ES2923573T3

ES2923573T3 - Composiciones de ARNi de proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2923573T3
Application number: ES19192281T
Authority: ES
Inventors: Brian Bettencourt; William Querbes; Kevin Fitzgerald; Maria Frank-Kamenetsky; Stuart Milstein; Svetlana Shulga-Morskaya
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2022-09-28
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: EP3444348A1; WO2012177784A2; US20140179768A1; KR102554896B1; EP4092120A1; NZ620151A; KR20140044870A; US20170355994A1; US20190316137A1; JP7245194B2; US10550390B2; US20200140866A1; BR122019026068B1; AU2019226296A1; JP2014524738A; US20190352645A1; AU2012272970A1; KR20220063292A; MX2013014364A; US11306314B2

Abstract

La invención se refiere a composiciones de ácido ribonucleico de doble cadena (dsRNA) dirigidas al gen ANGPTL3, así como métodos para inhibir la expresión de ANGPTL3 y métodos para tratar sujetos que tienen un trastorno del metabolismo de los lípidos, como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia, utilizando tales composiciones de dsRNA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de ARNi de proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) y métodos de uso de las mismas Descripción

La proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) es un miembro de la familia de tipo angiopoyetina de factores secretados que regula el metabolismo lipídico y que se expresa predominantemente en el hígado (Koishi, R. et al., (2002) Nat. Genet. 30(2):151-157). ANGPTL3 inhibe doblemente las actividades catalíticas de la lipoproteína lipasa (LPL), que cataliza la hidrólisis de triglicéridos, y de la lipasa endotelial (EL), que hidroliza fosfolípidos de lipoproteínas de alta densidad (HDL). En ratones KK/Snk hipolipidémicos, aunque obesos, una reducción de la expresión de ANGPTL3 tiene un efecto protector contra la hiperlipidemia y aterosclerosis al promover el aclaramiento de triglicéridos (Ando et al., (2003) J. Lipid Res., 44:1216-1223). Las concentraciones plasmáticas de ANGPTL3 humana se correlacionan positivamente con los niveles de fosfolípidos HDL y colesterol HDL plasmáticos (Shimamura et al., (2007) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 27:366-372).

Los trastornos del metabolismo lipídico pueden conducir a niveles elevados de lípidos séricos, tales como triglicéridos y/o colesterol. Los lípidos séricos elevados están fuertemente asociados con una tensión arterial alta, enfermedades cardiovasculares, diabetes y otras afecciones patológicas. La hipertrigliceridemia es un ejemplo de un trastorno del metabolismo lipídico que se caracteriza por niveles elevados de triglicéridos en sangre. Se ha asociado con la aterosclerosis, incluso en ausencia de niveles elevados de colesterol (hipercolesterolemia). Cuando las concentraciones de triglicéridos son excesivas (es decir, mayores de 1000 mg/dl o 12 mmol/l), la hipertrigliceridemia también puede conducir a pancreatitis. La hiperlipidemia es otro ejemplo de un trastorno del metabolismo lipídico que se caracteriza por niveles elevados de uno cualquiera o todos los lípidos y/o las lipoproteínas en la sangre. Los tratamientos actuales para los trastornos del metabolismo lipídico, incluyendo la dieta, el ejercicio y el tratamiento con estatinas y otros fármacos, no siempre son eficaces. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de tratamientos alternativos para sujetos que tienen trastornos del metabolismo lipídico.

La presente invención se define por las reivindicaciones. En consecuencia, la presente invención proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de la proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3), que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en el que la hebra sentido y la hebra antisentido forman una región de complementariedad de al menos 17 nucleótidos de longitud, en el que dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado, en el que al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido modificado con 2'-amino, y en el que dicho ARNbc comprende un ligando que comprende un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc), en el que la hebra antisentido comprende al menos 17 nucleótidos contiguos que no difieren en más de tres nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de: (a) 5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3' (nucleótidos 274-296 de SEQ ID NO: 1); (b) 5'-AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU-3' (nucleótidos 273-295 de SEQ ID NO: 1); o (c) 5'-AGACUGAUCAAAUAUGUUG-3' (nucleótidos 276-294 de SEQ ID NO: 1).

La presente invención también se refiere a una célula aislada que contiene el ARNbc de la invención así como a una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3, que comprende el ARNbc de la invención. Un aspecto adicional de la invención es un método in vitro de inhibición de la expresión de ANGPTL3 en una célula, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la célula con el ARNbc de la invención; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de ANGPTL3, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de ANGPTL3 en la célula. Finalmente, la presente invención se refiere al ARNbc de la invención para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción de la expresión de ANGPTL3.

También se describen en el presente documento, pero no forman parte de la invención, composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen de ANGPL3. El gen de ANGPL3 puede estar dentro de una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un ser humano. La presente divulgación también proporciona métodos de uso de las composiciones de ARNi de la divulgación para inhibir la expresión de un gen de ANGPL3 y/o para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la inhibición o reducción de la expresión de un gen de ANGPL3, por ejemplo, sujeto que padece o es propenso a padecer un trastorno del metabolismo lipídico, tal como un sujeto que padece o es propenso a padecer hiperlipidemia o hipertrigliceridemia.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación también proporciona ácidos ribonucleicos bicatenarios (ARNbc) para inhibir la expresión de ANGPTL3. Los ARNbc comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, en los que la hebra sentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la hebra antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, la presente divulgación también proporciona ácidos ribonucleicos bicatenarios (ARNbc) para inhibir la expresión de ANGPTL3. Los ARNbc comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, comprendiendo la hebra antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias antisentido enumeradas en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En una implementación, las hebras sentido y antisentido comprenden secuencias seleccionadas del grupo que consiste en AD-53063.1, AD-53001.1, AD-53015.1, AD-52986.1, AD-52981.1, AD-52953.1, AD-53024.1, AD-53033.1, AD-53030.1, AD-53080.1, AD-53073.1, AD-53132.1, AD-52983.1, AD-52954.1, AD-52961.1, AD-52994.1, AD-52970.1, AD-53075.1, AD-53147.1, AD-53077.1 de las tablas 7 y 8.

En ciertas implementaciones de la divulgación, los ARNbc comprenden al menos un nucleótido modificado. En una implementación, al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2’-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5’-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico. En otra implementación, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2’-desoxi-2’-fluoro, un nucleótido modificado con 2’-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2’-amino, un nucleótido modificado con 2’-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.

La región de complementariedad de los ARNbc puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud, entre 19 y 21 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud.

En una implementación, cada hebra de un ARNbc no tiene más 30 nucleótidos de longitud.

Al menos una hebra de un ARNbc puede comprender una proyección 3’ de al menos 1 nucleótido o al menos 2 nucleótidos.

En ciertas implementaciones, un ARNbc comprende además un ligando. En una realización, el ligando está conjugado con el extremo 3’ de la hebra sentido del ARNbc.

En algunas implementaciones, el ligando es uno o más derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc) unido a través de un enlazador ramificado bivalente o trivalente. En implementaciones particulares, el ligando es

En algunas implementaciones, el agente de ARNi está conjugado con el ligando tal como se muestra en el siguiente esquema

En algunas implementaciones, el agente de ARNi incluye además al menos una unión internucleotídica de fosforotioato o metilfosfonato. En algunas realizaciones, la unión internucleotídica fosforotioato o metilfosfonato está en el extremo 3’-terminal de una hebra. En algunas realizaciones, la hebra es la hebra antisentido. En otras realizaciones, la hebra es la hebra sentido.

En una implementación, la región de complementariedad de un ARNbc consiste en una de las secuencias antisentido de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En otra implementación, un ARNbc comprende una hebra sentido que consiste en una secuencia de hebra sentido seleccionada de las secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, y una hebra antisentido que consiste en una secuencia antisentido seleccionada de las secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

También se describe en el presente documento, pero sin formar parte de la invención, una célula, por ejemplo, un hepatocito, que contiene un ARNbc de la divulgación.

En aun otro aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona un vector que codifica para ambas hebras de un ARNbc, en el que el ARNbc comprende una región de complementariedad con al menos una parte de un ARNm que codifica para ANGPTL3, en el que el ARNbc tiene 30 pares de bases o menos de longitud, y en el que el ARNbc selecciona como diana el ARNm para su escisión. La región de complementariedad puede tener al menos 15 nucleótidos de longitud o de 19 a 21 nucleótidos de longitud.

En un aspecto adicional que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona una célula que comprende un vector que codifica para al menos una hebra de un ARNbc, en el que el ARNbc comprende una región de complementariedad con al menos una parte de un ARNm que codifica para ANGPTL3, en el que el ARNbc tiene 30 pares de bases o menos de longitud, y en el que el ARNbc selecciona como diana el ARNm para su escisión.

En un aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3 que comprende un ARNbc o vector de la divulgación.

En una implementación, la composición farmacéutica comprende una formulación lipídica, tal como una formulación de MC3, SNALP o XTC.

En otro aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona métodos de inhibición de la expresión de ANGPTL3 en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un ARNbc o un vector de la divulgación, y mantener la célula producida durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de ANGPTL3, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de ANGPTL3 en la célula.

La célula puede estar dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano, por ejemplo un sujeto humano que padece un trastorno del metabolismo lipídico, por ejemplo, hiperlipidemia o hipertrigliceridemia.

En una implementación de los métodos tal como se describen también en el presente documento, la expresión de ANGPTL3 se inhibe en al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente el 99%.

En otro aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción de la expresión de ANGPTL3, por ejemplo, un trastorno del metabolismo lipídico, tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia. Los métodos que se describen también en el presente documento incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc o un vector de la divulgación, tratando de ese modo al sujeto.

El trastorno puede ser un trastorno del metabolismo lipídico, tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia.

En una implementación, la administración del ARNbc al sujeto provoca una disminución del nivel de un lípido sérico, triglicéridos, colesterol y/o ácidos grasos libres; y/o una disminución de la acumulación de proteína ANGPTL3. En una implementación, administración del ARNbc al sujeto provoca una disminución del nivel de LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C y/o colesterol total.

En una implementación, el ARNbc se administra a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 4,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 9,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8. 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8. 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8. 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 o aproximadamente 10 mg/kg.

En otra implementación, el ARNbc se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg.

Por ejemplo, a los sujetos se les puede administrar una cantidad terapéutica de ARNi, tal como aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg.

En otro aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la presente divulgación proporciona métodos de inhibición de la expresión de ANGPTL3 en un sujeto. Los métodos que también se describen en el presente documento incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc o un vector de la invención, inhibiendo de ese modo la expresión de ANGPTL3 en el sujeto.

En aun otro aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona kits para realizar los métodos de la invención. En un aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona un kit para realizar un método de inhibición de la expresión de un gen de ANGPTL3 en una célula poniendo en contacto una célula con un agente de ARNi bicatenario en una cantidad eficaz para inhibir la expresión del ANGPTL3 en la célula. El kit comprende un agente de ARNi e instrucciones para su uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi a un sujeto.

La figura 1 es un esquema del procedimiento experimental usado para las pruebas in vivo descritas en el ejemplo 2. La figura 2, panel A, es un gráfico que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 2, panel B, es un gráfico que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones ob/ob después del tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 3, panel A, es un gráfico que muestra los niveles medidos de LDL-c en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 3, panel B, es un gráfico que muestra los niveles medidos de LDL-c en ratones ob/ob después del tratamiento con el a Rní indicado o un control.

La figura 4, panel A, es un gráfico que muestra los niveles medidos de triglicéridos en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 4, panel B, es un gráfico que muestra los niveles medidos de triglicéridos en ratones ob/ob después del tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 5, panel A, es un gráfico que muestra los niveles medidos de colesterol total (TC) en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 5, panel B, es un gráfico que muestra los niveles medidos de colesterol total (TC) en ratones ob/ob después del tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 6, panel A, es un gráfico que muestra los niveles medidos de HDL-c en ratones WT después del tratamiento con el ARNi indicado o un control. La figura 6, panel B, es un gráfico que muestra los niveles medidos de HDL-c en ratones ob/ob después del tratamiento con el ARNi indicado o un control.

La figura 7 es un gráfico que muestra los niveles medidos de proteína ANGPTL3 en ratones transgénicos para PCS humana después del tratamiento con una sola dosis del ARNi indicado o un control.

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La presente divulgación proporciona generalmente composiciones de ARNi, que efectúan la escisión mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen de ANGPTL3. El gen de ANGPTL3 puede estar dentro de una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un ser humano. La presente divulgación también proporciona métodos de uso de las composiciones de ARNi de la invención para inhibir la expresión de un gen de a Ng Pt L3 y/o para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la inhibición o reducción de la expresión de un gen de ANGPTL3, por ejemplo, un trastorno del metabolismo lipídico, tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia. Los ARNi de la divulgación incluyen una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que tiene aproximadamente 30 nucleótidos o menos de longitud, por ejemplo, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18 21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud, región que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen de ANGPTL3. El uso de estos ARNi permite la degradación dirigida de ARNm de un gen de ANGPTL3 en mamíferos. Dosificaciones muy bajas de ARNi de ANGPTL3, en particular, pueden mediar específica y eficazmente en la interferencia de ARN (ARNi), dando como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de ANGPTL3. Usando ensayos basados en células, los presentes inventores han demostrado que los ARNi que seleccionan como diana ANGPTL3 pueden mediar en la ARNi, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión de un gen de ANGPTL3. Por tanto, los métodos y las composiciones que incluyen estos ARNi son útiles para tratar a un sujeto que se beneficiaría de una reducción de los niveles y/o la actividad de una proteína ANGPTL3, tal como un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico, tal como hiperlipidemia o hipertrigliceridemia.

La siguiente descripción detallada da a conocer cómo preparar y usar composiciones que contienen ARNi para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3, así como composiciones y métodos para tratar a sujetos que tienen enfermedades y trastornos que se beneficiarían de la inhibición y/o reducción de la expresión de este gen.

I. Definiciones

Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar se definen ciertos términos.

Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento, por ejemplo, una pluralidad de elementos.

