JP2001503607A - 製紙における改変澱粉の代用品 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、改変澱粉の代わりにStreptococcus mutans種のグルコシルトランスフェラーゼＢ酵素により産生されるグルカンを用いる製紙の方法を提供する。本発明のグルカンは、ヒドロキシル化改変澱粉と機能的に同様であり、そして製紙の糊づけおよびコーティングの工程において特に有用である。本発明のグルカンはまた、熱可塑性の特性を示し、そしてコーティング工程に間の紙に光沢を付与する。
Description
【発明の詳細な説明】
製紙における改変澱粉の代用品
発明の分野
本発明は、製紙の分野に関する。詳細には、本発明は、製紙における改変澱粉
に代わる供給源を提供する。
発明の背景
澱粉が成分として用いられる製紙において３つの主要な段階が存在する。第１
段階は、セルロース線維が澱粉とスラリー中で混合され、そしてスラリーがワイ
ヤーベルト上へ狭い開口部を通って押し出される「ウェットエンド(wet end)」
である。水は、形成されたシートがベルトの長さを移動する際に、迅速に除去さ
れる。代表的には、ベルト上の５〜15メートルの距離の後、シート自体の重量を
支え得るように、シートはそれから十分な水分を除去されている。シートは、多
数のホイルおよびロールを通って移動し、ここでさらに水が除去される。これは
約11％の水分まで乾燥される。
澱粉を含む製紙の第２段階は、「糊づけ(sizing)工程」である。ここで、紙は
糊づけプレスを通過し、ここで澱粉スラリーがシートに塗布される。シートは、
再び一連のホイルおよびロールを通過する。シートはローラーで乾燥され、そし
て最終産物としてプレス機から取り外され得る。
第３工程は、紙を澱粉と熱可塑性分子との混合物でコーティングすることを含
む。特定のラインについては、これは糊づけ工程の後に生じる。新生のロールが
また取り出され得、そしてコーティングのために別のプレス機上へ再び取り付け
られ得る。代表的なコーティングデバイスは紙の幅を移動する２つの刃を有する
。これらの刃は、コーティング材料を２つのローリングドラムに塗布する。紙は
、ドラムとコーティング材料（澱粉および熱可塑性成分を含む）との間を通過し
、紙の上のドラムから離れる。紙がドラムから離れた後、紙は多くの乾燥機を通
過する。紙が乾燥したら、２つのドラム（１つは、高密度の線維で作られ、そし
て
もう一方は加熱された鋼鉄ドラムである）を含む「ソフトカレンダー(soft cale
ndar)」上を通過する。２つのドラムと加熱された鋼鉄ドラムとの間を紙が通過
することによって、十分に加熱してコーティング剤混合物の熱可塑性成分を融解
し、紙上にしっかりした光沢仕上げを提供する。
上記のプロセスにおいて代表的に使用されるセルロースの木材パルプ線維は天
然において陰イオン性である。陽イオン性澱粉の「ウェットエンド」スラリーへ
の添加は、塩架橋を介するパルプ線維の架橋により接着剤として作用する。従っ
て、架橋した重合体ネットワークが作製され、これは澱粉およびセルロース線維
を含む。代表的には、「ウェットエンド」において用いられるカチオン性澱粉は
、３価アミンまたは４価アミンである。これらのアミン基は、湿式粉砕器(wet m
iller)により澱粉に添加される。
表面の糊づけ用の澱粉は、シートが「ウェットエンド」から離れた後にシート
に対し強度および滑らかな仕上げの両方を与えるために使用さる。そのような澱
粉はまた、種々のコーティングを受け入れるようにシートを調製する。より安価
なグレードの紙の製造において、および繊維板の製造においては、糊づけ用澱粉
は非改変トウモロコシ澱粉として単純に使用される。高いグレードの紙について
は、化学的に改変された澱粉が使用される。これは、紙への滑らかで一様な高い
質の表面の塗布のために重要である。
澱粉は、劣化、すなわち、別のゼラチン様澱粉スラリーにおいて高次構造（ヘ
リックスおよび結晶化の両方）を再形成する傾向がある。高品質の紙上での劣化
した澱粉の析出は、紙上に局部的な不一致を生じ、そしてそれは容認できない。
さらに、糊づけプレス機中の劣化した澱粉は、装置を清浄するためにラインを止
めることを必要とし得る。
糊づけの塗布のために最も頻繁に使用される澱粉は、例えばヒドロキシエチル
澱粉のような共有結合した中性の添加物を有する澱粉である。これは、湿式粉砕
プラントで単離された後、エチレンオキシドと澱粉との反応により調製される。
ヒドロキシエチル（または類似の）添加物の機能は、その化学的性質とは無関係
である；むしろ、それは立体障害を提供するように作用し、それによって高次構
造の形成を阻害する。この立体障害は、劣化を減少させるために重要である。添
加物により与えられる周期的な隆起は、劣化を導く高次構造の形成を崩壊する。
速度は、製紙において最も重要な事項である。プレス速度を制限することによ
