FI116068B - Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi - Google Patents
Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI116068B FI116068B FI20031319A FI20031319A FI116068B FI 116068 B FI116068 B FI 116068B FI 20031319 A FI20031319 A FI 20031319A FI 20031319 A FI20031319 A FI 20031319A FI 116068 B FI116068 B FI 116068B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- vector
- gene
- arad
- seq
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 28
- 238000010187 selection method Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 77
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 11
- 108090000416 L-ribulose-5-phosphate 4-epimerases Proteins 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 claims description 4
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 20
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 20
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 20
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N D-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 4
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N Rbl5P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108700003859 araC Genes Proteins 0.000 description 3
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N D-xylulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-CRCLSJGQSA-N L-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 1
- 101150064223 PAG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 108700017804 supF tRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 1
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
, 116068
Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, baktee-risolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee uutta selektiojärjestelmää, joka perus-5 tuu araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin käyttöön selektiomerkkinä, ja bakteerisolun, josta puuttuu araD-geeni, käyttöön. Esillä oleva keksintö koskee lisäksi uusia vektoreita, jotka sisältävät araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin, ja uusia bakteerikantoja, joista puuttuu araD-10 geeni. Esillä oleva keksintö koskee lisäksi menetelmää plasmidilla transformoitujen solujen valitsemiseksi, joka plasmidi sisältää mielenkiinnon kohteena olevan geenin.
Keksinnön tausta
Oleellinen edellytys bakteerien ja muiden soluviljelmissä lisättävien 15 solujen tehokkaalle geneettiselle manipuloinnille on kyky valikoida solut, joilla on spesifinen genotyypin muutos. Yleisin valintastrategia yhdistelmä-DNA- tekniikassa on sisällyttää selektiomerkki kloonausvektoriin tai -plasmidiin. Se- lektiomerkki voi olla kloonattu geeni tai DNA-sekvenssi, joka sallii selektiomer- kin sisältävien isäntäsolujen erottamisen soluista, jotka eivät sitä sisällä. Selek- 20 tiomerkki yhdessä sopivan valintaväliaineen kanssa pitää kloonausvektorin so- '·' * luissa. Muuten, koska plasmidien replikaatio on energiaa kuluttava taakka bak- ‘ : teeri-isännälle, kasvavassa viljelmässä bakteereilla, jotka ovat menettäneet • · » : V plasmidin, olisi kasvuetu plasmidin sisältäviin soluihin nähden.
Useimmissa tarkoituksissa antibioottiresistenssigeeni on yleisesti 25 käytetty selektiomerkki. Kuitenkin rekombinanttilääkkeiden valmistuksessa, jol-loin päämääränä on saada aikaan korkealla saannolla tuotetta, kuten DNA-rokotetta, annettavaksi potilaille, antibioottiresistenssigeenien käyttö aiheuttaa on-: gelmia: antibiooteille resistenttien patogeenien leviäminen on vakava maailman- ’···[ laajuinen ongelma [Levy, S. B., J. Antimicrob. Chemother. 49 (2002) 25 - 30].
• I
30 Tämän vuoksi antibioottiresistenssigeenejä ei voida laajasti käyttää farmaseut-: '· tisessa teollisuudessa, ja esimerkiksi Yhdysvaltojen terveysviraston sääntöjen mukaan antibioottiresistenssigeenit eivät ole sallittuja kokeellisissa DNA-rokotteissa, jotka menevät kolmanteen faasiin.
.···, Vaihtoehtoisesti on ehdotettu antibioottia sisältämättömiä selek- 35 tiojärjestelmiä. Tällaisia antibioottia sisältämättömiä selektiojärjestelmiä ovat 116068 2 esimerkiksi bakteeritoksiini-antitoksiinijärjestelmät [Engelberg-Kulka, H. ja Glaser, G., Annu Rev Microbiol 53 (1999) 43 - 70], geenit, jotka ovat vastuussa resistenssistä raskasmetalleja, kuten telluuria, vastaan [Silver, S. ja Phung, L. T, Annu Rev Microbiol 50 (1996) 753 - 789], ja järjestelmät, joissa 5 plasmidi koodaa geeniä, joka täydentää isännän auksotrofiaa [Wang, M.D., et ai., J. Bacteriol. 169(1987) 5610-5614], US-patenttihakemuksessa 2000/0014476 A1 esitetään yleisesti mm. ei-antibioottisen selektiomerkin käyttö, joka merkki voi olla geeni, jonka tuote on tarpeellinen solun metabolialle tietyissä viljelyolosuhteissa, kuten katabo-10 liageeni, joka mahdollistaa sen, että solu voi assimiloida tiettyä viljelyväliai-neessa läsnä olevaa ainetta (spesifinen hiili- tai typpilähde) jne. Tällaisista sopivista geeneistä ei anneta spesifisiä esimerkkejä. Tämä lähestymistapa ei välttämättä ole sovellettavissa kaupalliseen tuotantoon, sillä oleellisen komponentin, kuten aminohapon tai hiililähteen, pois jättäminen kasvatusväliai-15 neesta vähentää saantoa, mikä ei ole toivottavaa. Lisäksi kasvatusväliaineen manipulointi siten, että jätetään pois oleellinen ravintoaine, voi merkittävästi lisätä kasvatusväliaineen kustannuksia, koska kaupallisesti saatavissa olevat ravintoaineseokset on korvattava yksittäisillä ravintoaineilla.
Kaupallisissa terapeuttisissa tarkoituksissa olisi edullista käyttää 20 geeniä, joka ei ole oleellinen isännän kasvulle mutta jonka manipulointi silti vaikuttaa kasvuun valituissa olosuhteissa. Lisäksi, kun otetaan huomioon tera-peuttinen käyttö, olisi edullista käyttää geeniä, jonka poistaminen johtaa sel-laisten yhdisteiden kerääntymiseen, jotka ovat toksisia isäntäsolulle, mutta jotka eivät ole toksisia nisäkkäille ihmiset mukaan lukien. Olisi myös edullista 25 käyttää pienempiä geenejä, jotka puolestaan sallisivat pienempien plasmidien •«· rakentamisen, jolloin replikaatioon tarvittava energian kulutus on pienempi ja • · siten bakteeriviljelmän kasvunopeus ja plasmidisaanto paranevat.
Keksinnön lyhyt kuvaus • Esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusi antibioottia ; ’ ”: 30 sisältämätön selektiojärjestelmä, jonka avulla vältetään aikaisemmin kuvattujen ,,· selektiojärjestelmien ongelmat, käytettäväksi rekombinanttien terapeuttisten : t ’ ’ tuotteiden valmistuksessa.
Keksinnön toinen tarkoitus on antaa käyttöön uusi antibioottia sisäl-tämätön selektiojärjestelmä, jota voidaan käyttää ympäristön ja potilasturvalli-.··. 35 suuden kannalta turvallisesti rekombinanttien terapeuttisten tuotteiden valmis tuksessa.
116068 3
Vielä eräs keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusi antibioottia sisältämätön selektiojärjestelmä, jota voidaan käyttää kustannustehokkaasti re-kombinanttien terapeuttisten tuotteiden valmistuksessa tavanomaisia kasva-tusväliaineita käyttäen.
5 Vielä eräs keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusi antibioottia si sältämätön selektiojärjestelmä, jolla saadaan aikaan lisääntynyt kasvunopeus ja parantunut saanto.
Vielä toinen esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusi vektori, joka sisältää selektiomerkin, joka ei ole toksinen ympäristölle eikä ih-10 misille ja joka kykenee pitkäaikaiseen ylläpitoon isännässä.
Vielä toinen esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön uusi isäntäsolu, joka sisältää geenivirheen, joka ei ole vahingollinen ympäristölle.
Vielä toinen esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan geenin sisältävien solujen valitse-15 miseksi rekombinanttien terapeuttisten tuotteiden valmistuksessa.
Havaittiin yllättäen, että esillä olevan keksinnön tarkoitukset saavutetaan käyttämällä araD-geeniä, sen komplementaarista sekvenssiä tai sen ka-talyyttisesti aktiivista fragmenttia selektiomerkkinä ja käyttämällä spesifistä bakteeri-isäntää, josta puuttuu araD-geeni.
20 Siten esillä oleva keksintö antaa käyttöön uuden selektiojärjestel- män, joka käsittää vektorin, joka kantaa araD-geeniä eli L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasia (EC 5.1.3.4.) koodaavaa geeniä, sen komplementaarista sek-:· · venssiä tai sen katalyyttisesti aktiivista fragmenttia selektiomerkkinä, ja baktee- • ri-isännän, erityisesti Escherichia co//-kannan, josta puuttuu araD-geeni.
• · 25 Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön uusia vektoreita, jotka sisältävät araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyytti-sesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä.
*** Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön uusia bakteerikantoja, joista puuttuu araD-geeni.
: 30 Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön menetelmän plasmidilla ···' transformoitujen solujen valitsemiseksi, joka plasmidi sisältää 1) araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä, ja 2) mielenkiinnon kohteena olevan geenin, jolloin menetelmässä insertoidaan mainittu plasmidi isäntäsoluun, josta puuttuu araD, ja : ‘‘ 35 kasvatetaan soluja kasvatusväliaineessa, joka sisältää arabinoosia.
116068 4
Piirustukset
Kuvio 1 esittää arabinoosin käytön E. coli -solujen hiililähteenä (Lin, 1987).
