개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄를 포함하는 것인 단리된 항-GITR 항체.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원의 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 진뱅크 서열, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다. 특히, PCT 공개 WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863 및 PCT/US2013/072918, 및 미국 특허 공개 번호 2011/0150892의 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 상이한 항-GITR 항체의 생성
인간 항-GITR 모노클로날 항체를, HuMAb® 트랜스제닉 마우스 ("HuMAb"은 뉴저지주 프린스턴 소재의 메다렉스, 인크.의 상표명임)의 Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17, 및 Hc2 계통 및 KM 마우스 (KM 마우스® 계통은 PCT 공개 WO 02/43478에 기재된 바와 같은 SC20 트랜스크로모솜을 함유함)에서 생성하였다. HC2/KCo27 HuMAb 마우스 및 KM 마우스는 미국 특허 번호 5,770,429 및 5,545,806에 기재된 바와 같이 생성하였고, 그의 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
7종의 유전자형의 트랜스제닉 마우스 (KM, Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17 및 Hc2)를 포함한 총 94마리의 마우스를 상이한 면역화 전략 (상이한 항원, 상이한 용량, 지속기간, 투여 경로 (발바닥 (fp), 복강내 (ip) 및 피하 (sc)) 및 아주반트 (CFA/IFA, 리비 및 항체) 등)에 의해 면역화하였다. 54마리의 마우스로부터 36종의 융합을 수행하고 스크리닝하였다. 157종의 항체가 이들 36종의 융합으로부터 확인되었고, 추가의 특징화는 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 및 6G10으로 지정된 항체를 포함한, 특정한 관심 항체의 단리로 이어졌다.
cDNA 서열분석으로 항체 28F3, 19D3, 18D10, 2G6, 8A6, 14E3 및 6G10 각각에 대해 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 확인하였고, 항체 3C3, 9G7 및 19H8 각각에 대해 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄 (경쇄 1 또는 "L1" 및 경쇄 2 또는 "L2")를 확인하였다. 단백질 분석에 의해 항체 3C3 및 9G7에 대해 단일 경쇄를 확인하였고, N-말단 서열분석 및 분자량 결정으로 이는 3C3의 경우에 경쇄 L1이고 9G7의 경우에 경쇄 L2인 것으로 나타났다. 항체 19H8과 관련하여, 하이브리도마에 의해 발현된 항체의 93%는 경쇄 L1을 함유하였고 3%는 경쇄 L2를 함유하였다. 항체 3C3-1 및 3C3-2는 각각 경쇄 L1 및 L2를 갖는 항체 3C3에 상응한다. 항체 9G7-1 및 9G7-2는 각각 경쇄 L1 및 L2를 갖는 항체 9G73에 상응한다. 항체 19H8-1 및 19H8-2는 각각 경쇄 L1 및 L2를 갖는 항체 19H8에 상응한다. 3종의 항체의 각각의 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표 15에 제공된다.
항체 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 및 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 및 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 및 19H8-2) 및 6G10의 가변 영역 아미노산 서열 및 이소형이 도 2-31에 제시된다. 각각의 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 표 15에 제공된다. 28F3의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 15 및 16으로 이루어진다. 19D3의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 28 및 29으로 이루어진다. 18E10의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 41 및 42으로 이루어진다. 3C3의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 55 및 56으로 이루어진다. 2G6의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 73 및 74으로 이루어진다. 8A6의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 86 및 87으로 이루어진다. 9G7의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 100 및 101으로 이루어진다. 14E3의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 117 및 118으로 이루어진다. 19H8-1의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 131 및 132으로 이루어진다. 19H8-2의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 서열식별번호: 131 및 133으로 이루어진다. 6G10의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 337 및 338로 이루어진다. 이들 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 15에 제공된다.
실시예 2: 활성화된 인간 및 시노 T 세포에 대한 항-GITR 항체의 결합
실시예 1에서 생성된 인간 모노클로날 항-GITR 항체를, 그의 표면 상에서 GITR을 발현하는 활성화된 인간 및 시노 T 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다.
인간 또는 시노몰구스 원숭이로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 플레이트-코팅된 항-CD3 항체 (클론: 인간 T 세포 활성화의 경우 UCHT1; 클론: 시노몰구스 T 세포 활성화의 경우 SP34; 둘 다 비디 바이오사이언시스로부터의 것) 및 가용성 항-CD28 항체 (클론: 인간 및 시노몰구스 원숭이 둘 다의 경우 CD28.2, 비디 바이오사이언시스)로 4일 (인간)/ 또는 5일 (시노몰구스 원숭이) 동안 활성화시켰다. 세포를 피코에리트린 (PE)-접합된 항-인간 IgG 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 사용하여 형광-활성화 세포 분류 (FACS)-기반 검정에서 GITR mAb 결합에 대해 시험하였다. 샘플을 BD FACS 칸토 유동 세포측정기 상에서 분석하였다.
항-GITR 항체 3C3, 19D3, 18E10, 및 28F3은 활성화된 인간 및 시노몰구스 T 세포 둘 다에 결합하였다. 도 32에 제시된 바와 같이, 항체 3C3, 19D3, 18E10, 및 28F3은 각각 0.04916 nM, 0.3633 nM, 0.1461 nM 및 0.1916 nM의 EC50 값에 반영된 바와 같이 강력하게, 활성화된 인간 T 세포에 결합하였다. 유사하게, 항체 18E10 및 28F3은, 18E10 및 28F3에 대해 각각 0.9134 nM 및 1.044 nM의 EC50 값으로 활성화된 시노몰구스 T 세포에 결합하였다 (도 33). 3C3은 시노몰구스 T 세포에 유의하게 결합하지 않았다.
실시예 3: 가용성 GITR에 대한 항-GITR 항체의 결합
항-GITR 항체의 가용성 GITR에 대한 결합을 비아코어에 의해 결정하였다. 항-GITR 항체를 인간 카파 코팅된 칩 (~5KRU; 서던바이오테크(Southernbiotech) cat#2060-01) 상에 포획시키고, 재조합 인간 GITR (rHGITR/Fc: 알앤디 시스템즈, CAT#689-GR)을 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62 nM, 및 31 nM의 농도로 칩 전체에 유동시켰다. mAb의 포획 농도/부피는 2-40 μg/mL (10 μL/분으로 5 μL)였다. 항원 회합 시간은 15 μL/분으로 5분이었고, 항원 해리 시간은 6분이었으며, 재생은 50 mM HCl/50 mM NaOH (100 μL/분으로 각각 12μL)를 사용하여 수행하였다. 28F3 및 여러 다른 항-GITR 항체로 수득된 결과를 표 5에 제시한다.
표 5: 항GITR 항체의 Kon (ka), Koff (kd) 및 KD
결과는 항-GITR 항체가 가용성 GITR에 1.2 10-8 내지 3.5 10-8M 범위의 KD로 결합한다는 것을 나타낸다. 3C3의 2종의 서브클론에 대한 데이터가 제공되며, KD는 1.33 10-8 내지 1.44 10-8M 범위이다.
별개의 비아코어 실험에서, 3개의 상이한 불변 영역과 함께 28F3의 가변 영역을 갖는 항체의 결합 특징을 결정하였다. 제1 28F3 항체는 야생형 IgG1 불변 영역 ("g1f", 또한 "g1" 또는 "IgG1" 또는 "IgG1f"로도 지칭됨; 서열식별번호: 17을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 19를 갖는 경쇄)을 갖는다. 접미어 "f"는 동종이형을 지칭한다. 제2 항체는 Fc 영역에서 3개의 돌연변이를 갖는 무이펙터 IgG1 불변 영역 (L234A, L235E, G237A를 갖는 "g1.1f", 또한 "g1.1" , "IgG1.1" 및 "IgG1.1f"로도 지칭됨; 서열식별번호: 18을 갖는 중쇄 및 서열식별번호: 19를 갖는 경쇄)을 갖고; 제3 28F3 항체는 N297A 돌연변이를 갖는 IgG1 불변 영역을 갖는다.
칩을 항-CH1 (인비트로젠 Ref# 054500)로 코팅한 것을 제외하고, 상기 기재된 바와 같이 비아코어 실험을 수행하였다. 표 6에 제시된 결과는 모든 3종의 항체가 3.93 x 10-8 M 내지 4.39 x 10-8 M 범위의 KD로 유사한 결합 특징을 갖는다는 것을 나타낸다.
표 6: 다양한 Fc를 갖는 28F3의 동역학적 특징
실시예 4: 활성화된 인간 T 세포 및 3A9-huGITR 세포에 대한 항-GITR 항체의 결합 친화도
활성화된 인간 T 세포, 및 인간 GITR을 이소 발현하는 마우스 T 세포 하이브리도마 3A9 세포주 (3A9-hGITR) 상의 GITR에 대한 항-GITR 항체의 결합을 스캐차드 분석에 의해 결정하였다. 이러한 검정은 28F3.IgG1.1 (중쇄의 경우 서열식별번호: 18 및 경쇄의 경우 서열식별번호: 19)을 4.59 mg/mL로 사용하여 수행하였다.
활성화된 인간 T 세포에 대한 스캐차드 분석은 하기와 같이 수행하였다. 인간 공여자로부터 수득한 T 세포를 배양 배지 (10% FBS, 2mM L-글루타민, 피루브산나트륨, 2-메르캅토에탄올이 함유된 RPMI)로 1회 세척하고, 1 μg/mL 항-CD28 (CD28.2, BD#555725) 및 100U/mL IL-2 (페프로테크(Peprotech)#200-02)가 보충된 동일한 배양 배지에 106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 5x106개의 세포를 각각, 20ug 항-CD3으로 코팅된 6-웰 플레이트 중 3개의 웰에 플레이팅하였다 (5 mL, 4 μg/mL, 4℃에서 밤새; UCHT-1, BD#555329). 세포를 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 이들 세포의 절반을 스캐차드 분석에 사용하였다 ("제3일" 분석). 다른 절반의 소비된 배지를 5 mL의 새로운 배지로 교체하고, 세포를 하루 더 인큐베이션한 다음, 이들 세포로 스캐차드 분석에 사용하였다 ("제4일" 분석).
스캐차드 분석을 위해, 28F3.IgG1.1을 아이오도-겐(IODO-GEN)® 고체 상 아이오딘화된 시약 (1,3,4,6-테트라클로로-3a-6a-디페닐글리코우릴; 피어스(Pierce) #28601)을 사용하여 125I-Na (퍼킨엘머(Perkin Elmer) # NEZ033H001MC (1mCi))로 방사성 아이오딘화하였다. 과량의 아이오다이드를 탈염 칼럼 (피어스 #43243)을 사용하여 제거하였다. 표지된 항체의 분획을 수집하여 위자드(Wizard) 1470 감마선 계수기 (퍼킨-엘머) 상에서 방사능을 분석하였다. 각각의 분획에서의 125I-28F3.IgG1.1 농도를 인비트로젠의 큐비트(Qubit)™ 형광계를 사용하여 계산하였다. 방사성순도는 피크 단백질 및 방사성 분획의 박층 크로마토그래피 (파인스타 테크놀로지(Pinestar Technology) #151-005)에 의해 확립하였다.
활성화된 인간 T 세포에 대한 방사성 아이오딘화된 28F3.IgG1.1 결합은, 활성화된 인간 T 세포를 125I-28F3.IgG1.1의 적정과 함께 인큐베이션하여 입증하였다. 비특이적 결합은 100배 몰 과량의 비표지된 항체의 적정의 존재 하에서의 결합에 의해 결정하였고, 이를 총 CPM에서 차감하여 특이적 결합을 계산하였다. 125I-28F3.IgG1.1 농도 대 CPM의 선형 표준 곡선을 사용하여 결합된 125I-28F3.IgG1.1의 최대 nM을 외삽하고, 그에 의해 세포당 수용체 수를 계산하였다. 자극된 인간 CD4+T 세포당 인간 GITR 분자의 수는 제3일에 약 8,400개였고, 제4일에 약 13,200개였다. 스캐차드 분석의 결과는 28F3.IgG1.1이 제3일 자극된 인간 CD4+ T 세포에 0.7 nM의 KD로 특이적으로 결합하고, 제4일 자극된 인간 CD4+ T 세포에 0.87 nM의 KD로 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
3A9-huGITR 세포에 대한 방사성 아이오딘화된 28F3.IgG1.1 결합은, 3A9-huGITR 세포를 125I-28F3.IgG1.1의 적정과 함께 인큐베이션하여 입증하였다. 비특이적 결합은 100배 몰 과량의 비표지된 항체의 적정의 존재 하에서의 결합에 의해 결정하였고, 이를 총 CPM에서 차감하여 특이적 결합을 계산하였다. 125I-28F3.IgG1.1 농도 대 CPM의 선형 표준 곡선을 사용하여 결합된 125I-28F3. IgG1.1의 최대 nM을 외삽하고, 그에 의해 세포당 수용체 수를 계산하였다. 3A9-huGITR 세포당 인간 GITR 분자의 수는 약 180,000개였다. 스캐차드 분석의 결과는 28F3.IgG1.1이 3A9-huGITR 세포에 0.5 nM의 KD로 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 인간 및 시노 공여자로부터의 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 28F3.IgG1 및 28F3.IgG1.1의 결합을 결정하였다. 인간 및 시노 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 인간 및 시노 공여자로부터 단리하고, 활성화를 위해 항-CD3 및 항-CD28 항체로 처리하였다. 결과는 28F3.IgG1 및 28.IgG1.1이 활성화된 인간 CD4+ 세포에 각각 0.55 nM 및 0.67 nM의 EC50으로 유사하게 결합하고, 활성화된 인간 CD8+ 세포에 각각 0.56 nM 및 0.65 nM의 EC50으로 유사하게 결합한다는 것을 나타내었다. 28F3.IgG1 및 28.IgG1.1은 활성화된 시노 CD4+ 세포에 각각 1 nM 및 0.86 nM의 EC50으로 결합하였고, 활성화된 시노 CD8+ 세포에 각각 1.26 nM 및 0.74 nM의 EC50으로 유사하게 결합하였다.
실시예 5: 인간 모노클로날 항-GITR 항체는 GITR에 대한 GITR-L의 결합을 억제한다
HuMab 항-GITR 항체가 GITR 리간드의 GITR에 대한 결합을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 GITR을 이소 발현하는 마우스 T 세포 하이브리도마 3A9 세포주 (GITR-3A9 세포)를 10-4 μg/mL 내지 100 μg/mL 범위의 농도의 GITR mAb와 사전-인큐베이션한 다음, 10 ng/mL의 농도의 GITR 리간드 (알앤디 시스템즈#6987-GL)와 인큐베이션하였다. 세포에의 GITR 리간드의 결합을 PE 접합된 항-헤마글루티닌 (HA) 태그 항체를 사용하여 FACS-기반 검정에서 결정하였고, 샘플을 BD FACS 칸토 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. 도 34a 및 34b에 제시된 바와 같이, 이들 조건 하에서, 항체 19D3, 28F3, 및 GITR.3 (3C3)은 모두 GITR-L의 GITR-3A9 세포에 대한 결합을 각각 0.7546, 0.2783, 및 0.06934의 EC50 값으로 차단하였다. 항체 19H8에 의해 유사한 결과가 수득되었다.
항-GITR 항체가 GITR-L의 GITR에 대한 결합을 차단하는 정도를 추가로 평가하기 위해, 상이한 조건 하에서 또 다른 세트의 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, 가용성, 재조합 hGITR-L 삼량체를 1.06 x 10-9 내지 100 mg/ml의 농도로 활성화된 인간 T 세포에 첨가하였고, 이는 용량-의존적 방식으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 0.016 ug/ml의 EC50 값으로 결합하였다 (도 34c). 실험을 하기와 같이 수행하였다: 재조합 hGITR-L 삼량체 (알앤디 시스템즈 Cat. 6987-GL)를 1.06e-9 내지 100 μg/mL의 농도로 PHA-활성화된 T 세포에 첨가하였다. 30-분 1차 인큐베이션 후에, 세포-결합된 GITR-L을 PE 접합된 항-HA 태그 (밀테니(Miltenyi) Cat. 120-002-687)를 사용하여 검출하였다. 샘플을 FACS 칸토 유동 세포측정기 (비디, 산호세) 상에 획득하여, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타, 인크., 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 분석하였다.
