JP2001511346A

JP2001511346A - ヒト副甲状腺ホルモンの組換え発現ベクター

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Publication number: JP2001511346A
Application number: JP2000504251A
Authority: JP
Inventors: ジュン，ユン−キュン; パク，ドー−ホン; チュン，ソー−イル
Original assignee: モガンバイオテクノロジーリサーチインスティチュート
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2001-08-14
Anticipated expiration: 2018-06-05
Also published as: CA2298106C; CN1154727C; KR100230578B1; CA2298106A1; US6500647B1; ATE398178T1; JP3480836B2; WO1999005277A1; AU7789498A; KR19990011970A; EP1012289B1; DE69839607D1; CN1275163A; AU728703B2; ES2306476T3; EP1012289A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリブロキナーゼ遺伝子断片、あるいはその突然変異体を融合パートナーとして含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された組換え微生物、および前記微生物をＬ-アラビノース含有培地で培養することによりヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法に関する。本発明の組換え発現ベクターで形質転換された微生物中で、Ｌ-アラビノースによる融合タンパク質の発現を誘導する段階を含む製造方法により、天然のヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持している組換えヒトＰＴＨを、正確な誘導調節を通して高収率で製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、ホスホリブロキナーゼを融合パートナーとして利用する発現ベクタ
ーおよび、それを用いたヒト副甲状腺ホルモンの製造方法に関する。より具体的
には、本発明はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリブロキナーゼ遺伝子断片、あるいはその突然変
異体を融合パートナーとして含有するＬ-アラビノースの誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を挿入して製造し
た組換え発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された組換え微生物、および
該微生物をＬ-アラビノースの含有培地で培養することにより、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法に関する。

【０００２】（背景技術）骨粗しょう症は、骨の質量が正常より顕著に減少して骨の組織が弱まり、軽い
衝撃にも骨折等の有害な影響を来す疾患である。医学や生物学等の発展のため、
老人人口が増加するにつれて骨粗しょう症の患者も増えてきている。かつ、核家
族化の傾向に従い一人暮らしの老人が増えている今日、骨粗しょう症は重要な社
会問題になっている。

【０００３】一般に、正常な骨の組織の場合には、骨を破壊する細胞の破骨細胞と、骨を生
成する細胞の骨芽細胞の活性が、互いに均衡をなして、常に骨の組織を改造して
いる。正常人の場合にも、年を取るにつれて、破骨細胞の機能が骨芽細胞の機能
を上回るようになり、骨密度が全般的に減少するが、骨粗しょう症の患者の場合
には、その破骨細胞と骨芽細胞の活性間の均衡破壊が正常人に比べて遙かに激し
い。

【０００４】破骨細胞と骨芽細胞の活性間の均衡破壊の原因については明確に知られていな
いが、閉経期以後の女性たちに多く見られるタイプ１骨粗しょう症の場合には、
女性ホルモンであるエストロゲンの閉経後の分泌減少に起因することが知られて
いる。従って、タイプ１骨粗しょう症の治療にはエストロゲンを投与しているが
、乳癌、子宮内膜癌等の発病率が高まる等の副作用のため、エストロゲンの使用
を好まない患者が多い。また、タイプ１骨粗しょう症とは異なる原因により発病
すると知られているタイプ２骨粗しょう症には、エストロゲンの使用では治療効
果が得られない。

【０００５】前記タイプ１骨粗しょう症の治療剤であるエストロゲンの短所を補完し、エス
トロゲンで治療効果を得られないタイプ２骨粗しょう症を治療する薬剤としては
、破骨細胞の活性を抑制して骨組織の吸収を阻害する作用をするカルシトニンが
用いられる。しかしながら、エストロゲンとカルシトニンは両方とも既に損失さ
れた骨質量を増加させる効果はなく、単に骨密度がそれ以上減少しないように予
防する機能のみを有しているため、効果的な骨粗しょう症の治療剤としては不適
当である。

【０００６】最近、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）が骨密度の減少を予防するだけでなく、骨
密度を増大する効果がある上、副作用も報告されていないため、骨粗しょう症の
優秀な治療剤として注目されている。副甲状腺の主細胞で生産され、アミノ酸１
１５個からなるプレプロ副甲状腺ホルモン（プレプロＰＴＨ）は、小胞体を経な
がら切断されてアミノ酸９２個からなるプロＰＴＨに変形する。続いて、プロＰ
ＴＨは、ゴルジ器官を経ながら再び切断されてアミノ酸８４個からなる成熟ＰＴ
Ｈになる。上記過程を経て合成されたＰＴＨは、血中に分泌された後、標的器官
である骨と腎臓に輸送される。分泌されたＰＴＨの半減期は１８分にすぎない。

【０００７】ＰＴＨは、骨細胞膜のＣａ²⁺ポンプを活性化して骨からのＣａＨＰＯ₄の移動を促進することにより、数分以内に血中Ｃａ²⁺濃度を増加させる。更に、ＰＴＨ
が分泌し続けると既に形成されている破骨細胞を活性化し、新しい破骨細胞の生
成を促進し、骨芽細胞の活動を一時的に抑えることにより、骨でのＣａ²⁺沈着を
抑制して、Ｃａ²⁺の放出を促進し、血中へのＣａ²⁺および、ＰＯ₄ ^3-の分泌をも増加させる。一方、ＰＴＨは血中Ｃａ²⁺濃度による強力なフィードバックメカニ
ズムで分泌が調節される。すなわち、血中のＣａ²⁺濃度が短時間に１０％減少す
ると、ＰＴＨの分泌は２倍に増加する。長時間にわたって血中Ｃａ²⁺濃度が低い
状況では、１％のＣａ²⁺濃度減少によってもＰＴＨの分泌は２倍に増加する。こ
のようなＰＴＨの生体内調節機能とは別に、ＰＴＨを外部から間欠的に小量づつ
投与する場合、骨形成を促進することが報告された（参照：Ｔａｍ、Ｃ．Ｓ．ら
，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１０：５０６-５１２（１９８２））。このような骨形成の促進機能が、ＰＴＨを骨粗しょう症の治療剤として用いる根拠と
なっている。ＰＴＨの骨形成の促進機能について正確なメカニズムは知られてい
ないが、投与されたＰＴＨによる（ｉｎｖｉｖｏ）ＰＴＨ分泌の抑制、骨芽細
胞に対する直接的な機能促進、インスリン様成長因子-１（ＩＧＦ-１）、及び形
質転換成長因子-β（ＴＧＦ-β）等の成長因子を介した間接的な骨形成促進等の
仮説が提示されている。

【０００８】ところが、ＰＴＨを利用して骨粗しょう症を治療するには、ＰＴＨを長期間に
渡って投与する必要があるが、今まではＰＴＨの大量生産方法が確立していなか
ったため、骨粗しょう症の治療剤としてＰＴＨを実用化するのは非常に困難であ
った。故に、本発明者らは遺伝子工学的方法を利用して組換え微生物よりＰＴＨ
を大量製造するための研究を行い、ＰＴＨアミノ末端のＳｅｒ-Ｖａｌ-Ｓｅｒア
ミノ酸配列がＰＴＨの生物学的活性に必須であることが報告されているため、大
腸菌でのＰＴＨ発現時、アミノ末端のメチオニン残基の除去に努力した。

【０００９】組換えタンパク質発現の宿主として幅広く用いられている大腸菌には、発現タ
ンパク質のアミノ末端の翻訳開始のメチオニンを除去する酵素であるメチオニン
特異的アミノペプチダーゼがある。ところが、外来タンパク質が大腸菌内で大量
発現する際にはアミノ末端のメチオニンが完全に除去されない場合がある。この
ような現状はアミノ末端のアミノ酸配列が生物学的活性に大きな影響を及ぼすＰ
ＴＨのようなタンパク質の発現系を構築するためには、必ず解決されるべきな事
項である。