El término “que incluye” se usa en el presente documento queriendo decir, y se usa indistintamente con, la frase “que incluye pero no se limita a”. El término “o” se usa en el presente documento queriendo decir, y se usa indistintamente con, el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

El término “ANGPTL3” se refiere a una proteína 3 de tipo angiopoyetina que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier fuente de vertebrado o mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, ser humano, bovino, pollo, roedor, ratón, rata, porcino, ovino, primate, mono y cobaya, a menos que se especifique lo contrario. El término también se refiere a fragmentos y variantes de ANGPTL3 nativa que mantienen al menos una actividad in vivo o in vitro de una ANGPTL3 nativa. El término abarca formas precursoras no procesadas de longitud completa de ANGPTL3 así como formas maduras que resultan de la escisión postraduccional del péptido señal y formas resultantes del procesamiento proteolítico del dominio similar a fibrinógeno. La secuencia de un transcrito de ARN de ANGPTL3 humana puede encontrarse en, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank GI: 41327750 (NM_014495.2; SEQ ID NO: 1). La secuencia predicha de ARNm de ANGPTL3 de rhesus puede encontrarse en, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank GI: 297278846 (XM_001086114.2; SEQ ID NO: 2). La secuencia de ARNm de ANGPTL3 de ratón puede encontrarse en, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank GI:142388354 (NM_013913.3; SEQ ID NO: 3). La secuencia de ARNm de ANGPTL3 de rata puede encontrarse en, por ejemplo, el n.° de registro de GenBank GI: 68163568 (NM_001025065.1; SEQ ID NO: 4).

El término “ANGPTL3” tal como se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido particular expresado en una célula por variaciones en la secuencia de ADN que se producen de manera natural del gen de ANGPTL3, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de ANGPTL3. Se han identificado numerosos SNP dentro del gen de ANGPTL3 y pueden encontrarse en, por ejemplo, NCBI dbSNP (véase, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Pueden encontrarse ejemplos no limitativos de SNP dentro del gen de ANGPTL3 en los n.os de registro de NCBI dbSNP rs193064039; rs192778191; rs192764027; rs192528948; rsl91931953; rs191293319; rs191171206; rs191145608; rs191086880; rs191012841; o rs190255403.

Tal como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de ANGPTL3, incluyendo ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario. En una realización, la porción diana de la secuencia será al menos lo suficientemente larga como para servir como sustrato para la escisión dirigida por ARNi en o cerca de esa porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de ANGPTL3.

La secuencia diana puede tener desde aproximadamente 9-36 nucleótidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 15-30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la secuencia diana puede tener desde aproximadamente 15-30 nucleótidos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19 27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21,21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud.

Tal como se usa en el presente documento, el término “hebra que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia usando la nomenclatura convencional de nucleótidos.

“G”, “C”, “A”, “T” y “U” representan generalmente cada uno un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, timidina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” puede referirse también a un nucleótido modificado, tal como se detalla adicionalmente a continuación, o a un resto de reemplazo sustituto. El experto en la técnica es muy consciente de que la guanina, citosina, adenina y uracilo pueden reemplazarse por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva tal resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede aparearse con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden reemplazarse en las secuencias de nucleótidos de ARNbc presentadas en la divulgación por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, la adenina y citosina en cualquier lugar en el oligonucleótido pueden reemplazarse por guanina y uracilo, respectivamente para formar un apareamiento de bases de G-U titubeo (wobble) con el ARNm diana. Secuencias que contienen tales restos de reemplazo son adecuadas para las composiciones y los métodos presentados en la divulgación.

Los términos “ARNi”, “agente de ARNi”, “agente de ARNi”, “agente de interferencia de ARN” se usan indistintamente en el presente documento, refiriéndose a un agente que contiene ARN tal como se define ese término en el presente documento, y que media en la escisión dirigida de un transcrito de ARN por medio de una ruta de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El ARNi dirige la degradación específica de secuencia de ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (ARNi). El ARNi modula, por ejemplo, inhibe, la expresión de ANGPTL3 en una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto mamífero.

En una implementación, un agente de ARNi de la divulgación incluye un ARN monocatenario que interacciona con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de ANGPTL3, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin querer restringirse a la teoría, el ARN bicatenario largo introducido en las células se descompone en ARNip mediante una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Dicer, una enzima similar a ribonucleasa III, procesa el ARNbc para dar ARN de interferencia cortos de 19-23 pares de bases con proyecciones características de dos bases en 3' (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Entonces, los ARNip se incorporan a un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip, lo que permite que la hebra antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., (2001) Celda 107:309). Al unirse al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana induciendo el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Por tanto, en un aspecto que también se describe en el presente documento pero que no forma parte de la invención, la divulgación se refiere a un ARN monocatenario (ARNip) generado dentro de una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen diana, es decir, un gen de ANGPTL3. En consecuencia, el término “ARNip” también se usa en el presente documento para referirse a una ARNi tal como se describió anteriormente.

En otro aspecto, el agente de ARNi tal como se describe en el presente documento es una molécula de ARN antisentido monocatenario. Una molécula de ARN antisentido es complementaria a una secuencia dentro del ARNm diana. El ARN antisentido puede inhibir la traducción de manera estequiométrica mediante apareamiento de bases con el ARNm y obstruyendo físicamente la maquinaria de traducción, véase Dias, N. et al., (2002) Mol. Cancer Ther.

1: 347-355. La molécula de ARN antisentido monocatenario puede tener de aproximadamente 13 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y tener una secuencia que es complementaria a una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula de ARN antisentido monocatenario puede comprender una secuencia que tiene al menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias antisentido de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10.

En otra implementación, un “ARNi” para su uso en las composiciones y los métodos tal como se describe en el presente documento es un ARN bicatenario y se denomina en el presente documento “agente de ARNi bicatenario”, “molécula de ARN bicatenario (ARNbc)”, “agente de ARNbc” o “ARNbc”. El término “ARNbc” se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, que se dice que tienen orientaciones “sentido” y “antisentido” con respecto a un ARN diana, es decir, un gen de ANGPTL3. En algunas implementaciones de la divulgación, un ARN bicatenario (ARNbc) desencadena la degradación de un ARN diana, por ejemplo, un ARNm, a través de un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional denominado en el presente documento interferencia de ARN o ARNi.

La región de dúplex puede tener cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN diana deseado a través de una ruta de RISC, y puede oscilar entre aproximadamente 9 y 36 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 15-30 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 pares de bases de longitud, tal como aproximadamente 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15 -25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27 , 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19 26, 19 -25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-2420-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases de longitud.

Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos hebras son parte de una molécula más grande y, por tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva formando la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina “bucle de horquilla”. Un bucle de horquilla puede comprender al menos un nucleótido no apareado. En algunas implementaciones, el bucle de horquilla puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 23 o más nucleótidos no apareados.

Cuando las dos hebras sustancialmente complementarias de un ARNbc están compuestas por moléculas de ARN separadas, no es necesario que esas moléculas estén conectadas covalentemente, pero pueden estarlo. Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva que forma la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina “enlazador”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier proyección que esté presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, una ARNi puede comprender una o más proyecciones de nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, el término “proyección de nucleótidos” se refiere a al menos un nucleótido no apareado que sobresale de la estructura de dúplex de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc. Por ejemplo, cuando un extremo 3' de una hebra de un ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa, existe una proyección de nucleótidos. Un ARNbc puede comprender una proyección de al menos un nucleótido; alternativamente, la proyección puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Una proyección de nucleótidos puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluyendo un desoxinucleótido/nucleósido. La/las proyección/proyecciones puede(n) estar en la hebra sentido, la hebra antisentido o cualquier combinación de las mismas. Además, el/los nucleótido(s) de una proyección puede(n) estar presentes en el extremo 5', el extremo 3' o en ambos extremos de una hebra o bien sentido o bien antisentido de un ARNbc.

En una implementación, la hebra antisentido de un ARNbc tiene una proyección de 1-10 nucleótidos, por ejemplo, una proyección de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos en el extremo 3' y/o el extremo 5'. En una realización, la hebra sentido de un ARNbc tiene una proyección de 1-10 nucleótidos, por ejemplo, una proyección de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' y/o el extremo 5'. En otra realización, uno o más de los nucleótidos en la proyección se reemplazan con un tiofosfato de nucleósido.

Los términos “romo” o “de extremos romos”, tal como se usan en el presente documento en referencia a un ARNbc, significan que no hay nucleótidos o análogos de nucleótidos no apareados en un extremo terminal dado de un ARNbc, es decir, sin proyección de nucleótidos. Uno o ambos extremos de un ARNbc pueden ser romos. Cuando ambos extremos de un ARNbc son romos, se dice que el ARNbc es de extremos romos. Para ser claros, un ARNbc de “extremos romos” es un ARNbc que es romo en ambos extremos, es decir, sin proyección de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula. Más frecuentemente, una molécula de este tipo será bicatenaria a lo largo de toda su longitud.

El término “hebra antisentido” o “hebra guía” se refiere a la hebra de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana, por ejemplo, un ARNm de ANGPTL3. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de complementariedad” se refiere a la región en la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de ANGPTL3, tal como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los apareamientos erróneos pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula. En general, los apareamientos erróneos más tolerados se encuentran en las regiones terminales, por ejemplo, dentro de los 5, 4, 3 o 2 nucleótidos de los extremos 5' y/o 3' del ARNi.

El término “hebra sentido” o “hebra pasajera”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNi que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra antisentido tal como se define ese término en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término “complementario”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar un estructura de dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, tal como entenderá el experto en la técnica. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido por lavado (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiado para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.

Las secuencias complementarias dentro de un ARNi, por ejemplo, dentro de un ARNbc tal como se describe en el presente documento, incluyen el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse “totalmente complementarias” entre sí en el presente documento. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina “sustancialmente complementaria” con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2 pares de bases desapareadas tras la hibridación para un dúplex de hasta 30 pares de bases, conservando al mismo tiempo la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final, por ejemplo, la inhibición de la expresión génica a través de una ruta de RISC. Sin embargo, cuando se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, uno o más proyecciones monocatenarias, tales proyecciones no se considerarán apareamientos erróneos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, aún puede denominarse “totalmente complementario” para los fines descritos en el presente documento.

Las secuencias “complementarias”, tal como se usan en el presente documento, también pueden incluir, o estar formadas completamente a partir de, pares de bases que no son de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse. Tales pares de bases que no son de Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases de G:U titubeo o Hoogstein.

Los términos “complementario”, “totalmente complementario” y “sustancialmente complementario” en el presente documento pueden usarse con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un agente de ARNi y una secuencia diana, tal como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos parte de” un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica para ANGPTL3). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de ANGPTL3 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica para ANGPTL3.

En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero tal como se describe en detalle en el presente documento, cada una o ambas hebras también pueden incluir uno o más nucleótidos distintos de ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, un “ARNi” puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas. Tales modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones dadas a conocer en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquier modificación de este tipo, tal como se usa en una molécula de ARNi, está abarcada por “ARNi” para los fines de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones.

El término “inhibir”, tal como se usa en el presente documento, se usa indistintamente con “reducir”, “silenciar”, “regular por disminución”, “suprimir” y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.

La frase “inhibir la expresión de una ANGPTL3”, tal como se usa en el presente documento, incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen de ANGPTL3 (tal como, por ejemplo, un gen de ANGPTL3 de ratón, un gen de ANGPTL3 de rata, un gen de ANGPTL3 de mono o un gen de ANGPTL3 humana) así como variantes o mutantes de un gen de ANGPTL3 que codifica para una proteína ANGPTL3.

“Inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3” incluye cualquier nivel de inhibición de un gen de ANGPTL3, por ejemplo, la supresión al menos parcial de la expresión de un gen de ANGPTL3, tal como una inhibición de al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente el 99%.

La expresión de un gen de ANGPTL3 puede evaluarse basándose en el nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen de ANGPTL3, por ejemplo, el nivel de ARNm de ANGPTL3 o el nivel de proteína ANGPTL3. La expresión de una ANGPTL3 también puede evaluarse indirectamente basándose en los niveles de un lípido sérico, un triglicérido, colesterol (incluyendo LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C y colesterol total), o ácidos grasos libres. La inhibición puede evaluarse mediante una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la técnica, por ejemplo, un nivel basal antes de la dosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no se trata o se trata con un control (tal como, por ejemplo, control de solo tampón o control de agente inactivo).

En una implementación, la supresión al menos parcial de la expresión de un gen de ANGPTL3 se evalúa mediante una reducción de la cantidad de ARNm de ANGPTL3 que puede aislarse de o detectarse en una primera célula o grupo de células en las que se transcribe un gen de ANGPTL3 y que se ha(n) tratado de manera que se inhibe la expresión de un gen de ANGPTL3, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se ha(n) tratado de ese modo (células de control). El grado de inhibición puede expresarse en términos de:

La frase “poner en contacto una célula con un agente de ARNi”, tal como un ARNbc, tal como se usa en el presente documento, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de ARNi incluye poner en contacto una célula in vitro con el ARNi o poner en contacto una célula in vivo con el ARNi. La puesta en contacto puede hacerse directa o indirectamente. Así, por ejemplo, el agente de ARNi puede ponerse en contacto físico con la célula por parte del individuo que realiza el método o, alternativamente, el agente de ARNi puede ponerse en una situación que permita o provoque que entre en contacto posteriormente con la célula.

La puesta en contacto de una célula in vitro puede hacerse, por ejemplo, incubando la célula con el agente de ARNi. La puesta en contacto de una célula in vivo puede hacerse, por ejemplo, inyectando el agente de ARNi en o cerca del tejido donde está ubicada la célula, o inyectando el agente de ARNi en otra área, por ejemplo, el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de manera que el agente alcanzará posteriormente el tejido donde está ubicada la célula que va a ponerse en contacto. Por ejemplo, el agente de ARNi puede contener y/o estar acoplado a un ligando, por ejemplo, GalNAc3, que dirige el agente de ARNi a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado. También son posibles combinaciones de métodos in vitro e in vivo de puesta en contacto. Por ejemplo, una célula también puede ponerse en contacto in vitro con un agente de ARNi y posteriormente trasplantarse a un sujeto.