활성화된 T 세포에의 1.06 x 10-9 내지 100 ug/ml 농도의 rhGITR-L의 사전-결합은 0.5 ug/ml 28F3-hIgG1 (대략 90% 포화)의 후속 결합을 0.0024 ug/ml의 IC50으로 차단하였다. 100 ug/ml에서 MFI는 기준선이 되지 않았으므로 (IgG 대조군), 억제는 부분적이었다 (도 34d). 실험을 하기와 같이 수행하였다: 먼저 PHA-활성화된 T 세포를 100 μg/mL에서 시작하여 30분 동안 재조합 GITR-L 삼량체 (알앤디 시스템즈 6987-GL)의 24-포인트, 3-배 적정으로 처리하였다. 28F3-hIgG1을 0.5 μg/mL의 고정 농도로 세포 혼합물에 후속 첨가하고, 이것을 또 다른 30-분 인큐베이션에 적용하였다. 세포-결합된 28F3-hIgG1을 PE 접합된, 인간 IgG Fc에 대한 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 Cat. 109-116-098)를 사용하여 검출하였다. 비관련 hIgG1 Ab를 28F3-hIgG1에 대한 이소형 대조군으로서 사용하는 한편, 차단 부재 하의 28F3-hIgG1의 결합을 보여주기 위해 GITR-L과 사전-인큐베이션되지 않은 샘플을 포함시켰다. 샘플을 FACS 칸토 유동 세포측정기 (비디, 산호세) 상에 획득하여, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타, 인크., 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 분석하였다.
활성화된 T 세포를 1.06 x 10-9 내지 100 ug/ml 범위의 농도의 28F3-hIgG1과 사전-인큐베이션한 경우에, GITR-L의 결합은 0.6 ug/ml (대략 90% 포화)에서 영향을 받지 않았다 (도 34e). 그러나, GITR-L을 그의 EC50에 가까운 보다 낮은 농도인 20 ng/ml로 첨가한 경우에, 그의 결합은 사전-결합된 28F3-hIgG1에 의해 0.076 mg/ml의 IC50으로 부분적으로 차단되었다 (도 34f). 실험을 하기와 같이 수행하였다: PHA-활성화된 T 세포를 0.00056 내지 100 μg/mL 범위의 농도의 28F3-hIgG1과 사전-인큐베이션한 다음, 0.6 ug/ml 또는 20 ng/mL GITR-L을 첨가하였다. 세포-결합된 GITR-L을 PE 접합된 항-HA 태그로 검출하였다. 비관련 hIgG1을 28F3-hIgG1에 대한 이소형 대조군으로서 포함시켰고, 차단 부재 하의 GITR-L의 결합을 보여주기 위해 1차 항체가 부재하는 샘플을 사용하였다. 샘플을 FACS 칸토 유동 세포측정기 (비디, 산호세) 상에 획득하여, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타, 인크., 오레곤주 앳슈랜드)를 사용하여 분석하였다.
이들 데이터는 28F3-hIgG1이 GITR-L에 의한 GITR의 일부 생체내 맞물림을 허용할 수 있는 부분적 리간드 차단제라는 것을 보여준다.
실시예 6: 모든 항-GITR 항체는 1개의 군으로 비닝된다
하기 항-인간 GITR 항체: 28F3, 18E10, 19D3, 14E3, 8A6, 9G7, 3C3 및 6G10을 사용하여 항체 비닝 실험을 수행하였다.
항 GITR 항체를 센서 칩 CM5 칩 (시리즈 S, 지이 헬스케어(GE Healthcare) CAT# BR-1005-30) 표면, 플로우셀2, 플로우셀3 & 플로우셀4 (5000 RU) 상에 고정시키고, 플로우셀1을 음성 대조군으로서 사용하였다. 항체를 출발 농도에서 120 μg/mL (2X)로 희석시켰다. 8개의 상이한 농도 (120 μg/ml-0.0 μg/ml, 2X)를 위해 1:3 농도로 항체를 완충제로 희석시켜 일련의 희석을 행하여 적정 곡선을 수득하였다. 각각의 항체 농도 시리즈를 2등분하였다. 농도 시리즈의 첫번째 절반에서, 40 nM (2X) GITR 항원 (rHGITR/Fc CAT# 689-GR)을 첨가하여 최종 농도 시리즈 (60 μg/ml-0.0 μg/ml)를 만들고 각각의 웰에서 20 nM의 최종 항원 농도를 만들었다. 농도 시리즈의 두번째 절반에서는, 항원 대신, 완충제를 첨가하여 항체를 동일한 농도로 희석하고, 이 절반을 블랭크로서 처리하였다. 복합체를 2시간 동안 인큐베이션하였다. 40 μL 복합체를 항체 코팅된 표면에 30 μL/분 유량으로 주입하였다. 비아코어 T200 기기를 사용하였고, 구동 완충제는 HBE-EP, 지이 헬스케어 CAT# BR-1001-88, 여과 탈기, 0.01M HEPES, pH7.4, 0.15 NaCl, 3Mm EDTA, 0.005% 계면활성제 P20이었다. 표면을 25 mM NaOH (주문 코드: BR-1003-58, 지이 헬스케어)로 5초 동안 100 μL/분으로 재생시켰다. 데이터를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)을 사용하여 분석하였고, 여기서 항체의 농도 시리즈를 상응하는 반응 단위에 대해 플롯팅하여 적정 곡선을 수득하였다.
결과는 모든 시험된 항체가 1개의 군으로 비닝된다는 것을 나타내었고, 이는 이들이 모두 인간 GITR의 세포외 영역의 유사한 영역에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 항-GITR 항체는 입체형태적 에피토프에 결합한다
본 실시예는 항-GITR 항체 28F3 및 3C3이 비 변성된 인간 GITR에는 결합하지만, 변성된 인간 GITR에는 결합하지 않으며, 결합은 N- 또는 O-연결된 글리코실화에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
항-GITR 항체의, N-연결된 글리코실화를 갖거나 갖지 않는 천연 또는 변성된 GITR에 대한 결합은 하기와 같이 결정하였다. 천연 (즉, 비 변성된) 및 변성된 인간 GITR의 샘플을 효소 N-글리카나제 PNGase F의 존재 또는 부재 하에 PBS 중 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 N-글리코실화를 제거하였다. GITR의 변성은 37℃에서 50 mM 디티오트레이톨 및 4 M 구아니딘 히드로클로라이드 중에서 45분 동안 환원시킨 다음, 100 mM 아이오도아세트아미드 중에서 실온에서 20분 동안 알킬화하여 수행하였다. N-연결된 글리코실화를 갖거나 갖지 않는 천연 인간 GITR의 샘플을 SDS 겔 전기영동에 적용하고, N-연결된 글리코실화를 갖거나 갖지 않는 변성된 GITR의 샘플을 변성 SDS 겔 전기영동에 적용하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 28F3 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 IgG 중쇄 및 경쇄에 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 (HRP 표지된) 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.))와 함께 인큐베이션한 다음, 필름 상에 포획된 발광을 검출함으로써 결합을 검출하였다. 도 35에 제시된 결과는 항-GITR Ab 28F3이 천연 GITR에만 결합하며, 변성된 형태에는 결합하지 않고, 글리코실화의 존재 또는 부재는 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 항-GITR 항체 3C3에 의해 유사한 결과가 수득되었다.
따라서, 항-GITR 항체 28F3 및 3C3은 입체형태적인 에피토프에 결합하고, 이는 N-연결 및 O-연결된 글리코실화에 비의존적이다.
실시예 8: 천연 인간 GITR 펩티드에 대한 28F3 및 3C3의 결합 패턴
28F3 및 3C3의 인간 GITR에 대한 결합 패턴을, 이들 항체의 천연 인간 GITR로부터 생성된 펩티드에 대한 결합을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험함으로써 조사하였다. 실험을 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 천연 인간 GITR을 변성 시약의 부재 하에, 2% w/w 비로 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 트립신, 엔도프로테이나제 Glu-C 또는 엔도프로테이나제 Asp-N과 함께 PBS 중 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션함으로써 단백질분해에 적용하였다. 각각의 소화로부터의 전체 반응 혼합물 2 μg을 이어서 비-변성 SDS-PAGE 전기영동에 적용하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스로 옮겼다. 그 후, 웨스턴 블롯을 28F3 또는 3C3 항체와 함께 인큐베이션하고, 항-인간 IgG 중쇄 및 경쇄에 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 (HRP 표지된) 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.)와 함께 인큐베이션한 다음, 필름 상에 포획된 발광을 검출함으로써 결합을 검출하였다. 도 36에 제시된 결과는 28F3 및 3C3의 결합 패턴이 상이하다는 것을 나타내고, 이는 이들 항체가 인간 GITR의 정확하게 동일한 영역에 결합하지 않는다는 것을 시사한다.
실시예 9: 항-GITR 항체 28F3은 인간 GITR의 세포외 도메인의 N-말단에 결합한다
28F3이 인간 GITR에 결합하는 영역의 위치는, 용액 중에서 항체가 인간 GITR의 다양한 비-변성된 단편에 결합하는 것을 시험함으로써 결정하였다. 실험을 하기와 같이 수행하였다: 인간 GITR을 변성 시약의 부재 하에, 2% w/w 비로 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 트립신, 엔도프로테이나제 Glu-C 또는 엔도프로테이나제 Asp-N과 함께 PBS 중 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션함으로써 인간 GITR 펩티드 단편을 생성하였다. 이어서, 펩티드 혼합물을 항-GITR Ab 비드와 함께 PBS 중 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 일부 샘플은 상이한 효소와 함께 PBS 중에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 계내 2차 절단에 적용하였다. 항-GITR Ab 비드를 PBS로 2회 세척함으로써 미결합된 펩티드를 제거하였다. 항-GITR Ab 28F3 상에 결합된 펩티드를 2% 포름산으로 용리시킨 다음, LC-MS에 의한 서열 확인에 적용하였다. 도 37에서 열지도로 제시된 결과는 28F3이 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 아미노산 잔기 1 내지 39에 상응하는 하기 N-말단 아미노산 스트레치:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (서열식별번호: 215),
또는 보다 짧은 단편
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR (서열식별번호: 370)
내의 입체형태적 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 인간 GITR 상의 O-연결된 글리코실화는 28F3의 결합을 방해하지 않는다
인간 GITR의 세포외 도메인 상에는 공지되었거나 문서화된 O-연결된 글리코실화가 존재하지 않는다. 그러나, 서열식별번호: 215의 잔기 T18 및 T20은 O-글리코실화 컨센서스 서열을 함유한다. 이들 잔기를 에피토프 서열에 밑줄표시한다: QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (서열식별번호: 215). 따라서, O-연결된 글리코실화가 28F3의 인간 GITR에 대한 결합에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다.
28F3의 서열식별번호: 215로 이루어진 글리코실화 또는 비-글리코실화된 펩티드에 대한 결합을 하기와 같이 수행하였다: 마우스 Fc에 연결된 무손상 천연 인간 GITR 세포외 도메인의 단백질분해에 의해 인간 GITR의 부분적으로 글리코실화 및 비-글리코실화된 N-말단 펩티드를 생성하였다. 서열식별번호: 215의 아미노산 잔기 1에서 39로 이루어진 비-글리코실화된 GITR 펩티드를 또한 유기 합성에 의해 생성하였다. 28F3의 펩티드에 대한 결합을 위한 절차는 이전 섹션에 기재되어 있다 (28F3 코팅된 비드를 사용함). 도 38b에 제시된 바와 같이, 2개의 펩티드가 28F3 코팅된 비드에 결합하는 것으로 확인되었고, 이들은 LC-MS에 의해 O-연결된 글리코실화를 갖지 않는 N-말단 펩티드 (도 38a)이고 다른 것은 서열식별번호: 215의 T18 및/또는 T20 상에 O-연결된 글리코실화를 갖는 동일한 N-말단 펩티드 (도 38d)인 것으로 확인되었다.
따라서, 28F3은 아미노산 T18 및/또는 T20 상에 O-연결된 당을 갖는지에 관계 없이 인간 GITR의 N-말단 영역에 결합한다.
실시예 11: 20-mer에 대한 항-GITR 항체 28F3의 결합
이전 실시예에 기재된 실험의 일부로서, 어떠한 O-연결된 글리코실화도 갖지 않는 서열식별번호: 215의 합성 펩티드를 먼저 28F3 코팅된 비드에 결합시킨 다음, 엔도프로테이나제 Asp-N에 의한 계내 소화에 의해 추가로 절단하였다. 아미노산 서열 QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 216)로 이루어지고 O-연결된 글리코실화가 없는 아미노산 잔기 T18 및 T20을 함유하는 나머지 펩티드는 28F3에 결합하였다 (도 38e). 따라서, 28F3은 서열식별번호: 216으로 이루어진 20-mer에 결합한다.
실시예 12: HDX-MS에 의한 에피토프 맵핑
수소/중수소 교환 질량 분광측정 (HDX-MS) 방법은 백본 아미드 수소 원자의 중수소 교환 속도 및 정도를 모니터링함으로써 용액 중 단백질 입체형태 및 입체형태적 역학을 탐구한다. HDX의 수준은 백본 아미드 수소 원자 및 단백질 수소 결합의 용매 접근성에 좌우된다. HDX 시 단백질의 질량 증가는 MS에 의해 정확하게 측정될 수 있다. 이러한 기술이 효소적 소화와 짝을 이루면, 구조적 특성을 펩티드 수준에서 해석할 수 있고, 표면 노출된 펩티드를 내부에 폴딩된 것과 구별할 수 있게 된다. 전형적으로, 중수소 표지 및 후속 켄칭 실험이 수행되고, 이어서 온라인 펩신 소화, 펩티드 분리 및 MS 분석이 수행된다.
HDX-MS에 의한 GITR에서의 28F3.IgG1 mAb (각각 서열식별번호: 17 및 19로 이루어진 중쇄 및 경쇄를 가짐)의 에피토프 맵핑 전에, 재조합 인간 GITR/Fc (알앤디 시스템즈, 10 μM, 아미노산 치환 T20A를 함유함) 및 재조합 인간 GITR/Fc 및 28F3.IgG1 mAb의 단백질 복합체 (1:2 몰비, 10 μM & 20 μM)에 대한 공통의 펩신분해 펩티드의 목록을 생성하기 위해 비-중수소화 실험을 수행하였고, 이는 GITR N-말단 영역에 대해 86%의 서열 적용범위를 달성하였다 (도 39a). 이 실험에서, 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)를 표지 단계 동안 사용하였고, 이어서 켄칭 완충제 (200 mM 포스페이트 완충제와, 4M GdnCl 및 0.5M TCEP, pH 2.5, 1:1, v/v)를 첨가하였다. 에피토프 맵핑 실험을 위해, 각각의 샘플 (GITR/Fc, 또는 GITR/Fc와 28F3.IgG1 mAb (1:2 몰비)) 5 μL를 55 μL의 D2O 완충제 (10 mM 포스페이트 완충제, D2O, pD 7.0)로 희석시켜 실온에서 표지 반응을 시작하였다. 반응을 상이한 기간 동안 수행하였다: 20초, 1분, 10분, 60분 및 240분. 각각의 표지 반응 기간의 말미에, 켄칭 완충제 (1:1 v/v)를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 50 μL의 켄칭된 샘플을 분석을 위해 워터스(Waters) HDX-MS 시스템에 주입하였다. 관찰된 공통 펩신분해 펩티드를 28F3.IgG1 mAb의 부재/존재 하의 그의 중수소 흡수 수준에 대해 모니터링하였다.
GITR에서의 28F3.IgG1 mAb에 대한 HDX-MS 측정으로부터 수득된 도 39b 및 39c에 제시된 실험 데이터는 28F3.IgG1 mAb가 GITR N-말단 영역의 2개의 펩티드 영역으로 구성된 (또는 그 내의) 불연속 에피토프를 갖는다는 것을 보여준다:
펩티드 영역 1: PTGGPGCGPGRLLLGTGA (서열식별번호: 217)
펩티드 영역 2: CRDYPGEE (서열식별번호: 218)
상대적 중수소 흡수 수준의 변화에 기초하여, 2개의 펩티드 영역은 영역 1이 중수소 흡수에서 가장 유의한 변화를 갖고, 영역 2는 통계적으로 유의하므로 영역 1 > 2로 등급화될 수 있다.
실시예 13: 항-GITR 항체는 T 세포로부터의 IL-2 및 IFN-γ 분비를 유도한다
항체와 함께 인큐베이션된 T 세포에 의해 분비되는 IL-2 및 IFN-γ의 양을 측정함으로써, 항-GITR 항체가 시험관내에서 T 세포 활성을 증진시키는 능력에 대해 시험하였다.
