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JP2002540127A - コレステロールのレベルをもたらすための組成物および方法 - Google Patents

コレステロールのレベルをもたらすための組成物および方法

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JP2002540127A
JP2002540127A JP2000607588A JP2000607588A JP2002540127A JP 2002540127 A JP2002540127 A JP 2002540127A JP 2000607588 A JP2000607588 A JP 2000607588A JP 2000607588 A JP2000607588 A JP 2000607588A JP 2002540127 A JP2002540127 A JP 2002540127A
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polypeptide
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cholesterol
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マイケル ジェイ，
ケビン ジェイ． リンチ，
ディリップ ブイ． アミン，
キム−アン チ ドーン，
ドーン マーチャディア，
シリル モージエ，
ダニエル ジェイ． レイダー，
ジョン エイ． クローイエック，
ビクトリア ジェイ． サウス，
Original Assignee
アベンティス ファーマスーティカルズ プロダクツ インコーポレイテッド
ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルベニア
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者においてＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを上昇させるため、そして患者においてＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低下させるための、組成物および方法に関する。この組成物および方法は、遺伝子ＬＩＰＧの発現をもたらす組成物および方法を含み、この遺伝子は、トリアシルグリセロールリパーゼファミリーのメンバーであるリパーゼ酵素をコードするか、またはこの酵素の酵素的活性をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９９年３月２６日に出願した米国出願第０９／２７７，４０１
号に対する優先権を主張し、そしてこの出願の一部継続出願である。米国出願第
０９／２７７，４０１号は、１９９７年１２月５日に出願した米国出願第０８／
９８５，４９２号の一部継続出願である。米国出願第０８／９８５，４９２号は
、米国特許法第１１９条（ｅ）の下の仮出願第６０／０３２，２５４号および第
６０／０３２，７８３号の利益を主張する。仮出願第６０／０３２，２５４号お
よび第６０／０３２，７８３号は両方とも、１９９６年１２月６日に出願した。
これらの出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、患者における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよ
びアポリポタンパク質ＡＩのレベルを上昇させるための方法および組成物、なら
びに患者における超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールおよび低
密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールのレベルを低下させるための方法
および組成物に関する。本発明は、その範囲内に、遺伝子ＬＩＰＧの発現を低下
させるかまたはその活性を阻害する、方法および組成物を含む。ＬＩＰＧは、Ｈ
ＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを低下させるリパー
ゼ酵素をコードする。本発明はさらに、その範囲内に、リパーゼ酵素の発現を増
加させるかまたはその活性を増強して、ＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコ
レステロールのレベルの低下をもたらす、方法および組成物を含む。
【０００３】 （脂質） 脂質は、水不溶性の有機生体分子であり、これは、エネルギーの貯蔵、輸送お
よび代謝、ならびに膜の構造および流動性を含む、多様な生物学的機能の必須成
分である。脂質は、ヒトおよび他の動物における２つの供給源に由来する：いく
つかの脂質は食物脂肪および油として摂取され、他の脂質は、ヒトまたは動物に
よって生合成される。哺乳動物では、体重の少なくとも１０％が脂質であり、そ
の大部分は、トリアシルグリセロールの形態である。
【０００４】 トリアシルグリセロールは、トリグリセリドおよびトリアシルグリセリドとし
ても公知であり、グリセロールに対してエステル化された３つの脂肪酸から構成
される。食物トリアシルグリセロールは、脂肪組織内にエネルギー源として貯蔵
されるか、または消化管内でトリアシルグリセロールリパーゼによって加水分解
される。トリアシルグリセロールリパーゼのうち最も重要であるのは、膵臓リパ
ーゼである。トリアシルグリセロールは、リポタンパク質の形態で組織間を輸送
される。
【０００５】 リポタンパク質は、種々の比率の異なる型の脂質およびタンパク質（アポタン
パク質と呼ばれる）を含む、血漿中に見出されるミセル様集合体である。５つの
主なクラスの血漿リポタンパク質が存在する。これらの血漿リポタンパク質の主
な機能は、脂質輸送である。これらのクラスは、密度が増加する順番で、以下の
通りである：カイロミクロン；超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；中間密度
リポタンパク質（ＩＤＬ）；低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；および高密度リ
ポタンパク質（ＨＤＬ）。多くの型の脂質が、各々のリポタンパク質クラスに関
連して見出されているが、各々のクラスは、主に１つの型の脂質を輸送する：上
記のトリアシルグリセロールは、カイロミクロン、ＶＬＤＬおよびＩＤＬで輸送
される；一方、リン脂質およびコレステロールエステルはそれぞれ、ＨＤＬおよ
びＬＤＬで輸送される。
【０００６】 リン脂質は、ホスフェートに結合した極性基を含むグリセロールホスフェート
の二脂肪酸エステルである。リン脂質は、細胞膜の重要な構造成分である。リン
脂質は、ホスホリパーゼと呼ばれる酵素によって加水分解される。代表的なリン
脂質であるホスファチジルコリンは、大部分の真核生物細胞膜の主な成分である
。
【０００７】 コレステロールは、ステロイドホルモンおよび胆汁酸の代謝前駆体、ならびに
細胞膜の必須の構成要素である。ヒトおよび他の動物では、コレステロールは、
食物において摂取され、そして肝臓および他の組織によっても合成される。食物
コレステロールは、血液中の大きなリポタンパク質分子によって腸から肝臓へと
輸送される。肝臓は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を分泌する。ＶＬＤ
Ｌは、コレステロールおよびコレステロールエステルならびに種々の他の化合物
を血流中へと輸送する。ＶＬＤＬは、脂肪組織において部分的に低密度リポタン
パク質（ＬＤＬ）へと変換される。ＬＤＬは、遊離のコレステロールおよびエス
テル化したコレステロールの両方を身体組織へと輸送する。高密度リポタンパク
質（ＨＤＬ）は、コレステロールを肝臓へと輸送して、ここでコレステロールが
分解および排出される。
【０００８】 膜は、全ての生存細胞を取り囲み、そして細胞内区画と細胞外区画との間の障
壁として役立つ。膜はまた、真核生物核を取り囲み、小胞体を構成し、そして例
えば、軸索を取り囲むミエリン鞘において特殊化された機能を務める。代表的な
膜は、約４０％の脂質および６０％のタンパク質を含むが、かなりの変動がある
。主な脂質成分は、リン脂質（特にホスファチジルコリンおよびホスファチジル
エタノールアミン）ならびにコレステロールである。膜の物理化学的特性（例え
ば、流動性）は、リン脂質の脂肪酸プロフィールまたはコレステロール含量のい
ずれかの改変によって変更され得る。膜脂質の組成および組織を調節することは
また、膜依存性細胞機能（例えば、レセプター活性、エンドサイトーシスおよび
コレステロールの流れ）を調節する。
【０００９】 （酵素） トリアシルグリセロールリパーゼは、身体における脂質代謝においていくつか
の中心的な役割を果たす酵素ファミリーである。ヒトトリアシルグリセロールリ
パーゼファミリーの３つのメンバーが記載されている：膵臓リパーゼ、リポタン
パク質リパーゼおよび肝臓リパーゼ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｉ．Ｊ．，Ｌｅ，Ｎ．
−Ａ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．，Ｋｒａｕｓｓ，Ｒ．Ｍ．およびＬｉｎｄ
ｇｒｅｎ，Ｆ．Ｔ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１，５６１−
５６８；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｉ．Ｊ．，Ｌｅ，Ｎ．，Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ Ｊ．
Ｒ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｆ．Ｔ．およびＢｒｏ
ｗｎ，Ｗ．Ｖ．（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，１１８４−１
１９２；Ｈｉｄｅ，Ｗ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｌ．およびＬｉ，Ｗ．−Ｈ．（１９９
２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３３，１６７−１７８）。膵臓リパーゼは、食物
脂質の加水分解を主に担う。膵臓リパーゼの改変体が記載されているが、それら
の生理学的役割は決定されていない（Ｇｉｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｂｕｃｈｗａｌｄ，
Ｐ．，Ｂｌｕｍ−Ｋａｅｌｉｎ，Ｄ．およびＨｕｎｚｉｋｅｒ，Ｗ．（１９９２
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１６５０９−１６５１６）。リポタンパク
質リパーゼは、身体中でのトリグリセリドの分配および利用を担う主な酵素であ
る。リポタンパク質リパーゼは、カイロミクロンおよびＶＬＤＬの両方における
トリグリセリドを加水分解する。肝臓リパーゼは、ＩＤＬおよびＨＤＬにおける
トリグリセリドを加水分解し、そしてリポタンパク質再編を担う。肝臓リパーゼ
はまた、ホスホリパーゼとして機能し、そしてＨＤＬにおけるリン脂質を加水分
解する。
【００１０】 ホスホリパーゼは、リポタンパク質のリン脂質成分ならびに膜のリン脂質の異
化および再編において重要な役割を果たす。ホスホリパーゼはまた、アラキドン
酸の放出、およびその後のプロスタグランジン、ロイコトリエンおよび種々の炎
症プロセスに関与する他の脂質の形成において役割を果たす。
【００１１】 上記のリパーゼは約４５０アミノ酸長であり、そして分泌を促進するリーダー
シグナルペプチドを有する。リパーゼは、２つの主なドメインから構成される（
Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｋ．，Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．およびＨｕｎｚｉｋｅｒ，Ｗ．（１
９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３，７７１−７７４）。アミノ末端ドメインは触媒
部位を含むが、カルボキシルドメインは基質結合、補因子会合および細胞レセプ
ターとの相互作用を担うと考えられる（Ｗｏｎｇ，Ｈ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｃ．
，Ｎｉｋａｚｙ，Ｊ．，Ｓｅｅｂａｒｔ，Ｋ．Ｅ．およびＳｃｈｏｔｚ，Ｍ．Ｃ
．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１１２
９０−１１２９４；ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ，Ｈ．，Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ａ．
，Ｌａｌｏｕｅｌ，Ｊ．−Ｍ．およびＣａｍｂｉｌｌａｕ，Ｃ．（１９９４）Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，４６２６−４６３３；Ｗｏｎｇ，Ｈ．，Ｄａｖ
ｉｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｔｈｕｒｅｎ，Ｔ．，Ｇｏｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｎｉｋａｚｙ，
Ｊ．，Ｗａｉｔｅ，Ｍ．およびＳｃｈｏｔｚ，Ｍ．Ｃ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０３１９−１０３２３；Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｄ．Ａ．
，Ｉｎｏｕｅ，Ｉ．，Ｆｒｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｐｌａｄｅｔ，Ｍ．Ｗ．，Ｂｏｗｅｎ
，Ｓ．Ｌ．，Ｉｖｅｒｉｕｓ，Ｐ．Ｈ．，Ｌａｌｏｕｅｌ，Ｊ．−Ｍ．およびＳ
ｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｄ．Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，
１８００１−１８００６）。ファミリーのメンバーの間のアミノ酸相同性の全体
的レベルは２２％〜６５％であり、相同性の高い局所領域は、酵素機能に結び付
けられる構造的類似性に対応する。
【００１２】 天然に存在するリポタンパク質リパーゼは、グリコシル化されている。グリコ
シル化は、ＬＰＬ酵素活性に必要である（Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ，Ｃ．Ｆ．，
Ｌｕｏ，Ｃ．−Ｃ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．−Ｈ．，
Ｓｍｉｔｈ，Ｌ Ｃ．およびＣｈａｎ Ｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５，５４２９−５４３３）。肝臓リパーゼおよびリポタンパク質リパー
ゼにおけるＮ結合型グリコシル化のための２つの部位、ならびに膵臓リパーゼに
おける１つのＮ結合型グリコシル化のための部位が存在する。さらに、４つのセ
ットのシステインは、酵素活性のために構造的統合性を維持する際に必須である
、ジスルフィド架橋を形成する（Ｌｏ，Ｊ．−Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．およ
びＣｈａｎ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．２０６，２６６−２７１；Ｂｒａｄｙ，Ｌ．，Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ
，Ａ．Ｍ．，Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ，Ｚ．Ｓ．，Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．，Ｄｏｄｓｏ
ｎ Ｇ．，Ｔｏｌｌｅｙ，Ｓ．，Ｔｕｒｋｅｎｂｕｒｇ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈｒｉｓ
ｔｉａｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｈｕｇｅ−Ｊｅｎｓｅｎ Ｂ．，Ｎｏｒｓｋｏｖ，Ｌ．
，Ｔｈｉｍ，Ｌ．およびＭｅｎｇｅ，Ｕ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３，
７６７−７７０）。
【００１３】 トリアシルグリセロールリパーゼファミリーのメンバーは、多数の保存された
構造的特徴を共有する。１つのこのような特徴は、「ＧＸＳＸＧ」モチーフであ
り、このモチーフでは、中心のセリン残基が、「触媒性三つ組（ｃａｔａｌｙｔ
ｉｃ ｔｒｉａｄ）」を含む３つの残基のうちの１つである（Ｗｉｎｋｌｅｒ，
Ｋ．，Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．およびＨｕｎｚｉｋｅｒ，Ｗ．（１９９０）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４３，７７１−７７４；Ｆａｕｓｔｉｎｅｌｌａ，Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，
Ｌ．Ｃ．およびＣｈａｎ，Ｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，
７２１９−７２２３）。保存されたアスパラギン酸残基およびヒスチジン残基は
、触媒性三つ組の平衡を構成する。１９〜２３アミノ酸の短いスパン（ｓｐａｎ
）（「リド（ｌｉｄ）領域」）は、両親媒性ヘリックス構造を形成し、そして酵
素の触媒ポケットを覆う（Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｋ．，Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．およびＨ
ｕｎｚｉｋｅｒ，Ｗ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４３，７７１−７７４）。
この領域は、このファミリーのメンバーの間でかなり多様である。このスパンが
、この酵素に対して基質特異性を付与することが近年決定された（Ｄｕｇｉ，Ｋ
．Ａ．，Ｄｉｃｈｅｋ Ｈ．Ｌ．およびＳａｎｔａｍａｒｉｎａ−Ｆｏｊｏ，Ｓ
．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５３９６−２５４０１）。
肝臓リパーゼとリポタンパク質リパーゼとの間の比較は、これらの酵素のトリア
シルグリセロールリパーゼ活性およびホスホリパーゼ活性における相違が部分的
に、このふた領域によって媒介されることを実証した（Ｄｕｇｉ，Ｋ．Ａ．，Ｄ
ｉｃｈｅｋ Ｈ．Ｌ．およびＳａｎｔａｍａｒｉｎａ Ｆｏｊｏ，Ｓ．（１９９
５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５３９６−２５４０１）。
【００１４】 トリアシルグリセロールリパーゼは、種々の程度のヘパリン結合活性を保有す
る。リポタンパク質リパーゼは、ヘパリンについての最大の親和性を有する。こ
の結合活性は、アミノ末端ドメインにおいて正に荷電した残基のストレッチに対
してマッピングされている（Ｍａ，Ｙ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｌｉ
ｕ，Ｍ．−Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋ
ｅ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＢｒｕｎｚｅｌｌ，Ｊ．
Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５，２０４９−２０５９）。内皮表面に対する
リポタンパク質リパーゼの局在化（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｆ．，Ｏｏｓｔａ，Ｇ．Ｍ
．，Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ，Ａ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．（１９８１
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，１２８９３−１２８９６）は、主に表面プ
ロテオグリカンに対する結合を通して媒介される（Ｓｈｉｍａｄａ Ｋ．，Ｇｉ
ｌｌ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｗ．Ｈ．Ｊ．お
よびＦａｎｂｕｒｇ，Ｂ．Ｌ．（１９８１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８
，９９５−１００２；Ｓａｘｅｎａ，Ｕ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｇ．およびＧｏｌ
ｄｂｅｒｇ，Ｉ．Ｊ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１７５１
６−１７５２１；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｓｅｈａｙｅｋ，Ｅ．，Ｏｌｉｖ
ｅｃｒｏｎａ，Ｔ．およびＶｌｏｄａｖｓｋｙ，Ｉ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ
Ｉｎｖｅｓｔ．９０，２０１３−２０２１）。ＬＤＬと細胞表面との間で架橋
として作用して、酵素がＬＤＬ取り込みを加速するのを可能にするのは、この結
合活性である（Ｍｕｌｄｅｒ，Ｍ．，Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｐ．，Ｊａｎｓｅｎ，
Ｈ．，ｖａｎＢｅｒｋｅｌ Ｔ．Ｊ．，Ｆｒａｎｔｓ Ｒ．Ｒ．およびＨａｖｅ
ｋｅｓ，Ｌ．Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．１８５，５８２−５８７；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，Ｊ．Ｃ．およびＧｏｌｄｂ
ｅｒｇ，Ｉ．Ｊ．，（１９９４）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５．１１５２−１
１６０；Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｓ．，Ｙａｍａｂｅ，Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，
Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｎｎｏ，Ｔ．およびＴａｄａ，Ｋ．（１
９８０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６，１７１−１７６）。
【００１５】 リポタンパク質リパーゼおよび膵臓リパーゼはいずれも、コアクチベーター（
ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質（リポタンパク質リパーゼについてのア
ポリポタンパク質ＣＩＩ；および膵臓リパーゼについての補リパーゼ）と関連し
て機能することが公知である。
【００１６】 ヒト膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼおよびリポタンパク質リパーゼをコードする
遺伝子配列が報告されている（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録＃Ｍ９３２８５、
＃Ｊ０３５４０および＃Ｍ１５８５６）。ヒト肝臓リパーゼおよび膵臓リパーゼ
のメッセンジャーＲＮＡは、それぞれ、長さが約１．７キロベースおよび１．８
キロベースである。３．６キロベースおよび３．２キロベースの２つのｍＲＮＡ
転写物は、ヒトリポタンパク質リパーゼ遺伝子から産生される。これらの２つの
転写物は、代替ポリアデニル化シグナルを利用し、そしてそれらの翻訳効率にお
いて異なる（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｇ．，Ｏｎｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｕｋｈｔ，
Ａ．，Ｓａｇｈｉｚａｄｅｈ，Ｍ．，Ｓｉｍｓｏｌｏ，Ｒ．Ｂ．，Ｐａｕｅｒ，
Ａ．およびＫｅｒｎ，Ｐ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，
７１４９−７１５５）。
【００１７】 （生理学的プロセス） 脂質の代謝には、脂質、アポタンパク質、リポタンパク質、および酵素の相互
作用が関わる。
【００１８】 肝臓のリパーゼおよびリポタンパク質リパーゼは、リポタンパク質およびリン
脂質の結合、取り込み、異化、および再構築を媒介する多機能タンパク質である
。リポタンパク質リパーゼおよび肝臓のリパーゼは、末梢組織および肝臓のそれ
ぞれにおいて、内皮細胞の管腔の表面に結合しながら機能する。両方の酵素は、
逆向きのコレステロール輸送（これは、身体からの排出または再利用のいずれか
のための、末梢組織から肝臓へのコレステロールの移動である）に関与する。肝
臓のリパーゼおよびリポタンパク質リパーゼの両方における遺伝的欠損は、リポ
タンパク質代謝の家族性障害の原因であることが知られている。リポタンパク質
の代謝における欠損は、重篤な代謝障害を生じ、この障害には、高コレステロー
ル血症、高脂質血症、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
【００１９】 （報告された発生） アテローム性動脈硬化症は、複合的な、多遺伝子性疾患であり、これは、血管
壁（とりわけ、大きな動脈（大動脈、冠状動脈、頸動脈））における脂質および
他の血管誘導体の沈着物（脂質プラークまたは線維脂肪プラーク）による組織学
的用語において規定される。アテローム性動脈硬化症のプロセスの進行の度合い
に従って、より多くまたはより少なく石灰化されているこれらのプラークは、傷
害と連関され得、そして本質的にコレステロールエステルからなる脂肪沈着物の
血管中での蓄積に関連する。これらのプラークには、血管壁の肥厚、平滑筋の肥
大、泡沫細胞の外見（補充されたマクロファージによる制御されないコレステロ
ールの取り込みから生じる脂質を積んだ細胞）、および線維組織の蓄積が付随す
る。じゅく状斑は、壁から顕著に突出する。このことは、アテローム、血栓症、
または塞栓症（これらは、最も影響を受ける患者において起こる）による血管の
閉塞の原因である狭窄の性質をじゅく状斑に与える。これらの傷害は、重篤な心
臓血管の病理（例えば、梗塞形成、突然死、心不全、および発作）をもたらし得
る。
【００２０】 （高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルおよびアテローム性
動脈硬化症疾患） 高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルは、心臓血管疾患の危
険性と逆比例する（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１、１
３１１−１３１６（１９８９））。ＨＤＬコレステロールレベルにおける少なく
とも５０％の変動が、遺伝的に決定された（Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ、Ｔｈｅ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｅｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ、２０３１−２０５２、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９
５）；Ｈｅｌｌｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２８、１１５０−１１
５６（１９９３））が、ＨＤＬレベルの変動の原因である遺伝子は、十分に説明
されていない。リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および肝臓のリパーゼ（ＨＬ
）は、トリアシルグリセロール（ＴＧ）リパーゼファミリーの２つのメンバーで
あり、両方がＨＤＬ代謝に影響を与え（Ｂｒｅｓｌｏｗ、前出；Ｍｕｒｔｈｙら
、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７０、１０１−１３５（１９９６）；Ｇｏｌ
ｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉ．、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、３７、６９３−７０７（１
９９６）；Ｂｅｎｓａｄｏｕｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、７
、７７−８１（１９９６））、そしてＨＬ（ＬＩＰＣ）遺伝子座は、ヒトにおけ
るＨＤＬコレステロールレベルの変動に関連する（Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．、９４、２３７７−２３８４（１９９４）；Ｇｕｅｒｒａら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、４５３２−４５３７（
１９９７））。ＨＤＬコレステロールについての正常な範囲は、約３５〜６５ｍ
ｇ／ｄＬであり、そしてＨＤＬレベルは、全コレステロールの２５％より多くを
占めるはずである。
【００２１】 （超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールレベルおよび低密度リ
ポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルならびにアテローム性動脈硬化症
疾患） 高レベルの循環しているＬＤＬコレステロールおよびＶＬＤＬコレステロール
は、アテローム性動脈硬化症の危険性の増加と関連する。
【００２２】 ＶＬＤＬは、ＬＤＬの前駆体である。より低い血漿のＶＬＤＬコレステロール
レベルおよびＬＤＬコレステロールレベルは、これらの脂質パラメーターと冠状
動脈心臓疾患との間の既知の強力な関係ゆえに、非常に望ましい。
【００２３】 疫学的研究は、ＬＤＬコレステロールの上昇と、冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）
および他のアテローム性血管疾患との間の強力な関連性を実証する（Ｋｅｎｎｅ
ｌｌ，Ｗ．Ｂ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、７６、６９Ｃ−７７Ｃ（１９９５
））。スタチンを用いて実行する３つの主要な二次的な予防試験は、ＬＤＬコレ
ステロールレベルの低下が、ＣＨＤ事象および全体の死亡率における有意な低下
を生じることを実証した（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ
Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｌａｎｃｅｔ、３４４、１３８
３−１３８９（１９９４）；Ｓａｃｋｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３
５、１００１−１００９（１９９６）；Ｔｏｎｋｉｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．、３３９、１３４９−１３５７（１９９８）；Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．、
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１４３６−１４３９（１９９８））。スタチンを用い
る大規模な２つの一次予防試験もまた、心臓血管事象の減少におけるスタチンに
よるＬＤＬコレステロール減少の有意な利点を実証した（Ｇｒｕｎｄｙ、前出；
Ｓｈｅｐｈｅｒｄら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３、１３０１−１３０
７（１９９５）；Ｄｏｗｎｓら、ＪＡＭＡ、２７９、１６１５−１６２２（１９
９８））。しかし、現在の治療法は、すべての人においてＬＤＬコレステロール
レベルを十分に低下させない。ＶＬＤＬコレステロールレベルもまた、ＣＨＤの
危険性の増加に関連することが認識されてきた（Ｋａｎｎｅｌ、前出）。現在の
治療法は、ＶＬＤＬコレステロールの減少においてＬＤＬコレステロールと同程
度に高い効果を有しない。従って、ＬＤＬコレステロールおよびＶＬＤＬコレス
テロールの両方を減少するための新規なアプローチがなお必要とされる。
【００２４】 理想的には、ＶＬＤＬコレステロールについての範囲は、約１〜３０ｍｇ／ｄ
Ｌであり、そしてＬＤＬコレステロールについての範囲は、約６０〜１６０ｍｇ
／ｄＬである。ＬＤＬ対ＨＤＬの比は、理想的には３．５未満である。
【００２５】 （アテローム性動脈硬化症疾患におけるトリアシルグリセロールリパーゼの役
割） 血管病理（例えば、アテローム性動脈硬化症）におけるトリアシルグリセロー
ルリパーゼの役割は、熱心な研究の分野であった（Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｇ．
およびＯｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｔ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉ
ｄ．６、２９１−３０５において概説されている）。一般的には、リポタンパク
質リパーゼの作用は、抗アテローム発生性であると考えられている。なぜなら、
この酵素は、血清トリアシルグリセロールレベルを下げ、そしてＨＤＬ形成を促
進するからである。ヒトリポタンパク質リパーゼを発現するトランスジェニック
動物は、低下したレベルの血漿トリグリセリドおよび増加したレベルの高密度リ
ポタンパク質（ＨＤＬ）を有する（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｍ．、Ｓｈｉｍａｎｏ，Ｈ
．、Ｇｏｔｏｄａ，Ｔ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．、Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｍ．．
、Ｉｎａｂａ，Ｔ．、Ｙａｚａｋｉ，Ｔ．、およびＹａｍａｄａ，Ｎ．（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１７９２４−１７９２９；Ｌｉｕ，Ｍ．
−Ｓ．、Ｊｉｒｉｋ，Ｆ．Ｒ．、ＬｅＢｏｅｕｆ，Ｒ．Ｃ．、Ｈｅｎｄｅｒｓｏ
ｎ，Ｈ．、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ，Ｌ．Ｗ．、Ｌｕｓｉｓ，Ａ．、ｍａ，Ｙ．、
Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ．Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｈ．、Ｋｉｒｋ，Ｅ．、Ｂｒｕｎｚ
ｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．、およびＨａｙｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６９、１１４１７−１１４２４）。リポタンパク質リパーゼ活性の
レベルの低下を生じる遺伝的欠損を有するヒトは、高トリグリセリド血症を有す
ることが見出されてきたが、冠状動脈心臓疾患の危険性の増加はなかった。この
ことは、内皮下の領域に蓄積し得る中間の大きさの、アテローム発生性リポタン
パク質の産生の欠如に起因すると報告されている（Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ，Ｄ．
Ｂ．（１９７３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．３３、６３３−６３８）。
【００２６】 リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）とは対称的に、ＨＬの生理機能は、リポタ
ンパク質残余物およびＨＤＬの代謝に関連するようである（Ｂｅｎｓａｄｏｕｍ
ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、７、７７−８１（１９９６））。
ＨＬの遺伝的欠乏は、ヒト（Ｈｅｇｅｌｅら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈ
ｒｏｍｂ．１３、７２０−７２８（１９９３））および変異マウス（Ｈｏｍａｎ
ｉｃｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０、２９７４−２９８０（１９９５
））における残余物およびＨＤＬコレステロールの中程度に増加したレベルと関
連する。増加した血漿コレステロールレベルに関わらず、ＨＬ欠乏は、ａｐｏＥ
変異マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の減少に関連する（Ｍｅｄｚｄｏｕ
ｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１３５７０−１３５７５（１９９７
））ＨＬを過剰発現するトランスジェニック動物は、ＨＤＬを減少した（Ｂｕｓ
ｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１６３７６−１６３８２（１９９
４）；Ｆａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、８７
２４−８７２８（１９９４））。ヒトにおける増加したＨＬ活性は、低いＨＤｌ
コレステロールに関連する。染色体１５ｑ２１上のＨＬ遺伝子座は、ヒトにおけ
る血漿ＨＤＬコレステロールレベルの変動に関連する（Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４、２３７７〜２３８４（１９９４）；Ｇｕｅｒｒａら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、４５３２−４５３７