En una implementación, la puesta en contacto una célula con un ARNi incluye “introducir” o “suministrar el ARNi a la célula” facilitando o efectuando la captación o absorción en la célula. La absorción o captación de un ARNi puede producirse a través de procesos celulares activos o de difusión sin ayuda, o mediante agentes o dispositivos auxiliares. La introducción de un ARNi en una célula puede ser in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, para la introducción in vivo, el ARNi puede inyectarse en un sitio tisular o administrarse sistémicamente. El suministro in vivo también puede realizarse mediante un sistema de suministro de beta-glucano, tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.os 5.032.401 y 5.607.677, y la publicación estadounidense n.° 2005/0281781. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como electroporación y lipofección. A continuación en el presente documento se describen enfoques adicionales y/o se conocen en la técnica.

El término “SNALP” se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido. Una SNALP es una vesícula de lípidos que recubren un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico como un ARNi o un plásmido a partir del cual se transcribe un ARNi. Las SNALP se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os 20060240093, 20070135372, y en la solicitud internacional n.° WO 2009082817. A continuación se describen ejemplos de formulaciones de “SNALP”.

Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (tal como un ser humano, un primate no humano, por ejemplo, un mono y un chimpancé), un no primate (tal como una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata, un ratón, un caballo y una ballena), o un ave (por ejemplo, un pato o un ganso). En una realización, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano que se trata o se evalúa por una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción de la expresión de ANGPTL3; un ser humano en riesgo de una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión de ANGPTL3; un ser humano que tiene una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión de ANGPTL3; y/o ser humano que está tratándose para una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión de ANGPTL3 tal como se describe en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratar” o “tratamiento” se refieren a un resultado beneficioso o deseado incluyendo tal como una reducción de los niveles de triglicéridos en un sujeto. Los términos “tratar” o “tratamiento” también incluyen, pero no se limitan a, el alivio o la mejora de uno o más síntomas de un trastorno del metabolismo lipídico, tal como, por ejemplo, una disminución en el tamaño de los xantomas eruptivos. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento.

Por “inferior” en el contexto de un marcador o síntoma de enfermedad quiere decirse una disminución estadísticamente significativa de tal nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o más, y es preferiblemente hasta un nivel aceptado como dentro del intervalo de lo normal para un individuo sin tal trastorno. Tal como se usa en el presente documento, “prevención” o “prevenir”, cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o afección de los mismos, que se beneficiaría de una reducción en la expresión de un gen de ANGPTL3, se refiere a una reducción en la probabilidad de que un sujeto desarrolle un síntoma asociado con tal enfermedad, trastorno o afección, por ejemplo, altos niveles de triglicéridos o xantoma eruptivo. La probabilidad de desarrollar altos niveles de triglicéridos o xantoma eruptivo se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo para altos niveles de triglicéridos o xantoma eruptivo no logra desarrollar altos niveles de triglicéridos o xantoma eruptivo o desarrolla altos niveles de triglicéridos o xantoma eruptivo con menor gravedad en relación con una población que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe tratamiento tal como se describe en el presente documento. La falta de desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección, o la reducción en el desarrollo de un síntoma asociado con tal enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, en al menos el 10% en una escala clínicamente aceptada para esa enfermedad o trastorno), o la presentación de síntomas tardíos retrasados (por ejemplo, en días, semanas, meses o años) se considera una prevención eficaz.

Tal como se usa en el presente documento, el término “lípido sérico” se refiere a cualquier lípido principal presente en la sangre. Los lípidos séricos pueden estar presentes en la sangre en forma libre o como parte de un complejo proteico, por ejemplo, un complejo lipoproteico. Los ejemplos no limitativos de lípidos séricos pueden incluir triglicéridos y colesterol, tales como colesterol total (TG), colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C), colesterol de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL-C) y colesterol de lipoproteínas de densidad intermedia (IDL-C).

Tal como se usa en el presente documento, un “trastorno del metabolismo lipídico” se refiere a cualquier trastorno asociado o provocado por una alteración en el metabolismo lipídico. Por ejemplo, este término incluye cualquier trastorno, enfermedad o afección que pueda conducir a hiperlipidemia, o una afección caracterizada por una elevación anómala de los niveles de cualquiera o todos los lípidos y/o lipoproteínas en la sangre. Este término se refiere a un trastorno hereditario, tal como hipertrigliceridemia familiar, o un trastorno adquirido, tal como un trastorno adquirido como resultado de una dieta o la ingesta de ciertos fármacos. Los trastornos del metabolismo lipídico a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aterosclerosis, dislipidemia, hipertrigliceridemia (incluyendo hipertrigliceridemia inducida por fármacos, hipertrigliceridemia inducida por diuréticos, hipertrigliceridemia inducida por alcohol, hipertrigliceridemia inducida por agentes bloqueantes p-adrenérgicos, hipertrigliceridemia inducida por estrógenos, hipertrigliceridemia inducida por glucocorticoides, hipertrigliceridemia inducida por retinoides, hipertrigliceridemia inducida por cimetidina e hipertrigliceridemia familiar), pancreatitis aguda asociada con hipertrigliceridemia, síndrome de quilomicrones, quilomicronemia familiar, deficiencia o resistencia de Apo-E, deficiencia o hipoactividad de LPL, hiperlipidemia (incluyendo hiperlipidemia familiar combinada), hipercolesterolemia, gota asociada con hipercolesterolemia, xantomatosis (depósitos subcutáneos de colesterol).

Las enfermedades cardiovasculares asociadas con trastornos del metabolismo lipídico también se consideran “trastornos del metabolismo lipídico”, tal como se define en el presente documento. Estas enfermedades pueden incluir arteriopatía coronaria (también denominada cardiopatía isquémica), inflamación asociada con arteriopatía coronaria, reestenosis, enfermedades vasculares periféricas y accidente cerebrovascular.

Los trastornos relacionados con el peso corporal también se consideran “trastornos del metabolismo lipídico”, tal como se define en el presente documento. Tales trastornos pueden incluir obesidad, síndrome metabólico que incluye componentes independientes del síndrome metabólico (por ejemplo, obesidad central, FBG/prediabetes/diabetes, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hipertensión), hipotiroidismo, uremia y otras afecciones asociadas con el aumento de peso (incluyendo aumento de peso rápido), pérdida de peso, mantenimiento de la pérdida de peso o riesgo de recuperar peso después de la pérdida de peso.

Los trastornos del azúcar en sangre se consideran además “trastornos del metabolismo lipídico”, tal como se define en el presente documento. Tales trastornos pueden incluir diabetes, hipertensión y síndrome de ovario poliquístico relacionado con la resistencia a la insulina. Otros trastornos a modo de ejemplo del metabolismo lipídico también pueden incluir trasplante renal, síndrome nefrótico, síndrome de Cushing, acromegalia, lupus eritematoso sistémico, disglobulinemia, lipodistrofia, glucogenosis de tipo I y enfermedad de Addison.

“Cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir la cantidad de un agente de ARNi que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad). La “cantidad terapéuticamente eficaz” puede variar dependiendo del agente de ARNi, cómo se administra el agente, la enfermedad y su gravedad y los antecedentes, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la constitución genética, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del sujeto que va a tratarse.

“Cantidad profilácticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir la cantidad de un ARNi que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico, es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Mejorar la enfermedad incluye ralentizar el curso de la enfermedad o reducir la gravedad de la enfermedad que se desarrolla más tarde. La “cantidad profilácticamente eficaz” puede variar dependiendo del ARNi, cómo se administra el agente, el grado de riesgo de la enfermedad y los antecedentes, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la constitución genética, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que va a tratarse.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad profilácticamente eficaz” también incluye una cantidad de un agente de ARNi que produce algún efecto local o sistémico deseado a una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. El ARNi empleado en los métodos de la presente divulgación puede administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de sujetos humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación de beneficio/riesgo razonable. La expresión “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, adyuvante de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc, o ácido estérico), o material encapsulante de disolvente, implicado en el acarreo o transporte del compuesto objeto desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación y no perjudicial para el sujeto que está tratándose. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco; (8) excipientes, como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) disolución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos; (23) componente sérico, tal como albúmina sérica, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivarse de órganos particulares, partes de órganos o fluidos o células dentro de esos órganos. En ciertas implementaciones, las muestras pueden derivarse del hígado (por ejemplo, hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado, tales como, por ejemplo, hepatocitos). En algunas implementaciones, una “muestra derivada de un sujeto” se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto.

II. ARNi

Se describen en el presente documento ARNi que inhiben la expresión de un gen de ANGPTL3. En una realización, el agente de ARNi incluye moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3 en una célula, tal como una célula dentro de un sujeto, por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano que tiene trastorno del metabolismo lipídico, por ejemplo, hiperlipidemia familiar. El ARNbc incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen de ANGPTL3. La región de complementariedad tiene aproximadamente 30 nucleótidos o menos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 o 18 nucleótidos o menos de longitud). Tras el contacto con una célula que expresa el gen de ANGPTL3, el ARNi inhibe la expresión del gen de ANGPTL3 (por ejemplo, un gen de ANGPTL3 humano, de primate, de no primate o de ave) en al menos aproximadamente el 10% tal como se somete a ensayo mediante, por ejemplo, un método basado en PCR o ARN ramificado (ADNr), o mediante un método basado en proteínas, tal como mediante análisis de inmunofluorescencia, usando, por ejemplo, técnicas de inmunotransferencia de tipo Western o de citometría de flujo.

Un ARNbc incluye dos hebras de ARN que son complementarias y se hibridan formando una estructura de dúplex en las condiciones en las que se usará el ARNbc. Una hebra de un ARNbc (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y en general totalmente complementaria, a una secuencia diana. La secuencia diana puede derivarse de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de ANGPTL3. La otra hebra (la hebra sentido) incluye una región que es complementaria a la hebra antisentido, de manera que las dos hebras se hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Tal como se describe en otra parte en el presente documento y tal como se conoce en la técnica, en vez de estar en oligonucleótidos separados, las secuencias complementarias de un ARNbc también pueden estar contenidas como regiones autocomplementarias de una sola molécula de ácido nucleico.

Generalmente, la estructura de dúplex tiene entre 15 y 30 pares de bases de longitud, por ejemplo, entre 15-29, 15 28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18- 25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19 20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases de longitud.

De manera similar, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre 15 y 30 nucleótidos de longitud, por ejemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15 17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19- 25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21 30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud.

En algunas implementaciones, el ARNbc tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En general, el ARNbc es lo suficientemente largo como para servir como sustrato para la enzima Dicer. Por ejemplo, se conoce bien en la técnica que ARNbc más largos de aproximadamente 21-23 nucleótidos pueden servir como sustratos para Dicer. Tal como también reconocerá el experto habitual en la técnica, la región de un ARN seleccionado como diana para su escisión formará parte lo más a menudo de una molécula de ARN más grande, a menudo una molécula de ARNm. Cuando sea relevante, una “parte” de una diana de ARNm es una secuencia contigua de una diana de ARNm de suficiente longitud como para permitirle que sea un sustrato para la escisión dirigida por ARNi (es decir, escisión a través de una ruta de RISC).

Un experto en la técnica también reconocerá que la región de dúplex es una porción funcional primaria de un ARNbc, por ejemplo, una región de dúplex de aproximadamente 9 a 36 pares de bases, por ejemplo, aproximadamente 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35,9-34, 10 34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13 32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18 21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20- 26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases. Por tanto, en una implementación, en la medida en que se procese para dar un dúplex funcional de, por ejemplo, 15-30 pares de bases, que selecciona como diana un ARN deseado para su escisión, una molécula de ARN o complejo de moléculas de ARN que tiene una región de dúplex mayor de 30 pares de bases, es un ARNbc. Por tanto, un experto habitual en la técnica reconocerá que, en una implementación, un mARNi es un ARNbc. En otra implementación, un ARNbc no es un mARNi que se produzca de manera natural. En otra implementación, no se genera un agente de ARNi útil para seleccionar como diana la expresión de ANGPTL3 en la célula diana mediante la escisión de un ARNbc más grande.

Un ARNbc tal como se describe en el presente documento puede incluir además una o más proyecciones de nucleótidos monocatenarios, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Los ARNbc que tienen una proyección de al menos un nucleótido pueden tener propiedades inhibidoras inesperadamente superiores en relación con sus homólogos de extremos romos. Una proyección de nucleótido puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluyendo un desoxinucleótido/nucleósido. La/las proyección/proyecciones puede(n) estar en la hebra sentido, la hebra antisentido o cualquier combinación de las mismas. Además, el/los nucleótido(s) de una proyección puede(n) estar presente(s) en el extremo 5', extremo 3' o ambos extremos de una hebra o bien sentido o bien antisentido de un ARNbc.

Un ARNbc puede sintetizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica tal como se comenta adicionalmente a continuación, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.

Pueden prepararse compuestos de ARNi de la divulgación usando un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se preparan por separados las hebras individuales de la molécula de ARN bicatenario. Entonces, se aparean las hebras componentes. Las hebras individuales del compuesto de ARNip pueden prepararse usando síntesis orgánica en fase de disolución o en fase sólida o ambas. La síntesis orgánica ofrece la ventaja de que pueden prepararse fácilmente hebras de oligonucleótidos que comprenden nucleótidos no naturales o modificados. Los oligonucleótidos bicatenarios de la divulgación pueden prepararse usando síntesis orgánica en fase de disolución o en fase sólida o ambas.

En un aspecto, un ARNbc tal como se describe en el presente documento incluye al menos dos secuencias de nucleótidos, una secuencia sentido y una secuencia antisentido. La hebra sentido se selecciona del grupo de secuencias proporcionadas en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, y la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido se selecciona del grupo de secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10. En este aspecto, una de las dos secuencias es complementaria con la otra de las dos secuencias, siendo una de las secuencias sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión de un gen de ANGPTL3. Como tal, en este aspecto, un ARNbc incluirá dos oligonucleótidos, en donde un oligonucleótido se describe como la hebra sentido en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, y el segundo oligonucleótido se describe como la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10. En una implementación, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNbc están contenidas en oligonucleótidos separados. En otra implementación, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNbc están contenidas en un solo oligonucleótido.

