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JP2686090B2 - 新規融合蛋白質およびその精製方法 - Google Patents

新規融合蛋白質およびその精製方法

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JP2686090B2
JP2686090B2 JP63055085A JP5508588A JP2686090B2 JP 2686090 B2 JP2686090 B2 JP 2686090B2 JP 63055085 A JP63055085 A JP 63055085A JP 5508588 A JP5508588 A JP 5508588A JP 2686090 B2 JP2686090 B2 JP 2686090B2
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fusion protein
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rbs
asp
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JP63055085A
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ライナー・ゲンツ
エリッヒ・ホフリ
ディートリッヒ・スティバー
Original Assignee
エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー
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Publication date
Application filed by エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー filed Critical エフ・ホフマン―ラ ロシュ アーゲー
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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子技術による混成遺伝子の調製の可能性は、組換
え蛋白質の製造に当り新たな道を開く。所望の蛋白質を
コードする遺伝子配列とリガンドに対して高い親和性を
有する蛋白質フラグメント（親和性ペプチド）をコード
する遺伝子配列とを結合するこにより、親和性ペプチド
を使用する一工程で所望の組換え蛋白質を融合蛋白質の
形態において精製することが可能である。部位を制限し
た変異により、親和性ペプチドと所望の組換え蛋白質と
の結合点に特定の化学的または酵素的な開裂部位を導入
することも可能であり、その結果融合蛋白質を適当な親
和性樹脂により精製した後に、所望の組換え蛋白質を化
学的または酵素的開裂により回収することができる。斯
かる精製方法は、例えばScience 198,1056−1063（197
7）（Itakuraらによる）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
0,6848−6852（1983）（Germinoらによる）、Nucleic A
cids Res.13,1151−1162（1985（Nilssonらによる）、G
ene 32,321−327（1984）（Smithらによる）ならびにヨ
ーロッパ特許公開番号第150126号および第184355号によ
り知られている。
本発明により、少なくとも２個の直接隣接するヒスチ
ジン残基を有する親和性ペプチドが、ニトリロトリ酢酸
（NTA）樹脂上での金属キレートアフィニティークロマ
トグラフィーによる組換え蛋白質の精製に特に適してい
ることが見出された。これらの親和性ペプチドは、公知
のペプチドと、まず第一にそれらがNTA樹脂により天然
および変性蛋白質の精製を問題なく可能にする点におい
て区別できる。
従って本発明は、少なくとも２個の隣接するヒスチジ
ン残基を含み、かつリガンドに対して高い親和性を有す
る１種または２種の親和性ペプチドおよびこの１種また
は２種の親和性ペプチドに直接的または間接的に結合さ
れる生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質からな
る融合蛋白質、組換えDNA技術によるそれらの製造方法
ならびにNTA樹脂上での金属キレートアフィニティーク
ロマトグラフィーによるそれらの精製方法に関するもの
である。本発明は、また、該融合蛋白質をコードする遺
伝子、これらの遺伝子を含む発現ベクター、これらの発
現ベクターにより形質転換された微生物、ならびに前記
遺伝子、発現ベクターおよび形質転換微生物の製造方法
に関するものである。
本発明による融合蛋白質の親和性ペプチドは、一般式 R1-(His)2-6-R2 （式中R1は、水素、１個のアミノ酸または数個のアミノ
酸の配列を示し、R2は、Ｑ、Ｑ−Ile−Glu−Gly−Arg−
またはＱ−Asp−Asp−Asp−Asp−Lysを示し、およびＱ
は、ペプチド結合、１個のアミノ酸または数個の、最大
30個のアミノ酸の配列を示す） で定義される。
本発明による融合蛋白質の特に好ましい親和性ペプチ
ドは、次式のペプチド配列を有するものである。
Met−His−His, Met−His−His−His, Met−His−His−His−His, Met−His−His−His−His−His, Met−His−His−His−His−His−His, Met−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu−Gly−Arg および Met−His−His−Ala−Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys。
本発明による融合蛋白質の親和性ペプチドは、生物学
的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に直接的または間
接的に結合され得る。単一の親和性ペプチドを用いる場
合には、同ペプチドは生物学的に活性なポリペプチドま
たは蛋白質のアミノ末端アミノ酸またはカルボキシ末端
アミノ酸のいずれかに結合され得る。２個の親和性ペプ
チドを用いる場合には、それらの１個は、生物学的に活
性なポリペプチドまたは蛋白質のアミノ末端アミノ酸に
結合され、他方は生物学的に活性なポリペプチドまたは
蛋白質のカルボキシ末端アミノ酸に結合される。
間接的結合の場合には、親和性ペプチドは、適当な選
択的開裂部位を含み、それをを介し、それらは所望の生
物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に結合され
る。好適な選択的開裂部位としては、好ましくはアミノ
酸配列−(Asp)n−Lys−（式中、ｎは2,3または４を示
す）または−Ile−Glu−Gly−Arg−が考えられ、これら
はそれぞれプロテアーゼであるエンテロキナーゼおよび
凝集ファクタXaにより特異的に認識され得る。このよう
な親和性ペプチドは、次にそれ自体公知の方法により酵
素的に開裂することができる。
直接的結合の場合には、親和性ペプチドは、所望の生
物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質に結合して残
る。すなわち、親和性ペプチドは、化学的または酵素的
に開裂することができない。この形態の結合は、所望の
ポリペプチドまたは蛋白質の活性が親和性ペプチドの存
在により不利な影響を受けない場合には有利である。本
発明によるこのような融合蛋白質は多くの免疫的な処理
に用いることができる。これらは、例えば感染症の検出
用試薬として用いることができる。これらは、生理学的
に適合し得る担体物質と混合することができるので、こ
れらは疾患予防のワクチンとしても使用し得る。
本発明による融合蛋白質に関連して用いられる「生物
学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質」なる用語は、
それら自体が生物学的に活性なポリペプチドもしくは蛋
白質、または生物学的に活性なポリペプチドもしくは蛋
白質の調製に用い得るポリペプチドもしくは蛋白質に関
するものである。
生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質としては
たとえば、マラリア表層抗原、特にプラスモジウム・フ
ァルシパルム（Plasmodium folciparum）の5.1表層抗
原、CS蛋白質およびp190蛋白質、リンホカイン、インタ
ーフェロン、インシュリンおよびインシュリン前駆体、
HIV−１およびHIV−２のエンベロープおよび構造蛋白
質、成長ホルモンならびに成長ホルモン分泌因子などが
考えられる。本発明による融合蛋白質の特に好ましい生
物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質は、ヒト免疫
インターフェロンのアミノ酸配列およびヒト免疫インタ
ーフェロンの部分配列を有するもの、特に、次式のアミ
ノ酸配列： Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−
Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−Gly−His−Ser−
Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu−
Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−Glu−Ser−
Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−
Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn−Phe−
Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−
Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−Lys−
Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−
Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser−Var−
Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−
His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Leu−
Ser−Pro−Ala−Lys−Thr−Gly−Lys−Arg−Lys−Arg−
Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg−Gly−Arg−Arg−Ala−
Ser−Gln、 Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−
Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−Gly−His−Ser−
Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu−
Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−Glu−Ser−
Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−
Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn−Phe−
Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−
Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−Lys−
Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−
Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser−Val−
Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−
His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Leu−
Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Gly−Lys−Arg−Lys−
Arg−Ser−Gln−Met−Leu および Gln−Asn−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu−Ala−Glu−Asn−
Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala−Gly−His−Ser−
Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr−Leu−Phe−Leu−
Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys−Glu−Glu−Ser−
Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser−Gln−Ile−Val−
Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe−Lys−Asn−Phe−
Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln−Lys−Ser−Val−
Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met−Asn−Val−Lys−
Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys−Lys−Arg−Asp−
Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn−Tyr−Ser−Val−
Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg−Lys−Ala−Ile−
His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met−Ala−Glu−Leu−
Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Gly−Lys−Arg−Lys−
Arg−Ser−Gln−Met−Leuを有するもの、ならびにマウ
スジヒドロ葉酸塩還元酵素のアミノ酸配列を有するもの
である。
本発明による融合蛋白質の調製は、文献に記載されて
いる組換えDNA技術の方法に従って行なうことができ
る。好ましくは、所望の親和性ペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を最初に合成し、次いでこれを所望の生
物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質をコードする
ヌクレオチド配列に結合する。
こうして得られた混成遺伝子の発現ベクター、例えば
プラスミドpDS8/RBS II,Sph I;pD55/RBS II,3A＋5A;pDS
78/RBS IIまたはpDS56/RBS IIおよび他の市販のまたは
一般に入手可能なプラスミドへの組込みもまた、それ自
体公知の方法により行われる。加えて、Maniatisらによ
る教本（“Molecular Cloning",Cold Spring Harbor La
boratory,1982）を参照することが出来る。
本発明による融合蛋白質の発現方法は、また、それ自