（１９９７））が、ＨＤＬコレステロールレベルの変動に対する遺伝的寄与の一
部のみを説明する。ヒトにおけるＨＤＬコレステロールレベルに影響を与える少
なくとも１つの主要な遺伝子座が存在し、この遺伝子座は、ＨＬ遺伝子座とは別
個である（Ｍａｈａｎｅｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａ
ｓｃ．Ｂｉｏｌ．、１５、１７３０−１７３９（１９９５））。
【００２７】 アテローム性動脈硬化症傷害の局在化領域において、リパーゼ活性のレベルの
増加は、アテローム発生プロセスを加速すると仮定されている（Ｚｉｌｖｅｒｓ
ｍｉｔ，Ｄ．Ｂ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１、１５３−１５８；Ｚ
ａｍｂｏｎ，Ａ．、Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．、Ｂｉｊｖｏｅｔ，Ｓ．、Ｇａｇｎｅ，
Ｃ．、Ｍｏｏｊａｎｉ，Ｓ．Ｌｕｐｉｅｎ，Ｐ．Ｊ．、Ｈａｙｄｅｎ Ｍ．Ｒ．
、およびＢｒｕｎｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ ３４１、１１
１９−１１２１）。このことは、リパーゼによって媒介される血管組織によるリ
ポタンパク質の結合および取り込みの増加に起因し得る（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，
Ｓ．、Ｓｅｈａｙｅｋ，Ｅ．、Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｔ．、Ｖｌｏｄａｖｓｋ
ｙ，Ｉ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０、２０１３−２０２１
；Ｔａｂａｓ，Ｉ．、Ｌｉ、Ｉ．、Ｂｒｏｃｉａ Ｒ．Ｗ．、Ｘｕ，Ｓ．Ｗ．、
Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｔ．Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２０４１９−２０４３２；Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ，
Ｂ．Ｇ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ａ．Ｇ．（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌ
ｉｐｉｄ．５、２５２−２５７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｊ．、およびＴａｂａ
ｓ，Ｉ．（１９９５）Ａｒｔ．Ｔｈｒｏｍｂ．ａｎｄ Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１
５、５５１−５６１）。さらに、局所的に高いレベルのリパーゼ活性は、アテロ
ーム性動脈硬化症の傷害の前駆体において産生される、細胞傷害性のレベルの脂
肪酸およびリゾホスファチジルコリンを生じる。
【００２８】 脂質のレベルおよび種々の血漿リポタンパク質のレベルを調節する際のリパー
ゼ酵素活性の役割に関する理解が進んできたにも関わらず、ＨＤＬコレステロー
ルのレベルを増加させ得る治療法、ならびにアテローム性動脈硬化症の心臓血管
疾患を発症する危険性を減少するためにＶＬＤＬおよびＬＤＬコレステロールの
レベルを低くし得る治療法を同定および開発するための必要性が存在する。
【００２９】 （発明の要旨） 本発明に従って、患者においてＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させるための組成
物が提供され、この組成物は、アンチセンス核酸を含み、例えば、そのアンチセ
ンス核酸を含む発現ベクターを含む。好ましい発現ベクターの例は、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペ
スウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターである。アンチセンス核酸は、
例えば、化学修飾された塩基を含むオリゴヌクレオチドであり得る。
【００３０】 本発明の別の局面は、患者においてＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を低下さ
せるための組成物の提供であり、この組成物は、ＬＩＰＧポリペプチドに結合し
得、そしてその酵素活性を低下させ得る中和抗体を含み、例えば、その抗体をコ
ードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む。好ましい発現ベクターの例は、
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
ー、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターである。
【００３１】 本発明のさらに別の局面は、患者におけるＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を
低下させるための組成物の提供であり、この組成物は、細胞内結合タンパク質を
含み、例えば、その細胞内結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベ
クターを含む。好ましい発現ベクターの例は、レトロウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、
および裸のＤＮＡベクターである。
【００３２】 なお他の本発明の局面は、以下の組成物の提供である：（Ａ）患者においてＬ
ＩＰＧポリペプチドの酵素活性を阻害し得るインヒビターを含む組成物；（Ｂ）
患者においてＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させ得るインヒビターを含む組成物；
および（Ｃ）患者においてＬＩＰＧの発現を低下させ得る組成物であって、この
組成物はリボザイムを含み、例えば、そのリボザイムをコードするＤＮＡ配列を
含む発現ベクターを含む、組成物。好ましい発現ベクターの例は、レトロウイル
スベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペス
ウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターである。好ましいリボザイムは、
ハンマーヘッド型リボザイムである。
【００３３】 本発明はまた、以下の組成物を提供する：（Ｄ）患者においてＬＩＰＧポリペ
プチドのレベルを増加させる組成物、ここでこの組成物は、ＬＩＰＧポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列またはＬＩＰＧ遺伝子の発現を増加させ得るエンハン
サーを含む発現ベクターを含む；および（Ｅ）患者においてＬＩＰＧポリペプチ
ドの酵素活性を増加する組成物、ここでこの組成物は、ＬＩＰＧポリペプチドに
結合し、そしてその酵素活性を増強するエンハンサーを含む。
【００３４】 さらに、本発明は、例えば、患者におけるＬＩＰＧポリペプチドのレベルを低
下させることによって、その患者におけるＬＩＰＧの酵素活性を低下させる組成
物をその患者に投与することによって、患者において高密度リポタンパク質（Ｈ
ＤＬ）コレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを上昇させるため
の方法を提供する。好ましい形態において、この方法は、アンチセンス核酸（特
に、核酸の化学的安定性を増加させるように改変されているもの）を含む組成物
の使用を包含する。上述の方法は、ＬＩＰＧポリペプチドに結合し得、そしてそ
の酵素活性を低下させ得る中和抗体を含む組成物、またはＬＩＰＧポリペプチド
の酵素活性を阻害するインヒビター（例えば、ＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させ
る化合物）を含む組成物、またはＬＩＰＧをコードするｍＲＮＡを切断するリボ
ザイムを含む組成物、またはＤＮＡ分子およびリポソーム（例えば、カチオン性
リポソーム）を含む組成物の使用によってもまた、実施され得る。
【００３５】 好ましい形態において、上記の方法はまた、上記患者においてアポリポタンパ
ク質 ＡＩを発現し得る、組成物の投与を含む。
【００３６】 本発明の別の局面は、患者においてＬＩＰＧの酵素活性を増加させ得る組成物
を患者に投与することによって、患者において超低密度リポタンパク質（ＶＬＤ
Ｌ）コレステロールのレベルを低下させるための方法を提供し、これには、例え
ば、ＬＩＰＧポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含み、そして好
ましくは、ＬＩＰＧポリペプチドを発現可能な発現ベクター（好ましくは、レト
ロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベク
ター）を含む組成物を使用する。上記の方法は、ＬＩＰＧポリペプチドの酵素的
活性を増強するエンハンサーまたはＬＩＰＧ遺伝子の発現を増加させるエンハン
サーを含む組成物を使用することによって実施され得る。
【００３７】 本発明のさらに別の局面は、患者においてＬＩＰＧの酵素活性を増加させ得る
組成物を患者に投与することによって、患者において低密度リポタンパク質（Ｌ
ＤＬ）コレステロールのレベルを低下させるための方法を提供し、これには、好
ましくは、ＬＩＰＧポリペプチドを使用し、例えば、ＬＩＰＧポリペプチドを発
現させ得る発現ベクターを使用し、好ましくは、レトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを使用する。上記の方
法は、好ましくは、ＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を増強するエンハンサー
またはＬＩＰＧ遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む組成物の使用を含
む。
【００３８】 本発明はまた、ＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポリポ
タンパク質ＡＩとの間の酵素的活性に対して、ＬＩＰＧポリペプチドとＬＤＬコ
レステロールとの間の酵素的反応を優先的に増強するエンハンサーを患者に投与
することによって、患者のＬＤＬコレステロールのレベルを低下させるための方
法を提供する。
【００３９】 さらに、本発明は、ＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポ
リポタンパク質ＡＩとの間の酵素的活性に対して、ＬＩＰＧポリペプチドとＶＬ
ＤＬコレステロールとの間の酵素的反応を優先的に増強するエンハンサーを患者
に投与することによって、患者のＶＬＤＬコレステロールのレベルを低下させる
ための方法を提供する。
【００４０】 本発明のさらに別の局面は、患者から組織サンプルを入手し、そしてサンプル
中のＬＩＰＧポリペプチドのレベルを測定することによって、低ＨＤＬコレステ
ロールレベルおよび低アポリポタンパク質ＡＩレベルに対する素因を診断するた
めの方法を提供し、これは、例えば、血液組織を使用し、そして測定のためにイ
ムノアッセイを使用する。本発明の別の局面において、ＬＩＰＧポリペプチドの
レベルは、ＬＩＰＧ ｍＲＮＡのレベルを測定することによって測定される。
【００４１】 本発明のさらなる局面は、試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレス
テロールおよびアポリポタンパク質ＡＩとの間の酵素的反応を阻害し得るか否か
を決定するための方法を提供し、この方法は、以下： （Ａ）第１のサンプル中のＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩ
のレベルを、別のサンプル中のＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質
ＡＩのレベルと比較する工程であって、この第１のサンプルが：（１）ＨＤＬコ
レステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩ、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、お
よび（３）試験化合物を含み、そして別のサンプルが：（４）ＨＤＬコレステロ
ールおよびアポリポタンパク質ＡＩ、および（５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む
、工程；ならびに （Ｂ）この第１のサンプルが上記別のサンプルよりも高いＨＤＬコレステロール
およびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを有するか否かを観察することによって
、試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポリポタ
ンパク質ＡＩとの間の酵素的反応を阻害する際に有効であるか否かを同定する工
程、を包含する。
【００４２】 本発明はまた、試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＶＬＤＬコレステロール
との間の酵素的反応を増強し得るか否かを決定するための方法を提供し、この方
法は、以下： （Ａ）第１のサンプル中のＶＬＤＬコレステロールのレベルを、別のサンプル中
のＶＬＤＬコレステロールのレベルと比較する工程であって、この第１のサンプ
ルが：（１）ＶＬＤＬコレステロール、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、および（
３）試験化合物を含み、そしてこの別のサンプルが：（４）ＶＬＤＬコレステロ
ールおよび（５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む工程；ならびに （Ｂ）この第１のサンプルが上記別のサンプルよりも低いＶＬＤＬコレステロー
ルのレベルを有するか否かを観察することによって、試験化合物がＬＩＰＧポリ
ペプチドとＶＬＤＬコレステロールとの間の酵素的反応を増強する際に有効であ
るか否かを同定する工程、を包含する。
【００４３】 本発明のさらに別の局面は、試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＬＤＬコレ
ステロールとの間の酵素的反応を増強し得るか否かを決定するための方法を提供
し、この方法は、以下： （Ａ）第１のサンプル中のＬＤＬコレステロールのレベルを、別のサンプル中の
ＬＤＬコレステロールのレベルと比較する工程であって、この第１のサンプルが
：（１）ＬＤＬコレステロール、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、および（３）試
験化合物を含み、そして別のサンプルが；（４）ＬＤＬコレステロールおよび（
５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む工程；ならびに （Ｂ）この第１のサンプルが上記別のサンプルよりも低いＬＤＬコレステロール
のレベルを有するか否かを観察することによって、試験化合物がＬＩＰＧポリペ
プチドとＬＤＬコレステロールとの間の酵素的反応を阻害する際に有効であるか
否かを同定する工程、を包含する。
【００４４】 （発明の詳細な説明） 以下の詳細な説明は、本発明の基礎、続いて定義の節を記載している。定義の
節の後に、本発明の実施に有用な種々の組成物が、議論されており、続いてＬＩ
ＰＧ活性レベルを低下または上昇させるために使用される方法が、議論される。
【００４５】 （ＬＩＰＧ遺伝子産物の酵素活性） 本発明は、ＬＩＰＧリパーゼ酵素の活性を低下または上昇させる方法および組
成物を利用して、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩ、ＶＬＤ
ＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを調節するための方法に
関する。特に、本発明は、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩ
、ＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールにおける、ＬＩＰＧ遺伝
子のポリペプチド産物の酵素活性の発見に部分的に基づく。ＬＩＰＧのポリペプ
チド産物は、トリアシルグリセロールリパーゼファミリーのメンバーであり、そ
してトリアシルグリセロールリパーゼファミリーのおよそ３９ｋＤの触媒ドメイ
ン（例えば、配列番号１０の配列を有する）を含む。この新規に発見されたリパ
ーゼは、内皮細胞によって合成されることが見出されており、そしてこれは、ト
リアシルグリセロールリパーゼファミリーの他のメンバーと比べて独特な特徴で
あることから、このリパーゼは、「内皮リパーゼ」（ＥＬ）と呼ばれている。Ｌ
ＩＰＧ遺伝子は以下の節において広範に議論されているので、ＥＬは、明確にす
る目的のために、本明細書中以降、ＬＩＰＧポリペプチドといわれる。一般に、
ＬＩＰＧポリペプチドは、２つの主要な形態（本明細書中以降、「ＬＬＧＮポリ
ペプチド」および「ＬＬＧＸＬポリペプチド」といわれる）において見出される
。ＬＬＧＮポリペプチドは、３５４個のアミノ酸を有する。ＬＬＧＸＬポリペプ
チドは、５００個のアミノ酸を有し、そしてヒトリポタンパク質リパーゼに対し
て４３％の類似性およびヒト肝リパーゼに対して３７％の類似性を示す。本明細
書中で使用される場合、用語「ＬＩＰＧポリペプチド」または「ＬＩＰＧタンパ
ク質」は、ＬＬＧＮおよびＬＬＧＸＬの両方を含む。
【００４６】 ＬＩＰＧポリペプチドの配列は、特徴的なＧＸＳＸＧリパーゼモチーフ、保存
された触媒３構造（ｔｒｉａｄ）、１９残基のｌｉｄ領域、保存されたヘパリン
結合部位および保存されたリポタンパク質結合部位、ならびに５つの潜在的Ｎ結
合型グリコシル化部位を含む。トリアシルグリセロールリパーゼファミリーで最
大の配列多様性を有する領域は、ｌｉｄドメインである。このｌｉｄドメインは
、この酵素の触媒ポケットを覆う両親媒性ヘリックスを形成し（Ｗｉｎｋｌｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ，３４３，７７１〜７７４（１９９０）；ｖａｎ Ｔｉｌｂｅ
ｕｒｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，４６２６〜４６３３（１９９４
））、そしてこのファミリーの酵素に対して基質特異性を付与する（Ｄｕｇｉら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５３９６〜２５４０１（１９９５））
。ＬＩＰＧの１９残基のｌｉｄ領域は、異なる酵素プロフィールと一致して、リ
ポタンパク質リパーゼおよび肝リパーゼにおいて見出される領域よりも３残基短
く、そしてより両親媒性ではない。この成熟タンパク質の推定分子量は、およそ
５５ｋＤであり；６８ｋＤ形態は、グリコシル化形態のようであり、一方、４０
ｋＤ形態は、特異的タンパク質分解切断の産物であり得る。
【００４７】 ＬＩＰＧポリペプチドは、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａ
Ｉのレベル、ならびにＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレ
ベルを低下させる能力を有する。ＨＤＬコレステロールレベルの低下は、アテロ
ーム性動脈硬化症に対する感受性の増大を生じ、そしてＨＤＬコレステリルエス
テルのレベルの増大は、アテローム性動脈硬化症に対する感受性を劇的に低下し
得ることが十分に確立されている。
【００４８】 ＬＩＰＧの１つの生理学的役割は、末梢組織中のＨＤＬリン脂質を加水分解し
て、そして肝臓中では、ＨＤＬレセプターＳＲ−ＢＩを介して、ＨＤＬコレステ
ロールエステルの選択的な取り込みを促進することであり得る（Ｋｏｚａｒｓｋ
ｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３８７，４１４〜４１７（１９９７））。別の可能性のあ
る役割は、肝リパーゼの役割と同様に、ａｐｏＢ含有レムナントリポタンパク質
の取り込みの促進である（Ｍａｈｌｅｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４０，
１〜１６（１９９９））。さらに、ＬＩＰＧは、胎盤中に多量に発現され、そし
て発生におけるこの酵素の役割は、胎児発生における脂質輸送の重要性を考慮す
るとあり得る（Ｆａｒｅｓｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１４，１１５〜
１２０（１９９８））。
【００４９】 ＨＤＬコレステロールの有益な特性に基づいて、ＬＩＰＧの酵素活性を低下さ
せることによって、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させることが所望される
。従って、本発明は、ＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させることによって、または
ＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を低下させることによって、身体中のＬＩＰＧ
活性を低下させる方法および組成物に関する。
【００５０】 ＬＩＧＰポリペプチドがＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロール
のレベルを低下させる能力、ならびに高レベルのこれらの化合物とアテローム性
動脈硬化症との間の相関性を実証する研究を考慮すると、患者において、これら
の化合物のレベルを低下させることが所望される。従って、本発明はさらに、Ｌ
ＩＰＧ遺伝子の発現を増大するための、およびＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性
を増大させるための方法および組成物を提供する。
【００５１】 本明細書中で使用される用語の定義、および本発明の好ましい実施形態の説明
が、本明細書中以降に示されている。
【００５２】 （定義） 以下に定義される用語は、本明細書全体にわたって使用され、そして本発明の
範囲および実施の理解に役立つはずである。
【００５３】 「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から構成されるポリマー性化
合物である。アミノ酸は、側鎖に基づいて以下の７つの群に分類される：（１）
脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）イオウ原子を含
む側鎖、（４）酸性すなわちアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、
（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）プロリン（側鎖がアミノ基に縮合され
ているイミノ酸）。
【００５４】 「タンパク質」は、生きている細胞において構造的役割または機能的役割を果
たすポリペプチドである。
【００５５】 本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化されていてもグリコ
シル化されていなくともよい。
【００５６】 「相同性」は、共通の進化の起源を反映する配列の類似性を意味する。ポリペ
プチドまたはタンパク質は、それらのアミノ酸の実質的な数が、（１）同一であ
るか、または（２）化学的に類似する側鎖を有するか、のいずれかである場合に
、相同性、すなわち類似性を有するといわれる。核酸は、それらのヌクレオチド
の実質的な数が同一である場合に、相同性を有するといわれる。
【００５７】 「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その天然状
態においてポリペプチドまたはタンパク質に通常付随している化合物（例えば、
他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、糖質、脂質）を実質的に含まないポ
リペプチドまたはタンパク質である。「単離された」は、他の化合物を含む人工
混合物または合成混合物、あるいは生物学的活性を妨害せず、かつ例えば、不完
全な精製、安定化剤の添加、または薬学的に受容可能な調製物中への配合に起因
して存在し得る不純物の存在を排除することを意味しない。
【００５８】 分子は、免疫系の抗原認識分子（例えば、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細
胞抗原レセプター）と特異的に相互作用し得る場合に、「抗原性」である。抗原
性ポリペプチドは、少なくとも約５個、および好ましくは、少なくとも約１０個
のアミノ酸を含む。分子の抗原性部分は、抗体またはＴ細胞レセプター認識に対
して免疫優勢（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）の部分であり得るか、あるいは
これは、免疫のためにキャリア分子に抗原性部分を結合体化することによって、
この分子に対する抗体を生成するために使用される部分であり得る。抗原性であ
る分子はそれ自体、免疫原性を必要としない、すなわち、キャリアがなくとも免
疫応答を誘発し得る。
【００５９】 「ＬＬＧＮポリペプチド」および「ＬＬＧＮタンパク質」は、配列番号６の配
列を含むポリペプチド（このポリペプチドは、グリコシル化されているか、また
はグリコシル化されていない）を意味する。
【００６０】 「ＬＬＧＸＬポリペプチド」および「ＬＬＧＸＬタンパク質」は、配列番号８
の配列を含むポリペプチド（このポリペプチドは、グリコシル化されているか、
またはグリコシル化されていない）を意味する。
【００６１】 「ＬＩＰＧポリペプチド」および「ＬＩＰＧタンパク質」は、ＬＩＰＧ遺伝子
によってコードされるリパーゼ酵素を記載しており、そして包括的に、ＬＬＧＮ
ポリペプチドおよびＬＬＧＸＬポリペプチドの両方を記載している。
【００６２】 「内皮リパーゼ」すなわち「ＥＬ」は、ＬＩＰＧ遺伝子によりコードされるリ
パーゼ酵素をいい、そして用語ＬＩＰＧポリペプチドに等価である。
【００６３】 本発明のＬＩＰＧポリペプチドまたはタンパク質は、ＬＩＰＧポリペプチドか
ら誘導され、かつＬＩＰＧポリペプチドの少なくとも１つの生物学的特性を保持
する、任意のアナログ、フラグメント、誘導体、または変異体を含む。ＬＩＰＧ
ポリペプチドの異なる改変体は、天然に存在する。これらの改変体は、このタン
パク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の差異によって特徴付けられ
る対立遺伝子の変異物であり得るか、または示差的なスプライシングまたは翻訳
後改変を含み得る。当業者は、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、
またたは交換を有する改変体を生成し得る。これらの改変体としては、とりわけ
、以下が挙げられ得る：（ａ）１以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸または
非保存的アミノ酸で置換されている改変体、（ｂ）１以上のアミノ酸が、ＬＩＰ
Ｇポリペプチドに付加されている改変体、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含
む改変体、ならびに（ｄ）ＬＩＰＧポリペプチドが別のポリペプチド（例えば、
血清アルブミン）と融合している改変体。本発明の他のＬＩＰＧポリペプチドと
しては、ある種由来のアミノ酸残基が、保存位置または非保存位置のいずれかで
、別の種の対応する残基に対して代用されている改変体、が挙げられる。別の実
施形態において、非保存位置のアミノ酸残基は、保存性残基または非保存性残基
で置換される。これらの改変体を得るための技術（遺伝子技術（抑制、欠失、変
異など）、化学技術、および酵素技術が挙げられる）は、当業者に公知である。
【００６４】 このような対立遺伝子のバリエーション、アナログ、フラグメント、誘導体、
変異体、および改変（代替のｍＲＮＡスプライシング形態を含む）、ならびに代
替の後翻訳改変形態が、ＬＩＰＧポリペプチドの誘導体（これらは、ＬＩＰＧポ
リペプチドの生物学的特性にいずれかを保持する）を生じる場合、それらは、本
発明の範囲内に含まれる。
【００６５】 「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合されたサブユニットから構成さ
れるポリマー化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、その両方が、１本鎖または２本鎖であり得る。Ｄ
ＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。タ
ンパク質をコードするヌクレオチドの配列は、センス配列と呼ばれる。
【００６６】 「アンチセンス核酸」は、センス配列と相補的であるヌクレオチドの配列であ
る。アンチセンス核酸を使用して、センス鎖によってコードされるポリペプチド
の発現を下方制御し得るか、またはブロックし得る。
【００６７】 「単離された核酸」とは、その天然の状態において通常それと会合した化合物
が実質的にない核酸を意味する。「単離された」は、他の化合物を有する人工的
または合成混合物、あるいは生物学的活性を妨害せず、そして例えば、不完全な
精製、安定剤の添加、薬学的に受容可能な調製物への配合に起因して存在し得る
不純物の存在を排除することは意味しない。
【００６８】 語句「高いストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸」は、ハイブリダイ
ズされた核酸が、高いストリンジェンシー条件下で洗浄に耐えることが可能であ
ることを意味する。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについての高いストリンジェン
シー洗浄条件の例は、６８℃での０．１×ＳＣＣ、０．５％ ＳＤＳである。高
いストリンジェンシー洗浄の他の条件は、当業者に公知である。
【００６９】 「調節領域」は、核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特
定の核酸の発現の天然の原因である配列（相同領域）を含み得るか、または異な
る起源の配列（異なるタンパク質または合成タンパク質でさえの発現の原因であ
る）を含み得る。特に、配列は、真核生物またはウイルスの遺伝子の配列、ある
いは特異的または非特異的な様式で、および誘導性または非誘導性の様式で遺伝
子の転写を刺激するか、または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は、複製
起点、ＲＮＡスプライシング部位、エンハンサー、転写終結配列、シグナル配列
（これは、ポリペプチドを、標的細胞の分泌経路に指向させる）、およびプロモ
ーターを含む。
【００７０】 「異種供給源」からの調節領域は、発現された核酸と天然では関係のない調節
配列である。異種調節領域の中に、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子から
の調節領域、ハイブリッド調節領域、および天然には発生しない調節領域が含ま
れるが、これらは、当業者によって設計される。
【００７１】 「ベクター」は、本発明に従う核酸を宿主細胞に移入するための任意の手段で
ある。用語「ベクター」は、核酸を、原核生物細胞または真核生物細胞に、イン
ビトロ、エキソビボ、またはインビボで導入するためのウイルス的な手段および
非ウイルス的な手段の両方を含む。非ウイルス性ベクターには、プラスミド、リ
ポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複
合体、および生体高分子が挙げられる。ウイルス性ベクターには、レトロウイル
ス、アデノ関連ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、痘疹、単純ヘルペス、
エプスタイン−バー、およびアデノウイルスのベクターが挙げられる。本発明に
従う核酸に加えて、ベクターはまた、１つ以上の調節領域、および／または核酸
移入の結果（どの組織への移入、発現の持続期間など）の選択、測定、およびモ
ニタリングにおいて有用な選択可能なマーカーを含み得る。
【００７２】 「組換え細胞」は、細胞内に天然に存在しない核酸を含む細胞である。「組換
え細胞」は、より高度の真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、より低度の真
核生物細胞（例えば、酵母細胞）、原核生物細胞、および古細菌細胞を含む。
【００７３】 「薬学的に受容可能なキャリア」とは、投与方法のために薬学的に受容可能で
ある希釈剤および充填剤を含み、滅菌されており、そして適切な分散剤またな湿
潤剤および懸濁剤を使用して処方された水性または油性の懸濁液であり得る。特
定の薬学的に受容可能なキャリアおよびキャリアに対する活性化合物に比は、組
成物の溶解性および化学的特性、投与の特定の様式、および標準的な薬学的慣習
によって決定される。
【００７４】 「リパーゼ」は、脂質物質を酵素的に切断し得るタンパク質である。
【００７５】 「ホスホリパーゼ」は、リン脂質物質を酵素的に切断し得るタンパク質である
。
【００７６】 「トリアシルグリセロールリパーゼ」は、トリアシルグリセリド物質を酵素的
に切断し得るタンパク質である。
【００７７】 「ホスファチジルコリン」は、グリセロールリン脂質である。ホスファチジル
コリンはまた、レシチンとして公知である。
【００７８】 「脂質プロフィール」とは、ヒトまたは他の動物の身体におけるコレステロー
ル、トリグリセリド、リポタンパク質コレステロール、および他の脂質の濃度の
セットを意味する。
【００７９】 「所望ではない脂質プロフィール」は、コレステロール、トリグリセリド、ま
たはリポタンパク質コレステロールの濃度が、年齢および性別で調整された参照
範囲の外にある状態である。一般に、総コレステロールの濃度＞２００ｍｇ／ｄ
ｌ、血漿グリセリドの濃度＞２００ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬコレステロールの濃度＞
１３０ｍｇ／ｄｌ、ＨＤＬコレステロールの濃度＜３９ｍｇ／ｄｌ、またはＨＤ
Ｌコレステロールに対する総コレステロールの比＞４．０は、所望ではない脂質
プロフィールであると考えられる。所望ではない脂質プロフィールは、種々の病
理学的な状態（高脂血症、高コレステロール血症糖尿病、アテローム性動脈硬化
症、および他の形態の冠状動脈疾患を含む）と関連する。
【００８０】 「リボザイム」は、酵素として機能し得るＲＮＡ分子である。
【００８１】 「中和抗体」は、ＬＩＰＧポリペプチドに結合し得、そしてＬＩＰＧポリペプ
チドの酵素活性を低下させ得るかまたは排除し得る抗体である。これらの抗体は
、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本発明は、キメラ
抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発
現ライブラリーの産物、ならびにＦｖフラグメントおよびＦｖ発現ライブラリー
の産物を含む。
【００８２】 「阻害分子」または「インヒビター」は、ＬＩＰＧポリペプチドの発現を低下
されるか、または排除するか、あるいはＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を低下
させるか、または排除する分子である。
【００８３】 「エンハンサー分子」または「エンハンサー」は、ＬＩＰＧポリペプチドの発
現を増加させるか、あるいはＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を増加させる分子
である。
【００８４】 「リポソーム」は、人工的、または天然に存在するリン脂質ベシクルである。
【００８５】 「カチオン性リポソーム」は、正味の正の電荷を有するリポソームである。
【００８６】 以下の節は、特許請求された方法において使用される要素、および組成物およ
びこれらの要素の好ましい実施形態を議論する。
【００８７】 （ポリペプチド） 本発明は、トリアシルグリセロールリパーゼファミリーのメンバーであり、そ
して例えば、配列番号１０を有する、トリアシルグリセロールリパーゼファミリ
ーの３９ｋＤの触媒ドメインを含むＬＩＰＧによってコードされるポリペプチド
を利用する。本発明の特定の実施形態において、単離されたＬＩＰＧポリペプチ
ド（配列番号６を含み、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約４０ｋＤの見か
けの分子量を有する）が利用される。本発明の別の実施形態において、単離され
たＬＩＰＧポリペプチド（配列番号８を含み、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで約５５ｋＤまたは６８ｋＤの見かけの分子量を有する）が利用される。なお
別の実施形態において、本発明において利用されるポリペプチドは、これらのポ
リペプチドのサブフラグメントである。まだなお別の実施形態において、本発明
において使用されるポリペプチドは、ＬＩＰＧポリペプチドに結合し得る抗体で
ある。
【００８８】 本発明において利用されるポリペプチドまたはタンパク質は、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、そしてヒト、ウ
サギ、または他の動物起源であり得る。ポリペプチドは、再現性のある単一の分
子量および／または分子量の複数のセット、クロマトグラフ応答および溶離プロ
フィール、アミノ酸組成および配列、ならびに生物学的活性によって特徴付けら
れる。
【００８９】 本発明において利用されるポリペプチドは、天然の供給源（例えば、胎盤抽出
物、ヒト血漿、または培養された細胞（例えば、マクロファージまたは内皮細胞
）からの馴化培地）から、当業者に公知の精製手順を使用することによって単離
され得る。
【００９０】 あるいは、本発明において利用されるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を利
用して調製され得、この技術には、それらのポリペプチドをコードする核酸を適
切なベクターに組み合わせる工程、得られたベクターを適切な宿主細胞に挿入す
る工程、得られた宿主細胞によって産生されたポリペプチドを回収する工程、お
よび回収されたポリペプチドを精製する工程を包含する。
【００９１】 （核酸） 本発明は、ＬＩＰＧポリペプチドをコードする単離された核酸を利用する。
【００９２】 本発明はまた、ＬＩＰＧポリペプチドの発現を、インビトロ、エキソビボまた
はインビボで下方制御またはブロックするために使用され得るアンチセンス核酸
を利用する。