Kuvio 2 esittää S6wtd1EGFP:n kartan. d1EGFP:n, E2:n ja kanamy-5 siiniresistenssimerkin aminoglykosidi-3’-0-fosfotranseraasi (kana) koodaavat sekvenssit on merkitty nuolilla. Lisäpiirteet on osoitettu täytetyillä laatikoilla: 10E2BS - 10 korkean affiniteetin BPV-E2-sitoutumiskohtaa; CMV-tk - ihmisen sytomegaloviruksen välitön varhainen promoottori ja HSV-Th-geenin johtose-kvenssi; introni - kanin beetaglobiinigeenin introni, jossa on optimoidut SD- ja 10 SA-kohdat; tkpa - HSV-Tk-geenin polyadenylaatiosignaali; RSV LTR - Rousin sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto; bgh pA - naudan kasvuhormoni-geenin polyadenylaatiosignaali; pUCori - pUC18-plasmidista peräisin oleva bakteeriperäinen replikaation aloituskohta.
Kuvio 3 esittää S6wtd1EGFP/cana/araD1:n kartan. d1EGFP:n, E2:n, 15 kanamysiiniresistenssimerkin aminoglykosidi-3'-0-fosfotransferaasi (kana) ja L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (araD) koodaavat sekvenssit on merkitty nuolilla. Lisäpiirteet on osoitettu täytetyillä laatikoilla: 10E2BS - kymmenen korkean affiniteetin BPV-E2-sitoutumiskohtaa; CMV-tk - ihmisen sytomegaloviruksen välitön varhainen promoottori ja HSV-Th-geenin johtosekvenssi; 20 introni - kanin beetaglobiinigeenin introni, jossa on optimoidut SD- ja SA-kohdat; tkpa - HSV-Tk-geenin polyadenylaatiosignaali; RSV LTR - Rousin v : sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto; bgh pA - naudan kasvuhor- monigeenin polyadenylaatiosignaali; pUCori - pUC18-plasmidista peräisin ole-j va bakteeriperäinen replikaation aloituskohta.
·:*: 25 Kuvio 4 esittää S6wtd1 EGFP/cana/araD2:n kartan. d1EGFP:n, E2:n, kanamysiiniresistenssimerkin aminoglykosidi-3'-0-fosfotransferaasi (kana) ja "·. L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (araD) koodaavat sekvenssit on merkitty
I * I
nuolilla. Lisäpiirteet on osoitettu täytetyillä laatikoilla: 10E2BS - kymmenen • korkean affiniteetin BPV-E2-sitoutumiskohtaa; CMV-tk - ihmisen sytomega-30 loviruksen välitön varhainen promoottori ja HSV-Th-geenin johtosekvenssi; *; introni - kanin beetaglobiinigeenin introni, jossa on optimoidut SD- ja • ’·· SA-kohdat; tkpa - HSV-Tk-geenin polyadenylaatiosignaali; RSV LTR - Rousin sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto; bgh pA - naudan kasvuhor-monigeenin polyadenylaatiosignaali; pUCori - pUC18-plasmidista peräisin ole-35 va bakteeriperäinen replikaation aloituskohta.
116068 5
Kuvio 5 esittää S6wtd1 EGFP/araD1 :n kartan. d1EGFP:n, E2:n ja L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (araD) koodaavat sekvenssit on merkitty nuolilla. Lisäpiirteet on osoitettu täytetyillä laatikoilla: 10E2BS - kymmenen korkean affiniteetin BPV-E2-sitoutumiskohtaa; CMV-tk - ihmisen sytomega-5 loviruksen välitön varhainen promoottori ja HSV-Th-geenin johtosekvenssi; introni - kanin beetaglobiinigeenin introni, jossa on optimoidut SD- ja SA-kohdat; tkpa - HSV-Tk-geenin polyadenylaatiosignaali; RSV LTR - Rousin sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto; bgh pA - naudan kasvuhormoni-geenin polyadenylaatiosignaali; pUCori - pUC18-plasmidista peräisin oleva 10 bakteeriperäinen replikaation aloituskohta.
Kuvio 6 esittää S6wtd1EGFP/araD2:n kartan. d1EGFP:n, E2:n ja L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (araD) koodaavat sekvenssit on merkitty nuolilla. Lisäpiirteet on osoitettu täytetyillä laatikoilla: 10E2BS - kymmenen korkean affiniteetin BPV-E2 -sitoutumiskohtaa; CMV-tk - ihmisen sytomegalo-15 viruksen välitön varhainen promoottori ja HSV-Th-geenin johtosekvenssi; introni - kanin beetaglobiinigeenin introni, jossa on optimoidut SD- ja SA-kohdat; tkpa - HSV-Tk-geenin polyadenylaatiosignaali; RSV LTR - Rousin sarkoomaviruksen pitkä terminaalinen toisto; bgh pA - naudan kasvuhor-monigeenin polyadenylaatiosignaali; pUCori - pUC18-plasmidista peräisin ole-20 va bakteeriperäinen replikaation aloituskohta.
Kuvio 7A ja 7B esittävät S6wtd1EGFP/araD1:n (7A) ja v ' S6wtd1EGFP/araD2:n (7B) plasmidi-DNA:n, joka on uutettu E. coli -kannasta ':·*! AG1 delta araD ja kasvatettu eri väliaineissa, elektroforeettisen analyysin.
Kuvio 8 esittää S6wtd1EGFP/araD1:n ja S6wtd1EGFP/araD2:n
• I
25 plasmidi-DNA:n, joka on uutettu E. coli -kannasta AG1 delta araD, restriktio-mallianalyysin.
•
Kuvio 9 esittää S6wtd1EGFP/araD2:n elektroforeettisen analyysin I » stabiiliusmäärityksessä.
, , Kuvio 10A ja 10B esittävät S6wtd1EGFP/araD2:n restriktiomalliana- : 30 lyysin stabiiliusmäärityksessä.
' ' Kuvio 11 esittää AGIAaraD S6wtd1 EGFP/araD2:n syöttöpanosfer- mentaation kasvuparametrit, jotka mitattiin ja rekisteröitiin fermentaation aika--. na. Lyhenteet ovat seuraavat: sPump = syöttönopeus; p02 = hapen konsent- raatio; Temp = kasvulämpötila; mys = haluttu kasvunopeus; OD = absorbanssi * 35 aallonpituudella 600nm.
116068 6
Kuvio 12 esittää AGIAaraD S6wtd1EGFP/araD2:n hajotus- ja puh-distuskaavion.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Esillä oleva keksintö perustuu pyrkimykseen löytää vaihtoehtoinen 5 antibioottia sisältämätön selektiojärjestelmä, jota voitaisiin käyttää sellaisten rekombinanttien terapeuttisten tuotteiden tuotannossa, jotka on tarkoitettu annettaviksi in vivo, erityisesti DNA-rokotteiden tuotannossa. Yllättäen havaittiin, että araD-geeniä, joka on mukana pentoosifosfaattireitissä sekä prokaryootti-sissa että eukaryoottisissa organismeissa, kuten nisäkkäissä ihmiset mukaan 10 lukien, voidaan käyttää menestyksekkäästi selektiomerkkinä auksotrofisessa isäntäsolussa plasmidille. Auksotrofian käytöllä on se etu, ettei siinä käytetä eikä siinä muodostu toksisia aineita, jotka myöhemmin voisivat kontaminoida plasmidivalmisteen.
Tehokas selektiojärjestelmä, joka perustuu araD/araC-geeneihin, on 15 rakennettu [Ariza, R. R., et ai., Carcinogenesis 14 (1993) 303-305]. Tätä selek-tiojärjestelmää on kuitenkin käytetty tutkittaessa mutageneesin mekanismeja, mutta sitä ei ole aikaisemmin käytetty selektiomerkkinä plasmidin ylläpidosta. Ariza et ai. käyttivät kantaa, jossa araC-geeni sisältää terminaatiokodonin ja araD-geeni on inaktivoitu. supF-geenin tuote, joka koodaa suppressori-20 tRNA:ta, vietiin plasmidiin. Aktiivisen suppressori-tRNA:n läsnä ollessa muo-’ ‘ dostui entsymaattisesti aktiivinen tuote araC:stä, mikä aiheutti solujen kasvun pysähtymisen (koska araD oli inaktiivinen). Tämä järjestelmä sallii mutaatioi- I » * : V den suppression tutkimisen supF-tRNA:n avulla: kun supf inaktivoidaan mu- taatiolla, solut voivat kasvaa arabinoosilla. Siten tämä selektiojärjestelmä pe-25 rustuu araC-geeniin eikä araD-geeniin. araD:tä ei viety plasmidiin, eikä järjes-telmää kuvattu eikä karakterisoitu plasmidien tuotantotarkoituksiin.
* · » araD-geeni koodaa entsyymiä, joka on vastuussa ribuloosi-5-: fosfaatin epimerisaatiosta ksyluloosi-5-fosfaatiksi (kuvio 1), ja siten sallii ara- binoosin käytön pentoosifosfaattireitissä [Engelsberg, E., et ai., J. Bacteriol. 84: T 30 (1962) 137-146]. Jos araD inaktivoidaan, ribuloosi-5-fosfaattia kerääntyy bak- : teerisoluun, mikä johtaa kasvun pysähtymiseen.