인간 GITR을 이소 발현하는 마우스 T 세포 하이브리도마 3A9 세포주 (3A9-hGITR)를 항-CD3 모노클로날 항체-코팅된 플레이트 상에서, 증가하는 양의 19D3, 18E10, 및 28F3 항체의 존재 하에 배양하였다. 5 x 104개의 3A9-hGITR 세포를 1 μg/ml의 항-CD3 항체 (클론 145-2C11; 비디 바이오사이언시스)로 코팅된 플레이트 상에서 배양하고, 표시된 농도의 항체로 24시간 동안 처리하였다. 도 40에 제시된 바와 같이, 항체 3C3 (GITR.3), 28F3, 19D3, 및 18E10은 모두 용량-의존적 방식으로 T 세포로부터의 IL-2 분비를 증진시켰다. 예상대로, 대조군 hIgG1 및 hIgG2 항체는 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비를 증가시키지 않았다.
항-GITR 항체가 자극 CD3 신호의 존재 하에 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비를 증진시킨다는 것을 고려하여, 특정 항원에 의해 활성화된 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비를 증진시키는 항체의 능력을 시험하였다. 5 x 104개의 3A9-hGITR 세포를 0.4 μM HEL48-63 펩티드 및 표시된 항체의 존재 하에 24시간 동안 2.5 x 104개의 LK35.2 항원 제시 세포와 함께 공동-배양하였다. 도 41a 및 41b에 제시된 바와 같이, 항체 18E10, 13H2 (28F3과 동일한 항체), 28F3, 3C3 및 19D3은 용량-의존적 방식으로 3A9-hGITR 세포로부터의 IL-2 분비를 증진시켰다.
추가의 실험에서, T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비에 대한 28F3의 효과를 항-CD3scFv (OKT3) 발현 CHO 세포로 자극된 인간 공여자 T 세포로 시험하였다. CHO 세포는 항-GITR 항체에 의한 효능작용을 관찰할 수 있도록 준최적 자극을 촉진하는 낮은 수준의 OKT3을 발현하였다. 한 세트의 실험에서, 공여자로부터의 CD3+ T 세포를 OKT3 발현 CHO 세포 및 항-GITR 항체로 자극하여 IFN-γ 분비를 측정하였고, 두번째 세트의 실험에서는, 2명의 공여자 (CD3+ T 세포의 공여자와 상이함)로부터의 CD4+ T 세포를 OKT3 발현 CHO 세포 및 항-GITR 항체로 자극하여 IL-2 및 IFN-γ 분비를 측정하였다. 실험을 하기와 같이 수행하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 범 T 세포 단리 키트 (밀테니#130-091-156)를 사용하여 피콜 구배 (아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience) 17-1440-03)로부터 단리된 인간 PBMC로부터 범 T 세포를 수득하였다. CD4+ T 세포를 사용하는 실험의 경우에는, 제조업체의 프로토콜에 따라 로제트셉(RosetteSep) 인간 CD4+ T 세포 풍부화 칵테일 (스템셀 테크놀로지(StemCell Technology)#15062)을 사용하여 인간 PBMC (공여자 1 및 2)로부터 CD4+T 세포를 수득하였다. 항-CD3scFv (OKT3)를 발현하는 CHO 세포 (CHO-OKT3)를 RPMI 배지로 2회 세척하고, 50K Rad 선량의 방사선조사에 적용하였다. 세포를 수거하여 배양 배지 (10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 55nM β-메르캅토에탄올, 1mM 피루브산나트륨, 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640)에 2.5x105/mL로 재현탁시켰다. 96-웰 TC 등급 편평-바닥 플레이트 (코스타(Costar))에 웰당 2.5x104개의 CHO-OKT3 세포 및 1x105개의 T 세포를 시딩하였다. 세포를 20 μg/mL에서 시작하여, GITR 항체의 8-포인트, 3-배 적정과 함께 인큐베이션하였다. 비관련 hIgG1을 이소형 대조군으로서 20 μg/mL로 첨가하였다. 어떠한 처리도 되지 않은 기준선 활성을 나타나기 위해 세포만을 갖는 샘플을 포함시켰다. 각각의 샘플로부터 상청액을 IL-2 측정을 위해 제2일에 (CD4+ T 세포를 사용하는 검정만을 위함) (BD opt EIA 인간 IL- 2 ELISA 키트; 비디 바이오사이언스#555190) 및 IFN- γ 측정을 위해 제3일에 (BD optEIA 인간 IFN-g ELISA 키트; 비디 바이오사이언스#555142) 수거하였다.
도 42b-e에 제시된 결과는 둘 다의 공여자로부터의 CD4+ T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비에서의 28F3 용량 의존적 증가를 보여준다.
다른 항-GITR 항체에 의해 자극된 공여자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비가 또한 입증되었다. 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 42a에 제시된 바와 같이, 항체 28F3, 3C3, 19D3, 및 18E10은 모두 용량-의존적 방식으로 CD3+ T 세포로부터의 IFN-γ 분비를 증진시켰고, 항체 28F3 및 3C3은 시험 항체 중 최대 효과를 나타내었다.
또 다른 실험에서, 항-GITR 항체, 특히 28F3의 존재 하의 T 세포 증식이 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 관찰되었다.
집합적으로, 이들 데이터는 항체 18E10, 19D3, 및 28F3이 T 세포로부터의 시토카인의 분비를 증진시키는 효능작용 항-GITR 항체로서 기능한다는 것을 나타낸다.
실시예 14: 항-GITR 항체는 시험관내에서 FcR 상호작용에 비의존적으로 T 세포 반응을 활성화한다
효능작용 항-TNFR 항체는 그의 생체내 활성을 위해 FcγRIIB 공동-맞물림을 필요로 하는 것으로 보고된 바 있다 (Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344). 이러한 요건이 또한 항-GITR 항체로도 확장되는지 여부를 결정하기 위해, 3A9-hGITR 세포를 실시예 13에 기재된 바와 같이 LK35.2 세포 및 HEL48-63 펩티드와 함께 공동-배양하고, 전장 항-GITR 항체 28F3 (hIgG2), 28F3의 F(ab')2 단편 또는 28F3의 Fab 단편으로 처리하고, mIL-2 생산에 대해 평가하였다. 도 43에 제시된 결과는 전장 28F3 및 28F3의 F(ab')2 단편 둘 다가 mIL-2 생산을 증진시키지만, 28F3의 Fab 단편은 보다 약한 효과를 갖는다는 것을 보여주고, 이는 1가 맞물림이 아닌 2가 맞물림이 항-GITR 항체 28F3의 효과에 기여한다는 것을 시사한다. 이들 결과는 집합적으로, FcγRIIB 공동-맞물림이 효능작용 항-GITR 항체의 시험관내 T 세포-증진 효과를 위해 필요하지는 않지만, FcγRIIB 수용체 맞물림은 효능제 활성을 강화할 수 있다는 것을 시사한다. 항-GITR 항체는 FcγRIIB 수용체에의 결합을 증가시켜 그의 효능작용을 증가시키기 위해 조작될 수 있다.
실시예 15: 항-GITR 항체 28F3은 인간 편도 내 림프구를 표지한다
어느 조직이 GITR을 발현하는지 결정하기 위해, 항-GITR 항체 28F3을 다양한 조직에서의 GITR의 면역조직화학적 검출에 사용하였다. 비-림프성 조직에서는 어떠한 특이적 염색도 발견되지 않았다 (심장, 간, 폐, 신장, 피부, 말초 신경, 갑상선, 고환, 전립선 포함). 양성 염색은 림프성 (편도, 비장 및 흉선 포함) 및 림프성-풍부 (결장, 위, 자궁의 고유판) 조직 내 산재된 림프구 및/또는 단핵 세포의 하위세트에서만 관찰되었다. 편도에서의 염색을 도 44에 제시한다. 양성 염색은 여포성 영역 사이/주위 및 배 중심 내 산재된 림프구에서 관찰되었다. 단핵 세포 (상피하) 및 상피-침윤 림프구의 산재된 클러스터가 또한 양성 염색되었다.
실시예 16: MC38 종양 모델에서의 변이체 항-GITR 이소형의 항종양 활성
DTA-1은 효능작용 래트 항-마우스 GITR 항체이다 (Shimizu et al., 2002; 이바이오사이언스(eBioscience), 캘리포니아주 샌디에고). 이러한 IgG2b 항체는 B16 흑색종의 치료 동안 Treg 및 Teff 둘 다를 조정하는 것으로 밝혀졌다. 또한, DTA-1의 완전한 효과를 위해서는 Teff 및 Treg 둘 다에 의한 GITR 발현이 필요하였다. 문헌 [Cohen et al. (2010)]은, DTA-1에 의한 GITR 라이게이션이 Treg 억제 활성을 전반적으로 제거하지는 않지만, Treg 종양 침윤을 손상시키고 이는 종양내 Treg 내에서의 Foxp3 발현의 상실로 이어져, 국재화된 억제의 제거를 수반한다는 것을 시사하였다. 전체 결과는 증대된 종양내 Teff:Treg 비 및 종양 내에서의 보다 큰 Teff 활성화 및 기능이다. DTA-1은 GITR과 GITR 리간드 (GITRL) 사이의 상호작용을 차단하고, 가용성 항체는 시험관내에서 세포 반응을 촉진하는데 효과적이다. 이는 또한 다양한 종양 모델에서 종양 성장을 억제하는데 있어서 효과적이다 (예를 들어, 문헌 [Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010] 참조).
a) 실험 MC38 #1
상이한 항-GITR (DTA-1) 이소형의 항종양 활성을 병기결정된 MC38 결장 선암종 종양 모델에서 평가하였다. C57BL/6 마우스에 각각 2 x 106개의 MC38 종양 세포를 피하로 주사하였다. 7일 후에, 마우스를 5개의 처리군으로 무작위화하고, 시험 항체를 하기와 같이 용량당 200 μg을 200 μl의 부피로 제7일, 제10일 및 제14일에 IP 투여하였다: 군 1: 마우스 IgG1 대조군 (IgG); 군 2: 항-GITR 래트 IgG2b Ab (DTA-rG2b); 군 3: 항-GITR 마우스 IgG1 Ab (DTA-mG1); 및 군 4: 항-GITR 마우스 IgG 2a Ab (DTA-mG2a). 종양 및 비장을 제15일에 수거하였다.
도 45c는 IgG1 항-GITR-처리된 종양이 마우스 IgG1 대조군 (도 45a)으로 처리된 종양과 대등한 속도로 성장하고, 마우스의 모니터링이 끝날 때까지 10마리의 마우스 중 무종양 (TF)은 없다는 것을 보여준다. 그러나, DTA-rG2b (도 45b) 및 DTA-mG2a (도 45d)는 종양 성장 속도를 유의하게 감소시켰고, 10마리의 마우스 중 각각 3 및 2마리가 TF였다.
상이한 항-GITR 이소형으로 처리된 군의 마우스의 평균 종양 부피 및 중앙 종양 부피에서의 변화를 도 46a 및 46b에 플롯팅하였다. 이들 플롯은 항-GITR 항체의 IgG2b 이소형이 MC38 종양 성장에 대해 가장 강력한 억제 효과를 나타내고, IgG2a 이소형은 단지 약간 덜 강력한 억제 효과만을 나타낸다는, 도 45에 제시된 개별 마우스 데이터를 확인시켜 준다. IgG1 이소형은 종양 성장의 억제를 거의 나타내지 않았고, 평균 및 중앙 종양 부피가 마우스 IgG 대조군으로 처리된 마우스의 것과 유사하였다.
TIL 및 비장에서의 MC38 T 세포 하위세트에 대한 항-GITR 이소형의 효과를 또한 결정하였다. 상이한 항-GITR 이소형으로 처리된 마우스로부터의 MC38 TIL 및 비장에서의 T 세포 하위세트의 집단을 비교하였다. 비장에서, DTA-m2a 및 DTA-r2b는 CD8+ 세포의 수준을 약간 감소시킨 반면에, 9D9-m2a (항-CTLA-4 항체) 및 DTA-m1은 CD8+ T 세포 수준을 변경시키지 않았다 (도 47a). 시험된 이소형 변이체 중 어떠한 것도 비장 내 CD4+ 또는 CD4+Foxp3+ 세포의 백분율에 유의한 효과를 갖지 않았다 (도 47b 및 47c).
TIL에서, 9D9-m2a는 마우스 IgG1 대조군 둘 다와 비교하여 CD8+ 세포의 백분율을 적어도 2-배 증가시켰다 (도 47d). DTA-m2a는 CD8+ 세포의 백분율을 약 50% 증가시켜 덜 현저한 효과를 갖는 반면에, DTA-m1 및 DTA-r2b는 마우스 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 CD8+ 세포의 백분율을 전혀 증가시키지 않거나 또는 단지 미미하게 증가시켰다 (도 47d). 9D9-m2a는 마우스 IgG1 이소형 대조군과 비교하여 CD4+ 세포의 백분율을 적게 증가시킨 반면에, DTA-m1은 CD4+에서 어떠한 변화도 초래하지 않았다 (도 47e). 대조적으로, DTA-m2a 및 DTA-r2b는 둘 다 마우스 IgG1 이소형 둘 다와 비교하여 CD4+ 백분율을 40-50% 감소시켰다 (도 47e).
가장 현저한 효과는 TIL 중 CD4+Foxp3+ Treg의 수준에서 관찰되었다. DTA-m1은 이러한 T 세포의 집단에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았지만, 9D9-m2a 및 DTA-m2a는 IgG1 이소형 및 DTA-m1과 비교하여 CD4+Foxp3+ Treg의 수준에서 대략 6-배 감소를 유도하였다 (도 47f). 이들 데이터는 항-GITR의 IgG2a 변이체가 종양 환경에서 특이적으로 Treg 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다. 따라서, IgG2a 항-GITR 이소형은 종양 부위에서 CD8+ Teff의 증가 및 Treg의 감소를 유도하고, 이는 강건한 항종양 활성을 나타내는 상승된 Teff 대 Treg 비로 해석된다. DTA-r2b는 또한 IgG1 대조군과 비교하여 CD4+Foxp3+ Treg의 수준에서 유의한 감소를 유도하였지만, 9D9-m2a 및 DTA-m2a에 의해 유도되는 것만큼 현저한 감소는 아니었고, 이는 래트 IgG2b Fc 영역의 뮤린 활성화 FcγR에 대한 보다 낮은 결합과 일치한다. 이들 데이터는 효능제 항-GITR 항체가 고갈 활성을 위해 활성화 FcγR과의 맞물림을 필요로 한다는 것을 입증한다.
MC38 TIL 및 비장 내 T 세포의 상이한 하위세트 상에서의 GITR 발현 수준의 유동 세포 측정은, GITR이 종양 부위에서의 Treg 상에서 가장 고도로 발현되고, 그러한 발현 수준은 주변부에서의 Treg 또는 종양 부위에서의 CD8+ Teff보다 더 높고, 주변부에서의 CD8+ 또는 CD4+ Teff보다 높은 발현을 나타낸다는 것을 보여주었다. GITR 발현의 최저 상대 수준은 종양 부위의 CD4+ Teff 상에서 관찰되었다. 이들 데이터는 T 세포 고갈 활성이 T 세포 반응의 자극을 보조하고, 그에 의해 Fc 융합 단백질의 표적이 종양 부위의 Teff 상에서의 표적의 발현에 비해 종양 부위의 Treg 상에서 고도로 발현된다면 Fc 융합 단백질의 항종양 효능을 증진시키고, Fc 융합 단백질이 활성화 FcR에 결합하여 표적 세포의 고갈을 매개하는 메카니즘을 시사한다.
b) 실험 MC38 #2
DTA-1 변이체에서 발생하는 응집 때문에 (상업적으로 입수되는 원래 형태의 DTA-r2b는 제외), 이소형 변이체의 새로운 세트를 재조작하여 응집되지 않는 DTA-1 항체를 수득하였다. 관찰되는 응집은 조작된 이소형 변이체의 경쇄에 의도치 않게 혼입된 여분의 아미노산 때문인 것으로 추적되었고, 이러한 외래 아미노산을 제거함으로써 문제가 경감되었다. 재조작된 항체를 본 실험 #2에서 사용하였다. 재조작된 항-GITR (DTA-1; GITR.7 시리즈) 이소형의 항종양 활성을 병기결정된 MC38 모델을 사용하여 평가하였다. C57BL/6 마우스에 각각 2 x 106개의 MC38 세포를 피하로 이식하였다. 7일 후에, 마우스를 약 148 mm3/2의 대등한 평균 종양 부피를 갖도록 하여 7개의 처리군으로 무작위화하고, 시험 항체를 하기와 같이 용량당 200 μg으로 제7일, 제10일 및 제14일에 IP 투여하였다 (200 μg의 용량이 투여되는 mIgG 대조군 제외): 군 1: 마우스 IgG1 대조군 (mIgG 또는 "이소형"); 군 2: 항-GITR 마우스 IgG1Ab (mGITR.7.mg1); 군 3: 항-GITR 마우스 IgG1D265A 이소형 (mGITR.7.mg1-D265A); 군 4: 항-GITR 마우스 IgG2a Ab (mGITR.7.mg2a); 군 5: 항-GITR 마우스 IgG2b Ab (mGITR.7.mg2b); 및 군 6: 항-GITR 래트 IgG2b Ab (mGITR.7.r2b 또는 DTA-1-rG2b). 종양 및 비장을 제15일에 수거하였다.