【００１０】前述の問題を解決するため、主に次の３つの方法が用いられる：第一、目的タ
ンパク質のアミノ末端に分泌シグナル配列を融合させた形態で発現させることに
より、目的タンパク質をアミノ末端の切断（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）された形態
で大腸菌のペリプラズムや培養培地に分泌されるようにする方法である。当該方
法は細胞内活性を利用して成熟タンパク質を得ることができるのが長所である反
面、発現収率が比較的低いのが短所である。第二は、目的タンパク質を大腸菌で
単独発現させ、アミノ末端にメチオニンが付いている状態で大腸菌から分離し、
これをアミノペプチダーゼで切断して成熟タンパク質を得る方法である。当該方
法は、アミノ末端のメチオニンが除去されたタンパク質とメチオニンが付いてい
るタンパク質との分離が難しいため、タンパク質の精製工程が複雑であるのが短
所である。第三は、目的タンパク質を他のタンパク質との融合形態で発現させ、
融合タンパク質を大腸菌より分離した後、酵素、または化学物質を用いて融合タ
ンパク質より融合されたパートナーを除去することにより、成熟目的タンパク質
を製造する方法である。当該方法はアミノ末端のメチオニンが除去された目的タ
ンパク質を提供するだけでなく、目的タンパク質の発現効率も増大させることが
長所である。

【００１１】なお、融合タンパク質より目的タンパク質を得る方法は、化学物質を用いた切
断方法と酵素を用いた切断方法とに大きく分けることができる。このうち、化学
物質を用いた切断方法は、低価の化学物質を用いるため、費用節減の長所がある
が、切断部に対する特異性が低いため、切断時に目的タンパク質以外の様々な種
類の副産物が生じ、当該副産物より目的タンパク質を分離および、精製する工程
が追加要求されるとの短所がある。反面、酵素を用いた切断方法は切断部位に対
する特異性に優れ、化学物質を用いた切断方法の問題点を解決することができる
が、用いられる酵素が高価であるため、この方法を産業的規模で活用するのは無
理である。

【００１２】組換えタンパク質の大量生産の工程を研究している多くの研究者らは、融合タ
ンパク質より目的タンパク質を切断するための酵素を経済的に用いようと試して
きた。ところが、このような目的で、現在開発されて用いられているタンパク質
の分解酵素であるＸａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ等は大量生産には限
界があり、酵素を用いた切断方法は、様々の長所にもかかわらず、産業的な水準
では広く利用されていないのが実情である。従って、酵素を用いた切断方法によ
り効率的に用いられる、すなわち経済的に大量生産できる第３の酵素が切実に要
求されてきた。血栓溶解剤といて用いられているセリンプロテアーゼであるウロ
キナーゼ（２本鎖のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター）の場合、
大量生産の工程が既に開発されており、大腸菌のような原核生物の発現系を用い
て活性のあるウロキナーゼを大量製造することができ（参照：Ｗ．Ｅ．Ｈｏｌｍ
ｅｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：９２３-９２９（１９８５））、前記Ｘａ因子等の他酵素に比べ、より経済的にウロキナーゼを大量生産して取得
するに成功した。故に、ウロキナーゼは融合タンパク質より経済的に目的タンパ
ク質を切断、分離する候補として提案されてきた。

【００１３】こうした状況下、本発明者らはタンパク質内でウロキナーゼによる特異的切断
部位になるアミノ酸配列を決定し、融合タンパク質の目的タンパク質と融合パー
トナーとの間に特異的なウロキナーゼの切断部位のアミノ酸配列である-Ｘ-Ｇｌ
ｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＬｅｕを表す）が存在する場合に切断効率が優秀であり、その中でも、-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇが存在する際に切断効率がもっとも優秀であることを発見した（参照：大韓民
国特許公開第９７-６４９５号）。

【００１４】（発明の開示）本発明者らは、組換え大腸菌よりアミノ末端のメチオニンが除去されたＰＴＨ
を大量製造するために鋭意努力した結果、ロドバクター・スフェロイデスのホス
ホリブロキナーゼ（以下、’ＰＲＫ’）の遺伝子断片、あるいはその突然変異体
を融合パートナーとして含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼによる特異的切断部位を有し、大腸菌でのユニバーサルコードンを使用する
ヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して発現ベクターを構築し、大腸菌を該発現ベクターで
形質転換させ、形質転換細胞から融合タンパク質を分離し、ウロキナーゼで融合
タンパク質を切断することにより、天然のヒトＰＴＨの活性を有する組換えＰＴ
Ｈを大量製造することができることを確認し、本発明を完成するに至った。

【００１５】従って、本発明の主な目的は、ＰＲＫ遺伝子断片、あるいはその突然変異体を
含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子を挿入して製造した組換え発現ベクターを提供することであ
る。本発明の他の目的は、上記発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供
することである。本発明のもう一つの目的は、前記形質転換された組換え微生物をＬ-アラビノース含有培地で培養することにより、ヒトＰＴＨを大量製造する方法を提供する
ことである。

【００１６】まず、ヒトＰＴＨ遺伝子は、天然型ヒトＰＴＨのアミノ酸配列に翻訳され、大
腸菌で使用頻度の高いコドンを含む塩基配列を有するように調製した。また、融
合タンパク質から所望のタンパク質を容易に取得するため、融合パートナーと所
望のタンパク質との間にウロキナーゼ特異的切断部位、すなわち-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＬｅｕを表す）のア
ミノ酸配列、最も好ましくは-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのアミノ酸配列が位置するように、ウロキナーゼ特異的切断部位（参照：大韓民国特許公開第９７-６４９５号）を合成し、ヒトＰＴＨ遺伝子の前に挿入した。

【００１７】次に、前記ウロキナーゼ特異的切断部位‐ヒトＰＴＨ遺伝子と、ＰＲＫのアミ
ノ末端から１５３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターｐ１
５３ＰＴＨを調製した。続いて、前記発現ベクターよりＰＲＫ遺伝子断片を単離
し、ＰＲＫアミノ酸配列の一部を改変した後、再びヒトＰＴＨ遺伝子と融合させ
、発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨを調製した。

【００１８】上記の発現ベクターは、ＰＲＫのうち、そのアミノ末端から１５３個のアミノ
酸を有するＰＲＫ断片を融合パートナーとして用いているため、当該発現ベクタ
ーで形質転換された微生物において多量の融合タンパク質（ＰＲＫ断片に融合し
たヒトＰＴＨ）が発現された。この際、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸
菌は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌に比べて、同一またはやや増加し
た量の融合タンパク質を発現し、アミノ酸置換は融合タンパク質の発現に影響し
ないことが示唆された。一方、前述のウロキナーゼ特異的切断部位‐ヒトＰＴＨ
遺伝子と、ＰＲＫの完全長遺伝子を含む発現ベクターもまた、融合タンパク質を
発現することができた。

【００１９】さらに、部分的に改変されたＰＲＫ断片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質
、および天然型ＰＲＫ断片とヒトＰＴＨからなる融合タンパク質を各々ウロキナ
ーゼで切断した結果、部分的に改変されたＰＲＫ断片とヒトＰＴＨからなる融合
タンパク質では、ウロキナーゼによる非特異的な反応が減少し、同量の融合タン
パク質を用いる同一条件での切断反応から、遥かに多くのＰＴＨが得られること
が示された。

【００２０】ＰＲＫに融合したヒトＰＴＨは形質転換体内で封入体の形態で発現された。そ
の封入体を単離してウロキナーゼで処理した後、ＰＲＫ／ＰＴＨ融合タンパク質
から組換えヒトＰＴＨを分離および精製した。