って、澱粉を均一にする。プレスは、しばしばその全能力の速度より下で行われ
る。この適用に依存して、澱粉スラリーは３〜15％（通常は５〜６％）の間の固
体である。固体の増加は、製造されている紙シートから取り除かれるべき水の量
の減少を必然的に生じる。このことは、プレス機を高速で作動させることを可能
にする。
ヒドロキシエチル化澱粉はまた、温度の低下または濃度の増加に伴って、高次
構造を形成する。紙の表面での高次構造の形成が必須である。シートへの塗布の
後、澱粉はこれらの高次構造のいくらかを再形成し、そして構造的強度を与え、
インクおよび色素の受け入れを促進する均一な表面を作製する。しかし、高次構
造は、スラリーにでも塗布デバイスについても形成するべきではない。なぜなら
、これは、劣化した澱粉を清浄するために生産ラインを停止する必要があるから
である。
ヒドロキシエチル基の機能は、劣化が生じる時の澱粉の温度をより低くし、そ
して／またはその濃度を上昇させることである。処理ラインはすでに澱粉スラリ
ーの特定の温度について最適化されているので、劣化の傾向の減少は、スラリー
中のより高い炭水化物含量を可能にする。
コーティングプロセスにおいて紙シートに塗布される混合物は、ヒドロキシメ
チル化澱粉および熱可塑性分子を含む。使用される最も一般的な熱可塑性分子は
、スチレンブタジエンのようなラテックスである。ヒドロキシエチル澱粉の機能
は、上記のとおりである。熱可塑性分子の機能は、紙の上に高級な光沢仕上げを
形成することである。これは、インクおよび色素を取り込む増大した能力を生じ
、そして一般的には印刷シートの分解性を改善する。
上記に基づいて、製紙において、改変澱粉と機能的に類似である改変された澱
粉代用物の必要性が存在する。さらに、劣化の傾向がより少ない改変澱粉の代用
物を提供する必要がある。さらに、現在の方法より早く、そしてプレス機がそれ
らの全能力のスピードにより近く作動することが可能である、紙の製造の方法を
提供する必要がある。さらに、環境に優しく、そして化学的処理を必要とする投
入材料を含まない紙を製造する方法を提供する必要がある。
従って、本発明の目的は、製紙において使用される場合、劣化の傾向が少ない
改変澱粉の代用物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、現存の方法より迅速であり、そしてより効率的な紙
を製造する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、澱粉が必要とする高価な化学的改変を必要としない
、製紙における澱粉の代用物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、現存の方法より環境に優しい紙を製造するための方
法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、製紙の間のコーティング工程において現在使用され
ている熱可塑性分子の代用物を提供することである。
発明の要旨
本発明は、製紙において改変澱粉および／またはラテックスの代用物として使
用され得るグルカンを提供する。本発明のグルカンは、Streptococcus mutans種
のグルコシルトランスフェラーゼＢ（「GTF B」）酵素により産生され、そして
製紙において現在使用されている改変澱粉と機能的に類似である。本発明のグル
カンはまた、製紙のコーティング工程において現在使用されている熱可塑性分子
に対して類似の物理的特性を示す。
本発明はまた、生物学的に産生される投入材料である、本発明のグルカンを利
用する製紙の方法を提供する。従って、本方法は、化学的排液を産生する投入材
料を必要とする現在の方法より対費用効果が高く、そして環境に優しい。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「グルカン」は、α(1→3)、α(1→6)である結
合、および分枝α(1→3,6)を有するグルコースポリマーを意味する。
本明細書中で使用される場合、「アミロプラスト」は、植物貯蔵組織中の澱粉
蓄積細胞小器官を意味する。
本明細書中で使用される場合、「液胞」は、液胞膜により制限される細胞性区
画を意味する。
Streptococcus mutansは、口腔内に内在し、歯のエナメル質にコロニーを形成
する種である。例えば、Kuramitsu，「Characterization of Extracellular Glu
cosyl Transferase Activity of Streptococcus-mutans.」Infect ．Immun.;第12
(4)巻;738-749頁;(1975);およびYamashitaら，「Role of the Streptococcus-Mu
tans-gtf Genes in Caries Induction in the Specific-Pathogen-Free Rat Mod
