WO2023190275A1 - ラテックス粒子分散液 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a latex particle dispersion.
- the present invention also relates to a method and a detection kit for detecting a target substance in a specimen by immunoagglutination using the dispersion. Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing sedimentation of latex particles.
- Latex immunoagglutination method (also referred to as latex immunoturbidimetry, Latex tubidimetrical immunoassay: LTIA method) is known as a method for qualitatively or quantitatively measuring a target substance in a biological sample.
- This method is a method of optically detecting the degree of aggregation of latex particles caused by an immune reaction between an antigen or antibody supported on the surface of a latex particle and an antibody or antigen that is a target substance in a biological sample.
- the latex particles carrying the antigen or antibody are dispersed in an aqueous medium such as a buffer solution.
- the aqueous medium containing the latex particles will be referred to as a latex particle dispersion.
- the latex particle dispersion liquid can be used as a measurement reagent based on the latex immunoagglutination method, and is hereinafter referred to as a latex reagent.
- a latex reagent By applying measurement reagents to an automatic analyzer, it becomes possible to measure a large number of samples simply and quickly.
- the reagents are contained in containers and stored in the reagent storage of the automatic analyzer. In this case, from the viewpoint of usability, it is desirable that the reagent composition be uniform over a long period of time (good on-board stability) when the container is left stationary in the reagent storage.
- Patent Document 1 describes a method for suppressing sedimentation of microparticles to which reactive substances such as antigens and antibodies are bound, in which polyanions and their salts, dextran, cyclodextrin, polyethylene glycol, and A method is disclosed in which at least one type selected from the group consisting of glycerol is allowed to coexist.
- the sedimentation suppressing effect has only been confirmed for colloidal gold particles of 5 to 100 nm, and the sedimentation suppressing effect of latex particles is unknown.
- Patent Document 2 describes an immunological latex nephelometric reagent consisting of a suspension of latex particles carrying antigens or antibodies in order to improve particle sedimentation while maintaining high reagent sensitivity.
- a reagent containing specific amounts of sugars such as sucrose, glucose, and trehalose in a reagent for latex nephelometry is described.
- This technique attempts to improve the dispersibility by increasing the specific gravity of the particle suspension by including a specific amount of the saccharide in the particle suspension.
- the present inventors investigated the effect of these saccharides on suppressing the sedimentation of latex particles and the influence they have on the measurement sensitivity of the reagent.
- An object of the present invention is to provide a technique for increasing the sensitivity of a latex immunoagglutination reagent while increasing the dispersibility of particles in a latex particle dispersion and suppressing particle sedimentation.
- the objective is to suppress sedimentation and/or aggregation of latex particles in a dispersion containing latex particles with large particle diameters.
- the present inventors have discovered that, in some cases, the measurement sensitivity is maintained or enhanced compared to reagents to which these components are not added, leading to the completion of the present invention. That is, the present invention has the following configuration.
- ⁇ 1> A latex particle dispersion using an aqueous medium as a dispersion medium, the latex particle dispersion containing one or more compounds selected from the group consisting of polyacrylic acid, sodium polyacrylate, polyethylene oxide, and sodium poly- ⁇ -glutamate. liquid.
- ⁇ 2> The latex particle dispersion according to ⁇ 1>, wherein the aqueous medium contains water.
- ⁇ 3> The latex particle dispersion according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the latex particles are polymer particles derived from a monomer component containing a monomer having a styrene or vinylnaphthalene structure.
- ⁇ 4> The latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the latex particles are latex particles carrying a substance capable of binding to a target substance.
- ⁇ 5> The particle dispersion according to ⁇ 4>, wherein the substance capable of binding to the target substance is an antigen or antibody against the target substance.
- ⁇ 6> The latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which is used as an immunoagglutination reagent.
- ⁇ 7> The latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the latex particles have an average particle diameter of 50 to 1000 nm.
- ⁇ 8> The latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the latex particles are 0.01 to 0.10% by mass based on the total amount of the latex particle dispersion.
- a reagent kit for use in detecting a target substance in a specimen by immunoagglutination comprising the latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>.
- a method for detecting a target substance in a specimen by immunoagglutination comprising the step of bringing the specimen into contact with the latex particle dispersion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>.
- a method for suppressing sedimentation of latex particles carrying a substance capable of binding to a target substance in an immunoagglutination method comprising: The method is characterized by comprising a step of bringing the latex particles into contact with one or more compounds selected from the group consisting of polyacrylic acid, sodium polyacrylate, polyethylene oxide, and sodium poly- ⁇ -glutamate in an aqueous medium. Sedimentation suppression method.
- the latex particle dispersion of the present invention suppresses sedimentation and/or aggregation of latex particles, when applied to a latex immunoagglutination reagent, the latex particle dispersion liquid can be mixed by inverting the reagent container, stirring the reagent, etc. Latex reagents can be used for measurements without redispersing the particles. Furthermore, the on-board stability of immunoagglutination reagents using latex particles can be improved.
- the latex particle dispersion of the present invention using an aqueous medium as a dispersion medium contains one or more compounds selected from the group consisting of polyacrylic acid, sodium polyacrylate, PEO, and sodium poly- ⁇ -glutamate. By coexisting these compounds with latex particles, it has become possible to improve the dispersibility of latex particles in an aqueous medium.
- the polyacrylic acid used in the latex particle dispersion of the present invention preferably has an average molecular weight of 5,000 to 1,000,000, and commercially available ones include polyacrylic acid 5000, polyacrylic acid 25000, polyacrylic acid Examples include acid 250,000 and polyacrylic acid 1,000,000 (all manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
- the sodium polyacrylate used in the latex particle dispersion of the present invention preferably has a degree of polymerization of 2,700 to 70,000, and commercially available sodium polyacrylate 2700-7000, sodium polyacrylate 22000, etc. -70000 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), etc.
- the polyethylene oxide (PEO) used in the latex particle dispersion of the present invention preferably has a molecular weight of 100,000 to 2,200,000.
- PEO indicated by the grade symbol PEO-2 molecular weight 400,000-600,000
- PEO indicated by the grade symbol PEO-3 molecular weight 600,000-1,100,000
- PEO indicated by the grade symbol PEO-4 molecular weight 1,100,000-1,500,000
- PEO indicated by the grade symbol PEO-8 molecular weight 1,700,000-2,200,000 ( Sumitomo Seika Chemical Co., Ltd.)
- PEO molecular weight 100,000, 200,000, 400,000, 600,000, 1,000,000, Sigma-Aldrich
- Molecular weight for PEO indicates viscosity average molecular weight).
- the sodium poly- ⁇ -glutamate used in the latex particle dispersion of the present invention preferably has an average molecular weight of 400,000 or more, and a commercially available sodium poly- ⁇ -glutamate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be mentioned.
- the above compounds may be used alone or in combination of two or more.
- the content of the above compound in the latex particle dispersion is preferably 0.002 to 0.50% by mass, more preferably 0.003 to 0.30% by mass, and most preferably 0.005 to 0.20% by mass. It is. If it is more than 0.50% by mass (upper limit), latex particles may aggregate or the viscosity of the reagent may increase, reducing measurement accuracy; if it is less than 0.002% by mass (lower limit), This is because the effect of suppressing the settling of latex particles in the liquid is inferior.
- the pH of the particle dispersion of the present invention is preferably pH 4.0 to pH 10.0, more preferably pH 5.0 to pH 9.0, and most preferably pH 6.0 to pH 8.0.
- the pH can be adjusted using pH adjusting reagents well known to those skilled in the art, such as sodium hydroxide and hydrochloric acid.
- the latex particle dispersion of the present invention can be used as an immunoagglutination reagent, and can also be combined with other reagent configurations to form a kit.
- Immune aggregation reagents typically include in vitro diagnostic reagents. The configuration of the reagent kit will be described later.
- the aqueous medium used in the latex particle dispersion of the present invention may be any medium as long as it can disperse latex particles, and among these, those containing water are preferred.
- the content of water is not particularly limited as long as it can disperse the latex particles, and for example, 40 to 100% by mass, 60 to 100% by mass, 80 to 100% by mass, 90 to 100% by mass based on the total amount of the aqueous medium. Examples include ranges such as %.
- the aqueous medium may also be a buffer such as Good's buffer, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, ammonia buffer, citrate buffer, acetate buffer, or succinate buffer.
- the aqueous medium may also contain lower alcohols such as methanol, ethanol, and isopropanol, and organic solvents that mix with water such as dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide.
- the content of the aqueous medium is, for example, 50 to 99.9% by mass and 70 to 99.9% by mass based on the total amount of the latex particle dispersion.
- the latex particles are not particularly limited as long as they are latex particles commonly used as reagents for immunoassays.
- Latex particles can be obtained by polymerizing or copolymerizing various monomers. Examples of monomers include polymerizable monomers having phenyl groups such as styrene, ⁇ -methylstyrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, 4-vinylbenzoic acid, divinylbenzene, and vinyltoluene.
- polymerizable monomers having a phenyl group and a sulfonate such as styrene sulfonate, divinylbenzenesulfonate, o-methylstyrene sulfonate, p-methylstyrene sulfonate, 1-vinylnaphthalene, Polymerizable unsaturated aromatics such as polymerizable monomers having a naphthyl group such as 2-vinylnaphthalene, ⁇ -naphthyl (meth)acrylate, and ⁇ -naphthyl (meth)acrylate, such as (meth)acrylic acid; Polymerizable unsaturated carboxylic acids such as itaconic acid, maleic acid, and fumaric acid, such as methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, and 2-(meth)acrylate.