도 48b 및 48c는 IgG1 및 IgG1-D265A 항-GITR-처리된 종양이 마우스 IgG1 대조군 (도 48a)으로 처리된 종양과 대등한 속도로 성장하였음을 보여준다. 각각의 경우에, 이식후 35일째에 마우스의 모니터링이 끝날 때까지 9마리의 마우스 중 TF인 것은 없었다. 그러나, 실험 MC38 #1의 결과의 유사하게, mGITR.7.mg2a (도 48d)는 종양 성장의 최대 억제를 유도하였고, 9마리의 마우스 중 2마리가 TF였다. 마우스 및 래트 항-GITR-2b 항체는 또한, 이식 후 35일째에 래트 2b 항체가 1마리의 TF 마우스를 발생시키고 마우스 2b 항체는 어떠한 TF 마우스도 발생시키지 않았지만, 종양 성장의 속도를 유사한 정도로 유의하게 감소시켰다 (도 48e 및 48f).
평균 종양 부피 및 중앙 종양 부피에서의 변화가 도 49a 및 49b에 제시된다. MC38 실험 1에서 관찰되는 것과 유사한 경향이었지만, 단 IgG2a 항-GITR 이소형이 MC38 종양 성장의 가장 강력한 억제제였고, IgG2b 이소형은 종양 성장의 억제에서 유의하긴 하지만 보다 낮은 효력을 나타냈다. IgG1 및 IgG1-D265A 이소형은 마우스 IgG 대조군과 비교하여 낮은 수준의 종양 성장 억제를 보였다.
처리된 마우스로부터의 TIL 및 비장 내 Treg 집단에 대한 상이한 항-GITR 이소형의 효과를 도 50에 제시한다. 실험 #1에서 관찰된 바와 같이, 시험된 어떠한 이소형 변이체도 비장 내 CD4+Foxp3+ Treg의 백분율에 엄청난 효과를 갖지 않았고: 가장 강력한 효과는 래트 항-GITR IgG2b 이소형에 의한 처리에 의해 유도된 40% 미만의 증가였고, 반면에 마우스 항-GITR IgG2b 이소형은 CD4+Foxp3+ Treg의 백분율을 미미하게 감소시켰다. 시험된 다른 항-GITR 이소형 및 항-CTLA-4 IgG2a (9D9-mG2a) 항체는 Treg 백분율을 미미하게 증가시켰다 (도 50a).
대조적으로, TIL에서는, 이소형 대조군과 비교하여 어떠한 변화도 초래하지 않은 IgG1 이소형을 제외하고, 시험된 항체가 모두 Treg 백분율의 유의한 감소를 유도하였다. 항-CTLA-4 항체 9D9-mG2a는 IgG1 이소형과 비교하여 CD4+Foxp3+ Treg의 수준에서 대략 4-배 감소를 초래하였고; 항-GITR 마우스 2a 및 2b 이소형 및 래트 2b 이소형은 모두 Treg 수준을 약 2-배 낮췄고, IgG1-D265A 돌연변이체는 약간 더 낮은 감소를 초래하였다 (도 50b). 이들 데이터는 항-GITR mG2a, mG2b 및 rG2b 이소형이 종양 환경에서 종양 성장 억제와 상관되는 유의한 Treg 고갈을 유도한다는 것을 입증하여, 실험 #1에서 관찰된 효과를 확인시켜 주었다.
실험 MC38 #2에서 수득된 데이터는 실험 #1에서 수득된 것과 대부분 일치하였고, 이는 항체의 응집이 항체의 활성을 과도하게 방해하지 않는다는 것을 시사한다. 아마도, 응집된 항체는 마우스에서 급속하게 플러싱되므로, 항체 응집은 본 생체내 검정에서 유의한 문제가 아닐 수 있다.
실시예 17: 병기결정된 Sa1N 종양 모델에서의 변이체 항-GITR 이소형의 항종양 활성
항-GITR의 항종양 활성을 또한 A/J 마우스의 Sa1N 육종 모델에서 평가하였다. 마우스에 이식당 2 x 106개의 Sa1N 세포를 피하로 주사하였다. 7일 후에, 종양 부피를 결정하고, 마우스를 대등한 평균 종양 부피 (약 75 mm3/2)를 갖도록 하여 처리군으로 무작위화하였다. 실시예 10, 실험 MC38 #1에 기재된 바와 같이 상이한 이소형을 갖도록 조작된 항-GITR (DTA-1) 항체를 용량당 200 μg으로 제7일, 제10일 및 제12일에 IP 투여하였다.
종양 성장에 대한 효과를 도 51에 제시한다. IgG2a 항-GITR 항체에 의한 처리는 종양 성장을 완전히 억제하였고, 모든 10마리의 마우스가 이식 후 약 제20일에 TF였으며 (도 51b), 래트 IgG2b 이소형은 약 제20일에 10마리의 마우스 중 9마리에서 유사한 TF 효과를 가졌다 (도 51c). IgG1 (도 51d) 및 IgG1D265A (도 51e) 이소형은 IgG1 이소형 대조군-처리된 종양의 비억제된 종양 (도 51a)과 비교하여 종양을 어느 정도 억제하였으나, 이는 mIgG2a 및 rIgG2b 이소형에 의해 관찰되는 억제보다 훨씬 더 적었다. 도 52a 및 52b에 제시된 평균 종양 부피 및 중앙 종양 부피에서의 변화는, mIgG1 및 mIgG1-D265A 이소형에 의해 나타난 종양 성장의 훨씬 더 낮은 억제와 비교하여, 종양 성장에 대한 mIgG2a 및 rIgG2b 항체의 실질적으로 완전한 억제 효과를 확인시켜 준다.
집합적으로, 도 51 및 52의 데이터는 훨씬 더 낮은 항종양 활성을 나타내는 mIgG1 (및 mIgG1-D265A) 이소형과 대조적으로 항-GITR mIgG2a 및 rIgG2b 이소형이 강력한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 보여주어, MC38 종양 모델 (실시예 10)에 의해 수득된 데이터를 확인시켜 준다. Sa1N 모델에서 mIgG1 및 D265A 변이체 항체의 항종양 활성은 Treg 고갈 부재 하의 GITR의 효능작용 효과와 일치한다.
처리된 마우스로부터의 Sa1N TIL 및 비장 내 Treg 집단에 대한 상이한 항-GITR 이소형의 효과를 도 53에 제시한다. 시험된 모든 항-GITR 이소형 변이체는 비장 내 CD4+Foxp3+ Treg의 수준에서 약 20-40%의 상대적으로 적은 증가를 유도하였다. 최고 증가는 마우스 항-GITR IgG2a 이소형에 의한 처리에 의해 유도되었고, 이는 항-CTLA-4 IgG2b (9D9-G2b) 및 IgG1-D265A (9D9-G1-D265A) 항체에 의한 처리와 동일한 증가를 초래하였다 (도 53a). 후자의 항-CTLA-4 이소형은, Treg 고갈이 IgG2b 이소형에 의해 이전에 관찰되었기 때문에, 본 GITR 연구에서 양성 대조군으로서 사용되었다.
주변부에서의 Treg의 효과와 대조적으로, 항-GITR m2a 및 r2b 이소형, 뿐만 아니라, 항-CTLA-4 2b 이소형은 모두 종양 부위에서의 Treg의 수준을 적어도 3.5-배 낮추었다 (도 53b). 항-GITR IgG1 이소형 및 IgG1-D265A 돌연변이체 둘 다는 Treg의 백분율에서 약 35%의 보다 적은 감소를 유도한 반면에, 항-CTLA-4 IgG1-D265A 돌연변이체는 TIL 내 Treg의 백분율에서 어떠한 변화도 초래하지 않았다 (도 53b). 따라서, MC38 종양 모델에서 관찰되는 바와 같이, 항-GITR mG2a 및 rG2b 이소형은 종양 환경에서 IgG1 및 IgG1-D265A 항체보다 훨씬 더 큰, 종양 성장 억제와 상관되는 유의한 Treg 고갈을 유도한다.
실시예 18: 항-GITR 항체 및 항-PD1 길항제 항체 조합의 상승작용적 활성
항종양 메카니즘에 대한 억제 신호를 제공하는 분자인, PD-1에 길항작용하는 항체와 DTA-1 항체를 조합하는 것에 의해 상승작용적 항종양 효과가 수득될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 병기결정된 MC38 결장 선암종 모델을 사용하여 종양 부피에 대한 항체 조합의 효과를 평가하였다. 마우스를 제7일, 제10일 및 제14일에 (A) 대조군 mIgG1, (B) mIgG + DTA-1, (C) mIgG + PD-1 (클론 4H2, BMS), 및 (D) PD-1 + DTA-1로 처리하였다.
종양 성장에 대한 효과를 도 54에 제시한다. DTA-1 항체 또는 항-PD-1 항체에 의한 개별 처리는 종양 성장을 특정 정도까지 억제하였고, 각각 10마리의 마우스 중 2마리가 TF였다. 대조적으로, DTA-1 항체 및 항-PD-1 항체의 조합은 제30일에 TF 마우스의 수를 실질적으로 증가시켰고, 10마리의 마우스 중 7마리가 TF였다. 예상대로, 대조군 mIgG가 투여된 마우스에서는 TF 마우스가 없었다.
이들 결과는 효능작용 항-GITR 항체 및 길항작용 항-PD-1 항체의 조합이 상승작용으로 종양 성장을 억제하는 작용을 한다는 것을 시사한다.
실시예 19: 결합 친화도에 대한 CDR 아미노산 돌연변이의 효과
본 실시예는 28F3의 VH CDR3에서의 특정 아미노산 잔기가 그의 결합 친화도에 유의하게 영향을 미치지 않으면서, 또 다른 아미노산으로 돌연변이될 수 있다는 것을 보여준다.
VH CDR3 내의 하기 아미노산: M102, D106 및 M111 (서열식별번호: 13에 따른 넘버링) 중 1개 이상을 돌연변이시켜 28F3의 48개의 돌연변이체를 생성하고, 하기 활성을 시험하였다: 3A9-hGITR 세포에 대한 결합 및 플레이트-결합된 항-CD3의 존재 하에서의 3A9-hGITR 세포의 IL-2 분비. 실험을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과를 도 55a 및 55b (3A9-hGITR 세포에 대한 결합), 도 56a-f (IL-2 분비), 및 표 7에 제시한다.
표 7: 결합 친화도에 대한 CDR 아미노산 돌연변이의 효과
결과는 여러 돌연변이체가 28F3의 것과 대등한 결합 및 활성을 갖지만, 다른 돌연변이는 결합 및 IL-2 분비 중 어느 하나 또는 둘 다를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 하기 돌연변이체는 대등한 결합 및 활성 데이터를 갖는다: M98V; M98V/D106E; M98L/D106E; M98I/D160E; 및 M98A/D106E.
실시예 20: GITR 항체 효능제 활성에 대한 불변 영역 변형의 효과
본 실시예는 IgG2 힌지를 포함하는 GITR 항체가 IgG1 힌지를 갖는 동일한 항체에 비해, T 세포로부터의 IL-2 및 IFN-γ 분비를 유도하는 증가된 능력을 갖는다는 것을 입증한다.
상기 기재된 CHO-OKT3 및 3A9 검정에서, IgG2 불변 영역을 갖는 하이브리도마 유래 항체가, 중쇄 불변 영역이 IgG1 또는 무이펙터 IgG1 (IgG1.1)의 것으로 전환된 동일한 항체보다 시토카인 분비를 자극하는데 있어서 보다 강력하다는 것이 관찰되었다. 따라서, 항-GITR 항체에 대한 IgG2 불변 영역 또는 힌지의 효과를 이들 검정에서 추가로 시험하였다.
항-인간 GITR 항체의 중쇄 가변 영역을 하기 중쇄 불변 영역에 연결하였다:
표 8: 예시된 항-GITR 항체의 불변 영역 구성
먼저, 이들 GITR 항체의 결합 친화도를 IgG1 힌지를 갖는 GITR 항체의 것과 비교하였다. 결합 친화도는 실시예 2에 기재된 바와 같이 결정하였다. 도 57에 제시된 바와 같이, IgG2 힌지를 갖는 모든 3종의 GITR 항체는 IgG1 또는 IgG1.1 불변 영역을 갖는 2종의 GITR 항체와 유사한, 활성화된 T 세포에 대한 친화도를 가졌다.
이어서, IgG1 불변 영역 또는 IgG2 힌지/IgG1 Fc 도메인을 갖는 GITR 항체의 능력을, 실시예 13에 기재된 바와 같이, OKT3-발현 CHO 세포로 자극된 T 세포로부터 IL-2 및 IFN-γ 분비를 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 도 58a 및 58b에 제시된 바와 같이, IgG2 힌지/IgG1 Fc 도메인을 갖는 항체 ("항-GITR.G2.g1f")는 IgG1 불변 영역을 갖는 항체 ("항-GITR.g1f")보다 높은 정도로 T 세포로부터의 IFN-γ 및 IL-2 분비 둘 다를 유도하였다. 유사한 결과가 이들 불변 도메인의 무이펙터 버전에 의해 수득되었다 (도 58c).
IgG2 힌지를 포함하는 항-GITR 항체에 의한 T 세포의 증가된 활성화를 추가로 확인하기 위해, 상이한 실험 포맷으로 IL-2 분비를 시험하였다. 이러한 실험에서, 3A9-hGITR 세포 (인간 GITR을 이소 발현하는 마우스 T 세포 하이브리도마 3A9 세포주)로부터 IL-2 분비를 유도하는 GITR 항체의 능력을 실시예 13에 기재된 바와 같이 시험하였다. 도 59에 제시된 바와 같이, IgG2 힌지를 갖는 모든 항체 (항-GITR.g2, 항-GITR.g2.g1f, 및 항-GITR.g2.g1.1f)는 그의 IgG1 불변 영역 함유 대응물 (항-GITR.g1f 및 항-GITR.g1.1f)보다 높은 정도로 3A9-hGITR 세포로부터 IL-2 분비를 유도하였다.
이들 결과는 집합적으로 IgG2 힌지 및 g1 또는 g1.1 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체가 IgG1 힌지를 갖는 동일한 항체보다 더 강력하다는 것을 시사한다. IgG2 힌지 함유 GITR 항체의 개선된 효과를 설명하는 하나의 잠재적인 메카니즘은 IgG1 힌지를 포함하는 동일한 항체에 비해, 세포 표면에서의 이들 항체의 증가된 내재화 및/또는 증가된 복합체 형성이다.
실시예 21: 항-GITR 항체 유도된 증식은 Teff 세포-고유이다
GITR은 마우스 및 인간 조절 T (Treg) 세포 둘 다에서 발현된다. 문헌의 데이터에는, 효능작용 항-GITR 항체가 Treg 세포의 존재 하에 마우스 CD4+Foxp3- T 이펙터 (Teff) 세포의 증식을 구동한다는 것이 제시되어 있다. 추가적으로, 이러한 효과는 Treg 세포 억제 기능에 대한 직접 효과보다는, 주로 Teff 세포에의 항-GITR 항체 결합을 통해 구동되는 것으로 시사되었다. 다른 공개물은, 항-GITR 항체가 Treg 세포 증식을 구동하고 Foxp3의 상실을 특징으로 하는 Treg 세포 계통 불안정성을 유도할 수 있다는 것을 제시한다.
항-GITR 항체의 Treg 세포 기능에 대한 효과를 검사하기 위해, 마우스 Treg 세포 억제 검정을 수행하였고, 여기서 Teff 세포를 항-CD3 및 다양한 이소형의 항-마우스 GITR mAb DTA-1로 APC 및 적정 수의 Treg 세포의 존재 하에 자극하였다. 결과는 DTA-1 항체 처리가 이소형 대조군과 비교하여 증식을 증가시켰다는 것을 보여주었다. 추가로, IgG1, 2a, 2b, 및 불활성 IgG1 D265A 이소형은 모두 Teff 세포 증식을 증가시키는데 효과적이었고, 그에 따라 FcR 결합이 이러한 시스템에서 항-GITR 항체 기능을 위해 필요하지 않다는 것이 입증되었다.