El experto en la técnica es muy consciente de que los ARNbc que tienen una estructura de dúplex de entre aproximadamente 20 y 23 pares de bases, por ejemplo, 21 pares de bases, se han considerado como particularmente eficaces en la inducción de interferencia de ARN (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que estructuras de dúplex de ARN más cortas o más largas pueden ser también eficaces (Chu y Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). En la implementación descrita anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias e oligonucleótidos proporcionadas en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, los ARNbc descritos en el presente documento pueden incluir al menos una hebra de una longitud de, como mínimo, 21 nucleótidos. Puede esperarse razonablemente que dúplex más cortos que tienen una de las secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 menos solo unos cuantos nucleótidos en uno o ambos extremos, puedan ser eficaces de manera similar en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, se contemplan los ARNbc que tienen una secuencia de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos contiguos derivados de una de las secuencias de las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3 en no más de aproximadamente el 5, el 10, el 15, el 20, el 25 o el 30% de la inhibición de un ARNbc que comprende la secuencia completa.

Además, los ARN proporcionados en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 identifican un(os) sitio(s) en un transcrito de ANGPTL3 que es/son susceptible(s) a la escisión mediada por RISC. Como tal, la presente divulgación presenta además ARNi que se dirigen dentro de uno de estos sitios. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un ARNi se dirige dentro de un sitio particular de un transcrito de ARN si el ARNi promueve la escisión del transcrito en cualquier lugar dentro de ese sitio particular. Tal ARNi incluirá generalmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 acoplados a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen de ANGPTL3.

Mientras que una secuencia diana tiene generalmente 15-30 nucleótidos de longitud aproximadamente, existe una amplia variación en la idoneidad de secuencias particulares en este intervalo para dirigir la escisión de cualquier ARN diana dado. Varios paquetes de software y las directrices establecidas en el presente documento proporcionan orientación para la identificación de secuencias diana óptimas para cualquier diana génica dada, pero también puede adoptarse un enfoque empírico en el que una “ventana” o “máscara” de un tamaño dado (como ejemplo no limitativo, 21 nucleótidos) se coloca literal o figuradamente (incluyendo, por ejemplo, in silico) sobre la secuencia de ARN diana para identificar secuencias en el intervalo de tamaño que pueden servir como secuencias diana. Al mover la “ventana” de secuencias progresivamente un nucleótido en el sentido de 5' o en el sentido de 3' de una ubicación de secuencia diana inicial, puede identificarse la siguiente secuencia diana posible, hasta que se identifique el conjunto completo de posibles secuencias para cualquier tamaño diana dado. Este proceso, acoplado con la síntesis sistemática y las pruebas de las secuencias identificadas (usando ensayos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica) para identificar aquellas secuencias que funcionan de manera óptima, puede identificar aquellas secuencias de ARN que, cuando se seleccionan como diana con un agente de ARNi, median en la mejor inhibición de la expresión del gen diana. Por tanto, mientras que las secuencias identificadas, por ejemplo, en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10 representan secuencias diana eficaces, se contempla que puede lograrse una optimización adicional de la eficiencia de inhibición “moviendo la ventana” progresivamente un nucleótido en el sentido de 5' o en el sentido de 3' de las secuencias dadas para identificar secuencias con características de inhibición iguales o mejores.

Además, se contempla que, para cualquier secuencia identificada, por ejemplo, en las tablas 2, 3, 7, 8, 9 y 10, podría lograrse una optimización adicional añadiendo o eliminando sistemáticamente nucleótidos para generar secuencias más largas o más cortas y sometiendo a prueba esas secuencias generadas moviendo una ventana del tamaño más largo o más corto hacia arriba o hacia abajo del ARN diana desde ese punto. De nuevo, el acoplamiento de este enfoque para generar nuevas dianas candidatas con las pruebas de la eficacia de los ARNi basados en esas secuencias diana en un ensayo de inhibición tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento puede conducir a mejoras adicionales en la eficiencia de la inhibición. Todavía adicionalmente, tales secuencias optimizadas pueden ajustarse mediante, por ejemplo, la introducción de nucleótidos modificados tal como se describe en el presente documento o tal como se conoce en la técnica, la adición o cambios en la proyección, u otras modificaciones tal como se conoce en la técnica y/o comentadas en el presente documento para optimizar adicionalmente la molécula (por ejemplo, aumentar la estabilidad sérica o la semivida circulante, aumentar la estabilidad térmica, mejorar el suministro transmembrana, seleccionar como diana una ubicación o tipo de célula particular, amentar la interacción con las enzimas de la ruta de silenciamiento, aumentar la liberación de los endosomas) como inhibidor de la expresión.

Un ARNi tal como se describe en el presente documento puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. En una implementación, un ARNi tal como se describe en el presente documento contiene no más de 3 apareamientos erróneos. Si la hebra antisentido del ARNi contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es preferible que el área de apareamiento erróneo no esté ubicada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNi contiene apareamientos erróneos con la secuencia diana, es preferible que el apareamiento erróneo quede restringido a los últimos 5 nucleótidos desde o bien el extremo 5' o bien el extremo 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para un agente de ARNi de 23 nucleótidos, la hebra que es complementaria a una región de un gen ANGP^{t l}3, generalmente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en el presente documento o los métodos conocidos en la técnica pueden usarse para determinar si un ARNi que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz en la inhibición de la expresión de un gen de ANGPTL3. La consideración de la eficacia de los ARNi con apareamientos erróneos en la inhibición de la expresión de un gen de ANGPTL3 es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en un gen de ANGPTL3 tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

III. ARNi modificados

En una implementación, el ARN de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, se modifica químicamente para mejorar la estabilidad u otras características beneficiosas. Los ácidos nucleicos presentados en la divulgación pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en “Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE. UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones en los extremos, por ejemplo, modificaciones en el extremo 5' (fosforilación, conjugación, uniones invertidas) o modificaciones en el extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, uniones invertidas, etc.); modificaciones de la base, por ejemplo, reemplazo con bases estabilizantes, bases desestabilizantes o bases que se aparean con un repertorio más amplio de parejas, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones del azúcar (por ejemplo, en la posición 2' o en la posición 4') o reemplazo del azúcar; y/o modificaciones de la estructura principal, incluyendo la modificación o el reemplazo de las uniones fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en las implementaciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, ARN que contienen estructuras principales modificadas o uniones internucleosídicas no naturales. Los ARN que tienen estructuras principales modificadas incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal. Para los fines de esta memoria descriptiva, y tal como a veces se hace referencia en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica también pueden considerarse oligonucleósidos. En algunas realizaciones, un ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su estructura principal internucleosídica.

Las estructuras principales de ARN modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo 3'-alquilenfosfonatos y quirales fosfonatos, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen uniones 3'-5' normales, análogos unidos en 2'-5' de estos y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósido están unidos de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de las uniones que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6. 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; y la patente estadounidense RE39464.

Las estructuras principales de ARN modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras principales que están formadas por uniones internucleosídicas de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y uniones intenucleosídicas de alquilo o cicloalquilo, o una o más uniones internucleosídicas heteroatómicas o heterocíclicas de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen uniones morfolino (formadas en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.

Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

En otras implementaciones, se contemplan miméticos de ARN adecuados para su uso en ARNi, en los que tanto el azúcar como la unión internucleosídica, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótido se reemplazan con grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para su hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico de este tipo, un mimético de ARN que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos de PNA, la estructura principal de azúcar de un ARN se reemplaza con una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción de amida de la estructura principal. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se describen compuestos de PNA adicionales adecuados para su uso en los ARNi de la divulgación en, por ejemplo, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Algunas implementaciones también presentadas en el presente documento incluyen ARN con estructuras principales de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos, y en particular --CH2-NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conocida como estructura principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- y --N(CH3)-CH2--CH2--[en la que la estructura principal de fosfodiéster nativa se representa como --O--P--O-CH2--] de la patente estadounidense n.° 5.489.677 a la que se hizo referencia anteriormente, y las estructuras principales de amida de la patente estadounidense n.° 5.602.240 a la que se hizo referencia anteriormente. En algunas implementaciones, los ARN caracterizados en el presente documento tienen estructuras principales de morfolino de la patente estadounidense n.° 5.034.506 a la que se hizo referencia anteriormente.

Los ARN modificados pueden contener también uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, por ejemplo, ARNbc, presentados en el presente documento, pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo puede ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Las modificaciones a modo de ejemplo incluyen O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(cH2)nON[(CH2)nCH3)]2, en donde n y m son de desde 1 hasta aproximadamente 10. En otras implementaciones, los ARNbc incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNi, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas implementaciones, la modificación incluye un grupo 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxilo. Otra modificación a modo de ejemplo es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos a continuación en el presente documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el ARN de un ARNi, en particular la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los ARNbc unidos en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcar, tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, algunas de los cuales son de propiedad común con la presente solicitud.

Un ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente “base”). Tal como se usa en el presente documento, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 3.687.808, las divulgadas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, las divulgadas por Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, edición internacional, 30:613, y las divulgadas por Sanghvi, Y S., capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos presentados en el presente documento. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico entre 0,6 y 1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases a modo de ejemplo, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo.

Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os mencionadas anteriormente 3.687.808. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121.

5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088.

El ARN de un ARNi también puede modificarse para que incluya uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en el que el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura “bloquea” eficazmente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha mostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip aumenta la estabilidad del ARNip en el suero y reduce los efectos inespecíficos (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Cane Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12): 3185-3193).

Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de nucleótidos de ácido nucleico bloqueado incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: patentes estadounidenses n.os 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845.

Las modificaciones potencialmente estabilizantes en los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoiluridina-3''-fosfato, base invertida dT(idT) y otros. La divulgación de esta modificación puede encontrarse en la publicación PCT n.° WO 2011/005861.

IV. ARNi conjugados con ligandos

Otra modificación del ARN de un ARNi de la divulgación implica unir químicamente al ARN uno o más ligandos, restos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular del ARNi. Tales restos incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060), un tioéter, por ejemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973), o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264:229-237) o un resto de octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937).

En una implementación, un ligando altera la distribución, el direccionamiento o la vida útil de un agente de ARNi en el que se incorpora. En implementaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad mejorada por una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u orgánico, tejido, órgano o región del cuerpo, como, por ejemplo, en comparación con una especie ausente tal como un ligando. Los ligandos preferidos no tomarán parte en el apareamiento del dúplex en un ácido nucleico de dúplex.

Los ligandos pueden incluir una sustancia que se produce de manera natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica bovina (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando puede ser también una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido de hélice alfa.

Los ligandos pueden incluir también grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento a células o tejidos, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificado tal como una célula renal. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, hidrato de carbono de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente de N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido de RGD o mimético de péptido de RGD.

Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), agentes reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (por ejemplo, EDTA), moléculas lipófilas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantanoacético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido de Antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores del transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupaciones de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificado, tal como una célula hepática. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente de N-acetil-glucosamina o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa o un activador de NF- ^k B.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.

En algunas implementaciones, un ligando unido a un ARNi tal como se describe en el presente documento actúa como modulador farmacocinético (modulador PK). Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden varias uniones fosforotioato se unen a la proteína sérica, por lo que oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples uniones fosforotioato en la estructura principal, también son susceptibles a la presente divulgación como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores de PK). Además, aptámeros que se unen a componentes séricos (por ejemplo, proteínas séricas) también son adecuados para su uso como ligandos moduladores PK en las implementaciones descritas en el presente documento.

Los oligonucleótidos conjugados con ligando de la divulgación pueden sintetizarse mediante el uso de un oligonucleótido que lleva una funcionalidad reactiva colgante, tal como la derivada de la unión de una molécula de unión sobre el oligonucleótido (descrito a continuación). Este oligonucleótido reactivo puede hacerse reaccionar directamente con ligandos disponibles comercialmente, ligandos que se sintetizan portando cualquiera de una variedad de grupos protectores, o ligandos que tienen un resto de unión unido a los mismos.

Los oligonucleótidos usados en los conjugados de la presente divulgación pueden prepararse de manera conveniente y rutinaria a través de la conocida técnica de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis lo comercializan varios vendedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica puede emplearse adicional o alternativamente. También se conoce el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. En los oligonucleótidos conjugados con ligando y nucleósidos unidos específicos de secuencia que portan moléculas de ligando de la presente divulgación, los oligonucleótidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN adecuado utilizando precursores de nucleótidos o nucleósidos convencionales, o precursores de conjugados de nucleótidos o nucleósidos que ya portan el resto de unión, precursores de ligando-nucleótido o conjugados de nucleósido que ya portan la molécula de ligando o bloques de construcción que portan ligandos distintos de nucleósidos.

Cuando se usan precursores de conjugados de nucleótidos que ya portan un resto de unión, la síntesis de los nucleósidos unidos específicos de secuencia se completa normalmente, y la molécula de ligando reacciona luego con el resto de unión para formar el oligonucleótido conjugado con ligando. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la presente divulgaciónse se sintetizan mediante un sintetizador automatizado que usa fosforamiditas derivadas de conjugados de ligando-nucleósido además de las fosforamiditas convencionales y fosforamiditas no convencionales que están disponibles comercialmente y se usan de manera rutinaria en la síntesis de oligonucleótidos.

A. Conjugados de lípidos

En una implementación, el ligando o conjugado es un lípido o una molécula basada en lípidos. Un lípido o molécula basada en lípidos de este tipo se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo, un tejido diana distinto de riñón del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluyendo células parenquimatosas del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden usarse como ligandos. Por ejemplo, puede usarse neproxina o aspirina. Un lípido o un ligando basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte a una célula o membrana celular diana, y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.

Puede usarse un ligando basado en lípidos para inhibir, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o ligando basado en lípidos que se une a la HSA más fuertemente será menos probable que se dirija al riñón y, por tanto, será menos probable que se aclare del cuerpo. Puede usarse un lípido o ligando basado en lípidos que se une a HSA menos fuertemente para dirigir el conjugado al riñón.

En una implementación preferida, el ligando basado en lípidos se une a HSA. Preferiblemente, se une a HSA con una afinidad suficiente para que el conjugado se distribuya preferiblemente a un tejido distinto del riñón. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión de HSA-ligando no pueda revertirse.

En otra implementación preferida, el ligando basado en lípidos se une a HSA débilmente o no se une en absoluto, de manera que el conjugado se distribuirá preferiblemente al riñón. También pueden usarse otros restos que seleccionan como diana células renales en lugar o además del ligando basado en lípidos.