【００２１】一方では、生体内においてＰＴＨは腎臓および無機質化した骨からのカルシウ
ムの再吸収を促進し、血中カルシウム濃度を増加させることにより、カルシウム
の恒常性を調節する活性を有しているが、前記活性は、ＰＴＨが骨細胞や腎臓細
胞の表面にある高親和性受容体に結合し、該受容体に結合しているアデニル酸シ
クラーゼを活性化することにより、ＡＴＰから生じた細胞内の２次シグナル伝達
物質であるｃＡＭＰ（cyclic AMP）により媒介されると報告されている（参照：
Donahue、H.J.et al.,Endocrinology,126:1471-1477(1990)）。このような報告に
基き、本発明者らは、上述のように精製された組換えヒトＰＴＨが天然ＰＴＨの
活性を有しているかどうかを調べるため、骨細胞または腎臓細胞に存在する受容
体に対するＰＴＨの結合力と細胞内ｃＡＭＰ形成の刺激度を測定した。その結果
、上述のように調製された組換えヒトＰＴＨは、受容体に結合して細胞内ｃＡＭ
Ｐ生産を刺激することができることが分かった。

【００２２】従って、本発明の組換え発現ベクターｐ１５３ＰＴＨまたはｐｍ１５３ＰＴＨ
で形質転換された微生物を培養し、Ｌ-アラビノースで発現を誘導することにより、天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持している組換えヒトＰＴＨを
、正確な誘導調節を通して高収率で調製することができる。

【００２３】以下、実施例を通して本発明をさらに具体的に説明する。但し、これらの実施
例は、本発明の技術的範囲を限定するものではない。〔実施例１〕発現ベクターΔｐＭＡの構築サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhymurium）LT2株よりＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した後、ｐＵＣ１９ベクターに挿入
してｐＵＣ-サルモネラライブラリーを調製した。ｐＵＣ-サルモネラライブラリ
ーを大腸菌ＤＨ５α株（E.coli DH5α F’endA1 hsdR17(rk^-mk⁺)supE44thi-1 re
cA1 gyrA(Nair)U169D(lacZAY-argF)deoR）に導入し、形質転換された大腸菌コロ
ニーを得た。一方、アラビノースオペロン中のａｒａＢ-Ｃの調節部位とａｒａＣタンパク質のアミノ末端３個のアミノ酸を含む塩基配列に対して相補的な２種
のオリゴヌクレオチド、すなわち１５量体である5’-GCCATCGTCTTACTC-3’（配列番号１５）と１４量体である5’-GCGTTTCAGCCATG-3’（配列番号１６）を合成
した。これらをプローブとして使用するコロニーハイブリダイゼーションを実施
し、上述のように調製されたｐＵＣ-サルモネラライブラリーからａｒａＢ-Ａお
よびａｒａＣ遺伝子を含むクローンを選択した。

【００２４】上記のように選択されたプラスミドｐＵＣ-ａｒａをＡｖａＩ制限酵素で消化し、クレノウ酵素で平滑末端化した後、ＳａｌＩ制限酵素で処理して２．５２ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＵＣ１１９（参照：Maniatis et al.、Molecu
lar Cloning 2nd ed.,1989）ベクターをＨｉｎｄIIIで消化し、クレノウ酵素で平滑末端化した後、ＳａｌＩで処理して３．１８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。こ
うして得られた２つの断片、すなわち２．５２ｋｂｐのＤＮＡ断片と３．１８ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、５．７ｋｂｐのｐＵＣ-ａｒａＢＣベクターを調製した。こうして得たベクターから一本鎖ＤＮＡを得た後、
ａｒａＢプロモーターの下流に位置するａｒａＢタンパク質の構造遺伝子の翻訳
開始コドンにＮｄｅＩ制限部位のヌクレオチド配列である5’-CATATG-3’(配列番号１７）を挿入し、ａｒａＢプロモーターのシャイン‐ダルガノヌクレオチド
配列が5’-TAAGGAGG-3’（配列番号１８）に変換されるように、部位特異的突然
変異を行った。

【００２５】このように改変されたａｒａクローンを再びＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで消化し
、ａｒａＢ-Ｃ遺伝子を含む２．６１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、ｐＵＣ１８からの２２８ｂｐの多クローニング部位を含むＭｐＫＬ１０ベクターをＮｄ
ｅＩで消化し、クレノウ酵素で平滑末端化してＴ４ＤＮＡリガーゼで再連結させ
ることにより、該ベクター内に存在するＮｄｅＩ制限部位を除去した。こうして
得たベクターをＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで消化し、多クローニング部位、転写終
結シグナル、アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌内ＤＮＡ複製起点を含む２
．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【００２６】上記で得られた２．６１ｋｂｐのＤＮＡ断片と２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連
結した後、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＮｃｏＩ制限部位を含み、両末端に
各々ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドにＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、約５．３２ｋｂｐのベクターΔｐＭＡを構築
した（参照：大韓民国特許公告第９７-５５８５号）。このように構築されたΔ ｐＭＡの遺伝子地図を図１に示した。

【００２７】〔実施例２〕ヒトＰＴＨ遺伝子の調製天然型ヒトＰＴＨをコードし、大腸菌で使用頻度が高いコドンを含むヌクレオ
チド配列を有するヒトＰＴＨ遺伝子を調製するため、まず、ＰＴＨのセンス鎖と
アンチセンス鎖に相当する１２個のオリゴヌクレオチド（配列番号１；配列番号
２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号
８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；
配列番号１４）を合成した（参照：図２）。前記１２個のオリゴマーを選択的に
、リン酸化、アニーリング、溶出（elution）、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。まず、自己連結を防ぐために、オリゴマー＃２，＃４，＃５，＃
８，＃９，＃１２および＃１３の末端をリン酸化し、ＤＮＡアニーリングを行っ
て＃１：＃２，＃３：＃４，＃５：＃６，＃７：＃８，＃９：＃１０，＃１１：
＃１２および、＃１３：＃１４の対を生成させた。次いで、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動して正しくアニールされた二本鎖のオリゴマー等I、II、III、IV、
V、VIおよびVIIのみを溶出した。二本鎖オリゴマーVIIの３’末端はＸｂａＩ制限部位の付着末端を有し、発現ベクターのＸｂａＩ部位に容易にクローニングす
ることができる。

【００２８】こうして溶出した二本鎖オリゴマーの末端をリン酸化した後、IIとIII、IVとV
、VIとVIIを各々Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、正しく連結されたII／III、IV／V、VI／VIIのＤＮＡ断片を溶出した。続いて、II／III、IV／V、VI／VIIの３つの断片の末端をリン酸化し、IとII／II
I、IV／VとVI／VIIをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、再びI／II／IIIとIV／V／VI
／VIIを連結し、最終的にウロキナーゼ特異的切断部位を含み、大腸菌での使用頻度が高いコドンを含む塩基配列を有するヒトＰＴＨ遺伝子を合成した（参照：
図３）。図３で、括弧内の数字は塩基数を示す。二本鎖オリゴマーIはウロキナーゼ特異的切断部位を含み、その合成については、下記で詳細に記載する。