이전의 실험으로부터, 증가된 Teff 증식이 Treg 및/또는 Teff 세포에 작용하는 항-GITR 항체로 인한 것인지 여부는 분명하지 않았다. 이러한 의문을 다루기 위해, 인간 GITR "녹-인(knock-in)" (huGITR KI) 마우스를 사용하였다. 이들 마우스에서, 마우스 GITR을 코딩하는 유전자 Tnfrsf18을 인간 TNFRSF18 유전자로 대체하였고, 인간 GITR은 아생형 마우스에서 muGITR과 유사하게 발현되었고; 인간 GITR은 Teff 및 Treg 세포 둘 다에서 발현되었고 후자에서 보다 높은 수준으로 발현되었다. 항-인간 GITR mAb 28F3은 huGITR KI 마우스로부터 Teff 세포의 증식을 구동할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 28F3은 마우스 GITR이 아닌 인간 GITR에 결합하기 때문에, GITR이 Teff 및 Treg 세포 상에서 차등 표적화될 수 있는 Treg 억제 검정 시스템을 설정하는 것이 가능하였다. 이러한 시스템은 또한 인간 IgG1 또는 불활성 IgG1.1 Fc 영역을 갖는 28F3 사이의 기능적 차이의 검사를 가능하게 하였다.
Treg 및 Teff 세포를 huGITR KI 및 WT 마우스로부터의 CD4 및 CD25 발현에 기초하여 분류하였다. WT 및 huGITR Treg 및 Teff 세포를, Treg 또는 Teff 세포의 28F3에 의한 단일구획 표적화를 가능하게 하는 조합으로 혼합하였다 (huGITR KI Teff 세포와 야생형 Treg 세포 등). 대조군으로서, 28F3이 Treg 및 Teff 세포 둘 다에 결합할 수 있거나 또는 어느 것에도 결합할 수 없는 조건을 포함시켰다. Teff 및 Treg 세포-함유 배양물을 항-CD3으로 APC 및 28F3 IgG1, 28F3 IgG1.1, 또는 이소형 대조군의 존재 하에 자극하였다.
결과를 도 60에 제공한다. 예상대로, Teff 세포 증식의 증가는 28F3이 Treg 및 Teff 세포 둘 다에 결합할 수 있을 때 관찰되었고, 이러한 효과는 28F3이 Teff 세포에만 결합할 수 있는 조건에서 유지되었다. 대조적으로, 28F3이 Treg 세포에만 결합할 수 있는 때는, 이소형 대조군을 초과하는 Teff 증식의 증가가 없었다. 이소형과 관련하여, 28F3이 효과를 나타내는 조건에서 IgG1과 IgG1.1 Fc 사이에는 차이가 없었다. 이는 Fc 가교가 항-GITR 효능작용을 위해 필요하지 않다는 것을 보여주는, 상기 기재된 데이터와 일치한다. 종합하면, 이러한 시스템에서 항-GITR 항체는 Treg 세포 억제 능력의 억제를 통해서가 아닌, 주로 Teff 세포 기능을 조정하는 그의 능력을 통해 작용한다. 그러나, 항-GITR 항체는 Treg 세포 증식을 구동하거나 또는 ADCC 또는 ADCP를 위한 Treg-특이적 표적을 제공할 수 있기 때문에, 생체내 Treg 세포에서의 GITR 신호전달에 대한 역할을 배제하지 않는다.
실시예 22: 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)
28F3.IgG1f 및 28F3.IgG1.1f의 시험관내 ADCC 활성을 이펙터로서 NK92/CD16 세포 또는 1차 NK 세포를 사용하여 평가하였고, GITR을 발현하는 것으로 공지된 다양한 세포를 표적으로서 사용하였다.
검정 3일 전에, 표적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트를 음성 선택에 의해 단리하고, Treg를 추가로 CD4+ T 세포로부터 CD25 양성 선택에 의해 단리하였다. 각각의 T 세포 하위세트를 3일 동안 CD2/CD3/CD28 비드 (밀테니 바이오텍)로 자극하여 GITR의 상향조절을 유도하였다. 검정 1일 전에, 1차 NK 세포를 새로운 PBMC로부터 음성 선택에 의해 단리하고 (스템셀 테크놀로지스, 인크.), 500IU/mL 재조합 IL-2 (알앤디 시스템즈) 및 1uM 히드로코르티손 (스템셀)이 보충된 미엘로컬트(MyeloCult) H5100 배지 (스템셀)에서 밤새 인큐베이션하였다. 검정일에, 이펙터 세포 (1차 NK 세포 또는 NK92/CD16)를 칼세인 AM-표지된 활성화된 T 세포와 명시된 이펙터 대 표적 비로, 1 ug/mL 28F3.IgG1f 및 28F3.IgG1.1f의 존재 하에 인큐베이션하였다.
이펙터로서 1차 NK 세포 또는 NK92/CD16 세포의 사용 시, 28F3.IgG1은 활성화된 CD4+ T 이펙터 및 Treg 세포의 용해를 유도하였고, 활성화된 CD8+ T 세포의 더 적은 용해가 관찰되었다 (도 61). 예상대로, 28F3.IgG1.1은 이펙터로서 NK92 또는 1차 NK 세포의 사용 시 임의의 표적 세포의 ADCC를 매개하지 않았다. 따라서, 28F3.IgG1은 활성화된 CD4+ T 이펙터 및 Treg 세포의 용해, 및 더 적은 정도로, 활성화된 CD8+ T 세포의 용해를 유도하였고, 28F3.IgG1에 의해 유도되는 용해의 수준은 표적 세포 상에서의 GITR 발현의 수준에 비례하는 것으로 보인다.
실시예 23: 인간 GITR 녹-인 마우스에서의 28F3.IgG1 항체의 활성
본 실시예는 28F3.IgG1 및 28F3IgG1.1이 인간 면역계 및 인간 GITR 단백질을 갖는 C57BL/6 마우스에서 MC38 종양에 대해 항종양 활성을 갖고, 항종양 활성은 28F3.IgG1의 경우에 더 강력하다는 것을 보여준다.
인간 GITR 녹-인 마우스의 생성: C57BL/6 마우스를, 마우스 막횡단 및 세포질 서열은 무손상으로 유지시키면서, 마우스 GITR 세포외 도메인 (ECD) 대신 인간 GITR ECD가 발현되도록 유전자 조작하였다. 인간/마우스 키메라 GITR의 발현은 항-CD3/CD28-활성화된 비장 세포의 항-인간 GITR 항체에 의한 염색에 의해 확인되었다.
MC38 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 4.5 g/L (45%) 글루코스 (10 mL/L), 및 1 mM 피루브산나트륨 (10 mL/L)이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 2일마다 1:10으로 분할하였다. 마우스의 2개의 코호트를 사용하였고, 둘 다의 코호트에 대해, 각각의 마우스의 우측 측복부에 0.2 mL PBS 중 75만개의 MC38 세포를 1-cm3 시린지 및 25-게이지 1/2 인치 바늘을 사용하여 피하로 이식하였다. 코호트 1의 경우에, 이식 후 제7일에, 40마리의 마우스를 종양 부피 (L×W×H/2)에 따라 각각 12-13마리의 마우스의 3개의 군으로 무작위화하였다. 모든 군은 대략 174 mm3 /2의 평균 종양 부피를 가졌다. 제7일, 제10일 및 제14일에, 비히클 대조군 또는 mAb를 10 mg/kg으로 투여하였다. 코호트 2의 경우에는, 이식 후 제7일에, 10마리의 마우스를 종양 부피 (L×W×H/2)에 따라 각각 5마리 마우스의 2개의 군으로 무작위화하였다. 모든 군은 대략 69 mm3 /2의 평균 종양 부피를 가졌다. 제7일, 제10일 및 제14일에, 비히클 대조군 또는 28F3.IgG1 mAb를 10 mg/kg으로 투여하였다.
마우스에 표 9에 요약된 농도 및 날짜로 복강내로 (IP) 투여하였다.
표 9.
종양 및 체중을 연구 종료 시까지 매주 2회 측정하였다. 종양은 파울러 일렉트로닉 디지털 캘리퍼(Fowler Electronic Digital Caliper) (모델 62379-531; 프레드 브이. 파울러 캄파니(Fred V. Fowler Co.), 매사추세츠주 뉴턴)를 사용하여 3 차원으로 측정하였고, 데이터는 스터디로그 시스템즈, 인크.(Studylog Systems, Inc.) (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)의 스터디디렉터 소프트웨어를 사용하여 전자적으로 기록하였다.
이러한 종양 연구에서, 코호트 1은 이식 후 제52일에 종결되었다. 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 종양 부피 및 체중의 평균, 표준 편차 (SD) 및 중앙값을 계산하였다. 각각의 처리군에 연구 동물의 100% 및 적어도 60%가 남아있을 때 평균 및 중앙값을 각각 계산하였다. 코호트 2의 마우스로부터의 종양을 제15일에 수거하였다.
결과는 모든 연구 마우스가 생존해 있는 마지막 날인, 종양 이식 후 제22일에, 10 mg/kg 용량의 28F3.IgG1이 이소형 대조군 항체와 비교하여 MC38 이종이식편에 대해 67%의 평균 종양 성장 억제 (TGI)를 보임을 나타낸다. 종양 TGI를 처리군에 따라 표 10에 요약한다. 처리군에 따른 종양 성장 곡선을 도 62a-62c에 제시한다. 처리군에 따른 평균 및 중앙 종양 성장 곡선을 도 63a-63b에 제시한다. 임의의 처리군에서 평균 및 중앙 체중 변화는 20% 미만이었으므로, 어떠한 독성도 분명하지 않았다. 시간의 경과에 따른 마우스 체중 및 백분율 변화를 도 64a-64b에 제시한다.
표 10.
결과는 이식 후 제22일에, 28F3.IgG1이 67%의 TGI를 갖고 28F3.IgG1.1f가 22%의 TGI를 갖는다는 것을 보여주며, 이는 둘 다의 항체가 MC38 종양 모델에서 종양 성장을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 결과는 28F3.IgG1에 의한 Fc 결합이 MC38 종양 모델에서 항종양 효력을 증진시킨다는 것을 시사한다.
28F3.IgG1이 T 세포 집단에 대해 갖는 효과를 조사하기 위해, 이식 후 제15일에 각각의 처리군에서 5마리의 마우스로부터 조직을 수거하였다. 비장 및 종양을 젠틀맥스 옥토 디소시에이터(gentleMACS Octo Dissociator)™ (밀테니, 캘리포니아주 샌디에고)로 프로세싱하였다. 단세포 현탁액을 유동 세포측정법 (FACS)을 사용하여 T 세포 마커에 대해 염색하였다. 항체 형광을 포르테사(Fortessa) (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에서 유동 세포측정법에 의해 검출하였고, 결과를 컴퓨터 프로그램, 플로우조 (플로우조, 엘엘씨, 오레곤주 앳슈랜드)에 의해 분석하였다.
도 65 및 66에 제시된 결과는 Treg 세포의 감소된 백분율을 나타내며, 이는 이소형 대조군에 비해 28F3.IgG1로 처리된 마우스에서의 고갈과 일치한다 (도 65). 반대로, 28F3.IgG1 군에서는 CD8+ T 세포의 백분율에서 증가가 존재하였다 (도 66).
따라서, 이소형 대조군과 비교하여 28F3.IgG1로 처리된 마우스의 면역-모니터링은, TGI가 Treg 고갈 및 CD8+ T 세포의 증가에 의해 매개될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 24: 28F3.IgG1의 가교는 그의 효력을 증가시킨다
본 실시예는 28F3.IgG1의 가교가 T 세포의 IFN-γ 분비를 증진시키고 T 세포 증식을 촉진시키는 그의 효력을 증가시킨다는 것을 보여준다.
T 세포를 CHO-OKT3 세포 또는 CHO-OKT3-CD32a고와 함께, 다양한 농도의 항-GITR 항체 또는 대조군 시약의 존재 하에 공동-배양하고, 인터페론-γ (IFN-γ) 분비 및 세포 증식 수준을 측정하였다. CHO-OKT3-CD32고 세포주는 매우 높은 수준의 Fc 수용체 CD32a를 갖고, 그의 모 CHO-OKT3 클론보다 약간 더 높은 OKT3 발현을 갖는다.
검정을 하기와 같이 수행하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 T 세포 단리 키트 (라이프 테크놀로지스(Life technologies), Cat. 113.31D) 및 CD25 마이크로비즈 (밀테니, Cat. 130-092-983)를 사용하여 피콜 구배 (아머샴 바이오사이언스 17-1440-03)로부터 단리된 인간 PBMC로부터 반응자 T 세포를 수득하였다. 항-CD3scFv (OKT3)를 발현하는 CHO 세포 (CHO-OKT3) 또는 항-CD3scFv 및 CD32a를 발현하는 CHO 세포를 RPMI 배지로 2회 세척하고, 50K Rad 선량의 방사선조사에 적용하였다. 세포를 수거하여 배양 배지 (10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 55 nM β-메르캅토에탄올, 1mM 피루브산나트륨, 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640)에 2.5x105/mL로 재현탁시켰다. 96-웰 TC 등급 편평-바닥 플레이트 (코스타)에 웰당 2.5x104개의 CHO 세포 및 1x105개의 T 세포를 시딩하였다. 세포를 20 μg/mL에서 시작하여, GITR 항체의 8-포인트, 4-배 적정과 함께 인큐베이션하였다. 비관련 hIgG1을 이소형 대조군으로서 20 μg/mL로 첨가하였다. 어떠한 처리도 되지 않은 기준선 활성을 나타나기 위해 세포만을 갖는 샘플을 포함시켰다. 각각의 샘플로부터 상청액을 IFN-γ 측정을 위해 제3일에 (BD optEIA 인간 IFN-g ELISA 키트; 비디 바이오사이언스#555142) 수거하였다. 세포 증식을 인큐베이션의 마지막 8-시간 동안의 3H-티미딘 혼입에 의해 평가하였다. 도 67 및 68에 제시된 결과는, 28F3.IgG1의 존재 하에, CHO-OKT3 세포와 함께 공동-배양된 것에 비해 CHO-OKT3-CD32a고와 함께 공동-배양된 T 세포로부터 보다 많은 IFN-γ가 분비되었음을 나타낸다 (도 67). 예상대로, CD32a에 결합하지 않는, 무이펙터 28F3.IgG1.1f 항체와 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 또한, 28F3.IgG1의 존재 하에, CHO-OKT3 세포와 함께 공동-배양된 것에 비해 CHO-OKT3-CD32a고와 함께 공동-배양된 T 세포에서 보다 많은 T-세포 증식이 관찰되었고; 이러한 효과는 무이펙터 28F3.IgG1.1f 항체에 의해서는 관찰되지 않았다 (도 68). 따라서, 28F3.IgG1의 가교는 T 세포의 IFN-γ 분비를 증진시키고 T 세포 증식을 촉진시키는 그의 효력을 증가시킨다. 이러한 강화 효과는 또한 보다 낮은 수준의 CD32a를 발현하는 CHO-OKT3 세포에 의한 T 세포 증식에서도 관찰되었다. GITR.6 g1.1f는 가용성일 때와 비교하여 가교되었을 때 보다 높은 수준의 IFN-γ를 나타낸다. 이는 아마도 CHO-OKT3 세포에 비해 CHO-OKT3-CD32a고 세포에서 발현되는 약간 더 높은 수준의 OKT3의 반영일 수 있다. 가교된 GITR.6 g1f에 의해 관찰되는 증가는 불활성 이소형에 의해 관찰되는 것보다 더 크고, 이는 가교의 긍정적 이익을 시사한다. G1f 버전은 가용성 항체가 백그라운드에 비해 효능작용이 거의 없음을 입증한 낮은 용량에서도 높은 수준의 IFN-γ를 촉진하며, 이는 다시 가교의 긍정적 역할을 시사한다.
따라서, 28F3.IgG1 및 무이펙터 28F3.IgG1 항체 둘 다는 IFN-γ의 생산을 자극하고 T 세포 증식을 자극하지만, 28F3.IgG1의 가교는 T 세포의 IFN-γ 분비를 증진시키고 T 세포 증식을 촉진시키는 그의 효력을 추가로 증가시킨다.
실시예 25: IgG2 CH1은 CD4+ T 세포에 의한 GITR Ab 유도된 IL-2 분비를 증진시킨다
본 실시예는 IgG1 이소형의 CH1 도메인을 갖는 항체에 비해 IgG2 이소형의 CH1 도메인이 항-GITR 항체 유도된 T 세포 활성을 증진시킨다는 것을 보여준다.
표 11에 제시된 변형된 중쇄 불변 영역을 항-GITR 항체의 가변 영역에 연결하였다. 공여자 CD4+ T 세포를 OKT3-scFv 발현 CHO 세포 및 다양한 항-GITR 항체와 인큐베이션하고, 분비된 IL-2의 수준을 측정하였다. 이는 실시예 20에 기재된 바와 같이 수행하였다.