, , Jos araD:n kromosomaalinen kopio inaktivoidaan isäntäsolussa ja : \ koskematon kopio araD-geenistä, sen komplementaarisesta sekvenssistä tai sen katalyyttisestä aktiivisesta fragmentista insertoidaan plasmidiin, saavute-“ 35 taan plasmidia sisältävien solujen kasvuetu väliaineessa, joka sisältää L-arabinoosi, tuloksena kahdesta vaikutuksesta. Ensiksi, plasmidia sisältävät 116068 7 solut voivat käyttää arabinoosia hiililähteenä, ja toiseksi, toksista ribuloosi-5-fosfaattia ei keräänny. Tämä sallii arabinoosilla täydennetyn rikkaan kasvatus-väliaineen käytön. Rikkaissa väliaineissa E. coli -solut kasvavat nopeasti ja plasmidisaanto on korkea. Hinnaltaan edullisia bakteerien kasvatusväliainei-5 den standardikomponentteja, kuten hiivauutetta, voidaan käyttää aminohappo-lähteenä. Ribuloosi-5-fosfaattijäämät, jotka teoreettisesti voisivat kontaminoida plasmidivalmisteen, eivät ole ongelma, kun valmiste annetaan in vivo, sillä ih-missolut voivat tehokkaasti metaboloida ribuloosi-5-fosfaattia, eikä se ole toksinen.
10 Keksintö koskee selektiojärjestelmää, joka käsittää vektorin, jossa on araD-geeni eli L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (EC 5.1.3.4.) geeni, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarinen sekvenssi tai sen katalyyttisesti aktiivinen fragmentti selektiomerkkinä, ja bakteerisolun, josta puuttuu araD-geeni. Kun spesifistä isäntää, josta puuttuu 15 araD-geeni, viljellään arabinoosin läsnä ollessa, ainoat henkiin jäävät solut ovat soluja, jotka sisältävät vektorin, joka sisältää araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin.
Keksinnön mukaisessa selektiojärjestelmässä voidaan käyttää mitä tahansa ekspressiovektoria, jota tavallisesti käytetään terapeuttisten tuotteiden 20 valmistuksessa, jolloin araD-geeni, sen komplementaarinen sekvenssi tai sen katalyyttisesti aktiivinen fragmentti insertoidaan vektoriin käyttäen alalla ylei-: sesti tunnettuja menetelmiä. Tässä yhteydessä araD-geeni käsittää sekvens- ·:··: sin, jota identifioi sekvenssi tunnusnumero 1, sen komplementaarinen sek- j··*,. venssi tai siihen hybridisoituva sekvenssi. Tässä yhteydessä termillä "sek- 25 venssin tunnusnumero 1 komplementaarinen sekvenssi" on sen tavanomainen merkitys ja termi "araD-geenin katalyyttisesti aktiivinen fragmentti" on mikä ta-hansa geenifragmentti, joka koodaa polypeptidiä tai proteiinia, joka kykenee epimerisoimaan L-ribuloosi-5-fosfaatin D-ksyluloosi-5-fosfaatiksi. Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa araD-geeni, sen komplementaarinen sekvenssi • ” ’ 30 tai sen katalyyttisesti aktiivinen fragmentti insertoidaan vektoriin, joka kykenee pitkäaikaiseen ylläpitoon ja siten kykenee saamaan aikaan halutun antigeenin tai haluttujen antigeenien pysyvän ekspression.
.*·*. Siten keksintö koskee myös vektoria, joka käsittää araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarisen : *' 35 sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä.
8 1 16068
Erityisen edullisessa keksinnön suoritusmuodossa käytetty vektori on ekspressiovektori, joka käsittää: (a) DNA-sekvenssin, joka koodaa tumaan ankkuroivaa proteiinia, joka on operatiivisesti kytketty heterologiseen promoottoriin, jolloin mainittu 5 tumaan ankkuroiva proteiini käsittää (i) DNA:ta sitovan domeenin, joka sitoutuu spesifiseen DNA-sekvenssiin, ja (ii) funktionaalisen domeenin, joka sitoutuu tuman komponenttiin, tai sen funktionaalisen ekvivalentin, ja (b) multimeroidun DNA-sekvenssin, joka muodostaa sitoutumiskohdan tumaan ankkuroivalle proteiinille, jolloin mainitusta vektorista puuttuu pa- 10 pilloomaviruksen replikaation aloituskohta, ja (c) araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen kata-lyyttisesti aktiivisen fragmentin.
Tällaisia vektoreita on kuvattu yksityiskohtaisesti kansainvälisessä patenttihakemuksessa W002/090558, joka sisällytetään tähän viitteenä.
15 Edullisin esillä olevan keksinnön mukaisessa valintamenetelmässä käytetty vektori on ekspressiovektori, joka käsittää: (a) naudan papilloomaviruksen tyypin 1 (BPV) E2-proteiinin ja (b) lukuisia BPV-E2-proteiinin sitoutumispaikkoja inkorporoituna vektoriin kimppuna, jolloin paikat voivat olla päästä-häntään-rakenteita tai ne 20 voidaan sisällyttää vektoriin erillään oleviin paikkoihin, jolloin mainitusta vektorista puuttuu papilloomaviruksen replikaation aloituskohta, ja :T: (c) araD-geenin, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen kata- ·:··· lyyttisesti aktiivisen fragmentin.
!'·*; Keksinnön mukaisessa selektiojärjestelmässä voidaan periaatteessa 25 käyttää mitä tahansa tunnettua isäntää, josta puuttuu araD-geeni ja joka on sopi- va käytettäväksi terapeuttisten tuotteiden tuotannossa. Tässä yhteydessä termi "josta puuttuu" tarkoittaa isäntää, josta araD-geeni on kokonaan poistettu tai se on inaktivoitu millä tahansa tunnetulla menetelmällä.
, . Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään Escherichia * · « :;j : 30 co//-kantaa, edullisesti kaupallisesti saatavissa olevia E. coli -kantoja AG1 ja *··· JM109, joista araD-geeni on poistettu yleisesti tunnetuilla menetelmillä, kuten jäljempänä esimerkeissä kuvatuilla menetelmillä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaupallisesti saatavissa olevia E. coli -kantoja AG1 ja JM 109, joissa araD-geeni on inaktivoitu millä tahansa tunnetulla menetelmällä.
• · * »· •» » 116068 9
Keksintö koskee erityisesti muunnettua E. coli -kantaa AG1 ja muunnettua E. coli -kantaa JM 109, joista puuttuu araD-geeni, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi.
Keksintö koskee lisäksi menetelmää sellaisten solujen valikoimisek-5 si, jotka on transformoitu plasmidilla, joka sisältää araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä ja mielenkiinnon kohteena olevan geenin, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että insertoidaan plasmidi isäntäsoluun, josta puuttuu araD, jolla on sekvenssillä 10 tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, ja viljellään soluja kasvatusväliaineessa, joka sisältää arabinoosia. Menetelmässä sellaisten solujen valikoimiseksi, jotka sisältävät mielenkiinnon kohteena olevan geenin, rekombinanttien terapeuttisten tuotteiden tuottamiseksi, mielenkiinnon kohteena oleva geeni insertoidaan isäntäsoluun, josta puuttuu araD, käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä 15 ja soluja viljellään kasvatusväliaineessa, joka sisältää arabinoosia, viljelyväliai-neessa ja olosuhteissa, jotka sopivat kyseiselle isännälle.
Mitä tahansa kasvatusväliainetta, joka sopii E. coli -solujen viljelyyn, voidaan käyttää. Kaupallisessa tuotannossa kasvatusväliaine luonnollisesti optimoidaan saannon suhteen. Esimerkkejä sopivista kasvatusväliaineista ovat 20 kaupallisesti saatavissa olevat kasvatusväliaineet, kuten M9 ja LB (joita on saatavissa useilta valmistajilta, kuten yhtiöstä Fermentas, Liettua). Kasvatus-:T: väliaineeseen lisättävän arabinoosin määrä ei ole kriittinen, mutta luonnollisesti ·:··· arabinoosia tulisi olla läsnä määrä, joka riittää koko viljelyajanjakson ajan.
Niinkin alhaisen määrän kuin 0,1 % on havaittu olevan riittävä selektiolle. Tyy- > » 25 pillisesti arabinoosia lisätään väliaineeseen määrä, joka on noin 0,1 - 2,0 %, ·.*. edullisesti määrä, joka on noin 0,2 -1,0 %, edullisemmin 0,2 -% 0,5 %. Kuiten- kin L-arabinoosin vaikutus havaitaan niinkin matalissa pitoisuuksissa kuin 0,01 %, ja L-arabinoosia voidaan lisätä kasvatusväliaineeseen jopa 5 %:iin asti. Erityisessä suoritusmuodossa, jossa L-arabinoosia käytetään sekä valikoivana ai-: 30 neena että rajoitettuna hiililähteenä, 0,2% L-arabinoosia on sopiva määrä lisät- *·. ‘ täväksi kasvatusväliaineeseen.
Keksinnön mukainen selektiojärjestelmä sopii käytettäväksi missä tahansa ekspressiojärjestelmässä. Se sopii erityisen hyvin käytettäväksi in vivo -käyttöön tarkoitettujen rekombinanttien terapeuttisten tuotteiden, kuten DNA- * « : ' 35 rokotteiden, ekspressiossa, koska vältetään ongelmat, jotka liittyvät antibiootti- • · 116068 10 resistenssigeenien käyttöön. Samoin keksinnön mukainen selektiojärjestelmä sopii käytettäväksi rekombinanttiproteiinien tuotannossa.