En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que se capta por una célula diana, por ejemplo, una célula en proliferación. Estas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Las vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitamina B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por células diana tales como células hepáticas. También se incluyen HSA y lipoproteínas de baja densidad (LDL).

B. Agentes de permeación celular

En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente a modo de ejemplo es un péptido tal como tat o antennopedia. Si el agente es un péptido, puede estar modificado, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros, uniones no peptídicas o pseudopeptídicas y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferentemente un agente alfa-helicoidal, que tiene preferiblemente una fase lipófila y otra lipófoba.

El ligando puede ser un péptido o un peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en el presente documento oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. La unión de péptidos y peptidomiméticos a agentes de ARNi puede afectar a la distribución farmacocinética del ARNi, tal como mejorando el reconocimiento y la absorción celulares. El resto peptídico o peptidomimético puede tener aproximadamente 5-50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.

Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación a la membrana hidrófoba (MTS). Un péptido que contiene MTS hidrófoba a modo de ejemplo es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos A^aVAL^lP^aVL^lA^lLAP (SEQ ID NO: 13). Un análogo de RFGF (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de “suministro”, que puede transportar moléculas polares grandes que incluyen péptidos, oligonucleótidos y proteína a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que secuencias de la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRRPQ (SEQ ID NO: 11) y la proteína de Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede codificarse por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación en fagos, o una biblioteca combinatoria de una perla, un compuesto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Los ejemplos de un péptido o peptidomimético anclado a un agente de ARNbc por medio de una unidad de monómero incorporada para fines de direccionamiento celular es un péptido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), o mimético de RGD. La longitud de un resto peptídico puede variar desde aproximadamente 5 aminoácidos hasta aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales. Puede utilizarse cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación.

Un péptido de RGD para su uso en las composiciones y los métodos de la divulgación puede ser lineal o cíclico, y puede modificarse, por ejemplo, glicosilarse o metilarse, para facilitar el direccionamiento a tejido(s) específico(s). Los péptidos y peptidiomiméticos que contienen RGD pueden incluir D-aminoácidos, así como miméticos de RGD sintéticos. Además de RGD, pueden usarse otros restos que seleccionen como diana el ligando de integrina. Los conjugados preferidos de este ligando seleccionan como diana PECAM-1 o VEGF.

Un “péptido de permeación celular” es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido que permea células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropin PI), un péptido que contiene enlaces disulfuro (por ejemplo, a-defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que se deriva del dominio del péptido de fusión de gp41 del VIH-1 y el NLS del antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).

C. Conjugados de hidratos de carbono

En algunas implementaciones de las composiciones y los métodos de la divulgación, un oligonucleótido de ARNi comprende además un hidrato de carbono. Los ARNi conjugados con hidratos de carbono son ventajosos para el suministro in vivo de ácidos nucleicos, así como composiciones adecuadas para el uso terapéutico in vivo, tal como se describe en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “hidrato de carbono” se refiere a un compuesto que es un hidrato de carbono per se constituido por una o más unidades de monosacáridos que tienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte del mismo un resto de hidrato de carbono constituido por una o más unidades de monosacárido, teniendo cada una de las cuales al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los hidratos de carbono representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen desde aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades de monosacáridos) y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas de polisacáridos. Los monosacáridos específicos incluyen azúcares C5 y por encima (por ejemplo, azúcares C5, C6, C7 o C8); los di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacáridos (por ejemplo, C5, C6, C7 o C8).

En una implementación, un conjugado de hidrato de carbono para su uso en las composiciones y los métodos de la divulgación es un monosacárido. En una implementación, el monosacárido es una N-acetilgalactosamina, tal como

Fórmula II.

En otra implementación, un conjugado de hidrato de carbono para su uso en las composiciones y los métodos de la divulgación se selecciona del grupo que consiste en:

,

la IX,

,

rmua ,

rmua ,

Fórmula XXII.

Otro conjugado de hidrato de carbono representativo para su uso en las implementaciones descritas en el presente documento incluye, pero no se limita a,

(Fórmula XXIII), cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es un hidrógeno.

En algunas implementaciones, el conjugado de hidrato de carbono comprende además uno o más ligandos adicionales tal como se describió anteriormente, tal como, pero sin limitarse a, un modulador PK y/o un péptido de permeación celular.

D. Enlazadores

En algunas implementaciones, el conjugado o ligando descrito en el presente documento puede unirse a un oligonucleótido de ARNi con diversos enlazadores que pueden ser escindibles o no escindibles.

El término “enlazador” o “grupo de unión” significa un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto, por ejemplo, une covalentemente dos partes de un compuesto. Los enlazadores comprenden normalmente un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH o una cadena de átomos, tales como, pero sin limitarse a, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilheterociclilalquinilo, alquenilheterociclilalquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilheteroarilo, que uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocíclico sustituido o no sustituido; en donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En una realización, el enlazador tiene entre aproximadamente 1 y 24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17 o 8-16 átomos.

Un grupo de unión escindible es uno que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que al entrar en una célula diana, se escinde liberando las dos partes que el enlazador mantiene juntas. En una realización preferida, el grupo de unión escindible se escinde al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o más, o al menos aproximadamente 100 veces más rápido en una célula diana o en una primera condición de referencia (que puede seleccionarse, por ejemplo, para imitar o representar condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o en una segunda condición de referencia (que puede seleccionarse, por ejemplo, para imitar o representar las condiciones que se encuentran en la sangre o el suero). Los grupos de unión escindibles son susceptibles a agentes de escisión, por ejemplo, pH, potencial redox o presencia de moléculas degradantes. Generalmente, los agentes de escisión son más prevalentes o se encuentran a niveles o actividades superiores dentro de las células que en el suero o la sangre. Los ejemplos de tales agentes degradantes incluyen: agentes redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluyendo, por ejemplo, enzimas oxidativas o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo de unión escindible redox por reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un entorno ácido, por ejemplo, aquellos que dan como resultado un pH de cinco o inferior; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de unión escindible por ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas de sustrato) y fosfatasas.

Un grupo de unión escindible, tal como un enlace disulfuro, puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es de 7,4, mientras que el pH intracelular promedio es ligeramente inferior, oscilando entre 7,1 y 7,3. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5,5 a 6,0, y los lisosomas tienen un pH incluso más ácido a alrededor de 5,0. Algunos enlazadores tendrán un grupo de unión escindible que se escinde a un pH preferido, liberando de ese modo un lípido catiónico del ligando dentro de la célula o en el compartimento deseado de la célula.

Un enlazador puede incluir un grupo de unión escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de unión escindible incorporado en un enlazador puede depender de la célula que va a seleccionarse como diana. Por ejemplo, un ligando dirigido al hígado puede unirse a un lípido catiónico a través de un enlazador que incluye un grupo éster. Las células hepáticas son ricas en esterasas y, por tanto, el enlazador se escindirá más eficientemente en las células hepáticas que en tipos de células que no son ricas en esterasas. Otros tipos de células ricas en esterasas incluyen células del pulmón, la corteza renal y los testículos.

Pueden usarse enlazadores que contienen enlaces peptídicos cuando se seleccionan como diana tipos de células ricas en peptidasas, tales como células hepáticas y sinoviocitos.

En general, la idoneidad de un grupo de unión escindible candidato puede evaluarse sometiendo a prueba la capacidad de un agente degradante (o condición) para escindir el grupo de unión candidato. También será deseable someter a prueba también la capacidad del grupo de unión escindible candidato para resistir la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no diana. Por tanto, puede determinarse la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona para que sea indicativa de escisión en una célula diana y la segunda se selecciona para que sea indicativa de escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo, sangre o suero. Las evaluaciones pueden llevarse a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivo celular, en cultivo de órganos o tejidos, o en animales completos. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libres de células o de cultivo y confirmar mediante evaluaciones adicionales en animales completos. En realizaciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre o el suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares).

i. Grupos de unión escindibles redox

En una implementación, un grupo de unión escindible es un grupo de unión escindible redox que se escinde tras la reducción o la oxidación. Un ejemplo de grupo de unión escindible por reducción es un grupo de unión de disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo de unión escindible candidato es un “grupo de unión escindible por reducción” adecuado o, por ejemplo, es adecuado para su uso con un resto de ARNi particular y un agente de direccionamiento particular, pueden consultarse los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un candidato puede evaluarse mediante incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor usando reactivos conocidos en la técnica, que imitan la velocidad de escisión que se observaría en una célula, por ejemplo, una celda diana. Los candidatos también pueden evaluarse en condiciones que se seleccionan para imitar las condiciones en sangre o suero. En uno, los compuestos candidatos se escinden como máximo en un 10% en la sangre. En otras realizaciones, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares). La velocidad de escisión de los compuestos candidatos puede determinarse usando ensayos de cinética enzimática convencionales en condiciones elegidas para imitar los medios intracelulares y compararse con las condiciones elegidas para imitar los medios extracelulares.

ii. Grupos de unión escindibles basados en fosfato

En otra implementación, un enlazador escindible comprende un grupo de unión escindible basado en fosfato. Un grupo de unión escindible basado en fosfato se escinde por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en células son enzimas tales como fosfatasas en células. Ejemplos de grupos de unión basados en fosfato son -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -OP(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O -, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Realizaciones preferidas son -O-P(O)(OH)-O-, -OP(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O- , -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Una implementación preferida es -OP(O)(OH)-O-. Estos candidatos pueden evaluarse usando métodos análogos a los descritos anteriormente.

iii. Grupos de unión escindibles por ácido

En otra implementación, un enlazador escindible comprende un grupo de unión escindible por ácido. Un grupo de unión escindible por ácido es un grupo de unión que se escinde en condiciones ácidas. En implementaciones preferidas, los grupos de unión escindibles por ácido se escinden en un entorno ácido con un pH de aproximadamente 6,5 o inferior (por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 o inferior) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, orgánulos específicos de pH bajo, tales como endosomas y lisosomas, pueden proporcionar un entorno de escisión para los grupos de unión escindibles por ácido. Los ejemplos de grupos de unión escindibles por ácido incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles por ácido pueden tener la fórmula general -C=NN-, C(O)O u -OC(O). Una realización preferida es cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, grupo alquilo sustituido o grupo alquilo terciario tal como dimetilpentilo o t-butilo. Estos candidatos pueden evaluarse usando métodos análogos a los descritos anteriormente.

iv. Grupos de unión basados en éster

En otra implementación, un enlazador escindible comprende un grupo de unión escindible basado en éster. Un grupo de unión escindible basado en éster se escinde por enzimas tales como esterasas y amidasas en células. Los ejemplos de grupos de unión escindibles basados en éster incluyen, pero no se limitan a, ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos de unión escindibles de éster tienen la fórmula general -C(O)O- u -OC(O)-. Estos candidatos pueden evaluarse usando métodos análogos a los descritos anteriormente.

v. Grupos de escisión basados en péptidos

En aún otra implementación, un enlazador escindible comprende un grupo de unión escindible basado en péptidos. Un grupo de unión escindible basado en péptidos se escinde por enzimas tales como peptidasas y proteasas en células. Grupos de unión escindibles basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para producir oligopéptidos (por ejemplo, dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos. Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida puede formarse entre cualquier alquileno, alquenileno o alquineleno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida formado entre aminoácidos para producir péptidos y proteínas. El grupo de escisión basado en péptidos generalmente se limita al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que producen péptidos y proteínas y no incluye el grupo funcional amida completo. Los grupos de unión escindibles basados en péptidos tienen la fórmula general -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos pueden evaluarse usando métodos análogos a los descritos anteriormente.

En una implementación, un ARNi de la divulgación se conjuga con un hidrato de carbono a través de un enlazador. Los ejemplos no limitativos de conjugados de hidratos de carbono de ARNi con enlazadores de las composiciones y los métodos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a,

(Fórmula XXIV),

(Fórmula XXVII),

(Fórmula XXVIII),

(Fórmula XXX), cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es un hidrógeno.

En ciertas implementaciones de las composiciones y los métodos, un ligando es uno o más derivados de GalNAc (N-acetilgalactosamina) unidos a través de un enlazador ramificado bivalente o trivalente.

En una implementación, un ARNbc de la divulgación se conjuga con un enlazador ramificado bivalente o trivalente seleccionado del grupo de estructuras mostradas en cualquiera de las fórmulas (XXXI) -(XXXIV):

Fórmula XXXI Fórmula XXXII

Fórmula XXXIII Fórmula XXXIV

en las que:

q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada aparición 0-20 y en las que la unidad de repetición puede ser igual o diferente;

p2A, p2B, p3A, p3B, p4A, p4B, p5A, p5B, p5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5c están cada uno independientemente para cada aparición ausentes, son C^o, NH, O, S, ^oC(O), N^hC(O), C^h2, ^cH2NH o CH2O;

Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C están independientemente para cada aparición ausentes, son alquileno, alquileno sustituido en el que uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por uno o más de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R”), C=C o C(O);

R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5c están cada uno independientemente para cada aparición ausentes, son NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO,

o heterociclilo;

L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5c representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada aparición un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o cadena lateral de aminoácido. Derivados de GalNAc de conjugación trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de ARNi para inhibir la expresión de un gen diana, tales como los de fórmula (XXXV):

Fórmula XXXV

en la que L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, tal como un derivado de GalNAc.

Los ejemplos de grupos enlazadores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que se conjugan con derivados de GalNAc incluyen, pero no se limitan a, las estructuras mencionadas anteriormente como fórmulas II_VII, XI, X y XIII.

Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de conjugados de ARN incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802; 5.138.045 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439 5.578.718 5.608.046; 4.587.044 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582 4.958.013; 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830; 5.112.963 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098 5.371.241. 5.391.723 5.416.203. 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785; 5.565.552 5.567.810 5.574.142 5.585.481; 5.587.371 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931;6.900.297; 7.037.646; 8.1

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente y, de hecho, puede incorporarse más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNi. La presente divulgación también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.