体公知であり、前述の数本に詳細に記載されている。こ
れらは、次の方法を包含している： （ａ）前述の混成遺伝子が発現制御配列に有効に結合さ
れている発現ベクターによる適当な宿主生物、有利には
E.coliの形質転換； （ｂ）こうして得られた宿主生物の適当な生育条件下に
おける培養；および （ｃ）宿主生物からの所望の融合蛋白質の抽出および単
離 宿主生物としては、グラム陰性およびグラム陽性の細
菌、例えばE.coliおよびB.subtilisの株が考えられる。
E.coli M15株（第31頁参照）は、本発明の特に好ましい
宿主生物である。しかしながら、上述のE.coli株とは別
に、他の一般に入手可能なE.coli株、例えばE.coli 294
（ATCC No.31446）、E.coli RRI（ATCC No.31343）およ
びE.coli W3110（ATCC No.27325）も用いることができ
る。
本発明による融合蛋白質の精製に用いる理想的な金属
キレート樹脂は、一般式 キャリア・マトリックス−スペーサーNH−(CH2)X-CH
(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+ （式中Ｘは２、３または４を示す） のニトリロトリ酢酸（NTA）樹脂である。
キャリア・マトリックスとしては、マフィニティーお
よびゲルクロマトグラフィーに使われる物質、例えば架
橋したデキストラン、アガロース（特に商標セファロー
ス（Sepharose ）として知られている）またはポリア
クリルアミドが考えられる。
スペーサとしてはアフィニティークロマトグラフィー
で既に知られているスペーサ基が考えられ、特に-O-CH2
-CH(OH)-CH2-基および−Ｏ−CO−基が好ましい。
本発明による融合蛋白質の精製の為に特に好ましいNT
A樹脂は、式 〔セファロースCL 6B〕−Ｏ−CH2-CH(OH)-CH2-NH-(CH
2)4-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+ で示されるものであって、その調製は実施例10に記載さ
れているようにして行なうことができる。
前述したNTA樹脂は、バッチ式または連続的に操作す
るカラムにおいて、本発明による融合蛋白質の精製の為
に使用することができる。本発明による融合蛋白質の充
填前に、NTA樹脂をそれ自体はニッケルとキレート形成
しない緩衝液、好ましくはpH7.5のトリス・HCI緩衝液で
好適に平衡化させる。平衡化緩衝液（ならびに溶出緩衝
液）は、変性剤または洗浄剤、例えばグアニジン・HC
L、尿素またはトリトン（Triton）を含有することがで
きる。このような変性剤または洗浄剤の添加は、本発明
による融合蛋白質が水溶液に極めて難溶であっても問題
ない操作を可能にする。本発明による融合蛋白質の溶出
は、一定のpH値、または直線もしくは不連続的に下降す
るpH勾配により行なうことができる。至適溶出条件は、
存在する不純物の量と種類、精製される物質の量、カラ
ムの大きさ等に依存し、その場合に応じて好適に決定さ
れる。
以下の実施例は、本発明による融合蛋白質の調製、金
属キレートクロマトグラフィーによるそれらの精製、お
よび本発明により精製された融合蛋白質の酵素的開裂に
よる生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質の調製
を示す。
これらの実施例は、添付図面と関連させて読むと、よ
り良く理解されよう。これらの図中には以下の略号およ
び記号が示される。
B,Bg,E,H,N,Na,Nd,P,S,Sa,Sc,XおよびXbは、それぞれ
制限酵素BamH I,Bgl II,EcoR I,Hind III,Nae I,Nar I,
Nde I,Pst I,Sph I,Sal I,Sca I,Xho 1およびXba Iの開
裂部位を示す。
bla,lac Iおよびneo遺伝子のプロモータを示し、 bla,cat,neoおよびlac I遺伝子のリボゾーム結合部位を
示し、 ターミネータtoおよびT1を示し、 調節可能なプロモータ／オペレータ要素PN25x/0またはN
250PSN250P29を示し、 リボゾーム結合部位RBS II,Sph IおよびRBS II、3A＋5A
を示し、→は、これらのリボゾーム結合部位の制御下に
あるコード領域を示し、 本発明による親和性ペプチドおよび選択的開裂部位をコ
ードする領域を示し、 2,4または６のヒスチジン残基をコードする領域を示
し、 複製に必要な領域（repl.）を示し、 ジヒドロ葉酸塩還元酵素（dhfr）、クロラムフェニコー
ル アセチルトランスフェラーゼ、lac−リプレッサー
（lac I）、β−ラクタマーゼ（bla）、ネオマイシン
フォスフォトランスフェラーゼ（neo）およびγ−イン
ターフェロンの種々の誘導体のコード領域を示してい
る。
第１図 プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iの図式的表示。
第２図 プラスミドpDS8/RBS II,Sph IのXho I/Xba Iフラグメ
ントのヌクレオチド配列。このフラグメントは、調節可
能なプロモータ／オペレータ要素PN25X/0、リボゾーム
結合部位RBS II,Sph I,dhfr遺伝子、ターミネータto、c
at遺伝子およびターミネータT1を含む。第１図中に示さ
れている制限酵素の開裂部位には、上線が付してあり、
一方、RBS II,Sph Iの制御下にあるジヒドロ葉酸塩還元
酵素の変異体をコードする領域には下線が付してある。
さらに、プラスミドpBR322に由来するプラスミドpDS8/R
BS II,Sph Iの部分は、pBR322の配列と関連する番号を
付して図式的に示した（J.G.SutcliffeのCold Spring H
arbor Symp.Quant.Biol.43.pp.77−90［1979］）。
第３図 プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5Aの図式的表示。
第４図 プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5Aのヌクレオチド配列。第
３図中に示されている制御酵素の開裂部位には、上線が
付してあり、一方、RBS II,3A＋5Aの制御下にあるクロ
ラムフェニコール、トランスフェラーゼの変異体をコー
ドする領域には下線が付してある。
第５図 プラスミドpDS78/RBS IIの図式的表示。
第６図 プラスミドpDS78/RBS IIのヌクレオチド配列。第５図
中に示されている制限酵素の開裂部位には、上線が付し
てあり、一方、RBS IIの制御下にあるジヒドロ葉酸塩還
元酵素の変異体をコードする領域には下線が付してあ
る。
第７図 プラスミドpDS56/RBS IIの図式的表示。
第８図 プラスミドpDS56/RBS IIのヌクレオチド配列。第７図
中に示されている制限酵素の開裂部位には上線が付して
あり、一方、RBS IIの制御下にある領域には下線が付し
てある。
第９図 プラスミドpDM I,1の図式的表示。
第10図 プラスミドpDM I,1のヌクレオチド配列。第９図中に
示されている制限酵素の開裂部位には、上線が付してあ
り、一方、ネオマイシン フォスフォトランスフェラー
ゼ（neo）およびlac−リプレッサ（lac I）をコードす
る領域には下線が付してある。
第11図 実施例において用いられるプラスミドを構築するため
に使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。
各々において、２つのオリゴヌクレオチドが結合され、
アダプタとして示されている。制限酵素Nae I、Nar Iお
よびBgl IIの開裂部位には上線が付してある。
第12図 フラグメント１の構築および単離の図式的表示。この
フラグメントは、プラスミドpRC23/IFI−900から単離さ
れ、Ｎ−末端アミノ酸としてCys−Tyr−Cysを有する組
換えヒトインタフェロンの遺伝子を含んでいる。
第13図 フラグメント１をプラスミドpDS8/RBS II,Sph Iに組
み込むことによるプラスミドgGLSの構築の図式的表示。
このpGLSの図式的表示においては、（Sc）は、フラグメ
ント１が制限酵素Sca Iの開裂部位を介して、プラスミ
ドpDS8/RBS II,Sph Iと結合されている位置を示す。
第14図 フラグメント２の構築および単離の図式的表示。この
フラグメントは、Ｃ末端において８個のアミノ酸が短縮
され、IFN−γ−（−８）として示されるヒトインター
フェロンをコードしている。示されたヌクレオチド配列
において、相当する終止コドンには下線を付してある。
第15図 制限酵素E.coR IおよびHind IIIの開裂部位を介して、
プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iにフラグメント２を組み
込むことによるプラスミドpIFN−γ−（−８）の構築の
図式的表示。
第16図 フラグメント３の構築および単離の図式的表示。この
フラグメントは、調節可能なプロモータ／オペレータ要
素PN25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,Sph Iおよびア
ミノ酸配列Met−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu−Gly−
Arg−Leu−Gly−Serをコードするアダプタ３を有してい
る。
第17図 制限酵素Xho IおよびBamH Iの開裂部位を介してプラ
スミドpDS8/RBS II,Sph Iにフラグメント３を組み込む
ことによるプラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa
−BamH Iの構築の図式的表示。
第18図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γの構築に用いたフ
ラグメント４の構築および単離の図式的表示。
第19図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ、pHis,His−Ek−I
FN−γ（−８）およびpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）
（Asn）の構築に用いたフラグメント５の単離の図式的
表示。
第20図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γの構築に用いたフ
ラグメント６の単離の図式的表示。
第21図 フラグメント4,5および６を結合することによるプラ
スミドpHis,His−Xa−IFN−γの構築の図式的表示。プ
ラスミドpHis,His−Xa−IFN−γは、付加的アミノ酸配
列としてMet−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu−Gly−Ar
gを有するIFN−γ結合蛋白質（His,His−Xa−IFN−γ）
をコードする。
第22図 プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）の構築に
用いたフラグメント７の構築および単離の図式的表示。
第23図 プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）およびpHi
s,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の構築に用いたフ
ラグメント８の単離の図式的表示。
第24図 フラグメント5,7および８を結合することによるプラ
スミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）の構築の図式的
表示。プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）は、
８個のアミノ酸が短縮され付加的なＮ−末端アミノ酸配
列としてMet−His−His−Ala−Gly−Asp−Asp−Asp−As
p−Lysを有するIFN−γ融合蛋白質（His,His−Ek−IFN
−γ（−８）をコードする。
第25図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の
構築に用いたフラグメント９の構築および単離の図式的
表示。
第26図 フラグメント5,8および９を結合することによるプラ
スミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の構築の
図式的表示。このプラスミドは、Ｃ−末端において８個
のアミノ酸が短縮され、Ｎ−末端においてアミノ酸配列
Met−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu−Gly−Argが延長
され、更に２番目の位置においてアミノ酸Aspがアミノ
酸Asnに置換されているIFN−γ融合蛋白質（His,His−X
a−IFN−γ（−８）（Asn））をコードする。
第27図 プラスミドp6xHis−DHFRの構築に用いたフラグメント
10の構築および単離の図式的表示。
第28図 フラグメント10と、複製領域を含むプラスミドpDS78/
RBS IIのXho I/BamH Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドp6xHis−DHFRの構築の図式的表示。プラ
スミドp6xHis−DHFRは、６個のヒスチジンをＮ−末端に
有するDHFR融合蛋白質［(His)6−mDHFR］をコードす
る。
第29図 プラスミドp4xHis−DHFRの構築に用いたフラグメント
11の構築および単離の図式的表示。
第30図 フラグメント11と、複製領域を含むプラスミドpDS78/
RBS IIのXho I/BamH Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドp4xHis−DHFRの構築の図式的表示。プラ
スミドp4xHis−DHFRは、４個のヒスチジンをＮ−末端に
有するDHFR融合蛋白質［(His)4−mDHFR］をコードす
る。
第31図 プラスミドpRBS II−6xHisの構築に用いたフラグメン
ト12の構築および単離の図式的表示。
第32図 フラグメント12と、複製領域を含むプラスミドpDS56/
RBS IIのXba I/BamH Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドpRBS II−6xHisの構築の図式的表示。
第33図 プラスミドpRBS II−4xHisの構築に用いたフラグメン
ト13の構築および単離の図式的表示。
第34図 フラグメント13と、複製領域を含むプラスミドpDS56/
RBS IIのXba I/BamH Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドpRBS II−4xHisの構築の図式的表示。
第35図 プラスミドpRBS II−2xHisの構築に用いたフラグメン
ト14の構築および単離の図式的表示。
第36図 フラグメント14と、複製領域を含むプラスミドpDS56/
RB IIのXba I/BamH Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドpRBS II−2xHisの構築の図式的表示。
第37図 複製領域を含むプラスミドpDS78/RBS IIのXba I/Bgl
IIフラグメントと、cat遺伝子を含むプラスミドpRBS II
/6xHisのBgl II/Xba Iフラグメントとを結合することに
よるプラスミドpDHFR−6xHisの構築の図式的表示。プラ
スミドpDHFR−6xHisは、６個のヒスチジンをＣ−末端に
有するDHFR融合蛋白質［Met−mDHFR−(His)6］をコード
する。
第38図 複製領域を含むプラスミドpDS78/RBS IIのXba I/Bgl
IIフラグメントと、cat遺伝子を含むプラスミドpRBS II
−2xHisのBgl II/Xba Iフラグメントとを結合すること