【００９３】 組換えＤＮＡ技術の技術は、当業者に公知である。組換え分子のクローニング
または発現のための一般的な方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，１９８２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ，１９８７）に記載され、これらは、参考として援用される。
【００９４】 本発明の核酸は、１つ以上の調節領域に連結され得る。適切な調節領域（単数
または複数）の選択は、慣用的な問題であり、当業者のレベル内にある。調節領
域は、プロモーターを含み、そしてエンハンサー、サプレッサーなどを含み得る
。
【００９５】 本発明で使用され得るプロモーターは、構成的プロモーターおよび調節プロモ
ーター（誘導性）プロモーターの両方を含む。これらのプロモーターは、宿主に
依存して、原核生物性、または真核生物性であり得る。本発明の実施において有
用な原核生物性（バクテリオファージを含む）プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌ
ａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、λＰr、Ｐl、およびｔｒｐプロモーターが挙げられる。本
発明の実施において有用な真核生物性（ウイルス性を含む）プロモーターには、
普遍的なプロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリ
ン）、中間フィラメントプロモーター（例えば、デスミン、神経フィラメント、
ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療的遺伝子プロモーター（ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第Ｖ
ＩＩＩ因子）、組織特異性プロモーター（例えば、平滑筋細胞内のアクチンプロ
モーター、または内皮細胞内で活性なＦｌｔおよびＦｌｋプロモーター）であり
、動物転写制御領域を含み、これらは、組織特異性を示し、トランスジェニック
動物において利用されてきた：エラスターゼＩ遺伝子制御領域（これは、膵臓腺
房細胞において活性である）（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３
９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎ
ａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；インスリン
遺伝子制御領域（これは、膵臓β細胞において活性である）（Ｈａｎａｈａｎ，
１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、免疫グロブリン遺伝子制
御領域（これは、リンパ系細胞において活性である）（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら
，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４）、マウス乳房腫瘍ウイル
ス制御領域（これは、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥胖細胞におい
て活性である）（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）
、アルブミン遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｐｉｎｋｅ
ｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、
α−フェトプロテイン遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｋ
ｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−
１６４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）
、α１−抗トリプシン遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｋ
ｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．，１：１６１−１７
１）、β−グロブリン遺伝子制御領域（これは、骨髄性細胞において活性である
）（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏ
ｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、ミエリン塩基性タン
パク質遺伝子制御領域（これは、脳内の稀突起膠細胞において活性である）（Ｒ
ｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）、ミオシン軽
鎖−２遺伝子制御領域（これは、骨格筋において活性である）（Ｓａｎｉ，１９
８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）、および性腺刺激ホルモン放出
ホルモン遺伝子制御領域（これは、視床下部において活性である）（Ｍａｓｏｎ
ら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００９６】 本発明の実施において用いられ得る他のプロモーターとしては、分裂する細胞
において優先的に活性化されるプロモーター、刺激（例えば、ステロイドホルモ
ンレセプター、レチン酸レセプター）に反応するプロモーター、テロラサイクリ
ンで調節された転写モジュレータープロモーター、サイトメガロウイルス最初期
プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ＳＶ−４０プロモーター、Ｅ１ａプロモーターおよびＭＬＰプロモーター
が挙げられる。テトラサイクリン調節転写モジュレーターおよびＣＭＶプロモー
ターは、その内容が本明細書において参考として援用されているＷＯ ９６／０
１３１３、米国特許第５，１６８，０６２号および同第５，３８５，８３９号に
記載されている。
【００９７】 （ウイルスベクター系） 好ましくは、本発明の遺伝子治療方法において用いられるウイルスベクターは
、複製欠損性である。すなわち、それらは、標的細胞において自立的に複製し得
ない。一般に、本発明の範囲内で用いられる複製欠損ウイルスベクターのゲノム
は、感染した細胞におけるウイルスの複製のために必要な少なくとも１つの領域
を欠失する。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術で、（全体としてかま
たは部分的に）排除され得るか、または非機能的にされ得る。これらの技術とし
ては、（複製に関して）必須の領域に対する１つ以上の塩基の、総除去（ｔｏｔ
ａｌ ｒｅｍｏｖａｌ）、置換（特に挿入された核酸による、他の配列による）
、部分的欠失または付加が挙げられる。このような技術は、遺伝子操作の技術を
用いて、または変異性薬剤での処理により、（単離されたＤＮＡ上で）インビト
ロで、またはインサイチュで実行され得る。
【００９８】 好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子をキャプシド形成するのに必
要なゲノムの配列を保持する。
【００９９】 レトロウイルスは、分裂する細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロ
ウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、キャプシド化配列および３つのコード領域（
ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターの構築は
、以下に記載されている：特にＥＰ ４５３２４２、ＥＰ１７８２２０、Ｂｅｒ
ｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉ
ｃｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９などを参照のこと。
組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は
、一般的に全てまたは部分的に欠失しており、そして目的の異種核酸配列と置換
されている。これらのベクターは、以下のような異なる型のレトロウイルスから
構築され得る：ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（
「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；
ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフ
レンドウイルス。レンチウイルスベクター系はまた、本発明の実施において用い
られ得る。レンチウイルスゲノムは、全てのレトロウイルスに代表的な５’〜３
’に組織化された３つの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を含む９，００
０〜１０，０００塩基対の正鎖ポリアデニル化ＲＮＡである。レンチウイルス系
の広範な概説については、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第２巻、
第５５章、第１５７１〜１５８９頁「レンチウイルス」（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０）を参照のこと。
【０１００】 一般に、ＬＩＰＧをコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築するた
めに、ＬＴＲ、キャプシド形成配列およびコード配列を含むプラスミドを構築す
る。この構築物を用い、プラスミドを欠くレトロウイルス機能をトランスで供給
し得るパッケージング細胞株をトランスフェクトする。従って、一般に、このパ
ッケージング細胞株は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現し得る。この
ようなパッケージング細胞株は、先行技術で記載されている。詳細には、ＰＡ３
１７細胞株（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ
９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９／０７１５
０）。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためにＬ
ＴＲ内に改変を含み得る、そしてｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範なキャプシ
ド形成配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１
６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的技術により
精製され得る。
【０１０１】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスであ
る、これは感染する細胞のゲノム内に、安定かつ部位特異的な様式で組み込み得
る。それらは、細胞増殖、形態または分化になんらかの影響を誘導することなく
、広範なスペクトルの細胞に感染し得る。そしてそれらは、ヒト病理に関与しな
いようである。ＡＡＶゲノムはクローニングされ、配列決定され、そして特徴付
けされている。それは、約４７００塩基を含み、そして各末端で約１４５塩基の
逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含む。これは、ウイルスの複製起点として働く
。ゲノムの残部は、キャプシド形成機能を有する２つの必須の領域に分割される
：ゲノムの左側部分（ウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅ
ｐ遺伝子を含む）；およびゲノムの右側部分（ウイルスのキャプシドタンパク質
をコードするｃａｐ遺伝子を含む）。
【０１０２】 インビトロおよびインビボにおいて遺伝子を移入するためのＡＡＶ由来のベク
ターの使用は、記載されている（ＷＯ ９１／１８０８８；ＷＯ ９３／０９２
３９；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、Ｅ
Ｐ４８８ ５２８を参照のこと）。これらの刊行物は、種々のＡＡＶ由来構築物
（ここでは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が、欠失しており、そして目的
の遺伝子により置換されている）、ならびにインビトロ（培養細胞へ）またはイ
ンビボ（生物体に直接）において、目的のこのような遺伝子を移入するためのこ
れらの構築物の使用を記載している。本発明において利用される複製欠損組換え
ＡＡＶは、２つのＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する目的の核酸
配列を含むプラスミド、およびＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａ
ｐ遺伝子）を保有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウ
イルス）で感染した細胞株へ同時トランスフェクトすることにより調製され得る
。次に、産生されるＡＡＶ組換え体を標準的技術により精製する。従って、本発
明はまた、ＡＡＶ由来組換えウイルスに関する。このウイルスのゲノムは、ＡＡ
Ｖ ＩＴＲに隣接するＬＩＰＧポリペプチドをコードする配列を包含する。本発
明はまた、ＡＡＶ由来の２つのＩＴＲに隣接するＬＩＰＧポリペプチドをコード
する配列を包含するプラスミドに関する。このようなプラスミドは、プラスミド
を用いて、適切な位置にＬＩＰＧ配列を移入するためにそのまま用いられる。こ
れは、リポソームベクター（偽ウイルス（ｐｓｅｕｄｏ−ｖｉｒｕｓ））に組み
込まれる。
【０１０３】 好ましい実施形態において、本発明に利用されるベクターはアデノウイルスベ
クターである。
【０１０４】 アデノウイルスは、種々の細胞型に対して核酸を効率的に送達するために改変
され得る真核生物ＤＮＡウイルスである。
【０１０５】 種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうちで、本発明
の範囲内には、２型もしくは５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ ２またはＡｄ
５）、または動物由来のアデノウイルスを用いることが好ましい（ＷＯ９４／２
６９１４を参照のこと）。本発明の範囲内で用いられ得る動物起源のこれらのア
デノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス（例えば、Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら
、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル
（例えば：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物起源
のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくは、ＣＡＶ２アデノウ
イルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−
８００））である。
【０１０６】 好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、ＩＴＲ、キャプシド形成配
列および目的の核酸を含む。なおより好ましくは、アデノウイルスベクターの少
なくともＥ１領域は、非機能性である。Ｅ１領域における欠損は、好ましくはＡ
ｄ５アデノウイルスの配列のヌクレオチド４５５〜３３２９に伸びる。他の領域
がまた、詳細には、Ｅ３領域（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／
２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９および
ＷＯ９５／０２６９７）において、または後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれかにお
いて、改変され得る。欠損レトロウイルスベクターは、ＷＯ９５／０２６９７に
開示されている。
【０１０７】 好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１およびＥ４領域
において欠損を有する。別の好ましい実施形態において、アデノウイルスベクタ
ーは、Ｅ１領域において欠損を有する。ここでＥ１領域にＥ４領域およびＬＬＧ
をコードする配列が挿入される（ＦＲ９４ １３３５５を参照のこと）。
【０１０８】 複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術により調製され
得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５、ＥＰ １８５
５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。詳細には
、それらは、アデノウイルスとプラスミド（とりわけ、目的のＤＮＡ配列を保有
する）との間の相同組換えにより調製され得る。この相同組換えは、適切な細胞
株へのこのアデノウイルスとプラスミドの同時トランスフェクションにより達成
される。使用される細胞株は、好ましくは（ｉ）このエレメントにより形質転換
可能でなければならず、そして（ｉｉ）複製欠損アデノウイルスのゲノムの一部
に相補的であり得る配列、好ましくは、組換えの危険性を回避するために組み込
み型で、含むべきである。用いられ得る細胞株の例は、ヒト胚性腎細胞株２９３
（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）であり、
これは、そのゲノムに組み込まれたＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左側部分（
１２％）を含み、そしてこの細胞株は、出願ＷＯ ９４／２６９１４およびＷＯ
９５／０２６９７に記載のようにＥ１機能およびＥ４機能を補完し得る。組換え
アデノウイルスは、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて回収およ
び精製され得る。
【０１０９】 （アンチセンス核酸） アンチセンス核酸を用いる遺伝子発現のダウンレギュレーション（下方制御）
は、翻訳レベルまたは転写レベルで達成され得る。本発明のアンチセンス核酸は
、好ましくは、ＬＩＰＧをコードする核酸または対応するメッセンジャーＲＮＡ
の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズし得る核酸フラグメントである。さ
らに、その主な転写物のスプライシングを阻害することによりＬＩＰＧ遺伝子の
発現を低下させるアンチセンス核酸は、示されるかまたは同定され得る。ＬＩＰ
Ｇ遺伝子の構造配列および部分配列の知見に関して、このようなアンチセンス核
酸は、効力について指定され、そして試験され得る。
【０１１０】 アンチセンス核酸は、好ましくは、オリゴヌクレオチドであり、そして全体と
してデオキシリボヌクレオチド、改変デオキシリボヌクレオチド、または両者の
組み合わせから構成され得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドで
あり得る。オリゴヌクレオチドは、所望の場合、安定性および／または選択性を
改善するために、化学的に改変され得る。オリゴヌクレオチドは、細胞内ヌクレ
アーゼによる分解に感受性であるので、改変としては、例えば、イオウ基の使用
によるホスホジエステル結合の遊離の酸素の置き換えが挙げられ得る。この改変
は、ホスホロチオエート連結と呼ばれる。ホスホロチオエートアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、水溶性、ポリアニオン性であり、そして内因性ヌクレアーゼ
に対して抵抗性である。さらに、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレ
オチドがその標的部位にハイブリダイズする場合、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖は、内
因性酵素リボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ）Ｈを活性化する。これは、ハイブリッ
ド分子のｍＲＮＡ成分を切断する。
【０１１１】 さらに、ホスホロアミダイト結合およびポリアミド（ペプチド）結合を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、合成され得る。これらの分子は、ヌクレア
ーゼ分解に対して非常に耐性であるべきである。さらに、化学基は、糖部分の２
’炭素およびピリミジンの５炭素（Ｃ−５）に付加され、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドのその標的部位への結合の安定性を増強し、結合を容易にする。改変
としては、２’デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フ
ロロ、メトキシエトキシホスホロ−チオエート、改変塩基、ならびに当業者に公
知の他の改変が挙げられ得る。
【０１１２】 アンチセンス核酸はまた、ＤＮＡ配列（細胞中でのその発現が、ＬＩＰＧ ｍ
ＲＮＡの全てまたは一部に相補的なＲＮＡを産生する）であり得る。アンチセン
ス核酸は、ＥＰ １４０３０８に記載のように、反対方向で、配列番号２、配列
番号３、配列番号７または配列番号１１からなる群より選択される配列の全てま
たは一部の発現により調製され得る。任意の長さのアンチセンス配列は、それが
ＬＩＰＧの発現を下方制御し得るかまたはブロックし得る限り、本発明の実施に
ついて適切である。好ましくは、アンチセンス配列は、少なくとも２０ヌクレオ
チドの長さである。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
の調製および使用ならびにオリゴおよび遺伝的アンチセンスの使用は、ＷＯ９２
／１５６８０に開示され、その内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０１１３】 アンチセンス核酸処置方法において使用するためのＬＩＰＧの最適フラグメン
トを決定するための１つのアプローチは、フラグメントを機械的にせん断し、酵
素処理をし、そして本明細書中に記載されるベクター系のいずれかにクローニン
グすることによって、ＬＩＰＧ ＤＮＡのランダムなフラグメントを調製する工
程を含む。個々のクローンまたはクローンのプールは、ＬＩＰＧ発現細胞を感染
させるために使用され、そして効果的なアンチセンスＬＩＰＧ ｃＤＮＡフラグ
メントが、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでＬＩＰＧ発現をモニターする
ことによって同定される。
【０１１４】 本明細書中上で議論されるレトロウイルスベクター系、アデノ随伴ウイルスベ
クター系、およびアデノウイルスベクター系は、すべて、アンチセンス核酸を細
胞中に導入して、発現させるために使用され得る。アンチセンス合成オリゴヌク
レオチドは、本明細書中以下に議論される方法を含む種々の方法で導入され得る
。
【０１１５】 （リボザイム） ＬＩＰＧポリペプチドのレベルにおける低下は、リボザイムを使用して達成さ
れ得る。リボザイムは、別々の触媒ドメインおよび基質結合ドメインを有する触
媒性ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性に
よって、そしておそらく非水素結合相互作用によってその標的配列と結合する。
触媒部分は、標的ＲＮＡを特異的部位で切断する。リボザイムの基質ドメインは
、それを特定のｍＲＮＡ配列に指向させるために操作され得る。リボザイムは、
標的ｍＲＮＡを認識し、次いで、相補的な塩基対合を介して標的ｍＲＮＡを結合
する。一旦、リボザイムが正しい標的部位に結合すると、リボザイムは、酵素的
に作用して標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイムによるＬＩＰＧ ｍＲＮＡの切
断は、ＬＩＰＧポリペプチドの合成を指向するＬＩＰＧ ｍＲＮＡの能力を破壊
する。一旦、リボザイムがその標的配列を切断すると、リボザイムは放出されて
、他のＬＩＰＧ ｍＲＮＡにおいて繰り返し結合および切断し得る。
【０１１６】 本発明の好ましい実施形態において、リボザイムは、ハンマーヘッドモチーフ
で形成される。他の形態としては、ヘアピンモチーフ、デルタ肝炎ウイルス、グ
ループＩイントロンまたは（ＲＮＡガイド配列と会合した)ＲｎａｓｅＰ ＲＮ
ＡモチーフまたはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフが挙げられる。
ハンマーヘッドモチーフは、Ｒｏｓｓｉら、１９９２、Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、８、１８３によって記
載される。ヘアピンモチーフは、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ、１９８９、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、４９２９、およびＨａｍｐｅｌら、１９９０、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、２９９に記載される。デルタ肝
炎ウイルスモチーフは、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、１９９２、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、１６によって記載され、ＲｎａｓｅＰモチーフは、Ｇ
ｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３５、８４９によって
記載され、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌ
ｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１、
６８５−６９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉ
ｎｓおよびＯｌｉｖｅ、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２、２７９５
−２７９９）によって記載され、グループＩイントロンモチーフは、Ｃｅｃｈら
、米国特許第４，９８７，０７１号によって記載される。
【０１１７】 リボザイムを調製する際の１つのアプローチは、転写後に標的ＬＩＰＧ ｍＲ
ＮＡにハイブリダイズする配列に隣接するリボザイム触媒性ドメイン（約２０ヌ
クレオチド）を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成すること
である。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、プライマーとして基質結合配列を
使用することによって増幅される。増幅産物は、真核生物発現ベクターにクロー
ン化される。
【０１１８】 ハンマーヘッド構造またはへアピン構造を有するリボザイムは、容易に調製さ
れる。なぜなら、これらの触媒性ＲＮＡ分子は、真核生物プロモーターから細胞
内で発現され得るからである（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎ
ｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、２、３
−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、１４３２−
４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、５５３
１−４；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８９、１０８０２−６；Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４７、１２２２−１２２５））。本発明のリボザイムは、適切なＤＮ
Ａベクターから真核生物細胞において発現され得る。望ましい場合、リボザイム
の活性は、第２のリボザイムによる一次転写物からのその放出によって増強され
得る（Ｏｈｋａｗａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓ
ｅｒ．、２７、１５−６；Ｔａｉｒａら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、１９、５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａら、１９９３、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１、３２４９−５５）。
【０１１９】 リボザイムを調製するための１つのアプローチにおいて、リボザイムは、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたはウイルスベクターに挿入された転写単位から発現される。リボ
ザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ（Ｉ））、ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩＩ）に対するプロモーターから駆動される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ
ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞において高レベルで発現される
。所与の細胞タイプにおける所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、すぐ
近くの遺伝子調節配列に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは
また、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が、適切な細胞で発現される場合、使用
される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、６７４３−７；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ
１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１、２８６７−７２；
Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７、４７
−６６；Ｚｈｏｕら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４５２
９−３７）。これらのプロモーターから発現されるリボザイムが哺乳動物細胞に
おいて機能し得ることが示された（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２、
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、２、３−１５；Ｏｊｗａｎｇら、１９
９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０８０２−
６；Ｃｈｅｎら、１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、４
５８１−９；Ｙｕら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、９０、６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２、ＥＭＢＯ Ｊ．
、１１、４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、８０００−４）。
【０１２０】 本発明の１つの実施形態において、ＬＩＰＧ ＲＮＡを切断するリボザイムを
発現する転写単位が、プラスミドＤＮＡベクター、レトロウイルスベクター、ア
デノウイルスＤＮＡウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターに挿入
される。組換えベクターは、好ましくは、ＤＮＡプラスミドまたはアデノウイル
スベクターである。しかし、ＲＮＡの発現を指向する他の哺乳動物細胞ベクター
は、この目的のために使用され得る。ベクターは、組換えウイルス粒子として送
達される。ＤＮＡは、単独でまたは種々のビヒクルと複合体化されて送達され得
る。ＤＮＡ、ＤＮＡ／ビヒクル複合体、または組換えウイルス粒子は、以下に議
論されるように、処置部位に局所的に投与される。好ましくは、リボザイムを発
現し得る組換えベクターは、以下に記載されるように局所的に送達され、標的細
胞において持続する。一旦発現されると、リボザイムは標的ＬＩＰＧ ｍＲＮＡ
を切断する。
【０１２１】 リボザイムは、種々の方法によって患者に投与され得る。リボザイムは、直接
標的組織に加えられ得るか、カチオン性脂質と複合体化され得るか、リポソーム
にパッケージングされ得るか、または当該分野で公知の他の方法によって標的細
胞に送達され得る。所望の組織に対する局所的投与は、本明細書中以下に議論さ
れるように、カテーテル、注入ポンプ、またはステントによって、生体高分子中
へのリボザイムの取り込みを伴うかまたは伴わないでなされ得る。代替の送達経
路としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤
または丸剤形態）、局所的、全身的、眼、腹腔内、および／または髄腔内の送達
が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイムの送達および投与について
のより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５およ
びＤｒａｐｅｒら、ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供され、これらは、本明
細書中に参考として援用される。
【０１２２】 （非ウイルス送達系） 特定の非ウイルス系は、当該分野において使用されており、ＬＩＰＧポリペプ
チドをコードするＤＮＡまたはアンチセンス核酸の患者への導入を容易にし得る
。
【０１２３】 所望のＬＩＰＧポリペプチドまたはアンチセンス配列をコードするＤＮＡベク
ターは、リポフェクションによってインビボで導入され得る。過去１０年におい
て、インビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポ
ソームの使用が増加している。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する
困難および危険を制限するために設計される合成カチオン性脂質は、マーカーを
コードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためにリポソームを調製す
るために使用され得る［Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３
１（１９８８）を参照のこと；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４
５−１７４８（１９９３）］。カチオン性脂質の使用は、負に荷電された核酸の
カプセル化を促進し得、そしてまた負に荷電された細胞膜との融合を促進し得る
［ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−３８
８（１９８９）］。核酸の移入のために特に有用な脂質化合物および組成物は、
国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国
特許第５，４５９，１２７号に記載される。インビボで外来性遺伝子を特定の器
官に導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実際的な利点を有する。
特定の細胞に対するリポソームの分子標的化は、利益の有る１つの領域を表す。
特定の細胞型に対してトランスフェクションを指向させることが、細胞的不均質
性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳において特に有利である
ことは明かである。脂質は、標的化の目的のために他の分子に化学的に結合され
得る［Ｍａｃｋｅｙら、上記を参照のこと］。標的化されたペプチド（例えば、
ホルモンまたは神経伝達物質）およびタンパク質（例えば、抗体または非ペプチ
ド分子）は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０１２４】 他の分子（例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公開ＷＯ９
５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されるペプチド（例えば、国
際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際
特許公開ＷＯ９５／２１９３１））もまた、核酸のインビボでのトランスフェク
ションを容易にするために有用である。
【０１２５】 裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでＬＩＰＧポリペプチドをコードするＤ
ＮＡベクターまたはアンチセンス配列を導入することもまた可能である（米国特
許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０
，８５９号を参照のこと）。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当該分
野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸
カルシウム沈澱、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使