Compuestos de ARNi “quiméricos” o “quimeras”, en el contexto de esta divulgación, son compuestos de ARNi, preferiblemente ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNi contienen normalmente al menos una región en la que el ARN está modificado para conferir al ARNi una resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, una captación celular aumentada y/o una afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNi puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, por tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, mejorando en gran medida de ese modo la eficiencia de la inhibición por ARNi de la expresión génica. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con ARNi más cortos cuando se usan ARNbc quiméricos, en comparación con desoxi ARNbc de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN puede detectarse rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el ARN de un ARNi puede modificarse mediante un grupo distinto de ligando. Varias moléculas distintas de ligando se han conjugado con ARNi con el fin de mejorar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNi, y están disponibles procedimientos para realizar tales conjugaciones en la bibliografía científica. Tales restos distintos de ligando han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FE^bS Lett., 1990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969) o ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229) o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Anteriormente se han enumerado patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de ARN. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de ARN que portan un enlazador de amino en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino se hace reaccionar entonces con la molécula que está conjugándose usando reactivos de activación o acoplamiento apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse o bien con el ARN todavía unido al soporte sólido o bien tras la escisión del ARN, en fase de disolución. La purificación del conjugado de ARN mediante HPLC proporciona normalmente el conjugado puro.

IV. Suministro de un ARNi

El suministro de un ARNi de la divulgación a una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano (por ejemplo, un sujeto que lo necesita, tal como un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico) puede lograrse de varios modos diferentes. Por ejemplo, el suministro puede realizarse poniendo en contacto una célula con un ARNi de la divulgación o bien in vitro o bien in vivo. El suministro in vivo puede realizarse también directamente administrando una composición que comprende un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, a un sujeto. Alternativamente, el suministro in vivo puede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se comentan adicionalmente a continuación.

En general, puede adaptarse cualquier método de suministro de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) para su uso con un ARNi de la divulgación (véase, por ejemplo, Akhtar S. y Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 y el documento WO94/02595). Para el suministro in vivo, los factores a considerar con el fin de suministrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, la estabilidad biológica de la molécula suministrada, la prevención de efectos no específicos y la acumulación de la molécula suministrada en el tejido diana. Los efectos no específicos de un ARNi pueden minimizarse mediante administración local, por ejemplo, mediante inyección o implantación directa en un tejido o la administración por vía tópica de la preparación. La administración local a un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a los tejidos sistémicos que, de lo contrario, pueden verse dañados por el agente o que pueden degradar el agente, y permite que se administre una dosis total inferior de la molécula de ARNi. Varios estudios han mostrado la desactivación satisfactoria de productos génicos cuando se administra localmente un ARNi. Por ejemplo, se mostró que tanto el suministro intraocular de un ARNbc de VEGF mediante inyección intravítrea en monos cynomolgus (Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24: 132 138) como inyecciones subretinianas en ratones (Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9: 210-216) prevenían la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones reduce el volumen tumoral (Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther.

11: 267-274) y puede prolongar la supervivencia de ratones que portan tumores (Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther.

14: 343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). La interferencia de ^aRⁿtambién ha tenido éxito con el suministro local al SNC mediante inyección directa (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12: 59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3: 18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129: 521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) y a los pulmones mediante administración intranasal (Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administrar un ARNi de manera sistémica para el tratamiento de una enfermedad, el ARN puede modificarse o suministrarse alternativamente usando un sistema de suministro de fármacos; ambos métodos actúan previniendo la degradación rápida del ARNbc por endo- y exo-nucleasas in vivo. La modificación del ARN o el portador farmacéutico también puede permitir el direccionamiento de la composición de ARNi al tejido diana y evitar efectos inespecíficos no deseados. Las moléculas de ARNi pueden modificarse mediante conjugación química a grupos lipófilos tales como colesterol para mejorar la captación celular e impedir la degradación. Por ejemplo, un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipófilo se inyectó de manera sistémica en ratones y dio como resultado la desactivación del ARNm de apoB en tanto el hígado como el yeyuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432: 173-178). Se ha mostrado que la conjugación de un ARNi a un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media en la regresión tumoral en un modelo de ratón de cáncer de próstata (McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). En una implementación alternativa, el ARNi puede suministrarse usando sistemas de suministro de fármacos tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de suministro catiónico. Los sistemas de suministro catiónicos cargados positivamente facilitan la unión de una molécula de ARNi (cargada negativamente) y también mejoran las interacciones en la membrana celular cargada negativamente permitiendo una captación eficaz de un ARNi por la célula. Los lípidos, dendrímeros o polímeros catiónicos o bien pueden unirse a un ARNi, o bien inducirse para que formen una vesícula o micela (véase, por ejemplo, Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116) que encierra un ARNi. La formación de vesículas o micelas impide además la degradación del ARNi cuando se administra de manera sistémica. Los métodos para preparar y administrar complejos de ARNi catiónicos se encuentram perfectamente dentro de las capacidades de un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327: 761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1291-1300; Arnold, AS et al., (2007) J. Hypertens. 25: 197-205). Algunos ejemplos no limitativos de sistemas de suministro de fármacos útiles para el suministro sistémico de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), citado anteriormente; Verma, UN. et al., (2003), citado anteriormente), Oligofectamine, “partículas lipídicas de ácido nucleico sólido” (Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441: 111-114), cardiolipina (Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321-328; Pal, A. et al., (2005) IntJ. Oncol. 26: 1087 1091), polietilenimina (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Epub del 16 de agosto antes de la impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos de Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472-487) y poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res.

16:1799-1804). En algunas implementaciones, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para la administración sistémica. Pueden encontrarse métodos para la administración y composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas en la patente estadounidense n.° 7.427.605.

A. ARNi codificados por vectores

El ARNi que selecciona como diana el gen de ANGPTL3 puede expresarse a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12: 5-10; Skillern, A., et al., publicación PCT internacional n.° Wo 00/22113, Conrad, publicación PCT internacional n.° WO 00/22114 y Conrad, patente estadounidense n.° 6.054.299). La expresión puede ser transitoria (del orden de horas a semanas) o sostenidas (de semanas a meses o más prolongada), dependiendo del constructo específico usado y el tipo de célula o tejido diana. Estos transgenes pueden introducirse como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede ser un vector integrador o no integrador. El transgén puede construirse también para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1292).

La hebra o hebras individuales de un ARNi pueden transcribirse a partir de un promotor en un vector de expresión. Cuando van a expresarse dos hebras separadas para generar, por ejemplo, un ARNbc, pueden introducirse conjuntamente dos vectores de expresión separados (por ejemplo, por transfección o infección) en una célula diana. Alternativamente, cada hebra individual de un ARNbc puede transcribirse mediante promotores, ambos ubicados en el mismo plásmido de expresión. En una implementación, se expresa un ARNbc como polinucleótidos repetidos invertidos unidos por una secuencia de polinucleótido enlazador de manera que el ARNbc tiene una estructura de tallo y bucle.

Los vectores de expresión de ARNi son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden usarse vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferiblemente aquellos compatibles con células de vertebrados, para producir constructos recombinantes para la expresión de un ARNi tal como se describe en el presente documento. En la técnica se conocen bien vectores de expresión de células eucariotas y están disponibles de varias fuentes comerciales. Normalmente, tales vectores se proporcionan conteniendo sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. El suministro de vectores que expresan ARNi puede ser sistémico, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana explantadas del paciente seguido por reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.

Los plásmidos de expresión de ARNi pueden transfectarse en células diana como un complejo con portadores de lípidos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamine) o portadores basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). En el presente documento también se contemplan múltiples transfecciones de lípidos para desactivaciones mediadas por ARNi que seleccionan como diana diferentes regiones de un ARN diana a lo largo de un período de una semana o más. La introducción satisfactoria de vectores en células huésped puede monitorizarse usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria puede señalarse con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP). Puede garantizarse la transfección estable de células ex vivo usando marcadores que proporcionan a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a higromicina B.

Los sistemas de vectores virales que pueden utilizarse con los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, incluyendo, pero sin limitarse a, vectores lentivirales, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores de virus de polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores de virus de la viruela como un ortopox, por ejemplo, vectores del virus vaccinia o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de adyuvante o sin virulencia. Los virus con replicación defectuosa también pueden ser ventajosos. Diferentes vectores se incorporarán o no al genoma de las células. Los constructos pueden incluir secuencias virales para la transfección, si se desea. Alternativamente, el constructo puede incorporarse en vectores capaces de replicación episomal, por ejemplo, vectores de VEP y VEB. Los constructos para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para garantizar la expresión del ARNi en las células diana. Otros aspectos a considerar para los vectores y constructos se describen adicionalmente a continuación.

Los vectores útiles para el suministro de un ARNi incluirán elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNi en la célula o tejido diana deseado. Los elementos reguladores pueden elegirse para proporcionar una expresión o bien constitutiva o bien regulada/inducible.

La expresión del ARNi puede regularse con precisión, por ejemplo, mediante el uso de una secuencia reguladora inducible que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, los niveles circulantes de glucosa o las hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-Dl tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la técnica podría elegir la secuencia reguladora/promotora adecuada basándose en el uso previsto del transgén de ARNi.

Pueden usarse vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un ARNi. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véase Miller et al., (1993) Met. Enzimol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para un ARNi se clonan en uno o más vectores, lo que facilita el suministro del ácido nucleico a un paciente. Pueden encontrarse más detalles sobre los vectores retrovirales, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen de mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem et al., (1994) Blood 83: 1467-1473; Salmons y Gunzberg, (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; y Grossman y Wilson, (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114. Los vectores lentivirales contemplados para su uso incluyen, por ejemplo, los vectores basados en VIH descritos en las patentes estadounidenses n.os 6.143.520; 5.665.557; y 5.981.276.

También se contemplan adenovirus para su uso en el suministro de los ARNi de la divulgación. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, por ejemplo, para suministrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de manera natural los epitelios respiratorios, donde provocan una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 499-503 presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., (1994) Human Gene Therapy 5: 3-10 demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Pueden encontrarse otros casos del uso de adenovirus en terapia génica en Rosenfeld et al., (1991) Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143 155; Mastrangeli et al., (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234; la publicación PCT WO94/12649; y Wang et al., (1995) Gene Therapy 2: 775-783. Se describen un vector de AV adecuado para expresar un ARNi presentado en la divulgación, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector a las células diana en XiaH et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

También pueden usarse vectores de virus adenoasociados (VAA) para suministrar un ARNi de la divulgación (Walsh et al., (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; patente estadounidense n.° 5.436.146). En una implementación, el ARNi puede expresarse como dos moléculas de ARN monocatenario complementarias, separadas a partir de un vector de VAA recombinante que tiene, por ejemplo, o bien los promotores de ARN U6 o H1, o bien el promotor de citomegalovirus (CMV). Se describen vectores de VAA adecuados para expresar el ARNbc presentado en la divulgación, métodos para construir el vector de AV recombinante y métodos para suministrar los vectores a las células diana en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher KJ et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; la patente estadounidense n.° 5.252.479; la patente estadounidense n.° 5.139.941; la solicitud de patente internacional n.° WO 94/13788; y la solicitud de patente internacional n.° WO 93/24641.

Otro vector viral adecuado para el suministro de un ARNi de la invención es un virus de la viruela, tal como un virus vaccinia, por ejemplo, vaccinia atenuado tal como el virus Ankara modificado (MVA) o NYVAC, un avipox, tal como viruela aviar o viruela del canario.

El tropismo de los vectores virales puede modificarse pseudotipificando los vectores con proteínas de la envuelta u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según sea apropiado. Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden seudotipificarse con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Puede hacerse que los vectores de VAA se dirijan a diferentes células modificando por ingeniería genética los vectores para que expresen diferentes serotipos de proteínas de la cápside; véase, por ejemplo, Rabinowitz JE et al. (2002), J Virol 76:791-801.

La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de suministro génico. Alternativamente, cuando el vector de suministro génico completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de gen.

V. Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los ARNi de la divulgación. En una implementación, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi, tal como se describe en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen de ANGPTL3, por ejemplo, un trastorno del metabolismo lipídico, tal como hipertrigliceridemia.

Tales composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de suministro. Un ejemplo son composiciones que se formulan para la administración sistémica por medio de suministro parenteral, por ejemplo, mediante suministro intravenoso (IV) o subcutáneo. Otro ejemplo son composiciones que se formulan para suministro directo al hígado, por ejemplo, mediante infusión en el hígado, tal como mediante infusión con bomba continua.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3. En general, una dosis adecuada de un ARNi de la divulgación estará en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 200,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, generalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg por una sola dosis.

Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 o aproximadamente 10 mg/kg.

En otra realización, el ARNbc se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg.

Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 o aproximadamente 10 mg/kg.

En otra realización, el ARNbc se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg.

Por ejemplo, puede administrarse a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNi, tal como aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg.

La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNi puede administrarse como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso mediante infusión continua o suministro a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNi contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño para lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede combinarse para el suministro a lo largo de varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida del ARNi a lo largo de un período de varios días. En la técnica se conocen bien formulaciones de liberación sostenida y son particularmente útiles para el suministro de agentes en un sitio particular, tal como podría usarse con los agentes de la presente divulgación. En esta implementación, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.

El efecto de una sola dosis sobre los niveles de ANGPTL3 puede ser duradero, de modo que las dosis posteriores se administren en intervalos de no más de 3, 4 o 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas.

El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y el momento requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos. Pueden hacerse estimaciones de semividas in vivo y dosificaciones eficaces para los ARNi individuales abarcados por la divulgación usando metodologías convencionales o basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, tal como se describe en otra parte en el presente documento.

Los avances en la genética del ratón han generado varios modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como trastornos del metabolismo lipídico que se beneficiarían de la reducción de la expresión de ANGPTL3. Tales modelos pueden usarse para pruebas in vivo de ARNi, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz. En la técnica se conocen modelos de ratón adecuados e incluyen, por ejemplo, un ratón obeso (ob/ob) que contiene una mutación en el gen obeso (ob) (Wiegman et al., (2003) Diabetes, 52:1081-1089); un ratón que contiene una inactivación homocigota de un receptor de LDL (ratón LDLR -/-); Ishibashi et al., (1993) J. Clin. Invest. 92(2):883-893); modelo de ratón de aterosclerosis inducida por la dieta (Ishida et al., (1991) J. Lipid. Res., 32:559-568); y modelo de ratón con inactivación de lipoproteína lipasa heterocigota (Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest. 96(6): 2555-2568).

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (por ejemplo, mediante un parche transdérmico), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo, por medio de un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, mediante administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular.