Mahdollisella valmistusmenetelmästä johtuvalla arabinoosikontami-naatiolla lopputuotteessa ei ole merkitystä, koska arabinoosi on syötäväksi 5 kelpaava sokeri, jota on luonnostaan ja lisäaineena ruoka-aineissa ja siten se ei ole toksinen nisäkkäille ihminen mukaan lukien.
Lisäksi araD-geeni on kooltaan pienempi kuin tavallisesti käytetyt antibioottiresistenssigeenit esim. ampisilliniä ja tetrasykliiniä vastaan ja samankokoinen kuin kanamysiini- ja kloramfenikoliresistenssigeenit. Tämä antaa 10 lisäedun, sillä se sallii pienempien plasmidien rakentamisen, joiden plasmidien replikaatioon käyttämä energiankulutus on pienempi kuin isoilla plasmideilla. Tällöin sekä bakteeriviljelmän kasvunopeus että plasmidisaanto kasvavat.
Esillä oleva keksintö voidaan ymmärtää paremmin seuraavien ei-rajoittavien, esimerkkeinä keksinnöstä annettujen esimerkkien perusteella.
15 Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön edullisten suoritusmuotojen valaisemiseksi täydellisemmin. Niitä ei kuitenkaan tule pitää mitenkään keksinnön laajaa suoja-alaa rajoittavina.
Esimerkki 1 araD-selektioplasmidien kloonaus 20 araD-selektiokonstruktien kloonaamiseksi käytettiin plasmidia « · · S6wtd1EGFP (kuvio 2). Siinä on pMB1- replikaation aloituskohta ja kanamysii- • · .. . niresistenssimerkki funktionaalisina elementteinä plasmidirungossa. Kanamy- ' siiniresistenssin näissä plasmideissa tuottaa geeni, joka on peräisin E.coli - - ·»«· transposonista Tn903.
• » • ‘ 25 araD-geeni monistettiin käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR) E. coli DH5a:n kromosomista standardimenetelmän mukaisesti. PCR-tuote kloonattiin valittuihin plasmideihin kahdessa eri orientaatiossa alu-·,; j kepareilla s6araDL1 + s6araDR1 tai s6araDL1 + s6araDR1, jota saivat aikaan tuotteet, jotka nimettiin araD1:ksi ja vastaavasti araD2:ksi: 30 s6araDL1:
;..! ’ CGCCAT GGTT CT CAT GTTT GACAGCTTAT CAT CGAT AAGCTTT A
* ·; · * ATGCGGTAGl I IAGCACGAAGGAGTCAACATG (sekvenssi tunnusnumero 2); i ' . s6araDR1:
:;;;: CGCCATGGACTAGTAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCT
35 GTCATTACTGCCCGTAATATGC (sekvenssi tunnusnumero 3); 116068 11 s6araDL2: CGCCAT GG ACTAGTT CT CAT GTTT G ACAGCTT AT CAT CG AT MG CTTT AAT G CG GTAGTTT AGCACG AAG G AGT CAACAT G (sekvenssi tunnusnumero 4); 5 s6araDR2: CGCCATGGAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCAT-TACTGCCCG (sekvenssi tunnusnumero 5);
Alukkeet suunniteltiin siten, että P2-promoottori plasmidista pBR322 (jota käytettiin tetrasykliiniresistenssigeenin ajamiseksi pBR322:een) ja termi-10 naatiosekvenssi E. colin trp-operonista lisättiin PCR:n aikana ylävirtaan ja vastaavasti alavirtaan araD:ta koodaavasta sekvenssistä.
814 ja 815 emäsparin PCR-tuotteet kloonattiin pUC18-vektoriin, joka oli linearisoitu Hindi:lla (Fermentas, Liettua) ja oikeat sekvenssit varmistettiin sekvensoimalla käyttäen universaaleja sekvensointialukkeita 15 M13F22: GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA (sekvenssi tunnusnumero 6) ja M13R24: GAGCGGATAACAATTTCACACAGG (sekvenssi tunnusnumero 7) ja araD-spesifisiä alukkeita 20 araDF311: CCAACTCACCGGCTGCTCTATC (sekvenssi tunnusnumero 8), araD F614: ·:·· AATGCCGAAGATGCGGTGCATAAC (sekvenssi tunnusnumero 9), araD R700: • · 25 TAACTGCGGCGCTAACTGAC (sekvenssi tunnusnumero), ja » * ;v< araDR421: GGTTGCTGGAATCGACTGAC (sekvenssi tunnusnumero 11).
’···’ Mutaatiot monistetuissa sekvensseissä korjattiin eri kloonien re- kombinaatiolla.
i 30 araD:n kloonaamiseksi S6wtd1EGFP:hen, vektori linearisoitiin osit- •* » täisellä digeroinnilla restriktioentsyymillä Pagl (asema 4761) (Fermentas, Liet- \‘.it tua) ja DNA-5'-päät defosforyloitiin vasikan suolen alkalisella fosfataasilla ,···. (CIAP; Fermentas, Liettua). araD1- ja araD2-fragmentit leikattiin pUC18:sta
• I
_]·’ Ncoklla (Fermentas, Liettua) ja ligatoitiin S6wtd1 EGFP/Pagl:een.
i ’ ' 35 Molemmat ligaatioseokset transformoitiin E. coli DH5a -kompe- tentteihin soluihin ja levitettiin maljoille, jotka sisälsivät LB-väliainetta, jossa oli 116068 12 50 pg/ml kanamysiiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli. Pesäkkeet analysoitiin ensin pesäke-PCR:llä ja sen jälkeen DNA eristettiin ja digeroitiin eri restriktio-entsyymeillä.
Kloonaus johti plasmideihin S6wtd1EGFP/cana/araD1, 5 S6wtd1 EGFP/cana/araD2, jotka on esitetty kuvioissa 3 ja 4.
Kanamysiiniresistenssimerkkigeenin poistamiseksi plasmideista S6wtd1EGFP/cana/araD1 ja S6wtd1EGFP/cana/araD2 digeroitiin restriktioen-donukleaasilla Bcul (Fermentas, Liettua) ja 6473 emäsparin vektorifragmentti ligatoitui itsestään.
10 Ligaatioseokset transformoitiin E. coli AG1 AaraD -kantaan (katso esimerkki 2) ja levitettiin maljoille, jotka sisälsivät M9-väliainetta, jota oli täydennetty 2 %:lla L-arabinoosia, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 36 tuntia. Pesäkkeet analysoitiin ensin pesäke-PCR:llä ja sen jälkeen DNA eristettiin ja digeroitiin eri restriktioentsyymeillä. Kloonaus johti plasmideihin S6wtd1EGFP/araD1 ja vas-15 taavasti S6wtd1 EGFP/araD2, jotka esitetään kuvioissa 5 ja 6.
Bakteeripesäkkeitä, jotka sisälsivät S6wtd1EGFP/araD1:tä ja S6wtd1EGFP/araD2:ta, kasvatettiin kahdessa eri väliaineessa: LB:ssä, jota oli täydennetty 2,5 %:lla L-arabinoosia, ja M9:ssa, jota oli täydennetty 0,2 %:lla L-arabinoosia, 37 °C:ssa voimakkaasti ravistellen. Solut otettiin talteen ja plasmi-20 di-DNA uutettiin soluista käyttäen QIAprep Spin Miniprep Kit -kittiä (QIAGEN) ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (kuviot 7A ja vastaavasti 7B).
:T: Plasmidi-DNA-näytteet viljelmistä LB-ja M9-väliaineissa analy- ·:··· soitiin agaroosigeelielektroforeesilla ennen ja jälkeen digestion restriktio- endonukleaasilla Pagl (Fermentas, Liettua) (kuvio 8). Pagl-digestiossa 25 saatujen fragmenttien ennustetut koot olivat 3954 ja 2519 emäsparia • · S6wtd1EGFP/araD1:lle ja 4315 ja 2157 emäsparia S6wtd1EGFP/araD2:lle. \.!t lambda-DNA:ta, joka oli digeroitu Eco91l:llä (M15 kuviossa 8C), ja lambda- DNA:ta, joka oli digeroitu EcoRI/Hindl11:ila (Fermentas, Liettua) (M3 kuviossa 8C), käytettiin molekyylipainomerkkeinä. Kaikki analysoidut kloonit olivat * 30 oikein restriktioentsyymianalyysissä, mutta DNA-saanto oli hyvin matala, kun plasmideja kasvatettiin LB-väliaineessa. Kahdella neljästä analysoidusta S6wtd1 EGFP/araD2-kloonista (nro 13 ja nro 14 kuviossa 8B) oli korkeampi .···. kopioluku, kun niitä kasvatettiin M9-väliaineessa, jota oli täydennetty 0,2 %:lla ,.· L-arabinoosia (kuviot 7 ja 8).
• < I
I I
116068 13
Esimerkki 2
Arabinoosiherkkien ΔaraD Escherichia coli -kantojen muodostaminen.