【００２９】融合タンパク質からＰＴＨを容易に分離するため、次のようにして、ウロキナ
ーゼ特異的切断部位を合成して、融合パートナーとＰＴＨ遺伝子の間に挿入した
。このウロキナーゼ特異的切断部位はＧｌｙ-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇを含み（参照：大韓民国特許公開第９７-６４９５号）、前記配列の前に比較的小分子量のアミノ酸を付加して柔軟性（flexibility）を与えた。また、５’末端は、いずれの標的遺伝子であってもそのオープンリーディングフレームに合わせて容易に
融合できるように、平滑末端を与える３個の制限酵素、ＳｍａＩ、ＳｃａＩおよ
びＰｖｕIIの認識部位を含んでいた。ウロキナーゼ特異的切断部位とヒトＰＴＨ
遺伝子の連結部位にはＢｇｌII制限部位を配置した。このような条件を満足させ
るセンスオリゴマー＃１とアンチセンスオリゴマー＃２を合成して連結させた後
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、正しくアニールした二本鎖オリゴマ
ーIを溶出した。二本鎖オリゴマーIは両末端ともに平滑であるため、アニーリン
グの前に＃２オリゴマーのみをリン酸化させ、オリゴマーIの二量体や三量体の形成を防止した。二本鎖オリゴマーIは、上述のように、合成されたヒトＰＴＨ遺伝子の前に位置するようにＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。

【００３０】〔実施例３〕ＰＲＫ遺伝子を含む発現ベクターｐＰＲＫの構築ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）菌株から染色体ＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、ＰＲＫ遺伝子を
増幅した。この際、実施例１で調製したＬ-アラビノース誘導性発現ベクターであるΔｐＭＡへのＰＲＫ遺伝子のサブクローニングを容易にするため、ＰＲＫの
アミノ末端領域に相当するプライマーに翻訳開始コドンとＮｄｅＩ制限部位を、
また、ＰＲＫのカルボキシ末端領域に相当するプライマーに翻訳終結コドンとＸ
ｂａＩ制限部位を導入し、各々５’および３’プライマーとして用いた：５’プ
ライマー：5’-GGAGCTGAATACATATGAGCAAG-3’（配列番号１９）；３’プライマー：5’ーCCCCCGGGTCTAGATCAGGCCA-3’（配列番号２０）。

【００３１】ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動した後に、８７３ｂｐのＰＲＫ
遺伝子を単離し、ＮｄｅＩとＸｂａIで消化した後、ＮｄｅＩとＸｂａＩで処理したΔｐＭＡベクターの断片にサブクローニングすることにより、発現ベクター
ｐＰＲＫを構築した（参照：図４）。こうして構築した発現ベクターで大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１（E.coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16Δ(lac) X74rpsL(Str^r) hsdR2(rk^-mk⁺) mcrA mcrB1）を形質転換し、その形質転換体から３２ｋＤａの分子量を有するＰＲＫタンパク質が発現されることを確認した。

【００３２】〔実施例４〕ＰＲＫ遺伝子の断片化完全長ＰＲＫ遺伝子を融合パートナーとして用いる場合、融合パートナー部分
が大きいために、最終的に所望のタンパク質の収率が低くなるという短所がある
ので、融合パートナーを小さくして所望のタンパク質の収率を増大するため、Ｐ
ＲＫの大きさを様々に減少させた。まだＰＲＫの構造が明らかになっていないた
め、Chou & Fasmanの方法（参照：Adv.Enzymol,47:45-148(1978):Annu.Rev.Bioc
hem.,47:251-276(1978)）に基づくコンピュータープログラム（PROSIS,Hitachi,
JAPAN）を用いてＰＲＫタンパク質の２次構造を予測した後、タンパク質の構造的安定性を破壊しないようにαーヘリックス（α-helix）やβー鎖（β-strand ）等の２次構造が形成されないと予想される２つの領域（各々ＰＲＫのアミノ末
端から１１３および１５３番目のアミノ酸までを含む領域、以下、各々「１１３
ＰＲＫ」および「１５３ＰＲＫ」という）を選定した。

【００３３】ＰＲＫ遺伝子断片を増幅するため、５’プライマーとしては実施例３で使用し
た５’プライマーを使用し、３’プライマーとしては、各々アミノ酸１１３番お
よび１５３番を含むヌクレオチド配列に相当し、サブクローニングが容易にでき
るようにＢａｍＨＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチドを使用した（１１３ＰＲ
Ｋ増幅用３’プライマー：5’-GGTGAAGGATCCGGGCGCCACGCCGGTー3’（配列番号２１）：１５３ＰＲＫ増幅用５’プライマー：5’-CGGAACGGATCCGATCTTGAGGTCGGCー
3’（配列番号２２））（参照：図５）。

【００３４】こうして増幅されたＰＲＫ遺伝子断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、
１％アガロースゲル電気泳動を行って単離した。こうして単離した１１３ＰＲＫおよび１５３ＰＲＫのＰＣＲ産物（遺伝子断片
）をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、同一の酵素で消化されたΔｐＭＡに挿入してｐ１１３ＰＲＫおよびｐ１５３ＰＲＫを構築した。前記発現ベク
ター、すなわちｐ１１３ＰＲＫおよびｐ１５３ＰＲＫで大腸菌ＭＣ１０６１（E.
coli MC1061,F-araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16Δ(lac) X74rpsL(Str^r)hsdR2(rk^-mk⁺)mcrA mcrB1）を形質転換して培養した。その結果、
タンパク質１１３ＰＲＫおよび１５３ＰＲＫは正常に大量発現されることが分か
った。従って、タンパク質１１３ＰＲＫおよび１５３ＰＲＫをコードする遺伝子
断片は、融合パートナーとして適切に用いることができることが確認された。

【００３５】〔実施例５〕発現ベクターｐ１５３ＰＴＨの構築およびＰＴＨの発現大腸菌の複製開始抑制タンパク質であるＩｃｉＡタンパク質のうち、アミノ末
端から１６６番アミノ酸までをコードするＤＮＡ断片を融合パートナーとして用
い、ウロキナーゼ特異的制限部位を含むヒトＧＨの発現ベクターｐＡＩ５ＵＧ（
参照：大韓民国特許公開第９７-６５０５号）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのウロキナーゼ（以下、「ＵＫ」）制限部位とヒト
ＧＨ遺伝子を含むベクター断片を得た。実施例４で単離した１５３ＰＲＫ遺伝子
断片を、こうして得られたベクター中にサブクローニングし、発現ベクターｐ１
５３ｈＧＨを構築した（参照：図６）。

【００３６】一方、大腸菌の複製開始抑制タンパク質であるＩｃｉＡをコードするＩｃｉＡ
遺伝子のうち、アミノ末端から１６６番アミノ酸のコドンの部位にＳｍａＩ制限
部位を挿入したΔｐＭＡ５Ｓ（参照：大韓民国特許公開第９７-６５０５号、ＫＣＣＭ-１００７２）をＳｍａＩとＸｂａＩで消化し、５００ｂｐのＩｃｉＡ遺伝子断片を含むベクター断片を得た。実施例２で合成したウロキナーゼ特異的切
断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子を、こうして得られたベクター断片中にサブクロ
ーニングし、ａｒａＢプロモーター系の制御下でＩｃｉＡタンパク質のアミノ末
端１６６アミノ酸断片との融合形態でヒトＰＴＨを発現できるベクターｐＡＩ５
ＵＰを構築した（参照：図７、大韓民国特許公開第９７-６４９７号、ＫＣＣＭ-
１００７１）。

【００３７】こうして構築されたベクターｐＡＩ５ＵＰをＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化し、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒトＰＴＨ遺伝子断片を得た。こうして
得た断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIでｐ１５３ｈＧＨを消化して調製されるベクター断片にサブクローニングし、アミノ末端から１５３番アミノ酸までで構
成された１５３ＰＲＫを融合パートナーとし、ウロキナーゼ特異的切断部位を含
むヒトＰＴＨ融合タンパク質を、ａｒａＢプロモーター系の制御下で発現するベ
クターｐ１５３ＰＴＨを構築した（参照：図８）。