El ARNi puede administrarse de manera que seleccione como diana un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi presentados en el presente documento están mezclados con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearolifosfatidilcolina), negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los ARNi presentados en el presente documento pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNi pueden complejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un éster alquílico C1-20 (por ejemplo, miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Se describen formulaciones tópicas en detalle en la patente estadounidense n.° 6.747.014.

A. Formulaciones de ARNi que comprenden conjuntos moleculares membranosos

Puede formularse un ARNi para su uso en las composiciones y los métodos de la divulgación para su suministro en un conjunto molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Tal como se usa en el presente documento, el término “liposoma” se refiere a una vesícula compuesta por lípidos anfífilos dispuestos en al menos una bicapa, por ejemplo, una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilaminares y multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición de ARNi. El material lipófilo aísla el interior acuoso de un exterior acuoso, que normalmente no incluye la composición de ARNi, aunque en algunos ejemplos puede incluirla. Los liposomas son útiles para la transferencia y el suministro de principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, la bicapa liposomal se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que avanza la fusión del liposoma y la célula, el contenido acuoso interno que incluye el ARNi se suministra a la célula, donde el ARNi puede unirse específicamente a un ARN diana y puede mediar en la ARNi. En algunos casos, los liposomas también están específicamente dirigidos, por ejemplo, para dirigir el ARNi a tipos de células particulares.

Un liposoma que contiene un agente de ARNi puede prepararse mediante una variedad de métodos. En un ejemplo, el componente lipídico de un liposoma se disuelve en un detergente de modo que se forman micelas con el componente lipídico. Por ejemplo, el componente lipídico puede ser un lípido catiónico anfipático o un conjugado lipídico. El detergente puede tener una alta concentración micelar crítica y puede ser no iónico. Los detergentes a modo de ejemplo incluyen colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato y lauroilsarcosina. Entonces, se añade la preparación de agente de ARNi a las micelas que incluyen el componente lipídico. Los grupos catiónicos del lípido interaccionan con el agente de ARNi y se condensan alrededor del agente de ARNi formando un liposoma. Después de la condensación, se elimina el detergente, por ejemplo, mediante diálisis, para producir una preparación liposomal del agente de ARNi.

Si es necesario, puede añadirse un compuesto portador que ayude en la condensación durante la reacción de condensación, por ejemplo, mediante adición controlada. Por ejemplo, el compuesto portador puede ser un polímero distinto de un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina). También puede ajustarse el pH para favorecer la condensación.

Se describen además métodos para producir vehículos de suministro de polinucleótidos estables, que incorporan un complejo de polinucleótido/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo de suministro en, por ejemplo, el documento WO 96/37194. La formación de liposomas puede incluir también uno o más aspectos de los métodos a modo de ejemplo descritos en Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7413-7417; la patente estadounidense n.° 4.897.355; la patente estadounidense n.° 5.171.678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol.

23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557: 9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728: 339; y Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757. Las técnicas comúnmente usadas para preparar agregados de lípidos de tamaño apropiado para su uso como vehículos de suministro incluyen sonicación y congelación-descongelación más extrusión (véase, por ejemplo, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858: 161. Puede usarse microfluidización cuando se deseñan agregados consistentemente pequeños (de 50 a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169). Estos métodos se adaptan fácilmente para empaquetar preparaciones de agente de ARNi en liposomas.

Los liposomas se encuentran en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interaccionan con las moléculas de ácido nucleico cargadas negativamente formando un complejo estable. El complejo de liposoma/ácido nucleico cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen y liberan su contenido al citoplasma celular. Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comun., 147:980-985).

Los liposomas, que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan los ácidos nucleicos en lugar de formar complejos con ellos. Dado que tanto el ácido nucleico como el lípido tienen una carga similar, se produce repulsión en lugar de formación de complejos. No obstante, algo de ácido nucleico queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han usado liposomas sensibles al pH para suministrar ácidos nucleicos que codifican el gen de timidina cinasa a monocapas celulares en cultivo. Se detectó la expresión del gen exógeno en las células diana (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19: 269-274).

Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos de fosfatidilcolina de origen natural. Pueden formarse composiciones de liposomas neutros, por ejemplo, a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Se forman composiciones de liposomas aniónicos, en general, a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras que se forman liposomas fusogénicos aniónicos principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.

Los ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en células in vitro e in vivo incluyen la patente estadounidense n.° 5.283.185; la patente estadounidense n.° 5.171.678; los documentos WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269: 2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3: 649; Gershon, (1993) Biochem. 32: 7143; y Strauss, (1992) EMBO J.11:417. También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) y Novasome™ II (estearil éter de diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietileno-10) para suministrar ciclosporina-A a la dermis de la piel del ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos fueron eficaces para facilitar la deposición de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).

Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estericamente”, un término que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado una vida útil en circulación potenciada en relación con liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica formadora de vesículas del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido G^m-ⁱ, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin querer restringirse a ninguna teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, la vida media de circulación potenciada de estos liposomas estabilizados estéricamente se deriva de una captación reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223: 42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53: 3765).

En la técnica se conocen diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507: 64) notificaron la capacidad de monosialogangliósido G^mi, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar la semivida en sangre de los liposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85: 6949). La patente estadounidense n.° 4.837.028 y el documento WO 88/04924, ambos concedidos a Allen et al., dan a conocer liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gm1 o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La patente estadounidense n.° 5.543.152 (Webb et al.) da a conocer liposomas que comprenden esfingomielina. Se dan a conocer liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina en el documento WO 97/13499 (Lim et al.). En una implementación, se usan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos presentan la ventaja de poder fusionarse con la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse tan eficazmente con la membrana plasmática, se captan por macrófagos in vivo y pueden usarse para suministrar agentes de ARNi a los macrófagos.

Las ventajas adicionales de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y en lípidos; los liposomas pueden proteger a los agentes de ARNi encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación. Rosoff, en “Pharmaceutical Dosage Forms”, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volumen 1, pág. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial de lípidos, el tamaño de las vesículas y el volumen acuoso de los liposomas.

Puede usarse un lípido catiónico sintético cargado positivamente, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMa ) para formar liposomas pequeños que interaccionan espontáneamente con el ácido nucleico para formar complejos de lípido-ácido nucleico que son capaces de fusionarse con los lípidos cargados negativamente de las membranas celulares de células en cultivo tisular, dando como resultado el suministro del agente de ARNi (véase, por ejemplo, Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7413-7417 y la patente estadounidense n.° 4.897.355 para una descripción de DOTMA y su uso con ADN).

Puede usarse un análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamoniaco)propano (DOTAP) en combinación con un fosfolípido para formar vesículas complejantes de ADN. Lipofectin™, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) es un agente eficaz para el suministro de ácidos nucleicos altamente aniónicos en células en cultivo tisular vivas que comprenden liposomas de DOTMA cargados positivamente que interaccionan espontáneamente con polinucleótidos cargados negativamente para formar complejos. Cuando se usan suficientes liposomas cargados positivamente, la carga neta en los complejos resultantes también es positiva. Los complejos cargados positivamente preparados de este modo se unen espontáneamente a superficies celulares cargadas negativamente, se fusionan con la membrana plasmática y suministran eficazmente ácidos nucleicos funcionales a, por ejemplo, células en cultivo tisular. Otro lípido catiónico comercialmente disponible, 1,2-bis(oleoiloxi)-3,3-(trimetilamoniaco)propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana) difiere de DOTMA en que los restos oleoílo están unidos por éster, en lugar de uniones éter.

Otros compuestos de lípidos catiónicos notificados incluyen aquellos que se han conjugado con una variedad de restos incluyendo, por ejemplo, carboxiespermina que se ha conjugado con uno de dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como 5-carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermilamida (“DPPES”) (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.171.678).

Otro conjugado de lípido catiónico incluye la derivatización del lípido con colesterol (“DC-Chol”) que se ha formulado en liposomas en combinación con DOPE (véase, Gao, X. y Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Comun.

179:280). Se ha notificado que la lipopolilisina, producida mediante la conjugación de polilisina con DOPE, es eficaz para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). Para ciertas líneas celulares, se dice que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos conjugados presentan menor toxicidad y proporcionan una transfección más eficaz que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos de lípidos catiónicos disponibles comercialmente incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Otros lípidos catiónicos adecuados para el suministro de oligonucleótidos se describen en los documentos WO 98/39359 y W^o96/37194.

Las formulaciones liposomales son particularmente adecuadas para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, aumento de la acumulación del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad de administrar el agente de ARNi a la piel. En algunas implementaciones, se usan liposomas para administrar el agente de ARNi a células epidérmicas y también para mejorar la penetración del agente de ARNi en los tejidos dérmicos, por ejemplo, en la piel. Por ejemplo, los liposomas pueden aplicarse por vía tópica. Se ha documentado el suministro tópico de fármacos formulados como liposomas a la piel (véase, por ejemplo, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2, 405-410 y du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18: 259-265; Mannino, R. J. y Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6: 682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56: 267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Met. Enzimol. 149: 157-176; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527; Wang, C. Y. y Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855).

También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposomales no iónicas que comprendían Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) y Novasome II (diestearato de glicerilo/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) para suministrar un fármaco a la dermis de la piel de ratón. Tales formulaciones con agente ARNi son útiles para tratar un trastorno dermatológico.

Puede hacerse que los liposomas que incluyen ARNi sean altamente deformables. Tal deformabilidad puede permitir que los liposomas penetren a través de poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, los transferosomas son un tipo de liposomas deformables. Pueden producirse transferosomas añadiendo activadores de bordes superficiales, generalmente tensioactivos, a una composición liposomal convencional. Pueden administrarse transferosomas que incluyen un agente de ARNi, por ejemplo, por vía subcutánea mediante infección con el fin de administrar el agente de a Rní a los queratinocitos de la piel. Con el fin de atravesar la piel intacta de los mamíferos, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Además, debido a las propiedades de los lípidos, estos transferosomas pueden autooptimizarse (adaptarse a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel), autorrepararse y, con frecuencia, pueden alcanzar sus dianas sin fragmentarse y, a menudo, autocargarse. Otras formulaciones susceptibles de la presente descripción se describen en la solicitud provisional estadounidense con número de serie 61/018.616, presentada el 2 de enero de 2008; 61/018.611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039.748, presentada el 26 de marzo de 2008; 61/047.087, presentada el 22 de abril de 2008 y 61/051.528, presentada el 8 de mayo de 2008. La solicitud PCT n.° PCT/US2007/080331, presentada el 3 de octubre de 2007, también describe formulaciones que son susceptibles de la presente divulgación.

Los transferosomas son otro tipo más de liposomas, y son agregados de lípidos altamente deformables que son candidatos atractivos para vehículos de suministro de fármacos. Los transferosomas pueden describirse como gotitas de lípidos que son tan altamente deformables que pueden penetrar fácilmente a través de poros que son más pequeños que la gotita. Los transferosomas pueden adaptarse al entorno en el que se usan, por ejemplo, se autooptimizan (se adaptan a la forma de los poros de la piel), se autorreparan, con frecuencia alcanzan sus dianas sin fragmentarse y, a menudo, se autocargan. Para producir transferosomas, es posible agregar activadores de bordes superficiales, generalmente tensioactivos, a una composición liposomal convencional. Se han usado transferosomas para suministrar albúmina sérica a la piel. Se ha mostrado que el suministro de albúmina sérica mediado por transferosomas es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina sérica.

Los tensioactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. El modo más común de clasificar y ordenar las propiedades de los muchos diferentes tipos de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como “cabeza”) proporciona los medios más útiles para clasificar los diferentes tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285).

Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y pueden usarse a lo largo de un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB oscilan entre 2 y aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y los éteres no iónicos tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.

Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquilbenceno, isetionatos de acilo, tauratos y sulfosuccinatos de acilo, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.

Si la molécula de tensioactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.

Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de llevar una carga o bien positiva o bien negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados del ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.

Se ha revisado el uso de tensioactivos en productos farmacéuticos, formulaciones y emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p.285).

El ARNi para su uso en los métodos de la divulgación también puede proporcionarse como formulaciones micelares. Las “micelas” se definen en el presente documento como un tipo particular de conjunto molecular en el que moléculas anfipáticas están dispuestas en una estructura esférica de manera que todas las porciones hidrófobas de las moléculas están dirigidas hacia adentro, dejando las porciones hidrófilas en contacto con la fase acuosa circundante. Existe la disposición inversa si el entorno es hidrófobo.

Puede prepararse una formulación micelar mixta adecuada para el suministro a través de membranas transdérmicas mezclando una disolución acuosa de la composición de ARNip, un alquilsulfato Ce a C22 de metal alcalino y compuestos formadores de micelas. Los ejemplos de compuestos formadores de micelas incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleína, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de onagra, mentol, trihidroxioxocolanilglicina y sales farmacéuticamente aceptables de la misma, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, alquil éteres de polidocanol y análogos de los mismos, quenodesoxicolato, desoxicolato y mezclas de los mismos. Los compuestos formadores de micelas pueden añadirse al mismo tiempo o después de la adición del alquilsulfato de metal alcalino. Se formarán micelas mixtas sustancialmente con cualquier tipo de mezclado de los ingredientes, pero con un mezclado vigoroso con el fin de proporcionar micelas de tamaño más pequeño.

En un método, se prepara una primera composición micelar que contiene la composición de ARNip y al menos el alquilsulfato de metal alcalino. Entonces, la primera composición micelar se mezcla con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición micelar mixta. En otro método, la composición micelar se prepara mezclando la composición de ARNip, el alquilsulfato de metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido por la adición de los restantes compuestos formadores de micelas, con mezclado vigoroso.

Puede añadirse fenol y/o m-cresol a la composición micelar mixta para estabilizar la formulación y proteger contra el crecimiento bacteriano. Alternativamente, puede añadirse fenol y/o m-cresol con los componentes formadores de micelas. También puede añadirse un agente isotónico tal como glicerina después de la formación de la composición micelar mixta. Para el suministro de la formulación micelar como una pulverización, la formulación puede colocarse en un dispensador de aerosol y el dispensador se carga con un propelente. El propelente, que está bajo presión, está en forma líquida en el dispensador. Las razones de los componentes se ajustan de modo que las fases acuosa y de propelente se vuelvan una, es decir, hay una fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una porción del contenido, por ejemplo, a través de una válvula dosificadora. La dosis dispensada del agente farmacéutico se impulsa desde la válvula dosificadora en una pulverización fina.