Kahta E. coli -kantaa, AG1 ja JM 109, käytettiin AaraD-mutanttien muodostamiseen. araD-geeni E. coli -genomissa tuhottiin menetelmällä, jonka 5 ovat kuvanneet Datsenko ja Wanner [PNAS 97 (2000) 6640 - 6645]. Tässä menetelmässä käytetään hyväksi faagi λ Red -rekombinaatiosysteemiä. Lyhyesti kuvattuna tämän systeemin strategia on korvata kromosomaalinen sekvenssi valikoitavissa olevalla antibioottiresistenssigeenillä, joka muodostetaan PCR:llä käyttäen alukkeita, joissa on homologisia pidennyksiä. Tämä saadaan 10 aikaan Red-välitteisellä rekombinaatiolla näissä reunustavissa homologeissa.
pKD46:n [Datsenko ja Wanner, PNAS 97 (12) (2000)], joka koodaa faagi A rekombinaatiosysteemiä, transformoimiseksi E. coli -kantoihin AG1 ja JM109, nämä solut tehtiin kemiallisesti kompetenteiksi käyttäen RF1- ja RF2-liuoksia: 15 RF1 100ml__
RbCI______IJ^g_
MnCI2 4H2Q ___0,99 g_ 1 M KAc pH 7,5__3ml_
CaCI2 2H2Q__0,15 g_ v : Glyseroli__15 g l pH 5,8 (lisää CH3COOH:ta) • · · ·:·: RF2100ml _ 0,5 M MOPS__2_ml_ j"’: RbCI__0,12 g_
CaCI2 2H2Q__1J_g_ : Glyseroli__15 g_ ,···.’ pH 6,8 (lisää NaOH) • » * · ·* '· 20 Soluja kasvatettiin 2 ml.ssa LB-väliainetta tiheyteen OD600 0,2 - 0,5.
Viljelmä sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan RF1:tä.
t Seosta pidettiin jäiden päällä 10 min ja sentrifugoitiin. Pelletti suspendoitiin !··-. 100 //l:aan RF2:ta ja suspensiota pidettiin jäiden päällä 30 - 45 minuuttia.
• »
Noin 50 ng pKD43:a lisättiin ja soluja pidettiin jäiden päällä vielä 30 minuuttia, 116068 14 minkä jälkeen annettiin 5 minuutin lämpösokki 37 °C:ssa. Kymmenen minuutin jäiden päällä inkuboinnin jälkeen 900 μΙ SOB-väliainetta lisättiin transformoituihin soluihin ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa yksi tunti. Solut levitettiin LB-väli-aineelle, joka sisälsi ampisilliiniä (100 /vg/ml). Pesäkkeet poimittiin transfor-5 maatiolevyiltä ja niitä kasvatettiin 2 ml:ssa samaa väliainetta tiheyteen OD6oo noin 1 ja glyserolikantavalmisteet valmistettiin (2 ml viljelmää + 0,6 ml 50-%:ista glyserolia). Kantavalmisteita varastoitiin -80 °C:ssa.
araD-geenin tuhoamiseksi muodostettiin lineaarinen PCR-tuote, joka sisältää kanamysiiniresistenssigeenin. Plasmidia pKD13 (Datsenko ja Wan-10 ner, PNAS voi. 97, nro 12, kesäkuu 2000) käytettiin PCR-templaattina. Käytetyt alukkeet olivat ara(pr1) ja ara(pr4): ara( pr1) 5'-CTCAAACGCCCAGGTATTAGAAGCCAACCTGGCGCTGCC-AAAACACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3' (sekvenssi tunnusnumero 12) 15 ara(pr4) 5'-GGTTT GAT CACAAAGACGCCGCGCT CGCGAT CAACGG-CGCATTCCGGGGATCCGTCGACC 3' (sekvenssi tunnusnumero 13) Näissä alukkeissa on PCR:ssä hybridisaatioon pKD13:n kanssa ja araD-geenin kanssa homologiseen rekombinaatioon tarvittavat komplementit 20 sekvenssit.
PCR-reaktioseos oli seuraava: PFU- natiivi puskuri (5 μ\), 10 mM dNTP (5 μΙ), aluke ara(pr1) 10 μΜ (1 μΙ), aluke ara(pr4) 10 μΜ (1 μΙ), *:'*· pKD13 100 ng (2μΙ), DMSO (4μΙ), PFU 2,5 U (1 μΙ) ja mQ-vesi δΟμΙ^θη asti.
PCR-menetelmä oli seuraava: denaturaatio 45 s, 96 Ό, hybridi- • * 25 saatio 45 s, 50 °C, synteesi 2 min 30 s, 72 °C, 25 sykliä. Saatu PCR-tuote oli 1,4 kiloemästä.
i · ,*··, Viisi reaktiota suoritettiin samanaikaisesti, DNA puhdistettiin 2-%:isesta agaroosigeelistä käyttäen Ultrapure Puhdistus Kit -kittiä (MoBio La-. , botratories Inc.) ja eluoitiin 60 μΙ-.lla vettä. DNA konsentroitiin etanolisaostuk- » I t / 30 sella ja liuotettiin δμΙ^η vettä. Loppupitoisuus oli 0,6 μg/μl. Yhteen elektropo- “·;·* raatioon käytettiin 1,5μΙ:η määrä.
, PCR-tuote vietiin elektroporaatiolla AG1 pKD46- (Datsenko ja :** ; Wanner, supra) ja JM109 pKD46 E. coli -soluihin. Ensin 200 ml YENB-väli- ainetta, joka sisälsi 10 mM L-arabinoosia rekombinaatiosysteemin indusoimi- * * ·., ’ 35 seksi ja 100 μg/ml ampisilliiniä, siirrostettiin yön yli -viljelmään AG1 pKD46:ta ' ja JM 109 pKD46:ta. Viljelmiä kasvatettiin 30 °C:ssa tiheyteen Οϋθοο 116068 15 0,8 (JM109) ja 0,6 (AG1). Bakteerit otettiin talteen sentrifugoimalla kierrosno-peudella 4 000 g 10 minuuttia 4 °C:ssa, pestiin kahdesti 20 ml.lla steriiliä vettä ja kerran 20 ml:lla steriiliä vettä, joka sisälsi 10 % glyserolia. Solut suspendoi-tiin 300 //haan vettä, joka sisälsi 10 % glyserolia. 40 μΙ kompetentteja soluja 5 käytettiin yhteen elektroporaatioon.
Elektroporaatio suoritettiin BioRad E. coli Pulser -laitteella käyttäen 0,2 cm:n kyvettejä ja 2,5 kV:n jännitettä. Puhdistettu PCR-tuote (1,5 μΙ) lisättiin kompetentteihin soluihin, niitä pidettiin jäiden päällä 1 minuutti ja välittömästi elektroporaation jälkeen 2 ml lämmintä SOB-väliainetta lisättiin soluihin ja seo-10 sta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunti. Solut levitettiin LB-väliaineelle, joka sisälsi ka-namysiiniä (25 μg/ml). 100 pg suurta kanamysiinille resistenttiä plasmidia (GTU-MultiHIV C-clade) käytettiin positiivisena kontrollina, negatiiviseen kontrolliin ei lisätty plasmidia. Transformaatiotehokkuus oli 106 AG1:lle ja 107 JM 109:lle positiivisen kontrollin suhteen. Negatiivisella kontrollilevyllä ei oils lut pesäkkeitä, 215 pesäkettä saatiin JM109+PCR-tuotelevyllä ja 70 pesäkettä AG 1 +PCR-tuotelevyllä.
Esimerkki 3 E. coli AGIAaraD-ja JM109AaraD-kantojen testaus
Pesäkkeet, jotka oli saatu elektroporaatiosta esimerkissä 2 kuvatulla 20 tavalla, testattiin kanamysiiniresistenssigeenin läsnä olon suhteen pesäke-PCR:llä käyttäen alukkeita araVIisF (5' CGGCACGAAGGAGTCAACAT 3’; • * ;Vi sekvenssi tunnusnumero 14) ja araVIisR (5’ TGATAGAGCAGCCGGTGAGT 3’; • t • sekvenssi tunnusnumero 15), jotka sisältävät hybridisaatiokohdat araD- / geenissä lähellä insertiokohtaa. Odotettiin saatavan 272 emäsparin PCR-tuote I · i 25 E. coli AG1- ja JM109-kannoista, joissa ei ollut insertiota araD:ssä, ja 1545 emäsparin tuote, jos PCR-tuote oli insertoitu araD-geeniin. Yhdeksän pesäkettä AG1AaraD:tä ja 14 pesäkettä JM109AaraD:tä 15 pesäkkeestä tarkistettiin ja
• I
;,· · ne antoivat 1545 emäsparin tuotteen. Siten pääteltiin, että nämä kannat sisäl- sivät kanamysiiniresistenssigeeni-insertion.
30 Kanamysiinigeenin insertion varmistamiseksi suoritettiin toinen pe- "... säke-PCR käyttäen alukkeita kanaSF (5TCAGATCCTTGGCGGCAAGA3'; sekvenssi tunnusnumero 16) ja araVR (5TGTAATCGACGCCGGAAGGT3'; • · i ’·· sekvenssi tunnusnumero 17). Nämä alukkeet tuottavat 435 emäsparin tuot- teen, jos kanamysiiniresistenssigeeni on insertoitu araD-geeniin. Kuusi pesä-35 kettä molemmista kannoista testattiin ja kaikki antoivat oikean tuotteen.
116068 16
Kuusi AGIAaraD-pesäkettä ja kuusi JM109AaraD-pesäkettä levitettiin LB-väliaineelle, joka sisälsi 25 /vg/ml kanamysiiniä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli pKD46-plasmidin eliminoimiseksi, jossa plasmidissa on lämpötilaherkkä replikaation aloituskohta. Solut testattiin ampisilliiniherkkyyden suhteen replica 5 plating -menetelmällä LB-väliaineella ja LB-väliaineella, joka sisälsi ampisillii-niä. Yksikään ei kasvanut väliaineella, joka sisälsi ampisilliiniä, ja pääteltiin, että bakteerit eivät enää sisällä pKD46-plasmidia.