el」Infect ．Immun.;第61(9)巻;3811-3817頁;(1993)を参照のこと；共に、本明
細書中にその全体が参考として援用される。Streptococcus mutans種は、食用ス
クロースを利用して種々の細胞外グルカンを作製するグルコシルトランスフェラ
ーゼＢ(「GTF B」)酵素を分泌する。例えば、Kametakaら、「Purification and
characterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-mutans OMZ176
with Chromatofocusing,」Microbios;第51(206)巻;29-36頁;(1978)を参照のこ
と；本明細書中に参考として援用される。
可溶性グルカンおよび不溶性グルカンの両方が合成され、原因であるタンパク
質が単離され、そして特徴付けられている。例えば、Aokiら，「Cloning of a S
treptococcus-mutans Glucosyltransferase Gene Coding for Insoluble Glucan
Synthesis．Infect. Immun.;第53(3)巻;587-594頁;(1986);Shimamuraら，「Ide
ntification of Amino Acid Residues in Streptococcus Mutans Glucosyltrans
ferases Influencing the Structure of the Glucan Produced,」J. Bacteriol.
第176(16)巻;4845-50頁;(1994)；および、Kametakaら;「Purification and Char
acterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-:mutans OMZ176 wi
th Chromatofocusing,」Microbios;第51(206)巻;29-36頁;(1987)を参照のこと;
全ては本明細書中にその全体が参考として援用される。
タンパク質は大きく（約155kDa)、そしてスクロースのグリコシル部分の、α(
1→3)結合およびα(1→6)結合を介するアクセプターグルカンへの基の転移を触
媒する。例えば、Wenhamら，「Regulation of Glucosyl Transferase and Fruct
osyl Transferase Synthesis by Continuous Cultures of Streptococcus-mutan
s,」J. Gen. Microbiol.;第114巻(第１部);117-124頁;(1979)；Fuら，「Maltode
xtrin Acceptor Reactions of Streptococcus-mutans 6715 glucosyltransf
erases,」Carbohydr ．Res.;第217;巻;210-211頁;(1991);およびBhattacharjeeら
，「Formation of Alpha-(1→6)，Alpha-(1→3)，and Alpha(1→2)Glycosidic L
inkages by Dextransucrase from Streptococcus Sanguis in Acceptor-Depende
nt Reactions,」Carbohydr ．Res.;第242巻;191-201;(1993)を参照のこと；全て
は本明細書中にその全体が参考として援用される。
グルカン合成に関連する遺伝子が単離され、そして配列決定されている。Shim
amuraら、（本明細書中上記に引用）および、Russelら，「Expression of a Gen
e for Glucan-binding Protein from Streptococcus-mutans in「Escherichia-c
oli」J. Gen. Microbiol ．;第131(2)巻;295-300頁;(1985)；Russellら，「Char
acterization of Glucosyltransferase Expressed from a Streptococcus-Sobri
nus Gene Cloned in Escherichia-coli,」J. Gen. Microbiol.;第133(4)巻;９35
-944頁；(1987);およびShirozaら，「Sequence Analysis of the GTF B Gene fr
om Streptococcus Mutans,」J. Bacteriol ．;第169(9)巻;4263-4270(1987)を参
照のこと;全ては本明細書中にその全体が参考として援用される。
GTF酵素により産生される種々のグルカンの構造は、任意の所定のグルカン中
に存在するα(1→3)、α(1→6)、およびα(1→3,6)分枝の割合に関して全く不均
