JP2000146974A - 免疫測定法 - Google Patents
免疫測定法Info
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- JP2000146974A JP2000146974A JP10316125A JP31612598A JP2000146974A JP 2000146974 A JP2000146974 A JP 2000146974A JP 10316125 A JP10316125 A JP 10316125A JP 31612598 A JP31612598 A JP 31612598A JP 2000146974 A JP2000146974 A JP 2000146974A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 非特異的反応による凝集がなく、希釈しなく
ても広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高
感度で迅速な測定が可能な免疫測定法を提供する。 【解決手段】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と前記試料を溶液中で混合して抗原抗体反応によ
る凝集反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測
定して検量線と照合することよりなる測定対象物質の測
定方法であって、（１）前記不溶性担体としてラテック
ス粒子を用い、（２）前記溶液中に、水溶性高分子から
なる増感剤が０．１〜５重量％含有され、（３）前記溶
液中に、非イオン性界面活性剤が５〜５，０００ｐｐｍ
含有され、（４）前記凝集反応は、恒温において、５秒
〜１５分間行うものであり、（５）前記吸光度変化量
は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であることを
特徴とする免疫測定法。
ても広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高
感度で迅速な測定が可能な免疫測定法を提供する。 【解決手段】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と前記試料を溶液中で混合して抗原抗体反応によ
る凝集反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測
定して検量線と照合することよりなる測定対象物質の測
定方法であって、（１）前記不溶性担体としてラテック
ス粒子を用い、（２）前記溶液中に、水溶性高分子から
なる増感剤が０．１〜５重量％含有され、（３）前記溶
液中に、非イオン性界面活性剤が５〜５，０００ｐｐｍ
含有され、（４）前記凝集反応は、恒温において、５秒
〜１５分間行うものであり、（５）前記吸光度変化量
は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であることを
特徴とする免疫測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラテックス凝集比
濁法を利用した、高感度で迅速な測定が可能な免疫測定
法に関する。
濁法を利用した、高感度で迅速な測定が可能な免疫測定
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、反応系の微量化、感度の向上、反
応時間の短縮を目的として、ラテックス凝集による免疫
測定法が開発されている。ラテックス凝集による免疫測
定法については、様々なラテックス凝集試薬が上市され
ているが、非特異的な凝集が見られ、ＥＩＡ法等に比べ
ると、特に低濃度においては、正確に測定できないとい
った問題点があった。また、一般に免疫測定は、抗原抗
体反応を利用するためにその好適な測定範囲は広くな
く、体内において広範囲の濃度をとるものについては多
くの場合、測定を行う際に複数回の希釈等煩雑な操作が
必要とされ、極めて不便であると同時に、測定精度が低
下するといった問題点があった。そこで、特に低濃度に
おいて測定感度向上のため、増感剤を添加する試みもな
されているが（特開平４−２０８５９号公報）、非特異
的凝集を促し、逆に測定精度が低下するという問題点が
あった。
応時間の短縮を目的として、ラテックス凝集による免疫
測定法が開発されている。ラテックス凝集による免疫測
定法については、様々なラテックス凝集試薬が上市され
ているが、非特異的な凝集が見られ、ＥＩＡ法等に比べ
ると、特に低濃度においては、正確に測定できないとい
った問題点があった。また、一般に免疫測定は、抗原抗
体反応を利用するためにその好適な測定範囲は広くな
く、体内において広範囲の濃度をとるものについては多
くの場合、測定を行う際に複数回の希釈等煩雑な操作が
必要とされ、極めて不便であると同時に、測定精度が低
下するといった問題点があった。そこで、特に低濃度に
おいて測定感度向上のため、増感剤を添加する試みもな
されているが（特開平４−２０８５９号公報）、非特異
的凝集を促し、逆に測定精度が低下するという問題点が
あった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
に鑑み、非特異的反応による凝集がなく、希釈しなくて
も広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高感
度で迅速な測定が可能な免疫測定法を提供することにあ
る。
に鑑み、非特異的反応による凝集がなく、希釈しなくて
も広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高感
度で迅速な測定が可能な免疫測定法を提供することにあ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
試料中の測定対象物質を測定するにあたり、測定対象物
質に対する抗原又は抗体を感作した不溶性担体と前記試
料を溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生
じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測定して検量線と
照合することよりなる測定対象物質の測定方法であっ
て、（１）前記不溶性担体としてラテックス粒子を用
い、（２）前記溶液中に、水溶性高分子からなる増感剤
が０．１〜５重量％含有され、（３）前記溶液中に、非
イオン性界面活性剤が５〜５，０００ｐｐｍ含有され、
（４）前記凝集反応は、恒温において、５秒〜１５分間
行うものであり、（５）前記吸光度変化量は、凝集反応
の進行に伴う吸光度の増加量であることを特徴とする免