によるプラスミドpDHFR−2xHisの構築の図式的表示。プ
ラスミドpDHFR−2xHisは、２個のヒスチジンをＣ末端に
有するDHFR融合蛋白質［Met−mDHFR−(His)2］をコード
する。
第39図 複製領域を含むプラスミドp4xHis−DHFRのXba I/Bgl
IIフラグメントと、cat遺伝子を含むプラスミドpRBS II
−4xHisのBgl II/Xba Iフラグメントとを結合すること
によるプラスミドp4xHis−DHFR−4xHisの構築の図式的
表示。プラスミドp4xHis−DHFR−4xHisは、それぞれの
場合に４個のヒスチジンをＮ−およびＣ−末端に有する
DHFR融合蛋白質［(His)4−mDHFR−(His)4］をコードす
る。
第40図 プラスミドpGLSによりコードされるIFN−γ遺伝子の
ヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸配
列。
第41図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γによりコードされ
るIFN−γ融合遺伝子のヌクレオチド配列およびそれか
ら導かれるアミノ酸配列。
第42図 プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）によりコ
ードされるIFN−γ融合遺伝子のヌクレオチド配列およ
びそれから導かれるアミノ酸配列。
第43図 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）に
よりコードされるIFN−γ融合遺伝子のヌクレオチド配
列およびそれから導かれるアミノ酸配列。
［実施例１］ プラスミドpGLS、pHis,His−Xa−IFN−γ、pHis,His
−Ek−IFN−γ（−８）、pHis,His−Xa−IFN−γ（−
８）（Asn）、p6×His−DHFR、p4×His−DHFR−４×Hi
s、pDHFR−２×HisおよびpDHFR−６×Hisの構築に用い
たプラスミドの説明 A.基本的事項 プラスミドpDS8/RBS II,Sph I（第１図および第２
図）、pDS5/RBS II,3A＋5A（第３図および第４図）、pD
S78/RBS II（第５図および第６図）ならびにpDS56/RBS
II（第７図および第８図）を、特定のプラスミドの構築
のために用いた。これらのプラスミドにより形質転換さ
れるE.coli細胞は、ブダペスト条約の下に、ゲッチンゲ
ン（Ｇttingen）（ブラウンシュヴァイク（Braunschw
eig）においては1987年11月21日から）のDeutsche Samm
lung von Mikroorganismenに1985年10月３日〔E.coli M
15（pDS5/RBS II,3A＋5A;pDMI,1）、DSM No.3517〕、19
86年８月６日〔E.coli M15（pDS8/RBS II,Sph I;pDMI,
1）、DSM No.3809〕、1978年９月３日〔E.coli M15（pD
S78/RBS II;pDMI,1）、DSM No.4232〕および1987年12月
23日〔E.coli M15（pDS56/RBS II;pDMI,1）、DSM No.43
30〕に寄託されている。
上記のベクターは、調節可能なプロモータ／オペレー
タ要素PN25X/0（StberらのEMBO J.３,3143−3148〔19
84〕）またはN250PSN250P29、およびリボゾーム結合部
位RBS II,Sph I,RBS II,3A＋5AまたはRBS IIを含んでい
る。これらのリボゾーム結合部位は、E.coliファージT5
のプロモータPG25のリボゾーム結合部位から誘導され
（R.Gentzの論文、ハイデルベルク大学、BRD〔198
4〕）、DNA合成を経て得られた。これらの発現シグナル
の高い効率を考慮すると、上記のプラスミドは、lacリ
プレッサがオペレータに結合して、プロモータ／オペレ
ータ要素が抑制されている場合にのみE.coli細胞中で安
定に保たれ得る。lacリプレッサは、lac I遺伝子内にコ
ードされる。PN25x/0およびN250PSN250P29は、細胞中に
十分な数のリプレッサ分子が存在する場合にのみ充分に
抑制され得る。従って、リプレッサ遺伝子の発現を増加
させる変異プロモータを含むlac Iq対立遺伝子を使用し
た。このlac Iq対立遺伝子は、プラスミドpDMI,1中に存
在する（第９図および第10図）。このプラスミドは、la
c I遺伝子に加えて選択マーカーとして使用され、かつ
カナマイシン耐性を細菌に与えるneo遺伝子を有してい
る。pDM I,1は、上述のプラスミドと適合する。このよ
うな発現ベクターにより形質転換されるE.coliは、細胞
中で発現ベクターが安定に保たれることを保証する為に
pDM I,1を含まねばならない。この系での誘発は、所望
の細胞密度において培地にIPTGを添加することにより達
成される。
B.プラスミドpDS8/RBS II,Sph I Xba IおよびXho Iの制限開裂部位の間にあり、複製領
域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を与えるβ−ラ
クタマーゼの遺伝子を含むpDS8/RBS II,Sph I（第１図
および第２図）の部分は、プラスミドpBRS322から誘導
される（BolivarらのGene2,95−113〔1977〕;Sutcliffe
のCold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.43,77−90〔19
79〕）。プラスミドの残りの部分は、調節可能なプロモ
ータ／オペレータ要素PN25x/0（Stberらの前出文献）
およびそれに続いてEcoR I/BamH Iフラグメントの部分
であるリボゾーム結合部位RBS II,Sph Iを有している。
マウス細胞系AT−3000のジヒドロ葉酸塩還元酵素（DHF
R）の遺伝子（ChangらのNature 275,617−624〔1978〕;
MastersらのGene21,59−63〔1983〕）、E.coliファージ
ラムダのターミネータto（SchwartzらのNature 272,410
−414〔1978〕）、クロラムフェニコール アセチルト
ランスフェラーゼのプロモータを欠いた遺伝子（Marcol
iらのFEBS Letters,110,11−14（1980〕）およびE.Coli
rrnBオペロンのターミネータT1（BrosiusらのJ.Mol.Bi
ol.,148,107−127〔1981〕）が続いている。
C.プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5A 制限酵素Xba IおよびXho Iの開裂部位の間にあり、複
製領域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を与えるβ
−ラクタマーゼの遺伝子を含むPDS5/RBS II,3A＋5A（第
３図および第４図）の部分は、プラスミドpBR322から元
来誘導される（Bolivarらの前出文献、Sutcliffeの前出
文献）。しかしながら、β−ラクタマーゼ遺伝子は、制
限酵素Hinc IIおよびPst Iの開裂部位が除去されるよう
に修飾されている。しかしながら、DNA配列中のこれら
の変更は、β−ラクタマーゼのアミノ酸配列には何ら影
響を与えない。このプラスミドの残りの部分は、調節可
能なプロモータ／オペレータ要素PN25x/0（Stberらの
前出文献）およびそれに続くEcoR I/BamH Iフラグメン
トの部分であるリボゾーム結合部位RBS II,3A＋5Aを有
している。制限酵素Sal I、Pst IおよびHind IIIの開裂
部位、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラ
ーゼのプロモータを欠いた遺伝子（Marcoliらの前出文
献）およびE.Coli rrnBオペロンのターミネータT1（Bro
siusらの前出文献）が続いている。
D.プラスミドpDS78/RBS II Xba IおよびXho Iの制限開裂部位の間にあり、複製領
域を含むと共に細胞にアンピシリン耐性を与えるβ−ラ
クタマーゼの遺伝子を含むpDS78/RBS II（第５図および
第６図）の部分は、プラスミドpBR322から元来誘導され
る（Bolivarらの前出文献;Sutcliffeの前出文献）。し
かしながらβ−ラクタマーゼの遺伝子は、プラスミドpD
S5/RBS II,3A＋5Aについて述べた方法において修飾され
る。このプラスミドの残りの部分は、調節可能なプロモ
ータ／オペレータ要素N250PSN250P29およびそれに続くE
coR I/BamH Iフラグメントの部分であるリボゾーム結合
部位RBS IIを有している。マウス細胞系AT−3000のジヒ
ドロ葉酸塩還元酵素の遺伝子（Changらの前出文献;Mast
ersらの前出文献）であって、構造遺伝子の末端の直前
に制限酵素Bgl IIの開裂部位を導入することにより変更
を受けたもの、ターミネータto（Schwartzらの前出文
献）、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラ
ーゼのプロモータを欠いた遺伝子（Marcoliらの前出文
献）およびターミネータT1（Brosiusらの前出文献）が
続いている。
E.プラスミドpDS56/RBS II プラスミドpDS56/RBS II（第７図および第８図）は、
プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5Aに極めて類似している。
しかしながら、これを対比すると、プラスミドpDS56/RB
S IIは、発現シグナルとして、調節可能なプロモータ／
オペレータ要素N250PSN250P29とリボゾーム結合部位RBS
IIとを含んでいる。さらに、pDS56/RBS IIは、E.coli
ファージラムダのターミネータto（Schwartzらの前出文
献）を含んでいる。
F.プラスミドpDMI,1 プラスミドpDMI,1（第９図および第10図）は、E.coli
細胞にカナマイシン耐性を与えるトランスボゾンTn5由
来のネオマイシン フォスフォトランスフェラーゼの遺
伝子（BeckらのGene 19,327−336〔1982〕）およびLac
リプレッサーをコードする、プロモータの変異Iq（Calo
sのNature 274,762−765〔1978〕）を伴ったlac I遺伝
子（FaraboughのNature 274,765−769〔1978〕）を有し
ている。さらに、プラスミドpDMI,1は、複製および娘細
胞への安定した移行のために必要なすべての情報を含む
プラスミドpACYC 184（ChangおよびCohenのJ.Bacterio
l.134,1141−1156〔1978〕）の領域を含んでいる。
［実施例２］ 種々のプラスミドの構築に用いたDNAアダプタの説明 A.基本的事項 リボゾーム結合部位RBS II,Sph Iを免疫インターフェ
ロン（IFN−γ）の遺伝子に適合させること、この遺伝
子を短縮すること、IFN−γおよびIFN−γ（−８）など
のIFN−γフラグメントを親和性ペプチドと結合するこ
とにならびに少なくとも２つの隣接するヒスチジン残基
を有するDHFR融合蛋白質を発現することを目的として、
オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、それらを調製し
た後にホスホリル化した。用いたアダプタのヌクレオチ
ド配列を二重鎖DNA配列として第11図に示してある。
B.オリゴヌクレオチドの合成および調製 オリゴヌクレオチドは、多重合成装置（1985年５月21
日発行のヨーロッパ特許出願番号第181号に記載されて
いる）により所定の粒径のガラス（CPG）を担体物質と
して用いて同時に調製した（KieferらのImmuno.Meth.3,
69−83〔1985〕、SproatらのTetrahedr.Lett.24,5771−
5774〔1983〕、AdamsらのJ.Amer.Chem.Soc.,105,661−6
63〔1985〕）。凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを水中
に採取し、４℃において１時間で溶解した。DNA濃度
は、100nmoles/mlであった。
C.オリゴヌクレオチドのホスホリル化 オリゴヌクレオチドをそれぞれ別々のバッチにおいて
20μｌの50mMトリス・HCl pH 8.5および10mM MgCl2中で
2pmolのγ〔32P〕−ATP（Amersham,ブラウンシュヴァイ
ク;5000 Ci/mmol）および１単位のT4ポリヌクレオチド
キナーゼ（Gibco-BRL,バーゼル）と共に37℃で20分間イ
ンキュベートした。次いで、5nmolのATPを加え、更に37
℃で20分間保った後、65℃に加熱することにより反応を
完結させた。こうして得られたホスホリル化オリゴヌク
レオチドは、更に手を加えることなく用いた。
［実施例３］ プラスミドpGLSの構築 A.基本的事項 プラスミドpGLSの構築のために、IFN−γ遺伝子を先
ずアダプタ１（第11図）と結合させ（第12図）、単離し
た。次いで得られたフラグメント１をプラスミドpDS8/R
BS II,Sph I中に統合した（第13図）。
B.フラグメント１の調製 ４μｇのプラスミドpRC23/IFI−900（ヨーロッパ特許
公開第99084号、1984年１月25日公開）を、DNA濃度400
μg/mlとして10単位の制限酵素Nde Iを用い、コア緩衝
液（50mMトリス・HCl、pH 8、10mM MgCl2、50mM NaCl）
中で37℃にて１時間消化した（体積20μｌ）。次いで試
料をフェノールを用いて１度抽出し、フェノールの残分
をエーテルにより除去し、最終的に66％アルコールと0.
3M酢酸カリウムを用いて沈澱生成させた。沈澱物をSpee
d−vac濃縮装置中で２分間乾燥させ、そしてT4リガーゼ
緩衝液（50mMトリス・HCl、pH7.8、10mM MgCl2、10mM D
TT、500 μM ATP）に溶解した。25pmolのホスホリル化
したアダプタ１（第11図）を１×リガーゼ緩衝液に溶解
し、これを先の反応混合液に加え、総体積が25μｌとな
るようにした。連結反応は、１μｌのDNAリガーゼ（1Wh
ite単位、Boehringer Mannheim）を用いて22℃で３時間
行なった。連結反応を、試料を65℃で７分間加熱するこ
とにより停止させた。DNAをアルコールにより沈澱さ
せ、上述のようにして乾燥させ、次いで50μｌのNco I
消化用緩衝液（50mMトリス・HCl、pH8、10mM MgCl2、50
mM NaCl、50mM KCl）に溶解させた。これに10単位のNco
Iを加え、この試料を37℃で１時間インキュベートし
た。次いで、試料を65℃で７分間加熱することにより酵
素を失活させた。フェノール抽出の後、DNAを前述と同
様にして沈澱させ、この沈澱物を乾燥させた。DNAをク
レナウ緩衝液（50mMトリス・HCl、pH7.2、10mM MgSO4、
100μM DTT）に溶解し、これにdATP、dGTP、dCTPおよび
dTTP（最終濃度は各々100μＭ）ならびに１単位のクレ
ナウ酵素（Boehringer Mannheim）を加え、更にこの試
料を22℃に１時間保った。反応を２μｌの0.25M EDTAを
加えることにより停止させ、この試料をフェノールで抽
出し、DNAを前述と同様にしてアルコールにより沈澱さ
せ、Sph I消化緩衝液（50mMトリス・HCl、pH 7.5、6mM
MgCl2、50mM NaCl、6mM 2−メルカプトエタノール）に
溶解した。10単位のSph Iを添加した後、この試料を37
℃で１時間インキュベートし、消化を前述と同様にして
停止させ、フェノール抽出を行ない、このDNAをアルコ
ールにより沈澱させ、これを乾燥させた。DNA沈澱物を1
0μｌの試料緩衝液に溶解し、DNAフラグメントを６％ポ
リアクリルアミドゲルにより分離した（溶出緩衝液;40m
Mトリス・HCl、20mM酢酸ナトリウム、2mM EDTA、pH 7.