【００３８】こうして構築した発現ベクターｐ１５３ＰＴＨで大腸菌ＭＣ１０６１（F-araD
139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)X74 rpsL(Str^r)hsdR2(rk^-mk⁺)mcrA
mcrB1）を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ液体培地（培地１Ｌ当たり５ｇのＮａＣｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのバクトトリプトン、
５０ｍｇのアンピシリンが含まれる）にまき、３７℃で１８０ｒｐｍに一夜振と
う培養した。コンフルエントの培地を再びアンピシリンの含まれた新鮮なＬＢ液
体培地に最終１％の濃度になるまでまき、６００ｎｍで０．５の吸光度に達する
まで振とう培養した。次いで、最終濃度１％のＬ-アラビノースを培養液に添加して１５３ＰＲＫ／ＰＴＨ（以下、「１５３ＰＴＨ」）融合タンパク質の発現を
誘導した後、約２０時間振とう培養を続けた。

【００３９】大腸菌培養細胞の総タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した結果、Ｌ-アラビ
ノース誘導により大腸菌内で約２６ｋＤａの１５３ＰＴＨ融合タンパク質が高効
率で発現されることが分かった（参照：図９）。図９で、第１レーンおよび第２
レーンはｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％のＬ-アラビノースで誘導し、２０時間培養した後の総タンパク質を示し；Ｍレーンは標
準タンパク質マーカー（ＢＲＬ１６０４０-０１６、ＵＳＡ）を示す。

【００４０】発現ベクターｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）Ｍ
Ｃ１０６１を大腸菌（Escherichia coli）ＭＣ１０６１：ｐ１５３ＰＴＨと命名
し、１９９７年７月９日に、国際寄託機関である社団法人韓国種菌協会附設微生
物保存センター（ＫＣＣＭ）（大韓民国ソウル特別市西大門区新村洞１３４番地
）に、ＫＣＣＭー１０１０１として寄託されている。

【００４１】〔実施例６〕：１５３ＰＴＨ融合タンパク質の封入体の分離および切断実施例５のように、Ｌ-アラビノースで発現誘導した間に、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１（ＫＣＣＭ-１０１０１）中に発現される１５３ＰＴＨ融合タンパク質が封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）を形成す
るか調べた。遠心分離して収得した培養大腸菌をトリス緩衝液（０．１ｍＭＥ
ＤＴＡおよび、２５％の蔗糖を含む５０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．８）に懸
濁した。リゾチームを該細胞に添加し、氷浴で１．５時間インキュベートした。
その後、ＭｇＣｌ₂とＤＮａｓｅＩを該細胞に加え、さらに１．５時間反応させた。さらにその後、１％のデオキシコール酸と１．６％のＮｏｎｉｄｅｔＰ- ４０を含む緩衝液を該細胞に添加し、氷浴で１５分間攪拌し、超音波破砕（ｓｏ
ｎｉｃａｔｉｏｎ）で細胞を溶解した。前記細胞溶解液を遠心分離し、封入体画
分と水性画分に分け、封入体画分を０．５％のトリトンＸ-１００溶液で４回洗浄した。このようにして得られた封入体を８Ｍの尿素（ｕｒｅａ）溶液に入れ、
４℃で徐々に攪拌し、変性させた。封入体の分離過程中に採取したアリコートを
ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１０）。

【００４２】図１０で、第２レーンは細胞溶解液、第３レーンは細胞溶解液の上清を、第４
〜７レーンは封入体の洗浄液を、第８レーンは変性された封入体を各々示す。第
１レーンと第９レーンは標準タンパク質マーカーとして、各々ＢＲＬ１６０４
０-０１６（分子量順に列挙すると、４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋＤ、３．４ｋＤ）とＮＥＢ７７０７Ｌ（分子量順に列挙す
ると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋ
Ｄ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）を示す。図１０のように、１５３ＰＴＨ融合
タンパク質は大腸菌内で相当量発現され、全て封入体の形態で分離されることが
分かった。

【００４３】分離した１５３ＰＴＨ融合タンパク質の定量を行った後、１５３ＰＴＨ融合タ
ンパク質１００μｇにウロキナーゼを０．５μｇ添加し２５℃で１時間反応させ
、切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１１）。図１１では、第１レーンはコントロールとしてウロキナーゼを添加していない１５３ＰＴＨ融合
タンパク質を示し、第２レーンはウロキナーゼを添加した１５３ＰＴＨ融合タン
パク質を示す。Ｍレーンは標準タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ７７
０７Ｌ、分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋ
Ｄ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。１５３ＰＴＨ融
合タンパク質をウロキナーゼで切断する場合、１５３個のアミノ酸に相当する分
子量を有する融合パートナーと、８４個のアミノ酸に相当する分子量を有する目
的タンパク質であるＰＴＨタンパク質が得られるべきである。図１１に示される
ように、予想に従い、約１０ｋＤのＰＴＨタンパク質は現れることがわかった。
しかしながら、約１７ｋＤの１５３ＰＲＫのタンパク質フラグメント、すなわち
融合パートナーはほとんど現れず、より小さいサイズのタンパク質フラグメント
が現れることが示された。これは、ウロキナーゼによる非特異的切断が１５３Ｐ
ＲＫの１２個のアルギニン残基の数カ所で起こったことを示唆する。

【００４４】〔実施例７〕：発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨの構築およびそれを用いた発現１５３ＰＲＫのウロキナーゼによる追加的な切断を減らすため、このような追
加的な切断が起こりうる部位に位置するアルギニン残基を除去した。１５３ＰＴ
Ｈのウロキナーゼによる切断で、生成されるタンパク質断片の大きさを考慮する
と、ＰＲＫのアミノ末端から各々３０、３１、５８、５９、９４および、９６番
目のアルギニン残基で追加的な切断が生じる可能性があると予想し、これらのア
ルギニン残基を他のアミノ酸で置換しようとした。

【００４５】まず、発現ベクターｐ１５３ＰＴＨをＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素
で切断して分離した１５３ＰＴＨ遺伝子フラグメントを、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）をＳａｃＩＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉの制限酵素で処理することによって調製したベクターのフラグメントに挿入し
、一本鎖のＤＮＡを得ることのできるｐＳＫ（＋）１５３ＰＴＨという突然変異
用のプラスミドを得た（参照：図１２）。大腸菌ＣＪ２３６をｐＳＫ（＋）１５
３ＰＴＨで形質転換させた後、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等の方法（参照：Ｋｕ
ｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：
４８８-４９２（１９８５））で部位特異的な突然変異を行った。この際、用いられたミュータマー（ｍｕｔａｍｅｒ）は次のようである。

【００４６】３０／３１ミュータマー：５’-ｃｃｔｔｇａｃｃｃｃｃｔｃｇｃ（ｃ／ｇ）ｃａｃｇａａｇａｔｃｔｇｇｔｃｇａａｃー３’（配列番号２３）；５８／５９ミュータマー：５’ーｇｃｃｃｇｃｃｇｃａｔａｇｃ（ｇ／ｃ）ｃａｃｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｇ
ｃｃｔｔｃー３’（配列番号２４）；９４／９６ミュータマー：５’-ｇａｃｇｔａｇｇｔｃｃ（ｃ／ｇ）ｃｇｔｃａｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃｇｇｔｃｔｃｇｃｃー３’（配列番号２５）。