一である。トウモロコシのような植物への天然に存在するGTF BおよびGTF B変異
タンパク質をコードする遺伝子の形質転換は、新規の組成物を有するアミロプラ
ストおよび液胞を提供する。
アミロプラストおよび／または液胞に取り込まれたGTF B酵素活性は、同じア
ミロプラストおよび／または液胞中での澱粉およびグルカンの蓄積を導く。劣化
は、澱粉分子の一部が相互作用し、そして続いて鎖間ヘリックスまたは鎖内ヘリ
ックスを形成する場合に生じる。澱粉とグルカンとの混合物において、へリック
ス形成を導く澱粉−澱粉相互作用の頻度が減少される。混合ポリマーから作製さ
れるペーストは、結果として劣化する傾向がより少ない。これは特に、形質転換
標的として予想される、澱粉の相対的な割合が減少した澱粉蓄積変異体において
真実である。
トランスジェニックGTF B酵素によりトウモロコシアミロプラストおよび／ま
たは液胞中で産生されるグルカンは、澱粉が必要とするような化学的改変を伴わ
ずに紙の処理において機能し得る。結果的に、ポリマー溶液は、変化した流体学
的特性を有し、そして澱粉と比べて劣化する傾向がより少ない。グルカンは分枝
状であり、そして不規則であり、そして同程度かまたは優れた効力を有する代用
改変澱粉であり得る。これらは、澱粉必要とするようないかなる高価な化学的改
変も必要としない。コーティング塗布について、本発明のグルカンは上記の利点
に加え、熱可塑性の特性を示す。
本発明によるグルカンの産生において有用な野生型GTFおよびその変異体は、
以下に提供される。以下のコードが使用される：
アミノ酸 １文字記号
アラニン Ａ
アスパラギン Ｎ
アスパラギン酸 Ｄ
グルタミン Ｑ
グルタミン酸 Ｅ
イソロイシン Ｉ
リジン Ｋ
トレオニン Ｔ
チロシン Ｙ
バリン Ｖ
本発明のグルカンを産生するために使用した変異体GTF B酵素の同定に使用し
た命名法は、以下のようである：
数字は、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の位置をいう；第１の文字は野生型酵素に
おけるアミノ酸をいう；第２の文字は変異酵素におけるアミノ酸をいう；および
複数の変異を有する酵素は、/により分離されたそれぞれの変異を有している。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
好ましくは、I448V;D457N;D567T;K1014T;D457N/D567T;D457N/D571K;D567T/D571K
;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;およびY169VY170
A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
より好ましくは、I448V;K1014T;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D57IK/
K779Q/K1014T;およびY169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
さらにより好ましくは、K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;および
Y169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
最も好ましくは、I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;またはY169A/Y170A/Y
171Aである。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用されるｓ変異体GTF B酵素は、好ま
しくは、I448V;D457N;D567T;K779Q;K1014T;D457N/D567T;D457N/D571K;D567T/D57
1K;およびD567T/D571K/K1014Tからなる群より選択される。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、より好
ましくは、I448V;D457N;K779Q;D567T/D571K;およびD567T/D571K/K1014Tからなる
群より選択される。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、最も好
ましくは、I448Vである。
本発明のグルカンは、好ましくはトランスジェニックのトウモロコシ、ジャガ
イモ、キャッサバ、サツマイモ、ライムギ、オオムギ、コムギ、サトウモロコシ
、カラスムギ、キビ、ライコムギ、サトウキビおよびイネにおいて産生される。
より好ましくは、本発明のグルカンは、トウモロコシ、ジャガイモ、サトウキビ
、キャッサバまたはサツマイモにおいて産生される。さらにより好ましくは、本
発明のグルカンは、トウモロコシまたはジャガイモにおいて産生される。最も好
ましくは、本発明のグルカンはトウモロコシにおいて産生される。
本発明の非常に好ましい実施態様において、澱粉生合成を欠損したトウモロコ
シ株が、変異体GTF B遺伝子で形質転換される。そのような株は、天然に存在す
るトウモロコシ変異体(すなわち、sh2、bt2、bt1)か、または野生型トウモロコ
シと比較した場合、胚乳中に低い量の澱粉を蓄積するように操作されたトランス
f the ADP-glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Suga
r-Storing Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber
Storage Prote in Genes,」The EMBO Journal;第11(4)巻;1229-1238頁;(1992);
およびCreech，「Carbohydrate Synthesis in Maize.」Advances in Agronomy;
第20巻;275-322頁;(1968)を参照のこと；両方が本明細書中にそれらの全体が参
考として援用される。
本発明のグルカンの産生は、当該分野で周知である形質転換の方法に従って行
われ、従って本発明の一部を構成しない。本発明の化合物は、転写および翻訳さ
れる場合、所望のグルカンを産生するGTF酵素を生じる合成的遺伝子を含む発現
カセットの挿入により合成される。所望の配列の植物発現のための適切な調節配
列を提供するこのような空の発現カセットもまた周知であり、そして合成遺伝子
についてのヌクレオチド配列（RNAまたはDNAのいずれか）は、標準的な教科書お
よび提供される参考文献を用いてタンパク質のアミノ酸配列に容易に由来し得る
。上記の合成遺伝子は、植物優先(plant-preffered)コドンを好ましく使用して
、所望のタンパク質の発現を増強する。
以下の記載は、本発明の組成物ならびにそれらの作成および使用の方法をさら
に例示する。しかし、当業者に同等に公知である他の方法もまた使用され得るこ
とが理解される。
本発明の酵素または変異体をコードする遺伝子は適切な発現カセット中に挿入
され得、そして植物種の細胞内へ導入され得る。従って、この方法の特に好まし
い実施態様は、植物において活性である転写プロモーター配列およびイニシエー
ター配列とともに適切なリーディングフレーム中にある変異体遺伝子または野生
型遺伝子をコードするDNA配列を植物のゲノム中へ挿入することを含む。調節配
列の制御下でのDNA配列の転写および翻訳は、植物の組織内で上昇した量のタン
パク質を提供するレベルでタンパク質配列の発現を生じる。
次いで、GTF Bタンパク質のアミノ酸の適切な配列をコードする合成DNA配列が
調製され得、そしてこの合成DNA配列は、適切な植物発現カセット中に挿入され
得る。
同様に、多数の植物の発現カセットおよびベクターが、当該分野で周知である
。用語「発現カセット」は、それらが適切なリーディングフレーム中の構造遺伝
子
に隣接する場合、植物細胞において機能するプロモーター配列、イニシエーショ
ン配列、および終結配列を含む制御配列の完全なセットを意味する。発現カセッ
トは、切断および任意の所望の構造遺伝子の挿入のために適切な制限部位の組合
せを、頻繁にかつ好ましく含む。クローン化遺伝子が、構造配列に対して正確な
リーディングフレームにおける開始コドンを有することが重要である。
本明細書中の用語「ベクター」は、宿主細胞中で複製が可能であり、そして外
来遺伝子を発現し得るDNA配列を意味する。代表的には、ベクターは、適切な酵
素の使用により予想される様式で切断され得る１つ以上の制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を有する。このようなベクターは、好ましくは、抗生物質および除草
剤の耐性を与えるさらなる構造遺伝子配列を含むように構築され、これらは次い
で、形質転換細胞を同定および分離するためのマーカーとして役立つ。好ましい
マーカー／選択剤は、カナマイシン、クロロスルフロン(chlorosulfuron)、ホス
ホノトリシン(phosphonothricin)、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート
を含む。ベクター中の外来の遺伝物質が機能的に発現される細胞は、ベクターに
より「形質転換」されており、そして「形質転換体」と呼ばれる。
特に好ましいベクターはプラスミドである。プラスミドは、細胞の染色体の一
部ではない環状２本鎖DNA分子を意味する。
上記に述べたように、目的の遺伝子をコードするゲノムDNAおよびcDNAの両方
が、本発明において使用され得る。目的の遺伝子はまた、部分的にcDNAクローン