- Polymerizable unsaturated carboxylic acid esters such as hydroxyethyl, glycidyl (meth)acrylate, ethylene glycol di-(meth)acrylate, tribromophenyl (meth)acrylate, (meth)acrylonitrile, (meth)acrolein , (meth)acrylamide, N-methylol-(meth)acrylamide, methylenebis(meth)acrylamide, butadiene, isoprene, vinyl acetate, vinylpyridine, N-vinylpyrrolidone, vinyl chloride, vinylidene chloride, vinyl bromide, etc.
- Examples include acid amides, polymerizable unsaturated nitriles, vinyl halides, and conjugated dienes.
- polymer particles derived from a monomer component containing a monomer having a styrene or vinylnaphthalene structure are preferred. These monomers are appropriately selected depending on required surface properties, specific gravity, etc., and can be used alone or in combination of two or more.
- the synthetic polymer constituting the latex particles of the present invention is not particularly limited, but includes, for example, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, itaconic acid polymer, styrene- Hydrophilic carboxy monomer copolymers: Examples include styrene-(meth)acrylic acid copolymers, styrene-acrylic acid copolymers, styrene-itaconic acid copolymers, and the like.
- styrene-methacrylic acid copolymers styrene-itaconic acid copolymers, styrene and styrene-styrene sulfonate copolymers are preferred.
- the content of latex particles is preferably 0.01 to 0.10% by mass based on the total amount of the latex particle dispersion.
- the average particle diameter of the latex particles may be a size that allows a difference in sensitivity to be obtained between the measurement target and the measurement range, and is preferably 50 nm to 1000 nm, for example.
- latex particles with a large average particle diameter increase sensitivity, the particles tend to sink, making it difficult to apply them to measurement reagents.
- the particles according to the latex particle dispersion of the present invention, the particles have a large average particle diameter. It also has the characteristic of not sinking easily. Therefore, in order to fully enjoy the effects of the present invention, the average particle diameter of the latex is preferably large, preferably 100 nm or more, more preferably 200 nm or more, and even more preferably 300 nm or more.
- the average particle diameter of latex particles can be analyzed by laser diffraction/scattering method (LS method), Coulter principle, dynamic light scattering photon correlation method, electron microscope, etc.
- the average particle size means the volume average particle size.
- substances that can bind to the target substance include proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, haptens, etc., and there are no particular restrictions on their molecular weight or origin such as natural or synthetic, but Examples include antibodies or antigens that can be used in immunoassays that utilize reactions.
- the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. More preferred are monoclonal antibodies.
- As the antibody used in the present invention in addition to the whole antibody molecule, it is also possible to use a functional fragment of an antibody that has antigen-antibody reaction activity.
- the amino acid sequence of an animal species different from the animal being immunized with the immunogen (substance to be measured) through genetic recombination technology, etc. It may also be an altered antibody (chimeric antibody, humanized antibody, fully humanized antibody, etc.).
- Functional fragments of antibodies include F(ab') 2 , Fab', single chain antibodies (scFv), VHH (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody) antibodies, and IgNAR ( Examples include new antigen receptor) antibodies. Functional fragments of these antibodies can be produced by treating the antibodies obtained as described above with a proteolytic enzyme (eg, pepsin, papain, etc.).
- the substance supported on the latex particles and capable of binding to the target substance can be immobilized and supported on the latex particles by a known method such as a physical adsorption method, a chemical bonding method, or a combination thereof.
- a substance capable of binding to the target substance and latex particles are mixed in a solution such as a buffer solution and brought into contact with each other, or a target substance dissolved in a buffer solution etc. is mixed in accordance with a known method. This can be carried out by, for example, bringing a bondable substance into contact with a carrier.
- the chemical bonding method "Clinical Pathology Extraordinary Special Issue No.
- the surface of latex particles may be treated with bovine serum albumin (BSA), casein, gelatin, ovalbumin or its salt, etc.
- BSA bovine serum albumin
- Blocking treatment (masking treatment) of the carrier may be performed by a known method such as contacting and coating the carrier with a protein, a surfactant, skim milk powder, or the like.
- a reagent kit for use in detecting a target substance in a specimen by the immunoagglutination method of the present invention includes at least the latex particle dispersion of the present invention.
- the kit typically has a two-reagent system comprising a particle dispersion (second reagent) containing particles carrying a substance that binds to a target substance, and a first reagent containing a buffer solution.
- the buffer include Good's buffer, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, ammonia buffer, citrate buffer, acetate buffer, and succinate buffer.
- the first reagent may contain a blocking agent and an aggregation promoter in addition to the buffer.
- the components of the kit include a sample dilution solution, a sample extraction solution, instructions for use, and sample collection tools (collection pipette, syringe, cotton swab, filtration filter, etc.). .
- the method of detecting a target substance in a specimen by the immunoagglutination method of the present invention is carried out by bringing the specimen into contact with the above-mentioned latex particle dispersion, and the immunoagglutination method is also called the latex immunoagglutination method (LTIA method).
- LTIA method latex immunoagglutination method
- Methods for measuring target substances using the LTIA method can be broadly classified into two types.
- the first method is to react latex particles carrying a substance capable of binding to the target substance with the target substance to form a sandwich-type immune complex, and to determine the degree of aggregation of the latex particles accompanying the formation of the immune complex. This is a method for measuring target substances.
- the second method is to add proteins, etc. on which multiple target substances or their analogues (including fragments thereof) are immobilized to the reagent, and to make them compete with the target substances in the sample, The target substance (antigen ).
- any substance can be selected as the target substance and the substance capable of binding to the target substance depending on the purpose.
- the target substance is an antigen
- antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (including recombinant antibodies and functional fragments of each antibody) can be selected as the substance capable of binding to the target substance.
- antigens such as natural and recombinant antigens can be selected as substances capable of binding to the target substance.
- the present invention can be used in any of the above methods, and specifically, the following steps are exemplified. (1) Step of mixing the target substance in the sample with a buffer solution, etc.
- Step (3) of bringing the latex particles into contact with the specimen (3) A step of optically detecting the degree of aggregation of latex particles in the liquid after the step (2).
- it means a step of measuring the agglutination reaction between the target substance and the latex particles after step (2) without going through a washing/separation step.
- methods for optically observing the degree of aggregation of latex particles include methods for measuring scattered light intensity, absorbance, or transmitted light intensity with an optical instrument (end point method, rate method, etc.).
- the measured values such as absorbance obtained by measuring the sample are compared with the measured values such as absorbance obtained by measuring the standard substance (a sample with a known concentration of the substance to be measured), and the results are determined by comparing the measured values such as the absorbance obtained by measuring the sample
- the concentration (quantitative value) of the substance to be measured can be calculated.
- the measurement of the absorbance of transmitted light, scattered light, etc. may be a one-wavelength measurement or a two-wavelength measurement (difference or ratio between two wavelengths).
- the measurement wavelength is generally selected from 500 nm to 900 nm.
- the measurement of a target substance in a specimen according to the present invention may be performed manually, or may be performed using a device such as a measuring device.
- the measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
- the method for suppressing sedimentation of latex particles carrying a substance capable of binding to a target substance in the immunoaggregation method of the present invention comprises the latex particles, polyacrylic acid, sodium polyacrylate, PEO, and sodium poly- ⁇ -glutamate.
- a method comprising the step of contacting one or more compounds selected from the group in an aqueous medium.
- suppressing sedimentation of latex particles refers to cases in which particles are prevented from settling as they are, and cases in which particles increase in size and settle as a result of suppressing adsorption or aggregation of particles. This includes cases in which this is suppressed, and cases in which both are suppressed.
- the presence or absence of the effect of suppressing sedimentation of latex particles is determined, for example, by adding the additive to be tested to a latex particle dispersion liquid and comparing the results of the dispersion with no additive, as shown in the examples below. When the content ratio of latex particles on the liquid surface is high, it can be evaluated that the additive has a sedimentation suppressing effect.
- Samples containing target substances in the present invention include those obtained from living organisms such as human or animal blood, serum, plasma, culture supernatant, urine, spinal fluid, saliva, sweat, ascites, or cell or tissue extracts. Examples include samples that have been tested. Further, the specimen in the present invention includes not only the sample itself obtained from a living body but also a sample that has undergone pretreatment such as dilution, purification, extraction, or filtration treatment. Blood specimens include whole blood, red blood cells, plasma, serum, etc., and also include plasma specimens collected from blood collection tubes containing anticoagulants.
- target substances include proteins, peptides, amino acids, lipids, carbohydrates, nucleic acids, haptens, etc., but there are no particular limitations as long as they are substances that can be measured theoretically.
- CRP C-reactive protein
- Lp(a) Lp(a)
- MMP3 matrix metalloproteinase 3
- antiphospholipid antibodies type IV collagen
- PSA BNP
- BNP brain natriuretic peptide
- insulin albumin
- cystatin C RF ( rheumatoid factor)
- KL-6 procalcitonin
- FDP D-dimer
- SF soluble fibrin
- TAT thrombin-antithrombin III complex
- PAI-1 phenytoin, phenobarbital, carbamazepine, valproic acid, theophylline
- TARC Thymus and activation-regulated chemokine
- sIL-2R soluble interleukin-2 receptor
- Anti-human TARC monoclonal antibody-sensitized latex was prepared with reference to the method described in JP-A-2017-181377. That is, an equal amount of 5mM Tris-HCl (pH 8.5) was added to a 1.0% latex solution (5mM Tris buffer (hereinafter referred to as Tris-HCl or simply Tris) (pH 8.5) with an average particle size of 0.3 ⁇ m). An anti-TARC antibody solution diluted to 0.36 mg/mL was added and stirred at 4°C for 2 hours. Then, an equal volume of 5mM Tris-HCl (pH 8.5) containing 0.5% BSA was added.