Tuotettujen AGIAaraD- ja JM109AaraD-kantojen arabinoosiherk-kyys testattiin. Yksi pesäke AG1AaraD:tä ja yksi pesäke JM109AaraD:tä siir-10 rostettiin kukin 2 ml:aan LB:tä. Viljelmiä kasvatettiin 8 tuntia, ne laimennettiin 1:100 M9-väliaineeseen, joka sisälsi 0,2 % glyserolia, 25 /yg/ml kanamysiinia ja 0,01 % tiamiinia (0,05% proliinia JM109AaraD:lle), ja eri pitoisuudet L-arabi-noosia lisättiin kasvatusväliaineeseen. Viljelmiä kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistusinkubaattorissa ja OD60o mitattiin (taulukko 1).
15
Taulukko 1. Arabinoosiherkkyyden testaus L-arabinoosi-% AGIAaraD OD6oo JM109AaraD OD6oo 0 3,2 1,9 0,1 0,03 0,03 0,2 0,030 0,026 ·:··: 0,5 0,030 0,020 1 0024 0,025 ' 2 0,017 0,021 ,! Kuten taulukosta 1 nähdään, niin alhainen määrä kuin 0,1 % L-arabi- 20 noosia riittää inhiboimaan keksinnön mukaisten AaraD-kantojen kasvun.
Lisäksi testattiin AaraD-kantojen plasmidi-DNA-saanto.
I t
Plasmidi S6wtd1EGFParaD2, joka oli valmistettu esimerkissä 1 ku- vatulla tavalla, transformoitiin AGIAaraD- ja JM109AaraD-kantoihin. Kompe- ·’·„ tentit solut valmistettiin RF1- ja RF2-liuoksia käyttäen esimerkissä 2 kuvatulla .··· 25 tavalla.
•»·
Transformaatiolevyiltä saadut pesäkkeet siirrostettiin 2 ml:aan • · : " M9-väliainetta, joka sisälsi 0,5 % hiivauutetta ja 25 /;g/ml kanamysiiniä + 0,01 % :: tiamiinia + L-arabinoosia (2 % ja 0,2 %).
17 1 1 6068
Viljelmiä inkuboitiin 37 °C:ssa 17 tuntia. Sitten ODöoo mitattiin soluti-heyden kvantitoimiseksi ja plasmidi-DNA uutettiin Qiagen Miniprep Kit -kitillä. Kerrointa 2,8 (OD6oo/ml) käytettiin miniprep-erityksessä verrannollisten tulosten saamiseksi. Tulokset esitetään taulukossa 2.
5 DNA-konsentraatio mitattiin spektrofotometrillä absorbanssina aal lonpituudella 260 nm. Mikroskooppista analyysiä varten tippa bakteeriviljelmää levitettiin lasisille objektilaseille ja peitettiin peitinlasilla. Viljelmää tarkasteltiin 10Ox-objektiivilla öljyimersiota käyttäen.
10 Taulukko 2. AaraD-kantojen plasmidi-DNA-saanto
Plasmidi-DNA
L-arabinoosi Plasmidi-DNA Näkymä
Kanta OD6oo saanto (jug per ml (%) pit. (jjg/μI) mikroskoopissa viljelmää) AGIAaraD 2 7,6 0,039 5,3 Ei filamentteja AGIAaraD 0,2 5,8 0,057 5,9 Ei filamentteja
Vain muutamia JM109AaraD 2 4,9 0,043 3,8 filamentteja Vain muutamia JM109AaraD 0,2 4,3 0,038 2,9 filamentteja ' . Näiden tulosten mukaan 0,2 % L-arabinoosia on riittävä saman tasoisen plasmidikopiolukumäärän saamiseksi kuin 2 % arabinoosilla.
15 Tässä plasmidiAGIAaraD näyttää olevan parempi, sillä sekä plas- midisaanto että myös solutiheydet ovat hieman korkeampia.
Esimerkki 4 , , S6wtd1EGFP/araD2:n stabiilius * · *
Rokotusvektorin tärkeä piirre on stabiilius bakteerisoluissa lisäänty- • · **;·' 20 misen aikana. S6wtd1EGFP/araD2:n stabiiliuden testaamiseksi bakteereissa : plasmidi transformoitiin E. coli AGIAaraD- ja JM109AaraD-kantoihin, jotka oli valmistettu esimerkissä 2 ja vektorin koskemattomuutta seurattiin plasmidi-./ DNA-analyysillä neljän sukupolven aikana.
Plasmidi S6wtd1EGFP/araD2 sekoitettiin kompetenttien E. coli 25 AGIAaraD- ja JM109AaraD-solujen kanssa ja inkuboitiin jäiden päällä 30 mi- 116068 18 nuuttia. Tämän jälkeen solususpensio altistettiin lämpösokille 3 minuutin ajaksi 37 °C:ssa, mitä seurasi nopea jäähdyttäminen jäiden päällä. Yksi millilitra LB-väliainetta lisättiin näytteeseen ja seosta inkuboitiin 45 minuuttia 37 °C:ssa voimakkaasti ravistaen. Lopuksi osa soluista levitettiin maljoille, joilla oli 5 M9-väliainetta, joka sisälsi 0,5 % hiivauutetta, 2 % L-arabinoosia ja 25 //g/ml kanamysiiniä. Seuraavana päivänä yhden pesäkkeen solut siirrettiin uudelle maljalle, joka sisälsi samaa väliainetta. Tämä menettely toistettiin, kunnes neljä bakteerisukupolvea oli kasvanut. Kaksi pesäkettä molempien bakteerikantojen kustakin sukupolvesta käytettiin siirrostamaan 2 ml M9-väliainetta, joka sisälsi 10 0,5 % hiivauutetta, 2 % L-arabinoosia ja 25 //g/ml kanamysiiniä, ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa voimakkaasti sekoittaen. Solut otettiin talteen ja plasmi-di-DNA uutettiin bakteereista käyttäen QIAprep Spin Miniprep Kit -kittiä (QIAGEN). Plasmidi-DNA-näytteet ennen (kuvio 9) ja jälkeen digestion restrik-tioendonukleaasilla Hindlll (Fermentas, Liettua) (kuvio 10) analysoitiin aga-15 roosigeelielektroforeesilla verrattuna alkuperäiseen transformaatioon käytettyyn S6wtd1EGFP/araD2-DNA:han (kontrolli kuvioissa 9 ja 10). lambda-DNA:ta, joka oli digeroitu EcoRI/Hindlll:llä (Fermentas, Liettua), käytettiin molekyylipaino-merkkinä (M3 kuviossa 10).
Näytteet digeroitiin Hindlll.lla. Kuten kuviossa 10A esitetään E.coli 20 AGIAaraD-kannalle ja kuviossa 10B JM109AaraD-kannalle, havaittiin mallit, jotka olivat identtiset alkuperäisen S6wtd1EGFP/araD2-plasmidi-DNA:n kans-v : sa. Hindlll-digestiosta saatujen fragmenttien ennustetut koot ovat 3274, 1688 ja 1510 emäsparia. Voidaan vetää se johtopäätös, että rokotevektori S6wtd1EGFP/araD2 on stabiili, kun sitä lisätään E. coli AGIAaraD- ja « :··: 25 JM109AaraD-kannoissa.
;* Esimerkki 5 AGIAaraD S6wtd1EGFP/araD2:n syöttöpanosfermentaatio i.j j araD-geenipohjainen selektiojärjestelmä testattiin myös syöttö- L..: panosfermentaatiossa tarkoituksena tuottaa plasmidia sisältäviä bakteereita.
:·’ 30 Yksi pesäke poimittiin AGIAaraD S6wtd1EGFP/araD2-levyltä ja siirrostettiin 250 ml:aan M9-väliainetta, joka sisälsi 0,5 % hiivauutetta, 0,2 % L-arabinoosia ja 25 A/g/ml kanamysiiniä, ja inkuboitiin yön yli 37 °C voimakkaasti sekoittaen.
• ’·· 18 tunnin kuluttua ympin OD6oo oli 6,4. 160 ml ymppiä lisättiin fermentoriin, jossa oli 5 I fermentoinnin aloitusväliainetta (8 g/l KF^PO^a, 10 g/l NaCI:a; 35 5 g/l NFUCLa; 5 g/l hiivauutetta; 2 g/l L-arabinoosia; 2 g/l MgS04:a, 25 mg/l 116068 19 kanamysiiniä ja 0,1 g/l tiamiinia; pH 6,7 NH40H:lla). Kun oli kasvatettu 5,5 tuntia automaattinen syöttö aloitettiin annetulla kasvunopeudella 0,15 h'1 (sallii hii-lilähteen rajoittaman kasvun) fermentaation syöttöväliainetta (300 g/l L-arabi-noosia; 150 g/l hiivauutetta; 50 mg/l kanamysiiniä; 0,2 g/l tiamiinia). Syöttöno-5 peutta kontrolloitiin tietokoneella kaavan F(t)=myS*Sj,r/Sf mukaan, jolloin myS on haluttu kasvunopeus, Sjn on ajankohtana lisätty hiililähteen määrä ja Sf hiili-lähteen pitoisuus syöttöväliaineessa. Kasvua seurattiin mittaamalla absor-banssia OD6oo ja plasmidi-DNA-näytteet otettiin. Fementaation aikana rekisteröidyt tiedot esitetään kuviossa 11. Fermentaation lopetettiin, kun 1 I syöttövä-10 liainetta oli kulutettu. Lopullinen Οϋβοο oli 45. Bakteerimassa otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin kerran 2 l:lla STE-puskuria. Bakteerien biomassa-saanto oli 410 g märkäpainoa. Tulokset plasmidi-DNA-sisällöstä esitetään taulukossa 3.