から、および部分的にゲノムクローンから構築され得る。目的の遺伝子が単離さ
れている場合、宿主細胞中で遺伝子の効率的な発現を提供するのに必要な調節配
列を含む遺伝子構築物が作成される。本発明によれば、遺伝子構築物は、(a)目
的のタンパク質または形質をコードする遺伝子配列、(b)目的の構造遺伝子のい
ずれかの側に作動可能に連結された１つ以上の調節配列、を含む。代表的には、
調節配列は、プロモーターおよびターミネーターからなる群より選択される。調
節配列は、自己かまたは異種の供給源由来であり得る。
所望の制御配列に作動可能に連結された本発明の変異体の構造遺伝子を含む発
現カセットは、適切なクローニングベクターに連結され得る。一般的に、宿主細
胞と互換性がある種に由来する複製配列および制御配列を含むプラスミドベクタ
ーまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。クローニング
ベクターは、代表的には複製開始点、ならびに形質転換宿主細胞において表現型
選択マーカーを提供し得る特定の遺伝子を有する。代表的には、抗生物質または
選択的除草剤に対して耐性を与える遺伝子が使用される。遺伝物質が標的細胞内
へ導入された後、首尾良く形質転換された細胞および／または細胞のコロニーは
、これらのマーカーに基づく選択により単離され得る。
代表的には、中間体宿主細胞が本発明の実行において使用されて、クローニン
グベクターのコピー数が増大される。コピー数の増加と共に、目的の遺伝子を含
むベクターは、所望の植物細胞内への導入のために有意な量にて単離され得る。
本発明の実施において使用され得る宿主細胞は、原核細胞（例えば、E．coli、S
．typhimuriumおよびSerratia marcescensのような細菌宿主を含む）を含む。酵
母または糸状菌のような真核生物の宿主もまた、本発明において使用され得る。
これらの宿主もまた微生物であるので、細菌内ではタンパク質の発現を引き起こ
さない植物プロモーターがそのベクターで使用されることを確認することが必須
である。
次いで、単離されたクローニングベクターは、細胞または組織培養において植
物発現カセットのDNA配列の少なくとも１つのコピーを外来DNAとして含む形質転
換植物細胞提供するために、単子葉植物または双子葉植物由来の細胞へのエレク
トロポレーション（プロトプラストにおいて）、レトロウイルス、照射、および
マイクロインジェクションを含む任意の適当な技術を使用して植物細胞内へ導入
される。公知の技術を用いて、プロトプラストは再生され得、そして細胞または
組織の培養物は、本発明によるタンパク質の遺伝子を保有しそして発現する全体
の稔性植物を形成するために再生され得る。従って、本発明の非常に好ましい実
施態様は、形質転換トウモロコシ植物であり、その細胞はGTF Bの変異体の発現
カセットのDNA配列の少なくとも１コピーを外来DNAとして含む。
本明細書中で提供される植物ベクターは、Agrobacterium tumefaciens中に取
り込まれ得、次いで主として双子葉種由来の感受性の植物細胞内にベクターを移
入するために使用され得ることもまた当業者に理解される。従って、本発明は、
Agrobacterium tumefaciens感受性双子葉植物中にGTF Bを導入するための方法を
提供し、ここで発現カセットは、Agrobacterium tumefaciensを細胞に感染させ
ることによって細胞に導入され、そのプラスミドは本発明の植物発現カセットを
含むように改変されている。
例えば、ジャガイモ植物はAgrobacterium tumefaciensを介して形質転換され
、本発明のグルカンを産生し得る。形質転換カセットは、パタチンプロモーター
、続いて、関連するGTF Bコード配列およびネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼポリアデニル化部位／ターミネーターを含む。例えば、Utsumiら、「Expres
sion and Accumulation for Normal and Modified Soybean Glycinins in Potat
o Tubers,」Plant Science;第102(2)巻;181-188頁;(1994)(Limerick)を参照のこ
と;本明細書中にこの全体が参考として援用される。トランスジェニックカセッ
トは、形質転換ベクター内に配置される。例えば、BIN19、またはその誘導体は
、Agrobacterium tumefaciensを介する形質転換の場合に有用である。例えば、V
isserら、「Transformation of Homozygous Diploid Potato with an Agrobacte
rium-tumefaciens Binary Vector System by Adventitious Shoot Regeneration