- Tris buffer hereinafter referred to as Tris-HCl or simply Tris
- an anti-TARC antibody-sensitized latex particle solution was prepared.
- the anti-TARC antibody-sensitized latex particle solution was diluted with 5mM MOPS-NaOH (pH 7.0) so that the absorbance at 600 nm was about 5.5OD.
- the solution was diluted with 20% chloride and used as a second LTIA measurement reagent.
- CCL17, thymus and activation regulated chemokine (Shenandoah Biotechnology, Inc.), CCL17/TARC, Human (LifeSpan Biosscience, Inc.), Human TARC (CCL17) (Abeomics, Inc.), etc.
- Examples 1 to 21 Additive formulation
- Measurements were performed in the same manner as in Comparative Example 1, except that each additive (name and final concentration is listed in Table 1) was added to the second LTIA measurement reagent. The measurement results are shown in Table 2.
- Mv indicates molecular weight.
- the ratio of absorbance at 600 nm and 800 nm represents the dispersibility of particles in the solution. Based on the 600/800 ratio of 2.21 in Comparative Example 1 (without additives) with overturning mixing, the dispersibility was evaluated to be good as long as the absorbance ratio did not decrease by 0.10 or more.
- the content ratio (%) of (without mixing by tumbling)/(with mixing by tumbling) represents the ease of particle sedimentation, and if it is higher than Comparative Example 1 (without additive), there is an effect of suppressing the sedimentation of the additive. It was also evaluated that if it was higher than Comparative Examples 2 and 3 (sucrose addition), it would be more effective in suppressing sedimentation than conventional additives.
- Comparative Example 1 the 600/800 ratio after 17 days was "2.21" with overturning mixing and "2.22" without overturning mixing, and there was no problem in dispersibility. On the other hand, after 17 days, the content ratio of no mixing by falling/mixing by falling was as low as 54.6%, and it was determined that the latex particles had settled. In Comparative Examples 2 and 3, the content ratios were 80.7% and 89.6%, higher values than Comparative Example 1, and a certain suppressive effect on latex sedimentation was observed. In the examples, firstly, the 600/800 ratio was 2.21 to 2.22 under all conditions of Examples 1 to 21, indicating that a good dispersion state was maintained regardless of the presence or absence of overturning mixing. It was suggested.
- Example 3 polyacrylic acid molecular weight 25,000, final concentration 0.01%
- Example 7 polyacrylic acid molecular weight 1,000,000, final concentration 0.01%
- Example 8 polyacrylic acid Sodium molecular weight 2,700-7,000, final concentration 0.01%
- Example 9 sodium polyacrylate molecular weight 22,000-70,000, final concentration 0.01%
- Example 14 PET-1
- Example 15 (PEO-3, molecular weight 600,000-1,100,000, final concentration 0.01%) used conventional additives. It was found that the content ratio (%) of Comparative Examples 2 and 3 was higher than that of Comparative Examples 2 and 3, and the effect of suppressing sedimentation on latex was greater than that of conventional additives.
- Sample TARC calibration material Sample 1: Physiological saline solution (TARC 0 pg/mL) Sample 2: TARC 677pg/mL Sample 3: TARC 1880pg/mL Sample 4: TARC 4910 pg/mL Sample 5: TARC 9946pg/mL Sample 6: TARC 20325pg/mL Any human serum samples (specimen 1 to sample 8) were used.
- Example 1-21 Additive formulation
- the measurement was performed in the same manner as in Comparative Example 1 of Test Example 2, except that the same second reagent as in Example 1-21 of Test Example 1 was used.
- the measurement results of the calibration substances are shown in FIGS. 1 and 2, Table 3, and the relative sensitivity is shown in Table 4.
- Table 5 also shows the measurement results of human serum samples (specimens 1 to 8).
- polyacrylic acid 5000 polyacrylic acid 25000, polyacrylic acid 250000, polyacrylic acid 100000, sodium polyacrylate 2700-7000, sodium polyacrylate 22000-70000, poly-
- the reagents to which ⁇ -sodium glutamate was added had good relative sensitivities of approximately 90% or higher regardless of the TARC content, and reagent sensitivity comparable to that of reagents without additives was obtained.
- Ta With the reagent containing these components, no major changes were observed in the measured values of human serum samples, indicating that TARC could be measured with high accuracy.
- the relative sensitivity was 100% or more, and a sensitizing effect was observed.
- Ta With the reagent containing these components, no major changes were observed in the measured values of human serum samples, indicating that TARC could be measured with high accuracy.
- Example 14 (PEO-1, molecular weight 150,000-400,000, final concentration 0.01%),
- Example 15 (PEO-3, molecular weight 600,000-1,100,000, final concentration 0.01%)
- has a higher sedimentation inhibitory effect than conventionally known sedimentation inhibitors Comparative Examples 2 and 3
- the addition of polyacrylic acid, sodium polyacrylate, poly- ⁇ -sodium glutamate, and PEO does not reduce reagent sensitivity or affect reagent performance, and the addition of these to reagents does not reduce reagent sensitivity or affect reagent performance.
- the target substance could be measured with high accuracy, and therefore it was found to be useful as the latex sedimentation inhibitor of the present invention.
- latex particle dispersion of the present invention sedimentation and/or aggregation of latex particles is suppressed, so when applied to a latex immunoagglutination reagent, it is possible to perform measurements without redispersing by stirring etc. become. Furthermore, the on-board stability of immunoagglutination reagents using latex particles can be improved.
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Abstract
本発明は、ラテックス粒子分散液中の粒子の沈降を抑制しつつ、ラテックス免疫凝集試薬の高感度化のための技術の提供を課題とする。特に、大きい粒子径のラテックス粒子分散液中における凝集体の経時的な発生を抑制しつつ十分な感度を有するラテックス免疫凝集試薬に適用可能なラテックス粒子分散液の提供を課題とする。 水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液であって、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する、ラテックス粒子分散液を提供する。また、当該ラテックス粒子分散液を適用した免疫凝集試薬を提供する。
Description
本発明は、ラテックス粒子分散液に関する。また、当該分散液を用いた免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法及び検出キットに関する。さらにまた、ラテックス粒子の沈降抑制方法に関する。