표 11: 변형된 중쇄 불변 영역:
도 69에 제시된 결과는 IgG2 이소형의 힌지에 더하여 IgG2 이소형의 CH1 도메인을 갖는 모든 항-GITR 항체가 IgG1 힌지 및 CH1을 갖는 것보다 CD4+ T 세포로부터의 IL-2 분비를 자극하는데 더 효과적이라는 것을 보여준다.
따라서, 본 실시예는 효능제 항-GITR 항체에서 IgG2 힌지 및 IgG2 CH1 도메인의 존재가 IgG2 이소형의 힌지 및/또는 CH1 도메인을 갖지 않는 동일한 항체에 비해 항체의 효능제 활성을 추가로 증진시킨다는 것을 보여준다. IgG2 이소형의 힌지 및 CH1 도메인 둘 다를 갖는 항체는, IgG2 이소형의 힌지는 갖지만 CH1은 갖지 않는 항체에 비해 더 강력한 효능제 효과를 갖는다. 추가적으로, IgG2로부터의 CH1 도메인을 갖는 항체는 IgG1 이소형으로부터의 CH1 도메인을 갖는 항체보다 더 강력한 효능제 활성을 갖는다. IgG2로부터의 힌지 및 IgG1로부터의 CH1 도메인을 갖는 항체는 IgG1 이소형으로부터의 CH1 및 힌지를 갖는 항체보다 더 강력한 효능제 활성을 갖는다.
실시예 26: 조작된 불변 도메인을 갖는 항체에 대한 Fc 수용체 결합
본 실시예는 IgG2의 CH1 및 힌지를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 갖는 항체가, 이것이 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 경우에 FcγR에 결합한다는 것을 입증한다.
가변 도메인에 의한 항원 결합에 더하여, 항체는 불변 도메인과의 상호작용을 통해 Fc-감마 수용체 (FcgR)와 맞물릴 수 있다. 이들 상호작용은 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADCP)을 매개한다. 이펙터 기능 활성은 IgG1 이소형의 경우에 높지만, IgG2 및 IgG4의 경우에는 이들 이소형이 FcgR에 대해 보다 낮은 친화도를 갖기 때문에 매우 낮거나 부재한다. 또한, IgG1의 이펙터 기능은 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 돌연변이를 통해 변형되어, FcgR 친화도 및 선택성을 변경시킬 수 있다.
Fc 감마 수용체 (FcγR 또는 FcgR)에 대한 항체의 결합은 비아코어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 포르테바이오 생물층 간섭측정법 (BLI)을 포함한 바이오센서 기술을 사용하여 연구하였다. SPR 연구를 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어) 상에서 25℃에서 수행하였다. 뮤린 항-6xHis 항체로부터의 Fab 단편을, EDC/NHS를 사용하여 CM5 센서 칩 상에 ~3000 RU의 밀도로 고정시켰다. 다양한 his-태그부착된 FcgR (7 ug/ml)을, 30 s 접촉 시간을 사용하여 10 ul/분으로 C-말단 his-태그를 통해 포획하고, 1.0 uM 항체의 결합을 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1의 구동 완충제 중에서 평가하였다. 이들 실험에 사용된 FcgR은 CD64 (FcgRI), CD32a-H131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1), 및 CD16B-NA2 (FcgRIIIb-NA2)를 포함하였다. BLI 실험은 포르테바이오 옥텟 RED 기기 (폴(Pall), 포르테바이오) 상에서 10 mM NaPO4, 130 mM NaCl, 0.05% p20 (PBS-T) pH 7.1 중 25℃에서 수행하였다. 항체를 희석되지 않은 발현 상청액으로부터 단백질 A 코팅된 센서 상에 포획한 다음, 1μM hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, 또는 0.1 μM hCD64 분석물을 결합시켰다.
먼저, 치환 S267E (SE) 및 S267E/L328F (SELF), 뿐만 아니라 V4, V7, V8, V9 및 V12로 지칭되는 돌연변이 P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D의 다양한 조합을 포함하는 변형된 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 항체를 제조하였다. 이들 항체의 결합은 비아코어 SPR에 의해 IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) 및 IgG4.1 (IgG4-S228P) 항체, 뿐만 아니라 모든 FcgR에 대한 결합이 감소되도록 조작된 IgG1.1f 항체와 비교하여 연구하였다. 도 70에 제시된 결과는 SE 및 SELF에 대한 증가된 CD32a-H131, CD32a-R131 및 CD32b 결합, 뿐만 아니라 CD32a-H131 및 CD32a-R131보다 CD32b에 대한 V4, V7, V8, V9 및 V12 돌연변이체의 증가된 선택성을 포함한, IgG1f, IgG2.3 및 IgG4.1 및 돌연변이된 IgG1 항체에 대해 예상된 FcgR 결합 특성을 입증하였다 (도 70).
다음 세트의 구축물을 사용하여 이펙터 기능을 다른 이펙터 기능 음성 IgG2 이소형으로 조작하였다. 이러한 연구를 위해, 상기 기재된 돌연변이를 IgG2.3 불변 영역, 또는 IgG2.3G1-AY로 불리는 IgG2.3/IgG1f 하이브리드의 맥락에 도입하였다 (표 12). 항체를 상청액으로서 소규모로 발현시키고, 포르테바이오 옥텟 생물층 간섭측정 바이오센서 기술을 사용하여 FcgR에 대한 결합에 대해 시험하였다. 항체는 상청액 중 낮은 농도로 존재하기 때문에, 단백질 A 코팅된 센서를 사용하여 상청액으로부터 항체를 포획한 다음, 용액 중 FcgR 분석물의 결합에 의해 실험을 수행하였다. 야생형 IgG1, SE, P238D, V4 및 V12 항체를 포함한, 정제된 및 상청액 대조군 IgG1f를 또한 비교를 위해 포함시켰고, 이들 대조군 항체 각각은 예상된 FcgR 결합 특성을 입증하였다 (도 71). IgG2.3 항체는 또한, CD32a-H131에 대해서만 인지가능하게 결합하여, 예상된 결합 프로파일을 입증하였다. 그러나, IgG2.3 내로 S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, 또는 E233D 돌연변이를 도입한 모든 돌연변이는 상응하는 조작된 IgG1 mAb의 FcgR 친화도를 재현하는데 실패하였다 (도 71). 대조적으로, IgG2.3G1-AY 구축물은 IgG2.3의 CH1 및 힌지 영역을 보유하면서, 야생형 IgG1의 FcgR 결합 특성을 완전하게 보존할 수 있었다. 또한, S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, 및 E233D를 함유하는 모든 IgG2.3G1-AY 돌연변이체는, 동일한 돌연변이를 함유하는 IgG1 버전 mAb와 대등한 FcgR 결합 특성을 입증하였다 (도 71). 이는 야생형 또는 돌연변이체 IgG1의 이펙터 기능과 조합된, IgG2의 CH1 및 힌지 영역을 갖는 항체의 성공적인 조작을 입증한다.
표 12: 조작된 IgG2 구축물
이러한 조작 전략을 추가로, IgG2.3G1-AY로 포맷된 다른 항체, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), 뿐만 아니라 IgG2-B-형태 변이체 (IgG2.5G1-AY 및 IgG2.5G1-AY-V27), 및 IgG1 및 IgG2 불변 도메인의 상이한 조합을 함유하는 다른 하이브리드 항체를 생산하고, 비아코어 SPR 기술을 사용하여 항-his Fab 포획된 his-태그부착된 FcgR에 대한 이들 항체의 결합을 시험함으로써 연구하였다. 옥텟 상청액 데이터와 일치하게, SPR 데이터는 IgG2.3G1-AY 및 IgG2.3G1-AY-V27 항체가, A-형태 IgG2 항체 (IgG2.3)의 CH1 및 힌지 영역을 함유함에도 불구하고, 각각 IgG1f 및 IgG1f-S267E와 대등한 FcgR 결합 특성을 갖는다는 것을 보여주었다 (표 13). IgG2.5G1-AY 및 IgG2.5G1-AY-V27 항체를 사용하여 또한 유사한 데이터를 수득하였고, 이는 IgG1f 또는 변형된 IgG1f 유사 이펙터 기능을 갖는 B-형태 IgG2 항체 (C131S 돌연변이 함유, IgG2.5로 불림)의 성공적인 조작을 입증한다. IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY, 또는 IgG2.5G1-AY-V27 불변 영역을 갖지만 가변 영역이 상이한 여러 다른 항체에 대한 데이터는 이러한 조작 전략이 가변 도메인과 독립적으로 다른 항체에도 광범위하게 적용가능하다는 것을 보여준다 (표 13). IgG1f-유사 FcgR 결합 특성을 입증하는 다른 구축물은 IgG1-G2.3G1-AY, 및 IgG1델타THT이며, 반면에 IgG2.3G1-KH, IgG2.5G1-KH, IgG2.3플러스THT, IgG2.5플러스THT 및 IgG2.3플러스GGG 구축물을 포함한 여러 변형된 불변 영역 구축물은 IgG1f-유사 FcgR 결합 특성을 보유할 수 없었다 (표 13).
표 13: 항-his Fab 포획된 FcgR-his 단백질에 결합한 1 uM 항체에 대한 %Rmax 값
종합하면 이들 데이터는, 힌지 영역 내의 보존된 CPPCPAP (서열식별번호: 479) 모티프의 바로 C-말단의 IgG1의 서열이 FcgR-매개된 이펙터 기능을 부여하는 반면에, 항체의 CH1 및 힌지의 상부 부분은, IgG1 및 변형된 IgG1의 이펙터 기능을 IgG2 CH1 및/또는 힌지 영역을 함유하는 항체의 뛰어난 내재화 또는 신호전달 특성과 잠재적으로 조합하기 위해, IgG2 또는 변형된 IgG2 서열로 대체될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 27: GITR 효능제 항체 내재화는 IgG2 힌지 및 CH1 도메인을 갖는 항체에서 증진된다
GITR 발현을 유도하기 위해, 세포를 20 ng/ml 항-CD3 + 1000 ng/ml CD28과 함께 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. T-세포 활성화의 대안적 방법으로서, 3개의 단계의 배양 프로토콜에 의해 대형 배치의 활성화된 CD4+ T-세포를 제조하였다. 간략하게, CD4+ T-세포를 1 μg/ml 가용성 CD28이 보충된 플레이트 결합된 CD3 (1.5 μg/ml)으로 37℃에서 72시간 동안 자극하고, 배양물 중 20 u/ml IL-2의 존재 하에 14일 동안 확장시키고, 10 μg/ml PHA, 2 u/ml IL-2 및 1 μg/ml CD28을 37℃에서 72시간 동안 첨가하여 또 다른 활성화 라운드에 최종 노출시켰다. 자극된 T 세포를 384 웰 PDL 영상화 플레이트에 2시간 동안 시딩하여 세포를 부착시키고, 4℃에서 15분 동안 냉각시킨 다음, 알렉사(Alexa) 488-표지된 GITR 항체를 개별적으로 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 HCS에 의해 최종 영상화하고, 데이터를 세포당 총 강도로서 보고하였다.
상기 언급된 T 세포 활성화 방법을 사용하여 3종의 상이한 GITR 항체를 평가하였다. 이들은 G1 이소형으로서 GITR.6 항체 및 Fc 수용체에 결합할 수 없는 불활성 (IgG1.1) 이소형, 뿐만 아니라 IgG1 힌지 대신 IgG2 힌지를 갖는 키메라이다.
GITR 항체-유도된 내재화를 CD3-자극된 CD4+ T-세포에서 알렉사 켄칭 검정 포맷을 사용하여 평가하였다. 새로이 수득한 CD4-양성 T 세포를 상기 기재된 바와 같은 조건 하에 인큐베이션하여 GITR 발현을 유도하였다. 자극 후, 세포를 신선한 배지에 재현탁시키고, 다음과 같은 내재화 검정을 위해 플레이팅하였다. 세포를 상기 기재된 바와 같이 항체와 인큐베이션하고, 따뜻한 매질로 세척하고, 고정 및 켄칭 전 표시된 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 내재화된 항체는 시간 0에 관찰된 작은 켄칭불가능한 신호를 초과한 증가된 형광으로서 측정한 다음, 세포에 초기에 결합된 총 형광 "비켄칭된 대조군"에 대해 정규화하였다. 도 72에 제시된 바와 같이, GITR 라이게이션은 시험된 각각의 항체에 대해 30-60분 사이에 신속한 내재화 최고점을 발생시킨 반면, 대조군 항체는 형질 막에서 국재화를 유지하는 것으로 확인되었다. 결과는 IgG2 힌지 영역이 GITR 라이게이션 유도된 내재화를 증진시킨다는 것을 나타낸다.
내재화 및 연관 역학의 상세 메카니즘을 추가로 조사하기 위해, 항체 세포내이입 및 초기 엔도솜 구획 내로의 전달을 분석하였다. 본 실험에서, 세포를 비표지된 항체를 사용한 펄스 추적 분석에 적용하였다. 고정 시, 세포는 투과화되었고, 초기 엔도솜 마커 EEA1 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology))에 대해 염색하고, 세척한 다음, 알렉사 플루오르-488 접합된 항-토끼 2차 항체 (EEA1) 및 알렉사 플루오르-647 접합된 항-인간 항체 (GITR)로 검출하였다. 플레이트를 60X 수침 대물렌즈가 구비된 오페라 공초점 시스템 상에서 영상화하였다. 결과는 막 결합된 항-GITR 항체 염색과 세포내 EEA1 신호 사이의 분명한 분리를 나타내었다. 배양물의 가온 시, 엔도솜 단백질과의 공동-국재화로 보이는 일부 항체의 군집화가 검출되었다. HCS 스튜디오 소프트웨어를 사용하여 엔도솜 공동-국재화의 정량화를 수행하였고, 결과를 총 염색 대비 공동국재화된 픽셀 강도의 비로서 플롯팅하였다 (도 73a-c). GITR 항체 및 초기 엔도솜의 공동국재화는 30분에 가장 우세하였다. 이러한 시험된 시점에, GITR.6.G2.G1f는 GITR.6.G1f 항체보다 더 높은 공동국재화된 분획을 나타내었다. 공동국재화 결과는 상기 기재된 알렉사 켄칭 방법을 사용하여 이루어진 관찰과 상관되었고, 이는 G2 힌지가 GITR 내재화를 유도하는데 G1보다 잠재적 이점을 갖는다는 것을 시사하는 모델을 지지한다.
실시예 28: T 세포 수용체 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 GITR 효능제 항체 신호전달은 IgG2 힌지 및 CH1 도메인을 갖는 항체에서 증진된다
항-GITR 효능제 항체에 대한 메카니즘을 추가로 조사하기 위해, T 세포 활성화에 수반되는 여러 신호전달 경로, 예컨대 NFkB 및 P38 신호전달 경로를 모니터링하였다.
건강한 공여자 (M6576)로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 플레이트-코팅된 0.4 μg/ml 항-CD3 및 0.4 μg/ml 항-CD28로 활성화하였다. 3일 후에, 세포를 수집하고, 신호전달 활성화를 위해 384-웰 영상 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포를 2시간 동안 플레이트에 침강시킨 후, 이를 항-GITR 항체로 15분 동안 처리하고, 포름알데히드를 최종 10%로 검정 플레이트에 첨가하여 신호전달 사건을 종결시켰다. 이어서 세포가 투과화되었고, 신호전달 검출을 위해 인광체-p65 NFKB 항체로 염색하였다. 도 74a 및 74b에 제시된 바와 같이, GITR.6.G2 및 GITR.6.G2.G1f 항체는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서 GITR.6.G1f와 비교하여 더 높은 신호전달 반응을 가졌다. 내재화와 신호전달 경로 활성화를 연결하는 어떠한 직접 증거도 존재하지 않지만, G2 이소형이 GITR.6의 경우 IgG1과 비교하여 항체 기능적 활성의 둘 다의 측면을 개선시키는 것으로 보인다고 주목되는 것은 흥미롭다.
각각의 항체에 대해 신호전달 활성을 정량화하기 위해, 각각의 항체에 대해 EC50 및 Emax 둘 다를 계산하였고, 이는 둘 다의 파라미터가 신호전달 사건의 전체 정도를 포획하는데 중요하기 때문이다. GITR.6.G2.G1f의 반응 수준을 100% 대조군인 것으로 선택하고, 모든 다른 항체를 그에 대해 정규화하였다. 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 둘 다에 대해 표 14에 제시된 바와 같이, 효력 (EC50) 및 효능 (Emax%) 둘 다의 관점에서 GITR 항체에 대한 활성의 범위가 존재하였다. GITR.6.G2, GITR.6.G2.G1f 및 GITR.6.G1f가 약 10 nM 범위의 유사한 효력 (EC50)을 나타내었지만, 효능 (Emax)은 상이한 이소형에 대해 매우 상이하였고, 이는 G1 항체가 G2 또는 키메라 이소형만큼 효과적으로 신호전달하지 않는다는 것을 시사한다.