on Leaf and Stem Segments,」Plant Mol ．Biol.:第12(3)巻;329-338頁;(1989)
を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
トウモロコシ形質転換ベクターについて、プロモーターは、発現が特異的であ
り、かつ胚乳細胞に限定される任意のプロモーターを含む。22 kDa zein、Opaqu
e2、gamma zeinおよびwaxyのいずれかをコードするものが含まれる。これらはGT
F B遺伝子内に至り、そして内在性ターミネーターまたは異種PINIIターミネータ
ーが続く。GTF Bタンパク質は、適切な移行配列を使用してトウモロコシ胚乳ア
ミロプラストへ指向される。アミロプラスト中に蓄積するために酵素をアミロプ
ラスト内へ指向することにおいて有用である移行配列は、リブロース２リン酸カ
ルボキシラーゼ小サブユニット、waxy、brittle-1、およびクロロフィルAB結合
タンパク質を含むが、これらに限定されない。移行配列は、プロモーターとGTF
Bコード配列との間に並列され、そして翻訳リーディングフレーム内にGTF B成分
と融合される。
液胞中に蓄積するために、酵素を液胞に指向することにおいて有用な移行配列
は当該分野で周知である。液胞ターゲッティングについては、例えばEbskampら
、
「Accumulation of Fructose Polymers in Transgenic Tobacco,」Bio/technol ogy
;第12巻，272-275頁;(1994)を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考とし
て援用される。
トウモロコシの形質転換および再生については、例えばArmstrong,C.，「Rege
neration of Plants from Somatic Cell Cultures:Applications for in vitro
Genetic Manipulation,」The Maize Handbook;Freelingら編,663-671頁;(1994)
を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
一旦所定の植物が形質転換されると、合成されたグルカンは、当業者に公知の
標準的方法により単離され得る。このようにしてトランスジェニック植物におい
て得られるグルカンは、改変澱粉の代わりに用いられ得、そして糊づけおよび／
またはコーティング工程において利用され得る。コーティング工程において有用
な処方物については、例えば、Heiserら，「Starch Formations,」Starch and S tarch Products in Paper Coating
;Kearneyら編，147-162頁;(1990);Tappi Pres
sを参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
糊づけおよびコーティングの両方において、本発明のグルカンは約４〜約15重
量％、より好ましくは、約５〜約12重量％、また好ましくは、約６〜約８重量％
の量において利用される。重量％は、100mlの溶液に対する分子のグラムとして
定義される。
本発明のグルカンは、澱粉および／もしくはラテックス分子を完全に置換する
ように使用されるか、または澱粉−グルカンもしくはラテックス-グルカンの混
合物が、スラリーにおいて使用される。糊づけ塗布において、グルカン：澱粉比
は、約10:90〜約100:0、より好ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好ましくは
約60:40〜約100:0、最も好ましくは約100:0の範囲である。
コーティング塗布において、グルカン：澱粉比は、約10:90〜約100:0、より好
ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好ましくは約60:40〜約100:0、最も好まし
くは約100:0にの範囲である。コーティング塗布において、グルカン：ラテック
ス比は、約10:90〜約100:0、より好ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好まし
くは約60:40〜約100:0、最も好ましくは約100:0の範囲である。
本出願に引用された全ての出版物は、本発明に属する当業者の技術レベルを表
示する。全ての出版物は、各個別の出版物または特許出願が参考として援用され
るために特異的かつ個別に示されるように、同じ範囲で参考として本明細書中に
援用される。
上記の実施態様に対する改変は当業者の能力の範囲内であり、そしてこのよう
な改変は、以下の請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱しない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｓ 3/02 Ｃ１２Ｓ 3/02