【００４７】これから３０、５８、９４番目のアルギニンが各々バリンで、５９、９６番目
のアルギニンが各々グリシンで置換された変異ベクターを製造し、ｐＳＫ（＋）
ｍ１５３ＰＴＨと命名した。ｐＳＫ（＋）ｍ１５３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨ
Ｉで切断することによって得られる変異１５３ＰＲＫのフラグメントと、発現ベ
クターｐ１５３ＰＴＨをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで処理して得られたウロキナーゼ
／ＰＴＨが含まれたベクターフラグメントをＴ４リガーゼで連結し、発現ベクタ
ーｐｍ１５３ＰＴＨを製造した（参照：図１２）。

【００４８】大腸菌ＭＣ１０６１（Ｆ-ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ-ｌｅｕ）７６９６ｇａ
ｌＥ１５ｇａｌＫ１６Ｄ（ｌａｃ）Ｘ７４ｒｐｓＬ（Ｓｔｒ^r）ｈｓｄＲ２（ｒｋ^-ｍｋ⁺）ｍｃｒＡｍｃｒＢ１）を発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで
形質転換させ、当該形質転換体を実施例５と同様の方法で培養した。ｍ１５３Ｐ
ＲＫ／ＰＴＨ（以下、’ｍ１５３ＰＴＨ’）融合タンパク質が発現されたことを
ＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した（参照：図１３）。図１３で、第１レーンは発現ベクターｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％のアラビノ
ースで誘導して２０時間培養した後の総タンパク質を、第２レーンは発現ベクタ
ーｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１を１％のアラビノー
スで誘導して２０時間培養した後の総タンパク質を、第３レーンは発現ベクター
ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０６１をアラビノースで誘導
する前の総タンパク質を各々ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した結果である。Ｍレーンは標準タンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ７７０７Ｌ（分子量順に列挙す
ると、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５
ｋＤ、６．５ｋＤ）。図１３に示されるように、ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換し
た大腸菌は、ｐ１５３ＰＴＨで形質転換した大腸菌に比べて同一、あるいはやや
増加した発現量を見せ、新たに導入されたアミノ酸置換による発現の減少は起こ
らないことが分かった。前記の発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
ｌｉ）ＭＣ１０６１：ｐｍ１５３ＰＴＨと命名し、１９９７年７月９日に、社団
法人韓国種菌協会附設微生物保存センター（ＫＣＣＭ）（大韓民国ソウル特別市
西大門区新村洞１３４番地）に、ＫＣＣＭー１０１０２として寄託されている。

【００４９】〔実施例８〕：ｍ１５３ＰＴＨの融合タンパク質封入体の分離および切断上記ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質が大腸菌内でどのように発現されるかを調
べるため、実施例６と同様の方法で封入体の分離過程中で採取したアリコートを
ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１４）。図１４では、第２レーンは細胞溶解液、第３レーンは細胞溶解液の上清を、第４〜７レーンは封入体の洗浄液を
、第８レーンは変性された封入体を各々示す。第１レーンと第９レーンは標準タ
ンパク質サイズマーカーとして、各々ＢＲＬ１６０４０-０１６（分子量順に列挙すると、４３ｋＤ、２９ｋＤ、１８．４ｋＤ、１４．３ｋＤ、６．２ｋＤ、
３．４ｋＤ）とＮＥＢ７７０７Ｌ（分子量順に列挙すると、１７５ｋＤ、８３
ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１６．５ｋＤ、６．
５ｋＤ、）を示す。図１４のように、１５３ＰＴＨ融合タンパク質と同様に、ｍ
１５３ＰＴＨ融合タンパク質も細胞内で封入体を形成することが分かった。

【００５０】実施例６と同様の方法で分離した融合タンパク質の定量を行った後、１５３Ｐ
ＴＨ、あるいはｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質１００μｇに０．５μｇのウロキ
ナーゼを各々添加して２５℃で１時間反応させた。切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１５）。図１５では、奇数のレーンはコントロールとし
てウロキナーゼを添加していない融合タンパク質を示し、偶数のレーンはウロキ
ナーゼを添加した融合タンパク質を示す。なお、第１および、２一レーンは１５
３ＰＴＨを、第３および、４レーンはｍ１５３ＰＴＨを示す。Ｍレーンは標準タ
ンパク質サイズマーカーである（ＮＥＢ７７０７Ｌ、分子量順に列挙すると、
１７５ｋＤ、８３ｋＤ、６２ｋＤ、４７．５ｋＤ、３２．５ｋＤ、２５ｋＤ、１
６．５ｋＤ、６．５ｋＤ、）。図１５に示すように、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパ
ク質のウロキナーゼ切断によれば、１５３ＰＴＨ融合タンパク質の同切断と比較
すると、ウロキナーゼによる非特異的切断が減少した。従って、同量の融合タン
パク質を使用し、同一の反応条件下では、１５３ＰＴＨ融合タンパク質よりもｍ
１５３ＰＴＨ融合タンパク質の方がより多い量のＰＴＨが得られることを確認し
た。

【００５１】さらに、ウロキナーゼによる１５３ＰＴＨとｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の
切断時間による切断効率を比較するため、融合タンパク質とウロキナーゼの濃度
比が２００：１になるようにし、２５℃で切断反応させた。アリコートを時間に
より採取し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した（参照：図１６）。図１６では、第１レーンはウロキナーゼによる切断時間が２０分、第２レーンは３０分、第３レー
ンは６０分、第４レーンは１５０分、第５レーンは１９０分、第６レーンは２２
５分、第７レーンは３６０分の時点での試料を各々示す。

【００５２】図１６のように、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質は反応６０分でほとんど完全
に切断されるが、１５３ＰＴＨ融合タンパク質は６時間が経過しても完全に切断
されなかった。上記切断比較実験より、ｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の場合には１５３ＰＴ
Ｈ融合タンパク質に比べ、時間および、ウロキナーゼ当たり得られるＰＴＨの収
率が増加することを確認した。

【００５３】〔実施例９〕：組換えヒトＰＴＨの精製実施例８と同様な方法で、分離した封入体に存在する、ｍ１５３ＰＴＨ融合タ
ンパク質の定量を行い、トリス緩衝液でタンパク質の濃度が１ｍｇ／ｍｌになる
ように希釈した。当該溶液にウロキナーゼ（プロテアーゼ）を添加し２５℃で反
応させ、融合タンパク質よりＰＴＨを分離した。図１７は、分離されたＰＴＨタ
ンパク質をイオン交換樹脂および、Ｃ₁₈逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで精製
し、これをＳＤＳ-ＰＡＧＥ（４-２０％グラジエントゲル）で分析した結果で
ある。図１７において、第１レーンは１５μｇの精製されたＰＴＨを、第２レー
ンは７．５μｇの精製されたＰＴＨを、第３レーンは３．７５μｇの精製された
ＰＴＨを各々示す。Ｍレーンは標準タンパク質サイズマーカーである（Ｎｏｖｅ
ｘＬＣ５６７７、分子量順に列挙すると、２００ｋＤ、１１６．３ｋＤ、９
７．４ｋＤ、６６．３ｋＤ、５５．４ｋＤ、３６．５ｋＤ、３１ｋＤ、２１．５
ｋＤ、１４．４ｋＤ、６ｋＤ、３．５ｋＤ）。図１７に示されるように、ヒト組
換えＰＴＨが単離された形態で純化されことが分かった。