生体試料中の標的物質を定性あるいは定量的に測定する方法として、ラテックス免疫凝集法（ラテックス免疫比濁法、Latex tubidimetrical immunoassay：LTIA法ともいう）が知られている。当該方法は、ラテックス粒子表面に担持された抗原又は抗体と、生体試料中の標的物質である抗体又は抗原の間の免疫反応に起因するラテックス粒子の凝集度合を、光学的に検出する方法である。この抗原又は抗体を担持したラテックス粒子は、緩衝液などの水性媒体中に分散されている。以下、当該ラテックス粒子を含む水性媒体を、ラテックス粒子分散液という。ラテックス粒子分散液は、ラテックス免疫凝集法を原理とする測定試薬として用いることができ、以下ラテックス試薬という。
測定試薬を自動分析装置に適用することで、簡便且つ迅速に多数の試料の測定が可能となる。試薬は、容器に収容されて自動分析装置の試薬保管庫の中に保管される。その際、ユーザービリティーの観点から、試薬保管庫の中に容器を静置した状態で、長期間にわたって試薬組成が均一であること（オンボード安定性が良好であること）が望まれる。
しかしながら、ラテックス免疫凝集法の試薬において、感度を上げるためにラテックス粒子の粒子径を大きくすると、試薬を容器に充填後、時間の経過とともにラテックス粒子が沈降し、ラテックス試薬が不均一になっていった。このような不均一なラテックス試薬を用いて試料を測定すると、正確な測定値を得ることができないという問題が起こる。 従って、粒子径の大きなラテックス粒子を含む試薬を用いて正確な測定を行うためには、測定前に試薬容器を転倒混和したり、試薬を攪拌することなどによりラテックス粒子を水性媒体中で再分散させる必要があった。
測定試薬を自動分析装置に適用することで、簡便且つ迅速に多数の試料の測定が可能となる。試薬は、容器に収容されて自動分析装置の試薬保管庫の中に保管される。その際、ユーザービリティーの観点から、試薬保管庫の中に容器を静置した状態で、長期間にわたって試薬組成が均一であること（オンボード安定性が良好であること）が望まれる。
しかしながら、ラテックス免疫凝集法の試薬において、感度を上げるためにラテックス粒子の粒子径を大きくすると、試薬を容器に充填後、時間の経過とともにラテックス粒子が沈降し、ラテックス試薬が不均一になっていった。このような不均一なラテックス試薬を用いて試料を測定すると、正確な測定値を得ることができないという問題が起こる。 従って、粒子径の大きなラテックス粒子を含む試薬を用いて正確な測定を行うためには、測定前に試薬容器を転倒混和したり、試薬を攪拌することなどによりラテックス粒子を水性媒体中で再分散させる必要があった。
ところで、試薬中の微小粒子の沈降を抑制したり、当該粒子の分散性を高める技術として以下に示すものが知られている。特許文献１には、抗原や抗体などの反応性を有する物質が結合した微小粒子の沈降抑制方法として、該微小粒子の分散液中に、ポリアニオン及びその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、及びグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる方法が開示されている。しかし、当該沈降抑制効果は５～１００ｎｍの金コロイド粒子について確認されたにすぎず、ラテックス粒子の沈降抑制効果については不明である。
特許文献２には、免疫学的ラテックス比濁定量用試薬において、高い試薬の感度を保持したまま粒子沈降性を改善するために、抗原又は抗体を担持したラテックス粒子の懸濁液からなる免疫学的ラテックス比濁定量用試薬中に特定量のスクロース、グルコース、トレハロースなどの糖を含む試薬について記載されている。特定量の前記糖類を粒子懸濁液に含ませることで懸濁液の比重を上昇させ、分散性を改善しようとする技術である。
本発明者らは、これらの糖類についてラテックス粒子の沈降抑制の効果、及び試薬の測定感度に与える影響を検討した。ところが、沈降抑制の効果を示したものの、試薬の測定感度が低下するという新たな問題が生じた（後述する実施例における比較例２，３参照）。
以上より、これまでラテックス粒子分散液中の粒子の沈降を抑制しつつ、ラテックス免疫凝集試薬の感度低下のような試薬性能に好ましくない影響を与えない技術は存在しなかった。
本発明者らは、これらの糖類についてラテックス粒子の沈降抑制の効果、及び試薬の測定感度に与える影響を検討した。ところが、沈降抑制の効果を示したものの、試薬の測定感度が低下するという新たな問題が生じた（後述する実施例における比較例２，３参照）。
以上より、これまでラテックス粒子分散液中の粒子の沈降を抑制しつつ、ラテックス免疫凝集試薬の感度低下のような試薬性能に好ましくない影響を与えない技術は存在しなかった。
本発明は、ラテックス粒子分散液中の粒子の分散性を高め、粒子の沈降を抑制しつつ、ラテックス免疫凝集試薬を高感度化するための技術の提供を課題とする。特に、大きい粒子径のラテックス粒子を含む分散液中のラテックス粒子の沈降及び／又は凝集の抑制を課題とする。
ラテックス免疫凝集試薬を用いて正確に高感度な測定を行うためには、ラテックス試薬中でラテックス粒子を均一、かつ、安定して分散させる技術が必要である。
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究したところ、標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の分散液中にポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド（以下単にＰＥＯと略することがある）及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を共存させることにより、ラテックス粒子の沈降が長時間にわたって抑制され、かつ、免疫凝集試薬に適用した場合に、それら成分を添加していない試薬に対して、測定感度が維持又は増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液であって、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する、ラテックス粒子分散液。
＜２＞
前記水性媒体が、水を含むものである、＜１＞に記載のラテックス粒子分散液。
＜３＞
前記ラテックス粒子が、スチレン又はビニルナフタレン構造を有するモノマーを含むモノマー成分に由来するポリマー粒子である、＜１＞又は＜２＞に記載のラテックス粒子分散液。
＜４＞
前記ラテックス粒子が、標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜５＞
前記標的物質と結合可能な物質が、標的物質に対する抗原又は抗体である、＜４＞に記載の粒子分散液。
＜６＞
免疫凝集試薬として使用するためのものである、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜７＞
ラテックス粒子の平均粒子径が５０～１０００ｎｍである、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜８＞
ラテックス粒子は、ラテックス粒子分散液全量に対して、０．０１～０．１０質量％である＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜９＞
免疫凝集法による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬キットであって、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液を備える、前記試薬キット。
＜１０＞
免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液と検体を接触させる工程を含む、前記検出方法。
＜１１＞
免疫凝集法における標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の沈降抑制方法であって、
前記ラテックス粒子と、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を水性媒体中で接触させる工程を含むことを特徴とする、前記沈降抑制方法。
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究したところ、標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の分散液中にポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド（以下単にＰＥＯと略することがある）及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を共存させることにより、ラテックス粒子の沈降が長時間にわたって抑制され、かつ、免疫凝集試薬に適用した場合に、それら成分を添加していない試薬に対して、測定感度が維持又は増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液であって、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する、ラテックス粒子分散液。
＜２＞
前記水性媒体が、水を含むものである、＜１＞に記載のラテックス粒子分散液。
＜３＞
前記ラテックス粒子が、スチレン又はビニルナフタレン構造を有するモノマーを含むモノマー成分に由来するポリマー粒子である、＜１＞又は＜２＞に記載のラテックス粒子分散液。
＜４＞
前記ラテックス粒子が、標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜５＞
前記標的物質と結合可能な物質が、標的物質に対する抗原又は抗体である、＜４＞に記載の粒子分散液。
＜６＞
免疫凝集試薬として使用するためのものである、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜７＞
ラテックス粒子の平均粒子径が５０～１０００ｎｍである、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜８＞
ラテックス粒子は、ラテックス粒子分散液全量に対して、０．０１～０．１０質量％である＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
＜９＞
免疫凝集法による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬キットであって、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液を備える、前記試薬キット。
＜１０＞
免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液と検体を接触させる工程を含む、前記検出方法。
＜１１＞
免疫凝集法における標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の沈降抑制方法であって、
前記ラテックス粒子と、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を水性媒体中で接触させる工程を含むことを特徴とする、前記沈降抑制方法。
本発明のラテックス粒子分散液によれば、ラテックス粒子の沈降及び／又は凝集が抑制されることから、ラテックス免疫凝集試薬に適用した場合には、試薬容器の転倒混和や、試薬の攪拌等によりラテックス粒子を再分散させることなく、ラテックス試薬を測定に使用することができる。また、ラテックス粒子を用いた免疫凝集試薬のオンボード安定性を向上させることができる。
（ラテックス粒子分散液）
本発明の水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液は、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ＰＥＯ及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する。これらの化合物をラテックス粒子と共存させることにより、水性媒体中においてラテックス粒子の分散性を向上することが可能になった。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリアクリル酸としては、平均分子量５，０００～１，０００，０００のものが好ましく、市販されているものとしてポリアクリル酸５０００、ポリアクリル酸２５０００、ポリアクリル酸２５００００、ポリアクリル酸１００００００（以上富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリアクリル酸ナトリウムとしては、重合度２，７００～７０，０００のものが好ましく、市販されているものとしてポリアクリル酸ナトリウム２７００－７０００，ポリアクリル酸ナトリウム２２０００－７００００（以上富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）は、分子量１００，０００～２，２００，０００のものが好ましく、このような分子量のＰＥＯとして、グレード記号ＰＥＯ－１で示されるＰＥＯ(分子量１５０，０００－４００，０００)、グレード記号ＰＥＯ－２で示されるＰＥＯ（分子量４００，０００－６００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－３で示されるＰＥＯ（分子量６００，０００－１，１００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－４で示されるＰＥＯ（分子量１，１００，０００－１，５００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－８で示されるＰＥＯ（分子量１，７００，０００－２，２００，０００）（以上住友精化株式会社）のほか、ＰＥＯ（分子量１００，０００、２００，０００、４００，０００、６００，０００、１，０００，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）などが挙げられる（以上、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈのＰＥＯについての分子量は、粘度平均分子量を示す）。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリ－γ－グルタミン酸ナトリウムは、平均分子量４００，０００以上のものが好ましく、市販されているものとしてポリ－γ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。