Ｄ２１Ｈ 19/10 Ｄ２１Ｈ 19/10 Ｂ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｓ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．改変澱粉の少なくとも部分的な代用物として、野生型または変異体のグルコ シルトランスフェラーゼＢ酵素により合成されるグルカンを製紙における１つ以 上の工程に添加する工程を包含する、製紙の方法。 ２．前記グルカンが、糊づけ工程またはコーティング工程に添加される、請求項 １に記載の方法。 ３．前記グルカンが、前記コーティング工程に添加される、請求項２に記載の方 法。 ４．前記グルカンが、I448V;D457N;D567T;K1014T;D457N/D567T;D457N/D571K;D56 7T/D571K;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;およびY 169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択されるグルコシルトランスフェラーゼＢ変 異体により産生される、請求項３に記載の方法。 ５．前記グルカンが、I448V;K1014T;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D5 71K/K779Q/K1014T;およびY169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択されるグルコシ ルトランスフェラーゼＢ変異体により産生される、請求項４に記載の方法。 ６．前記グルカンが、K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;およびY1 69A/Y170A/Y171Aからなる群より選択されるグルコシルトランスフェラーゼＢ変 異体により産生される、請求項５に記載の方法。 ７．前記グルカンが、I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;またはY169A/Y17 0A/Y171AグルコシルトランスフェラーゼＢ変異体により産生される、請求項６に 記載の方法。 ８．前記トランスジェニック植物が、澱粉生合成を下方制御または無効にするよ うに遺伝的に操作されている、請求項７に記載の方法。 ９．前記トランスジェニック植物が、遺伝子型sh2、bt2、またはbt1のトウモロ コシである、請求項８に記載の方法。 １０．前記グルカンが、糊づけ工程において使用される前記混合物に添加される 、請求項２に記載の方法。 １１．前記グルカンが、I448V;D457N;D567T;K779Q;K1014T;D457N/D567T;D457N/D 571K;D567T/D571K;およびD567T/D571K/K1014Tからなる群より選択されるグルコ シルトランスフェラーゼＢ変異体により産生される、請求項１０に記載の方法。 １２．前記グルカンが、I448V;D457N;K779Q;D567T/D571K;およびD567T/D571K/K1 014Tからなる群より選択されるグルコシルトランスフェラーゼＢ変異体により産 生される、請求項１１に記載の方法。 １３．前記グルカンが、I448VグルコシルトランスフェラーゼＢ変異体により産 生される、請求項１２に記載の方法。 １４．利用される前記グルカンの量が、前記糊づけ塗布において使用されるスラ リーの約４〜15重量％である、請求項１３に記載の方法。 １５．前記グルカンが、トウモロコシ、ジャガイモ、キャッサバ、サツマイモ、 ライムギ、オオムギ、サトウキビ、コムギ、サトウモロコシ、カラスムギ、キビ 、ライコムギ、およびイネからなる群より選択される植物において産生される、 請求項３に記載の方法。 １６．前記形質転換が、Agrobacterium tumefaciens、エレクトロポレーション 、レトロウイルス、照射、またはマイクロインジェクションにより行われる、請 求項１５に記載の方法。 １７．前記グルカンが、トウモロコシのアミロプラスト中に産生される、請求項 １６に記載の方法。 １８．プロモーターが、22 kDa zein、opaque2、gamma zein、およびwaxyからな る群より選択されて用いられる。請求項１８に記載の方法。 １９．前記トランスジェニック植物が、澱粉生合成を下方制御または無効にする ように遺伝的に操作されている、請求項１８に記載の方法。 ２０．グルコシルトランスフェラーゼＢ酵素の野生型および変異体によるトラン スジェニック植物のアミロプラストまたは液胞中に合成される、グルカン。
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