8）。Hae IIIにより消化したファージφＸ（Gibco−BR
L、バーゼル）のDNAを分子量の標準として用いた。DNA
を臭化エチジウム（0.5μg/ml）にて着色し、UV光（波
長300nm）により可視化し、IFN−γをコードするバンド
をメスにてゲルから切り出した。ゲルの切片をアガロー
スゲル（0.7％アガロースゲル、操作緩衝液:90mMトリス
ホウ酸塩、90mMホウ酸、3mM EDTA、pH8.3）の４×4mm大
のくぼみに移した。このくぼみを均一な電場が得られる
ように１×TBE中の0.7％液体アガロースにより封じた。
試料の前面にNA45メンブレン（Schleicher and Schul
l、ダッセル、BRD）の部分を配置し、DNAをメンブレン
上に電機泳動させた（５分間、15V/cm）。蒸留水で洗浄
した後、メンブレンを250μｌの1.5M酢酸リチウム、50m
Mトリス・HCl（pH 8）および10mM EDTAを入れたエッペ
ンドルフ試験管に移した。これにより、DNAを65℃で20
分間溶出させた。メンブレンの小片を試験管から除き、
試料を200μｌのフェノール（pH 8）を用いて１回抽出
した。DNAを、20μｌの5M酢酸リチウムおよび440μｌの
イソプロパノールを加えた後に沈澱させ、この沈澱物を
80％エタノールで洗浄し、次いで乾燥させた。次いで沈
澱物を10μｌのTE緩衝液（10mMトリス・HCl、pH7.6、1m
M EDTA）に溶解した。このようにして得たDNAフラグメ
ントにフラグメント１の名称を与えた（第12図）。
C.プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iの調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph Iを、最初に制限
酵素Sph Iにより開裂させた。その後、得られた線状プ
ラスミドDNAを制限された量の制限酵素Sca Iと共にイン
キュベートし、これによりDNAを存在するSca I開裂部位
の約50％においてのみ開裂させた。試料をフェノールに
より抽出し、エーテルにより抽出し、そしてDNAを前述
のようにして沈澱させた。沈澱物を乾燥させ、20μｌの
緩衝液（50mMトリス・HCl、pH 8）に溶解させ、１単位
のCIP（子牛腸管フォスファターゼ、Boehringer Mannhe
im）を加えた。試料を37℃で１時間インキュベートし、
酵素をフェノール抽出により除去し、DNAを沈澱させ
た。DNAを溶解させた後、cat遺伝子の一部、ターミネー
タT1、複製領域、bla遺伝子、プロモータN25x/0および
リボゾーム結合部位RBS II,Sph Iを含んだSca I/Sph I
フラグメントを、１％アガロールゲルから単離して、前
述のようにしてNA45メンブレンに電気泳動的に移した。
DNAの溶出、アルコール沈澱および10μｌのTE緩衝液へ
の溶解を前述のようにして行なった。約1pmolの所望の
ベクターフラグメントが得られた。
D.プラスミドpGLSの組立て 0.05pmolのベクターフラグメント（上記参照）をリガ
ーゼ緩衝液中で0.05pmolの挿入DNA（フラグメント１）
と連結した。これと並行して挿入DNAを用いない対照連
結を行なった。プラスミドpDMI,1を含むE.coli M15細胞
を、形質転換のためにMorrisonの方法（Methods Enzymo
l.68,326−331〔1979〕）に従って前調製した。65℃で
７分間加熱した後、連結混合物を200μｌのこれらの適
性細胞に加えた。試料を氷中に30分間保持し、次いで42
℃で２分間インキュベートし、0.5mlのLB培地を加えた
後、37℃で90分間インキュベートした。次いで、細胞を
100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシ
ンを含んだLB寒天板上に塗布し、培養装置中で37℃にて
一夜インキュベートした。対照連結の形質転換は、形質
転換体を生じなかった。一方、フラグメント１を用いた
連結は、約200のコロニーを生じた。各々のコロニーを
殺菌したつまようじで取り出し、100μg/mlのアンピシ
リンと25μg/mlのカナマイシンを有する10mlのLB培地を
入れた試験管に移し、振とう培養装置内に12時間保持し
た。その後、細胞を沈澱させ、プラスミドDNAをBirnboi
mとDolyの方法（Nucleic Acids Res.７,1515−1523〔19
79〕）に従って単離した。
各々について、１μｇの単離されたプラスミドを、IF
N−γ遺伝子およびターミネータT1を含むフラグメント
がこれらのプラスミド中に存在するか否かを試験するた
めに、Sph IおよびXba Iで消化した。全ての分析された
DNA試料は約1kbの上記DNAフラグメントを含んでいた。
これらのプラスミドにpGLSの名称を与えた（第13図）。
E.pGLSに組込まれたIFN−γ遺伝子の配列分析 正しいIFN−γ配列がプラスミドpGLSに存在するか否
かを検出するために、二重鎖環状プラスミドDNAを、
〔γ−32P〕−ATPにより標識付けされた起動配列（プラ
イマ）を用いて配列決定した。この起動配列は、プラス
ミドpDS8/RBS II,Sph Iの199−218位のヌクレオチドを
含み、Sph I開裂部位のATGから６ヌクレオチド手前で終
っている。
0.3pmolの単離されたプラスミドDNAをアルコールによ
り沈澱させ、沈澱物を80％エタノールで１回洗浄し、乾
燥させ、最後に８μｌの1/4TE緩衝液に溶解させた。2pm
olの起動配列を加えた後に、試料を42℃で５分間インキ
ュベートした。次いでDNAをSangerらの方法（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 74,5463−6567〔1977〕）に従って配列
決定した。
放射的に標識した“プライマ”を用いたため、すべて
の反応は、非標識のデオキシヌクレオチド三リン酸塩を
用いて行なった。DNAの配列分析は、正しいIFN−γ配列
がプラスミドpGLSに組込まれていたことを示した（アミ
ノ酸配列は第40図参照）。
［実施例４］ プラスミドpIFN−γ（−８）の構築 A.基本的事項 プラスミドpIFN−γ（−８）を構築するために、まず
アダプタ２（第11図）をIFN−γ遺伝子中の各Hinf I開
裂部位に結合させた。このアダプタ中の翻訳停止コドン
のために、IFN−γ蛋白質のＣ−末端領域では８個のア
ミノ酸が短縮されている（第14図）。かくして得られた
フラグメント２を、次いでプラスミドpDS8/RBS II,Sph
Iに組み込んだ（第15図）。
B.フラグメント２の調製 3pmolのプラスミドpGLSを、15単位のHinf Iで消化し
た（体積50μｌ、１時間、37℃）。次いで制限酵素を失
活させ（７分間、65℃）、試料をフェノールで抽出し、
エーテルで抽出し、酢酸カリウムおよびアルコールによ
り沈澱させ、乾燥した。沈澱物を50μｌのリガーゼ緩衝
液に溶解させ、100pmolのホスホリル化オリゴヌクレオ
チド（アダプタ２）を、10μｌのHinf I開裂プラスミド
pGLSと混合し、25μｌのリガーゼ緩衝液と１単位のT4−
DNAリガーゼを加えた後に22℃で12時間インキュベート
した。上述したように、試料を加熱することにより反応
を停止させ、DNAを沈澱させた。これに引続いて、制限
酵素EcoR I（15単位）およびHind III（20単位）を用い
て消化を37℃で20時間行なった。加熱による失活、フェ
ノール抽出、エーテルによる抽出およびアルコール沈澱
の後、試料を10μｌの試料用緩衝液に溶解させ、DNAフ
ラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル中で分離し
た。エチジウムブロマイドにより着色した後、DNAバン
ドをUV光（300nm）の下で可視化した。IFN−γ遺伝子を
含んだバンドを殺菌したメスによりゲルから切り出し、
そして前述のようにしてNA45メンブレン上に電気泳動さ
せた。DNAを前述のようにして溶出させ、これにフラグ
メント２の名称を与えた（第14図）。
C.プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iの調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph Iを10単位のEcoR
Iおよび10単位のHind IIIにより体積50μｌ中で37℃に
て１時間消化した。酵素の熱不活性化およびアルコール
沈澱の後、DNA沈澱物を10μｌの試料用緩衝液に溶解さ
せた。１％アガロースゲル中での電気泳動の後、ターミ
ネータto、cat遺伝子、ターミネータT1、複製領域、bla
遺伝子およびプロモータPN25x/0を含んだEcoR I/Hind I
IIフラグメントをゲルから切り出し、前述のようにして
溶出させた。
D.プラスミドpIFN−γ（−８）の組み立て 10μｌの単離されたEcoR I/Hind IIIベクターフラグ
メントおよび単離されたフラグメント２の半分を１単位
のT4リガーゼと共にインキュベートした（20℃、３時
間）。これに並行してフラグメント２を加えない対照連
結を行なった。連結を前述のように試料を加熱すること
により停止させた。
形質転換は、Morrisonの方法（前出文献）に従って、
プラスミドpDMI,1を含んだE.coli M15株を用いて行なっ
た。細胞を100μg/mlのアンピシリンと25μg/mlのカナ
マイシンを含んだLB寒天プレート上に塗布した。このプ
レートを培養装置内で37℃において15時間保った。
対照プレート（＝対照連結）上には形質転換体が見出
されなかった。ベクターDNAとフラグメント２とを用い
た連結は、約500のコロニーを生じた。各コロニーを殺
菌したつまようじにより拾い、100mlのLB培地中に移
し、前述のように生育のために置いた。プラスミドDNA
をBirnboimとDolyの方法（前出文献）に従って単離し
た。各々の場合について、単離され、TE緩衝液中に溶解
された４μｌのプラスミドDNAを、各々の場合について
２単位のEcoR IおよびHind IIIを用い前述のようにして
開裂させた。約450bpの所望の長さを持ったフラグメン
トを全ての試験プラスミドから切り出すことが出来た。
これらのプラスミドに、pIFN−γ（−８）の名称を与え
た（第15図）。
E.プラスミドpIFN−γ（−８）の配列分析 配列分析を実施例３に記載したようにして行なった。
しかしながら、起動配列として、プラスミドpDS8/RBS I
I,Sph Iの928−896位のヌクレオチドを含み、従って、
ターミネータtoの前方に組み込まれたDNAフラグメント
の配列決定を可能とするオリゴヌクレオチドを用いた。
配列分析により、８個のアミノ酸が（カルボキシル末端
において）短縮されたIFN−γ蛋白質をコードするIFN−
γ遺伝子の所望の配列を確認した。
［実施例５］ プラスミドpDS8/RBS II,SpH I−His,His−Xa−BamH Iの
構築 A.基本的事項 プラスミドpDS8/RBS II,SpH I−His,His−Xa−BamH I
を構築するために、２個の隣接したヒスチジンおよびフ
ァクタXaの開裂部位を含む親和性ペプチドをコードする
アダプタ３（第11図）をリボゾーム結合部位RBS II,Sph
Iに結合させた。次に、プロモータPN25x/0および該親
和性ペプチドを含むフラグメント３（第16図）を単離
し、プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iに組込んだ（第17
図）。
B.フラグメント３の調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph Iを制限酵素Sph
Iによって開裂させた。65℃で７分間インキュベートし
て反応を終了させ、試料をフェノール、および次いでエ
ーテルにより抽出し、DNAをアルコールおよび酢酸カリ
ウムで沈殿させた。沈殿物を10μｌのリガーゼ緩衝液に
取り上げ、リガーゼ緩衝液に溶解した25pmolのホスホリ
ル化したアダプタ３（第11図）を添加し、１単位のT4DN
Aリガーゼを添加した後、22℃で３時間インキュベート
した。反応を加熱（７分間、65℃）によって終了させ、
フェノール抽出およびその後のエーテルによる処理の
後、DNAをアルコールおよび酢酸カリウムで沈殿させ
た。沈殿物を30μｌの緩衝液に溶解し、各々10単位の制
限酵素BamH IおよびXho Iを添加し、混合液を、37℃で
２時間インキュベートした。次に、ポリアクリルアミド
ゲル用に10倍に濃縮した3.5μｌの試料緩衝液を試料に
添加し、混合液を、65℃で７分間インキュベートした。
DNAを６％のポリアクリルアミドゲル中で分離し、Xho I
およびBamH Iで遊離させたフラグメントをメスで切断し
た。DNAを前記と同様にして溶出させ、これにフラグメ
ント３の名称を与えた（第16図）。
C.プラスミドpDS8/RBS II,Sph Iの調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph Iを、各々10単位
の制限酵素BamH IおよびXho Iで開裂させた。酵素を熱
不活性化した後、試料をフェノール、および次いでエー
テルで抽出し、DNAをアルコールおよび酢酸カリウムで
沈殿させた。沈殿物を、pH8の50μｌの50mMトリス・HCl
に再けん濁させ、１単位のCLP（前記参照）を添加し、
試料を、37℃で30分間インキュベートした。酵素の熱不
活性化後、試料緩衝液を添加した後、DNAを６％のポリ
アクリルアミドゲル中で分離し、プラスミド体を前記と
同様にしてゲルから溶出させた。
D.プラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa−BamH I
の組立て 前記フラグメント３を、ベクタ体に連結させた（22
℃、２単位のT4DNAリガーゼ、25μｌのリガーゼ緩衝
液）。これと並行して、フラグメント３を添加すること
なく対照の連結を行なった。前記と同様にして連結バッ
チをプラスミドpDM I,1を含むE.coli M15株に形質転換
させ、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナ
マイシンを含んだLBプレートに塗布した。対照の連結の
形質転換は、形質転換体を与えなかった。フラグメント
３を伴なう連結バッチの形質転換は、約100のコロニー
を与えた。各々のコロニーを、前記と同様にして100ml
のLB培地中で生育させ、BirnboimおよびDolyの方法（前
出文献）に従ってプラスミドDNAを単離した。全てのプ
ラスミドは、アダプタによって新たに導入されるNae I
およびNar Iのための開裂部位（第17図参照）を含んで
いた。プラスミドDNAの配列分析を、前記（実施例３、
Ｆ）と同様にして行ない、アダプタ３がベクタ中に正し
く組み込まれていたことを確認した。これらのプラスミ
ドに、pDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa−BamH Iの名称
を与えた（第17図）。
〔実施例６〕 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−ｒの構築 A.基本的事項 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γを構築するため
に、以下のDNAフラグメントを単離し、互いに結合させ
た（第21図）： １）アダプタ４（第11図）と結合するプラスミドpGLSの
IFN−γ遺伝子（フラグメント４、第18図）； ２）プロモータPN25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,Sp
h Iおよび隣接するヒスチジンおよびファクタXaの認識
部位をコードする領域を含むプラスミドpDS8/RBS II,Sp
h I−His,His−Xa−BamH Iのシグナルユニット（フラグ
メント６、第20図）；および ３）プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5A由来のβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子を有する複製領域（フラグメント５、第19
図）。
B.フラグメント４の調製 2pmolのプラスミドpGLSを、制限酵素Nde Iで開裂させ
た。酵素の熱不活性化後、試料をフェノール、および次
いでエーテルで抽出し、DNAを前記と同様にして沈殿さ
せた。沈殿物を、10μｌのリガーゼ緩衝液に溶解させ
た。リガーゼ緩衝液に溶解させた50pmolのホスホリル化
したアダプタ４（第11図）を、Nde I−開裂プラスミドp
GLSに添加し、試料を、２単位のリガーゼと共にインキ
ュベートした（22℃、３時間）。リガーゼの熱不活性化
後、試料をフェノールおよび次いでエーテルで抽出し、
DNAを前記と同様にして沈殿させた。沈殿物を溶解さ
せ、DNAを制限酵素Nar IおよびXba Iで開裂させた。試
料緩衝液を添加し、混合物を65℃で７分間加熱し、６％
のポリアクリルアミドゲル中でDNAを分離した後、IFN−
γ遺伝子を含んだNar I/Xba Iフラグメントを前記と同
様にして単離した。このフラグメントに、フラグメント
４の名称を与えた（第18図）。
C.フラグメント５の調製 2pmolのプラスミドpDS5/RBS II,3A＋5Aを制限酵素Xho
IおよびXba Iで開裂させた。該混合物を前記と同様に
調製し、DNAを６％ポリアクリルアミドゲル中で分離し
た。bla遺伝子および複製領域を含んだフラグメント
を、前記と同様にゲルから単離した。このフラグメント
に、フラグメント５の名称を与えた（第19図）。
D.フラグメント６の調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa
−BamH Iを、制限酵素Xho IおよびNar Iで開裂させた。
試料を調製し、ゲル電気泳動後、プロモータPN25x/0、
リボゾーム結合部位RBS II,Sph Iならびに隣接するヒス
チジンをコードする領域およびファクタXaのための認識
部位を含むフラグメント６を単離した（第20図）。
E.プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γの組立て それぞれ0.5pmolのフラグメント４（第18図）、フラ
グメント５（第19図）およびフラグメント６（第20図）
を、２単位のT4DNAリガーゼと共にリガーゼ緩衝液中で
インキュベートした（22℃、５時間）。酵素の熱不活性
化後、バッチを前記と同様にして、プラスミドpDM I.1
を含んだE.coli M15株に形質転換させ、形質転換混合物
を100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイ
シンを含んだLB寒天プレートに塗布した。37℃で一夜イ
ンキュベートした後、約100の形質転換体が得られた。
各々のコロニーを前記と同様にして100mlのLB培地中で
生育させ、プラスミドをBirnboimおよびDolyの方法（前
出文献）に従って単離した。全てのプラスミドを、制限
酵素Xho I、BamH IおよびXba Iを用いて開裂させ、フラ
グメントを６％のポリアクリルアミドゲル中で分析し
た。制限酵素分析は、プラスミドが３個の所望のフラグ
メントを含んでいたことを示した。配列分析を前記（実
施例３、Ｆ）と同様にして行なったところ、アダプタ４
がIFN−γ遺伝子に正しく融合されていたことを示し
た。これらのプラスミドに、pHis,His−Xa−IFN−γの
名称を与えた（第21図）。これらのプラスミドからコー
ドされるIFN−γ融合蛋白質（アミノ酸配列は第41図参
照）に、His,His−Xa−IFN−γの名称を与えた。
〔実施例７〕 プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）の構築 A.基本的事項 プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）を構築す
るために、以下の３個のDNAフラグメントを互いに結合
させた（第24図）： １）アダプタ５（第11図）の働きにより、エンテロキナ
ーゼ（EK）の認識部位をコードする領域まで延長され
た、プロモータPN25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,Sp
h Iおよび隣接するヒスチジンをコードする領域を含む
プラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa−BamH I由
来のフラグメント（フラグメント７、第22図）； ２）IFN−γ（−８）のための遺伝子を含むプラスミドp
IFN−γ（−８）由来のフラグメント（フラグメント
８、第23図）；および ３）複製領域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を有するプ
ラスミドpDS5/RBS II,3A＋5A由来のフラグメント（フラ
グメント５、第19図） 最後に命名されたフラグメントの調製は、実施例６に
述べられている。
B.フラグメント７の調製 4pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa
−BamH Iを、制限酵素Nae Iで開裂させた。次で、酵素
を熱不活性化させ、試料をフェノール、および次いでエ
ーテルで抽出し、DNAを前記と同様にして沈殿させた。
沈殿物を50μｌのTE緩衝液中に取り出した。1.5pmolの
開裂したDNAを、30pmolのホスホリル化したアダプタ５
（第11図）および７単位のT4DNAリガーゼと共に200μｌ
容量においてリガーゼ緩衝液中で、14時間インキュベー
トした。酵素の熱不活性化後、DNAを制限酵素NdeIおよ
びXhoIで開裂させた。次に、酵素を熱不活性化し、試料
をフェノール、および次いでエーテルで抽出し、DNAを
前記と同様に沈殿させた。沈殿物を試料緩衝液中に取り
出し、混合物を、65℃で７分間インキュベートした。そ
の後、DNAを６％のポリアクリルアミドゲル中で分離し
た。プロモータPN25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,Sp
h Iならびに隣接するヒスチジンおよびエンテロキナー
ゼの認識部位をコードする領域を含む0.2pmolのXho I/N
de Iラグメントを、前記と同様にしてゲルから単離し
た。このDNAフラグメントに、フラグメント７の名称を
与えた（第22図）。
C.フラグメント８の調製 0.5pmolのプラスミドpIFN−γ（−８）を、制限酵素N
de IおよびXba Iで開裂させた。次いで、酵素を熱不活
性化させ、試料をフェノール、および次いでエーテルで
抽出し、DNAを前記と同様にして沈殿させた。沈殿物を
試料緩衝液中に取り出し、該混合物を、65℃で７分間イ
ンキュベートした。次に、DNAを６％のポリアクリルア
ミドゲル中で分離した。IFN−γ（−８）遺伝子、ター
ミネータt0、cat遺伝子およびターミネータT1を含む0.0
5pmolのNde I/Xba Iラグメントを、前記と同様にしてゲ
ルから単離した。このDNAフラグメントに、フラグメン
ト８の名称を与えた（第23図）。
D.プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）の組立て 0.006pmolのフラグメント５（第19図）、0.02pmolの
フラグメント７（第22図）および0.005pmolのフラグメ
ント８（第23図）を、0.5単位のT4DNAリガーゼと共に30
μｌ容量のリガーゼ緩衝液中、15℃で３時間インキュベ
ートした。酵素の熱不活性化後、バッチを前記と同様に
して、プラスミドpDM I.1を含んだE.coli M15株中に形
質転換させ、形質転換混合物を100μg/mlのアンピシリ
ン、25μg/mlのカナマイシンおよび５μg/mlのクロラム
フェニコールを含んだLBプレート上に塗布した。このプ
レートを、37℃で24時間インキュベートした後、得られ
た２つの形質転換体を、100μg/mlのアンピシリン、25
μg/mlのカナマイシンおよび５μg/mlのクロラムフェニ
コールを含む10mlのLB培地中で生育させ、プラスミド
を、BirnboimおよびDolyの方法（前出文献）に従って単
離した。プラスミドを、６％ポリアクリルアミドゲル
中、制限酵素Hind III、Hinf I、Nde I、Sph I,Xba Iお
よびXho Iにより、それらの組成に関し、および0.7％ア
ガロースゲ中で、それらのサイズに関して分析した。両
者のプラスミドは、互いに正しい配向で所望の３つのDN
Aフラグメントを含んでいた。前記したと同様に行なっ
た（実施例３、Ｆ）配列分析では、リボゾーム結合部位
RBS II,Sph Iとそれに続く要素がIFN−γ（−８）遺伝
子に正しく結合されていたことを示した。これらのプラ
スミドに、pHis,His−Ek−IFN−γ（−８）の名称を与
えた（第24図）。これらのプラスミドからコードされた
IFN−γ融合蛋白質（アミノ酸配列は第42図参照）に、H
is,His−Ek−IFN−γ（−８）の名称を与えた。
［実施例８］ プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の
構築 A.基本的事項 プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）を
構築するために、以下の３つのDNAフラグメントを互い
に結合させた（第26図）： １）IFN−γ（−８）遺伝子を含んだプラスミドpIFN−
γ（−８）からのフラグメント（フラグメント８、第23
図、その調製方法は実施例７に述べられている）； ２）上記１）に述べたフラグメントとの結合によりIFN
−γ（−８）の誘導体、IFN−γ（−８）（Asn）がコー
ドされる様に、アダプタ６（第11図）によって、延長さ
れた、プロモータPN25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,
Sph Iおよび隣接するヒスチジンおよびファクタXaの認
識部位をコードする領域を含むプラスミドpDS8/RBS II,
Sph I−His,His−Xa−BamH I由来のフラグメント（フラ
グメント９、第25図）；および ３）複製領域およびβ−ラクタマーゼのための遺伝子を
伴なうプラスミドpDS5/RBS II,3A＋5A由来のフラグメン
ト（フラグメント５、第19図、その調製方法は実施例６
に述べられている） B.フラグメント９の調製 2pmolのプラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa
−BamH Iを、制限酵素Nar Iで開裂させた。次で、酵素
を熱不活性化させ、試料をフェノール、および次いでエ
ーテルで抽出し、DNAを前記と同様にして沈殿させた。
沈殿物を50μｌのTE緩衝液中に取り出した。1pmolの開
裂したDNAを、30pmolのホスホリル化したアダプタ６