【００５４】〔実施例１０〕：組換えヒトＰＴＨの活性測定ＵＭＲ１０６細胞系（ラットコ骨髄細胞様骨肉腫細胞系）は、骨芽細胞の特性
を研究する材料として多く用いられており、該細胞系は骨芽細胞の特徴であるア
ルカリホスファターゼの活性が高く、タイプ１コラーゲンを生産すると知られて
いる（参照：ＭｅｉｋａＡ．Ｆａｎｇｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ，１３１（５）：２１１３-２１１９（１９９２）；ＣｈｅｒｙｌＯ．Ｑｕｉｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（３６）：２
２３４２-２２３４７（１９９０））。従って、実施例９で精製した組換えヒトＰＴＨ（ｒｈＰＴＨ（１-８４））の試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）活性は、ＵＭＲ１０６細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６１）を用いてＰＴＨの受容体に対
する結合性試験と細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験で測定した。これに関し、コン
トロールとしては、合成ヒトＰＴＨ（ｓｈＰＴＨ（１-８４）、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＵＳＡ）を用い、アミノ末端とカルボキシル末端を有
する完全なＰＴＨのみが検出される”ＡｌｌｅｇｒｏＩｎｔａｃｔＰＴＨ
ＲＩＡｋｉｔ（ＮｉｃｈｏｌｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳａｎＪｕａｎＣ
ａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＵＳＡ）”を用い、ＰＴＨを定量した（参照：Ｓａｍｕｅ
ｌＲ．Ｎｕｓｓｂａｕｍｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，３３（８）：１３６４-１３６７（１９８７））。一方、ＵＭＲ１０６細胞株は、０．２％の重炭酸ナトリウムおよび、１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂ
ｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ、５６℃で３０分間熱処理したもの）を含むＤＭＥＭ（
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）で３７
℃、５％のＣＯ₂の条件で培養した（参照：ＲｏｎａｌｄＪ．Ｍｉｄｕｒａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（１８）：１３２００ー
１３２０６（１９９４））。

【００５５】〔実施例１０−１〕：ＰＴＨ受容体に対する結合性試験ＰＴＨ受容体に対する結合性試験は、次のように実施した（参照：Ｃｈｏｈｅ
ｉＳｈｉｇｅｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（８
）：３８６４-３８７１（１９８８））：２４ウェルプレート当たり１０⁵個のＵ
ＭＲ１０６細胞株をまき、４ないし８日間培養した。この際、培地は２日に１回
ずつ、試験の３日前からは毎日交替した。なお、カルボキシ末端のチロシン残基
をラジオアイソトープの¹²⁵Ｉで標識した（Ｎｌｅ^8,18Ｔｙｒ³⁴）-ウシＰＴＨ（
１-３４）-ＮＨ₂（ｂＰＴＨ（１-３４））（参照：ＧｉｎｏＶ．Ｓｅｒｇｅ
ｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２５４（１５）：６９８０-６９８６（１９７９））を調製するため、触媒としてクロラミンＴ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
．、ＵＳＡ）を用い、ｂＰＴＨ（１-３４）をＮａ¹²⁵Ｉでヨウ素化した。ヨウ素
化の反応物をＣ₁₈Ｓｅｐ-Ｐａｋカラムに注入し、ヨウ素化されたｂＰＴＨを５０％のＡＣＮ（アセトニトリル）／０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で
溶出させ、遊離の¹²⁵Ｉを除去した。なお、分離されたｂＰＴＨよりＡＣＮを除去した。

【００５６】 ¹²⁵Ｉで標識した（Ｎｌｅ^8,18Ｔｙｒ³⁴）-ｂＰＴＨ（１-３４）をリガンドとして用い、当該受容体へのリガンド結合に対する、ｒｈＰＴＨ（１-８４）およびｓｈＰＴＨ（１-８４）の競争阻害を比較することによって、ＰＴＨの受容体への結合親和性を側定した。リガンドおよび、上記ＰＴＨを結合緩衝液（１００
ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、５％のウマ血清および、０．５％のＦＢＳを含む５０ｍＭのＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７））
で各々希釈した。一方、上記の培養後、得られた２４ウェルプレートを氷浴で冷
却し、１ｍｌの結合緩衝液で２回洗浄した後、３００００ないし５００００ｃｐ
ｍのリガンドおよび、種々の濃度の競争ＰＴＨを、最終体積が０．３ｍｌになる
まで添加した。続いて、各ホルモンの希釈液を３ウェルに同時に添加し、１５℃
で４時間吸着させた。反応後、ウェルを０．５ｍｌの結合緩衝液で４回洗浄し、
結合していない放射活性同位体を除去した。０．５ｍｌの０．５ＭＮａＯＨを
添加し、細胞に結合した放射活性同位体を室温で１６ないし１８時間抽出した。
抽出で得られた液と、０．５ｍｌの結合緩衝液により洗浄した後に得られた液と
を合わせ、ガンマカウンターで放射活性を測定した。

【００５７】前記測定の結合放射活性の測定値から１ｍＭの各競争ホルモンを用いて測定し
た非特異的結合の測定値を引き、特異的結合の測定値を決定した。測定結果は、
最大特異的結合に対する百分率で示し、曲線）の最適化および、各競争ホルモン
の結合力を比較する重要な指標になるＩＣ₅₀（５０％阻害濃度、リガンドの結
合を５０％阻害するに必要なホルモン濃度）の値は、Ｂｉｏｓｏｆｔ社のｆｉｇ
．Ｐｐｒｏｇｒａｍに従って測定した。ｓｈＰＴＨ（１-８４）とｒｈＰＴＨ（１-８４）のＩＣ₅₀の値は、各々１８．６±１．５および、１７．３±３．１ｎＭ（平均値±標準偏差）として示し、その一つの実験結果を図１８（Ａ）で示
した。図１８（Ａ）のように、組換えＰＴＨは合成ＰＴＨと同様な受容体に対す
る結合活性を有していることが分かった。

【００５８】〔実施例１０−２〕：細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験細胞内ｃＡＭＰの生成促進試験は、次のように実施した（参照：ＴｈｏｍａｓＪ．Ｇａｒｄｅｌｌａｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２６５（２６）：１５８
５４―１５８５９（１９９０））。実施例１０-１で、４ないし８日間２４ウェルプレートで培養したＵＭＲ１０６細胞を氷浴で１５分間冷却させた後、０．２
５ｍｌのｃＡＭＰ緩衝液（２ｍＭ３-イソブチル-メチルキサンチン、１ｍｇ／
ｍｌＢＳＡ、３５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ、ｐＨ７．４）で１回洗浄
した。続いて、０．１ｍｌのｃＡＭＰ緩衝液をプレートに添加し、種々の濃度の
各ホルモンを含むｃＡＭＰ緩衝液０．１ｍｌを添加した。その後、反応を３７℃
で２０分間で行い、緩衝液を除去した。さらにその後、-７０℃での凍結および室温での解凍を各々２０分間３回繰り返して細胞を破壊した。１ｍｌの５０ｍＭ
のＨＣｌをプレートの各ウェルに加え、-２０℃で１６ないし１８時間細胞内ｃＡＭＰを抽出し、その抽出物にあるｃＡＭＰをｃＡＭＰＲＩＡｋｉｔ（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，ＤｕＰｏｎｔ，ＵＳＡ）で定量した。曲
線の最適化および、ＥＣ₅₀（細胞内ｃＡＭＰの生成を５０％促進するに必要なホ
ルモン濃度）の値は、Ｂｉｏｓｏｆｔ社のｆｉｇ．Ｐｐｒｏｇｒａｍを用いて
決定した。ｓｈＰＴＨ（１-８４）および、ｒｈＰＴＨ（１-８４）のＥＣ₅₀値は
、各々１．９±０．１と１．３±０．２ｍＭ（平均値±標準偏差）として得られ
、その一つの実験結果を図１８（Ｂ）に示した。図１８（Ｂ）から、組換えＰＴ
Ｈは合成ＰＴＨと同様なアデニレートサイクラーゼ促進活性を有していることが
分かった。