本発明の水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液は、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ＰＥＯ及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する。これらの化合物をラテックス粒子と共存させることにより、水性媒体中においてラテックス粒子の分散性を向上することが可能になった。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリアクリル酸としては、平均分子量５，０００～１，０００，０００のものが好ましく、市販されているものとしてポリアクリル酸５０００、ポリアクリル酸２５０００、ポリアクリル酸２５００００、ポリアクリル酸１００００００（以上富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリアクリル酸ナトリウムとしては、重合度２，７００～７０，０００のものが好ましく、市販されているものとしてポリアクリル酸ナトリウム２７００－７０００，ポリアクリル酸ナトリウム２２０００－７００００（以上富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）は、分子量１００，０００～２，２００，０００のものが好ましく、このような分子量のＰＥＯとして、グレード記号ＰＥＯ－１で示されるＰＥＯ(分子量１５０，０００－４００，０００)、グレード記号ＰＥＯ－２で示されるＰＥＯ（分子量４００，０００－６００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－３で示されるＰＥＯ（分子量６００，０００－１，１００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－４で示されるＰＥＯ（分子量１，１００，０００－１，５００，０００）、グレード記号ＰＥＯ－８で示されるＰＥＯ（分子量１，７００，０００－２，２００，０００）（以上住友精化株式会社）のほか、ＰＥＯ（分子量１００，０００、２００，０００、４００，０００、６００，０００、１，０００，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）などが挙げられる（以上、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈのＰＥＯについての分子量は、粘度平均分子量を示す）。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられるポリ－γ－グルタミン酸ナトリウムは、平均分子量４００，０００以上のものが好ましく、市販されているものとしてポリ－γ－グルタミン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬株式会社）が挙げられる。
上記化合物は、１種類で用いても良く、２種類以上を組み合わせて用いても良い。
上記化合物のラテックス粒子分散液中の含有量は、好ましくは０．００２～０．５０質量％、より好ましくは０．００３～０．３０質量％、最も好ましくは０．００５～０．２０質量％である。０．５０質量％（上限）より多いと、ラテックス粒子が凝集してしまったり、試薬の粘度が高まり測定精度が低下してしまったりする場合があり、０．００２質量％（下限）より少ないと液中のラテックス粒子の沈降抑制効果に劣るからである。０．００２質量％（下限）～０．５０質量％（上限）の範囲であると、ラテックス粒子の沈降抑制効果を得つつ、ラテックス粒子の凝集や試薬の粘度の増加と言った、試薬精度への望まない影響が生じず、好適である。
本発明の粒子分散液のｐＨは、好ましくはｐＨ４．０～ｐＨ１０．０であり、より好ましくはｐＨ５．０～ｐＨ９．０であり、最も好ましくはｐＨ６．０～ｐＨ８．０である。
ｐＨの調整は、当業者に周知のｐＨ調整用試薬、例えば水酸化ナトリウムや塩酸等を用いて行うことができる。
本発明のラテックス粒子分散液は免疫凝集試薬として使用することができ、他の試薬構成と組み合わせキット化することもできる。免疫凝集試薬としては、典型的には体外診断用試薬が挙げられる。試薬キットの構成については後述する。
上記化合物のラテックス粒子分散液中の含有量は、好ましくは０．００２～０．５０質量％、より好ましくは０．００３～０．３０質量％、最も好ましくは０．００５～０．２０質量％である。０．５０質量％（上限）より多いと、ラテックス粒子が凝集してしまったり、試薬の粘度が高まり測定精度が低下してしまったりする場合があり、０．００２質量％（下限）より少ないと液中のラテックス粒子の沈降抑制効果に劣るからである。０．００２質量％（下限）～０．５０質量％（上限）の範囲であると、ラテックス粒子の沈降抑制効果を得つつ、ラテックス粒子の凝集や試薬の粘度の増加と言った、試薬精度への望まない影響が生じず、好適である。
本発明の粒子分散液のｐＨは、好ましくはｐＨ４．０～ｐＨ１０．０であり、より好ましくはｐＨ５．０～ｐＨ９．０であり、最も好ましくはｐＨ６．０～ｐＨ８．０である。
ｐＨの調整は、当業者に周知のｐＨ調整用試薬、例えば水酸化ナトリウムや塩酸等を用いて行うことができる。
本発明のラテックス粒子分散液は免疫凝集試薬として使用することができ、他の試薬構成と組み合わせキット化することもできる。免疫凝集試薬としては、典型的には体外診断用試薬が挙げられる。試薬キットの構成については後述する。
（水性媒体）
本発明のラテックス粒子分散液に用いられる水性媒体は、ラテックス粒子を分散できるものであればよく、このうちでも水を含むものが好ましい。水の含有量は、ラテックス粒子を分散できる量であれば特に制限はなく、水性媒体全量に対して、例えば４０～１００質量％、６０～１００質量％、８０～１００質量％、９０～１００質量％などの範囲が挙げられる。
また、水性媒体は、グッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。
なお、水性媒体は、上記の水や緩衝液の他に、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールや、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の水と混合する有機溶媒を含んでいてもよい。
水性媒体の含有量は、ラテックス粒子分散液全量に対して、例えば５０～９９．９質量％、７０～９９．９質量％が挙げられる。
本発明のラテックス粒子分散液に用いられる水性媒体は、ラテックス粒子を分散できるものであればよく、このうちでも水を含むものが好ましい。水の含有量は、ラテックス粒子を分散できる量であれば特に制限はなく、水性媒体全量に対して、例えば４０～１００質量％、６０～１００質量％、８０～１００質量％、９０～１００質量％などの範囲が挙げられる。
また、水性媒体は、グッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。
なお、水性媒体は、上記の水や緩衝液の他に、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールや、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の水と混合する有機溶媒を含んでいてもよい。
水性媒体の含有量は、ラテックス粒子分散液全量に対して、例えば５０～９９．９質量％、７０～９９．９質量％が挙げられる。
(ラテックス粒子)
本発明のラテックス粒子分散液において、ラテックス粒子は、免疫測定用の試薬として一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン等のフェニル基を有する重合性単量体、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩等のフェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α－ナフチル、（メタ）アクリル酸β－ナフチル等のナフチル基を有する重合性単量体などの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸等の重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸－ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール－ジ－（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル等の重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール－（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ －ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル等の不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等を挙げることができる。このうちでも、スチレン又はビニルナフタレン構造を有するモノマーを含むモノマー成分に由来するポリマー粒子が好ましい。
これらのモノマーは、要求される表面特性、比重等によって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
本発明のラテックス粒子分散液において、ラテックス粒子は、免疫測定用の試薬として一般的に用いられているラテックス粒子であれば特に制限されない。ラテックス粒子は、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えば、スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン等のフェニル基を有する重合性単量体、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩等のフェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α－ナフチル、（メタ）アクリル酸β－ナフチル等のナフチル基を有する重合性単量体などの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸等の重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸－ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール－ジ－（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル等の重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール－（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ －ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル等の不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等を挙げることができる。このうちでも、スチレン又はビニルナフタレン構造を有するモノマーを含むモノマー成分に由来するポリマー粒子が好ましい。
これらのモノマーは、要求される表面特性、比重等によって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
本発明のラテックス粒子を構成する合成高分子としては特に限定はないが、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、イタコン酸重合体、スチレン－親水性カルボキシモノマー共重合体：例えば、スチレン－（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体等が挙げられる。その中で、好ましくはスチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－イタコン酸共重合体、スチレン及びスチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体である。
ラテックス粒子の含有量は、ラテックス粒子分散液全量に対して、０．０１～０．１０質量％であることが好ましい。
本発明においてラテックス粒子の平均粒子径は、測定対象及び測定範囲で感度差を得られるような大きさであればよく、例えば５０ｎｍ～１０００ｎｍが好ましい。ラテックス粒子の平均粒子径が大きいと高感度化するものの、粒子が沈みやすくなるため測定試薬への適用が困難であったところ、本発明のラテックス粒子分散液によれば、大きい粒子径であっても沈みにくいという特徴がある。したがって、本発明の効果を最大限享受するのであれば、ラテックスの平均粒子径は大きい方が好ましく、１００ｎｍ以上が好ましく、２００ｎｍ以上がより好ましく、３００ｎｍ以上がよりいっそう好ましい。
また、大小２種類以上の平均粒子径のラテックス粒子を用いてさらに測定可能な濃度範囲を拡大することも可能である。
ラテックス粒子の平均粒子径は、レーザー回析・散乱法（ＬＳ法）、コールター原理、動的光散乱光子相関法、電子顕微鏡などで解析することができる。本明細書において、平均粒子径は、体積平均粒子径を意味する。
また、大小２種類以上の平均粒子径のラテックス粒子を用いてさらに測定可能な濃度範囲を拡大することも可能である。
ラテックス粒子の平均粒子径は、レーザー回析・散乱法（ＬＳ法）、コールター原理、動的光散乱光子相関法、電子顕微鏡などで解析することができる。本明細書において、平均粒子径は、体積平均粒子径を意味する。