（第11図）および５単位のT4DNAリガーゼと共に150μｌ
容量において、リガーゼ緩衝液中、20℃で14時間インキ
ュベートした。酵素の熱不活性化後、DNAを制限酵素Nde
IおよびXho Iで開裂させた。次に、酵素を熱不活性化
後、試料をフェノール、および次いでエーテルで抽出
し、DNAを前記したと同様にして沈殿させた。沈殿物を
試料緩衝液中に取り出し、バッチを、65℃で７分間イン
キュベートした。次で、得られたDNA混合物を、６％の
ポリアクリルアミドゲル中で分離させた。プロモータP
N25x/0、リボゾーム結合部位RBS II,Sph Iならびに隣接
するヒスチジン、ファクタXaの認識部位および酸アミノ
Asnをコードする領域を有する0.25pmolのXho I/Nde Iフ
ラグメントを、前記ゲルから単離した。このDNAフラグ
メントに、フラグメント９の名称を与えた（第25図）。
C.プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の
組立て 0.006pmolのフラグメント５（第19図）、0.005pmolの
フラグメント８（第23図）および0.02pmolのフラグメン
ト９（第25図）を、30μｌのリガーゼ緩衝液および0.5
単位のT4DNAリガーゼ中において、15℃で３時間インキ
ュベートした。酵素の熱不活性化後、バッチを前記と同
様にして、プラスミドpDM I,1を含んだE.coli M15株中
に形質転換させ、形質転換混合物を、100μg/mlのアン
ピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含むLBプレー
ト上に塗布した。プレートを、37℃で一夜インキュベー
トした後、２つのコロニーを、前記と同様にして、100
μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを
含む10mlのLB培地中で生育させ、プラスミドを、Birnbo
imおよびDolyの方法（前出文献）に従って単離した。プ
ラスミドを、６％ポリアクリルアミドゲル中、制限酵素
Hind III、Hinf I,Nde I、Sph I,Xba IおよびXho Iによ
り、それらの組成に関し、および0.7％アガロースゲ中
で、それらのサイズに関して分析した。２つのプラスミ
ドの一方は、互いに正しい配向で所望の３つのDNAフラ
グメントを含んでいた。このプラスミドの配列分析を前
記したと同様に（実施例３、Ｆ）行なったところ、リボ
ゾーム結合部位RBS II,Sph Iとそれに続く要素がIFN−
γ（−８）（Asn）をコードする領域に正しく結合して
いたことを示した。このプラスミドに、pHis,His−Xa−
IFN−γ（−８）（Asn）の名称を与えた（第26図）。こ
のプラスミドからコードされるIFN−γ融合蛋白質（ア
ミノ酸配列は第43図参照）に、His,His−Xa−IFN−γ
（−８）（Asn）の名称を与えた。
［実施例９］ プラスミドp6xHis−DHFRの構築 A.基本的事項 プラスミドp6xHis−DHFRの構築のために、以下のDNA
フラグメントを単離し、互いに結合させた（第28図）： １）プロモータN250PSN250P29およびリボゾーム結合部
位RBS IIを有し、アダプタ７（第11図）に結合されたプ
ラスミドpDS78/RBS IIのシグナルユニット（フラグメン
ト10、第27図）；および ２）プラスミドpDS78/RBS IIの２つのXho I/BamH Iフラ
グメントの大きい方（第28図） B.フラグメント10の調製 2pmolのプラスミドpDS78/RBS IIを、制限酵素BamH I
で開裂させた。酵素の熱不活性化後、試料をフェノー
ル、および次いでエーテルで抽出し、DNAを前記と同様
にして沈殿させた。沈殿物を、10μｌのリガーゼ緩衝液
中に溶解させた。リガーゼ緩衝液に溶解された50pmolの
ホスホリル化したアダプタ７（第27図）を、開裂させた
プラスミドに添加し、試料を２単位のリガーゼと共にイ
ンキュベートした（22℃、３時間）。リガーゼを熱不活
性化した後、試料をフェノール、および次いでエーテル
で抽出し、DNAを前記と同様にして沈殿させた。沈殿物
を溶解し、DNAを制限酵素Xho IおよびBamH Iで開裂させ
た。試料緩衝液を添加し、混合物を、65℃で７分間加熱
し、DNAを６％ポリアクリルアミドゲル中で分離した
後、前記と同様にしてプロモータN250PSN250P29、リボ
ゾーム結合部位RBS IIおよび６個のヒスチジンをコード
する領域を有するXho I/BamH Iフラグメントを単離し
た。このフラグメントに、フラグメント10の名称を与え
た（第27図）。
C.プラスミドpDS78/RBS IIのBamH I/Xho Iフラグメント
の調製 2pmolのプラスミドpDS78/RBS IIを、制限酵素Xho Iお
よびBamH Iで開裂させた。試料を調製し、ゲル電気泳動
にかけた後、複製領域を含むフラグメントを単離した
（第28図）。
D.プラスミドp6xHis−DHFRの組立て それぞれ0.1pmolの特定したフラグメントを、２単位
のT4DNAリガーゼと共にリガーゼ緩衝液中でインキュベ
ートした（22℃、３時間）。酵素の熱不活性化後、混合
物を前記と同様にして、プラスミドpDM I,1を含んだE.c
oli M15株中に形質転換し、形質転換混合物を、100μg/
mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含ん
だLB寒天プレート上に塗布し、プレートを、37℃で一夜
インキュベートした。各々のコロニーを前記と同様の10
mlのLB培地中で生育させ、プラスミドをBirnboimおよび
Dolyの方法（前出文献）によって単離した。酵素Xho I
およびBamH Iを用いた制限酵素分析は、プラスミドが２
つの所望のフラグメントを含んだいたことを示した。前
記と同様にして（実施例３、Ｅ）、配列分析を行ない、
アダプタ７がリボゾーム結合部位に正しく結合していた
ことを確認した。DHFR融合蛋白質(His)6−mDHFRをコー
ドするこれらのプラスミドに、p6xHis−DHFRの名称を与
えた（第28図）。
［実施例10］ プラスミドp4xHis−DHFRの構築 プラスミドp4xHis−DHFRの構築を、プラスミドp6xHis
−DHFRの構築と同様にして（実施例９）行ない、以下の
フラグメントを単離し、結合させた（第30図）： １）プロモータN250PSN250P29およびリボゾーム結合部
位RBS IIを持ち、アダプタ８（第11図）に結合されてい
るプラスミドpDS78/RBS IIのシグナルユニット（フラグ
メント11、第29図）；および ２）プラスミドpDS78/RBS II（第30図）の２つのXho I/
BamH Iフラグメントの大きい方 得られたプラスミドp4xHis−DHFRは、DHFR融合蛋白質
(His)4−mDHFRをコードする。
［実施例11］ プラスミドpRBS II−6xHisの構築 A.基本的事項 プラスミドpRBS II−6xHisの構築のために、以下のDN
Aフラグメントを単離し、互いに結合させた（第32
図）： １）ターミネータt0、cat遺伝子およびターミネータT1
を有し、アダプタ９（６個のヒスチジンをコードする）
によって延長されているプラスミドpDS56/RBS IIからの
領域（フラグメント12、第31図）；および ２）複製領域、bla遺伝子、プロモータN250PSN250P29お
よびリボゾーム結合部位RBS IIを有するプラスミドpDS5
6/RBS IIからのXba I/BamH Iフラグメント（第32図） B.フラグメント12の調製 2pmolのプラスミドpDS56/RBS IIを、制限酵素Hind II
で開裂させた。試料を調製後、50pmolのホスホリル化し
たアダプタ９を、開裂したプラスミドに添加し、試料を
前記したと同様にしてT4DNAリガーゼと共にインキュベ
ートした。この連結バッチを行なった後、DNAを、制限
酵素BamH IおよびXba Iで開裂させ、前記と同様にし
て、６個のヒスチジンをコードする領域、ターミネータ
to、cat遺伝子およびターミネータてT1を有するBamH I/
Xba Iフラグメントを単離した。このフラグメントに、
フラグメント12の名称を与えた（第31図）。
C.プラスミドpDS56/RBS IIのXba I/BamH Iフラグメント
の調製 2pmolのプラスミドpDS56/RBS IIを、制限酵素Xba Iお
よびBamH Iで開裂させ、複製領域、bla遺伝子、プロモ
ータN250PSN250P29およびリボゾーム結合部位RBS IIを
有するフラグメントを前記と同様にして単離した（第32
図）。
D.プラスミドpRBS II−6xHisの組立て 各々0.1pmolの単離したフラグメントを、前記と同様
にして（実施例９、Ｄ）連結させ、次いで、E.coli M15
株（pDM,1）中に形質転換させた。塗布およびインキュ
ベート（実施例９、Ｄ）後、各々のコロニーを、前記と
同様にして10mlの培地中で生育させ、プラスミドをBirn
boimおよびDolyの方法（前出文献）に従って単離した。
酵素BamH IおよびXba Iを用いて制限酵素分析は、プラ
スミドが２つの所望のフラグメントを含んでいたことを
示した。配列分析（実施例３、Ｅ）によって、アダプタ
９がプラスミドDNA中に正しく導入されていたことを確
認した。これらのプラスミドに、pRBS II,6xHisの名称
を与えた。
［実施例12］ プラスミドpRBS II−4xHisの構築 プラスミドpRBS II−4xHisの構築を、プラスミドpRBS
II−6xHisの構築（実施例11）と同様にして行ない、以
下のDNAフラグメントを単離し、互いに結合させた（第3
4図）： １）ターミネータto、cat遺伝子およびターミネータてT
1を有し、アダプタ10（４つのヒスチジンをコードす
る）によって延長されたプラスミドpDS56/RBS IIからの
領域（フラグメント13、第33図）および ２）複製領域、b1a遺伝子、プロモータN250PSN250P29お
よびリボゾーム結合部位pRBS Iを有するプラスミドpDS5
6/RBS IIからのXba I/BamH Iフラグメント（第34図）。
［実施例13］ プラスミドpRBS II−2xHisの構築 プラスミドpRBS II−2xHisの構築を、プラスミドpRBS
II−6xHisの構築（実施例11）と同様にして行ない、以
下のDNAフラグメントを単離し、互いに結合させた（第3
6図）： １）ターミネータto、cat遺伝子およびターミネータT1
を有し、アダプタ11（２つのヒスチジンをコードする）
によって延長されたプラスミドpDS56/RBS IIからの領域
（フラグメント14、第35図）および ２）複製領域、bla遺伝子、プロモータN250PSN250P29お
よびリボゾーム結合部位pRBS IIを有するプラスミドpDS
56/RBS IIからのXba I/BamH Iフラグメント（第36
図）。
［実施例14］ プラスミドpDHFR−6xHisの構築 A.基本的事項 プラスミドpDHFR−6xHisの構築のために、以下のDNA
フラグメントを単離し、互いに結合させた（第37図）。
１）複製領域、bla遺伝子、プロモータN250PSN250P29、
リボゾーム結合部位RBS IIおよびdhfr遺伝子を有するプ
ラスミドpDS78/RBS IIからのXba I/Bg1 IIフラグメント
および ２）６つのヒスチジンをコードする領域、ターミネータ
to、cat遺伝子およびターミネータT1を有するプラスミ
ドpRBS II−6xHisからのBgl II/xBA Iフラグメント 得られたプラスミドpDHFR−6xHisは、dhfr融合蛋白質
Met−mDHFR−(HIS)6をコードする。
B.プラスミドpDS78/RBS IIのXba I/Bg1 IIフラグメント
の調製 2pmolのプラスミドpDS78/RBS IIを、制限酵素Xba Iお
よびBg1 IIを用いて開裂させた。試料を調製後、前記と
同様にして、複製領域、bla遺伝子、プロモータN250PSN
250P29、リボゾーム結合部位RBS IIおよびdhfr遺伝子を
有するXba I/Bgl IIフラグメントを単離した。
C.プラスミドpRBS II−6xHisのBgl IIxba Iフラグメン
トの調製 2pmolのプラスミドpRBS II−6sxHisを制限酵素Bgl II
およびxBa Iを用いて開裂させた。試料を調製後、前記
と同様にして、６つのヒスチジンをコードする領域、タ
ーミネータto、cat遺伝子およびターミネータT1を有す
るBgl II/Xba Iフラグメントを単離した。
D.プラスミドpDHFR−6xHisの組立て それぞれ0.1pmolの単離されたフラグメントを、前記
と同様にして（実施例９、Ｄ）連結させ、E.coli M15株
（pDMI,1）中に形質転換させた。塗布およびインキュベ
ート（実施例９、Ｄ）後、各々のコロニーを、10mlの前
記培地中で生育させ、プラスミドをBirnboimおよびDoly
の方法（前出文献）に従って単離した。酵素Xba Iおよ
びBgl IIを用いた制限酵素分析は、２つのフラグメント
が、所望の様式で互いに結合していたことを示した。こ
れらのフラグメントに、pDHFR−6xHisの名称を与えた。
［実施例15］ プラスミドpDHFR−2xHisの構築 DHFR融合蛋白質Met−mDHFR(His)2をコードするプラス
ミドpDHFR−2xHisの構築を、プラスミドpDHFR−6xHis
（実施例14）の構築と同様にして行ない、以下のDNAフ
ラグメントを単離し、互いに結合、させた（第38図）： １）複製領域、bla遺伝子、プロモータN250PSN250P29、
リボゾーム結合部位RBS IIおよびdhfr遺伝子を有するプ
ラスミドおよび ２）２つのヒスチジンをコードする領域、ターミネータ
to、cat遺伝子およびターミネータT1を有するプラスミ
ドpRBS II−2xHisからのBgI II/XBa Iフラグメント。
［実施例16］ プラスミドp4xHis−DHFR−4xHisの構築 DHFR融合蛋白質(His)4−mDHFR−(His)4をコードする
プラスミドp4xHis−DHFR−4xHisの構築を、プラスミドp
DHFR−6xHisの構築（実施例14）と同様にして行ない、
以下のDNAフラグメントを単離し、互いに結合させた
（第39図）： １）複製領域、b1a遺伝子、プロモータN250PSN250P29、
リボゾーム結合部位RBS II,4xHisおよびdhfr遺伝子を有
するプラスミドp4xHis−DHFRからのXba I/Bgl IIフラグ
メントおよび ２）４つのヒスチジンをコードする領域、ターミネータ
to、cat遺伝子およびターミネータT1を有するプラスミ
ドpRBS II−4xHisからのBg1 II/XBa Iフラグメント。
［実施例17］ NTA樹脂の調製 41.7gのブロム酢酸を、150mlの2N水酸化ナトリウム溶
液に溶解し、０℃に冷却した。これに42gのＮε−Ｚ−
Ｌ−リジンを225mlの2N水酸化ナトリウム溶液に溶解し
た溶液を撹拌しながら０℃でゆっくり滴下した。２時間
後冷却を止め、混合物を一夜撹拌した。反応混合物を、
50℃で２時間保ち、次いで、450mlの1N塩酸を添加し
た。混合物を冷却した後、分離された結晶を濾別した。
生成物を1N水酸化ナトリウム溶液に溶解し、同量の1N塩
酸で再沈殿させ、濾別した。白色結晶、m.p.172−174℃
（分解）、〔α〕Ｄ＝＋9.9°（ｃ＝1:0.1N NaOH）のＮ
−〔５−ベンゾイルオキシカルボニルアミノ−１−カル
ボキシペンチル〕−イミノジ酢酸40gを得た。
得られた7.9gのリジン誘導体を、49mlの1N水酸化ナト
リウム溶液に溶解し、スパチュラの先一杯分の５％Pd/C
を添加後、室温、常圧下で水素添加した。触媒を識別
し、濾液を蒸発させた。6.2gのＮ−〔５−アミノ−１−
カルボキシペンチル〕−イミノジ酢酸を得、その構造
は、NH2(CH2)4-CH(COOH)-N-(CH2COOH)2であることをNMR
スペクトルによって確認した。
100mlのセファロース（Sepharose ）CL−6B（ファル
マシア製）（架橋アガロースを約６％含む、直径45〜16
5μｍのビーズ状ゲル）を、ガラス吸引濾過器上で、約6
00mlの水で２回洗浄し、次いで500ml丸フラスコ中、30
℃で４時間、16mlの4N水酸化ナトリウム溶液および8.22
mlのエピブロムヒドリンと反応させた。反応混合物の全
量は200mlであった。次いで活性化されたセファロース
を濾別し、水で中性洗浄し、反応容器に戻した。6.5gの
Ｎ−〔５−アミノ−１−カルボキシペンチル〕−イミノ
ジ酢酸を50mlの水に溶解し、10.6gの固体炭酸ナトリウ
ムと共に活性化されたセファロースに添加した。混合物
を、60℃で一夜ゆっくりと撹拌した。次いで、式〔セフ
ァロース（Sepharose CL−6B〕−Ｏ−CH2−CH（OH）−
CH2−NH−(CH2)4−CH（COOH）−Ｎ−(CH2COOH)2（NTA樹
脂）を有する得られたキレート樹脂を、クロマトグラフ
ィーカラム中で順次、500mlの水、100mlのNiSO4・6H2O
（２重量％）水溶液、200mlの水、200mlの0.2M酢酸（0.
2M NaClおよび0.1重量／容器％トゥイーン20含有）およ
び200mlの水で洗浄した。式〔セファロース（Sepharose
）CL−6B〕−Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2−NH−(CH2)4−
CH（COOH）−Ｎ−(CH2COO-)2Ni2+の得られたキレート樹
脂中のニッケルイオン濃度は約7.1マイクロモル/mlであ
った。
［実施例18］ 精製IFN−γを用いる金属キレート親和性クロマトグラ
フィー カラム（直径1.6cm、長さ7.0cm）に、式〔セファロー
ス（Sepharose ）CL−6B〕−Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2
−NH−(CH2)4−CH（COOH）−N(CH2COOH)2（NTA樹脂）の
金属を含まないキレート樹脂を充填し、該樹脂をカラム
の３倍容量の0.1M NiSO4・5H2Oですすいでニッケル型に
し、次いで、カラムの３倍容量の0.2M酢酸で洗浄した。
次いで、この樹脂を0.1Mトリス・HCL緩衝液（pH7.5）お
よび0.5M NaClで平衡化した（それぞれの流速:60ml/時
間）。
1mgの精製IFN−γ（実施例３、アミノ酸配列は第40図
参照）を、3mlの平衡緩衝液中に取りカラムにかけた。
酵素免疫検定法〔Gallati,H.,J.Clin.Chem.Clin.Bioche
m.20.907−914（1982）〕によって、２種の内部蛋白質
構造要素Gly−His−SerおよびI1e−His−Gluにもかかわ
らず、NTAカラムへの結合が起こらなかったことが分っ
た。
［実施例19］ NTA樹脂によるHis,His−Xa−IFN−γの精製 プラスミドpDM I,1およびpHis、His−Xa−IFN−γを
含むE.coli M15細胞（実施例６）を、100μg/mlのアン
ピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む１のLB
培地中、37℃で、OD600＝0.6の光学密度になるまで生育
させた。次いでIPTGを添加し（最終濃度0.5mM）、細胞
をさらに４時間インキュベートした。続いて、細胞を、
遠心分離（4000×ｇ、10分間、４℃）によって培地から
分離し（5g湿重量）、15mlの7Mグアニジン・HClおよび
0.01M硼酸ナトリウム（pH8）（１時間、４℃、磁気撹拌
機）で抽出した。
かくして得られた粗抽出液を遠心分離し（10,000×
ｇ、15分、４℃）、上澄みを10倍容量の0.1Mトリス・HC
l緩衝液（pH7.5）および0.5M NaClで希釈し、再び遠心
分離し（10,000×ｇ、15分、４℃）、実施例18で述べた
と同一のNTAカラムにポンプで送った。次いでカラム
を、UV検出器（280mm）が再び基底値を示すまで平衡緩
衝液で洗浄した。His,His−Xa−IFN−γの溶出は、pH値
を5.5に低下させることによって行なった。酵素免疫検
定法〔Gallati,H.、前出文献〕によってこの蛋白質が定
量的にNTAカラムに吸着し、pH値を低下させることによ
ってのみ溶出されることが分った。SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動およびRP−18HPLCによって、得られ
た蛋白質は、純粋なHis,His−Xa−IFN−γ（純度＞90
％）であることが分った。Edman分解によって、期待し
たアミノ末端配列Met−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu
−Gly−Arg−Gln・・・を確認した。
［実施例20］ NTA樹脂によるHis,His−Ek−IFN−γの精製 実施例19と同様の方法によって、His,His−Ek−IFN−
γ（−８）（実施例７）を、E.coli中に発現させ、抽出
しおよびNTAカラムを通じて精製した。この融合蛋白質
は、またpH7.5でNTAカラムに結合し、pH値を5.5に低下
させることによって純粋な形態（純度＞90％）で溶出さ
れた。Edman分解によって、期待した配列Met−His−His
−Ala−Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−Gln・・・を確
認した。
［実施例21］ NTA樹脂によるHis,His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）の
精製 実施例19と同様の方法によって、His,His−Xa−IFN−
γ−（−８）（Asn）（実施例８）を、E.coli中に発現
させ、抽出しおよびNTAカラムを通じて精製した。この
蛋白質をまたpH7.5でNTAカラムに結合させ、pH値を5.5
に低下させることによって純粋な形態（純度＞90％）で
溶出した。
1mgのかくして得られたHis−His−Xa−IFN−γ（−
８）（Asn）を0.1Mトリス・HCl（pH7.5）、0.5M NaClお
よび1mM CaCl2に対して透析させた。透析物（5ml）を、
100μｌ（＝1U）の凝結ファクターXa（ベーリンガー／
マンハイム製）で処理し、22℃で16時間インキュベート
した。His,His−親和性ペプチドの酵素的分解を、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。
塩類、ウシ血清アルブミン（市販ファクタXa製品の成
分）およびファクタXaを分離するために、インキュベー
ト混合物を、まず、水に対して透析し、次に凍結乾燥さ
せ、続いてRP−18 HPLCカラム（Brownlee LabsからのNu
cleosil、5C18カラム、0.1％のトリフルオロ酢酸に対し
て作用、アセトニトリルによる勾配、流速1ml/分）上で
クロマトグラフィーにかけた。次に得られた精製蛋白質
から溶媒を除去し、Edman分解に付した。
期待したアミノ末端配列Gln−Asn−Pro−Tyr・・・が
この方法によって確認された。
この実験は、His−His−Xa−IFN−γ（−８）（Asn）
のNH2末端に於ける親和性配列が、金属キレート親和性
クロマトグラフィー後、はっきりと開裂され得ることを
示す。
［実施例22］ 6Mグアニジン・HCl中のNTA樹脂による(His)6−mDHFRの
精製 実施例19と同様の方法によって、(His)6−mDHFR（実
施例９）をE.coli中に発現させた。該細胞を0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH8.0）中の6Mグアニジン・HClで抽
出した（1gの細胞に対して5mlの緩衝液、１時間、22
℃、磁気撹拌機）。かくして調製した粗抽出物を、続い
て遠心分離し、上澄み液を実施例18で述べたと同一のNT
Aカラムにポンプで送った。使用された緩衝液を除き、
実施例19と同様にして、クロマトグラフィーを行なっ
た。使用した緩衝液は、それぞれの場合、以下のpH値を
有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中に6Mグアニジン・
HClを含んでいた。蛋白質を適用するためにpH8.0、非結
合E.coli蛋白質を洗出するためにpH6.0および(His)6−m
DHFRを溶出するためにpH4.5.得られた溶出液を水に対し
て透析し、次いで凍結乾燥した。SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって、得られた蛋白質は純粋な(H
is)6−mDHFR（純度＞90％）であることが分った。Edman
分解によって、期待した配列Met−Arg−Gly−Ser−His
−His−His−His−His−His−Gly−Ser−Ile−Met・・
・を確認した。
〔実施例23〕 6Mグアニジン・HCl中のNTA樹脂による(His)4−mDHFR−
(His)4の精製 実施例19と同様の方法によって、(His)4−mDHFR−(Hi
s)4（実施例16）を、E.coli中に発現させ、抽出しおよ
びNTAカラムを通じて精製した。実施例22において使用
した段階勾配の代わりに直線pH勾配溶出を使用した（pH
8.0−pH4.0、２時間）。(His)4−mDHFR−(His)4融合蛋
白質はpH4.9で溶出され、少なくとも90％の純度を有し
ていた。
［実施例24］ 6M尿素中のNTA樹脂によるMet−mDHFR−(His)6の精製 実施例19と同様の方法によって、Met−mDHFR−(His)6
（実施例14）を、E.coli中に発現させた。遠心分離で得
た細胞を、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）、6M
尿素で抽出し（1gの細胞に対して10mlの緩衝液）、超音
波処理した（10分間）。細胞破片を遠心分離した後、上
澄み液を、抽出緩衝液で平衡化したNTAカラム（4.5cm×
2.6cm）にかけた。抽出緩衝液を用いてカラムを洗浄
後、Met−mDHFR−(His)6融合蛋白質を、１時間当り18ml
のポンプ流速で５時間、pH7.5（抽出緩衝液）からpH4.8
（6M尿素を含む0.05リン酸ナトリウム緩衝液）の直線pH
勾配を用いて溶出させた。SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって、蛋白質を含んだフラクションを分
析した。9mgのMet−mDHFR−(His)6融合蛋白質を純度＞9
0％で得た。
［実施例25］ NTA樹脂によるMet−mDHFR−(His)2の精製 実施例19と同様の方法によって、Met−mDHFR−(His)2
（実施例15）を、E.coli中に発現させた。0.1M塩化カリ
ウムおよび0.1％のトゥイーン20を含む0.05Mリン酸カリ
ウム緩衝液中（pH8.0）の遠心分離した細胞を、氷浴中
で15分間、超音波で処理した（1gの細胞に対して10mlの
緩衝液）。次いで細胞破片を遠心分離し、清澄な上澄み
液を、抽出緩衝液で、平衡化したNTAカラム（4.6cm×2.