疫測定法である。請求項２記載の発明は、水溶性高分子
からなる増感剤が、数平均分子量３，０００〜１，００
０，０００のポリエチレングリコールであることを特徴
とする請求項１記載の免疫測定法である。以下に本発明
を詳述する。
試料中の測定対象物質を測定するにあたり、測定対象物
質に対する抗原又は抗体を感作した不溶性担体と前記試
料を溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生
じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測定して検量線と
照合することよりなる測定対象物質の測定方法であっ
て、（１）前記不溶性担体としてラテックス粒子を用
い、（２）前記溶液中に、水溶性高分子からなる増感剤
が０．１〜５重量％含有され、（３）前記溶液中に、非
イオン性界面活性剤が５〜５，０００ｐｐｍ含有され、
（４）前記凝集反応は、恒温において、５秒〜１５分間
行うものであり、（５）前記吸光度変化量は、凝集反応
の進行に伴う吸光度の増加量であることを特徴とする免
疫測定法である。請求項２記載の発明は、水溶性高分子
からなる増感剤が、数平均分子量３，０００〜１，００
０，０００のポリエチレングリコールであることを特徴
とする請求項１記載の免疫測定法である。以下に本発明
を詳述する。
【０００５】本発明においては、試料中の測定対象物質
を測定するにあたり、まず、測定対象物質に対する抗原
又は抗体を感作した不溶性担体と前記試料を溶液中で混
合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさせる。
を測定するにあたり、まず、測定対象物質に対する抗原
又は抗体を感作した不溶性担体と前記試料を溶液中で混
合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさせる。
【０００６】上記試料としては、例えば、血清、血漿等
が挙げられるが、これらのみに限定されるのもではな
く、各種の生体試料、非生体試料に適用することも可能
である。
が挙げられるが、これらのみに限定されるのもではな
く、各種の生体試料、非生体試料に適用することも可能
である。
【０００７】上記測定対象物質としては、例えば、α2
−ＰＩ、ＡＴIII 、ＰＬＧ、ＦＤＰ等の血液凝固・線溶
系酵素、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の癌マーカー、ＩｇＧやＩｇ
Ｅ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、α１−マイクログロブ
リンやＣＲＰ等の血漿タンパク質、ＡＳＯやＣＲＰ等の
感染症関連物質、ＨＢｓ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体等のウ
イルス抗体等がある。このうち、最も好適には、α2 −
ＰＩ（α2 −プラスミンインヒビター）を測定対象物質
とすることができる。
−ＰＩ、ＡＴIII 、ＰＬＧ、ＦＤＰ等の血液凝固・線溶
系酵素、ＡＦＰ、ＣＥＡ等の癌マーカー、ＩｇＧやＩｇ
Ｅ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン、α１−マイクログロブ
リンやＣＲＰ等の血漿タンパク質、ＡＳＯやＣＲＰ等の
感染症関連物質、ＨＢｓ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体等のウ
イルス抗体等がある。このうち、最も好適には、α2 −
ＰＩ（α2 −プラスミンインヒビター）を測定対象物質
とすることができる。
【０００８】本発明においては、上記不溶性担体とし
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗体の吸着性
に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持
できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子
が好適に用いられる。
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗体の吸着性
に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持
できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子
が好適に用いられる。
【０００９】上記ラテックス粒子の粒径は、０．０２〜
０．５μｍが好ましい。小さすぎると、凍結乾燥を行っ
たときに分散が困難となり、大きすぎると、自己凝集が
進み、分散性が低下する。より好ましくは、０．０５〜
０．２μｍである。
０．５μｍが好ましい。小さすぎると、凍結乾燥を行っ
たときに分散が困難となり、大きすぎると、自己凝集が
進み、分散性が低下する。より好ましくは、０．０５〜
０．２μｍである。
【００１０】上記不溶性担体には、上記測定対象物質に
対する抗原又は抗体が感作される。不溶性担体への抗原
又は抗体の感作は、物理的又は化学的に吸着させる方法
等により行うことができる。
対する抗原又は抗体が感作される。不溶性担体への抗原
又は抗体の感作は、物理的又は化学的に吸着させる方法
等により行うことができる。
【００１１】上記測定対象物質に対する抗体としては、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使
用することができる。上記ポリクローナル抗体として
は、ヒト、ウサギ、ヤギ等の由来の動物種、グロブリン
画分、アフィニティ精製画分等の純度、Ｆａｂ′、Ｆ
（ａｂ）2 等の処理方法等は制限されるものではない。
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使
用することができる。上記ポリクローナル抗体として
は、ヒト、ウサギ、ヤギ等の由来の動物種、グロブリン
画分、アフィニティ精製画分等の純度、Ｆａｂ′、Ｆ
（ａｂ）2 等の処理方法等は制限されるものではない。
【００１２】上記不溶性担体に感作させられた抗原また
は抗体の量としては、上記溶液中１〜１０μｇとするの
がよい。これは、１μｇ未満であると、感度が低く低濃
度域での正確な定量ができず、１０μｇを超えると、非
特異的反応による凝集が生じ正確な測定ができないため
である。
は抗体の量としては、上記溶液中１〜１０μｇとするの
がよい。これは、１μｇ未満であると、感度が低く低濃
度域での正確な定量ができず、１０μｇを超えると、非
特異的反応による凝集が生じ正確な測定ができないため
である。
【００１３】上記測定対象物質に対する抗原又は抗体を
感作した不溶性担体の上記溶液中での濃度は、０．３〜