Taulukko 3.
15 Plasmidi-DNA-saanto AGIAaraD S6wtd1 EGFP/araD2-fermentaation aikana
Aika ODeoo Plasmidi-DNA-pit. Plasmidi-DNA-saanto (//g///l) (/vg per ml viljelmää)
Ymppi 6,4 0,04 4,6 4 h 3,1 0,02 1,1 21 h 28 0,1 50 24 h 37 0,13 87 • · » 1 ; \ 29 h 45 0,14 113 • » *’ Taulukon 3 tulokset osoittavat, että L-arabinoosi-selektiojärjestelmä toimii erittäin hyvin korkeilla solutiheyksillä. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, 20 että enemmän plasmidikopioita bakteerisoluissa antaa edun olosuhteissa, jois- * · ·.: f sa L-arabinoosia on rajoitettu, jolloin bakteerin voi käyttää sokeria nopeammin.
’·’ Esimerkki 6 « · • · AGIAaraD S6wtd1EGFP/araD2:n puhdistus AGIAaraD S6wtd1EGFP/araD2:n puhdistus suoritettiin seuraavasti !···. 25 (kuvio 12): a) Syöttövalmiste 20 1 1 6068
Kirkas lysaatti valmistettiin Qiagen’s Plasmid Purification Handbook -käsikirjan mukaan paitsi, ettei RNaasia käytetty.
200 g E. coli -solutahnaa suspendoitiin uudelleen 2000 ml:aan uu-delleensuspendointipuskuria ja myöhemmin käytettiin yhtä suuret tilavuudet 5 P2:ta ja P3:a lyysiin ja neutralointiin. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 6000 g 30 minuuttia 4 °C:ssa. Kirkas lysaatti kaadettiin pa-peripyyhkeen läpi, 1/10 10-%:ista Triton X-114:ää (Sigma) lisättiin ja liuos jätettiin jäiden päälle yhdeksi tunniksi. (Triton X-114:n on osoitettu vähentävän tehokkaasti endotoksiinien pitoisuutta proteiinissa, Liu et ai., Clinical Biochemistry, 10 1997). Tunnin kuluttua nukleiinihapot saostettiin 0,6 tilavuudella kylmää isopro panolia. Supernatantti kaadettiin pois ja sakkaa säilytettiin yön yli -20 °C:ssa.
b) Plasmidi-DNA:n puhdistus
Plasmidi-DNA:n puhdistus suoritettiin Amersham Pharmacian kolmivaiheisen superkiertyneen plasmidin puhdistusmenetelmän mukaan, johon oli 15 tehty joitakin modifikaatioita.
Vaihe 1. Sakka liuotettiin uudelleen 1500 ml:aan TE:tä (10 mM TrisCI, 1 mM EDTA; pH 8,0) ja ladattiin RNA.n poistamiseksi ja puskurin vaihtamiseksi Sepharose 6 FF -pylvääseen (Amersham Pharmacia), joka oli aikaisemmin tasapainotettu puskurilla A - 2 M (NH^SO/f, 100 mM TrisCI, 10 mM 20 EDTA, pH 7,5.
Vaihe 2. Pylvään tilavuus vietiin PlasmidSelect (Amersham v : Pharmacia) -pylvääseen (joka oli tasapainotettu puskurilla A)ja kun oli pestyjä :·'· eluoitu puskurilla B2 (1,6 M NaCI, 2 M (NH4)2S04,100 mM TrisCI, 10 mM EDTA, pH 7,5), superkiertynyt plasmidi-DNA otettiin talteen.
25 Vaihe 3. Eluoitu plasmidi laimennettiin viidellä tilavuudella tislattua, deionisoitua vettä ja ladattiin SOURCE 30Q -pylvääseen (Amersham Pharma-cia), joka oli tasapainotettu puskurilla C1 (0,4 M NaCI, 100 mM TrisCI, 10 mM EDTA, pH 7,5). Pesun jälkeen puhdistettu plasmidi eluoitiin puskurilla C2 (1 M , . NaCI, 100 mM TrisCI, 10 mM EDTA, pH 7,5) ja eluutiohuippu otettiin talteen.
30 Fraktion koko oli 150 ml ja se sisälsi 100 mg endotoksiinia sisältämätöntä (<10 EU/mg) S6wtd1EGFP/araD2-plasmidia.
• · • >
Claims (9)
1. Selektiojärjestelmä, tunnettu siitä, että se käsittää vektorin, jossa on araD-geeni eli L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeraasin (EC 5.1.3.4.) geeni, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplemen- 5 taannen sekvenssi tai sen katalyyttisesti aktiivinen fragmentti selektiomerkkinä, ja bakteerisolun, josta puuttuu araD-geeni.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen selektiojärjestelmä, tunnet-t u siitä, että bakteerisolu on Escherichia coli -solu.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen selektiojärjestelmä, tunnet-10 t u siitä, että E. coli on E. coli -kanta JM 109.
4. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu siitä, että 15 vektori on ekspressiovektori, joka käsittää: (a) DNA-sekvenssin, joka koodaa tumaan ankkuroivaa proteiinia, joka on operatiivisesti kytketty heterologiseen promoottoriin, jolloin mainittu tumaan ankkuroiva proteiini käsittää (i) DNA:ta sitovan domeenin, joka sitoutuu spesifiseen DNA-sekvenssiin, ja (ii) funktionaalisen domeenin, joka sitoutuu 20 tuman komponenttiin, tai sen funktionaalisen ekvivalentin, ja (b) multimeroidun DNA-sekvenssin, joka muodostaa sitoutumiskoh-dan tumaan ankkuroivalle proteiinille, jolloin mainitusta vektorista puuttuu pa- .. . pilloomaviruksen replikaation aloituskohta, ja ' (c) araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sek- 25 venssi, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen ’ ·' fragmentin.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vektori on ekspressiovektori, joka käsittää: ; (a) DNA-sekvenssin, joka koodaa tumaan ankkuroivaa proteiinia, 30 joka on operatiivisesti kytketty heterologiseen promoottoriin, jolloin mainittu * »· tumaan ankkuroiva proteiini on naudan papilloomaviruksen tyypin 1 (BPV) E2-proteiini, ja '·;·1 (b) multimeroitu DNA-sekvenssi, joka muodostaa sitoutumiskohdan tumaan ankkuroivalle proteiinille, on lukuisia BPV-E2-proteiinin sitoutumispaik-35 koja inkorporoituna vektoriin kimppuna, jolloin paikat voivat olla päästä-häntään-rakenteita tai ne voidaan sisällyttää vektoriin erillään oleviin paikkoi- 116068 hin, jolloin mainitusta vektorista puuttuu papilloomaviruksen replikaation aloituskohta, ja (c) araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen 5 fragmentin.
7. Muunnettu £. co//-kanta AG1, tunnettu siitä, että siitä puuttuu araD-geeni, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi.
8. Muunnettu E. coli -kanta JM109, tunnettu siitä, että siitä puuttuu araD-geeni, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi.