（標的物質に結合可能な物質）
本発明において、標的物質に結合可能な物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低及び天然、合成といった由来に特に制限はないが、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体又は抗原が挙げられる。
前記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。
本発明に用いられる抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術等により免疫原（測定対象物質物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるF(ab')2、Fab'や一本鎖抗体(scFv)、VHH（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、IgNAR（new antigen receptor）抗体などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
本発明において、標的物質に結合可能な物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられ、分子量の高低及び天然、合成といった由来に特に制限はないが、免疫反応を利用する免疫学的測定法に使用され得る抗体又は抗原が挙げられる。
前記抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。より好ましくは、モノクローナル抗体である。
本発明に用いられる抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能である。一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術等により免疫原（測定対象物質物質）を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるF(ab')2、Fab'や一本鎖抗体(scFv)、VHH（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）抗体、IgNAR（new antigen receptor）抗体などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
本発明において、ラテックス粒子に担持される標的物質と結合可能な物質は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法によりラテックス粒子に固定化して担持させることができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、標的物質と結合可能な物質と、ラテックス粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した標的物質と結合可能な物質を、担体に接触させたりすること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、標的物質と結合可能な物質と、ラテックス粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標的物質と結合する物質と、ラテックス粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、標的物質と結合可能な物質と、ラテックス粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した標的物質と結合可能な物質を、担体に接触させたりすること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、標的物質と結合可能な物質と、ラテックス粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標的物質と結合する物質と、ラテックス粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
なお、ラテックス粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、ラテックス粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
（試薬キット）
本発明の免疫凝集法による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬キットは、少なくとも前記の本発明のラテックス粒子分散液を備える。キットの構成としては、典型的には、標的物質に結合する物質が担持された粒子を含む粒子分散液（第２試薬）と、緩衝液を含む第１試薬を備えた２試薬系の構成が挙げられる。緩衝液としてはグッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液等が挙げられる。また、第１試薬には、緩衝液の他にブロッキング剤や、凝集促進剤を含んでいてもよい。また、第１試薬及び第２試薬の他に含まれるキットの構成としては、試料希釈液、試料抽出液、使用説明書、試料採取用具（採取ピペット、シリンジ、綿棒、ろ過フィルターなど）が挙げられる。
本発明の免疫凝集法による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬キットは、少なくとも前記の本発明のラテックス粒子分散液を備える。キットの構成としては、典型的には、標的物質に結合する物質が担持された粒子を含む粒子分散液（第２試薬）と、緩衝液を含む第１試薬を備えた２試薬系の構成が挙げられる。緩衝液としてはグッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニア緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液等が挙げられる。また、第１試薬には、緩衝液の他にブロッキング剤や、凝集促進剤を含んでいてもよい。また、第１試薬及び第２試薬の他に含まれるキットの構成としては、試料希釈液、試料抽出液、使用説明書、試料採取用具（採取ピペット、シリンジ、綿棒、ろ過フィルターなど）が挙げられる。
（標的物質の検出方法）
本発明の免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法は、上述のラテックス粒子分散液と検体を接触させることにより行われ、当該免疫凝集法はラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ法）とも呼ばれる。ＬＴＩＡ法により標的物質を測定する方法は、大きく二つに大別することができる。
一つ目は、標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子と、標的物質とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から標的物質を測定する方法である。
二つ目は、試薬中に複数の標的物質又はその類縁体（これらの断片を含む）を固定化した蛋白質等を添加しておき、これらと試料中の標的物質とを競合させて、試薬中に含まれる標的物質と標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から標的物質（抗原）を測定する方法である。
本発明の免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法は、上述のラテックス粒子分散液と検体を接触させることにより行われ、当該免疫凝集法はラテックス免疫凝集法（ＬＴＩＡ法）とも呼ばれる。ＬＴＩＡ法により標的物質を測定する方法は、大きく二つに大別することができる。
一つ目は、標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子と、標的物質とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から標的物質を測定する方法である。
二つ目は、試薬中に複数の標的物質又はその類縁体（これらの断片を含む）を固定化した蛋白質等を添加しておき、これらと試料中の標的物質とを競合させて、試薬中に含まれる標的物質と標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から標的物質（抗原）を測定する方法である。
標的物質と、標的物質と結合可能な物質は、目的に応じて任意の物質を選択することができる。例えば、標的物質が抗原であれば、標的物質と結合可能な物質としてポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（組み換え型抗体及び各抗体の機能性断片を含む）などの抗体を選択することができる。標的物質が抗体であれば、標的物質と結合可能な物質として天然型及び組み換え型抗原などの抗原を選択することができる。本願発明は上記いずれの方法にも用いることができ、具体的には、以下の工程が例示される。
（１）検体中の標的物質と緩衝液などを混合する工程
（２）（１）工程の後に、前記混合液中に標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子分散液を添加して、検体と接触させる工程
（３）（２）の工程の後に、液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程
ここで、（３）の工程は、「（２）の工程の途中、あるいは（２）の工程の後に、洗浄・分離工程を経ることなく当該標的物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程」であることを意味する。
（１）検体中の標的物質と緩衝液などを混合する工程
（２）（１）工程の後に、前記混合液中に標的物質と結合可能な物質を担持したラテックス粒子分散液を添加して、検体と接触させる工程
（３）（２）の工程の後に、液中におけるラテックス粒子の凝集度合いを光学的に検出する工程
ここで、（３）の工程は、「（２）の工程の途中、あるいは（２）の工程の後に、洗浄・分離工程を経ることなく当該標的物質と当該ラテックス粒子の凝集反応を測定する工程」であることを意味する。
本発明において、ラテックス粒子の凝集の程度を光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法（エンドポイント法、レート法等）が挙げられる。試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（測定対象物質の濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度（定量値）を算出することができる。なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。測定波長は、５００ｎｍから９００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
本発明の検体中の標的物質の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
本発明の検体中の標的物質の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
（沈降抑制方法）
本発明の免疫凝集法における標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の沈降抑制方法は、前記ラテックス粒子と、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ＰＥＯ及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を水性媒体中で接触させる工程を含む方法である。当該化合物とラテックス粒子が水性媒体中で接触することにより、理由は定かではないが、ラテックス粒子の沈降が抑制され、分散性が向上すると考えられる。
なお、本願において、「ラテックス粒子が沈降する」とは、粒子がそのまま沈降する場合と、粒子どうしが吸着又は凝集して大きさを増して沈降する場合との、双方を含む。さらに本願において、「ラテックス粒子の沈降を抑制する」とは、粒子がそのまま沈降することを抑制する場合と、粒子どうしが吸着又は凝集することを抑制した結果、粒子が大きさを増して沈降することを抑制する場合と、それらの両方を抑制する場合とを含む。
本明細書において、ラテックス粒子の沈降抑制効果の有無は、例えば後述する実施例に示すように、ラテックス粒子分散液に試験対象の添加剤を添加し、添加剤無しの場合と比べて、前記分散液の液面のラテックス粒子の含量比が高い場合に、当該添加剤の沈降抑制効果があると評価できる。
本発明の免疫凝集法における標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の沈降抑制方法は、前記ラテックス粒子と、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ＰＥＯ及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を水性媒体中で接触させる工程を含む方法である。当該化合物とラテックス粒子が水性媒体中で接触することにより、理由は定かではないが、ラテックス粒子の沈降が抑制され、分散性が向上すると考えられる。
なお、本願において、「ラテックス粒子が沈降する」とは、粒子がそのまま沈降する場合と、粒子どうしが吸着又は凝集して大きさを増して沈降する場合との、双方を含む。さらに本願において、「ラテックス粒子の沈降を抑制する」とは、粒子がそのまま沈降することを抑制する場合と、粒子どうしが吸着又は凝集することを抑制した結果、粒子が大きさを増して沈降することを抑制する場合と、それらの両方を抑制する場合とを含む。