用）によって望ましい宿主細胞に導入され得る［例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；１９
９０年３月１５日に出願された、Ｈａｒｔｍｕｔら、カナダ国特許出願第２，０
１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０（１９９１）を参照のこと］。レセプター
媒介ＤＮＡ送達アプローチもまた、使用され得る［Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４（１９９２）；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）］。
【０１２６】 （抗体） 本発明は、ＬＩＰＧポリペプチドに対する抗体を提供する。これらの抗体は、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本発明は、キメラ抗
体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、そしてＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現
ライブラリーの産物、ならびにＦｖフラグメントおよびＦｖ発現ライブラリーの
産物を含む。
【０１２７】 ポリクローナル抗体は、本明細書中以下の実施例の節に記載されるように、Ｌ
ＩＰＧポリペプチドの抗原性フラグメントに対して調製され得る。抗体はまた、
インタクトなＬＩＰＧタンパク質またはポリペプチドに対して、あるいはこのタ
ンパク質またはポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはエピトープに対し
て作製され得る。抗体は、当該分野で公知の技術および手順を使用して、動物に
対するタンパク質、ポリペプチド、フラグメント、誘導体またはエピトープの投
与に従って得られ得る。
【０１２８】 モノクローナル抗体は、Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．ら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ編）Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）の方法を使用して調製
され得る。手短には、本発明のポリペプチドは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓細胞
を免疫するために使用される。免疫された脾臓細胞は、ミエローマ細胞に融合さ
れる。脾臓およびミエローマ細胞の特徴を含む融合細胞は、ＨＡＴ培地（両方の
親細胞を殺すが、融合産物を生き残らせ、そして増殖させ得る培地）での増殖に
よって単離される。
【０１２９】 本発明のモノクローナル抗体は、宿主が抗体に対する免疫応答を開始すること
を妨げるために、「ヒト化」され得る。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）ならびに／あるいは軽鎖可変ドメインフレームワークおよび／または重鎖
の他の部分が非ヒト免疫グロブリンから誘導されるが、分子の残りの部分が１つ
以上のヒト免疫グロブリンから誘導される抗体である。ヒト化抗体はまた、ドナ
ーもしくはアクセプターの非改変軽鎖、またはキメラ軽鎖と関連したヒト化重鎖
によって特徴付けられる抗体を含み、その逆も含む。抗体のヒト化は、当該分野
で公知の方法によって達成され得る（例えば、Ｇ．Ｅ．ＭａｒｋおよびＥ．Ａ．
Ｐａｄｌａｎ、「Ｃｈａｐｔｅｒ ４．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ 第１１３巻、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４を参照のこと）。トラ
ンスジェニック動物は、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。
【０１３０】 単鎖抗体の産生のための当該分野で公知の技術を適用して、本発明の免疫原性
ポリペプチドおよびタンパク質に対する単鎖抗体を産生し得る。
【０１３１】 好ましい実施形態では、抗ＬＩＰＧ抗体を用いて、タンパク質に結合させ、そ
してタンパク質におけるＬＩＰＧの酵素活性を阻害する。
【０１３２】 抗ＬＩＰＧ抗体はまた、ＬＩＰＧのレベルを検出または定量するためのアッセ
イに有用である。１つの実施形態では、これらのアッセイは、種々の疾患におけ
るＬＩＰＧの臨床的診断および評価、ならびに処置効果をモニタリングするため
の方法を提供する。これらの抗ＬＩＰＧ抗体をさらに用いて、組織サンプルにお
けるＬＩＰＧを定量して、低下したレベルのＨＤＬコレステロールおよびアポリ
ポタンパク質ＡＩに対する、さらなる感受性を予想する。
【０１３３】 （阻害分子およびエンハンサー分子を同定および利用する方法） 本発明は、ＬＩＰＧ活性のエンハンサー（アゴニスト）または活性化補助因子
（ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（タンパク様の補助活性化因子またはインヒビタ
ー（アンタゴニスト）を含む）についての低分子ライブラリーまたは天然物供給
源をスクリーニングする方法を提供する。潜在的なエンハンサーまたはインヒビ
ターを、ＬＩＰＧタンパク質およびＬＩＰＧの基質と接触させて、そしてＬＩＰ
Ｇ活性を増加させるか、または阻害する潜在的なエンハンサーまたはインヒビタ
ーの能力を測定する。
【０１３４】 これらのスクリーニング法をまた用いて、化合物が基質特異的なエンハンサー
またはインヒビターとして機能し得るか否か（すなわち、化合物が、ある基質に
対するＬＩＰＧの酵素活性を増加させる一方、異なる基質（例えば、本発明のＬ
ＩＰＧポリペプチドは、基質としてＨＤＬコレステロールを利用し、そして同様
に、基質としてＬＤＬコレステロールおよびＶＬＤＬコレステロールを利用する
）についての酵素活性の所定のレベルを低下または維持するか否か）を決定し得
る。特定の実施形態では、ＬＤＬコレステロールまたはＶＬＤＬコレステロール
に対するＬＩＰＧポリペプチドの酵素活性を増加する一方、ＨＤＬコレステロー
ルについての酵素活性の正常なレベルを低下または維持する、基質特異的エンハ
ンサーまたはインヒビターを単離および同定することが所望される。
【０１３５】 ＬＩＰＧタンパク質は、種々の宿主細胞（哺乳動物細胞、バキュロウイルス感
染昆虫細胞、酵母、および細菌を含む）において組換え的に産生され得る。安定
にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＬＩＰＧ発現は、細胞のメトトレ
キセート増幅により最適化され得る。ＬＩＰＧタンパク質はまた、天然の供給源
（例えば、ヒト血漿、胎盤抽出物、または培養した内皮細胞、ＴＨＰ−１細胞、
もしくはマクロファージ由来の馴化培地）から精製され得る。
【０１３６】 ｐＨ、イオン濃度、温度、基質の濃度、および乳化条件を含むアッセイパラメ
ーターの最適化は、当業者により経験的に決定される。
【０１３７】 基質の脂肪酸置換基は、鎖の長さ、ならびに不飽和の程度および部位で変化し
得る。基質は、いくつかの位置のいずれかにおいて放射性標識され得る。ホスフ
ァチジルコリンのようなリン脂質基質は、例えば、Ｓｎ−１脂肪酸位、Ｓｎ−２
脂肪酸位において、あるいはグリセロール基、リン酸基、または極性先端基（ｐ
ｏｌａｒ ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）（ホスファチジルコリンの場合コリン）にお
いて放射性標識され得る。
【０１３８】 放射性標識基質に対する代替物として、他のクラスの標識基質（例えば、蛍光
基質、またはチオ含有基質）もまた、スクリーニング法に用いられ得る。
【０１３９】 蛍光基質は、スクリーニングアッセイにおいて特に有用である。なぜならば、
酵素触媒は、蛍光強度を、基質からの産物の物理的分離（抽出）なしに、測定す
ることにより、連続的に測定され得るからである。蛍光ホスファチジルコリンの
例は、Ｃ6ＮＢＤ−ＰＣ[１−アシル−２−［６−（ニトロ−２，１，３−ベンズ
オキサジアゾール−４−イル）アミノ］カプロイルホスファチジルコリンである
。
【０１４０】 チオ含有基質としては、１，２−ビス（ヘキサノイルチオ）−１，２−ジデオ
キシ−ｓｎ−グリセリロ−３−ホスホリルコリン（Ｌ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、
Ｗ．Ｎ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ、Ｒ．Ａ．Ｄｅｅｍｓ、およびＥ．Ａ．Ｄｅｎｎｉｓ
、１９９１．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：３−２３
；Ｌ．ＹｕおよびＥ．Ａ．Ｄｅｎｎｉｓ、１９９１．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９７：６５−７５；Ｌ．Ａ．Ｗｉｔｔｅｎａｕｅｒ、Ｋ
．Ｓｈｉｒａｉ、Ｒ．Ｌ．Ｊａｃｓｏｎ、およびＪ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９
８４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．１１８：８９４
−９０１）。
【０１４１】 酵素活性のレベルで作動する阻害分子およびエンハンサー分子に加えて、ＬＩ
ＰＧ遺伝子の発現のレベルで作動する阻害分子およびエンハンサー分子が存在す
る。ＬＩＰＧの発現を増加または阻害し得る化合物を同定する１つの方法は、レ
ポーター遺伝子系を用いることである。これらの系は、所定のプロモーターが、
容易に検出および定量され得る「レポーター遺伝子」の上流でクローニングされ
得るクローニング部位を含む、レポーター遺伝子発現ベクターを利用する。当業
者は、ＬＩＰＧ遺伝子についてのプロモーターおよび他の制御配列を容易に同定
し得、そして市販のレポーター遺伝子発現ベクターにサブクローニングし得る。
発現ベクターは、宿種細胞に移され、そしてこの細胞を、試験化合物（推定のイ
ンヒビター分子またはエンハンサー分子）暴露させて、レポーター遺伝子産物の
発現に対する試験化合物の効果を決定する。詳細には、この細胞は、レポーター
ｍＲＮＡの量、レポータータンパク質自体の量、またはレポータータンパク質の
酵素活性を直接的に測定することにより、レポーター遺伝子産物の割合について
アッセイされる。理想的には、レポーター遺伝子は、目的の細胞型において内因
的に発現されず、そして感受性アッセイ、定量アッセイ、および迅速なアッセイ
にそれ自身が役立つ。種々のレポーターアッセイ構築物が市販されており、そし
ていくつかのレポーター遺伝子およびアッセイは、当業者により開発されており
、そして当業者により容易に調製され得る。真核生物細胞における遺伝子活性を
モニタリングするための最も有名な系としては、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ
、成長ホルモン（ＧＨ）、β−グルクロシダーゼ（ＧＵＳ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＰ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびＲｅｎｉｌｌａル
シフェラーゼが挙げられる。レポーターアッセイ構築物は、Ｐｒｏｍｅｇａおよ
びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎを含む種々の供給元から購入できる。
【０１４２】 上記のように、レポーター遺伝子活性は、レポーターｍＲＮＡまたはレポータ
ータンパク質についてアッセイすることにより検出され得る。レポーターｍＲＮ
Ａは、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒにより検出され得る。これらのアッセイは、タンパク質発現を測定するよりも
、より直接的であるが、多くのアッセイが、細胞に存在するｍＲＮＡよりむしろ
、レポータータンパク質の存在を測定するために開発されている。レポータータ
ンパク質は、分光光度法により、または酵素活性を検出することによりアッセイ
され得る。レポータータンパク質レベルはまた、抗体ベースのアッセイを用いて
測定され得る。一般に、酵素アッセイは、非常に敏感であり、そしてレポーター
遺伝子発現をモニタリングする好ましい方法である。
【０１４３】 （組成物） 本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、および抗体を含む、生物
学的に適合性（生体適合性）の溶液中の組成物を提供する。生物学的に適合性の
溶液は、本発明のポリペプチド、核酸、ベクター、または抗体が、活性形態で（
例えば、生物学的活性をもたらし得る形態で）維持される。例えば、本発明のポ
リペプチドは、ホスファチジル活性を有し；核酸は、相補的核酸に、複製し得る
か、メッセージを翻訳し得るか、またはハイブリダイズし得；ベクターは、標的
細胞をトランスフェクトし得；抗体は、本発明のポリペプチドを結合し得る。一
般に、このような生物学的に適合性の溶液は、水性緩衝液（例えば、塩イオンを
含む、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、またはＨＥＰＥＳ緩衝液）である。通常
、塩イオンの濃度は、生理学的レベルに類似する。特定の実施形態では、生体適
合性溶液は、薬学的に受容可能な組成物である。生物学的に適合性の溶液は、安
定化剤および保存剤を含み得る。
【０１４４】 このような組成物は、局所経路、経口経路、非経口経路、鼻内経路、皮下経路
、および眼内経路による投与のために処方され得る。非経口投与とは、静脈注射
、筋肉内注射、動脈内注射、または注入の技術を含むことを意味する。組成物は
、所望される場合、標準的な、周知の無毒性の生理学的に受容可能な、キャリア
、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位処方物で、非経口的に投与され
得る。
【０１４５】 好ましい滅菌の注射可能な調製物は、無毒性の非経口的に受容可能な溶媒また
は希釈剤中の溶液または懸濁液であり得る。薬学的に受容可能なキャリアの例と
しては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、等張生理食塩水（例えば、リン酸１ナ
トリウムもしくはリン酸２ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カ
ルシウム、または塩化マグネシウム、またはこのような塩の混合物）、リンガー
液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、およびこれらの
組み合わせが挙げられる。１，３−ブタンジオールおよび滅菌不揮発性油は、溶
媒または懸濁媒体として便利に用いられる。任意の混合不揮発製油は、合成モノ
グリセリドまたは合成ジグリセリドを含ませて用いられ得る。オレイン酸のよう
な脂肪酸はまた、注射可能物の調製における用途を見出す。
【０１４６】 組成物媒体はまた、任意の生体適合性ポリマーまたは非細胞傷害性（ホモまた
はヘテロ）ポリマー（例えば、薬物吸収スポンジとして作用し得る、親水性ポリ
アクリル酸ポリマー）から調製されるヒドロゲルであり得る。このようなポリマ
ーは、例えば、、ＷＯ９３／０８８４５（この内容の全体が本明細書中で参照と
して援用される）の出願に記載されている。一定のこれらは、例えば、特に、エ
チレンおよび/またはプロピレンオキシドから得られるものが、市販されている
。ヒドロゲルは、例えば、外科的処置の間に、処置される組織の表面上に直接的
に蓄積され得る。
【０１４７】 本発明の別の好ましい実施形態は、複製欠損組換えウイルスおよびポロキサマ
ー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）を含む薬学的組成物に関する。より詳細には、本発明
は、ＬＩＰＧポリペプチドをコードする核酸およびポロキサマーを含む複製欠損
組換えウイルスを含む組成物に関する。好ましいポロキサマーは、Ｐｏｌｏｘａ
ｍｅｒ ４０７（これは市販されており（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ
Ｊ）、そして無毒性の生体適合性ポリオールであり、そして最も好ましい）であ
る。組換えウイルスを浸込ませたポロキサマーは、例えば、外科的処置の間に、
処置される組織の表面上に直接的に蓄積され得る。ポロキサマーは、ヒドロゲル
と同じ利点を本質的に有するが、より低い粘度を有する。
【０１４８】 （処置の方法） 本発明は、本発明の組成物の有効量のヒトまたは他の動物への投与を包含する
、処置の方法を提供する。
【０１４９】 有効量は、年齢、処置される状態の型および重篤度、体重、処置の所望される
持続期間、投与の方法、ならびに他のパラメーターに依存して変化し得る。有効
量は、医師または他の資格のある医療専門家により決定される。ほとんどの場合
、投薬レベルは調整され得、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａ
Ｉの所望のレベルが、達成および維持される。同様に、投薬レベルは、ＶＬＤＬ
コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを受容可能なレベルまで低
くし、そして所ＨＤＬコレステロール対ＬＤＬコレステロールの割合、およびＶ
ＬＤＬコレステロールを、所望のレベル内にするように調整され得る。
【０１５０】 本発明に従うポリペプチドは、一般に、１日当たり体重の、約０．０１ｍｇ／
ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋ
ｇ、そして最も好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの容量で投与さ
れる。
【０１５１】 本発明に従う中和抗体は、ボーラスのみとして送達され得るか、経時的注入さ
れ得るか、またはボーラスとして投与されかつ経時的に注入され得る。この投薬
量は、上記のパラメーター、および抗体の結合能力に基づいて変化するが、０．
２〜０．６ｍｇ／ｋｇの用量が、ボーラスと引き続く２〜１２時間の注入時間の
場合に与えられる。あるいは、複数のボーラス注入が、必要な場合に、１日おき
、３日または４日ごとに投与される。投薬レベルは、ＨＤＬコレステロールレベ
ルおよび/またはＶＬＤＬおよびＬＤＬコレステロールレベルにより決定される
ように調整され得る。
【０１５２】 上記で議論したように、組換えウイルスを用いて、ＬＩＰＧをコードするＤＮ
ＡおよびＬＩＰＧのサブフラグメントの両方、ならびにアンチセンス核酸を導入
し得る。本発明に従う組換えウイルスは、一般に、約１０4〜約１０14ｐｆｕの
間の用量の形態で処方および投与される。ＡＡＶおよびアデノウイルスの場合、
約１０6〜約１０11ｐｆｕの用量が、好ましくは用いられる。用語ｐｆｕ（「プラ
ーク形成単位」）は、ウイルスの懸濁液の感染力に対応し、そして適切な細胞培
養物を感染させ、そして形成されたプラークの数を測定することにより決定され
る。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を測定するための技術は、先行技術で十分に考証
されている。
【０１５３】 本発明によるリボザイムは、薬学的に受容可能なキャリア中で、約５〜約５０
ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で、投与され得る。投薬量レベルは、測定された治療
効力に基づいて、調整され得る。
【０１５４】 インヒビター分子またはエンハンサー分子の適切なレベルは、上記で議論した
パラメーターを用いて、資格を有する医療職員により決定され得る。
【０１５５】 本発明は、患者において、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａ
Ｉのレベルを増加させ、そしてＶＬＤＬおよびＬＤＬコレステロールのレベルを
低下させるための、組成物および方法を提供する。本発明は、所望でない脂質プ
ロフィールを有するヒトまたは他の動物を処置する方法をさらに提供し、ここで
、この所望でない脂質プロフィールは、ＬＩＰＧポリペプチド活性の異常に高い
発現の結果である。
【０１５６】 （ＬＩＰＧポリペプチド活性のレベルを低下させるための方法および組成物） ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを増加させる目
的、ならびにＬＩＰＧポリペプチド活性が所望でない脂質プロフィールに関連す
る疾患または障害に寄与する状態を正す目的での、ＬＩＰＧポリペプチドの発現
を減少させるための方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：アンチセンス核酸を含有する組成物の投与、抗体のような細胞内結合タンパク
質を含有する組成物の投与、ＬＩＰＧの酵素的活性を阻害する阻害分子（例えば
、ＬＩＰＧのサブフラグメント（例えば、ＬＬＧＮポリペプチドまたは低分子量
分子）をコードする発現ベクターを含有する組成物）の投与（ＬＩＰＧ発現を、
転写、翻訳または翻訳後のレベルでダウンレギュレートする低分子量化合物の投
与を含む）、およびＬＩＰＧをコードするｍＲＮＡを切断するリボザイムの投与
。
【０１５７】 （アンチセンス核酸を利用する方法） １つの実施形態において、アンチセンス核酸を含有する組成物を使用して、Ｌ
ＩＰＧの発現をダウンレギュレートまたはブロックする。１つの好ましい実施形
態において、この核酸は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードする。この実施形態
において、この核酸は、この核酸配列の発現を可能にするシグナルに作動可能に
連結され、そして一旦組換えベクターが細胞に導入されるとアンチセンス核酸を
発現する組換えベクター構築物を、好ましくは利用して、細胞に導入される。適
切なベクターの例としては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
、レトロウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。好ましくは、このベ
クターは、アデノウイルスである。最も好ましくは、このベクターは、このウイ
ルスのＥ１および／またはＥ３領域において欠失を含む、複製欠損アデノウイル
スである。
【０１５８】 別の実施形態において、アンチセンス核酸が合成され、そして上記で議論され
るように、細胞内ヌクレアーゼによる分解に耐性であるように化学的に修飾され
得る。合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソームを用いて、細胞に導
入され得る。細胞取り込みは、アンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソーム内
にカプセル化される場合に起こる。効果的な送達系を用いて、低い非毒性の濃度
のアンチセンス分子を使用して、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。さらに、細
胞特異的結合部位と結合体化されるリポソームは、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを特定の組織に指向する。
【０１５９】 （中和抗体および他の結合タンパク質を利用する方法） 別の実施形態において、ＬＩＰＧの発現は、ＬＩＰＧと選択的に相互作用し得
る細胞内結合タンパク質をコードする核酸配列の発現により、ダウンレギュレー
トまたはブロックされる。ＷＯ９４／２９４４６およびＷＯ９４／０２６１０（
これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）は、細胞内結合タンパク
質をコードする遺伝子での細胞トランスフェクションを開示する。細胞内結合タ
ンパク質は、ＬＩＰＧが発現される細胞内のＬＩＰＧと選択的に相互作用または
結合し得、そして結合ＬＬＧの機能を中和し得る、任意のタンパク質を含む。好
ましくは、細胞内結合タンパク質は、中和抗体または中和抗体のフラグメントで
ある。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は、単鎖抗体である。
【０１６０】 ＷＯ９４／０２６１０は、抗体の調製および特定の抗体をコードする核酸の同
定を開示する。ＬＩＰＧまたはそのフラグメントを使用して、特定のモノクロー
ナル抗体が、当業者に公知の技術により、調製される。細胞内結合タンパク質ま
たはその一部をコードする核酸を含み、宿主細胞中で発現し得るベクターは、引
き続いて、本発明の方法における使用のために、調製される。
【０１６１】 あるいは、ＬＩＰＧ活性は、中和抗体を循環に投与することにより、ブロック
され得る。このような中和抗体は、タンパク質として直接投与され得るか、また
は（分泌シグナルとともに）ベクターから発現され得る。
【０１６２】 （ＬＩＰＧの酵素的活性を阻害する阻害分子を利用する方法） 別の実施形態において、ＬＩＰＧ活性は、ＬＩＰＧポリペプチドのサブフラグ
メント（例えば、ＬＬＧＮ）を含有する組成物の投与により、阻害される。この
組成物は、従来の様式（例えば、経口経路、局所経路、静脈内経路、腹腔内経路
、筋内経路、皮下経路、鼻腔内経路、または皮内経路による）において、投与さ
れ得る。この組成物は、直接投与され得るか、またはカプセル化され得る（例え
ば、脂質系、アミノ酸ミクロスフェア、または球状デンドリマー中）。ポリペプ
チドは、いくつかの場合において、血清アルブミンまたはポリビニルピロリドン
のような別のポリマーに付着され得る。
【０１６３】 別の実施形態において、ＬＩＰＧ活性は、遺伝子治療の使用により、すなわち
、ＬＩＰＧのサブセグメント（例えば、ＬＬＧＮ）をコードし、そしてこれの発
現を指向する核酸を含む組成物の投与により、阻害される。
【０１６４】 別の実施形態において、ＬＩＰＧ活性は、阻害分子の使用により阻害される。
これらの低分子量化合物は、ＬＩＰＧの酵素特性を干渉するか、または細胞結合
部位によるその適切な認識を防止する。
【０１６５】 特定の実施形態において、本発明のＬＩＰＧポリペプチドはまた、ヘパリンに
対する親和性を有する。血管の管腔内の細胞外ヘパリンに結合するＬＩＰＧポリ
ペプチドは、ＬＩＰＧがＬＤＬと細胞外ヘパリンとの間の架橋として作用するこ
とにより、ＬＩＰＧがＬＤＬと結合し、そしてＬＤＬ取り込みを加速することを
可能にする。アテローム性動脈硬化症病変の局在化した領域において増加したレ
ベルのリパーゼ活性が、アテローム発生プロセスを加速することが、仮定されて
いる（Ｚｉｌｖｅｒｓｍｉｔ，Ｄ．Ｂ．（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１
、１５３−１５８；Ｚａｍｂｏｎ，Ａ．、Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．、Ｂｉｊｖｏｅｔ
，Ｓ．、Ｇａｇｎｅ，Ｃ．、Ｍｏｏｊａｎｉ，Ｓ．、Ｌｕｐｉｅｎ，Ｐ．Ｊ．、
Ｈａｙｄｅｎ Ｍ．Ｒ．、およびＢｒｕｎｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．（１９９３）Ｌａ
ｎｃｅｔ ３４１、１１１９−１１２１）。これは、リパーゼにより媒介される
、血管組織によるリポタンパク質の結合および取り込みの増加に起因し得る（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．、Ｓｅｈａｙｅｋ，Ｅ．、Ｏｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｔ．
、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，Ｉ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０、
２０１３−２０２１；Ｔａｂａｓ，Ｉ．、Ｌｉ．Ｉ．、Ｂｒｏｃｉａ Ｒ．Ｗ．
、Ｘｕ，Ｓ．Ｗ．、Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｔ．Ｌ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ．Ｊ．（
１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、２０４１９−２０４３２；Ｎｏｒ
ｄｅｓｔｇａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．、およびＮｉｅｌｓｅｎ．Ａ．Ｇ．（１９９４）
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄ．５、２５２−２５７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｋ
．Ｊ．、およびＴａｂａｓ，Ｉ．（１９９５）Ａｒｔ．Ｔｈｒｏｍｂ，ａｎｄ
Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１５、５５１−５６１）。さらに、リパーゼ活性の高い局
所レベルにより、細胞傷害性レベルの脂肪酸およびリポホスファチジルコリンが
、アテローム性動脈硬化症病変の前駆細胞において産生され得る。ＬＬＧのこの
特定の活性は、特に、食事および遺伝の因子に起因する、被験体における過剰の
脂質レベルの観点において、アテローム性動脈硬化症の発症または進行に寄与し
得る。従って、本発明は、ＬＩＰＧポリペプチドの発現またはリポタンパク質（
例えば、ＬＤＬ）への結合を阻害することにより、リポタンパク質の蓄積の阻害
を可能にする。
【０１６６】 （ＬＩＰＧ遺伝子発現を妨げる阻害分子を利用する方法） 別の実施形態において、阻害分子（低分子量化合物を含む）は、転写、翻訳ま
たは翻訳後のレベルで、ＬＩＰＧ発現をダウンレギュレートし得る。このような
阻害分子を同定するために、上記レポーター遺伝子系を使用し得る。これらの阻
害分子は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ得、そして当該分野に
おいて公知の従来の方法を使用して投与され得る。
【０１６７】 （リボザイムを利用する方法） リボザイムは、リポソームへのカプセル化によるか、イオン電気泳動によるか
、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体接着
性ミクロスフェアへの組込みによるか、または上で議論した種々の他の方法のい
ずれかにより、細胞に投与され得る。リボザイムは、直接の注射によるか、また
はカテーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により、標的組織に送達され
得る。代替の送達経路としては、静脈内注射、筋内注射、皮下注射、エアロゾル
吸入、口腔（錠剤もしくは丸剤形態）、局所的、全身的、眼内、腹腔内および／
または鞘内の送達が挙げられる。
【０１６８】 好ましい実施形態において、リボザイムをコードする配列を、ＤＮＡ発現ベク
ターにクローン化する。このリボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐ
ｏｌ ＩＩＩ）プロモーターから駆動される。この発現ベクターは、ウイルスＤ
ＮＡベクター（例えば、上で議論したアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス
ベクター）を含む種々のベクターに組み込まれ得る。
【０１６９】 本発明の好ましい実施形態において、ＬＩＰＧ ＲＮＡを切断するリボザイム
を発現する転写単位が、アデノウイルスＤＮＡウイルスベクターに挿入される。
このベクターは、組換えウイルス粒子として送達され、そしてカテーテル、ステ
ントまたは注入ポンプの使用により、処置の部位に局所的に投与される。
【０１７０】 （アポリポタンパク質ＡＩの投与） 別の実施形態において、ＬＩＰＧポリペプチド活性のレベルを低下させるため
の、上に議論した方法のいずれかを、アポリポタンパク質ＡＩの投与または患者
においてアポリポタンパク質ＡＩを発現し得る発現系の投与と組み合わせて利用
し得る（例えば、米国特許第５，８６６，５５１号（これは、本明細書中に参考
として援用される）を参照のこと）。
【０１７１】 （ＬＩＰＧポリペプチド活性のレベルを増加させるための方法および組成物） ＬＩＰＧポリペプチドの発現または活性を増加させて、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ
コレステロールのレベルを低下させるための方法としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：ＬＩＰＧポリペプチドを含有する組成物の投与、ＬＩ
ＰＧポリペプチドをコードする発現ベクターを含有する組成物の投与、ＬＩＰＧ
ポリペプチドの酵素的活性を増強するエンハンサー分子を含有する組成物の投与
、およびＬＩＰＧ遺伝子の発現を増加させるエンハンサー分子の投与。
【０１７２】 （ＬＩＰＧポリペプチドを利用する方法） １つの実施形態において、ＬＩＰＧ活性のレベルを、ＬＩＰＧポリペプチドを
含有する組成物の投与により、増加する。この組成物は、従来の様式で（例えば
、経口、局所的、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内、または皮内の経路によ
り）投与され得る。この組成物は、直接投与され得るか、またはカプセル化（例
えば、脂質系内、アミノ酸ミクロスフェア内、もしくは球状デンドリマー内）さ
れ得る。このポリペプチドは、いくつかの場合において、血清アルブミンまたは
ポリビニルピロリドンのような別のポリマーに、付着され得る。
【０１７３】 （ＬＩＰＧを発現するベクターを利用する方法） 別の実施形態において、ＬＩＰＧのレベルを、遺伝子治療の使用により、すな
わち、ＬＩＰＧポリペプチドをコードし、そしてこれの発現を指向する核酸を含
む組成物の投与によって増加する。この実施形態において、ＬＩＰＧポリペプチ
ドは、適切な発現ベクターにクローニングされる。可能なベクター系およびプロ
モーターは、上で広範囲に議論される。この発現ベクターは、上で議論したベク
ター送達系の１つを用いて、標的組織に移入される。この移入は、核酸が実験室
において細胞に移入され、次いで改変された細胞がヒトまたは他の動物に投与さ
れる、エキソビボ手順において、あるいは核酸がヒトまたは他の動物内の細胞に
直接移入される、インビボ手順においてのいずれかで実施される。好ましい実施
形態において、アデノウイルスベクター系を使用して、この発現ベクターを送達
する。所望であれば、組織特異的プロモーターが、上で議論されたように、この
発現ベクターにおいて利用される。
【０１７４】 非ウイルス性ベクターを、当該分野で公知の任意の方法（リン酸カルシウム共
沈、リポフェクション（合成アニオン性およびカチオン性リポソーム）、レセプ
ター媒介性遺伝子送達、裸のＤＮＡの注入、エレクトロポレーション、および生
物弾道的（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）加速または粒子加速を含む）を使用して
、細胞に移入し得る。
【０１７５】 （ＬＩＰＧの酵素活性を増強するエンハンサー分子を使用する方法） 別の実施形態では、ＬＩＰＧの酵素活性を増加させるか、または細胞の結合部
位によるその適切な認識を増加させるエンハンサー分子によって、ＬＩＰＧの活
性を増強する。これらのエンハンサー分子は、ポリペプチドの投与について上記
で考察されたものと同じ方法によって導入され得る。
【０１７６】 （ＬＩＰＧ遺伝子発現を増加するエンハンサー分子を使用する方法） 別の実施形態では、転写、翻訳または翻訳後のレベルでＬＩＰＧ発現をアップ
レギュレートし得る低分子量化合物の使用を通して、ＬＩＰＧのレベルを増加さ
せる。これらの化合物は、ポリペプチドの投与について上記で考察されたものと
同じ方法によって投与され得る。
【０１７７】 （胆汁排出欠陥に関する処置方法） 肝内胆汁うっ滞は、血清のコレステロールおよびリン脂質レベルの増加によっ
て特徴付けられ得る。近年記載された、ラットにおけるファロイジン薬物誘導性
肝内胆汁うっ滞モデルによって、コレステロールおよびリン脂質の血清レベルに
おける有意な増加が実証された（Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｋ．、Ｋｉｎｂａｒａ，Ｓ
．、Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｎ．、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．、Ｈｉｒａｂａｙａｓｈ
ｉ，Ｎ．、Ｋａｓａｉ，Ｈ．およびＡｒａｋｉ，Ｔ．（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ９０、２９−３４）。本発明の産物を使用して、増加した
血清コレステロールおよび／またはリン脂質を有する患者における肝内胆汁うっ
滞を処置し得る。さらに、このラットモデルはまた、胆汁コレステロール排出率
において、かなりの低下を示した。本発明のＬＩＰＧポリペプチドおよび核酸産
物を使用して、胆汁排出系の欠陥を有する患者を処置し得る。
【０１７８】 肝内胆汁うっ滞はまた、肝臓からの胆汁の流動の欠損によって特徴付けられる
。近年、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣまたはバイラー病）および良性
再発性肝内胆汁うっ滞（ＢＲＩＣ）についての遺伝子座が、１８ｑ２１−ｑ２２
にマッピングされた（それぞれ、Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｖ．Ｅ．Ｈ．、Ｋｎｉｓｅｌ
ｙ，Ａ．Ｓ．、およびＦｒｅｉｍｅｒ，Ｎ．Ｂ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．
Ｇｅｎｅｔ．４、１０４９−１０５３、ならびにＨｏｕｗｅｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｂａ
ｈａｒｌｏｏ，Ｓ．、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ，Ｋ．、Ｒａｅｙｍａｅｋｅｒｓ
，Ｐ．、Ｊｕｙｎ，Ｊ．、Ｓａｎｄｋｕｉｊｌ，Ｌ．Ａ．およびＦｒｅｉｍｅｒ
，Ｎ．Ｂ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．８、３８０−３８６）。Ｌ
ＬＧ遺伝子は、１８ｑ２１でこの染色体領域内にマッピングされたので、本発明
のＬＬＧ遺伝子および産物を使用して、ＰＦＩＣ／ＢＲＩＣ疾患遺伝子の変異ま
たは発現欠損によって引き起こされる肝内胆汁うっ滞を有する患者を処置し得る
。
【０１７９】 別の実施形態では、本発明のＬＬＧ遺伝子またはポリペプチド産物を使用して
、１８ｑ２１−ｑ２２でのＰＦＩＣ／ＢＲＩＣ疾患遺伝子における欠損に起因し
ない肝内胆汁うっ滞を有する患者を処置し得る。近年の研究により、１８ｑ２１
−ｑ２２領域の外側に位置付けられる別の遺伝子座もまた、ＰＦＩＣ表現型を生
成し得ることが示唆された（Ｓｔｒａｕｔｎｉｅｋｓ，Ｓ．Ｓ．、Ｋａｇａｌｗ
ａｌｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｔａｎｎｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｒ．Ｍ．お
よびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３３、
８３３−８３６）。にもかかわらず、ＬＬＧポリペプチドの投与は、直接的また
は遺伝子送達を介してのいずれかで、この形態の状態を緩和し得る。
【０１８０】 （低ＨＤＬレベルへの素因を診断するための方法および組成物） ＬＩＰＧポリペプチドが、ＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａ
Ｉのレベルを低下させる能力を考慮し、身体内におけるＬＩＰＧポリペプチドの
レベルを使用して、個体が、低レベルのＨＤＬコレステロールおよびアポリポタ
ンパク質ＡＩへの素因を有するか否かを決定し得る。この方法では、組織サンプ
ルを患者から採取する。この組織は、血液、または実施例の節で考察されるよう
な、ＬＩＰＧを発現することが実証されている組織の１つであり得る。ＬＩＰＧ
のレベルの測定は、当業者に公知の種々の方法によって実施され得る。好ましい
実施形態では、ＬＩＰＧポリペプチドに対する抗体を使用して、組織サンプルに
おけるＬＩＰＧのレベルを測定し得る。
【０１８１】 （実施例） 以下の実施例は、本発明を例証する。この実施例は、例示としてのみであり、
本発明の範囲を制限しない。
【０１８２】 （実施例１−示差的に発現されたｃＤＮＡの同定） （ＲＮＡ調製） ヒト単球ＴＨＰ−１細胞（Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．、Ｋｒｏｈｎ，Ｒ．Ｉ．、Ｈ
ｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．、Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｆ．
Ｈ．Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ，Ｍ．Ｄ．、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｅ．Ｋ．、Ｇｏｅｋ
ｅ，Ｎ．Ｍ．、Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．およびＫｌｅｎｋ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６−８５）を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
１０％胎仔ウシ血清、１００ユニット／ｍｌナトリウムペニシリンＧおよび１０
０ユニット／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇ
ＩＢＣＯ）において培養した。細胞を、１．５×１０7細胞／プレートで、１５
ｃｍ組織培養ディッシュにプレーティングし、そして４０ｎｇ／ｍｌホルボール
１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ）で４８時間処理して、細胞
の分化を誘導した。ヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）をＣａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍから購入し、そして４℃にてＰＢＳに対して徹底的に透析した。次いで、ＬＤ
Ｌを５００μｇ／ｍｌに希釈し、そしてＰＢＳ中で３７℃にて１６時間、５μＭ
ＣｕＳＯ4に対して透析した。酸化を停止するために、ＬＤＬを１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＥＤＴＡに対して徹底的に透析し、次いで、濾過滅菌し
た。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Ｓｃｈｕｈ，Ｊ．Ｆａｉｒｃｈｌｏｕｇｈ
，Ｇ．Ｆ．、およびＨａｓｃｈｅｍｅｙｅｒ、Ｒ．Ｈ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５、３１７３−３１７７）（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）によって決定した。酸化の程度を、ＴＢＡＲＳ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ
，Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５、５３２−５３７）によ
って決定した。この酸化の程度は、２５〜３０ｎｍｏｌ ＭＤＡ当量／ｍｇタン
パク質であった。分化したＴＨＰ−１細胞を、１０％リポタンパク質欠損胎仔ウ
シ血清（Ｓｉｇｍａ）を有するＲＰＭＩ培地において、５０μｇ／ｍｌの酸化型
ＬＤＬまたはＮａＣｌ−ＥＤＴＡ緩衝液のいずれかに２４時間曝露した。ＲＮＡ
を収集するために、このプレートを１０ｍｌのＰＢＳでリンスし、次いで、１４
ｍｌのＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．およびＰａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．（１９９
２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７、９６７−９７１）（ＧＩＢＣＯ）を、各プレート
に添加した。この溶液を数回ピペッティングして混合し、次いで、類似のサンプ
ルを遠心チューブにプールし、そして１プレートあたり３ｍｌのクロロホルムを
添加し、そして混合した。このチューブを１２０００×ｇで１５分間遠心分離し
た。遠心分離後、上層を新しいチューブに移し、そして１プレートあたり７．５
ｍｌのイソプロパノールを添加し、そして混合した。このチューブを１２０００
×ｇで２０分間遠心分離した。このペレットを、氷冷７０％エタノールでリンス
し、そして室温で乾燥させた。このペレットを、５００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−
ＥＤＴＡ）中に懸濁し、そして２００ユニットのＲＮａｓｅフリーのＤＮＡｓｅ
Ｉおよび２００ユニットのＲＮａｓｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ＲＮａｓｅイ
ンヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃にて３０分間処理した。このＲＮＡを
、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４
：１）、およびクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）、次いでエタ
ノール沈殿による連続的抽出によって精製した。
【０１８３】 （ｃＤＮＡ合成） ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａ
ｙ Ｋｉｔバージョン１．０（Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）からのプロトコールを使用して、達成した。このシ
ステムは、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（Ｍｅａｄ，Ｄ．Ａ．、Ｐｅｙ，Ｎ．
Ｋ．、Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ，Ｃ．、Ｍａｒｃｉｌ，Ｒ．Ａ．およびＳｍｉｔｈ
，Ｌ．Ｍ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、６５７−６６３）
によってもともと記載された技術に基づく。リパーゼ様遺伝子の第１の情報を含
むｃＤＮＡフラグメントを生成したプライマー対は、下流プライマー７および上
流プライマー１５であった。増幅のためのｃＤＮＡを、緩衝液または酸化型ＬＤ
Ｌのいずれかに曝露されたＰＭＡ処理ＴＨＰ−１細胞に由来するＲＮＡを用いて
、以下の通りに合成した：３μｌの２５μＭ下流プライマー７および７．５μｌ
のジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水を、いずれかのＴＨＰ−１ Ｒ
ＮＡサンプルに由来する３００ｎｇ（３．０μｌ）のＲＮＡに添加した。これを
１０分間７０℃まで加熱し、次いで、氷上で冷却した。このチューブに、３μｌ
の５×ＰＣＲ緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ）（ＧＩＢＣＯ）、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、３μｌ ０．１
Ｍ ＤＴＴ、１．２μｌ ５００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．７μｌ ＲＮａｓｉｎ
、および５．６μｌ ＤＥＰＣ処理水を添加した。このチューブを室温で２分間
インキュベートし、その後、１．５μｌ（３００ユニット）のＳｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ）を添加した。このチ
ューブを、連続的に、室温で２分間、３７℃で６０分間、そして９５℃で５分間
インキュベートし、次いで、氷上で冷却した。ＰＣＲ増幅を、１１７μｌの１０
×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、７０
．２μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５．９μｌ α−33Ｐ ｄＡＴＰ（１０ｍ
Ｃｉ／ｍｌ、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）、４．７μｌ ５００μＭ ｄＮＴＰ混合
物、１１μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（５ユニット／μｌ、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）および４９３．３μｌ ＤＥＰＣ処理水を含むマス
ター混合物（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を使用して実施した。各反応について、１
２μｌのマスター混合物を、２μｌの下流プライマー＃７、１μｌのｃＤＮＡ、
および５μｌの上流プライマー＃１５に添加した。反応混合物を、１分間９４℃
まで加熱し、次いで、９４℃で１５秒間の変性工程、４０℃で１分間のアニーリ
ング工程、および７２℃で３０秒間の伸長工程により４０回熱サイクルした。４
０サイクル後、この反応物を７２℃で５分間インキュベートし、そして１０℃に
て保存した。ＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ Ｓｙ
ｓｔｅｍ ９６００サーモサイクラーにおいて実施した。
【０１８４】 ４μｌの増幅産物を、等量のローディング緩衝液（０．２％ブロモフェノール
ブルー、０．２％キシレンシアノール、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）およ
び２０％グリセロール）と混合した。この４μｌの混合物を、６％非変性アクリ
ルアミド配列決定様式ゲルにおいて、１２００ボルト（定電圧）で３時間泳動し
た。このゲルを、８０℃で１．５時間乾燥させ、そしてＫｏｄａｋ ＸＡＲフィ
ルムに露光した。酸化型ＬＤＬに曝露されたＴＨＰ−１細胞由来のｃＤＮＡを含
む反応物においてのみ見出される増幅産物を同定し、そしてゲルから切り出した
。１００μｌのＤＥＰＣ処理水を、切り出したゲル断片を含む微小遠心チューブ
に添加し、そして室温で３０分間、次いで９５℃で１５分間インキュベートした
。
【０１８５】 ＰＣＲ産物を増幅するために、２６．５μｌの溶出ＤＮＡを増幅反応に使用し
た。この増幅反応はまた、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３μｌの２５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、５μｌの５００μＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌの２μＭ下流プライマー７
、７．５μｌの上流プライマー１５、および０．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑポリ
メラーゼを含んだ。ＰＣＲサイクルのパラメーターおよび装置は、上記の通りで
あった。増幅後、２０μｌの再増幅物をアガロースゲルにおいて分析し、そして
４μｌを使用し、ＴＡクローニングシステム（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．、Ｄｕ
ｓｈ，Ｍ．Ｋ．、およびＭａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、８９９８−９００２）（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲＩＩにサブクローニングした。
１４℃での一晩の連結の後、連結生成物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し
た。生じた形質転換体を拾い、そして一晩の培養物３ｍｌを、プラスミドミニ調
製に使用した。挿入物サイズを、プラスミドのＥｃｏＲＩ消化物を用いて決定し
、そして本来のＰＣＲ産物の適切なサイズの挿入物を含むクローンを、蛍光色素
ターミネーター試薬（Ｐｒｉｓｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）お
よびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３ ＤＮＡシークエンサーを
使用して配列決定した。このＰＣＲ産物の配列を、図２に示す。増幅プライマー
の配列に下線を付す。
【０１８６】 （５’ＲＡＣＥ反応） ＲＴ−ＰＣＲを通して同定されたｃＤＮＡの伸長は、５’ＲＡＣＥシステム（
Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．、Ｅｌｉｏｔ，Ｊ．Ｆ．、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．、Ｌａｎｉｅｒ
，Ｌ．Ｌ．およびＤａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３、
２１７−２１９；Ｓｉｍｍｓ，Ｄ．、Ｇｕａｎ，Ｎ．、およびＳｉｔａｒａｍａ
ｎ，Ｋ．（１９９１）Ｆｏｃｕｓ １３、９９−１００）（ＧＩＢＣＯ）を使用
して達成した。ディファレンシャルディスプレイ反応において最初に使用された
１μｇのＴＨＰ−１ ＲＮＡ（酸化型ＬＤＬ処理）を、以下の５’ＲＡＣＥ手順
において利用した。
【０１８７】 １μｌ（１μｇ）のＲＮＡを、３μｌ（３ｐｍｏｌ）のプライマー２ａおよび
１１μｌのＤＥＰＣ処理水と合わせ、そして１０分間７０℃に加熱し、次いで氷
上に１分間置いた。２．５μｌの１０×反応緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ）、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、および２．５μｌの０．１Ｍ ＤＴＴを添加
した。この混合物を、４２℃で２分間インキュベートし、次いで１μｌのＳｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆逆転写酵素を添加した。この反応系を４２℃でさらに
３０分間、７０℃で１５分間、そして氷上で１分間インキュベートした。１μｌ
のＲＮａｓｅ Ｈ（２単位）を添加し、そしてこの混合物を５５℃で１０分間イ
ンキュベートした。ｃＤＮＡを、キットに含まれるＧｌａｓｓＭａｘカラム（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ
．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）を使用して精製した。
ｃＤＮＡをこのカラムから５０μｌのｄＨ2Ｏで溶出し、凍結乾燥し、そして２
１μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。ｃＤＮＡのテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）を、
以下の反応で達成した：７．５μｌのｄＨ2Ｏ、２．５μｌの反応緩衝液（２０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ）、１．５μｌの
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５μｌの２ｍＭ ｄＣＴＰ、および１０μｌのｃＤ
ＮＡを９４℃で３分間、次いで１分間氷上でインキュベートした。１μｌ（１０
単位）の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを添加し、そしてこの
混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。この酵素を、７０℃で１０分間
インキュベーションすることにより熱不活化し、そしてその混合物を氷上に置い
た。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、以下の工程で行った：５μｌのテーリングした（
ｔａｉｌｅｄ）ｃＤＮＡを、反応系に含めた。この反応系はまた、５μｌの１０
×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１μｌ
の１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、２μｌ（１０ｐｍｏｌ）アンカープライマー、１
μｌ（２０ｐｍｏｌ）のプライマー３ａ、および３５μｌのｄＨ2Ｏを含有する
。この反応系を１分間９５℃まで加熱し、次いで０．９μｌ（４．５単位）のＡ
ｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼを添加した。この反応系を、以下の条件下で４０回
循環させた：９４℃で５秒間、５０℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間。１
μｌのこの反応系を、続く単離のための特定の産物のレベルを増大させるために
、入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）再増幅で使用した。この再増幅は以下を含んだ：１
μｌの一次増幅物、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ
混合物、２μｌ（２０ｐｍｏｌ）のユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）増幅プ
ライマー、２μｌ（２０ｐｍｏｌ）のプライマー４ａ、および３８μｌのｄＨ2
Ｏ。この反応系を、１分間９５℃まで加熱し、次いで０．７μｌ（３．５単位）
のＡｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼを添加した。この反応系を以下の条件下で４０
回循環させた；９４℃で５秒間、５０℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間。
増幅産物を０．８％アガロースゲル電気泳動を介して分析した。約１．２キロ塩
基対の主な産物を検出した。２μｌの反応産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＲＩＩベクター中にクローニングし、そして１４
℃で一晩インキュベートした。この連結産物をＥ．ｃｏｌｉを形質転換するため
に使用した。生じた形質転換体の挿入サイズを、ＥｃｏＲＩ消化に従って決定し
た。およそのサイズのＰＣＲ産物のインサートを含むクローンを、蛍光色素−タ
ーミネーター試薬（Ｐｒｉｓｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およ
びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３ＤＮＡシーケンサーを使用し
て、配列決定した。ＴＡベクターからのＥｃｏＲＩ部位を含むＲＡＣＥ産物の配
列を、図３に示す。アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）（ユニバーサル増幅プラ
イマーおよび５’ＲＡＣＥプライマー４ａに対する相補体）に下線を付す。
【０１８８】 （実施例２−ＬＩＰＧ遺伝子のクローニングおよび染色体位置決定） （ｃＤＮＡライブラリースクリーニング） ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｏｌｉｇｏ ｄＴおよびランダムプライム（
ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ）、カタログ番号５０１４ｂ、ロット番号５２０３
３）をＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得た。放射性標識さ
れたプローブを、上記の５’ＲＡＣＥ反応ＰＣＲ産物を含有するプラスミドのイ
ンサートを切り出すことにより作製した。このプローブを、以下のようなランダ
ムプライミング技術を使用して放射標識した：ＤＮＡフラグメント（５０〜１０
０ｎｇ）を１μｇのランダムヘキサマー（Ｇｉｂｃｏ）とともに９５℃で１０分
間、次いで氷上で１分間インキュベートした。室温で以下を添加した：３μｌの
１０×Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、５７ｍＭジチオトレイトール；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）、３μｌの０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０
０μＣｉ α−32ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、および１μｌのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフ
ラグメント（５単位、Ｇｉｂｃｏ）。この反応系を２〜３時間室温でインキュベ
ートし、次いでこの反応を、ＴＥ ｐＨ８．０で容量を１００μｌにし、そして
ＥＤＴＡを最終濃度１ｍＭになるまで添加することにより終結させた。組込まれ
ていないヌクレオチドを反応系の容量を１００μｌに上昇させ、そしてＧ−５０
スピンカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を通すことにより除
去した。生じたプローブは、５×１０8ｃｐｍ／μｇ ＤＮＡより大きい特異的
な活性を有した。
【０１８９】 このライブラリーを、確立された方法（Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｇｉｌｍｏｒｅ
，Ｒ．およびＢｌｏｂｅｌ，Ｇ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３８，５−８）を使用
して調べた。簡単には、４．８×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３．６Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１× Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００×＝２
％Ｆｉｃｏｌｌ ４００、２％ポリビニルピロリドン、２％ＢＳＡ）、１０％硫
酸デキストラン、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および１
×１０6ｃｐｍ／ｍｌ放射標識プローブ中で、フィルターを６５℃で２４時間ハ
イブリダイズさせた。次いでフィルターを１５分間室温で２×ＳＳＣ（１×ＳＳ
Ｃ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム ｐＨ７．０）、０．
１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で３回洗浄し、次いで各々１５分間６５
℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回洗浄した。このプローブにハイブ
リダイズしたファージを、単離し、そして増幅した。ＤＮＡを増幅したファージ
から、ＬａｍｂｄａＳｏｒｂ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造者の使用
説明書に従って精製した。これらのインサートを、ファージＤＮＡから、Ｅｃｏ
ＲＩを用いる消化により切り出した。これらのインサートをプラスミドベクター
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部
位にサブクローニングした。このｃＤＮＡの２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメン
ト内に含まれるオープンリーディングフレームの配列を、上記のような自動化配
列決定により決定した。その配列を図４に示す。オープンリーディングフレーム
によりコードされる推定タンパク質のアミノ酸配列が、図５に示され、そしてＬ
ＬＧＸＬと呼ばれる。最初のメチオニンが、ヌクレオチド対２５２〜２５４によ
りコードされると推定される。推定タンパク質は、５００アミノ酸長である。最
初の１８アミノ酸は、分泌シグナルペプチド（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，およ
びＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３，２３７−２４４）に特徴
的な配列を形成する。プロペプチドは、５６，８００ダルトンの分子量を有する
と推定される。１８位におけるシグナルペプチドの切断を仮定すると、改変され
ていない成熟タンパク質は、５４，７２４ダルトンの分子量を有する。
【０１９０】 このタンパク質とトリアシルグリセロールリパーゼファミリーの他の公知のメ
ンバーとの間の全体的な類似性は、図６および表１に示される。図６に示される
整列において、ＬＩＰＧは、実施例１に記載されるｃＤＮＡ（配列番号５）によ
ってコードされるポリぺプチド（配列番号６）であり、本明細書の以下ではＬＬ
ＧＮといわれる。このタンパク質は、アミノ末端の３４５残基においてＬＬＧＸ
Ｌタンパク質と同一である。９つの独特な残基に、終止コドンが続き、３９．３
ｋＤのプロポリぺプチドおよび３７．３ｋＤの成熟タンパク質を産生する。ＬＬ
ＧＮおよびＬＬＧＸＬに共通の配列は、配列番号９の核酸配列および配列番号１
０のアミノ酸配列である。
【０１９１】 興味深いことに、ＬＬＧＮおよびＬＬＧＸＬタンパク質が分岐する位置は、他
のリパーゼの構造からのこれらのタンパク質のアミノドメインとカルボキシドメ
インとの間にある、公知である領域にある。従って、ＬＬＧＮタンパク質は、ト
リアシルグリセロールリパーゼの２つのドメインのうちの１つのみからなるよう
である。この配列は、位置１６７〜１７１における特徴的な「ＧＸＳＸＧ」リパ
ーゼモチーフならびにＳｅｒ１６９、Ａｓｐ１９３、およびＨｉｓ２７４におけ
る触媒性三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）残基の保存を含む。システ
イン残基（位置６４、７７、２５２、２７２、２９７、３０８、３１１、３１６
、４６３、および４８３）の保存は、他のリパーゼにおいてはジスルフィド結合
に関係しており、この保存は、ＬＬＧＸＬタンパク質が、他の酵素と構造的類似
性を有しているということを示唆する。Ｎ−連結グリコシル化についての５つの
推定部位が存在する；アミノ酸位置８０、１３６、３９３、４６９、および４９
１。比較に使用されるタンパク質配列は、以下である：ヒトリポタンパク質リパ
ーゼ（ＬＰＬ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１５８５６、配列番号１３）、ヒト肝
臓リパーゼ（ＨＬ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ０３５４０、配列番号１４）、ヒ
ト膵臓リパーゼ（ＰＬ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ９３２８５、配列番号１５）
、ヒト膵臓リパーゼ関連タンパク質−１（ＰＬＲＰ−１；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番
号Ｍ９３２８３）、およびヒト膵臓リパーゼ関連タンパク質−２（ＰＬＲＰ−２
；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ９３２８４）。 （表１．トリアシルグリセロールリパーゼ遺伝子ファミリーの類似性）
【０１９２】
【表１】 類似性パーセントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（Ｄｎａｓｔａｒ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムにお
けるＣｌｕｓｔａｌアルゴリズム（Ｃａｍｐｓ，Ｌ．，Ｒｅｉｎａ，Ｍ．，Ｌｌ
ｏｂｅｒａ，Ｍ．，Ｖｉｌａｒｏ，Ｓ．，およびＯｌｉｖｅｃｒｏｎａ，Ｔ．（
１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８，Ｃ６７３−Ｃ６８１）を使用し
た対をなす（ｐａｉｒｗｉｓｅ）整列に基づく。
【０１９３】 （染色体位置決定） ゲノムＬＬＧ ＤＮＡを含むＰ１クローン（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｒｕ
ｅｔｈｅｒ，Ｊ．およびＤｅＲｉｅｌ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓ
ｔ ２：１５１−６２，１９９０）由来のＤＮＡを、ジゴキシゲニンＵＴＰでニ
ックトランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により標識した
。標識化プローブを剪断したヒトＤＮＡと合わせ、そして５０％ホルムアミド、
１０％硫酸デキストラン、および２×ＳＳＣを含有する溶液中で、雄性ドナー由
来のＰＨＡ刺激末梢血液リンパ球にハイブリダイズさせた。特異的ハイブリダイ
ゼーションシグナルを、このハイブリダイズした細胞をフルオレセイン化抗ジゴ
キシゲニン抗体中でインキュベートし、次いでＤＡＰＩで対比染色することによ
り検出した。この最初の実験は、Ｅ群染色体の特異的標識化を生じ、このＥ群染
色体は、ＤＡＰＩ染色に基づいて第１８染色体にあると考えられた。
【０１９４】 第２の実験を行い、この実験において、第１８染色体のセントロメアに特異的
なビオチン標識化プローブを、ＬＬＧプローブと同時ハイブリダイズ（ｃｏｈｙ
ｂｒｉｄｉｚｅ）させた。この実験は、赤色の第１８染色体および緑色の第１８
染色体の長腕という特異的標識化を生じた。１１の特異的に標識されたハイブリ
ダイズされた第１８染色体の測定は、ＬＬＧが、０．６７のフィルター（Ｆｌｔ
ｅｒ）（０．３８のＦｒａｎｋｅ測定）を有するということを実証し、これは、
１８ｑ２１のバンドに対応する。いくつかの遺伝的疾患（肝臓内胆汁うっ滞、錐
杆体（ｃｏｎｅ ｒｏｄ）ジストロフィー、および家族性拡大性骨溶解を含む）
は、この染色体領域における欠損を含むと考えられる。
【０１９５】 （実施例３−ＬＩＰＧ ＲＮＡ分析） （ＴＨＰ−１細胞におけるＬＩＰＧ ＲＮＡの発現） ｃＤＮＡが由来するｍＲＮＡの分析を、ＴＨＰ−１ ＲＮＡのノーザン分析に
より行った。これらの細胞由来のＲＮＡを、上記のように調製した。このｍＲＮ
Ａをポリ−ｄＴ−磁気ビーズ系（Ｐｏｌｙａｔｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）の使用により、全体のＲＮＡから精製した。３μｇのポリ（Ａ）含
有ｍＲＮＡを、１％アガロース−ホルムアミドゲル上で電気泳動した．このゲル
を、３０分間ｄＨ2Ｏ中で洗浄した。ＲＮＡを、アルカリトランスファー緩衝液
（３Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＮａＯＨ、２ｍＭ サルコシル）を使用してナイロ
ン膜に真空トランスファーした。トランスファーした後、ブロットを、２００ｍ
Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ６．８中で５分間インキュベーションすることにより
中和した。このＲＮＡを、紫外線架橋装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して
膜に架橋させた。
【０１９６】 上記の５’ＲＡＣＥ反応ＰＣＲ産物を含むプラスミドのインサートを切り出す
ことにより、プローブを作製した。このプローブを、実施例２に記載のランダム
プライミング技術を使用して放射標識した。
【０１９７】 フィルターを、ＱｕｉｋＨｙｂ高速ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）中で３０分間６５℃で前ハイブリダイズした。放射標識プローブ（
１〜２×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）および超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（最終濃度
１００μｇ／ｍｌ）を、９５℃に１０分間加熱することにより変性し、そしてＱ
ｕｉｋＨｙｂ中のフィルターに添加する前に、氷上で急速冷却した。ハイブリダ
イゼーションは、６５℃で３時間であった。フィルターを１５分間２×ＳＳＣ、
０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで室温で２回洗浄し、次いで６２℃で１５分間
０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄することにより、ハイブリダイズし
ていないプローブを、除去した。洗浄に続いて、これらのフィルターを簡単に乾
燥させ、次いで−８０℃で増感スクリーンを有するＫｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィ
ルムに曝露した。結果を図７に示す。この図は、約４．５キロベースの主要なｍ
ＲＮＡ種を示す。４．３および１．６キロベースの少量の種も存在する。ＬＬＧ
Ｎ ｃＤＮＡの予測されたサイズは、１．６ｋｂである。ＬＬＧＸＬ配列は、検
出されたｍＲＮＡの主要な種によりコードされるようである。
【０１９８】 （種々のヒト組織におけるＬＩＰＧ ＲＮＡの発現） ヒト組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓）由来のｍ
ＲＮＡを各々３μｇ含む、商業的に調製されたフィルターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
（カタログ＃７７６０−１）から購入した。このフィルターを、上記のようにプ
ローブし、そして処理した。放射標識したＬＬＧフラグメントおよびオートラジ
オグラフィーを用いてプローブした後、プローブを、６５℃のインキュベーター
中で、沸騰している０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２×１５分間洗浄するこ
とにより、ストリップした。次いで、この膜を、ヒトリポタンパク質リパーゼを
コードする、１．４キロベース対ＤＮＡフラグメントでプローブした。このフラ
グメントは、図１に記載される５’ＬＰＬおよび３’ＬＰＬプライマーおよび上
記のＲＴ−ＰＣＲ条件を用いる、ＴＨＰ−１ ＲＮＡ（ＰＭＡおよびｏｘＬＤＬ
処理）のＲＴ−ＰＣＲにより得られた。オートラジオグラフィーの後、この膜を
再びストリップし、そしてヒトβアクチンｃＤＮＡの放射標識したフラグメント
を用いて再プローブして、ＲＮＡ含量について規格化した。これらの分析の結果
は、図８に示される。ＬＩＰＧメッセージの最も高いレベルは、胎盤ＲＮＡにお
いて検出され、最も低いレベルは、肺組織、肝臓組織、および腎臓組織由来のＲ
ＮＡ中に見出された。他者による先の研究（Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ａ．Ｊ．Ｍ．
，Ｊａｎｓｅｎ，Ｈ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１２１１，１２１−１２４）に従って、リポタンパク質リパーゼメッセージは
、多くの組織において見出され、心臓組織および骨格筋組織において最も高いレ
ベルで見出された。この分析の結果は、ＬＩＰＧ発現の組織分布は、ＬＰＬ発現
の組織分布と非常に異なることを示す。ＬＩＰＧ発現のパターンもまた、他者（
Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｓ．およびＨａｒｔｓｕｃｋ，Ｊ．Ａ．（１９９３）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１６６，１−１９；Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉ
ｃｈ，Ｃ．Ｆ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．−Ｗ．，Ｗｉｍｓ，Ｍ．，Ｌｕｏ，Ｃ．−Ｃ，
Ｌｉ，Ｗ．−Ｈ．およびＣｈａｎ，Ｌ．（１９８９）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．
３０，４２３−４３１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｅｒｌａｖａｇｅ，Ａ．Ｒ．
，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｃ．およびＶｅｎｔｅｒ，Ｃ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔ．４，２５６−２６５）によって報告されたように肝臓リパーゼまたは
膵臓リパーゼのいずれかの発現パターンと異なる。
【０１９９】 さらなるヒト組織における発現パターンを決定するために、別の商業的に調製
された膜を、ＬＬＧＸＬ ｃＤＮＡでプローブした。このドットブロット（ヒト
ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｂｌｏｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ＃７７７０−１）
は、５０の異なる組織由来の１００〜５００ｎｇのｍＲＮＡを含み、そして等価
なハウスキーピング遺伝子発現について規格化されている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．およ
びＭｏｒｉｎ，Ｒ．（１９７１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
２３１，１９４−１９７）。ＬＬＧＸＬ ｃＤＮＡの１．６ｋｂのＤｒａＩ−Ｓ
ｒｆＩフラグメントを、ランダムオリゴヌクレオチドプライミングシステム（Ｐ
ｒｉｍｅ Ｉｔ ＩＩ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造者の指示に従っ
て、32ＰｄＣＴＰで標識した。６５℃での３０分間のプレハイブリダイゼーショ
ンの後、プローブを、１．３×１０6ｃｐｍ／ｍｌのＱｕｉｋＨｙｂハイブリダ
イゼーション溶液に加えた。ハイブリダイゼーションは、６５℃で２時間であっ
た。フィルターを、室温で２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、続い
て６２℃で、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間２回、洗浄すること
により、ハイブリダイズしていないプローブを除去した。洗浄後、フィルターを
簡単に乾燥させ、次いで増感紙を用いて、−８０℃で、様々な時間で、Ｋｏｄａ
ｋ ＸＡＲ−２フィルムに曝露した。得られた画像は、デンシトメトリーによっ
て定量化した。結果を表２に示す。複数の組織ノーザンブロットおよび複数の組
織ドットブロットの両方において提示された、組織の相対的な発現レベルは類似
しており、胎盤において最も高いレベルであり、そして肺、肝臓および腎臓にお
いてより低いレベルである。胎児肝臓、腎臓、および肺もまた、成体組織とほぼ
同様のレベルで発現する。驚くべきことに、甲状腺組織発現レベルは、提示され
たすべての組織の中で最も高く、胎盤組織における発現の１２２％の発現であっ
た。胎盤によるリパーゼ発現についての先例が存在する（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｊ
．Ｅ．，Ｅｌｐｈｉｃｋ，Ｍ．Ｃ．（１９８２）Ｊ．Ｄｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
４，１５３−１５９；Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ａ．Ｊ．Ｍ．，Ｃａｒｌｉｎｇ，Ｄ
．およびＪａｎｓｅｎ，Ｈ．（１９９４）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５，９６
６−９７５；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｂ．Ｋ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈ．Ｗ．（１９８０）
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６１８，４４９−４６０）が、甲
状腺は、いかなるリパーゼも発現することは以前に知られていなかった。これら
の結果は、ＬＩＰＧ発現が、胎盤の維持に関与し得ることを示唆するが、ＬＩＰ
Ｇは、基質（例えば、リン脂質）からエネルギー源として遊離脂肪酸を遊離させ
るために役立ち得る。甲状腺において発現されたＬＩＰＧは、甲状腺による生理
活性分子の合成のための前駆体を提供し得る。
【０２００】
【表２】 与えられた値は、任意に１００％に設定した胎盤組織におけるレベルに対する、
発現のパーセンテージである。値は、２つのオートラジオグラフ曝露からのデン
シトメトリー測定の平均である。Ｎ．Ｄ．＝検出不可能。
【０２０１】 （培養内皮細胞におけるＬＩＰＧ ＲＮＡの発現） ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ
）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから購入した。ＨＵＶＥＣを、３ｍｇ／ｍｌウシ脳抽
出物を補充した商業的に調製された内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｓ）中で増殖させ（Ｍａｃｉａｇ，Ｔ．，Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｊ．，Ｉｌｓ
ｌｅｙ，Ｓ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．およびＦｏｒａｎｄ，Ｒ．（１９７９）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５６７４−５６７８、
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、一方ＨＣＡＥＣを、３ｍｇ／ｍｌウシ脳抽出物および３
％ウシ胎児血清（５％最終濃度）を補充したＥＧＭ中で増殖させた。細胞を、コ
ンフルエンとになるまで増殖させ、次いで培地をウシ脳抽出物なしのＥＧＭに交
換した。培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステート（Ｓｉｇｍａ）
を加えることによって刺激した。２４時間のインキュベーションの後、上記のＴ
ｒｉｚｏｌ法を介して、ＲＮＡを細胞から抽出した。２０マイクログラムの全Ｒ
ＮＡを電気泳動し、分析のための膜に移した。この膜を、上記のようにＬＩＰＧ
およびＬＰＬプローブでプローブした。結果を図９に示す。ＰＭＡで刺激された
ＴＨＰ−１細胞由来の２０マイクログラムの全ＲＮＡを、比較のためにブロット
を行った。ＬＩＰＧプローブにハイブリダイズするＲＮＡを、刺激していないＨ
ＵＶＥＣ細胞およびＰＭＡ刺激したＨＵＶＥＣ細胞において検出した。対照的に
、検出可能なレベルのＬＩＰＧ ｍＲＮＡは、ＰＭＡでの刺激後のＨＣＡＥＣ培
養物においてのみ見出された。他者の先の研究に従って、いかなる内皮ＲＮＡに
おいても、検出可能なリポタンパク質リパーゼｍＲＮＡは検出されなかった（Ｖ
ｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ａ．Ｊ．Ｍ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｈ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２１１，１２１−１２４）。
【０２０２】 （実施例４−ＬＩＰＧタンパク質分析） （抗体の調製） 抗血清を、ＬＩＰＧ ｃＤＮＡオープンリーディングフレームによりコードさ
れる推定タンパク質の領域に対応する配列を有するペプチドに対して産生させた
。このペプチドは、その高い推定抗原性指標（Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｂ．Ａ．および
Ｗｏｌｆ，Ｈ．（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌｉｃ．ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ４，１８１−１８６）のため、選択した。免疫ペプチドの
配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのいかなるタンパク質においても、翻訳さ
れたＤＮＡ配列においても、見出されなかった。ＬＩＰＧタンパク質におけるそ
の対応する位置を、図１０に示す。このペプチドのカルボキシ末端システインは
、ＬＩＰＧ推定タンパク質における残基と一致しなかったが、キャリアタンパク
質との結合を容易にするために導入された。このペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａペプチド合成機で合成した。２ミ
リグラムのペプチドを、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅ
ｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に含
まれるプロトコルに従って、２ミリグラムのマレイミド活性化キーホールリンペ
ットヘモシアニンに結合させた。脱塩後、２分の１の結合体を、等容積のＦｒｅ
ｕｎｄ’ｓ完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて乳化した。この乳化物を
、ニュージーランド白ウサギに注射した。最初の接種の４週間後、Ｆｒｅｕｎｄ
’ｓ不完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたこと以外は、正確に上記のと
おり作製した乳化物を用いて、追加免疫接種を行った。追加免疫の２週間後、試
験採血を行い、固定化ペプチドを用いるＥＬＩＳＡを介して特異的抗体の力価を
決定した。最初の追加免疫の１ヶ月後、次の追加免疫を行った。
【０２０３】 （内皮細胞培養物由来の培地のウエスタン分析） ＨＵＶＥＣおよびＨＣＥＡＣ細胞を、ＰＭＡで４８時間刺激したこと以外は、
実施例３Ｃに記載されているように培養し、そしてＰＭＡで刺激した。馴化培地
のサンプル（９ｍｌ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、１５０ｍＭ 塩化
ナトリウム、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中のヘパリン−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂの５０％スラリー（５００μｌ）とインキュベートした。ヘ
パリン−セファロースを、ＬＰＬのヘパリン結合活性に対する臨界として同定さ
れているＬＬＧＸＬ配列中の残基の保存のため（Ｍａ，Ｙ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏ
ｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｌｉｕ，Ｍ．−Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｆｏｒｓｙｔｈｅ，Ｉ
．Ｊ．，Ｃｌａｒｋｅ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．，Ｈａｙｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＢｒ
ｕｎｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ． Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５，２０４９−２０５９
；および図６）、ＬＩＰＧタンパク質を部分的に精製し、そして濃縮するために
選択した。４℃で１時間の回転後、このサンプルを１５０×ｇで５分間遠心分離
した。培地を吸引し、セファロースを１４ｍｌのＰＢＳで洗浄した。遠心分離お
よび吸引後、ペレット化したヘパリン−セファロースを、２００μｌの２×ＳＤ
Ｓローディング緩衝液（４％ ＳＤＳ、２０％ グリセロール、２％ β−メル
カプトエタノール、０．００２％ ブロムフェノールブルー、および１２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８）中に懸濁させた。このサンプルを、９５℃まで５分間
加熱し、そして４０μｌを１０％ Ｔｒｉｓ−グリシン ＳＤＳゲル上にロード
した。１４０Ｖで約９０分間の電気泳動後、このタンパク質を、Ｎｏｖｅｘエレ
クトロブロッティング装置（２１０Ｖ、１時間）を介して、ニトロセルロース膜
に移した。この膜を、ブロッキング緩衝液（５％ 脱脂粉乳、０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２）中
で３０分間ブロック化した。抗ペプチド抗血清および正常なウサギ血清を、ブロ
ッキング緩衝液中で１：５０００に希釈し、そして穏やかに攪拌しながら、この
膜と４℃で終夜でインキュベートした。次いで、この膜をＴＢＳＴ（０．１％
Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
７．２）で４×１５分間洗浄した。ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ結合体化抗血
清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をブロッキング緩衝液中で１：
５０００に希釈し、そして攪拌しながら、１時間この膜とともにインキュベート
した。膜を上記のように洗浄し、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ化学発光試薬（ＤｕＰ
ｏｎｔ ＮＥＮ）と反応させ、そしてＫｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルムに曝露し
た。結果を図１１に示す。免疫反応性タンパク質の２つの種は、刺激していない
ＨＵＶＥＣ細胞およびＨＣＡＥＣ細胞由来のサンプル中に存在する。刺激してい
ないＨＣＡＥＣサンプル中の免疫反応性タンパク質のレベルは、対応するＨＵＶ
ＥＣサンプルよりもかなり低い。ＰＭＡでの刺激の際に、３つの免疫反応性タン
パク質が内皮細胞培養物によって分泌される。ＰＭＡ曝露は、ＨＣＡＥＣ培養物
によって産生されるＬＩＰＧタンパク質のレベルを大いに増加させた。ＬＬＧタ
ンパク質のＰＭＡ誘導は、ＨＵＶＥＣ培養物においてはそれ程劇的ではなかった
。
【０２０４】 （実施例５−組換えＬＩＰＧタンパク質産生） （ＬＩＰＧ発現構築物） ＬＬＧＮおよびＬＬＧＸＬタンパク質をコードするｃＤＮＡを、哺乳動物発現
ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。このベクタ
ーは、サイトメガロウイルス主要後期プロモーターの使用を通して、多くの哺乳
動物細胞中で外来遺伝子の発現を可能にした。ＬＬＧＮ ５’ＲＡＣＥ産物を、
ｐＣＤＮＡ３のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ＬＬＧＸＬ ｃＤＮＡを、Ｄ
ｒａＩおよびＳｒｆＩを用いて消化し、１．５５ｋｂのｃＤＮＡを得た（図４を
参照のこと）。このベクターを、制限酵素（ＥｃｏＲＶ）で消化し、そしてベク
ターおよび挿入物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）からの試薬を用いて、
製造者の指示に従って連結した。連結生成物を使用して、コンピテントなＥ．ｃ
ｏｌｉを形質転換した。得られたコロニーを、制限分析によってスクリーニング
し、そして発現ベクター中の挿入物の存在および配向について配列決定した。
【０２０５】 （ＣＯＳ−７細胞におけるＬＩＰＧの一過性トランスフェクション） ＬＩＰＧ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎカチオン性脂質試薬（Ｇ
ＩＢＣＯ）の使用を介して、ＣＯＳ−７細胞に導入した。トランスフェクション
の２４時間前に、ＣＯＳ−７細胞を６０ｍｍの組織培養皿に、２×１０5細胞／
プレートの密度でプレートした。この細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／
ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂ
ｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）にて増殖させた。１マイ
クログラムのプラスミドＤＮＡを、３００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉ無血清培地
（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。１０マイクロリットルのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
試薬を、３００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉ培地に希釈し、そしてこれをこのＤＮ
Ａ溶液と合わせ、そして３０分間室温に放置した。この培地をプレートから除去
し、そして細胞を２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地でリンスした。このＤＮＡ−Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ溶液を、２．７ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共にプレート
に添加し、そしてこのプレートを３７℃で５時間インキュベートした。インキュ
ベートした後、無血清培地を除去し、２％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＤＥ
ＭＥで置換した。トランスフェクションの１２時間後に、培養物のうちのいくら
かを、０．２５ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）（プロテアーゼインヒビター）、または１０Ｕ／ｍｌのヘパリンの
いずれかで処理した。収集の３０分前に、ヘパリン処理サンプルを、さらに４０
Ｕ／ｍｌのへパリンで処理した。トランスフェクションの６０時間後に、細胞か
ら培地を除去した。ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ｐＨ７．２の
ＰＢＳ中の５０％スラリー２００μｌ）を、１ｍｌの培地に添加し、そして４℃
で１時間混合した。このＳｅｐｈａｒｏｓｅを、低速遠心分離によってペレット
化し、そして１ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄した。このＳｅｐｈａｒｏｓｅをペレ
ット化し、そして１００μｌの２×ローディング緩衝液中に懸濁した。このサン
プルを、９５℃まで５分間加熱した。４０μｌの各サンプルを、１０％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルにロードした。上記のような抗ＬＩＰＧ抗血清を使用して、電気泳
動およびウエスタンブロットを行った。結果を図１２に示す。ＨＣＡＥＣ馴化培
地からのタンパク質を、サイズ基準のために含ませた。ＬＬＧＮは、約４０ｋＤ
で移動し、ＨＣＡＥＣにおける最も下のバンドと一致する。ＬＬＧＸＬ ｃＤＮ
ＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地は、６８ｋＤおよび４０ｋＤ
の両方の種を含む。これらの細胞をヘパリンで処理した場合、培地から回収した
６８ｋＤおよび４０ｋＤの両方のタンパク質の量は、劇的に増加した。これは細
胞表面からのプロテオグリカン結合タンパク質の放出、またはヘパリンによるタ
ンパク質の安定化のいずれかを示す。この細胞をプロテアーゼインヒビターのＰ
ｅｆａｂｌｏｃで処理した場合、６８ｋＤのタンパク質の量は、４０ｋＤ種の量
に対して増加した。このことは、これらの細胞から産生される低分子量である方
のタンパク質が、より大きな６８ｋＤ形態のタンパク質分解産物であることを示
唆する。ディファレンシャルディスプレイを介して同定された、より短い４０ｋ
Ｄ種をコードするｍＲＮＡの役割は、未知である。しかし、肝リパーゼの選択的
にスプライスされた形態の報告が存在し、この形態は明らかに組織特異的様式で
発現され、そして切断タンパク質を生成する。
【０２０６】 （実施例６ 動物種におけるＬＩＰＧ） （ＬＩＰＧのウサギホモログのクローニング） ウサギ肺組織由来の市販のλｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ，Ｃａ
ｔ．＃ＴＬ１０１０ｂ）を、ＬＩＰＧ遺伝子のウサギホモログのフラグメントを
単離するために使用した。５マイクロリットルのストックライブラリーを、４５
μｌの水に添加し、そして９５℃まで１０分間加熱した。以下を、最終体積１０
０μｌで添加した：２００μＭのｄＮＴＰｓ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．４、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、各１００μＭのプライ
マーＤＬＩＰ７７４およびＬＬＧｇｅｎ２ａ、ならびに２．５ＵのＴａｑポリメ
ラーゼ（ＧＩＢＣＯ）。この反応を、以下のパラメータで３５回熱サイクルさせ
た：９４℃で１５秒、５０℃で２０秒、７２℃で３０秒。この反応物の１０マイ
クロリットルを、アガロースゲル電気泳動を介して分析した。約３００塩基対の
産物を検出した。この反応混合物の部分（４μｌ）を、ＴＡクローニング系を介
する産物のクローニングのために使用した。得られたクローンのインサートを配
列決定した（配列番号１１）。推定ウサギアミノ酸配列（配列番号１２）と対応
するヒトｃＤＮＡの配列との間のアライメントもまた、図１４に示す。いずれの
増幅プライマーの部分でもないヌクレオチドについて、ウサギとヒトのＬＬＧ配
列の間に８５．８％の同一性がある。このウサギｃＤＮＡによってコードされる
推定タンパク質は、ヒトタンパク質と９４．６％の同一性を共有し、ヌクレオチ
ド置換のほとんどがコドンの３番目の位置または「ゆらぎ」位置である。特に、
この領域は、推定ＬＬＧタンパク質の「リド（ｌｉｄ）」配列にまたがり、そし
てリパーゼ遺伝子ファミリーの可変ドメインである。これは、種間でのこの遺伝
子の高度な保存が存在するという証拠である。
【０２０７】 （他の種におけるＬＩＰＧ） 他の種におけるＬＬＧ遺伝子の存在を実証するために、種々の種由来のゲノム
ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで制限消化し、アガロースゲル中の電気泳動によって分離
し、そしてニトロセルロース膜にブロットした。
【０２０８】 この膜を、６Ｘ ＳＳＣ、１０％の硫酸デキストラン、５×Ｄｅｎｄａｒｄｔ
溶液、１％ＳＤＳ、および５μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーシ
ョン溶液において、２．５×１０6ｃｐｍ／ｍｌのランダムプライムされた32Ｐ
−ＬＬＧまたは32Ｐ−ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）プローブで、６５℃で
一晩ハイブリダイズした。この膜を０．１Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１０分
間室温で洗浄し、次いで連続的に４０℃、５０℃、および５５℃で１０分間洗浄
した。このブロットのオートラジオグラムを図１６に示す。
【０２０９】 図１６は、ラットＤＮＡに対してＬＬＧプローブでのハイブリダイゼーション
が観察されなかったことを除いて、試験した全ての種におけるＬＬＧ遺伝子およ
びＬＰＬ遺伝子の存在を示す。ラットからの例外的データは、ＬＬＧ配列を含む
異常なサイズの制限フラグメントの生成により生じる人工産物を示し得る。この
ようなフラグメントは、アガロースゲルの分画範囲の外側であり得るか、または
非能率的にブロットし得る。この２つのプローブによって検出される異なるバン
ドは、ＬＰＬおよびＬＩＰＧが、別個の進化的に保存された遺伝子であることを
示す。
【０２１０】 （実施例７ ＬＬＧＸＬの酵素活性） （ホスホリパーゼ活性） ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ＬＬＧＮ、またはＬＬＧＸＬを一過
性発現するＣＯＳ−７からの馴化培地を、ホスホリパーゼ活性についてアッセイ
した。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ（ＭＥＭ）をブランクとして使用し、そしてアン
チセンスＬＬＧＸＬプラスミド（ＡＳ）でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞
からの馴化培地を、陰性コントロールとして使用した。
【０２１１】 ホスファチジルコリン（ＰＣ）エマルジョンを、１０μｌのホスファチジルコ
リン（１０ｍＭ）、４０μｌのｓｎの１位または２位で標識した14Ｃ−ホスファ
チジルコリン（ジパルミトイル）（２μＣｉ）、および１００μｌのＴｒｉｓ−
ＴＣＮＢ（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＴｒｉｔｏｎ、５ｍＭのＣａＣｌ2、
２００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ）を使用して作製した。このエマルジ
ョンを、１０分間エバポレートし、次いでＴｒｉｓ−ＴＣＮＢ中で最終体積を１
ｍｌにした。
【０２１２】 反応を２連で実施し、そして５０μｌのＰＣエマルジョンおよび９５０μｌの
培地を含有させた。サンプルを、振盪水浴中で、３７℃で２〜４時間インキュベ
ートした。この反応を、１ＮのＨＣｌを１ｍｌ添加して停止させ、次いで４ｍｌ
の２−プロパノール：ヘキサン（１：１）で抽出した。上側の１．８ｍｌのヘキ
サン層をシリカゲルカラムに通し、そしてフロースルーフラクション中に含まれ
る遊離した14Ｃ−遊離脂肪酸を、シンチレーションカウンターで定量化した。こ
れらのアッセイの結果を図１４に示す。
【０２１３】 （トリアシルグリセロールリパーゼ活性） ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ＬＬＧＮ、またはＬＬＧＸＬを一過
性発現するＣＯＳ−７からの馴化培地を、トリグリセロールリパーゼ活性につい
てアッセイした。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭをブランクとして使用し、そしてアン
チセンスＬＬＧＸＬプラスミド（ＡＳ）でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞
からの馴化培地を、陰性コントロールとして使用した。
【０２１４】 標識トリオレイン、［９，１０−3Ｈ（Ｎ）］および非標識トリオレインの無
水エマルジョン（最終総トリオレイン＝１５０ｍｇおよび６．２５×１０8ｃｐ
ｍ）として、濃縮基質を調製し、これを１００％グリセロール中の９ｍｇのレシ
チンの添加によって安定化した。０．５６ｍｌの3Ｈ−トリオレイン（０．２８
ｍＣｉ）を、０．１７ｍｌの非標識トリオレインおよび９０μｌのレシチン（９
ｍｇ）と混合した。この混合物を、窒素流下でエバポレートした。乾燥した脂質
混合物を、２．５ｍｌの１００％グリセロール中でソニケーションすることによ
って乳化した（パルスレベル２で３０秒に続いて２秒間の冷却のサイクルを、５
分間）。
【０２１５】 アッセイ基質を、１容量の濃縮基質を、３％ｗ／ｖの脂肪酸除去ウシ血清アル
ブミンを含む４容量の０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈
することによって調製した。希釈基質を、５秒間激しくボルテックスした。
【０２１６】 反応を、０．１ｍｌのアッセイ基質および０．１ｍｌの指示馴化培地を含む総
容量０．２ｍｌで２連で実施した。この反応物を、３７℃で９０分間インキュベ
ートした。この反応を、３．２５ｍｌのメタノール−クロロホルム−ヘプタン
１．４１：１．２５：１（ｖ／ｖ／ｖ）、続いて１．０５ｍｌの０．１Ｍ炭酸カ
リウム−ボレート緩衝液（ｐＨ１０．５）の添加によって停止した。１５秒間激
しく混合した後、このサンプルを５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上側の
水相の１．０ｍｌのアリコートを、シンチレーションカウンターで計測した。こ
れらのアッセイの結果を図１５に示す。
【０２１７】 （実施例８ エンハンサーまたはインヒビターについてのスクリーニングのた
めのＬＩＰＧポリペプチドの使用） 組換えＬＩＰＧを、バキュロウイルス感染昆虫細胞または安定にトランスフェ
クトされたＣＨＯ細胞、あるいは他の条件の合った哺乳動物宿主細胞において産
生した。組換えＬＩＰＧを、血清含有馴化培地または無血清馴化培地から、ヘパ
リン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でのクロマトグラフィー、続いてカチオン交換樹脂
上でのクロマトグラフィーにより精製した。必要な場合、第三のクロマトグラフ
工程またはさらなるクロマトグラフ工程（例えば、分子ふるい）を、ＬＩＰＧの
精製において使用する。精製の間、抗ペプチド抗体を、ＬＩＰＧタンパク質をモ
ニターするために使用し、そしてホスホリパーゼアッセイを、ＬＩＰＧ活性を追
跡するために使用する。
【０２１８】 蛍光アッセイにおいて、最終アッセイ条件は、約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ2、５μＭのＣ6ＮＢＤ
−ＰＣ｛１−アシル−２−［６−（ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール
−４−イル）アミノ］カプロイルホスファチジルコリン｝、およびＬＩＰＧタン
パク質（約１〜１００ｎｇ）である。この反応物を４７０ｎｍでの蛍光励起に供
し、そして５４０ｎｍでの蛍光発光により測定される酵素活性を、連続的にモニ
ターする。ＬＩＰＧ活性の刺激および／または阻害について試験される化合物お
よび／または基質を、ジメチルスルホキシド中の１０〜２００ｍＭ溶液として添
加する。ＬＩＰＧ活性を刺激または阻害する化合物を、５４０ｎｍでの蛍光発光
の増加または低下の発生として同定する。
【０２１９】 チオアッセイにおいて、最終アッセイ条件は、約２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ2、４．２４ｍＭの
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５ｍＭの１，２−ビス（ヘキサノイルチオ）−
１，２−ジデオキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、５ｍＭの４，４
’−ジチオビスピリジン（エタノール中の５０ｍＭストック溶液から）、および
１〜１００ｎｇの組換えＬＩＰＧである。ホスホリパーゼ活性を、３４２ｎｍで
の吸収の増加を測定することで決定する。ＬＩＰＧ活性の刺激および／または阻
害について試験される化合物および／または基質を、ジメチルスルホキシド中の
１０〜２００ｍＭ溶液として添加する。ＬＩＰＧ活性を刺激または阻害する化合
物を、３４２ｎｍでの吸収の増加または低下の発生として同定する。
【０２２０】 （実施例９ ヒトＬＩＰＧを発現するトランスジェニックマウス） ＬＩＰＧの生理的役割のさらなる研究のために、ヒトＬＩＰＧを発現するトラ
ンスジェニックマウスを作製する。
【０２２１】 ＬＬＧＸＬをコードする１．５３ｋｂのＤｒａＩ／ＳｒｆＩ制限フラグメント
（図４を参照のこと）を、遍在的に発現された３−ヒドロキシ−３−メチルグル
タリル補酵素Ａ（ＨＭＧ ＣｏＡ）レダクターゼ遺伝子についてのプロモーター
の下流に、プラスミドベクター（ｐＨＭＧ）中にクローニングした。異なるレベ
ルのヒトＬＬＧＸＬを発現するトランスジェニックマウスを、標準的な方法を使
用して作製する（例えば、Ｇ．Ｌ．Ｔｒｅｍｐら、Ｇｅｎｅ １５６：１９９−
２０５、１９９５を参照のこと）。このトランスジェニックマウスを、脂質プロ
フィール、脈管病理学、アテローム硬化症の発達の速度および重症度、ならびに
他の生理的パラメータに対するＬＬＧＸＬの過剰発現の影響を決定するために使
用する。
【０２２２】 （実施例１０：アテローム性動脈硬化症組織におけるＬＩＰＧの発現） アテローム性動脈硬化症におけるＬＬＧＸＬ発現を、アテローム性動脈硬化症
を有する４人の患者の脈管の生検材料から単離されたｍＲＮＡを使用する逆転写
ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行することによって実験した。この
組織サンプルは、大動脈壁（１サンプル）、腸骨の動脈（２サンプル）、および
頸動脈（１サンプル）由来である。
【０２２３】 アテローム性動脈硬化症生検材料をＧｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ Ｒｏｙ
ａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（英国）から受け取り、そしてポリＡ＋ｍＲＮＡを調製
し、そして０．５μｇ／μｌ ｍＲＮＡの濃度にジエチルピロカルボネート（Ｄ
ＥＰＣ）処理水において再懸濁した。逆転写酵素反応を、第１鎖ｃＤＮＡ合成に
ついてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍに関するＧｉｂｃｏＢＲＬプロトコルに従い実行した。手短には、ｃＤＮＡ
を、以下のように合成した：２μｌの各ｍＲＮＡを、１μｌのオリゴ（ｄＴ）12 -18 プライマーおよび９μｌのＤＥＰＣ水に添加した。このチューブを、７０℃
で１０分間インキュベートし、そして氷上に１分間置いた。各チューブに、以下
の成分を添加した：２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ 混合物および２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ。４
２℃で５分後、１μｌ（２００ユニット）のＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
逆転写酵素を添加した。この反応系を緩やかに混合し、次いで、４２℃で５０分
間インキュベートした。この反応系を、７０℃で１５分間のインキュベーション
によって終結し、次いで氷上に置いた。残存しているｍＲＮＡを、１μｌのＲＮ
ａｓｅの各チューブへ添加することによって破壊し、そして３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。
【０２２４】 ＰＣＲ増幅を、２μｌのｃＤＮＡ反応系を使用して行った。各チューブに、以
下のものを添加した：５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ
、１μｌのｈｌｌｇ−ｇｓｐ１プライマー（２０ｐｍｏｌ／ｍｌ、図１を参照の
こと）、１μｌのｈｌｌｇ−ｇｓｐ２ａプライマー（２０ｐｍｏｌ／ｍｌ、図１
を参照のこと）、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５μｌのＴａｑポリ
メラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）および３４μｌの水。この反応系を９５℃で２分間保持
した後、ＰＣＲを３０回、以下のように行った：９４℃で１５秒、５２℃で２０
秒、７２℃で３０秒。最後の反応を、７２℃で１０分間保持し、その後アガロー
スゲル電気泳動によって分析した。ｈｌｌｇ−ｇｓｐプライマーは、ＬＩＰＧ特
異的であり、そして３００ｂｐの予期した産物を得た。ｃＤＮＡ合成反応が成功
したことを示す平行ＰＣＲにおいて、ハウスキーピング遺伝子に特異的なプライ
マーであるＧ３ＰＤＨ（ヒトグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ）を使用した（２０ｐｍｏｌ／ｍｌで各１μｌ）。
【０２２５】 このＧ３ＰＤＨプライマー（図１を参照のこと）は、全ての４つの脈管生検サ
ンプルにおいて９８３ｂｐの予期した産物を得た。ＬＩＰＧ発現を４つのサンプ
ルのうち３つにおいて検出し、頸動脈サンプルにおいては、発現は検出されなか
った。
【０２２６】 （実施例１１：ディファレンシャルディスプレイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮ
Ａライブラリースクリーニング） 実施例１２〜１６において議論される実験を実行するために、以下の手順（実
施例１に概説される手順に基づく）を使用して、ＬＩＰＧのｃＤＮＡを得た。Ｔ
ＨＰ−１細胞を、１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ，４０ｎｇ
／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）の存在下に４８時間置いた。この示差的なＴＨＰ−１細胞
を、ｏｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）またはコントロール培地のいずれかに２４時
間曝露した。全ＲＮＡを収集し、そして標準的な手順を使用して精製した。ポリ
（Ａ）+ＲＮＡを、全ＲＮＡからポリｄＴ磁気ビーズ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使
用して精製した。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
Ｄｉｓｐｌａｙキット、バージョン１．０（Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のプロトコルを使用して達成した。ＥＬの最初
のｃＤＮＡフラグメントを得るプライマー対は、下流プライマー ７（５’−Ｔ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡ−３’）および上流プライマー １５（５’−ＧＡＴ
ＣＣＡＡＴＣＧＣ−３’）であった。増幅反応物を、６％未変性アクリルアミド
配列決定型ゲルで分画し、そしてｏｘＬＤＬに曝露されたＴＨＰ−１細胞由来の
ｃＤＮＡを含む反応系においてのみ見出された増幅産物を同定し、そしてゲルか
ら切り出した。同一のプライマーを使用する再増幅を行い、そしてその産物を切
り出し、そしてＴＡクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ
ＩＩベクターにサブクローニングした。挿入サイズを、このプラスミドのＥｃｏ
ＲＩ消化物を使用して決定し、そして元のＰＣＲ産物のおおよその大きさの挿入
物を含むクローンを、蛍光色素ターミネーター試薬（Ｐｒｉｓｍ，Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３
７３ ＤＮＡ配列決定機を使用して配列決定した。本発明者らは、最初のゲル切
り出しｃＤＮＡのｃＤＮＡ配列を５’−ＲＡＣＥ系（ＧＩＢＣＯ）を使用して伸
長した。ディファレンシャルディスプレイ反応において最初に使用されたＴＨＰ
−１細胞由来のＲＮＡ（１μｇ）を、第１鎖ｃＤＮＡ合成のための遺伝子特異的
プライマー（５’−ＴＡＧＧＡＣＡＴＧＣＡＣＡＧＴＧＴＡＡＴＣＴＧ−３’）
を使用して５’−ＲＡＣＥ手順において使用した。本発明者らは、アンカープラ
イマーおよび遺伝子特異的プライマー２（５’−ＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡ
ＣＴＴＣＴＣ−３’）を使用してｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。この反応系（
１μｌ）を、ユニバーサル増幅プライマー（５’−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＧ
ＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’）および遺伝子特異的プライマ
ー３（５’−ＧＡＣＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＧ−３’）を使用するネス
ト化再増幅において使用し、引き続く単離のための特異的な産物のレベルを上昇
した。この反応産物を、ＴＡクローニングキットのｐＣＲＩＩベクターにクロー
ン化し、そして配列を決定した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（オリゴｄＴお
よびランダムプライム）を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そして５’−ＲＡＣ
Ｅ反応ＰＣＲ産物を用いてプローブした。ハイブリダイズするクローン由来のＤ
ＮＡを、ＬａｍｂｄａＳｏｒｂ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。挿
入物を、ＥｃｏＲＩでの消化によってファージＤＮＡから切り出し、Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏ
ＲＩ部位にサブクローン化し、そして配列決定した。
【０２２７】 （実施例１２：抗体の調製） １７残基のペプチド（ＧＰＥＧＲＬＥＤＫＬＨＫＰＫＡＴＣ）を、Ｍｏｄｅｌ
４３３Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分泌Ｌ
ＩＰＧ遺伝子産物の残基８〜２３に対応して合成した。ペプチド（２ｍｇ）を、
Ｉｍｊｅｃｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に含まれるプロトコルに従って
マレイミド活性化キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモ
シアニン（２ｍｇ）に結合体化した。脱塩後、半分の共役物を、等量のフロイン
ト完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて乳化し、そしてニュージーランド
シロウサギに注射した。最初の注射から４週間後、追加免疫注射を、フロイント
不完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）の使用を除いて上記のように正確に作製さ
れた乳化を用いて投与した。追加免疫から２週間後、特定の抗体の力価を、固定
化ペプチドを使用するＥＬＩＳＡを介して試験採血において決定した。
【０２２８】 （実施例１３：遺伝子発現研究） ＨＵＶＥＣを、ウシ脳抽出物（３ｍｇ／ｍｌ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を補充し
た市販の調製された内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において
増殖した。一方、ＨＣＡＥＣを、ウシ脳抽出物（３ｍｇ／ｍｌ）および５％ウシ
胎仔血清を含有するＥＧＭにおいて増殖した。培養を、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍ
ｌ）の添加によって刺激した。インキュベーションから２４時間後、ＲＮＡを、
Ｔｒｉｚｏｌ法によりこの細胞から抽出し、１％アガロースホルムアルデヒドゲ
ル上で電気泳動し、Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよ
びＳｃｈｕｅｌｌ）上でＮｙｔｒａｎ膜に転写し、そしてＳｔｒａｔａｌｉｎｋ
ｅｒ紫外線架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して膜に架橋した。５’−Ｒ
ＡＣＥ反応ＰＣＲ産物を、ランダムプライム技術を使用して放射能標識した。こ
の放射能標識したプローブ（１〜２×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）を、９５℃で１０分
間加熱することによって変性し、そして氷上で急冷し、その後、ＱｕｉｋＨｙｂ
における濾過材に添加した。ハイブリダイゼーションを、６５℃で３時間で進行
させた。濾過材を、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルムに−８０℃で強化スクリー
ンを用いて曝露した。本発明者らは、ＨＵＶＥＣ馴化培地およびＨＣＥＡＣ馴化
培地をヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂとともに４℃で１時間インキュベートし
た。遠心分離後、ペレット化したヘパリンセファロースを、ＳＤＳローディング
緩衝液に懸濁し、９５℃で５分間加熱し、そして１０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ ＳＤＳゲル（ＮＯＶＥＸ）上にロードした。１４０Ｖで９０分間の電気泳
動後、タンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、そしてウサギ抗ＬＩＰＧペ
プチド抗血清（１：５，０００）、二次抗体としてヤギ抗ウサギペルオキシダー
ゼ結合体化抗血清（１：５，０００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて検出した
。この膜を、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ化学発光試薬（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）と
反応させ、そしてＫｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルムに曝露した。商業的に調製さ
れたヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由来のポリ（Ａ） + ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（各３μｇ）を含む濾過材を、放射能標識化フラ
グメントを用いてハイブリダイズし、そして上記のように進行した。オートラジ
オグラフィーの後、ブロットを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで２×１５
分間６５℃での煮沸において洗浄することによってストリップし、次いでヒトＬ
ＰＬをコードする１．４ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを用いて上記のようにプロ
ーブ化した。このフラグメントを、５’ＬＰＬプライマーおよび３’ＬＰＬプラ
イマー（それぞれ、５’−ＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧ
−３’および５’−ＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＴＣ−３
’）を使用してＴＨＰ−１ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（ＰＭＡおよびｏｘＬＤＬ処
理した）によって得た。フィルムに曝露後、この膜を、再度ストリップし、そし
てＲＮＡ含量を正規化するためにヒトβアクチンｃＤＮＡの放射能標識化フラグ
メントを用いて再プローブ化した。
【０２２９】 ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、予期したようにＬＰＬ ｍＲＮＡ発現
について陰性であったが、ＬＩＰＧ遺伝子について高いレベルのｍＲＮＡを構成
的に発現することを見出した（図９）。
【０２３０】 ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）がまた、これらの細胞のホルボールエス
テルでの処置の際にさらにアップレギュレートされるｍＲＮＡを発現することを
見出した（図９）。
【０２３１】 刺激されたＨＵＶＥＣおよびＨＣＡＥＣ由来の馴化培地は、約６８ｋＤおよび
４０ｋＤの免疫反応性タンパク質、ならびに５５ｋＤのわずかに顕著なバンドを
含んだ（図１１）。
【０２３２】 インビボでのＬＩＰＧ産生の組織部位を決定するために、ＬＩＰＧおよびＬＰ
Ｌの両方のプローブを用いて多数のヒト組織ノーザンブロット分析を行った。高
いレベルのＬＩＰＧ ｍＲＮＡを、肺、肝臓そして腎臓の組織において見出した
（図８）。この組織は、低レベルのＬＰＬ発現を示した。ＬＩＰＧはまた、胎盤
において高レベルで発現し（図８）、これは、発達における役割の可能性を示唆
する。
【０２３３】 最高量のＬＰＬを発現した心臓および骨格筋のような組織（先の報告を確認の
こと、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７，６９３
−７０７（１９９６））において、本発明者らは、ＬＩＰＧ発現を検出しなかっ
た。この分析は、ＬＩＰＧ発現の組織分布は、ＬＰＬの組織分布ならびにＨＬお
よびＰＬについて報告された組織分布とは非常に異なることを示した。本発明者
らは、副腎または卵巣においてＬＩＰＧ ｍＲＮＡを見出さなかったが、精巣に
おいて非常に低レベルのＬＩＰＧ ｍＲＮＡを見出した（データは示さず）。本
発明者らはまた、ＨｅｐＧ２細胞が、インビトロでＬＩＰＧ ｍＲＮＡおよびタ
ンパク質を発現するが（データは示さず）、ＨＵＶＥＣによって発現されるそれ
の１０％未満のレベルであることを見出した。
【０２３４】 （実施例１４：リパーゼアッセイ） ｃＤＮＡおよび１．４ｋｂ ＬＰＬ ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐＣ
ＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。アンチ
センスｐＣＤＮＡ３ベクターを、陰性コントロールとして使用した。組換え発現
ベクター（３μｇ）を、リポフェクトアミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）と混合し、そして４通りに６０ｍｍ皿においてセミコンフルエントなＣＯ
Ｓ７細胞にトランスフェクトした。確立された方法を使用して、ＴＧリパーゼ活
性およびホスホリパーゼ活性についてトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞由来
の馴化培地のサンプルをアッセイした（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉ．，Ｊ．Ｌｉ
ｐｉｄ Ｒｅｓ．，３７、６９３−７０７（１９９６））。ＴＧリパーゼアッセ
イについて、９，１０−3Ｈ（Ｎ）−トリオレイン（２５０μＣｉ；ＮＥＮ）を
、未標識のグリセロール中トリオレイン（１５０ｍｇ）およびＶＩ型Ｓ−αレシ
チン（９ｍｇ；Ｓｉｇｍａ）と混合した。この混合物を、窒素下でエバポレート
し、そしてグリセロール（２．５ｍｌ）においてＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉ
ｅｒ ４５０を用いる超音波処理によって乳化した。このアッセイ基質を、１容
量の乳化基質、４容量の３％（ｗ／ｖ）無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．２Ｍ，ｐＨ８．０）および１容量の熱非動化ウシ血
清を混合することによって調製した。反応を、アッセイ基質（０．１ｍｌ）およ
び馴化培地（０．１ｍｌ）を含有する全量（０．２ｍｌ）において３通り行った
。この反応系を、３７℃で２時間インキュベートし、そしてメタノール−クロロ
ホルム−ヘプタン（１．４１：１．２５：１；３．２５ｍｌ）を添加することに
よって終結し、続いて炭酸カリウム−ホウ酸緩衝液（１．０５ｍｌ；０．１Ｍ，
ｐＨ１０．５）を添加した。１５秒間の激しい混合の後、このサンプルを、１，
０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上部の水層（１．０ｍｌ）を、シンチ
レーションカウンターで計測した。ホスホリパーゼアッセイについて、ホスファ
チジルコリン（ＰＣ）エマルジョンを、14Ｃ−ジパルミトイルＰＣ（２μＣｉ；
ＮＥＮ）およびレシチン（１０μｌ）をＴｒｉｓ−ＴＣＮＢ（１００μｌ；１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５
ｍＭ ＣａＣｌ2、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ）と混合すること
によって作製した。この混合物を２分間ボルテックスし、次いで窒素下でエバポ
レートした。乾燥脂質を、ＴＣＮＢ（１ｍｌ）で再構成し、１０秒間ボルテック
スした。反応は、３通り行い、ＰＣエマルジョン（５０μｌ）、馴化培地（６０
０μｌ）およびＭＥＭ（３５０μｌ）を含んだ。サンプルを、３７℃で２時間イ
ンキュベートし、ＨＣｌ（１ｍｌ）の添加によって終結し、そして２−プロパノ
ール：ヘキサン（１：１；４ｍｌ）を用いて抽出した。上部のヘキサン層のサン
プル（１．８ｍｌ）を、シリカゲルカラムに通し、そしてフロースルーフラクシ
ョンに含まれる遊離した無14Ｃ脂肪酸をシンチレーションカウンターにおいて定
量化した。両アッセイについて、１０％ ＦＢＳを含むＭＥＭをブランクとして
使用し、そしてアンチセンスプラスミド（ＡＳ）でトランスフェクトしたＣＯＳ
７細胞由来の馴化培地を、陰性コントロールとして使用した。
【０２３５】 （実施例１５−組換えアデノウイルスの構築および動物研究） ヒトＬＩＰＧをコードする組換えアデノウイルスを、記載されるように構築し
た（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００、１０７〜１
１４（１９９７）；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３８、１
８６９〜１８７６（１９９７））。手短かに言うと、全長ヒトｃＤＮＡをシャト
ルプラスミドベクターｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１にサブクローニングした。制限分
析により適切な方向についてスクリーニングした後、そのプラスミドをＮｈｅＩ
で線状化し、そしてＣｌａＩで消化したアデノウイルスＤＮＡとともに２９３細
胞に同時トランスフェクトした。細胞を寒天上に置き、そして３７℃で１５日間
インキュベートした。６つのプラークを拾い、そしてＰＣＲによりスクリーニン
グした；ｃＤＮＡについて陽性の２つのプラークを２回目のプラーク精製に供し
た。ｃＤＮＡの存在を確認した後、組換えアデノウイルスを３７℃で２９３細胞
中で増殖させた。馴化培地のウェスタンブロットによるヒトＬＩＰＧの発現の確
認のために、細胞溶解物を使用してＨｅＬａ細胞に感染させた。組換えアデノウ
イルス（ＡｄｈＥＬ）を２９３細胞中でさらに増殖させ、そして塩化セシウム超
遠心分離により精製した。ｃＤＮＡインサートを含まないコントロールアデノウ
イルス（Ａｄｎｕｌｌ）もまた、上記のようにプラーク精製に供して精製した。
精製したウイルスを、１０％グリセロール／ＰＢＸ中に−８０℃にて貯蔵した。
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ヒトＡｐｏＡ−Ｉトランスジェニックマウスおよ
びＬＤＬレセプター変異体マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙか
ら得た。すべてのマウスに食餌を与えた。野生型マウスおよびヒトａｐｏＡ−Ｉ
トランスジェニックマウスに、尾の静脈を介して、ＡｄｈＥＬまたはＡｄｎｕｌ
ｌを１×１０11粒子（約２×１０9ｐｆｕ）を静脈注射し、そしてＬＤＬＰ欠損
マウスに１×１０10粒子を注射した。すべての実験において、注射の１日前およ
び注射後の複数の時点で、眼窩叢後部から血液を得た。
【０２３６】 野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＡｄｈＥＬの静脈内注射によって、肝臓にお
ける発現（図１７）、およびＨＤＬコレステロールの血漿レベルの低下をもたら
し、これは、注射後少なくとも１４日間を通してコントロールウイルスを注射し
たマウスより有意に低いままであった（図１８）。リポタンパク質をＦＰＬＣゲ
ル濾過により分離した。このことは、ＨＤＬがアデノウイルス注射の１４日後に
検出不能であったことを示した（図１９）。ヒトａｐｏＡ−Ｉトランスジェニッ
クマウス（かなりより高いレベルのＨＤＬコレステロールおよびａｐｏＡ−Ｉを
有する）に組換えＬＩＰＧアデノウイルスを注射すると、ＨＤＬコレステロール
（図２０）およびａｐｏＡ−Ｉ（図２１）の両方のレベルを低下させた。ａｐｏ
Ｂ含有リポタンパク質であるＶＬＤＬおよびＬＤＬと比較した、ＨＤＬに対する
ＬＩＰＧ発現の相対的効果を決定するために、本発明者らは、給餌したＬＤＬレ
セプター欠損マウスにより低用量のＬＩＰＧアデノウイルスを注射した。このＬ
ＤＬレセプター欠損マウスは、ＶＬＤＬ／ＬＤＬにおいて約７０％のコレステロ
ールそしてＨＤＬにおいて約３０％のコレステロールを有する。上記のように、
ＬＩＰＧの発現によって、ＨＤＬコレステロールレベルが低下した（図２３）。
同じマウスにおいてＬＩＰＧ発現はＶＬＤＬ／ＬＤＬコレステロールレベルを低
下させた（図２４）が、その効果は比例して、より小さかった。ＬＩＰＧの過剰
発現はＶＬＤＬ／ＬＤＬコレステロールを低下させた。従って、ａｐｏＢ含有リ
ポタンパク質の調節におけるＬＩＰＧの役割は、除外され得る。
【０２３７】 （実施例１６−脂質／リポタンパク質分析） 血漿の総コレステロールレベルおよびＨＤＬコレステロールレベルを、Ｓｉｇ
ｍａの試薬を使用してＣｏｂａｓ Ｆａｒａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において酵素的に測定した。ａｐｏＡ−Ｉを、Ｃｏｂａｓ
Ｆａｒａにおいて濁度アッセイ（Ｓｉｇｍａ）を使用して定量した。プールし
た血漿サンプルを、記載されるように（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．、前出）、２つのＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムを連続して使用し
て、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ゲル濾過（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に供した。画分（０．５ｍｌ
）を収集し、そしてコレステロール濃度を、酵素的アッセイ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒ
ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して決定した。
【０２３８】 （実施例１７−ＬＩＰＧのインヒビターの同定） ＥＬ活性の調節因子を、以下の方法を使用して見出し得る： 組換えＬＩＰＧを、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵
巣細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ Ｌａｃｔｉｓ）または他の供給源の馴化
培地から精製する。ＬＩＰＧの非組換え供給源（例えば、ヒト血漿、内皮細胞馴
化培地など）もまた使用し得る。ＬＩＰＧ活性の調節因子を探すための一次スク
リーニングの例は、可溶性蛍光基質４−メチルウンベリフェリルヘパタノエート
を利用する。このアッセイは、連続的かつ均一的である。ＬＩＰＧによるこの基
質の加水分解は、マイクロプレート蛍光分析計において測定され得る、非常に蛍
光性の４−メチルウンベリフェロンの生成を生じる。使用し得る他の一次スクリ
ーニング形態は、ホスホリパーゼ活性を測定するシンチレーション近接（ｐｒｏ
ｘｉｍｉｔｙ）アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、実施例７に記載され（そして以
下に２次アッセイとして提案され）る、低スループット放射性ホスホリパーゼア
ッセイ、または実施例８に記載される代替的ホスホリパーゼアッセイである。
【０２３９】 ＬＩＰＧの触媒中心は、他のＴＧリパーゼと同様に、セリンプロテアーゼにお
いて見出される同じ触媒三つ組（ｔｒｉａｄ）（セリン、ヒスチジン、アスパラ
ギン酸）からなる。実際、他のＴＧリパーゼ（例えば、リポタンパク質リパーゼ
）は、セリンプロテアーゼインヒビター（例えば、ＰＭＳＦおよびＤＦＰ）によ
り阻害される。これらの化合物のいずれか１つは、ＬＩＰＧ活性のインヒビター
についての陽性コントロールとして作用し得る。
【０２４０】 （２次アッセイ） 上記のエステラーゼアッセイまたは代替的スクリーニング
アッセイにおいて活性な化合物を、標準的放射性ホスホリパーゼＡアッセイにお
いてアッセイする。このアッセイは、[１４Ｃ］−ジパルミトイル−ホスファチ
ジルコリンを含有する混合ミセルからの放射性標識パルミチン酸の放出を測定す
る。蛍光基質を利用する他のアッセイ形態およびより高スループットにされ得る
他のアッセイ形態を想定し得る。
【０２４１】 （選択性アッセイ） 化合物を、関連酵素であるリポタンパク質リパーゼ（Ｌ
ＰＬ）および膵リパーゼ（ＰＬ）の阻害についてアッセイする。ヒトＰＬおよび
ウシＬＰＬは市販されており、アッセイを容易に実行し得る。ＰＬのホスホリパ
ーゼ活性を、ＬＩＰＧの２次アッセイについて上記されたのと全く同じ様式で測
定する。ＬＰＬは主にＴＧリパーゼであるので、その２次アッセイは、放射性Ｔ
Ｇ（トリオレイン）基質からの放射性脂肪酸（オレイン酸）放出を測定する（実
施例７に記載される）。このアッセイは、同様の能力を有し、そして蛍光基質を
利用する他のアッセイ形態およびより高スループットにされ得る他のアッセイ形
態に適合され得る。
【０２４２】 ＬＩＰＧのホスホリパーゼ活性を、そのインビボ基質であるＨＤＬに対して、
インビトロアッセイにて試験する。放射性標識ＨＤＬは、放射性標識リン脂質で
の交換によって生成し得、次いでこの放射性標識ＨＤＬを使用して、ＬＩＰＧホ
スホリパーゼ活性およびこのスクリーニングから出現する化合物の活性を測定す
る。
【０２４３】 さらなるアッセイは、培養細胞（例えば、ラットＦｕ５ＡＨ肝細胞癌株）から
の放射性標識コレステロール流出に対する、ＬＩＰＧ、ＨＤＬ、＋／−化合物の
プレインキュベーションの影響を測定し得る。
【０２４４】 化合物の評価のためのインビボアッセイを、野生型マウス、ＬＩＰＧ過剰発現
マウス、およびコントロールとしてのＬＩＰＧヌルマウスにて実行し得る。ａｄ
ｅｎｏＥＬ発現の場合においてのように、トランスジェニックマウスがコントロ
ールマウスに対して低下したＨＤＬを示す場合、ＬＩＰＧ阻害化合物でのトラン
スジェニックマウスの処置が、コントロールマウスのレベルまでＨＤＬを上昇さ
せると予測される。他の動物（例えば、ＬＤＬＲ−／−マウス、ａｐｏＡＩトラ
ンスジェニックマウス、ａｐｏＡＩトランスジェニックハムスター、またはａｐ
ｏＡＩトランスジェニックウサギ）において、化合物をそのＬＩＰＧ阻害活性（
ＨＤＬの上昇）について試験し得ることもまた、可能である。ＬＩＰＧまたはＬ
ＩＰＧ活性を上昇させた化合物は、これらの動物モデルまたは他の動物モデルに
おいてＨＤＬを上昇させると予期される。
【０２４５】 （実施例１８−阻害低分子処置法） 実施例１７に概説されるスクリーニングにおいて、インビトロでＬＩＰＧポリ
ペプチドを阻害し得ると同定された低分子（本明細書中で以後、「阻害低分子」
）を、インビボでＬＩＰＧポリペプチドを阻害するその能力について試験する。
野生型マウスおよびＬＩＰＧトランスジェニックマウスを、その低分子を経口投
与すること（経口的に生物学的に利用性である場合）によってか、または静脈内
注射によって、研究する。ＬＩＰＧポリペプチドの活性を、（結合部位から酵素
を遊離させるための）ヘパリン注射の前および後に、血漿において測定する。さ
らに、コレステロールレベル、ＶＬＤＬコレステロールレベル、ＬＤＬコレステ
ロールレベル、およびＨＤＬコレステロールレベルならびにａｐｏＡ−Ｉレベル
を、阻害低分子を受ける動物においてモニターする。最終的に、ＬＤＬレセプタ
ー欠損マウスにアテローム発生食を給餌し、そして阻害低分子またはプラシーボ
を８週間投与する。阻害低分子の投与がアテローム性硬化症の進行を低下するか
または後退を誘導するか否かを決定するために、マウスの大動脈においてアテロ
ーム性動脈硬化症を定量する。これらの臨床前データに基づいて、さらなる動物
モデル（例えば、ハムスター、ウサギ、またはブタ）を、阻害低分子がＨＤＬコ
レステロールレベルを上昇させ、ＶＬＤＬコレステロールレベルおよびＬＤＬコ
レステロールレベルを低下させ、そして／またはアテローム性動脈硬化症の進行
を阻害する能力について、研究する。
【０２４６】 所望の特性を有することが見出された阻害低分子を、薬学的に受容可能なキャ
リアと組み合わせて患者に投与する。この阻害低分子は、経口投与および静脈内
注射を含む、種々の様式にて投与し得る。患者のＨＤＬコレステロールレベル、
ＶＬＤＬコレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルをモニターし
て、その阻害低分子の効力を決定し、そして投薬量および投与プロトコルを最適
にする。
【０２４７】 （実施例１９−阻害ペプチド処置法） 治療ペプチドを、ＬＩＰＧポリペプチドのフラグメントを試験して、これらの
うちのどのフラグメントがインビトロにてＬＩＰＧポリペプチド活性を阻害する
かを決定することによって同定する。一旦同定すると、次いで「阻害ペプチド」
を、インビボでＬＩＰＧポリペプチドを阻害するその能力について試験する。阻
害ペプチドは、当該分野で公知の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え産生
し、そして精製する。阻害ペプチドの効果を、静脈注射により阻害ペプチドを投
与することによって、野生型マウスおよびＬＩＰＧトランスジェニックマウスに
おいて研究する。ＬＩＰＧポリペプチドの活性を、（結合部位から酵素を遊離さ
せるための）ヘパリン注射の前および後に血漿において測定する。さらに、コレ
ステロールレベル、ＶＬＤＬコレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベ
ル、およびＨＤＬコレステロールレベルおよびａｐｏＡ−Ｉレベルを、阻害ペプ
チドを受ける動物においてモニターする。最終的に、ＬＤＬレセプター欠損マウ
スにアテローム発生食を給餌し、そして阻害ペプチドまたはプラシーボを８週間
投与する。阻害ペプチドの投与がアテローム性硬化症の進行を低下するかまたは
後退を誘導するかを決定するために、マウスの大動脈においてアテローム性動脈
硬化症を定量する。これらの臨床前データに基づいて、さらなる動物モデル（例
えば、ハムスター、ウサギ、またはブタ）を、その阻害ペプチドがＨＤＬコレス
テロールレベルを上昇させ、ＶＬＤＬコレステロールレベルおよびＬＤＬコレス
テロールレベルを低下させ、そして／またはアテローム性動脈硬化症の進行を阻
害する能力について、研究する。
【０２４８】 所望の特性を有することが見出された阻害ペプチドを、薬学的に受容可能なキ
ャリアと組み合わせて患者に投与する。この阻害ペプチドは、経口投与および静
脈内注射を含む、種々の様式にて投与し得る。患者のＨＤＬコレステロールレベ
ル、ＶＬＤＬコレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルをモニタ
ーして、その阻害ペプチドの効力を決定し、そして投薬量および投与プロトコル
を最適にする。
【０２４９】 （実施例２０−アンチセンス処置方法） 各々がＬＩＰＧ ｃＤＮＡの約２０個の塩基に相補的である一連のアンチセン
スオリゴヌクレオチドを、標準的な技術によって化学的に合成する。治療的に使
用するために最も有効なオリゴヌクレオチドを決定するために、各々のオリゴヌ
クレオチドを、標準的なトランスフェクションプロトコルを使用してＬＩＰＧ遺
伝子を発現する細胞中に個別にトランスフェクトする。
【０２５０】 オリゴヌクレオチドのトランスフェクションの約２４〜４８時間後、細胞中の
ＬＩＰＧ ｍＲＮＡレベルを、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅ保
護、または他の適切な方法によって決定する。あるいは、ＬＩＰＧ発現を、有効
なアンチセンスオリゴヌクレオチドについてスクリーンするために使用され得る
特異的な抗体を用いてモニターし得る。次いで、ＬＩＰＧ ｍＲＮＡレベルを有
効に低下させるオリゴヌクレオチドを、治療としてインビボ送達のために処方す
る。
【０２５１】 アンチセンスＬＩＰＧ配列を、遺伝子治療ベクター（例えば、アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、裸のＤＮＡ）または詳細な説明におい
て議論される他の系において送達し得る。遺伝子治療ベクター中で送達する場合
、このようなフラグメントを治療的に使用し得る。このような組換えベクターの
肝臓発現は、好ましいアプローチである。あるいは、合成アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを、上記のように治療としてインビボ送達のために処方し得る。
【０２５２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドを、以下の経路によって投与し得る：静脈内
経路、皮下経路、皮内経路、肺動脈経路、経口経路、脳室内経路、髄腔内経路、
および局所的経路。この投与経路は、血管壁（すなわち、内皮平滑筋および／ま
たは血管平滑筋）への直接投与を含み得る。例として、低いＨＤＬ−Ｃを有する
患者に、一日おきに２〜３週間まで静脈内に注入される、一用量０．５〜２ｍｇ
／ｋｇの有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを与え得る。ＬＩＰＧは肝臓内
で発現するので、アンチセンス試薬を門脈循環に送達することは望ましくあり得
る。これは、オリゴヌクレオチドを肝臓標的化部分（例えば、アシアログリコプ
ロテイン）と結合体化させるか、または複合体化させることによって達成され得
る。用量および治療のタイミングは、アンチセンス送達の有効性、ならびに半減
期、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性および毒性のようなパラメーター
に依存する。
【０２５３】 ＨＤＬ−Ｃの増加を、標準的な臨床実験手順を使用してモニターし得る。本来
の投薬スケジュール（上記のようなもの）を、ＨＤＬ−Ｃを３５ｍｇ／ｄＬより
多く維持するために必要とされるだけ繰り返す。
【０２５４】 （実施例２１−リボザイム処置方法） ＬＩＰＧ ｃＤＮＡ配列に基づいて、ＬＩＰＧ ｍＲＮＡレベルを効果的に低
下するハンマーヘッドリボザイムを調製する。これらは、ヌクレオチド配列の各
々がＬＩＰＧ ｍＲＮＡに相補的である６〜７塩基の２つの「アーム」からなり
、これらはリボザイムの触媒部分によって分離される。このようなハンマーヘッ
ドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら、１９９２、Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａ
ｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３によって記載される
。リボザイムを適切なＤＮＡベクターから真核生物細胞において発現する。
【０２５５】 リボザイムを、上記のようにリポソーム中にカプセル化して投与し得る。
【０２５６】 リボザイム／リポソーム組成物を、直接注射によってかあるいはカテーテル、
注入ポンプ、またはステントの使用によって肝臓に送達する。投与の経路は、血
管壁（すなわち、内皮平滑筋および／または脈管平滑筋）への直接投与を含み得
る。患者を、薬学的に有効なカテーテル中の５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日のリボザイ
ムを用いて、２週間までの間、処置する。ＨＤＬ−Ｃの増加および投薬レジメン
をアンチセンスオリゴヌクレオチド関してモニターし、そして決定する。
【０２５７】 （実施例２２−中和抗体処置方法） 少なくとも１つのＬＩＰＧ結合部分からなり、実施例１２に記載するように調
製される、抗ＬＩＰＧ抗体、抗体フラグメント、またはキメラ抗体を、インビボ
でＬＩＰＧ活性を阻害するために使用する。抗体を、単にボーラスとしてか、経
時的に注入するか、またはその両方かで送達し得る。代表的には、０．２〜０．
６ｍｇ／ｋｇの用量をボーラスとして、次いで２〜１２時間の注入として与える
。あるいは、複数ボーラス注射を、ＬＩＰＧを低下しそしてＨＤＬ−Ｃを増加さ
せるために必要とされるだけ、一日おきか、または３日に４日ごとに与える。反
復投薬を、ＨＤＬ−Ｃレベルの測定によって決定されるように行う。ＬＩＰＧに
対する抗体をまた、インビボでの発現を容易にするために遺伝子治療ビヒクルに
おいて送達し得る。抗体の発現のレベルを、ＨＤＬ−Ｃの測定によって間接的に
決定し、そしてさらなるベクターを必要なだけ導入し得る。
【０２５８】 （実施例２３−阻害分子またはエンハンサー分子の使用） 完全なＬＩＰＧ、必要な活性化補助因子、細胞表面レセプター、または結合タ
ンパク質への結合について競合することによってＬＩＰＧ活性を阻害し得る、Ｌ
ＩＰＧタンパク質のフラグメントを、治療的組換えタンパク質としてか、または
遺伝子治療ベクターから送達し得る。
【０２５９】 一例として、ＬＩＰＧに基づいたＬＬＧＮポリペプチドを、記載されるように
組換えアデノウイルス中にクローン化する（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００，１０７−１１４（１９９７）；Ｔｓｕｋａｍｏｔ
ｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，３８，１８６９−１８７６（１９９７））。
ＬＩＧＮ ｃＤＮＡを、シャトルプラスミドベクターｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１中
にクローンする。分析後、このプラスミドを、ＮｈｅＩを用いて線形化し、そし
てＣｌａＩで消化されたアデノウイルスＤＮＡと共に２９３個の細胞中に同時ト
ランスフェクトする。次いで、細胞を寒天で薄く覆い、そして３７°で１５日間
インキュベートする。プラークを採取し、そしてＰＣＲによってスクリーンする
；ｃＤＮＡに対して陽性なプラークを２回目のプラーク精製に供する。ｃＤＮＡ
の存在の確認後、組換えアデノウイルスを３７°で、２９３個の細胞中で増殖さ
せる。細胞溶解物を使用して、馴化培地のウエスタンブロットによるヒトＥＬの
発現の確認のために、ＨｅＬＡ細胞を感染させる。組換えアデノウイルスを、２
９３個の細胞中でさらに増殖させ、そして塩化セシウム超遠心分離によって精製
する。精製されたウイルスを、−８０°で１０％グリセロール／ＰＢＸ中に貯蔵
する。患者に、組換えアデノウイルスの１×１０11個の粒子（約２×１０9ｐｆ
ｕ）を静脈内で注射する。
【０２６０】 （実施例２４−発現ベクターからのＬＩＰＧの発現によって患者におけるＬＩ
ＰＧのレベルを増加させる方法） 全長ＬＩＰＧ ｃＤＮＡを、ヒトＬＩＰＧをコードする組換えアデノウイルス
中にクローン化する（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
１００，１０７−１１４（１９９７）；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．，３８，１８６９−１８７６（１９９７））。全長ヒトＬＩＰＧ ｃ
ＤＮＡを、シャトルプラスミドベクターｐＡｄＣＭＶＬｉｎｋ１中にクローン化
する。制限分析によって適切な配向についてスクリーニングした後、プラスミド
を、ＮｈｅＩを用いて線形化し、そしてＣｌａＩで消化されたアデノウイルスＤ
ＮＡと共に２９３個の細胞中に同時トランスフェクトする。細胞を寒天で薄く覆
い、そして３７°で１５日間インキュベートする。プラークを採取し、そしてＰ
ＣＲによってスクリーンする；ｃＤＮＡに対して陽性なプラークを２回目のプラ
ーク精製に供する。ｃＤＮＡの存在の確認後、組換えアデノウイルスを３７°で
、２９３個の細胞中で増殖させる。細胞溶解物を使用して、馴化培地のウエスタ
ンブロットによるヒトＬＩＰＧの発現の確認のために、ＨｅＬａ細胞を感染させ
る。組換えアデノウイルス（ＡｄｈＥＬ）を、２９３個の細胞中でさらに増殖し
、そして塩化セシウム超遠心分離によって精製する。精製されたウイルスを、−
８０°で１０％グリセロール／ＰＢＸ中に貯蔵する。患者に、ＡｄｈＥＬまたは
Ａｄｎｕｌｌの１×１０11個の粒子（約２×１０9ｐｆｕ）を静脈内で注射する
。
【０２６１】 （実施例２５−全長野生型ＬＩＰＧタンパク質または操作された組換えＬＩＰ
Ｇタンパク質の投与によってＬＩＰＧ活性のレベルを増加させる方法） 野生型ＬＩＰＧタンパク質は、ＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステ
ロールのレベルを低下させ、そしてＬＩＰＧは、ＨＤＬコレステロールに対する
影響を有することなくＶＬＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレ
ベルに特異的に作用するように操作され得る。野性型ＬＩＰＧまたは操作された
組換えＬＩＰＧの投与を、特定の場合において、ＶＬＤＬコレステロールおよび
／またはＬＤＬコレステロールのレベルを低下させるための治療として使用し得
る。野性型ＬＩＰＧタンパク質または操作された組換えＬＩＰＧタンパク質（「
組換えＬＩＰＧタンパク質」）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換え的に産生し、そして
当該分野で公知の方法を使用して精製する。野性型マウスを、静脈内注射によっ
て組換えＬＩＰＧタンパク質を投与することにより研究する。ＬＩＰＧの活性を
血漿中で測定する。さらに、コレステロール、ＶＬＤＬコレステロール、ＬＤＬ
コレステロール、およびＨＤＬコレステロール、ならびにａｐｏＡ−Ｉのレベル
を、組換えＬＩＰＧタンパク質を受け入れる動物においてモニターする。最後に
、ＬＤＬレセプター欠損マウスにアテローム性食餌を与え、そして８週間の間、
組換えＬＩＰＧタンパク質またはプラシーボを投与する。アテローム硬化症を、
組換えＬＩＰＧタンパク質の投与がアテローム性硬化症の進行を減少するかまた
は後退を誘導するかを決定するために、マウスの大動脈において定量する。これ
らの症状発現前のデータに基づいて、さらなる動物モデル（例えば、ハムスター
、ウサギ、またはブタ）を、組換えＬＩＰＧタンパク質の、ＶＬＤＬコレステロ
ールおよびＬＤＬコレステロールのレベルを低下し、そして／またはアテローム
性硬化症の進行を阻害する能力について研究する。ＶＬＤＬコレステロールおよ
びＬＤＬコレステロールのレベルを低下し、そして／またはアテローム性硬化症
の進行を阻害する、所望の能力を有することが見出された組換えＬＩＰＧタンパ
ク質を、薬学的に受容可能なキャリアと組合せ、そして患者に投与する。組換え
ＬＩＰＧポリペプチドは、経口投与および静脈内投与を含む、種々の方法で投与
され得る。
【０２６２】 本明細書中で議論された全ての参考文献は、参考として援用される。
【０２６３】 当業者は、本発明が、目標を果たし、そして本来備わっているものに加えて言
及した目的および利点を得るように十分に適合化されていることを容易に理解す
る。本明細書中に記載されたペプチド、ポリヌクレオチド、方法、手順、および
技術は、好ましい実施形態の代表として示され、そして例示であることを意図さ
れ、本発明の範囲に対する限定を意図しない。本発明の精神に含まれるか、また
は添付の特許請求の範囲によって規定される、本明細書中での変化および他の使
用は、当業者が想到する。
【０２６４】 （実施例２６−グリコシル化の実施およびＬＩＰＧの生物学的活性） ＬＩＰＧをさらに特徴付けるために、多数の実験を行った。引き続く実験は、
ＬＩＰＧ（これらの実験および図面において「内皮リパーゼ」、または「ＥＬ」
といわれる）の生物学的活性をさらに規定する。
【０２６５】 図２４は、内皮リパーゼが糖タンパク質であることを示す。ＥＬを、グリコシ
ダーゼＥｎｄｏＦ、グリコシダーゼＥｎｄｏＨ、およびノイラミニダーゼで処理
した。これは、ポリペプチド鎖からの糖質の除去に呼応して、ウエスタンブロッ
ティングでのＥＬバンドの大きさに減少を生じた。グリコシル化はまた、ＥＬ発
現細胞においてツニカマイシンで阻害された。これは、ＥＬバンドの大きさに実
質的な減少を生じた。グリコシダーゼおよびツニカマイシンの実験は、ＥＬが糖
タンパク質であることを示す。
【０２６６】 図２５は、内皮リパーゼがヘパリン結合タンパク質であることを示す。アデノ
ウイルスベクターを発現するＥＬ ＡｄｈＥＬ（実施例１５を参照のこと）を、
マウスに注射した。ヘパリン注射の前（ｐｒｅ）および後（ｐｏｓｔ）に、血液
を取り出した。全長６８ｋＤのＥＬバンドの強度は、ヘパリンの投与によってヘ
パリン硫酸プロテオグリカンに結合し、そして放出されたＥＬに一致して、ヘパ
リン注射の後、大いに増大した。
【０２６７】 図２６Ａおよび２６Ｂおよび２７Ａおよび２７Ｂは、リポタンパク質リパーゼ
（ＬＰＬ）および肝リパーゼ（ＨＬ）に関する内皮リパーゼの脂肪分解活性を示
す。この実験は、内皮リパーゼがトリグリセリド（ＴＧ）リパーゼ活性を有する
か否かを決定するために実施した（図２７Ａ）。異なる馴化培地上での複数の研
究により、ＴＧリパーゼ活性の明らかな証拠が繰返し見出された。内皮リパーゼ
のホスホリパーゼ活性を、同じ馴化培地サンプルにおいてアッセイした（図２７
Ｂ）。ＴＧリパーゼ活性に対するホスホリパーゼの比は、異なるバッチの馴化培
地中でアッセイした場合、非常に一貫していた。定数項において、馴化培地体積
当たりで生成された脂肪酸のモルは、ＴＧリパーゼ活性に対してよりも、ホスホ
リパーゼに対して有意に大きかった。次いで、血清が内皮リパーゼ活性に影響を
与える能力を試験した（図２７Ａおよび２７Ｂ）。予期されたように、血清の添
加により、いずれのａｐｏＣ−ＩＩの他の供給源の非存在下において、リポタン
パク質リパーゼＴＧリパーゼ活性は、有意に上昇した。興味深いことに、血清は
、再現可能かつ実質的に内皮リパーゼの活性を減少した。これより、ａｐｏＣ−
ＩＩもいずれの他の血清因子も、要求される内皮リパーゼに対する補因子ではな
いことが確認される。これはまた、血清中に内皮リパーゼの内因性インヒビター
が存在することを示す。
【０２６８】 図２８Ａおよび２８Ｂは、ＥＬの発現が、用量依存的様式においてヘパリン後
（ｐｏｓｔ−ｈｅｐａｒｉｎ）血漿ホスホリパーゼ活性を増加したことを示す。
３つの異なる用量（１×１０11、３×１０10または１×１０10の粒子）のＡｄｈ
ＥＬのマウスへの注射により、ヘパリン後の血漿にＥＬタンパク質が存在するよ
うになった。６８ｋＤおよび４０ｋＤの主なバンドならびに５５ｋＤの小さいバ
ンドが観察された（図２８Ａ）。６８ｋＤのバンドは、ＥＬの全長グリコシル化
型であると考えられ、そして４０ｋＤのバンドは、タンパク質分解フラグメント
と考えられる。ウエスタンブロットによって評価された血漿中のＥＬタンパク質
の量は、注射されたベクターの用量と比例している（図２８Ｂ）。異なるレベル
のヒトＥＬの発現は、Ａｄｎｕｌｌ注射マウスと比較して、ヘパリン後血漿ホス
ホリパーゼ活性に有意かつ用量依存的な増加を引き起こした（それぞれ、９７７
９＋／−７３３、６５０１＋／−１２９９、３９６３＋／−７９６ｎｍｏｌ．ｍ
ｌ-1．ｈｒ-1対９５２＋／−２５８ｎｍｏｌ．ｍｏ-1．ｈｒ-1）。ヘパリン後ホ
スホリパーゼ活性は、ヒトＥＬタンパク質のレベルと相関していた（６８ｋＤの
バンドについて（ｒ＝０．９８、Ｐ＜０．０１）、５５ｋＤのバンドについて（
ｒ＝０．８３、Ｐ＜０．０５）、および４０ｋＤのバンドについて（ｒ＝０．９
４、Ｐ＜０．０５））。
【０２６９】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、例示的なＰＣＲ増幅で使用されるプライマーの配列（配列番号１７〜
３１）を示す。
【図２】 図２は、ＬＩＰＧ遺伝子ｃＤＮＡを含むディファレンシャルディスプレイＲＴ
−ＰＣＲ産物の核酸配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を示す。この増幅で使用される２個のプライマーに対応する配列に、下線を引く
。この終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを、四角で囲む。このＧＡＡＴ
ＴＣモチーフおよび隣接配列は、この産物がクローン化されるｐＣＲＩＩベクタ
ー由来のものである。
【図３】 図３は、ＬＩＰＧ ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥ伸長物の核酸配列（配列番号３）
および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。この増幅で使用される２個のプ
ライマーに対応する配列に、下線を引く。このＧＡＡＴＴＣモチーフおよび隣接
配列は、この産物がクローン化されるｐＣＲＩＩベクター由来のものである。
【図４】 図４は、ＬＩＰＧ遺伝子の完全オープンリーディングフレーム（ＬＬＧＸＬ）
を含むｃＤＮＡの配列（配列番号７）を示す。この開始コドン（ＡＴＧ）および
終止コドン（ＴＧＡ）を四角で囲う。発現ベクターの構築に使用される、Ｄｒａ
Ｉ部位（ＴＴＴＡＡＡ）およびＳｒｆＩ部位（ＧＣＣＣＧＧＧＣ）に、下線を引
く。
【図５】 図５は、ＬＬＧＸＬタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。予
想されるシグナル配列に、下線を引く。
【図６】 図６は、トリアシルグリセロールリパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーのタン
パク質配列アライメント（配列番号１３〜１５）を示す。影の部分の残基は、Ｌ
ＬＧＸＬタンパク質（配列番号８）と同一である。ヒトＬＩＰＧ（ＥＬ）の推定
アミノ酸配列を１番上の線に提供し、そしてＴＧリパーゼファミリーの他の主な
メンバー（ＬＰＬ、ＨＬおよびＰＬ）と比較する。ファミリー少なくとも１つの
他のメンバーの残基と同じである、ＥＬ残基に影を付け、そして残りのファミリ
ーのメンバーの残基と対応させる。アミノ酸は、シークエンスされたタンパク質
の開始残基で開始する変換に従って、番号付けする。シグナルペプチドの予想さ
れる切断部位は、アミノ酸残基の間の実線で印を付ける。活性なセリンを含むＧ
ＸＳＸＧリパーゼモチーフを、四角で囲う。触媒作用に関与する３組（ｃａｔａ
ｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）のアミノ酸に、アスタリスクで印をつける。変換され
たシステインを、黒丸で印をつける。強力なＮ−結合グルコシル化部位を、矢印
で印をつける。リッド領域（ｌｉｄ ｒｅｇｉｏｎ）を太線で示す。ギャップは
、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを使用してアライメント値を最大化するようにこの
配列に導入させた。
【図７】 図７は、ＴＨＰ−１細胞中のＬＩＰＧ ｍＲＮＡのノーザン分析を示す。細胞
を、ＰＭＡまたはＰＭＡのいずれか、および酸化ＬＤＬ（ＰＭＡ＋ｏｘＬＤＬ）
を用いて刺激した。左の数字は、ＲＮＡ標準（キロベース）の位置を示す。
【図８】 図８は、ヒト組織のＬＰＬと比較するＬＩＰＧ ｍＲＮＡの発現のノーザンブ
ロット分析を示す。示されるヒト組織由来のｍＲＮＡを含むブロットを、記載さ
れるように放射標識しＬＰＬプローグおよびβアクチン（ＡＣＴＢ）プローブと
共にインキュベートした。
【図９】 図９は、培養された細胞株のノーザンブロット分析を示す。左側のパネル（レ
ーン１〜６）を、ＬＩＰＧ（ＥＬ）プローブでハイブリダイズし、そして右側の
パネル（レーン７〜１２）を、ＬＰＬプローブでハイブリダイズした。レーン１
、７（未刺激のＨＵＶＥＣ）；レーン２、８（ＰＭＡで刺激されたＨＵＶＥＣ）
；レーン３、９（トロンビンで刺激されたＨＵＶＥＣ）；レーン４，１０（未刺
激のＨＣＡＥＣ）；レーン５、１１（ＰＭＡで刺激されたＨＣＡＥＣ）；レーン
６、１２（ＰＭＡで刺激されたＴＨＰ−１）。
【図１０】 図１０は、免疫化ペプチドの配列（配列番号１６）およびＬＬＧＸＬタンパク
質配列との関係を示す。このペプチドを、影を付けた四角の中に示す。末端シス
テインを、キャリアタンパク質にペプチドを結合する目的で導入した。
【図１１】 図１１は、ＨＵＶＥＣおよびＨＣＡＥＣ由来の馴化培地を、ウサギの抗ＥＬペ
プチド抗血清を用いて、イムノブロット分析に供した場合に得られる結果を示す
。レーン１（未馴化培地）；レーン２（未刺激ＨＵＶＥＣ）；レーン３（ＰＭＡ
で刺激されたＨＵＶＥＣ）；レーン４（未刺激ＨＣＡＥＣ）；レーン５（ＰＭＡ
で刺激された（ＨＣＡＥＣ）。
【図１２】 図１２は、ＬＬＧＮまたはＬＬＧＸＬのｃＤＮＡ含むか、あるいはＤＮＡを含
まない（Ｍｏｃｋ）、発現ベクターで一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ−
７細胞由来の馴化培地中におけるヘパリン−セファロース結合タンパク質のウエ
スタン分析を示す。ＰＭＡ刺激した内皮細胞（ＨＣＡＥＣ＋ＰＭＡ）由来のタン
パク質を、サイズ参照のため用いた。左側の数字は、主な免疫反応性タンパク質
の見かけ上の分子量を示し、タンパク質標準と比較して分子量を決定する。
【図１３】 図１３は、ウサギのＬＩＰＧ ＰＣＲ産物の配列（ＲＬＬＧ．配列、配列番号
１２）およびウサギのＬＩＰＧ ＰＣＲ産物とヒトｃＤＮＡの対応する配列（Ｌ
ＬＧ７７４２Ａ）との間の配列アライメントを示す。同じヌクレオチドに、影を
つけた。
【図１４】 図１４は、ホスファチジルコリン基質を使用するヒトＥＬ−ＡＳ、ＥＬおよび
ＬＰＬのホスホリパーゼＡ活性を示す。アッセイを実施するために、ｐｃＤＮＡ
３．０／ＬＩＰＧ−ＡＳ、ＬＩＰＧ、またはＬＰＬ発現構築物のいずれかで一過
的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から採取される馴化培地（７００μ
ｌ）を、以下に記載されるようにホスホリパーゼ活性について３連でアッセイし
た。３７℃で２時間インキュベートした後、この反応を終結させ、そして１４Ｃ
で標識化した遊離脂肪酸を抽出し、そして産生された遊離脂肪酸の量を決定する
ために計測した。
【図１５】 図１５は、トリオレイン基質を使用するヒトのＥＬ−ＡＳ、ＥＬおよびＬＰＬ
のトリアシルグリセリドリパーゼの活性を示す。このアッセイを実施するために
、ｐｃＤＮＡ３．０／ＬＩＰＧ−ＡＳ、ＬＩＰＧ、またはＬＰＬ発現構築物のい
ずれかで一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から採取される馴化培
地（７００μｌ）を、以下に記載されるようにトリグリセリド活性について３連
でアッセイした。３７℃で２時間インキュベートした後、この反応を終結させ、
そして１４Ｃで標識化した遊離脂肪酸を抽出し、そして産生された遊離脂肪酸の
量を決定するために測定した。
【図１６】 図１６は、ＬＩＰＧおよびＬＰＬプローブの、異なる種由来のゲノムＤＮＡへ
のハイブリダイゼーションを示す。
【図１７】 図１７は、ＡｄｈＥＬ注射の５日後の野生型マウスの肝臓でのＬＩＰＧの発現
を示す。レーン１（Ａｄｎｕｌｌを注射されたマウス由来の肝臓）；レーン２（
ＡｄｈＥＬを注射されたマウス由来の肝臓）。
【図１８】 図１８は、ＡｄｈＥＬ−およびＡｄｎｕｌｌ−注射の野生型マウスのＨＤＬコ
レステロールの血漿レベルを示す。
【図１９】 図１９は、注射前（左）および注射の１４日後（右）のベースラインでのＡｄ
ｈＥＬおよびＡｄｎｕｌｌを注射された野生型マウスのリポタンパク質プロフィ
ールを示す。
【図２０】 図２０は、ＡｄｎｕｌｌまたはＡｄｈＥＬを注射した後の、ヒトＡｐｏＡ−Ｉ
トランスジェニックマウスにおけるＨＤＬコレステロールレベルを示す。
【図２１】 図２１は、ＡｄｎｕｌｌまたはＡｄｈＥＬを注射した後の、ヒトＡｐｏＡ−１
トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏＡ−Ｉレベルを示す。
【図２２】 図２２は、ＶＬＤＬ／ＬＤＬコレステロールレベルに対する、ＬＤＬレセプタ
ー欠損マウスにおけるＡｄｈＥＬの注射の効果を示す。
【図２３】 図２３は、ＨＤＬコレステロールレベルに対する、ＨＤＬレセプター欠損マウ
スにおけるＡｄｈＥＬの注射の効果を示す。
【図２４】 図２４は、ＬＩＰＧ（ＥＬ）に対するグリコシダーゼおよびツニカマイシン効
果を実証する、ＥＬのウエスタンブロット分析である。レーンは、左から右へと
順番に以下の通りである：未処理ＥＬコントロール；ＥｎｄｏＦ処理ＥＬ；Ｅｎ
ｄｏＨ処理ＥＬ；ノイラミニダーゼ処理ＥＬ；マーカー（血漿サンプル）；ＥＬ
未処理溶解物；ＥＬツニカマイシン処理溶解物；ＥＬ未処理ペレット；ＥＬツニ
カマイシン処理ペレット；ＥＬ未処理培地；ＥＬツニカマイシン処理培地（マー
カー）；血漿。
【図２５】 図２５は、ヘパリン投与のＥＬに対する効果を示すウエスタンブロットである
。「前」レーンは、ヘパリン注射前にマウスから採取した血液サンプルである；
「後」レーンは、ヘパリン注射後に採取した血液サンプルである。「コントロー
ルウイルス」は、ＥＬを含まなかった；「ＥＬウイルス」は、ＥＬを発現するア
デノウイルスベクターであった。
【図２６】 図２６Ａおよび２６Ｂは、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＨＬ（肝リパ
ーゼ）およびＥＬ（内皮リパーゼ）のトリグリセリダーゼ活性（図２６Ａ）およ
びホスホリパーゼ活性（図２６Ｂ）を示す棒グラフである。
【図２７】 図２７Ａおよび２７Ｂは、リポタンパク質リパーゼのトリグリセリダーゼ活性
（図２７Ａ）および内皮リパーゼのトリグリセリダーゼ活性（図２７Ｂ）に対す
る、ヒト血清の効果を示すグラフである。
【図２８】 図２８Ａおよび図２８Ｂは、異なるウイルス用量でのＥＬの発現を示す。図２
８Ａは、異なるウイルス用量で存在するＥＬを示すウエスタンブロットである。
図２８Ｂは、異なるウイルス投薬量でのホスホリパーゼ活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 ４Ｃ０８７ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/64 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバー シティ オブ ペンシルベニア アメリカ合衆国 19104 ペンシルベニア， フィラデルフィア，サウス サーティシク スス ストリート 133 (72)発明者 ジェイ， マイケル アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19038， グレンサイド， ノース リンウッド アベニュー 142 (72)発明者 リンチ， ケビン ジェイ． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19446， ランズデイル， ウエスト ハンプシャ ー ドライブ 17904 (72)発明者 アミン， ディリップ ブイ． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19446， ランズデイル， アレンバック レーン 2204 (72)発明者 ドーン， キム−アン チ アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19475， スプリング シティー， キャスリン レーン 76 (72)発明者 マーチャディア， ドーン アメリカ合衆国 ニュー ジャージー 08043， ボーアヒース， ウッドストー ン ドライブ 58 (72)発明者 モージエ， シリル アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19102， フィラデルフィア， サウス 15ティー エイチ ストリート 348 (72)発明者 レイダー， ダニエル ジェイ． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19146， フィラデルフィア， ケイター ストリ ート 2103 (72)発明者 クローイエック， ジョン エイ． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19406， ガルフ ミルズ， アーデン ロード 360 (72)発明者 サウス， ビクトリア ジェイ． アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19426， カレッジビル， リージェンツ ロード 122 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CA25 DA20 DA36 DA62 DA69 FB01 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 EA02 HA17 4C084 AA02 AA17 BA44 DC32 ZC202 ZC332 4C085 AA13 AA14 BB22 DD62 DD63 DD88 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 ZC20 ZC33 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZC20 ZC33

Claims (65)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者においてＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させるための組成
    物であって、アンチセンス核酸を含む、組成物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の組成物であって、前記アンチセンス核酸を
    含む発現ベクターを含む、組成物。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の組成物であって、前記発現ベクターが、レ
    トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター
    、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選択さ
    れる、組成物。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の組成物であって、前記アンチセンス核酸が
    合成アンチセンス核酸である、組成物。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の組成物であって、前記アンチセンス核酸が
    オリゴヌクレオチドである、組成物。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の組成物であって、前記オリゴヌクレオチド
    が化学的に改変された塩基を含む、組成物。
  7. 【請求項７】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を低下させ
    るための組成物であって、該ＬＩＰＧポリペプチドに結合し得かつ該ＬＩＰＧポ
    リペプチドの酵素的活性を低下させ得る、中和抗体を含む、組成物。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の組成物であって、前記抗体をコードするＤ
    ＮＡ配列を含む発現ベクターを含む、組成物。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の組成物であって、前記発現ベクターが、レ
    トロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター
    、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選択さ
    れる、組成物。
  10. 【請求項１０】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を低下さ
    せるための組成物であって、細胞内結合タンパク質を含む、組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の組成物であって、前記細胞内結合タン
    パク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む、組成物。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の組成物であって、前記発現ベクターが
    、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
    ター、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選
    択される、組成物。
  13. 【請求項１３】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を阻害し
    得るインヒビターを含む、組成物。
  14. 【請求項１４】 患者においてＬＩＰＧ遺伝子の発現を低下させ得るインヒ
    ビターを含む、組成物。
  15. 【請求項１５】 患者においてＬＩＰＧの発現を低下させ得る組成物であっ
    て、リボザイムを含む、組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の組成物であって、前記リボザイムをコ
    ードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む、組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組成物であって、前記発現ベクターが
    、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
    ター、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選
    択される、組成物。
  18. 【請求項１８】 請求項１５に記載の組成物であって、前記リボザイムがハ
    ンマーヘッドリボザイムである、組成物。
  19. 【請求項１９】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドのレベルを増加させる
    ための組成物であって、該ＬＩＰＧポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む
    発現ベクターを含む、組成物。
  20. 【請求項２０】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドのレベルを増加させる
    ための組成物であって、ＬＩＰＧポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリ
    アを含む、組成物。
  21. 【請求項２１】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドのレベルを増加させる
    ための組成物であって、ＬＩＰＧ遺伝子の発現を増加させ得るエンハンサーを含
    む、組成物。
  22. 【請求項２２】 患者においてＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を増加さ
    せるための組成物であって、該ＬＩＰＧポリペプチドに結合しかつ該ＬＩＰＧポ
    リペプチドの酵素的活性を増強するエンハンサーを含む、組成物。
  23. 【請求項２３】 患者において高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロ
    ールおよびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを上昇させるため医薬の製造のため
    の組成物の使用であって、該組成物はＬＩＰＧの酵素的活性を低下させる、使用
    。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物が患者にお
    いてＬＩＰＧポリペプチドのレベルを低下させる、使用。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物がアンチセ
    ンス核酸を含む、使用。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の使用であって、前記アンチセンス核酸
    が合成アンチセンス核酸である、使用。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の使用であって、前記アンチセンス核酸
    が該核酸の化学的安定性を増加するように改変されている、使用。
  28. 【請求項２８】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物が、ＬＩＰ
    Ｇポリペプチドに結合し得かつ該ＬＩＰＧポリペプチドの酵素的活性を低下させ
    得る、中和抗体を含む、使用。
  29. 【請求項２９】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物が、ＬＩＰ
    Ｇポリペプチドの酵素的活性を阻害するインヒビターを含む、使用。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の使用であって、前記インヒビターがＬ
    ＩＰＧ遺伝子の発現を低下させる化合物を含む、使用。
  31. 【請求項３１】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    をコードするｍＲＮＡを切断するリボザイムを含む、使用。
  32. 【請求項３２】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物がＤＮＡ分
    子およびリポソームを含む、使用。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の使用であって、前記リポソームがカチ
    オン性リポソームである、使用。
  34. 【請求項３４】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物がＤＮＡお
    よび薬学的に受容可能なキャリアを含む、使用。
  35. 【請求項３５】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物が発現ベク
    ターを含む、使用。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
    ー、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選択
    される、使用。
  37. 【請求項３７】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターがリ
    ボザイムをコードするＤＮＡ配列を含む、使用。
  38. 【請求項３８】 請求項３７に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
    ー、ヘルペスウイルスベクター、および裸のＤＮＡベクターからなる群より選択
    される、使用。
  39. 【請求項３９】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターがア
    ンチセンス核酸をコードするＤＮＡ配列を含む、使用。
  40. 【請求項４０】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターがＬ
    ＩＰＧに結合する中和抗体をコードするＤＮＡ配列を含む、使用。
  41. 【請求項４１】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    ＬＩＰＧに結合し得かつ該ＬＩＰＧを中和し得る細胞内結合タンパク質をコード
    するＤＮＡ配列を含む、使用。
  42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の使用であって、前記細胞内結合タンパ
    ク質が抗体である、使用。
  43. 【請求項４３】 請求項３５に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    ＬＩＰＧの酵素的活性を阻害する阻害分子をコードするＤＮＡ配列を含む、使用
    。
  44. 【請求項４４】 請求項２３に記載の使用であって、前記組成物は、前記患
    者においてアポリポタンパク質ＡＩを発現し得る組成物と組み合わせて投与され
    る、使用。
  45. 【請求項４５】 患者において超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレス
    テロールのレベルを低下させるための医薬の製造のための組成物の使用であって
    、該組成物はＬＩＰＧの酵素的活性を増加させ得る、使用。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアである、使用。
  47. 【請求項４７】 請求項４５に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドを発現し得る発現ベクターである、使用。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス
    ベクターからなる群より選択される、使用。
  49. 【請求項４９】 請求項４５に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドの酵素的活性を増強するエンハンサーを含む、使用。
  50. 【請求項５０】 請求項４５に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む、使用。
  51. 【請求項５１】 患者において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロ
    ールのレベルを低下させるための医薬の製造のための組成物の使用であって、該
    組成物はＬＩＰＧの酵素的活性を増加させ得る、使用。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアである、使用。
  53. 【請求項５３】 請求項５１に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドを発現し得る発現ベクターである、使用。
  54. 【請求項５４】 請求項５３に記載の使用であって、前記発現ベクターが、
    レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス
    ベクターからなる群より選択される、使用。
  55. 【請求項５５】 請求項５３に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    ポリペプチドの酵素的活性を増強するエンハンサーを含む、使用。
  56. 【請求項５６】 請求項５３に記載の使用であって、前記組成物がＬＩＰＧ
    遺伝子の発現を増加させるエンハンサーを含む、使用。
  57. 【請求項５７】 患者においてＬＤＬコレステロールのレベルを低下させる
    ための医薬の製造のためのエンハンサーの使用であって、該エンハンサーは、Ｌ
    ＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩとの
    間の酵素的反応に対して、ＬＩＰＧポリペプチドとＬＤＬコレステロールとの間
    の酵素的反応を優先的に増強する、使用。
  58. 【請求項５８】 患者においてＶＬＤＬコレステロールのレベルを低下させ
    るための医薬の製造のためのエンハンサーの使用であって、該エンハンサーは、
    ＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩと
    の間の酵素的反応に対して、ＬＩＰＧポリペプチドとＶＬＤＬコレステロールと
    の間の酵素的反応を優先的に増強する、使用。
  59. 【請求項５９】 低ＨＤＬコレステロールレベルおよび低アポリポタンパク
    質ＡＩレベルへの傾向を予測するための方法であって、患者から得た組織サンプ
    ル中のＬＩＰＧポリペプチドのレベルを測定する工程を包含する、方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５９に記載の方法であって、前記組織が血液である
    、方法。
  61. 【請求項６１】 請求項６０に記載の方法であって、前記サンプル中のＬＩ
    ＰＧポリペプチドのレベルをイムノアッセイにより測定する、方法。
  62. 【請求項６２】 請求項５９に記載の方法であって、ＬＩＰＧ ｍＲＮＡの
    レベルを測定することによって前記ＬＩＰＧポリペプチドのレベルを測定する、
    方法。
  63. 【請求項６３】 試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロー
    ルおよびアポリポタンパク質ＡＩとの間の酵素的反応を阻害し得るか否かを決定
    するための方法であって、以下： （Ａ）第１のサンプル中のＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク質Ａ
    Ｉのレベルを、別のサンプル中のＨＤＬコレステロールおよびアポリポタンパク
    質ＡＩのレベルと比較する工程であって、該第１のサンプルが（１）ＨＤＬコレ
    ステロールおよびアポリポタンパク質ＡＩ、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、およ
    び（３）該試験化合物を含み、そして該別のサンプルが（４）ＨＤＬコレステロ
    ールおよびアポリポタンパク質ＡＩおよび（５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む、
    工程；ならびに （Ｂ）該第１のサンプルが該別のサンプルよりも高いＨＤＬコレステロールお
    よびアポリポタンパク質ＡＩのレベルを有するか否かを観察することによって、
    該試験化合物が該ＬＩＰＧポリペプチドとＨＤＬコレステロールおよびアポリポ
    タンパク質ＡＩとの間の酵素的反応を阻害する際に有効であるか否かを同定する
    工程、 を包含する、方法。
  64. 【請求項６４】 試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＶＬＤＬコレステロ
    ールとの間の酵素的反応を増強し得るか否かを決定するための方法であって、以
    下： （Ａ）第１のサンプル中のＶＬＤＬコレステロールのレベルを、別のサンプル
    中のＶＬＤＬコレステロールのレベルと比較する工程であって、該第１のサンプ
    ルが（１）ＶＬＤＬコレステロール、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、および（３
    ）該試験化合物を含み、そして該別のサンプルが（４）ＶＬＤＬコレステロール
    および（５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む、工程；ならびに （Ｂ）該第１のサンプルが該別のサンプルよりも低いＶＬＤＬコレステロール
    のレベルを有するか否かを観察することによって、該試験化合物が該ＬＩＰＧポ
    リペプチドとＶＬＤＬコレステロールとの間の酵素的反応を増強する際に有効で
    あるか否かを同定する工程、 を包含する、方法。
  65. 【請求項６５】 試験化合物がＬＩＰＧポリペプチドとＬＤＬコレステロー
    ルとの間の酵素的反応を増強し得るか否かを決定するための方法であって、以下
    ： （Ａ）第１のサンプル中のＬＤＬコレステロールのレベルを、別のサンプル中
    のＬＤＬコレステロールのレベルと比較する工程であって、該第１のサンプルが
    （１）ＬＤＬコレステロール、（２）ＬＩＰＧポリペプチド、および（３）該試
    験化合物を含み、そして該別のサンプルが（４）ＬＤＬコレステロールおよび（
    ５）ＬＩＰＧポリペプチドを含む、工程；ならびに （Ｂ）該第１のサンプルが該別のサンプルよりも低いＬＤＬコレステロールの
    レベルを有するか否かを観察することによって、該試験化合物が該ＬＩＰＧポリ
    ペプチドとＬＤＬコレステロールとの間の酵素的反応を増強する際に有効である
    か否かを同定する工程、 を包含する、方法。
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