6cm）にかけた。カラムを抽出緩衝液で洗浄し、Met−mD
HFR−(His)2融合蛋白質を、１時間当り50mlのポンプ流
速で10時間、pH8.0（抽出緩衝液）からpH5.0（0.1M塩化
カリウムおよび0.1％ツイーン20を含む0.05Mリン酸カリ
ウム緩衝液）の直線pH勾配を用いて溶出させた。SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ピークフラ
クションの溶出液を分析した。7mgのMet−mDHFR−(His)
2融合蛋白質を純度＞85％で得た。
かくして得られた3mgの融合蛋白質Met−mDHFR−(His)
2を、６℃で0.05Mトリス・HCl（pH6.0）に対して透析し
た。次に蛋白質溶液を、0.5M NaOHを用いてpH9.0に調節
し、ウシ膵臓からの8.5単位のカルボキシペプチターゼ
Ａ（Serva.Feinbiochemica,Heidelberg BRD）の存在
下、37℃でインキュベートした。０分、15分、30分、90
分および180分後、試料を取り除き、HPLCによって、そ
れらのヒスチジン含有量を分析した。480分後、pH値を
8.0に低下させ、反応混合液を、0.05Mリン酸カリウム緩
衝液（pH8）で平衡化した。NTAカラムにポンプで送っ
た。反応混合液に含まれている蛋白質は、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による流れの過程（flow−th
rough）において検出された。さらに時間に伴なって増
加するヒスチジン残基の量が、15分、30分、90分および
180分後に蛋白質溶液から取り除かれた試料中に検出さ
れた。
この実験は、NTA樹脂上での精製後、カルボキシ末端
における親和性配列がはっきり取り除かれ得るというこ
とを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpDS8/RBS II,Sph I、 第２図は、プラスミドpDS8/RBS II,Sph IのXho I/Xba I
フラグメントのヌクレオチド配列、 第３図は、プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5A、 第４図は、プラスミドpDS5/RBS II,3A＋5Aのヌクレオチ
ド配列、 第５図は、プラスミドpDS78/RBS II、 第６図は、プラスミドpDS78/RBS IIのヌクレオチド配
列、 第７図は、プラスミドpDS56/RBS II、 第８図は、プラスミドpDS56/RBS IIのヌクレオチド配
列、 第９図は、プラスミドpDM I,1、 第10図は、プラスミドpDM I,1のヌクレオチド配列、 第11図は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、 第12図は、フラグメント１の構築および単離、 第13図は、プラスミドpGLSの構築、 第14図は、フラグメント２の構築および単離、 第15図は、プラスミドpIFN−γ（−８）の構築、 第16図は、フラグメント３の構築および単離、 第17図は、プラスミドpDS8/RBS II,Sph I−His,His−Xa
−BamH Iの構築、 第18図は、フラグメント４の構築および単離、 第19図は、フラグメント５の単離、 第20図は、フラグメント６の単離、 第21図は、プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γの構築、 第22図は、フラグメント７の構築および単離、 第23図は、フラグメント８の単離、 第24図は、プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）
の構築、 第25図は、フラグメント９の構築および単離、 第26図は、プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）
（Ans）の構築、 第27図は、フラグメント10の構築および単離、 第28図は、プラスミドp6xHis−DHFRの構築、 第29図は、フラグメント11の構築および単離、 第30図は、プラスミドp4xHis−DHFRの構築、 第31図は、フラグメント12の構築および単離、 第32図は、プラスミドpRBS II−6xHisの構築、 第33図は、フラグメント13の構築および単離、 第34図は、プラスミドpRBS II−4xHisの構築、 第35図は、フラグメント14の構築および単離、 第36図は、プラスミドpRBS II−2xHisの構築、 第37図は、プラスミドpDHFR−6xHisの構築、 第38図は、プラスミドpDHFRR−2xHisの構築、 第39図は、プラスミドp4xHis−DHFR−4xHisの構築、 第40図は、プラスミドpGLSによりコードされるIFN−γ
遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配
列、 第41図は、プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γによりコ
ードされるIFN−γ融合遺伝子のヌクレオチド配列およ
び対応するアミノ酸配列、 第42図は、プラスミドpHis,His−Ek−IFN−γ（−８）
によりコードされるIFN−γ融合遺伝子のヌクレオチド
配列および対応するアミノ酸配列、 第43図は、プラスミドpHis,His−Xa−IFN−γ（−８）
（Asn）によりコードされるIFN−γ融合遺伝子のヌクレ
オチド配列および対応するアミノ酸配列を各々示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エリッヒ・ホフリ スイス国アリスドルフ4411・キルハッカ ストラッセ25 (72)発明者 ディートリッヒ・スティバー ドイツ国グレンツアッハ‐ウイーレン Ｄ‐7889 (56)参考文献 特開 昭61−148197（ＪＰ，Ａ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リガンドに対して高い親和性を有する、少
    なくとも２個の直接隣接するヒスチジン残基を含む１種
    または２種の親和性ペプチドおよび（２）この１種また
    は２種の親和性ペプチドに直接的または間接的に結合さ
    れる生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質からな
    ることを特徴とする融合蛋白質。
  2. 【請求項２】該親和性ペプチドが式 R1−(His)2-6−R2 （式中R1は、水素、１個のアミノ酸または数個のアミノ
    酸の配列を示し、R2は、Ｑ、Ｑ−Ile−Glu−Gly−Arg−
    またはＱ−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−を示し、および
    Ｑはペプチド結合、１個のアミノ酸または数個の、最大
    30個のアミノ酸の配列を示す） を有することを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白
    質。
  3. 【請求項３】該親和性ペプチドが次式 Met−His−His, Met−His−His−His, Met−His−His−His−His, Met−His−His−His−His−His, Met−His−His−His−His−His−His, Met−His−His−Ala−Gly−Ile−Glu−Gly−Arg または、 Met−His−His−Ala−Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys のペプチド配列を有することを特徴とする請求項１また
    は請求項２に記載の融合蛋白質。
  4. 【請求項４】１つの親和性ペプチドが該生物学的に活性
    なポリペプチドまたは蛋白質のアミノ末端アミノ酸また
    はカルボキシ末端アミノ酸に直接的または間接的に結合
    していることを特徴とする請求項１ないし請求項３のい
    ずれかに記載の融合蛋白質。
  5. 【請求項５】１つの親和性ペプチドが該生物学的に活性
    なポリペプチドまたは蛋白質のアミノ末端アミノ酸に直
    接的または間接的に結合し、かつ他の親和性ペプチドが
    該生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋白質のカルボ
    キシ末端アミノ酸に結合していることを特徴とする請求
    項１ないし請求項３のいずれかに記載の融合蛋白質。
  6. 【請求項６】該親和性ペプチドが固定化ニッケルイオン
    に錯化することを特徴とする請求項１ないし請求項５の
    いずれかに記載の融合蛋白質。
  7. 【請求項７】該生物学的に活性なポリペプチドまたは蛋
    白質がヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列もしく
    はその部分配列またはマウスジヒドロ葉酸塩還元酵素の
    アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし
    請求項６のいずれかに記載の融合蛋白質。
  8. 【請求項８】微生物的に調製された融合蛋白質であるこ
    とを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれかに記
    載の融合蛋白質。
  9. 【請求項９】E.coliにより調製されることを特徴とする
    請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の融合蛋白
    質。
  10. 【請求項１０】均質な形態であることを特徴とする請求
    項１ないし請求項９のいずれかに記載の融合蛋白質。
  11. 【請求項１１】請求項１ないし請求項９のいずれかに記
    載の融合蛋白質をコードすることを特徴とする遺伝子。
  12. 【請求項１２】請求項11に記載の遺伝子が発現制御配列
    に有効に結合されていることを特徴とする発現ベクタ
    ー。
  13. 【請求項１３】グラム陰性菌内で複製可能であることを
    特徴とする請求項12に記載の発現ベクター。
  14. 【請求項１４】E.coli内で複製可能であることを特徴と
    する請求項13に記載の発現ベクター。
  15. 【請求項１５】請求項12ないし請求項14に記載の発現ベ
    クターにより形質転換されている細菌。
  16. 【請求項１６】請求項12ないし請求項14に記載の発現ベ
    クターにより形質転換されているE.coli株。
  17. 【請求項１７】請求項12ないし請求項14に記載の発現ベ
    クターにより形質転換されているE.coli M15株。
  18. 【請求項１８】細菌宿主を請求項12ないし請求項14のい
    ずれかに記載の発現ベクターにより形質転換し、該形質
    転換体を適当な生育条件下で培養し、該融合蛋白質を単
    離することを特徴とする請求項１ないし請求項９のいず
    れかに記載の融合蛋白質の製造方法。
  19. 【請求項１９】請求項１ないし請求項９のいずれかに記
    載の融合蛋白質を含む溶液を下記構造 キャリア・マトリックス−スペーサーNH− (CH2)X-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Ni2+ （式中、Ｘは2,3または４を示す） を有する金属キレート樹脂に接触させ、該負荷された樹
    脂を洗浄液を用いて処理することにより該融合蛋白質を
    溶出させることを特徴とする該融合蛋白質の精製方法。
  20. 【請求項２０】該キャリア・マトリックスが架橋アガロ
    ースを約６％含む、直径45〜165μｍのビーズ状ゲルで
    あることを特徴とする請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】該スペーサが−Ｏ−CO−または −Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2−であることを特徴とする請
    求項19または請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】請求項１ないし請求項９のいずれかに記
    載の融合蛋白質を請求項19ないし請求項21のいずれかに
    記載の方法により精製し、次いで該親和性ペプチドを選
    択的開裂により除去することを特徴とする生物学的に活
    性なポリペプチドまたは蛋白質の精製方法。
  23. 【請求項２３】該親和性ペプチドの開裂にプロテアーゼ
    を用いることを特徴とする請求項22記載の方法。
  24. 【請求項２４】プロテアーゼがファクターXaであること
    を特徴とする請求項23記載の方法。
  25. 【請求項２５】（１）リガンドに対して高い親和性を有
    する、少なくとも２個の直接隣接するヒスチジン残基を
    含む１種または２種の親和性ペプチドおよび（２）この
    １種または２種の親和性ペプチドに直接的または間接的
    に結合される、HIV−１およびHIV−２のエンベロープ並
    びに構造蛋白質から選択される生物学的に活性なポリペ
    プチドまたは蛋白質からなる請求項１ないし請求項６お
    よび請求項８ないし請求項10のいずれかに記載の融合蛋
    白質を含むことを特徴とする感染症判定用試薬。
  26. 【請求項２６】請求項22ないし請求項24のいずれかに記
    載の方法による生物学的に活性なポリペプチドの精製に
    おいて、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の融
    合蛋白質を使用する方法。
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