本明細書において、ラテックス粒子の沈降抑制効果の有無は、例えば後述する実施例に示すように、ラテックス粒子分散液に試験対象の添加剤を添加し、添加剤無しの場合と比べて、前記分散液の液面のラテックス粒子の含量比が高い場合に、当該添加剤の沈降抑制効果があると評価できる。
（検体）
本発明における標的物質を含む検体としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等の生体から得られた試料等が挙げられる。
また、本発明における検体は、生体から得られた試料そのもののほかに、希釈、精製、抽出又はろ過処理などの前処理を行った試料も含まれる。血液検体としては、全血、赤血球、血漿、血清等が挙げられ、抗凝固剤を添加した採血管により採血した血漿検体も含まれる。
本発明における標的物質を含む検体としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、又は細胞あるいは組織の抽出液等の生体から得られた試料等が挙げられる。
また、本発明における検体は、生体から得られた試料そのもののほかに、希釈、精製、抽出又はろ過処理などの前処理を行った試料も含まれる。血液検体としては、全血、赤血球、血漿、血清等が挙げられ、抗凝固剤を添加した採血管により採血した血漿検体も含まれる。
（標的物質）
本発明において標的物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な物質であれば特に制限はない。例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗リン脂質抗体、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、インスリン、アルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＫＬ－６、プロカルシトニン、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＡＩ－１や、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリン、ＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）, ｓＩＬ－２Ｒ（可溶性インターロイキン－２受容体）などが挙げられる。
以下本発明において以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明において標的物質としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な物質であれば特に制限はない。例えばＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗リン脂質抗体、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、インスリン、アルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＫＬ－６、プロカルシトニン、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＡＩ－１や、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリン、ＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）, ｓＩＬ－２Ｒ（可溶性インターロイキン－２受容体）などが挙げられる。
以下本発明において以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［試験例１：ラテックス粒子の沈降評価］
ラテックス粒子分散液（ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬）に各種添加剤を処方して保存し、溶液中のラテックス粒子の沈降を評価した。
ラテックス粒子分散液（ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬）に各種添加剤を処方して保存し、溶液中のラテックス粒子の沈降を評価した。
［比較例１：添加剤無し］
試験方法及び評価方法は以下のとおりである。また試薬の組成を下記に示した。
（１）ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬の調製
５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックス（２種類）
なお、抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体は、市販のＴＡＲＣ抗原（＊）を使用し、当業者周知の方法にて取得した。さらに、ＴＡＲＣ抗原に対してサンドイッチ測定が可能であるモノクローナル抗体の組み合わせは、当業者周知の方法にて選定した。抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックスは、特開２０１７－１８１３７７記載の方法を参考に調製した。すなわち、平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ トリス緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ又は単にＴｒｉｓという）（ｐＨ８．５）に、等量の５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で０．３６ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＴＡＲＣ抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ ＢＳＡ含有５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ＴＡＲＣ抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。当該抗ＴＡＲＣ抗体感作ラテックス粒子溶液を、６００ｎｍにおける吸光度が約５．５ＯＤとなるよう５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）で希釈し、ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬とした。
（＊）市販抗原；
CCL17, thymus and activation regulated chemokine（Shenandoah Biotechnology,Inc.）、CCL17/TARC, Human（LifeSpan Biosscience,Inc.）、Human TARC (CCL17)（Abeomics,Inc.）など
試験方法及び評価方法は以下のとおりである。また試薬の組成を下記に示した。
（１）ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬の調製
５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）
抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックス（２種類）
なお、抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体は、市販のＴＡＲＣ抗原（＊）を使用し、当業者周知の方法にて取得した。さらに、ＴＡＲＣ抗原に対してサンドイッチ測定が可能であるモノクローナル抗体の組み合わせは、当業者周知の方法にて選定した。抗ヒトＴＡＲＣモノクローナル抗体感作ラテックスは、特開２０１７－１８１３７７記載の方法を参考に調製した。すなわち、平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ トリス緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ又は単にＴｒｉｓという）（ｐＨ８．５）に、等量の５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で０．３６ｍｇ／ｍＬに希釈した抗ＴＡＲＣ抗体溶液を添加して４℃、２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ ＢＳＡ含有５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して４℃、１時間攪拌し、抗ＴＡＲＣ抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。当該抗ＴＡＲＣ抗体感作ラテックス粒子溶液を、６００ｎｍにおける吸光度が約５．５ＯＤとなるよう５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）で希釈し、ＬＴＩＡ測定試薬第２試薬とした。
（＊）市販抗原；
CCL17, thymus and activation regulated chemokine（Shenandoah Biotechnology,Inc.）、CCL17/TARC, Human（LifeSpan Biosscience,Inc.）、Human TARC (CCL17)（Abeomics,Inc.）など
（２）保存条件
ガラス試験管２本に上記第２試薬を５ｍLずつ分注した後、２～８℃で１７日間静置した。
ガラス試験管２本に上記第２試薬を５ｍLずつ分注した後、２～８℃で１７日間静置した。
（３）評価方法
ガラス試験管２本のうち１本は転倒混和した状態から、もう１本は静置した状態から、液面からサンプリングを１００μＬ行い、５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）９００μＬと混合（１０倍希釈）し、６００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度を測定した。８００ｎｍの吸光度に対する６００ｎｍの吸光度の比（６００/８００比）を、溶液中の粒子の分散性を表す指標として算出した。６００ｎｍにおける（転倒混和なし）/（転倒混和あり）の吸光度比を、液面におけるラテックス粒子の含量比（％）として算出した。測定結果を表２に示した。なお、６００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度は、測定値を１０倍し、原液の吸光度を表２に記載した。
ガラス試験管２本のうち１本は転倒混和した状態から、もう１本は静置した状態から、液面からサンプリングを１００μＬ行い、５ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）９００μＬと混合（１０倍希釈）し、６００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度を測定した。８００ｎｍの吸光度に対する６００ｎｍの吸光度の比（６００/８００比）を、溶液中の粒子の分散性を表す指標として算出した。６００ｎｍにおける（転倒混和なし）/（転倒混和あり）の吸光度比を、液面におけるラテックス粒子の含量比（％）として算出した。測定結果を表２に示した。なお、６００ｎｍ及び８００ｎｍにおける吸光度は、測定値を１０倍し、原液の吸光度を表２に記載した。
[比較例２～３：スクロース添加処方]
比較例１で示したＬＴＩＡ測定試薬第２試薬に、スクロース（終濃度は表１に記載）を処方したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。
比較例１で示したＬＴＩＡ測定試薬第２試薬に、スクロース（終濃度は表１に記載）を処方したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。
[実施例１～２１：添加剤処方]
比較例１で示したＬＴＩＡ測定試薬第二試薬に、各添加剤（名称、終濃度は表１に記載）を処方したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。なお、実施例１６～２０の成分名中、Mvは分子量を示す。
比較例１で示したＬＴＩＡ測定試薬第二試薬に、各添加剤（名称、終濃度は表１に記載）を処方したほかは同一の方法で測定を行った。測定結果を表２に示した。なお、実施例１６～２０の成分名中、Mvは分子量を示す。
（結果と考察）
６００ｎｍと８００ｎｍの吸光度の比（６００／８００比）は、溶液中の粒子の分散性を表している。比較例１（添加剤無し）の転倒混和ありの６００／８００比である２．２１を基準とし、吸光度の比が０．１０以上低下しない条件であれば分散性が良いと評価した。
（転倒混和なし）／（転倒混和あり）の含量比（％）は、粒子沈降のしやすさを表しており、比較例１（添加剤無し）よりも高ければ添加剤の沈降抑制効果があると評価し、また、比較例２，３（スクロース添加）よりも高ければ従来の添加剤よりも沈降抑制効果があると評価した。
比較例１では、１７日経過後の６００/８００比は、転倒混和あり「２．２１」に対して、転倒混和なし「２．２２」と同等であり、分散性に問題はなかった。一方で１７日経過後の転倒混和なし/転倒混和ありの含量比は５４．６％と低い数字となり、ラテックス粒子が沈降していると判断された。比較例２、３では含量比は８０.７％、８９.６％となり、比較例１に対して高値となり、ラテックス沈降に対して一定の抑制効果が認められた。
実施例において、まず６００/８００比は、実施例１～２１のいずれの条件においても２．２１～２．２２であり、転倒混和の有無に依らず良好な分散状態を維持していることが示唆された。次に含量比（％）は、実施例１～２１のいずれの条件においても比較例１と比べ高値となり、ラテックスに対して一定の沈降抑制効果が認められた。特に実施例３（ポリアクリル酸 分子量２５，０００、終濃度０．０１％）、実施例７（ポリアクリル酸 分子量１，０００，０００、終濃度０．０１％）、実施例８（ポリアクリル酸ナトリウム 分子量２，７００－７，０００、終濃度０．０１％）、実施例９（ポリアクリル酸ナトリウム 分子量２２，０００－７０，０００、終濃度０．０１％）、実施例１４（ＰＥＯ－１、分子量１５０，０００－４００，０００終濃度０．０１％）、実施例１５（ＰＥＯ－３、分子量６００，０００－１，１００，０００、終濃度０．０１％）は従来の添加剤を用いた比較例２、３の前記含量比（％）を上回り、従来の添加剤よりラテックスに対する沈降抑制効果がより大きいことが判明した。