【００５９】（産業上の利用の可能性）以上詳細に説明し、立証した通り、本発明はＰＲＫ遺伝子断片、あるいはその
突然変異体を融合パートナーとして含有するＬ-ａｒａｂｉｎｏｓｅ誘導性ベクターに、ウロキナーゼの切断部のヌクレオチド配列を含むＰＴＨ遺伝子を挿入し
て製造した組換え発現ベクター、それで形質転換された組換え微生物および、前
記微生物をＬ-ａｒａｂｉｎｏｓｅの添加された培地で培養することにより、ヒト副甲状腺ホルモンを大量製造する方法に関する。本発明で製造した組換えヒト
ＰＴＨは天然型ヒトＰＴＨの活性を有していることを確認した。従って、本発明
の組換え発現ベクターで形質転換された微生物を用い、Ｌ-ａｒａｂｉｎｏｓｅで発現を誘導することにより天然型ヒトＰＴＨの有する活性をそのまま維持して
いる組換えヒトＰＴＨを正確な誘導調節を通し、高収率で製造することができる
。

【００６０】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターΔｐＭＡの遺伝子地図を示す図である。

【図２】ヒトＰＴＨ遺伝子を調製するためのオリゴマーの塩基配列（配列番号１；配列
番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列
番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１
３；配列番号１４）を示す図である。

【図３】合成されたオリゴマーの連結過程を示す図である。

【図４】発現ベクターｐＲＫの遺伝子地図を示す図である。

【図５】本発明のＰＲＫ遺伝子断片をＰＣＲによって増幅する手法を示す図である。

【図６】ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合タンパク質を発現する発現ベクターｐ１５
３ｈＧＨの遺伝子地図を示す図である。

【図７】ＰＴＨの融合タンパク質を発現する発現ベクターｐＡＩ５ＵＰの遺伝子地図を
示す図である。

【図８】本発明の組換えヒトＰＴＨを発現する発現ベクターｐ１５３ＰＴＨを調製する
構築手法を示す図である。

【図９】ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌の、Ｌ-アラビノース誘導による、ＰＲＫ断片で融合されたヒトＰＴＨタンパク質の発現を示す電気泳動パターンの写
真である。

【図１０】ｐ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌から発現された融合タンパク質を単離
する過程で得られた試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。

【図１１】１５３ＰＴＨ融合タンパク質の封入体の、ウロキナーゼで消化した後のＳＤＳ
-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。

【図１２】ｐ１５３ＰＴＨを改変することにより、本発明のヒトＰＴＨの発現ベクターｐ
ｍ１５３ＰＴＨを調製する構築手法を示す図である。

【図１３】ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌の、Ｌ-アラビノース誘導による、融合タンパク質の発現を示す電気泳動パターンの写真である。

【図１４】ｐｍ１５３ＰＴＨで形質転換された大腸菌から発現された融合タンパク質を単
離する過程で得られた試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。

【図１５】１５３ＰＴＨおよびｍ１５３ＰＴＨ融合タンパク質の封入体の、ウロキナーゼ
で消化した後のＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。

【図１６】１５３ＰＴＨおよびｍ１５３ＰＴＨの封入体のウロキナーゼ消化効率を比較す
るための、各反応物の電気泳動パターンを示す写真である。

【図１７】精製されたヒトＰＴＨのＳＤＳ-ＰＡＧＥパターンを示す写真である。

【図１８Ａ】精製されたヒトＰＴＨとその受容体の結合を示すグラフである。

【図１８Ｂ】精製されたヒトＰＴＨが細胞内ｃＡＭＰ生産を刺激することを示すグラフであ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年２月２３日（２０００．２．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】ヒト副甲状腺ホルモンの組換え発現ベクター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チュン，ソー−イル大韓民国 463−050 キョンギ‐ド，ソンナム，セオヒュン−ドン，ヒュンダイアパートメント 112−902 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA07 FA02 HA01 4B064 AG15 BA13 CA02 CC24 DA01 4B065 AA01Y AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB15 BD14 CA24 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のホスホリブロキナーゼ遺伝子断片、またはその突然
変異型遺伝子を融合パートナーとして含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターに、ウロキナーゼ特異的切断部位を含むヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を挿入して
製造した組換え発現ベクター。
【請求項２】融合パートナーとしてホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）遺伝
子を含有するＬ-アラビノース誘導性ベクターが、図４の遺伝子地図で示表されるｐＰＲＫである請求項１記載の組換え発現ベクター。
【請求項３】ホスホリブロキナーゼ遺伝子断片が、ホスホリブロキナーゼ
のアミノ末端から１１３個から１５３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片であ
る請求項１記載の組換え発現ベクター。
【請求項４】ウロキナーゼ特異的切断部位が、下記のアミノ酸配列： -Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（上記式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、あるいはＬｅｕを表す）より類推されるＤＮＡ配列である、請求項１記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】ウロキナーゼ特異的切断部位が、-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-Ａｒｇのアミノ酸配列より類推されるＤＮＡ配列である、請求項４記載の組換え発現ベク
ター。
【請求項６】ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子が、下記のＤＮＡ配列を有する
、請求項１記載の組換え発現ベクター：
【請求項７】ロドバクター・スフェロイデスのホスホリブロキナーゼのア
ミノ末端から１５３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片、ウロキナーゼ特異的
切断部位の-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-ＡｒｇをコードするＤＮＡ断片、およびヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を含む組換え発現ベクターｐ１５３ＰＴＨ。
【請求項８】ロドバクター・スフェロイデスのホスホリブロキナーゼのア
ミノ末端から１５３個のアミノ酸をコードし、その３０、３１、５８、５９、９
４、および９６番目の位置にあるアルギニン残基の一部が突然変異して他のアミ
ノ酸で置換されたＤＮＡ断片、ウロキナーゼ特異的切断部位の-Ｘ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ（式中、ＸはＰｒｏ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、あるいはＬｅｕを表す）をコ
ードするＤＮＡ断片、およびヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を連続して含む組換え
発現ベクター。
【請求項９】ロドバクター・スフェロイデスのホスホリブロキナーゼのアミノ末端から１５３個のアミノ酸をコードし、その３０、５８および、９４番
目のアルギニン残基が部位特異的に突然変異してバリンに置換し、５９、および
９６番目のアルギニン残基がグリシンに置換されたＤＮＡ断片、ウロキナーゼ特
異的切断部位の-Ｔｈｒ-Ｇｌｙ-ＡｒｇをコードするＤＮＡ断片、およびヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を連続して含む組換え発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨ。
【請求項１０】請求項７記載の組換え発現ベクターｐ１５３ＰＴＨで形質
転換された大腸菌ＭＣ１０６１：ｐ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０１）。
【請求項１１】請求項９記載の組換え発現ベクターｐｍ１５３ＰＴＨで形
質転換された大腸菌ＭＣ１０６１：ｐｍ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０２）。
【請求項１２】請求項１０記載の形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１：ｐ
１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０１）を培養し、Ｌ-アラビノースでヒト副甲状
腺ホルモンの発現を誘導し、これを回収する工程を含む、ヒト副甲状腺ホルモン
の製造方法。
【請求項１３】請求項１１記載の形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１：ｐ
ｍ１５３ＰＴＨ（ＫＣＣＭ-１０１０２）を培養し、Ｌ-アラビノースでヒト副甲
状腺ホルモンの発現を誘導し、これを回収する工程を含む、ヒト副甲状腺ホルモ
ンの製造方法。
【請求項１４】請求項１記載の組換え発現ベクターで形質転換された組換
え微生物を培養し、Ｌ-アラビノースでヒト副甲状腺ホルモンの発現を誘導し、発現されたホスホリブロキナーゼおよびヒト副甲状腺ホルモンの融合タンパク質
をウロキナーゼ処理することにより、ヒト副甲状腺ホルモンを回収する工程を含
む、ヒト副甲状腺ホルモンの製造方法。