표 14. TCR 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 GITR HuMab NFKB 신호전달 활성의 요약
GITR.6.G1f와 비교하여 GITR.6.G2 및 GITR.6.G2.G1f의 신호전달 차이가 NFkB 신호전달에만 제한되는지 또는 다른 신호전달 사건에서도 또한 마찬가지인지 여부를 추가로 확인하기 위해, P38MAPK 신호전달 판독을 연구하였다. 도 75에 제시된 바와 같이, GITR.6.G2 및 GITR.6.G2.G1f 항체는 CD4+ 세포 p38 MAPK 활성화 검정에서 GITR.6.G1f 항체와 비교하여 더 높은 신호전달 반응을 가졌다. 따라서, G1 이소형과 비교하여 GITR.6 G2 이소형의 경우 보다 나은 신호전달 활성은 NFkB 신호전달에만 제한되지 않는다.
실시예 29: T 세포에 대한 GITR 효능작용을 개선시키는데 있어서 IgG2 CH1 및 힌지 내 특정 아미노산 잔기의 관련성
28F3의 중쇄 불변 영역을 갖는 항-GITR 항체 (GITR.6)를 제조하고, 이를 실시예 25에 기재된 바와 같은 IL-2 생산 검정에서 시험하되, 상청액을 48시간이 아닌 40시간에 수거하였다. 결과를 도 76a-d에 제시한다.
표 15: 서열 목록의 요약
표 15는 성숙 가변 영역 및 중쇄 및 경쇄의 서열, 및 표시된 경우에 신호 펩티드를 갖는 서열을 제공한다. 그의 C-말단이 K 또는 GK로 표시된 중쇄는 또한 K 또는 GK 없이 사용될 수 있다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용을 넘지 않는 실험을 사용하여 본원에 개시된 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
<120> ANTIBODIES AGAINST GLUCOCORTICOID-INDUCED TUMOR NECROSIS FACTOR
RECEPTOR (GITR) AND USES THEREOF
<130> MXI-547PC
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently herewith
<150> US 62/257,599
<151> 2015-11-19
<150> US 62/303,990
<151> 2016-03-04
<160> 543
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(241)
<223> Human GITR isoform 1
<400> 1
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(255)
<223> Human GITR isoform 2
<400> 2
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Cys Trp Arg Cys Arg Arg Arg Pro Lys Thr
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Ser Ser Pro Arg Lys Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gln
145 150 155 160
Arg Arg Arg Gly Gly Trp Glu Thr Cys Gly Cys Glu Pro Gly Arg Pro
165 170 175
Pro Gly Pro Pro Thr Ala Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ala Pro Gln Ala
180 185 190
Ala Gly Ala Leu Arg Ser Ala Leu Gly Arg Ala Leu Leu Pro Trp Gln
195 200 205
Gln Lys Trp Val Gln Glu Gly Gly Ser Asp Gln Arg Pro Gly Pro Cys
210 215 220
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gly Pro Cys Arg Arg Glu Arg Glu Thr Gln
225 230 235 240
Ser Trp Pro Pro Ser Ser Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Gly Ser
245 250 255
<210> 3
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(234)
<223> Human GITR isoform 3
<400> 3
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Lys Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
195 200 205
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
210 215 220
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
225 230
<210> 4
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(137)
<223> Human GITR (mature)
<400> 4
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met
35 40 45
Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys
65 70 75 80
Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser
85 90 95
Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe
100 105 110
Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys
115 120 125
Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro
130 135
<210> 5
<211> 235
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(235)
<223> Cynomolgus GITR
<400> 5
Met Cys Ala Ser Gly Thr Leu Cys Cys Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ala
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg
20 25 30
Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Pro
35 40 45
Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Gln Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp
50 55 60
Asp Cys Val Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asn Pro Cys Cys
65 70 75 80
Thr Thr Cys Gln His His Pro Cys Pro Ser Gly Gln Gly Val Gln Pro
85 90 95
Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Arg Cys Val Asp Cys Ala Leu Gly
100 105 110
Thr Phe Ser Arg Gly His Asp Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys
115 120 125
Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn
130 135 140
Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Pro Gly Trp Leu
145 150 155 160
Thr Ile Ile Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser
165 170 175
Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Pro Thr Gly
180 185 190
Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp
195 200 205
Ala Ser Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Leu Ala
210 215 220
Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
225 230 235
<210> 6
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(199)
<223> Human GITR-L
<400> 6
Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro
20 25 30
Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu
35 40 45
Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser
50 55 60
Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys
65 70 75 80
Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser
85 90 95
Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn
115 120 125
Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp
130 135 140
Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser
165 170 175
Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu
180 185 190
Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
195
<210> 7
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> Human IgG1 constant domain
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 8
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> Human IgG1 constant domain (allotypic variant)
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 9
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> Human IgG1constant domain with L234A, L235E, and G237A mutations
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 10
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> Human IgG1constant domain with A330S and P331S mutations
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> Human IgG1.1 constant domain (L234A, L235E, G237A, A330S, and
P331S mutations)
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> Human IgG1 kappa light chain constant region (CL)
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 13
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VL)
<400> 14
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (full length wild-type heavy chain)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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Gly Gly Gln Leu Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Val
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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Ala Arg Gly Gly Arg Ile Ala Val Ala Phe Tyr Tyr Ser Met Asp Val
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Ile Ala Val Ala Phe Tyr Tyr Ser Met Asp Val
100 105 110
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Ala Arg Gly Gly Arg Ile Ala Val Ala Phe Tyr Tyr Ser Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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275 280 285
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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245 250 255
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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<211> 9
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<400> 52
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Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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50 55 60
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100 105
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<220>
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<400> 55
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65 70 75 80
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85 90 95
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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<400> 56
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
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165 170 175
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 57
<211> 213
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 57
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Thr
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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130 135 140
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<220>
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Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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<213> Artificial Sequence
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210
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1 5
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<400> 71
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 72
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (full length wild-type heavy chain)
<400> 73
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Leu Ala Thr Gly His Phe Tyr Tyr Val Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
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210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (full length wild-type light chain)
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6.IgG1 (VH + IgG1)
<400> 75
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1 5 10 15
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
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210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 76
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6.IgG1.1 (VH + IgG1.1)
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Leu Ala Thr Gly His Phe Tyr Tyr Val Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
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420 425 430
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165 170 175
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195 200 205
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275 280 285
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325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Phe Gly Ser Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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210 215 220
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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115 120 125
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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195 200 205
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
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435 440 445
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3.IgG1.1 (VH + IgG1.1)
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 121
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3.IgG1 (VL + CL)
<400> 121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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210
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1 5
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Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
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115 120 125
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<212> PRT
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 133
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 133
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 135
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8.IgG1.1 (VH + IgG1.1)
<400> 135
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
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Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8.IgG1 (VL1 + CL)
<400> 136
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8.IgG1.2 (VL2 + CL)
<400> 137
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VH CDR1
<400> 138
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 139
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VH CDR2
<400> 139
Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VH CDR3
<400> 140
Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL1 CDR1
<400> 141
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL1 CDR2
<400> 142
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL1 CDR3
<400> 143
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln Thr
1 5
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL2 CDR1
<400> 144
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL2 CDR2
<400> 145
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 VL2 CDR3
<400> 146
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 147
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH) nucleotide sequence
<400> 147
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 148
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VL) nucleotide sequence
<400> 148
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 149
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 149
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
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aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 150
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 150
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
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cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 151
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1 (VH + IgG1) nucleotide sequence
<400> 151
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 840
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900
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tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140
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acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1260
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggtt ga 1362
<210> 152
<211> 1362
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1.1 (VH + IgG1.1) nucleotide sequence
<400> 152
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720
gccgaagggg ccccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 840
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccaag cagcatcgag 1020
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1260
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggtt ga 1362
<210> 153
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1 (VL + CL) nucleotide sequence
<400> 153
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 154
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 (VH) nucleotide sequence
<400> 154
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccaac ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggct tccactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctaag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cagttggact actactacta ttacgttatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 155
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 (VL) nucleotide sequence
<400> 155
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 156
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 156
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccaac ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggct tccactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctaag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cagttggact actactacta ttacgttatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 420
acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 600
acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 660
gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 900
acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 157
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 157
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 158
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 18E10 (VH) nucleotide sequence
<400> 158
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
cgtatagcag tggccttcta ctacagtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 159
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 18E10 (VL) nucleotide sequence
<400> 159
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 160
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 18E10 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 160
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
cgtatagcag tggccttcta ctacagtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 420
acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 600
acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 660
gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 900
acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 161
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 18E10 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 161
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 162
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 (VH) nucleotide sequence
<400> 162
caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggacctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gtggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actgggggcc 300
tttgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351
<210> 163
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 (VL1) nucleotide sequence
<400> 163
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 164
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 (VL2) nucleotide sequence
<400> 164
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggcc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcacacttt tggccagggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 165
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 165
caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggacctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gtggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actgggggcc 300
tttgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 166
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 L1 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 166
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 167
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 L2 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 167
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggcc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcacacttt tggccagggg 300
accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639
<210> 168
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (VH) nucleotide sequence
<400> 168
caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt catcttgagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgacagtt atctggtatg atggaagtaa taaattctat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cgtctagcaa caggtcactt ctactacgtt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (VL) nucleotide sequence
<400> 169
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 170
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 170
caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt catcttgagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgacagtt atctggtatg atggaagtaa taaattctat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cgtctagcaa caggtcactt ctactacgtt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 171
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 2G6 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 171
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 172
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 (VH) nucleotide sequence
<400> 172
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcagtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaaa attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggcggt 300
cttatggttc ggggtctctt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 173
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 (VL) nucleotide sequence
<400> 173
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 174
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 174
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcagtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaaa attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggcggt 300
cttatggttc ggggtctctt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 175
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 175
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 176
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 (VH) nucleotide sequence
<400> 176
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt accgtctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcacacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300
gggcagctga tcccttactc ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacctcg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 177
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 (VL1) nucleotide sequence
<400> 177
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 178
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 (VL2) nucleotide sequence
<400> 178
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gagaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 179
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 179
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt accgtctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcacacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300
gggcagctga tcccttactc ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacctcg 360
gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 420
aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600
ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagagagttg agtccaaata tggtccccca tgcccatcat gcccagcacc tgagttcctg 720
gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 840
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1356
<210> 180
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 L2 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 180
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gagaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 L1 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 181
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 182
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 (VH) nucleotide sequence
<400> 182
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggagaa atcaatcata gtggaaacac ctactacaac 180
ccgtccctca agagtcgcgt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttatccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atttgggagt 300
aatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351
<210> 183
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 (VL) nucleotide sequence
<400> 183
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 184
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 184
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggagaa atcaatcata gtggaaacac ctactacaac 180
ccgtccctca agagtcgcgt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttatccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atttgggagt 300
aatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 185
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 185
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 186
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 (VH) nucleotide sequence
<400> 186
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg gtggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa ctcgctgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
gctatggttc ggggagtcta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 187
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 (VL1) nucleotide sequence
<400> 187
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcagac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 188
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 (VL2) nucleotide sequence
<400> 188
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 189
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 (full length wild-type heavy chain) nucleotide
sequence
<400> 189
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg gtggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa ctcgctgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
gctatggttc ggggagtcta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 190
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 L1 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 190
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcagac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 191
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19H8 L2 (full length wild-type light chain) nucleotide
sequence
<400> 191
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 192
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-33 (28F3, 18E10, 19D3, 2G6, 8A6, 19H8)
<400> 192
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 193
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-10 (28F3, 8A6)
<400> 193
Met Val Arg Gly
1
<210> 194
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-10 (9G7)
<400> 194
Tyr Tyr Tyr Gly
1
<210> 195
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-10 (19H8)
<400> 195
Tyr Tyr Tyr
1
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH JH6 (28F3, 19H8)
<400> 196
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH JH6 (18E10, 2G6, 8A6)
<400> 197
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 198
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH JH6 (19D3, 9G7)
<400> 198
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210> 199
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 6-19 (18E10)
<400> 199
Ile Ala Val Ala
1
<210> 200
<211> 2
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-16 (19D3)
<400> 200
Asp Tyr
1
<210> 201
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 4-34 (3C3, 14E3)
<400> 201
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 202
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH JH3 (3C3, 14E3)
<400> 202
Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 203
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VH 3-15 (9G7)
<400> 203
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 204
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL L18 (28F3, 8A6, 19H8VK1)
<400> 204
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr
85 90
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK2 (28F3, 18E10, 19D3, 3C3VK1, 8A6, 2G6)
<400> 205
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK2 (3C3VK2)
<400> 206
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 207
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL L15 (18E10, 19D3, 3C3VK1, 2G6, 14E3)
<400> 207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
85 90
<210> 208
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL L20 (3C3VK2)
<400> 208
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
<210> 209
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL A27 (9G7VK1, 9G7VK2)
<400> 209
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
<210> 210
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK1 (9G7VK1)
<400> 210
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK1 (14E3, 19H8VK1)
<400> 211
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 212
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK5 (9G7VK2)
<400> 212
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 213
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL L6 (19H8VK2)
<400> 213
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: VL JK4 (19H8VK2)
<400> 214
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 215
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: GITR epitope
<400> 215
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
35
<210> 216
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: GITR epitope
<400> 216
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr
20
<210> 217
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: GITR epitope (region 1)
<400> 217
Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Thr
<210> 218
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: GITR epitope (region 2)
<400> 218
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu
1 5
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Peptide linker
<400> 219
Pro Val Gly Val Val
1 5
<210> 220
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Heavy chain C-terminus
<400> 220
Leu Ser Pro Gly Lys
1 5
<210> 221
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: G2 constant region
<400> 221
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 222
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 222
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 223
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 223
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 224
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 224
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 225
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: G2(C219S).g1 modified constant region
<400> 225
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 226
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: G2(C219S).g1.1 modified constant region
<400> 226
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 227
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH + G2(C219S)) or; 28F3-IgG2-C219S
<400> 227
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 228
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH + G2.g1) or; 28F3-IgG2-IgG1
<400> 228
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 229
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH + G2.g1.1) or; 28F3-IgG2-IgG1.1
<400> 229
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Gly
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<220>
<223> Synthetic: 28F3 (VH + G2(C219S).g1) or ; 28F3-IgG2-C219S-IgG1
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
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435 440 445
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20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Heavy chain C-terminus
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1
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<400> 277
000
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<212> PRT
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<210> 279
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(98)
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20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 280
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Wildtype human IgG1 CH2
<400> 280
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
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35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 281
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Human IgG1 CH2 with A330S/P331S
<400> 281
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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20 25 30
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35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 282
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> Wildtype human IgG1 CH3
<400> 282
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 283
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2-IgG1f
<400> 283
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 284
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2CS-IgG1f
<400> 284
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
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130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 285
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2-IgG1.1f
<400> 285
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Arg Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 286
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2CS-IgG1.1f
<400> 286
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 287
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2-1gG1f2
<400> 287
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 288
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2(C219S)-IgG1f2
<400> 288
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 289
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2-IgG1f2
<400> 289
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 290
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2(C219S)-IgG1f2
<400> 290
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 291
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> WT human IgG2 hinge
<400> 291
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 292
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> Human IgG2 hinge with C219S
<400> 292
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 293
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2/IgG1 hinge