9. Menetelmä sellaisten solujen valikoimiseksi, jotka on transformoi tu plasmidilla, joka sisältää araD-geenin, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, sen komplementaarisen sekvenssin tai sen katalyyttisesti aktiivisen fragmentin selektiomerkkinä ja mielenkiinnon kohteena olevan geenin, tunnettu siitä, että insertoidaan plasmidi isäntäsoluun, josta puuttuu 15 araD, jolla on sekvenssillä tunnusnumero 1 annettu sekvenssi, ja viljellään soluja kasvatusväliaineessa, joka sisältää arabinoosia. • · · • « 1 · * ♦ 116068
Priority Applications (24)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20031319A FI116068B (fi) | 2003-09-15 | 2003-09-15 | Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi |
| ES04767054.2T ES2529346T3 (es) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Sistema de selección que contiene un marcador de selección que no es de resistencia a antibióticos |
| EP14191756.7A EP2949753A1 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| PL04767054T PL1664305T3 (pl) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Układ selekcyjny zawierający marker selekcyjny nie oparty na oporności na antybiotyk |
| EP04767054.2A EP1664305B1 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| US10/531,870 US7521182B2 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| PCT/FI2004/000540 WO2005026364A1 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| AU2004272776A AU2004272776B2 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| CA2538863A CA2538863C (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| PT47670542T PT1664305E (pt) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Sistema de seleção contendo um marcador de seleção não antibiótico |
| BRPI0414392-2A BRPI0414392A (pt) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | sistema de seleção contendo um marcador de seleção não antibiótico de resistência |
| EA200600585A EA011823B1 (ru) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Бактериальная система селекции и ее применение |
| HK06107273.7A HK1084975B (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| NZ545937A NZ545937A (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| SI200432219T SI1664305T1 (sl) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selekcijski sistem, ki vsebuje selekcijski marker ne-rezistenten na antibiotike |
| DK04767054.2T DK1664305T3 (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | SELECTION SYSTEM CONTAINING NON-ANTIBIOTIC RESISTANCE SELECTION MARKER |
| MXPA06002559A MXPA06002559A (es) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Sistema de seleccion que contiene marcador de seleccion sin resistencia a antibioticos. |
| JP2006526650A JP4732348B2 (ja) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | 非抗生物質耐性選択マーカー含有選択システム |
| AP2006003577A AP1993A (en) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| CN2004800336943A CN1882692B (zh) | 2003-09-15 | 2004-09-15 | 包含非抗生素抗性选择标志物的选择系统 |
| IL173923A IL173923A0 (en) | 2003-09-15 | 2006-02-23 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| ZA200602153A ZA200602153B (en) | 2003-09-15 | 2006-03-14 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker |
| KR1020067005158A KR101215245B1 (ko) | 2003-09-15 | 2006-03-14 | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 |
| HK16105149.1A HK1217111A1 (en) | 2003-09-15 | 2016-05-05 | Selection system containing non-antibiotic resistance selection markers |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20031319A FI116068B (fi) | 2003-09-15 | 2003-09-15 | Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi |
| FI20031319 | 2003-09-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20031319A0 FI20031319A0 (fi) | 2003-09-15 |
| FI20031319L FI20031319L (fi) | 2005-03-16 |
| FI116068B true FI116068B (fi) | 2005-09-15 |
Family
ID=27838984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20031319A FI116068B (fi) | 2003-09-15 | 2003-09-15 | Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7521182B2 (fi) |
| EP (2) | EP2949753A1 (fi) |
| JP (1) | JP4732348B2 (fi) |
| KR (1) | KR101215245B1 (fi) |
| CN (1) | CN1882692B (fi) |
| AP (1) | AP1993A (fi) |
| AU (1) | AU2004272776B2 (fi) |
| BR (1) | BRPI0414392A (fi) |
| CA (1) | CA2538863C (fi) |
| DK (1) | DK1664305T3 (fi) |
| EA (1) | EA011823B1 (fi) |
| ES (1) | ES2529346T3 (fi) |
| FI (1) | FI116068B (fi) |
| HK (1) | HK1217111A1 (fi) |
| IL (1) | IL173923A0 (fi) |
| MX (1) | MXPA06002559A (fi) |
| NZ (1) | NZ545937A (fi) |
| PL (1) | PL1664305T3 (fi) |
| PT (1) | PT1664305E (fi) |
| SI (1) | SI1664305T1 (fi) |
| WO (1) | WO2005026364A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA200602153B (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060135457A1 (en) * | 2004-08-13 | 2006-06-22 | Yvonne Paterson | Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines |
| DK1789559T3 (en) | 2004-08-13 | 2015-08-24 | Univ Pennsylvania | Methods to construct vaccines with no antibiotic resistance |
| EP2802646B1 (en) * | 2011-12-21 | 2017-05-10 | Bionet-Asia Co. Ltd | Modified bordetella pertussis strains |
| WO2014018602A1 (en) * | 2012-07-26 | 2014-01-30 | Glycos Biotechnologies, Inc. | Strains and methods for plasmid maintenance |
| EP2950816B1 (en) | 2013-02-04 | 2019-07-31 | Schweitzer Biotech Company Ltd. | The use of dna sequences encoding an interferon as vaccine adjuvants |
| WO2015148680A1 (en) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Methods and genetic systems for cell engineering |
| EP3569710A1 (en) * | 2018-05-16 | 2019-11-20 | BioVersys AG | Bacterial vectors for genetic manipulation of bacteria |
| CN109136247B (zh) * | 2018-08-09 | 2022-03-29 | 天津大学 | 一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5843760A (en) * | 1994-04-15 | 1998-12-01 | Midwest Research Institute | Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation |
| ATE215986T1 (de) * | 1994-12-09 | 2002-04-15 | Microscience Ltd | Virulenzgene in der vgc2-region von salmonella |
| US5824485A (en) * | 1995-04-24 | 1998-10-20 | Chromaxome Corporation | Methods for generating and screening novel metabolic pathways |
| FR2738842B1 (fr) | 1995-09-15 | 1997-10-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique |
| US6479279B2 (en) * | 1995-12-29 | 2002-11-12 | Estonian Biocentre | Episomal vectors and uses thereof |
| US6162433A (en) * | 1996-04-19 | 2000-12-19 | Medeva Europe Limited | Non antibiotic selectable markers for live vaccines |
| ES2157084T3 (es) | 1996-08-16 | 2001-08-01 | Medical Res Council | Vectores de expresion episomicos autorreplicantes que confieren expresion genica histoespecifica. |
| WO1998011231A1 (en) * | 1996-09-10 | 1998-03-19 | The Rockefeller University | Highly regulable promoter for heterologous gene expression |
| KR100230578B1 (ko) * | 1997-07-25 | 1999-12-01 | 허영섭 | 포스포리불로키나제를 융합파트너로 이용하는 재조합 인간 부갑상선호르몬의 발현벡터 |
| US6291245B1 (en) * | 1998-07-15 | 2001-09-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Host-vector system |
| US6368793B1 (en) * | 1998-10-14 | 2002-04-09 | Microgenomics, Inc. | Metabolic selection methods |
| DK1268823T3 (da) * | 2000-03-24 | 2008-03-10 | Xoma Technology Ltd | Fremgangsmåder og celler til ekspression af rekombinante proteinprodukter |
| HU227667B1 (en) * | 2001-05-03 | 2011-11-28 | Fit Biotech Oyj Plc | Novel expression vectors and uses thereof |
-
2003
- 2003-09-15 FI FI20031319A patent/FI116068B/fi not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-09-15 EP EP14191756.7A patent/EP2949753A1/en not_active Withdrawn
- 2004-09-15 EP EP04767054.2A patent/EP1664305B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-15 AP AP2006003577A patent/AP1993A/xx active
- 2004-09-15 ES ES04767054.2T patent/ES2529346T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-15 DK DK04767054.2T patent/DK1664305T3/en active
- 2004-09-15 BR BRPI0414392-2A patent/BRPI0414392A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-09-15 CA CA2538863A patent/CA2538863C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-15 PL PL04767054T patent/PL1664305T3/pl unknown
- 2004-09-15 CN CN2004800336943A patent/CN1882692B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-15 AU AU2004272776A patent/AU2004272776B2/en not_active Ceased
- 2004-09-15 JP JP2006526650A patent/JP4732348B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-15 PT PT47670542T patent/PT1664305E/pt unknown
- 2004-09-15 MX MXPA06002559A patent/MXPA06002559A/es active IP Right Grant
- 2004-09-15 SI SI200432219T patent/SI1664305T1/sl unknown
- 2004-09-15 WO PCT/FI2004/000540 patent/WO2005026364A1/en active Application Filing
- 2004-09-15 EA EA200600585A patent/EA011823B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-09-15 NZ NZ545937A patent/NZ545937A/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-09-15 US US10/531,870 patent/US7521182B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-02-23 IL IL173923A patent/IL173923A0/en unknown
- 2006-03-14 ZA ZA200602153A patent/ZA200602153B/en unknown
- 2006-03-14 KR KR1020067005158A patent/KR101215245B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-05-05 HK HK16105149.1A patent/HK1217111A1/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dardel et al. | Molecular cloning and primary structure of the Escherichia coli methionyl-tRNA synthetase gene | |
| US5656488A (en) | Recombinant avirulent salmonella antifertility vaccines | |
| Nichols et al. | Cloning and sequencing of Escherichia coli ubiC and purification of chorismate lyase | |
| HK1217111A1 (en) | Selection system containing non-antibiotic resistance selection markers | |
| KR20120136349A (ko) | 고가의 화학적 생성물의 미생물 생산, 및 관련 조성물, 방법 및 시스템 | |
| WO1999047657A2 (en) | Lactobacilli harboring aggregation and mucin binding genes as vaccine delivery vehicles | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| KR20140015136A (ko) | 3-히드록시프로피온산 및 다른 생성물의 제조 방법 | |
| Tolmasky et al. | A single amino acid change in AngR, a protein encoded by pJM1-like virulence plasmids, results in hyperproduction of anguibactin | |
| Fleming et al. | Physical and genetic characterization of cloned enterobactin genomic sequences from Escherichia coli K-12 | |
| US5434253A (en) | DNA encoding Helicobacter pylori recombinase | |
| PT1575610E (pt) | Vacina viva atenuada contra pleuropneumonia porcina | |
| Rule et al. | Overproduction and nucleotide sequence of the respiratory D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli | |
| US6783764B1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| FI104429B (fi) | Ilmentämisplasmidit, jotka sisältävät deo-promoottorin, ja bakteeri-isännät, jotka sisältävät näitä plasmideja | |
| Kawakami et al. | Isolation and characterization of herC, a mutation of Escherichia coli affecting maintenance of ColE1 | |
| Heinzen et al. | Characterization of the succinate dehydrogenase-encoding gene cluster (sdh) from the rickettsia Coxiella burnetii | |
| Maas et al. | D-Serine deaminase is a stringent selective marker in genetic crosses | |
| Somarny et al. | Cloning and expression of Vibrio cholerae virulence gene, accessory cholera enterotoxin(ACE) | |
| JP2009514506A (ja) | Ｅ．コリ株ｄｓｍ６６０１のプラスミド不含のクローン | |
| HK1084975B (en) | Selection system containing non-antibiotic resistance selection marker | |
| Wachira | Regulation of the Pseudomonas aeruginosa amidase operon by transcription antitermination | |
| CN101497889A (zh) | 人Kappa阿片受体1的制备方法 | |
| MXPA98002798A (en) | Live attenuated bacteria of the species actinobacillus pleuropneumon |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 116068 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |