CN102628060A

CN102628060A - 一种低脂奶的生产方法

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Publication number: CN102628060A
Application number: CN2012100783500A
Authority: CN
Inventors: 王媛媛; 赵要风; 李宁
Original assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2012-08-08

Abstract

本发明提供了一种低脂奶的生产方法，其是通过基因工程技术，将编码人源脂蛋白脂酶(LPL)的基因转入哺乳动物中，利用该转基因动物生产低脂奶。本发明利用构建LPL乳腺特异表达载体，制备转基因动物，特别是转基因奶牛或奶山羊，生产出乳脂率显著减低的奶制品，对于提高奶制品的应用价值具有重要意义。

Description

一种低脂奶的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用转基因哺乳动物生产低脂奶的方法。

背景技术

脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)是将血浆乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解为甘油和游离脂防酸反应的限速酶，其与机体肥胖与否密切相关，在血浆脂蛋白的运输过程和能量代谢方面也起着重要作用。它主要由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等实质细胞分泌，在泌乳期的乳腺组织中亦有合成，并且乳腺组织是LPL在各物种中表达的保守位点。

LPL是已报告的基因突变最丰富的蛋白质之一，至今已达143种突变，且90％以上的突变位点均位于功能区。LPL基因的突变有可能影响其催化功能，LPL活性或量的改变及功能的失衡与脂代谢紊乱(高甘油三酯血症、低高密度脂蛋白血症)、动脉粥样硬化、冠心病、肥胖等一系列临床症状有关。此外，LPL基因已作为动物脂肪代谢和沉积以及畜禽肉质研究的重要基因，与畜禽瘦肉率的提高，调节动物的体重，影响肉的风味等方面有着密切关系。近年来LPL成为研究的热点，构建了各种用于研究其功能的转基因小鼠模型，其中包括全身表达的，或分别在脂肪、肌肉、心脏、肝等组织中特异表达的，但没有发现LPL在乳腺中特异表达的相关报道。

随着人们生活水平的提高，对健康优质奶品的要求也越来越高，人们更加关注牛奶中的优质蛋白质，而希望牛奶中所含的脂肪更少。但是目前市场上的脱脂牛奶，在脱脂的过程中脂溶性的维生素也会被除去，主要是维生素A和维生素D，影响了人体对钙质的吸收，而且如果完全脱除牛奶中的脂肪，会破坏其营养价值，影响牛奶的口感和风味。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程技术，制备转基因动物，并利用该转基因动物生产低脂奶。

为了实现本发明目的，本发明的一种低脂奶的生产方法，其是将编码人源脂蛋白脂酶的基因转入哺乳动物中，并利用该转基因动物生产低脂奶。

优选地，前述方法是将编码人源脂蛋白脂酶的基因通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法等方法转入哺乳动物中，并利用该转基因动物生产低脂奶。

其中，人源脂蛋白脂酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

优选地，编码上述人源脂蛋白脂酶的基因序列如SEQ ID No.2所示。

前述的方法，所述哺乳动物为牛、羊、猪、马、兔、鹿、狗等。

本发明还提供含有编码人源脂蛋白脂酶的基因的乳腺特异表达载体。优选的出发载体为pBC1。

本发明还提供含有上述表达载体的转基因哺乳动物细胞。

本发明还提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。

本发明进一步提供一种制备转基因家畜的方法，其是将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。

本发明利用构建LPL乳腺特异表达载体，制备转基因动物，特别是转基因奶牛或奶山羊，生产出乳脂率显著减低的奶制品，对于提高奶制品的应用价值具有重要意义。

附图说明

图1为线性化且去除了pBC1原核载体骨架结构部分后的特异性人LPL乳腺表达载体。

图2为NotI和SalI双酶切表达载体pBC-hLPL线性化后的载体凝胶电泳结果，其中，M为λ/HindIII分子量标准，1和2为线性化后的载体片段。

图3为转基因小鼠制备流程。

图4为PCR检测F0代阳性转基因小鼠结果，其中，M为1kb梯度DNA分子量标准，转基因小鼠基因组分别为11、16、17、21、25、27、31和37，WT为阴性对照，P为阳性质粒。