<400> 293
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 294
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 (C219S)/IgG1 hinge
<400> 294
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 295
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> Wild type human IgG1 hinge
<400> 295
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly
20
<210> 296
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1.1 Hinge (L234A/L235E/G237A)
<400> 296
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala
20
<210> 297
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Wildtype human IgG2 CH2
<400> 297
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100
<210> 298
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> Wildtype human IgG2 CH3
<400> 298
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 299
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 C-termianl CH1 (same for IgG3 (17-15-15-15), igG3
(17-15-15), IgG3 (17-15), IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), and IgG4
<400> 299
Val Asp Lys Arg Val
1 5
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 C-termianl CH1
<400> 300
Val Asp Lys Thr Val
1 5
<210> 301
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 upper hinge
<400> 301
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 302
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15-15) upper hinge (same for IgG3
(17-15-15) and IgG3 (17-15))
<400> 302
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 303
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15-15-15) upper hinge (same for IgG3(15))
<400> 303
Glu Pro Lys Ser
1
<210> 304
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4 upper hinge
<400> 304
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
1 5
<210> 305
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 middle hinge
<400> 305
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 middle hinge
<400> 306
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 307
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15-15) middle hinge
<400> 307
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
35 40 45
Cys Pro
50
<210> 308
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15) middle hinge
<400> 308
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro
35
<210> 309
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15) middle hinge
<400> 309
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro
20
<210> 310
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15-15-15) middle hinge
<400> 310
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
20 25 30
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
35 40
<210> 311
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15) middle hinge
<400> 311
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4 middle hinge
<400> 312
Cys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 lower hinge (same for IgG3 (17-15-15-15), IgG3
(17-15-15), IgG3 (17-15), IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), and IgG4)
<400> 313
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 lower hinge
<400> 314
Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5
<210> 315
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 VH signal sequence (same for 18E10, 19D3, 19H8,
6G10)
<400> 315
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 316
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 VH signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 316
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr
20 25 30
Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr
50 55
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 VL signal sequence (same for 18E10, 8A6, 19H8VL1,
6G10)
<400> 317
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 318
<211> 64
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3 VL signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 318
Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Cys
1 5 10 15
Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly
35 40 45
Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr
50 55 60
<210> 319
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 VL signal sequence
<400> 319
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys
20
<210> 320
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 19D3 VL signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 320
Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala
35 40 45
Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr
50 55 60
<210> 321
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VH signal sequence (same for 14E3)
<400> 321
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 322
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VH signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 322
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys
50 55
<210> 323
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VL signal sequence (same for 14E3)
<400> 323
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 324
<211> 66
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VL signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 324
Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Cys
1 5 10 15
Thr Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr
50 55 60
Gly Thr
65
<210> 325
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VL2 signal sequence (same for 19H8 VL2)
<400> 325
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 326
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3C3 VL2 signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 326
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala
35 40 45
Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala
50 55 60
<210> 327
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 VH signal sequence
<400> 327
Met Glu Phe Gly Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 328
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8A6 VH signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 328
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr
20 25 30
Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr
50 55
<210> 329
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 VH signal sequence
<400> 329
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Ala Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 330
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 VH signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 330
Ala Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Gly Cys
20 25 30
Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Thr
50 55
<210> 331
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 VL1 and VL2 signal sequence
<400> 331
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 332
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 9G7 VL1 and VL2 signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 332
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala
35 40 45
Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala
50 55 60
<210> 333
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 VH signal sequence
<400> 333
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 334
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14E3 VH signal sequence (nucleotide sequence)
<400> 334
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys
50 55
<210> 335
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 (VH)
<400> 335
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 336
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 (VL)
<400> 336
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 337
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 (full length wild-type heavy chain)
<400> 337
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 338
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 (full length wild-type light chain)
<400> 338
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 339
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10.IgG1 (VH + IgG1)
<400> 339
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 340
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10.IgG1.1 (VH + IgG1.1)
<400> 340
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 341
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10.IgG1 (VL + CL)
<400> 341
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 342
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VH CDR1
<400> 342
Thr Tyr Gly Met His
1 5
<210> 343
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VH CDR2
<400> 343
Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 344
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VH CDR3
<400> 344
Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 345
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VL CDR1
<400> 345
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 346
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VL CDR2
<400> 346
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 347
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 VL CDR3
<400> 347
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 348
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6G10 (VH + G2(C219S)) or 6G10-IgG2-C219S
<400> 348
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 349
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 349
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210 215 220
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Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys
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260 265 270
Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
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930 935 940
Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly
1250 1255 1260
Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys
1265 1270 1275
Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly
1280 1285 1290
Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys
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Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly
1310 1315 1320
Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly
1325 1330 1335
Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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sequence
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Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala
50 55 60
Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala
65 70 75 80
Gly Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr
85 90 95
Thr Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys
100 105 110
Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys
115 120 125
Thr Cys Cys Thr Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys
130 135 140
Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr
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Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys
165 170 175
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Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly
195 200 205
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210 215 220
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr
245 250 255
Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr
260 265 270
Thr Ala Ala Thr Ala Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Gly Thr Ala Cys
275 280 285
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290 295 300
Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala
305 310 315 320
Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala
325 330 335
Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr
340 345 350
Thr Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala
355 360 365
Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala
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385 390 395 400
Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Thr
405 410 415
Cys Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys
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Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly
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Gly Ala Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys
485 490 495
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Gly Cys Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys
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Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Thr
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<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
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aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagaggggg gagtatggtt 360
cggggggact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ID NO: 148 with sequence encoding signal peptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide
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65 70 75 80
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100 105 110
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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435 440 445
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1.1 (VH + IgG1.1) (SEQ ID NO: 18) with signal
peptide
<400> 362
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1 5 10 15
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20 25 30
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
35 40 45
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50 55 60
Val Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Cys Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 363
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1 (VH + IgG1) with signal peptide nucleotide
sequence; SEQ ID NO: 151 with sequence encoding signal peptide
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aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagaggggg gagtatggtt 360
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gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
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cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 780
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<210> 364
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1.1 (VH + IgG1.1) with signal peptide
nucleotide sequence; SEQ ID NO: 152 with sequence encoding signal
peptide
<400> 364
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ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca 120
gcgtctggat tcaccttcag tagctatggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag 180
gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gaaggaagta ataaatatta tgcagactcc 240
gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 300
aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagaggggg gagtatggtt 360
cggggggact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgaaggg 780
gccccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccaa gcagcatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260
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<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1 (VL+CL) (SEQ ID NO: 19) with signal peptide
<400> 365
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1 5 10 15
Ala Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
20 25 30
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
35 40 45
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
100 105 110
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 366
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 28F3.IgG1 (VL+CL) with signal peptide nucleotide
sequence; SEQ ID NO: 153 with signal sequence
<400> 366
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgccatccag 60
ttgacccagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 120
cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcctggtatc agcagaaacc agggaaagct 180
cctaagctcc tgatctatga tgcctccagt ttggaaagtg gggtcccatc aaggttcagc 240
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt 300
gcaacttatt actgtcaaca gtttaatagt tacccgtaca cttttggcca ggggaccaag 360
ctggagatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 420
cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 480
gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 540
acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 600
gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 660
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Signal peptide
<400> 367
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 368
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Signal peptide nucleotide sequence
<400> 368
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccggga gagcgctcgc a 51
<210> 369
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Signal peptide nucleotide sequence
<400> 369
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc c 51
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<211> 31
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<222> (1)..(31)
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<400> 370
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Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 371
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 373
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Gly
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<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Gly
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Gly Gly Ser Xaa Val Arg Gly Xaa Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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acids 3 - 9 may be absent
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Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Asp Val Trp Tyr Tyr Xaa
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Met Asp Val Trp
20
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acids 6 - 8 may be absent
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Arg Ala Ser Gln Gly Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Leu Ala
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<400> 380
Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Gln Gln Xaa Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: degenerate VL CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 382
Gln Gln Xaa Xaa Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 383
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2.3
<400> 384
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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305 310 315 320
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325
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<213> Artificial Sequence
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 386
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2.3G1-KH
<400> 386
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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165 170 175
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 387
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2.3G1.1f-KH
<400> 389
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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100 105 110
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
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195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
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305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<211> 327
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
275 280 285
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Gly Lys
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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65 70 75 80
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100 105 110
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
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130 135 140
Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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Ala Gly Xaa
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Ala Gly Xaa
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Ala Gly Xaa
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Leu Gly Gly
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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Glu Arg Lys Cys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly
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<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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<222> (5)..(5)
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 476
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<213> Artificial Sequence
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 480
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 481
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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100 105 110
Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 482
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100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Glu Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 483
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1 5 10 15
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
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195 200 205
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
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260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1f-GASDALIE
<400> 484
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 541
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4.1-R214T
<400> 541
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 542
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4.1-S217R
<400> 542
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
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20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Arg Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 543
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4.1-S217P
<400> 543
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
Claims (68)
- 인간 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, (1) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아닌 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서, 항체가 항종양 면역 반응을 자극하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 GITR-발현 T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 T 세포 증식을 증가시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fc 수용체에 결합하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 1개 이상의 활성화 FcγR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 비아코어에 의해 측정 시 100 nM 이하의 KD로 가용성 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 스캐차드에 의해 측정 시 1 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 1 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 인간 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 10 nM 이하의 EC50으로 막 결합된 시노몰구스 GITR에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다가 가교를 필요로 하지 않으면서 T 세포 활성화를 유도하거나 증진시키는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 FACS에 의해 측정 시 1 μg/mL 이하의 EC50으로 GITR 리간드가 GITR에 결합하는 것을 억제하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 쌍으로 3개의 가변 중쇄 CDR 및 3개의 가변 경쇄 CDR을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 서열식별번호: 335 및 336. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(b) 각각 서열식별번호: 33, 34, 및 35를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 36, 37, 및 38을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(c) 각각 서열식별번호: 46, 47, 및 48을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 49, 50, 및 51을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(d) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 65, 66, 및 67을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(e) 각각 서열식별번호: 62, 63, 및 64를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 68, 69, 및 70을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(f) 각각 서열식별번호: 78, 79, 및 80을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 81, 82, 및 83을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(g) 각각 서열식별번호: 91, 92, 및 93을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 94, 95, 및 96을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(h) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 109, 110, 및 111을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(i) 각각 서열식별번호: 106, 107, 및 108을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 112, 113, 및 114를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(j) 각각 서열식별번호: 122, 123, 및 124를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 125, 126, 및 127을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(k) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 141, 142, 및 143을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열;
(l) 각각 서열식별번호: 138, 139, 및 140을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 144, 145, 및 146을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 또는
(m) 각각 서열식별번호: 342-344를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 345-347을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열. - 제16항에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25를 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제16항에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 33, 34, 및 35를 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 36, 37, 및 38을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제16항에 있어서, 항체가 각각 서열식별번호: 46, 47, 및 48을 포함하는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열식별번호: 49, 50, 및 51을 포함하는 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이고, (1) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아닌 것인, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, 및 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 중쇄는 (1) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 (2) 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 아미노산 변형(들)은 자연 발생 인간 중쇄 불변 영역에 존재하지 않는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543 내의 특정 아미노산(들)에서 이루어진 것이 아닌 것인, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 13 및 14;
(b) 각각 서열식별번호: 26 및 27;
(c) 각각 서열식별번호: 39 및 40;
(d) 각각 서열식별번호: 52 및 53;
(e) 각각 서열식별번호: 52 및 54;
(f) 각각 서열식별번호: 71 및 72;
(g) 각각 서열식별번호: 84 및 85;
(h) 각각 서열식별번호: 97 및 98;
(i) 각각 서열식별번호: 97 및 99;
(j) 각각 서열식별번호: 115 및 116;
(k) 각각 서열식별번호: 128 및 129;
(l) 각각 서열식별번호: 128 및 130; 및
(m) 각각 서열식별번호: 335 및 336. - 제22항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제23항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제24항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 (a)-(m)으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제25항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제25항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제25항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR)에 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분:
(a) 각각 서열식별번호: 15 및 16;
(b) 각각 서열식별번호: 17 및 19;
(c) 각각 서열식별번호: 18 및 19;
(d) 각각 서열식별번호: 28 및 29;
(e) 각각 서열식별번호: 30 및 32;
(f) 각각 서열식별번호: 31 및 32;
(g) 각각 서열식별번호: 41 및 42;
(h) 각각 서열식별번호: 43 및 45;
(i) 각각 서열식별번호: 44 및 45;
(j) 각각 서열식별번호: 55 및 56;
(k) 각각 서열식별번호: 55 및 57;
(l) 각각 서열식별번호: 58 및 60;
(m) 각각 서열식별번호: 59 및 60;
(n) 각각 서열식별번호: 58 및 61;
(o) 각각 서열식별번호: 59 및 61;
(p) 각각 서열식별번호: 73 및 74;
(q) 각각 서열식별번호: 75 및 77;
(r) 각각 서열식별번호: 76 및 77;
(s) 각각 서열식별번호: 86 및 87;
(t) 각각 서열식별번호: 88 및 90;
(u) 각각 서열식별번호: 89 및 90;
(v) 각각 서열식별번호: 102 및 104;
(w) 각각 서열식별번호: 103 및 104;
(x) 각각 서열식별번호: 100 및 101;
(y) 각각 서열식별번호: 100 및 371;
(z) 각각 서열식별번호: 102 및 105;
(za) 각각 서열식별번호: 103 및 105;
(zb) 각각 서열식별번호: 117 및 118;
(zc) 각각 서열식별번호: 119 및 121;
(zd) 각각 서열식별번호: 120 및 121;
(ze) 각각 서열식별번호: 131 및 132;
(zf) 각각 서열식별번호: 134 및 136;
(zg) 각각 서열식별번호: 135 및 136;
(zh) 각각 서열식별번호: 131 및 133;
(zi) 각각 서열식별번호: 134 및 137;
(zj) 각각 서열식별번호: 135 및 137;
(zk) 각각 서열식별번호: 337 및 338;
(zl) 각각 서열식별번호: 339 및 341; 및
(zm) 각각 서열식별번호: 340 및 341. - 제29항에 있어서, 중쇄가 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제30항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제30항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열에 포괄되는 가변 도메인 및 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- (a) 제25항의 항체와 GITR 상의 동일한 에피토프에 결합하고, (b) 제25항의 항체가 활성화된 T 세포 상의 GITR에 결합하는 것을 FACS에 의해 측정 시 적어도 90%만큼 억제하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제15항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 성숙 인간 GITR (서열식별번호: 4)의 PTGGPGCGPGRLLLGTGT (서열식별번호: 217) 및 CRDYPGEE (서열식별번호: 218)에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제15항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 및 시노몰구스 GITR 둘 다에 결합하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제36항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제36항에 있어서, 항체가 무이펙터 IgG1 Fc를 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제38항에 있어서, 하기 돌연변이: L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S를 포함하는 무이펙터 IgG1 Fc를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제36항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 활성화 FcγR에 대해 증진된 결합을 갖는 Fc를 포함하는 것인 항체.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, CDR 영역 내 메티오닌 잔기가 산화를 겪지 않은 아미노산 잔기로 치환된 것인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제15항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
- 제2 결합 특이성을 갖는 분자에 연결된, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 이중특이적 분자.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
- 제44항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제45항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
- 작용제에 연결된, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 면역접합체.
- 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체, 및 담체를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 이중특이적 분자, 또는 면역접합체, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
- 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제46항의 세포에서 발현시키고, 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 세포로부터 단리하는 것을 포함하는, 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
- 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 T 세포를 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법.
- 이펙터 T 세포를 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체, 및 CD3과 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 이펙터 T 세포가 활성화 또는 공동-자극되는 것인, 이펙터 T 세포를 활성화 또는 공동-자극하는 방법.
- T 세포를 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 방법.
- T 세포를 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체와 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식을 증가시키는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여 T 세포로부터 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체에서 T 세포에서의 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 방법.
- 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여, T 조절 세포의 수의 감소 또는 고갈을 필요로 하는 대상체의 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소시키는 것을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 이펙터 또는 증진된 이펙터 기능을 갖는 것인, 상기 종양에서 T 조절 세포의 수를 감소 또는 고갈시키는 방법.
- 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
- 제57항에 있어서, 대상체가 종양을 갖고, 종양에 대한 면역 반응이 자극되는 것인 방법.
- 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
- 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제43항 및 제47항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역접합체를 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
- 제60항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁/자궁경부암, 난소암, 전립선암, 고환암, 식도암, 위장암, 췌장암, 결장직장암, 결장암, 신장암, 두경부암, 폐암, 위암, 배세포암, 골암, 간암, 갑상선암, 피부암, 중추 신경계의 신생물, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 및 바이러스-관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 암이 전이성 암, 불응성 암 또는 재발성 암인 방법.
- 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제63항에 있어서, 추가의 요법이 항-PD1 항체, LAG-3 항체, CTLA-4 항체 또는 PD-L1 항체인 방법.
- 샘플을 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 글루코코르티코이드-유도성 TNF 수용체 (GITR) 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 GITR의 존재를 검출하는 방법.
- IgG2 힌지 및 IgG2 이소형의 것이 아닌 CH1, CH2 및 CH3 중 적어도 1개를 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 단리된 항-GITR 항체이며, 여기서 항-GITR 항체가 비-IgG2 힌지를 갖는 것을 제외하고는 동일한 항-GITR 항체에 비해 증진된 효능제 활성을 갖는 것인 단리된 항-GITR 항체.
- 제66항에 있어서, 변형된 중쇄 불변 영역이 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 서열식별번호: 223-226, 283-290, 383-446 및 480-543의 아미노산 서열과 최대 5개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 단리된 항-GITR 항체.
- 제67항에 있어서, 중쇄가 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, 및 362의 아미노산 서열과 최대 10개의 아미노산이 상이하거나 또는 그와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄를 포함하는 것인 단리된 항-GITR 항체.
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