４重量％とするのがよい。これは、０．３重量％未満で
あると凝集塊の形成が不十分で必要な感度が得られず、
４重量％を超えるとバックグラウンドとしての吸光度が
高すぎ、正確な定量が行えないからである。
感作した不溶性担体の上記溶液中での濃度は、０．３〜
４重量％とするのがよい。これは、０．３重量％未満で
あると凝集塊の形成が不十分で必要な感度が得られず、
４重量％を超えるとバックグラウンドとしての吸光度が
高すぎ、正確な定量が行えないからである。
【００１４】本発明においては、上記試料と上記不溶性
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
【００１５】本発明においては、上記溶液中に、水溶性
高分子からなる増感剤が０．１〜５重量％含有される。
この増感剤が上記溶液中に含有されることにより、感度
の向上及び反応の促進を図ることができる。上記水溶性
高分子からなる増感剤の上記水溶液中の濃度は、０．１
重量％未満であると、感度が低く、低濃度域での正確な
測定ができず、５重量％を超えると、非特異的反応によ
る凝集が生じ、正確な測定ができないため上記範囲に限
定される。
高分子からなる増感剤が０．１〜５重量％含有される。
この増感剤が上記溶液中に含有されることにより、感度
の向上及び反応の促進を図ることができる。上記水溶性
高分子からなる増感剤の上記水溶液中の濃度は、０．１
重量％未満であると、感度が低く、低濃度域での正確な
測定ができず、５重量％を超えると、非特異的反応によ
る凝集が生じ、正確な測定ができないため上記範囲に限
定される。
【００１６】上記水溶性高分子からなる増感剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン等が挙げられ、中でも、ポリエチレングリコール
を好適に用いることができる。これらの増感剤は、単独
で用いても、複数種組み合わせて用いてもよい。
は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン等が挙げられ、中でも、ポリエチレングリコール
を好適に用いることができる。これらの増感剤は、単独
で用いても、複数種組み合わせて用いてもよい。
【００１７】上記ポリエチレングリコールは、数平均分
子量が３，０００〜１，０００，０００のものを用いる
のが好ましい。これは、数平均分子量が３，０００未満
であると、感度の向上又は反応促進の効果が不十分であ
り、数平均分子量が１，０００，０００を超えると、上
記溶液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点で問題
が生じるためである。
子量が３，０００〜１，０００，０００のものを用いる
のが好ましい。これは、数平均分子量が３，０００未満
であると、感度の向上又は反応促進の効果が不十分であ
り、数平均分子量が１，０００，０００を超えると、上
記溶液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点で問題
が生じるためである。
【００１８】上記水溶性高分子からなる増感剤は、適当
な媒体に分散及び溶解させて使用することが好ましい。
この場合において、上記不溶性担体と、上記水溶性高分
子からなる増感剤とを同一の媒体に分散及び溶解させる
ことにより１液型のラテックス試薬として使用してもよ
く、また、それぞれ、別個の媒体に分散及び溶解させる
ことによりラテックス試薬と溶液状試薬との２液型試薬
として使用してもよい。
な媒体に分散及び溶解させて使用することが好ましい。
この場合において、上記不溶性担体と、上記水溶性高分
子からなる増感剤とを同一の媒体に分散及び溶解させる
ことにより１液型のラテックス試薬として使用してもよ
く、また、それぞれ、別個の媒体に分散及び溶解させる
ことによりラテックス試薬と溶液状試薬との２液型試薬
として使用してもよい。
【００１９】上記媒体としては特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、
５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは、６．５〜
８．０である。
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、
５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは、６．５〜
８．０である。
【００２０】上記１液型のラテックス試薬中には、更
に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整のために塩
化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。また、上記ラ
テックス試薬と溶液状試薬との２液型試薬として使用す
る場合にも、それぞれに牛血清アルブミン、ショ糖、塩
濃度調整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させても
よい。
に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整のために塩
化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。また、上記ラ
テックス試薬と溶液状試薬との２液型試薬として使用す
る場合にも、それぞれに牛血清アルブミン、ショ糖、塩
濃度調整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させても
よい。
【００２１】上記溶液中には、非特異凝集を抑制するた
めに、非イオン性界面活性剤を５〜５，０００ｐｐｍ含
有させる。これは、界面活性剤により分散性を向上させ
ることにより、非特異的凝集を抑制するためである。界
面活性剤の濃度は、５ｐｐｍ未満では、分散性の向上が
十分ではないため、非特異的凝集の発生を招き、５，０
００ｐｐｍより大きいと、特異的凝集の発生まで抑制す
るため、感度の低下を招く。界面活性剤としては、非イ
オン性界面活性剤に限られ、陰イオン性界面活性剤や陽
イオン性界面活性剤は、抗原抗体反応系に影響を与える
ために感度の低下を招き用いることができない。非イオ
ン性界面活性剤としては、特に限定されないが、例え
ば、アルキルアリルポリエーテルアルコール（市販品と
しては、Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３９）やポリエチレ
ングリコールアルキルフェニルエーテル（市販品として
は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などが好適である。
めに、非イオン性界面活性剤を５〜５，０００ｐｐｍ含
有させる。これは、界面活性剤により分散性を向上させ
ることにより、非特異的凝集を抑制するためである。界
面活性剤の濃度は、５ｐｐｍ未満では、分散性の向上が
十分ではないため、非特異的凝集の発生を招き、５，０
００ｐｐｍより大きいと、特異的凝集の発生まで抑制す
るため、感度の低下を招く。界面活性剤としては、非イ
オン性界面活性剤に限られ、陰イオン性界面活性剤や陽
イオン性界面活性剤は、抗原抗体反応系に影響を与える
ために感度の低下を招き用いることができない。非イオ
ン性界面活性剤としては、特に限定されないが、例え
ば、アルキルアリルポリエーテルアルコール（市販品と
しては、Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３９）やポリエチレ
ングリコールアルキルフェニルエーテル（市販品として
は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などが好適である。
【００２２】本発明においては、上記抗原抗体反応によ
る凝集反応は、恒温において行われる。好ましくは、２
５〜３７℃である。また、上記凝集反応は、５秒〜１５
分間行う。５秒未満であると、正確な測定ができず、１
５分間を超えると、非特異的反応による凝集が生じ、正
確な測定ができないので、上記範囲に限定される。
る凝集反応は、恒温において行われる。好ましくは、２
５〜３７℃である。また、上記凝集反応は、５秒〜１５
分間行う。５秒未満であると、正確な測定ができず、１
５分間を超えると、非特異的反応による凝集が生じ、正
確な測定ができないので、上記範囲に限定される。
【００２３】本発明においては、上記凝集反応の際の凝
集反応液の吸光度変化量を測定して検量線と照合するこ
とにより、試料中の測定対象物質を測定する。上記吸光
度変化量は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であ
る。
集反応液の吸光度変化量を測定して検量線と照合するこ
とにより、試料中の測定対象物質を測定する。上記吸光
度変化量は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であ
る。
【００２４】上記吸光度変化量の測定の際の測定波長
は、通常、５００〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００
〜８００ｎｍ、より好ましくは、５５０〜６５０ｎｍの
範囲から適切な波長が選択される。上記吸光度変化量の
測定に用いられる測定装置としては、経時的に上記溶液
の吸光度を測定することできるものであれば特に限定さ
れず、例えば、汎用の生化学自動分析装置等が挙げられ
る。上記測定波長、検体量、試薬量等は、上記測定装置
に合わせて適宜選択することができる。
は、通常、５００〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００
〜８００ｎｍ、より好ましくは、５５０〜６５０ｎｍの
範囲から適切な波長が選択される。上記吸光度変化量の
測定に用いられる測定装置としては、経時的に上記溶液
の吸光度を測定することできるものであれば特に限定さ
れず、例えば、汎用の生化学自動分析装置等が挙げられ
る。上記測定波長、検体量、試薬量等は、上記測定装置
に合わせて適宜選択することができる。
【００２５】上記検量線と照合する具体的な方法として
は、例えば、既知量の測定対象物質を含む試料につい
て、吸光度変化量の測定を行い、その測定値と測定対象
物質の量とから検量線を作成しておき、未知量の測定対
象物質を含む試料について同一条件で測定した吸光度変
化量の測定値から上記検量線において対応する測定対象
物質の量を求めることにより実施することができる。
は、例えば、既知量の測定対象物質を含む試料につい
て、吸光度変化量の測定を行い、その測定値と測定対象
物質の量とから検量線を作成しておき、未知量の測定対
象物質を含む試料について同一条件で測定した吸光度変
化量の測定値から上記検量線において対応する測定対象
物質の量を求めることにより実施することができる。
【００２６】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
【００２７】実施例１ １）試薬及び材料 ａ）ラテックス 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と、５０ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ
4 とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗ヒトα2 −ＰＩ抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ウサギ抗ヒトα2 −ＰＩ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ
社製）を用いた。
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と、５０ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ
4 とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗ヒトα2 −ＰＩ抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ウサギ抗ヒトα2 −ＰＩ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ
社製）を用いた。
【００２８】ｄ）抗体希釈用緩衝液 上記ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液とし
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と、１００ｍＭのＮａＨ2
ＰＯ4 とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）にな
るように、また、ＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテスク
社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したもの
を用いた。
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と、１００ｍＭのＮａＨ2
ＰＯ4 とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）にな
るように、また、ＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテスク
社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したもの
を用いた。
【００２９】ｆ）血漿検体 血栓既往症を有する患者及び健常人の血漿を用いた。 ｇ）ヒトα2 −ＰＩ標準ヒト血清 ヒトプール血清から調製された血液項目用標準血清（イ
アトロセーラ；ダイアヤトロン製）をエルピアα2 −Ｐ
Ｉ（帝国臓器製）を用いてα2 −ＰＩ量を測定し、生理
食塩水で約５、２．５、１．２５、０．６２５ｎｇ／ｍ
ｌにそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目用標準
血清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌ
とした。
アトロセーラ；ダイアヤトロン製）をエルピアα2 −Ｐ
Ｉ（帝国臓器製）を用いてα2 −ＰＩ量を測定し、生理
食塩水で約５、２．５、１．２５、０．６２５ｎｇ／ｍ
ｌにそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目用標準
血清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌ
とした。
【００３０】ｈ）検体希釈用液（Ｒ１液） ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０
００（平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３％
（Ｗ／Ｖ）、及び、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカ
ライテスク社製）を２０ｐｐｍになるように添加したも
のを用いた。 ｉ）ヒトα2 −ＰＩ測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアα2 −ＰＩ、
帝国臓器製）を用いた。
００（平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３％
（Ｗ／Ｖ）、及び、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカ
ライテスク社製）を２０ｐｐｍになるように添加したも
のを用いた。 ｉ）ヒトα2 −ＰＩ測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアα2 −ＰＩ、
帝国臓器製）を用いた。
【００３１】２）方法 （１）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝
液３容を添加希釈し、２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液
とした。抗ヒトα2 −ＰＩ抗体は、タンパク濃度が６
６．７μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈
し、感作抗体液とした。２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス
液２００μ１を２５℃のインキュベーター中でマグネチ
ックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液８００μｌ
を素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、
ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて
続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５０００ｒ
ｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッ
キング用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分離す
ることにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行っ
た。この沈殿にブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加
し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬とし
た。このようにして調製したラテックス試薬は４℃にて
保存した。
形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝
液３容を添加希釈し、２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液
とした。抗ヒトα2 −ＰＩ抗体は、タンパク濃度が６
６．７μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈
し、感作抗体液とした。２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス
液２００μ１を２５℃のインキュベーター中でマグネチ
ックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液８００μｌ
を素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、
ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて
続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５０００ｒ
ｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッ
キング用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分離す
ることにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行っ
た。この沈殿にブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加
し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬とし
た。このようにして調製したラテックス試薬は４℃にて
保存した。
【００３２】（２）ラテックス試薬によるヒトα2 −Ｐ
Ｉ量の測定 ラテックス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量の測定は、生化
学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用い
て行った。上記（１）で得られた固形分０．２５％（Ｗ
／Ｖ）のラテックス試薬をそのままＲ２液（固形分０．
２５％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りであ
る。
Ｉ量の測定 ラテックス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量の測定は、生化
学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用い
て行った。上記（１）で得られた固形分０．２５％（Ｗ
／Ｖ）のラテックス試薬をそのままＲ２液（固形分０．
２５％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りであ
る。
【００３３】 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ１液） ３００μｌ 試薬（Ｒ２液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃
【００３４】試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のヒトα2 −ＰＩ量を測定した。
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のヒトα2 −ＰＩ量を測定した。
【００３５】（３）ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量の
測定 上記（２）で測定したすべての検体について、市販のＥ
ＩＡ試薬（帝人社製）を用いて、検体中のヒトα2 −Ｐ
Ｉ量を測定した。方法は、キット添付の操作法に従って
行った。
測定 上記（２）で測定したすべての検体について、市販のＥ
ＩＡ試薬（帝人社製）を用いて、検体中のヒトα2 −Ｐ
Ｉ量を測定した。方法は、キット添付の操作法に従って
行った。
【００３６】実施例２ 上記１）試薬及び材料の項のｈ）検体希釈用液（Ｒ１
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに５００ｐｐ
ｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに５００ｐｐ
ｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００３７】実施例３ 上記１）試薬及び材料の項のｈ）検体希釈用液（Ｒ１
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに４０００ｐ
ｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに４０００ｐ
ｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００３８】比較例１ 上記１）試薬及び材料の項のｈ）検体希釈用液（Ｒ１
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）を添加しなかったこと以外は、実施例１と
同様に行った。
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）を添加しなかったこと以外は、実施例１と
同様に行った。
【００３９】比較例２ 上記１）試薬及び材料の項のｈ）検体希釈用液（Ｒ１
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに３００００
ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
液）において、ＴｒｉｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライ
テスク社製）の濃度を２０ｐｐｍの代わりに３００００
ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００４０】実施例１〜３および比較例１・２による測
定結果を、表１に示した。また、表１に示したラテック
ス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量とＥＩＡ法によるヒトα
2 −ＰＩ量との相関を図１に示した。
定結果を、表１に示した。また、表１に示したラテック
ス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量とＥＩＡ法によるヒトα
2 −ＰＩ量との相関を図１に示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】表１及び図１から明らかなように、本発明
の免疫測定法によって測定されたヒトα2 −ＰＩ量は、
ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量と、低濃度域において
も高濃度域においてもよく一致したが、比較例によるヒ
トα2 −ＰＩ量は、ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量
と、低濃度域及び高濃度域において、必ずしも一致しな
かった。以上の結果から、本発明の免疫測定法は、従来
のラテックス凝集免疫試薬による測定法よりも高感度
で、かつ、ＥＩＡ法よりも迅速、簡便な優れた定量法で
あることが確認された。
の免疫測定法によって測定されたヒトα2 −ＰＩ量は、
ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量と、低濃度域において
も高濃度域においてもよく一致したが、比較例によるヒ
トα2 −ＰＩ量は、ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量
と、低濃度域及び高濃度域において、必ずしも一致しな
かった。以上の結果から、本発明の免疫測定法は、従来
のラテックス凝集免疫試薬による測定法よりも高感度
で、かつ、ＥＩＡ法よりも迅速、簡便な優れた定量法で
あることが確認された。
【００４３】
【発明の効果】本発明の免疫測定法は、上述の構成から
なるので、従来のラテックス凝集法で見られたような検
体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、かつ低濃
度域でもＥＩＡ法と同様の検出感度を示す。また、この
免疫測定法を利用することにより、迅速かつ簡便に測定
対象物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発
見、病態の把握、治療方法の決定等に有効に利用するこ
とができる。
なるので、従来のラテックス凝集法で見られたような検
体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、かつ低濃
度域でもＥＩＡ法と同様の検出感度を示す。また、この
免疫測定法を利用することにより、迅速かつ簡便に測定
対象物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発
見、病態の把握、治療方法の決定等に有効に利用するこ
とができる。
【図１】 ラテックス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量と、
ＥＩＡ法によるヒトα 2 −ＰＩ量との相関を示す図であ
る。横軸は、ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量を表し、
縦軸は、ラテックス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量を表
す。
ＥＩＡ法によるヒトα 2 −ＰＩ量との相関を示す図であ
る。横軸は、ＥＩＡ法によるヒトα2 −ＰＩ量を表し、
縦軸は、ラテックス試薬によるヒトα2 −ＰＩ量を表
す。
Claims (2)
- 【請求項１】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と前記試料を溶液中で混合して抗原抗体反応によ
る凝集反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測
定して検量線と照合することよりなる測定対象物質の測
定方法であって、（１）前記不溶性担体としてラテック
ス粒子を用い、（２）前記溶液中に、水溶性高分子から
なる増感剤が０．１〜５重量％含有され、（３）前記溶
液中に、非イオン性界面活性剤が５〜５，０００ｐｐｍ
含有され、（４）前記凝集反応は、恒温において、５秒
〜１５分間行うものであり、（５）前記吸光度変化量
は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であることを
特徴とする免疫測定法。 - 【請求項２】 水溶性高分子からなる増感剤が、数平均
分子量３，０００〜１，０００，０００のポリエチレン
グリコールであることを特徴とする請求項１記載の免疫
測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10316125A JP2000146974A (ja) | 1998-11-06 | 1998-11-06 | 免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10316125A JP2000146974A (ja) | 1998-11-06 | 1998-11-06 | 免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000146974A true JP2000146974A (ja) | 2000-05-26 |
Family
ID=18073535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10316125A Withdrawn JP2000146974A (ja) | 1998-11-06 | 1998-11-06 | 免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000146974A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005091111A (ja) * | 2003-09-16 | 2005-04-07 | Godo Shusei Co Ltd | 尿中総ヘモグロビン定量試薬 |
| WO2013100146A1 (ja) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 積水メディカル株式会社 | 粒子凝集測定用ラテックス粒子 |
| JP2013238502A (ja) * | 2012-05-16 | 2013-11-28 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定試薬 |
| WO2019031581A1 (ja) * | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Jsr株式会社 | 免疫凝集の検出又は測定方法 |
| WO2023190275A1 (ja) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 積水メディカル株式会社 | ラテックス粒子分散液 |
-
1998
- 1998-11-06 JP JP10316125A patent/JP2000146974A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005091111A (ja) * | 2003-09-16 | 2005-04-07 | Godo Shusei Co Ltd | 尿中総ヘモグロビン定量試薬 |
| JP4515733B2 (ja) * | 2003-09-16 | 2010-08-04 | 合同酒精株式会社 | 尿中総ヘモグロビン定量試薬 |
| WO2013100146A1 (ja) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 積水メディカル株式会社 | 粒子凝集測定用ラテックス粒子 |
| US9939433B2 (en) | 2011-12-28 | 2018-04-10 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Latex particles for measuring particle agglutination |
| JP2013238502A (ja) * | 2012-05-16 | 2013-11-28 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定試薬 |
| WO2019031581A1 (ja) * | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Jsr株式会社 | 免疫凝集の検出又は測定方法 |
| WO2023190275A1 (ja) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 積水メディカル株式会社 | ラテックス粒子分散液 |
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