６００ｎｍと８００ｎｍの吸光度の比（６００／８００比）は、溶液中の粒子の分散性を表している。比較例１（添加剤無し）の転倒混和ありの６００／８００比である２．２１を基準とし、吸光度の比が０．１０以上低下しない条件であれば分散性が良いと評価した。
（転倒混和なし）／（転倒混和あり）の含量比（％）は、粒子沈降のしやすさを表しており、比較例１（添加剤無し）よりも高ければ添加剤の沈降抑制効果があると評価し、また、比較例２，３（スクロース添加）よりも高ければ従来の添加剤よりも沈降抑制効果があると評価した。
比較例１では、１７日経過後の６００/８００比は、転倒混和あり「２．２１」に対して、転倒混和なし「２．２２」と同等であり、分散性に問題はなかった。一方で１７日経過後の転倒混和なし/転倒混和ありの含量比は５４．６％と低い数字となり、ラテックス粒子が沈降していると判断された。比較例２、３では含量比は８０.７％、８９.６％となり、比較例１に対して高値となり、ラテックス沈降に対して一定の抑制効果が認められた。
実施例において、まず６００/８００比は、実施例１～２１のいずれの条件においても２．２１～２．２２であり、転倒混和の有無に依らず良好な分散状態を維持していることが示唆された。次に含量比（％）は、実施例１～２１のいずれの条件においても比較例１と比べ高値となり、ラテックスに対して一定の沈降抑制効果が認められた。特に実施例３（ポリアクリル酸 分子量２５，０００、終濃度０．０１％）、実施例７（ポリアクリル酸 分子量１，０００，０００、終濃度０．０１％）、実施例８（ポリアクリル酸ナトリウム 分子量２，７００－７，０００、終濃度０．０１％）、実施例９（ポリアクリル酸ナトリウム 分子量２２，０００－７０，０００、終濃度０．０１％）、実施例１４（ＰＥＯ－１、分子量１５０，０００－４００，０００終濃度０．０１％）、実施例１５（ＰＥＯ－３、分子量６００，０００－１，１００，０００、終濃度０．０１％）は従来の添加剤を用いた比較例２、３の前記含量比（％）を上回り、従来の添加剤よりラテックスに対する沈降抑制効果がより大きいことが判明した。
［試験例２：ＬＴＩＡ法における吸光度測定：ＴＡＲＣの測定］
ＬＴＩＡ測定試薬の第２試薬と下記の第１試薬を組み合わせ、ＴＡＲＣ標準物質溶液及び実検体のＴＡＲＣ濃度の測定を行い、第２試薬に含まれる添加剤が検出感度に及ぼす影響を評価した。
ＬＴＩＡ測定試薬の第２試薬と下記の第１試薬を組み合わせ、ＴＡＲＣ標準物質溶液及び実検体のＴＡＲＣ濃度の測定を行い、第２試薬に含まれる添加剤が検出感度に及ぼす影響を評価した。
［比較例１：添加剤無し］
１．測定方法
１－１．ＬＴＩＡ測定試薬
以下に示す、第１試薬及び第２試薬からなるＬＴＩＡ測定試薬を調製した。
（１）第１試薬
１００ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
５００ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＢＳＡ
（２）第２試薬
試験例１の比較例１と同一のものを用いた。
１．測定方法
１－１．ＬＴＩＡ測定試薬
以下に示す、第１試薬及び第２試薬からなるＬＴＩＡ測定試薬を調製した。
（１）第１試薬
１００ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）
５００ｍＭ ＮａＣｌ
０．５％ ＢＳＡ
（２）第２試薬
試験例１の比較例１と同一のものを用いた。
１－２．試料
ＴＡＲＣ検量用物質
試料１：生理食塩液（ＴＡＲＣ ０ｐｇ／ｍＬ）
試料２：ＴＡＲＣ ６７７ｐｇ／ｍＬ
試料３：ＴＡＲＣ １８８０ｐｇ／ｍＬ
試料４：ＴＡＲＣ ４９１０ｐｇ／ｍＬ
試料５：ＴＡＲＣ ９９４６ｐｇ／ｍＬ
試料６：ＴＡＲＣ ２０３２５ｐｇ／ｍＬ
任意のヒト血清検体（検体１～検体８）を用いた。
ＴＡＲＣ検量用物質
試料１：生理食塩液（ＴＡＲＣ ０ｐｇ／ｍＬ）
試料２：ＴＡＲＣ ６７７ｐｇ／ｍＬ
試料３：ＴＡＲＣ １８８０ｐｇ／ｍＬ
試料４：ＴＡＲＣ ４９１０ｐｇ／ｍＬ
試料５：ＴＡＲＣ ９９４６ｐｇ／ｍＬ
試料６：ＴＡＲＣ ２０３２５ｐｇ／ｍＬ
任意のヒト血清検体（検体１～検体８）を用いた。
１－３．測定手順
第１試薬と第２試薬を組み合わせ、日立自動分析装置３５００を用いて、試料中のＴＡＲＣ濃度を測定した。具体的には、試料２．４μＬに第１試薬１２０μＬを加えて３７℃で５分間保温した後、第２試薬４０μＬを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。
１－４．解析方法
検量用物質の濃度及び吸光度変化量から検量線を作成し、血清検体中のＴＡＲＣ濃度を算出した。
検量用物質の各測定条件における吸光度値について、比較例１（添加剤無し）の吸光度値に対する相対感度(各吸光度値÷比較例１の吸光度値（％）)を算出した。
第１試薬と第２試薬を組み合わせ、日立自動分析装置３５００を用いて、試料中のＴＡＲＣ濃度を測定した。具体的には、試料２．４μＬに第１試薬１２０μＬを加えて３７℃で５分間保温した後、第２試薬４０μＬを加えて攪拌した。凝集形成に伴う吸光度変化を、その後５分間にわたり、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。
１－４．解析方法
検量用物質の濃度及び吸光度変化量から検量線を作成し、血清検体中のＴＡＲＣ濃度を算出した。
検量用物質の各測定条件における吸光度値について、比較例１（添加剤無し）の吸光度値に対する相対感度(各吸光度値÷比較例１の吸光度値（％）)を算出した。
２．測定結果
検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
［比較例２、３：スクロース添加処方］
試験例１の比較例２、３と同一の第２試薬を用いたほかは、試験例２の比較例１と同一の方法で測定を行った。検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
試験例１の比較例２、３と同一の第２試薬を用いたほかは、試験例２の比較例１と同一の方法で測定を行った。検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
［実施例１－２１：添加剤処方］
試験例１の実施例１－２１と同一の第２試薬を用いたほかは、試験例２の比較例１と同一の方法で測定を行った。検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
試験例１の実施例１－２１と同一の第２試薬を用いたほかは、試験例２の比較例１と同一の方法で測定を行った。検量用物質（試料１～６）の測定結果を図１、２、表３、相対感度を表４に示した。また、ヒト血清検体（検体１～８）の測定結果を表５に示した。
（結果と考察）
表３の測定感度については、添加剤無しの比較例１に対して、測定感度が同等以上である条件が好ましい。しかし、スクロースを添加した比較例２、３の試薬では、ＴＡＲＣ含量が低い試料で感度低下が顕著であり、最も低下した条件（比較例２－試料２）で６８．２％となった。ＴＡＲＣ含量の増加と共に感度低下の相対的な幅は狭まったものの、従来の添加剤であるスクロースの添加は、試薬感度に負の影響を与えることがわかった。
これに対し、本願で見いだされた成分であるポリアクリル酸５０００、ポリアクリル酸２５０００、ポリアクリル酸２５００００、ポリアクリル酸１０００００、ポリアクリル酸ナトリウム２７００－７０００、ポリアクリル酸ナトリウム２２０００－７００００、ポリ－γ－グルタミン酸ナトリウムを添加した試薬（実施例１～９、２１）では、相対感度はＴＡＲＣ含量によらず約９０％以上と良好であり、添加剤無しの試薬と同程度の試薬感度が得られた。これらの成分を添加した試薬では、ヒト血清検体の測定値にも大きな変化は認めず、ＴＡＲＣを高い精度で測定できることが分かった。
また、ＰＥＯ－１、ＰＥＯ－３、ＰＥＯ－８、ＰＥＯ Ｍｖ１０００００、２０００００、４０００００、６０００００、１００００００を添加した試薬（実施例１０～２０）では、相対感度は１００％以上となり、増感効果を認めた。これらの成分を添加した試薬では、ヒト血清検体の測定値にも大きな変化は認めず、ＴＡＲＣを高い精度で測定できることが分かった。
中でも実施例１４（ＰＥＯ－１、分子量１５０，０００－４００，０００終濃度０．０１％）、実施例１５（ＰＥＯ－３、分子量６００，０００－１，１００，０００、終濃度０．０１％）については、従来知られている沈降抑制剤（比較例２、３）よりも沈降抑制効果が高く、かつ特に標的物質が低濃度である試料において測定感度の増強効果があり、沈降抑制と感度増強の効果を兼ね備える優れた成分であることが判明した。
以上より、ラテックス免疫凝集測定方法において、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリ－γ－グルタミン酸ナトリウム、ＰＥＯの添加は試薬感度を低下させず、試薬性能に影響を与えず、これらを試薬に添加した場合には高い精度で標的物質を測定可能であることから、本発明のラテックス沈降抑制剤として有用であることがわかった。
表３の測定感度については、添加剤無しの比較例１に対して、測定感度が同等以上である条件が好ましい。しかし、スクロースを添加した比較例２、３の試薬では、ＴＡＲＣ含量が低い試料で感度低下が顕著であり、最も低下した条件（比較例２－試料２）で６８．２％となった。ＴＡＲＣ含量の増加と共に感度低下の相対的な幅は狭まったものの、従来の添加剤であるスクロースの添加は、試薬感度に負の影響を与えることがわかった。
これに対し、本願で見いだされた成分であるポリアクリル酸５０００、ポリアクリル酸２５０００、ポリアクリル酸２５００００、ポリアクリル酸１０００００、ポリアクリル酸ナトリウム２７００－７０００、ポリアクリル酸ナトリウム２２０００－７００００、ポリ－γ－グルタミン酸ナトリウムを添加した試薬（実施例１～９、２１）では、相対感度はＴＡＲＣ含量によらず約９０％以上と良好であり、添加剤無しの試薬と同程度の試薬感度が得られた。これらの成分を添加した試薬では、ヒト血清検体の測定値にも大きな変化は認めず、ＴＡＲＣを高い精度で測定できることが分かった。
また、ＰＥＯ－１、ＰＥＯ－３、ＰＥＯ－８、ＰＥＯ Ｍｖ１０００００、２０００００、４０００００、６０００００、１００００００を添加した試薬（実施例１０～２０）では、相対感度は１００％以上となり、増感効果を認めた。これらの成分を添加した試薬では、ヒト血清検体の測定値にも大きな変化は認めず、ＴＡＲＣを高い精度で測定できることが分かった。
中でも実施例１４（ＰＥＯ－１、分子量１５０，０００－４００，０００終濃度０．０１％）、実施例１５（ＰＥＯ－３、分子量６００，０００－１，１００，０００、終濃度０．０１％）については、従来知られている沈降抑制剤（比較例２、３）よりも沈降抑制効果が高く、かつ特に標的物質が低濃度である試料において測定感度の増強効果があり、沈降抑制と感度増強の効果を兼ね備える優れた成分であることが判明した。
以上より、ラテックス免疫凝集測定方法において、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリ－γ－グルタミン酸ナトリウム、ＰＥＯの添加は試薬感度を低下させず、試薬性能に影響を与えず、これらを試薬に添加した場合には高い精度で標的物質を測定可能であることから、本発明のラテックス沈降抑制剤として有用であることがわかった。
本発明のラテックス粒子分散液によれば、ラテックス粒子の沈降及び／又は凝集が抑制されることから、ラテックス免疫凝集試薬に適用した場合には、攪拌等により再分散させることなく測定することが可能になる。また、ラテックス粒子を用いた免疫凝集試薬のオンボード安定性を向上させることができる。
Claims (11)
- 水性媒体を分散媒とするラテックス粒子分散液であって、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を含有する、ラテックス粒子分散液。
- 前記水性媒体が、水を含むものである、請求項１に記載のラテックス粒子分散液。
- 前記ラテックス粒子が、スチレン又はビニルナフタレン構造を有するモノマーを含むモノマー成分に由来するポリマー粒子である、請求項１又は２に記載のラテックス粒子分散液。
- 前記ラテックス粒子が、標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
- 前記標的物質と結合可能な物質が、標的物質に対する抗原又は抗体である、請求項４に記載の粒子分散液。
- 免疫凝集試薬として使用するためのものである、請求項１～５のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
- ラテックス粒子の平均粒子径が５０～１０００ｎｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
- ラテックス粒子は、ラテックス粒子分散液全量に対して、０．０１～０．１０質量％である請求項１～７のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液。
- 免疫凝集法による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬キットであって、請求項１～８のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液を備える、前記試薬キット。
- 免疫凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載のラテックス粒子分散液と検体を接触させる工程を含む、前記検出方法。
- 免疫凝集法における標的物質と結合可能な物質が担持されたラテックス粒子の沈降抑制方法であって、
前記ラテックス粒子と、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレンオキサイド及びポリ-γ-グルタミン酸ナトリウムからなる群から選ばれる１以上の化合物を水性媒体中で接触させる工程を含むことを特徴とする、前記沈降抑制方法。
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