图5为Southern blotting检测阳性转基因小鼠结果，其中，M：为1kb梯度DNA分子量标准，WT为野生型小鼠对照，P1、P5、P10分别为相当于1、5、10个拷贝的阳性质粒对照杂交结果，11、16、17、21、25、27、31和37分别为F0代阳性小鼠对应基因组的杂交结果。

图6为Western Blot检测转基因小鼠乳样中人源LPL表达情况，其中，H为人奶样品杂交结果，WT为野生型小鼠乳样杂交对照，21、25、27、31和37为F0代阳性小鼠乳样杂交结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所使用的载体、菌种、试剂及其来源：

pBC1载体(Invitrogen)；SC120026载体购于Origene公司(含有人脂蛋白脂酶cDNA序列)；引物合成及序列测定由上海生工完成；实验动物选用昆明小白鼠，购自北京实验动物中心；Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均为Biolabs公司产品；质粒纯化及回收试剂盒为Omega公司产品；同位素标记试剂盒购于Promega公司；放射性同位素α-32P-dCTP以及Southern杂交膜购自美国Amersham biosciences公司；HRP标记的抗人脂蛋白脂酶的一抗购自Santa Cruz公司；LPL含量检测ELISA试剂盒购自GBD公司；甘油三酯检测试剂盒购自中生北控公司；BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天公司；乳糖检测试剂盒购自Boehringer公司；酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。实施例中所使用的其它技术手段，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1人LPL乳腺表达载体构建

以含有人脂蛋白脂酶cDNA序列的SC120026质粒(Origene公司)为模板，设计一对引物：Hlpl-F(5′-CCGCTCGAGGAGATGGAGAGCAAAGCCCT-3′)和Hlpl-R(5′-CCGCTCGAGTGTGGTAATAAAATGTTGT-3′)，进行PCR扩增，得到人源LPL基因cDNA序列，该序列如SEQ ID No.2所示。用来扩增LPLcDNA序列的引物Hlpl-F和Hlpl-R序列内均含有XhoI酶切位点。将扩增序列回收，克隆到经过XhoI酶切的商业化乳腺表达载体pBC1(Invitrogen公司)中，利用PCR鉴定插入片段序列及方向，并进行测序鉴定，最终将含有正确插入片段的表达载体命名为pBC-hLPL，所采用的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等技术均为常规分子生物学实验操作步骤，详见《分子克隆(第三版)》。

实施例2转基因小鼠模型的建立及检测

将构建好的表达载体pBC-hLPL进行酶切，去除原核载体的骨架结构，然后将该线性化后的载体进行显微注射。线性化后的人LPL乳腺表达载体结构如图1所示，其包含了珠蛋白隔离子、β-酪蛋白启动子和β-酪蛋白3’调控区，目的基因人源LPL cDNA克隆到pBC1载体中的XhoI酶切位点上。

2.1显微注射生产转基因小鼠

研究表明，用显微注射法生产转基因小鼠，线性DNA比环状DNA整合效率高，因此要将构建好的表达载体pBC-hLPL酶切去除无用的原核部分同时线性化后进行显微注射。

用NotI/SalI酶切表达载体pBC-hLPL去掉原核载体骨架结构部分。然后将酶切DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。切下含有19.1kb大小的目的片段的凝胶，利用可回收10kb以上DNA片段的凝胶回收试剂盒(Omega)进行回收。将回收片段溶于TE溶液(10mmol/LTris·Cl(pH7.4)，0.1mmol/L EDTA，用Milli-Q水配制)中，在紫外分光光度计中测定260nm和280nm下OD比值并计算浓度，所得OD260/OD280比值在1.8以上，可用于注射小鼠受精卵。将含有外源基因片段的TE溶液稀释至终浓度2.5μg/ml，注射到小鼠受精卵的雄原核，然后移植到同期发情的假孕母鼠输卵管中。转基因小鼠制备过程参见《小鼠胚胎操作实验指南》(A.纳吉等著，2004，科学出版社)。

转基因小鼠制备流程如图3所示。

2.2转基因小鼠的PCR检测

取3周龄转基因小鼠的尾巴组织样品，提取DNA。以提取的基因组为模板，利用人源LPL cDNA序列设计的引物(L-F：5’-GTGGCTACCTGTCATTTCAAT-3’，L-R：5’-ACAGAGAGTCGATGAAGAG-3’)在转基因阳性小鼠中可以扩增出648bp片段，以野生型小鼠基因组为阴性对照，以载体pBC-hLPL为阳性对照。扩增条件为94℃，30sec；58℃，30sec；72℃，90sec；30个循环。1.0％琼脂糖电泳观察结果。PCR在F0代42只小鼠中检测出8只阳性小鼠，结果见图4，第11、16、17、21、25、27、31和37号小鼠均为转基因阳性小鼠。

2.3转基因小鼠的Southern blotting检测

将PCR检测为阳性的F0代8只转基因小鼠，剪尾部组织提取基因组，取10μg用EcoRI内切酶消化，以EcoRI酶切的野生型小鼠基因组为阴性对照，EcoRI酶切的pBC-hLPL注射载体片段为阳性对照，杂交探针是以人LPLcDNA为模板利用PCR扩增后回收1.1kb的基因片段(引物为S-F：5’-ATTCTGGATCTTTCGGACTGA-3’，S-R：5’-ATTCCAAGCCTGATGATGTTA-3’)。将样品低压慢速电泳，采用碱转移方法将DNA从琼脂糖转移至尼龙膜，将尼龙膜上DNA的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，加入预杂交液，于65℃预杂交不短于1hr，加入经过加热变性的α-P³²dCTP同位素标记的探针，65℃杂交12～16hr，洗膜后用保鲜膜包好，置于暗盒中，暗室中压上X光片，于-70℃放射自显影，12小时冲洗X光片观察结果。Southern blotting结果见图5，结果表明阳性小鼠Southern blotting检测结果与PCR检测结果一致。

实施例3重组人LPL在转基因小鼠乳样中的表达分析

3.1转基因小鼠乳样的Western blotting检测

采集F0代21、25、27、31和37号小鼠泌乳中期的奶样，野生型小鼠乳汁作为阴性对照，人奶为阳性对照。乳汁在小鼠出生后第8-12天采集，采集前将母鼠与仔鼠分离3小时以上，并向腹腔注射一定剂量的催产素。将离心后去除乳脂和酪蛋白的乳清在10％的SDS-PAGE上电泳后转到尼龙膜上。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人的LPL一抗进行Western Blot分析，即可检测重组人LPL在转基因小鼠乳汁中的表达。重组人LPL与人奶中LPL分子量大小相一致，约为56kDa。结果如图6所示。

3.2转基因小鼠乳样中LPL表达量分析

采用ELISA法对转基因小鼠乳汁中的LPL表达量进行分析，选取了10只转基因小鼠泌乳中期的奶样进行检测。由于采用的商业化的ELISA试剂盒并不能有效地区分人源与鼠源的LPL，因此本发明检测了6只野生型小鼠泌乳中期的奶样作为对照(具体操作按说明书)。转基因鼠表达的LPL含量极显著高于野生型鼠奶中的LPL含量，最高表达量达到0.16mg/ml。

3.3转基因小鼠奶样中LPL的活性检测

采用与上述3.2中使用的同样一批转基因和野生型的鼠奶进行酶活性的检测。使用含³H标记三油酸甘油酯的甘油乳剂为底物，标本与底物37℃孵育反应后通过抽提将甘油酯与游离脂肪酸分开，脂解产生的游离脂肪酸的放射活性与标本中脂肪酶的活性成正比的放射性同位素标记法测定体外LPL活性。具体操作可参考文献(张爱宏，刘国庆，放射性同位素标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用，中国动脉硬化杂志，2003年第11卷第6期)。转基因鼠奶中LPL活性在泌乳期各阶段均显著高于野生型鼠奶，具体结果见表1。

表1转基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳早、中、晚三期LPL表达量和活性统计表

*P＜0.05；***P＜0.001。以上数据代表平均值±SD。

实施例4转基因鼠奶中主要成分检测

4.1奶中甘油三酯，蛋白，乳糖含量的检测

采用与实施例3中3.2使用的同样一批转基因和野生型的鼠奶进行奶中各物质成分的检测。对奶中三种主要成分的检测均采用的是商业化试剂盒，具体操作步骤依照说明书。转基因鼠奶中在泌乳各个时期的甘油三酯含量较在野生型鼠奶中显著降低，而蛋白和乳糖的含量在转基因和野生型鼠奶中变化不大，无显著性差异，具体结果见表2。

表2转基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳早、中、晚三期甘油三酯、蛋白、乳糖含量统计表

*P＜0.05；***P＜0.001。以上数据代表平均值±SD。

实施例5利用转基因奶牛生产低脂奶

转基因家畜制备方法可以采用显微注射法、体细胞克隆法、精子载体法等方法，转基因家畜包括转基因牛、转基因羊、转基因猪等。本发明优选体细胞克隆法制备转基因奶牛，但不限于体细胞克隆法，也不限于转基因奶牛的制备。

取牛耳组织接种培养出成纤维细胞(参见《细胞试验指南》)，将线性化的pBC-hLPL载体(见实施例1和2)与线性化的pCI-neo(美国Promega公司)混合于TE溶液，将混合溶液用电穿孔转染法转入到牛的胎儿成纤维细胞中，经G418筛选及PCR鉴定，确定为转基因阳性细胞。

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，取直径2-8毫米的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体，将卵丘-卵母细胞-复合体以50枚/孔放入含成熟液(含有10w/w％FBS、0.01U/ml猪促卵泡激素+0.01U/ml猪生长激素+1μg/ml雌二醇的M199培养基)的四孔板中，在38.5℃、5％CO₂培养箱中成熟培养18-20h后，将成熟的卵母细胞放入0.1％透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体。

将带有第一极体的卵母细胞移入含7.5μg/ml细胞松驰素B、10w/w％FBS的M199培养基中，在200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将透明带切一小口，再用内径为20μm的玻璃管将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入含(质量百分含量)20％FBS的M199培养基中洗三遍后，置于培养箱中备用，获得转有抗体双链基因及标记载体的转基因细胞。

将血清饥饿2-4d的转基因细胞用0.25％trypsin消化2-4min，选择直径为10-12μm的体细胞用20μm直径玻璃管将其移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入Zimmerman液中平衡3-5min后放入融合槽内，转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触面与电场垂直，同时在直流脉冲的场强为2.5kV/cm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合(融合仪为BTX公司的ECM-2001)后，迅速将重构胚移入含20％(质量百分含量)FBS的M199培养液中。再将重构胚放入5μmol/L Ionomycin液中，4min后换到1.9mmol/L6-DMAP液中，4h后再移入含5％(质量百分含量)FBS CR1aa液中，在38.5℃、5％CO₂培养箱中培养2天。

将形态优良的第7d的克隆囊胚用非手术法移入已同期发情的受体母牛的子宫内，具体做法参考郭志勤等，《家畜胚胎工程》。受体母牛选择的都是经产母牛，在移植后的第60d进行直肠检测，以确定妊娠。

妊娠期满后对出生的克隆牛进行PCR和Southern检测，检测方法同实施例2和3的方法，获得共整合pBC-hLPL的转基因奶牛。转基因奶牛性成熟后，对其进行配种，产犊后收集奶样进行乳成分分析，结果表明，在泌乳各个时期的甘油三酯含量较在对照非转基因牛奶中显著降低，而蛋白和乳糖的含量则无显著性差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种低脂奶的生产方法，其特征在于，其是将编码人源脂蛋白脂酶的基因转入哺乳动物中，并利用该转基因动物生产低脂奶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其是将编码人源脂蛋白脂酶的基因通过显微注射法、体细胞克隆法或精子载体法转入哺乳动物中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，人源脂蛋白脂酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，编码人源脂蛋白脂酶的基因序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为牛、羊、猪、马、兔、鹿、狗。

6.含有编码人源脂蛋白脂酶的基因的乳腺特异表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为pBC1。

8.含有权利要求6或7所述表达载体的转基因哺乳动物细胞。

9.一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求8所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。

10.一种制备转基因家畜的方法，其是将权利要求9所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。