Los propelentes pueden incluir clorofluorocarbonos que contienen hidrógeno, fluorocarbonos que contienen hidrógeno, dimetil éter y dietil éter. En ciertas implementaciones, puede usarse HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano). Las concentraciones específicas de los componentes esenciales pueden determinarse mediante una experimentación relativamente sencilla. Para la absorción a través de las cavidades orales, a menudo es deseable aumentar, por ejemplo, al menos el doble o el triple, la dosificación para inyección o administración a través del tracto gastrointestinal.

B. Partículas lipídicas de ácido nucleico

Los ARNi, por ejemplo, ARNbc de la divulgación, pueden encapsularse completamente en la formulación lipídica, por ejemplo, para formar una SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula de ácido nucleico-lípido. Tal como se usa en el presente documento, el término “SNALP” se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable, que incluye SPLP. Tal como se usa en el presente documento, el término “SPLP” se refiere a una partícula de ácido nucleicolípido que comprende ADN de plásmido encapsulado dentro de una vesícula lipídica. Las SNALP y SPLP contienen normalmente un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que impide la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado de PEG-lípido). Las SNALP y SPLP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que presentan una vida útil de circulación prolongada tras la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración). Las SPLP incluyen “pSPLP”, que incluyen un complejo de ácido nucleico-agente de condensación encapsulado tal como se expone en la publicación PCT n.° WO 00/03683. Las partículas de la presente divulgación tienen normalmente un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más normalmente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más normalmente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, lo más normalmente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente divulgación, son resistentes en disolución acuosa a la degradación con una nucleasa. Se dan a conocer partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; la publicación estadounidense n.° 2010/0324120 y la publicación PCT n.° WO 96/40964.

En una implementación, la relación de lípido con respecto a fármaco (relación en masa/masa) (por ejemplo, relación de lípido con respecto a ARNbc) estará en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 50:1, desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 25:1, desde aproximadamente 3:1 hasta aproximadamente 15:1, desde aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 10:1, desde aproximadamente 5:1 hasta aproximadamente 9:1 o desde aproximadamente 6:1 hasta aproximadamente 9:1. También se contempla que intervalos intermedios con respecto a los intervalos mencionados anteriormente formen parte de la divulgación. El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(I-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(I-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DoTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DOd Ma ), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleiloxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), 1,2-sal de cloruro de dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) o 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos del mismo, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,r-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender desde aproximadamente el 20% en moles hasta aproximadamente el 50% en moles o aproximadamente el 40% en moles del lípido total presente en la partícula.

En otra implementación, puede usarse el compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. La síntesis de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional estadounidense número 61/107.998 presentada el 23 de octubre de 2008.

En una implementación, la partícula de lípido-ARNip incluye el 40% de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano:el 10% de DSPC:el 40% de colesterol:el 10% de P^eG-C-DOMG (porcentaje en moles) con un tamaño de partícula de 63,0 ± 20 nm y una relación de ARNip/lípido de 0,027.

El lípido ionizable/no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro que incluye, pero no se limita a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (^dO^pC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-0-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidetanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de desde aproximadamente el 5% en moles hasta aproximadamente el 90% en moles, aproximadamente el 10% en moles o aproximadamente el 58% en moles si se incluye colesterol, del lípido total presente en la partícula.

El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido que incluye, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer), o una mezcla de los mismos. El conjugado de PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG dilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) o un PEG-diesteariloxipropilo (Cié). El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede ser de desde el 0% en moles hasta aproximadamente el 20% en moles o aproximadamente el 2% en moles del lípido total presente en la partícula.

En algunas implementaciones, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye además colesterol a, por ejemplo, del 10% en moles a aproximadamente el 60% en moles o aproximadamente el 48% en moles del lípido total presente en la partícula.

En una implementación, pueden usarse el lipidoide ND98-4HC1 (PM 1487) (véase la solicitud de patente estadounidense n.° 12/056.230, presentada el 26/3/2008), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc (es decir, partículas LNP01). Pueden prepararse disoluciones madre de cada uno en etanol tal como sigue: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Las disoluciones madre de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 pueden combinarse entonces en una relación molar de, por ejemplo, 42:48:10. La disolución lipídica combinada puede mezclarse con ARNbc acuoso (por ejemplo, en acetato de sodio pH 5) de manera que la concentración final de etanol sea de aproximadamente el 35-45% y la concentración final de acetato de sodio sea de aproximadamente 100-300 mM. Normalmente, se forman nanopartículas de lípido-ARNbc espontáneamente al mezclarse. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseada, la mezcla de nanopartículas resultante puede extruirse a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, corte de 100 nm) usando, por ejemplo, una extrusora de termobarril, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc.). En algunos casos, puede omitirse la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio de tampón simultáneo pueden lograrse, por ejemplo, mediante diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón puede intercambiarse con, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH de aproximadamente 7, por ejemplo, aproximadamente pH 6,9, aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 7,1, aproximadamente pH 7,2, aproximadamente pH 7,3 o aproximadamente pH 7,4.

Se describen formulaciones de LNP01, por ejemplo, en la publicación de solicitud internacional n.° WO 2008/042973.

Se describen formulaciones de lípido-ARNbc a modo de ejemplo adicionales en la tabla a continuación.

DSPC: distearoilfosfatidilcolina

DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina

PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG, o PEG-C14) (PEG con peso molecular promedio de 2000) PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG, o PEG-C18) (PEG con peso molecular promedio de 2000)

PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con peso molecular promedio de 2000)

Se describen formulaciones que comprenden SNALP (1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) en la publicación internacional n.° WO2009/127060, presentada el 15 de abril de 2009.

Se describen formulaciones que comprenden XTC, por ejemplo, en el documento provisional estadounidense con número de serie 61/148.366, presentado el 29 de enero de 2009; el documento provisional estadounidense con número de serie 61/156.851, presentado el 2 de marzo de 2009; el documento provisional estadounidense con número de serie presentado el 10 de junio de 2009; el documento provisional estadounidense con número de serie 61/228.373, presentado el 24 de julio de 2009; el documento provisional estadounidense con número de serie 61/239.686, presentado el 3 de septiembre de 2009 y la solicitud internacional n.° PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero de 2010.

Se describen formulaciones que comprenden MC3, por ejemplo, en la publicación estadounidense n.° 2010/0324120, presentada el 10 de junio de 2010.

Se describen formulaciones que comprenden ALNY-100, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional número PCT/US09/63933, presentada el 10 de noviembre de 2009.

Se describen formulaciones que comprenden C12-200 en el documento provisional estadounidense con número de serie 61/175.770, presentado el 5 de mayo de 2009 y la solicitud internacional n.° PCT/US10/33777, presentada el 5 de mayo de 2010.

Síntesis de lípidos ionizables/catiónicos

Cualquiera de los compuestos, por ejemplo, lípidos catiónicos y similares, usados en las partículas de ácido nucleico-lípido de la divulgación, pueden prepararse mediante técnicas de síntesis orgánica conocidas, incluyendo los métodos descritos con más detalle en los ejemplos. Todos los sustituyentes son como se definen a continuación a menos que se indique lo contrario.

“Alquilo” significa un hidrocarburo alifático saturado de cadena lineal o ramificado, no cíclico o cíclico, que contiene desde 1 hasta 24 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo, y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares.

“Alquenilo” significa un alquilo, tal como se definió anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen isómeros cis y trans. Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, y similares.

“Alquinilo” significa cualquier alquilo o alquenilo, tal como se definió anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un triple enlace entre carbonos adyacentes. Los alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinilo, y similares.

“Acilo” significa cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo en el que el carbono en el punto de unión está sustituido con un grupo oxo, tal como se define a continuación. Por ejemplo, -C(=O)alquilo, -C(=O)alquenilo y -C(=O)alquinilo son grupos acilo.

“Heterociclo” significa un anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o bicíclico de 7 a 10 miembros que o bien está saturado, insaturado o bien es aromático, y que contiene desde 1 o 2 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre, y en el que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, incluyendo anillos bicíclicos en los que cualquiera de los heterociclos anteriores se fusiona con un anillo de benceno. El heterociclo puede unirse por medio de cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos tal como se define a continuación. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, y similares.

Los términos “alquilo opcionalmente sustituido”, “alquenilo opcionalmente sustituido”, “alquinilo opcionalmente sustituido”, “acilo opcionalmente sustituido” y “heterociclo opcionalmente sustituido” significan que, cuando se sustituye, al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un sustituyente. En el caso de un sustituyente oxo (=O), se reemplazan dos átomos de hidrógeno. En este sentido, los sustituyentes incluyen oxo, halógeno, heterociclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy, en los que n es 0, 1 o 2, Rx y Ry son iguales o diferentes y son independientemente hidrógeno, alquilo o heterociclo, y cada uno de dichos sustituyentes alquilo y heterociclo puede estar sustituido adicionalmente con uno o más de oxo, halógeno, -OH, -CN, alquilo, -ORx, heterociclo, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy.

“Halógeno” significa flúor, cloro, bromo y yodo.

En algunas implementaciones, los métodos de la divulgación pueden requerir el uso de grupos protectores. La metodología de grupos protectores la conocen bien los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, ciudad de Nueva York, 1999). Brevemente, los grupos protectores dentro del contexto de esta divulgación son cualquier grupo que reduzca o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional. Puede añadirse un grupo protector a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante ciertas reacciones y luego eliminarlo para revelar el grupo funcional original. En algunas implementaciones, se usa un “grupo protector de alcohol”. Un “grupo protector de alcohol” es cualquier grupo que disminuya o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional alcohol. Pueden añadirse y eliminarse grupos protectores usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Síntesis de la fórmula A

En algunas implementaciones, se formulan partículas de ácido nucleico-lípido de la divulgación usando un lípido catiónico de fórmula A:

en donde Ri y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno puede estar opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 pueden tomarse juntos para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. En algunas implementaciones, el lípido catiónico es XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). En general, el lípido de fórmula A anterior puede producirse mediante los siguientes esquemas de reacción 1 o 2, en los que todos los sustituyentes son tal como se definieron anteriormente a menos que se indique lo contrario.

Esquema 1

El lípido A, donde R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno puede estar opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 pueden tomarse juntos para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, puede prepararse según el esquema 1. La cetona 1 y el bromuro 2 pueden adquirirse o prepararse según métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica. La reacción de 1 y 2 produce el cetal 3. El tratamiento del cetal 3 con la amina 4 produce lípidos de fórmula A. Los lípidos de fórmula A pueden convertirse en la sal de amonio correspondiente con una sal orgánica de fórmula 5, donde X es un contraión aniónico seleccionado de halógeno, hidróxido, fosfato, sulfato, o similares.

Esquema 2

Alternativamente, el material de partida de cetona 1 puede prepararse según el esquema 2. El reactivo de Grignard 6 y el cianuro 7 pueden adquirirse o prepararse según métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica. La reacción de 6 y 7 produce la cetona 1. La conversión de la cetona 1 en los correspondientes lípidos de fórmula A es tal como se describe en el esquema 1.

Síntesis de MC3

La preparación de DLin-M-C3-DMA (es decir, 4-(dimetilamino)butanoato) de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo fue tal como sigue. Una disolución de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), clorhidrato de ácido 4-N,N-dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61 g) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,53 g) en diclorometano (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se lavó la disolución con ácido clorhídrico diluido seguido por bicarbonato de sodio acuoso diluido. Se secaron las fracciones orgánicas sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se eliminó el disolvente sobre un evaporador rotatorio. Se hizo pasar el residuo por una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente de elución de metanol/diclorometano al 1-5%. Se combinaron las fracciones que contenían el producto purificado y se eliminó el disolvente, produciendo un aceite incoloro (0,54 g).

Síntesis de ALNY-100

Se realizó la síntesis del cetal 519 [ALNY-100] usando el siguiente esquema 3:

Síntesis de 515

A una suspensión agitada de LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) en 200 ml de THF anhidro en un RBF de dos bocas (1 l), se le añadió una disolución de 514 (10 g, 0,04926 mol) en 70 ml de THF lentamente a 0°C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de completarse la adición, se calentó la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y luego se calentó hasta reflujo durante 4 h. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante CCF. Después de la finalización de la reacción (mediante CCF), se enfrió la mezcla hasta 0°C y se extinguió con la adición cuidadosa de disolución saturada de Na2SO4. Se agitó la mezcla de reacción durante 4 ha temperatura ambiente y se separó por filtración. Se lavó el residuo bien con THF. Se mezclaron el filtrado y los lavados y se diluyeron con 400 ml de dioxano y 26 ml de HCl conc. y se agitaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se eliminaron los compuestos volátiles a vacío para proporcionar la sal de clorhidrato de 515 como un sólido blanco. Rendimiento: 7,12 g. 1H-RMN (DMSO, 400 MHz): 8= 9,34 (ancho, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H).

Síntesis de 516

A una disolución agitada del compuesto 515 en 100 ml de DCM seco en un RBF de dos bocas de 250 ml, se le añadió NEt3 (37,2 ml, 0,2669 mol) y se enfrió hasta 0°C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de una adición lenta de N-(benciloxi-carboniloxi)-succinimida (20 g, 0,08007 mol) en 50 ml de DCM seco, se permitió que la mezcla de reacción se calentara hasta temperatura ambiente. Después de la finalización de la reacción (2-3 h mediante CCF), se lavó la mezcla sucesivamente con disolución de HCl 1 N (1 * 100 ml) y disolución saturada de NaHCO3 (1 * 50 ml). Entonces se secó la fase orgánica sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó el disolvente para dar el material en bruto que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para conseguir 516 como una masa pegajosa. Rendimiento: 11 g (89%). 1H-RMN (CDCh, 400 MHz): 8 = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (a, 1H) 2,74 (s, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). CL-EM [M+H] -232,3 (96,94%).

Síntesis de 517A y 517B

El ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) se disolvió en una disolución de 220 ml de acetona y agua (10:1) en un RBF de 500 ml de una sola boca y se le añadió morfolin-N-óxido de N-metilo (7,6 g, 0,06492 mol) seguido por 4,2 ml de disolución al 7,6% de OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) en terc-butanol a temperatura ambiente. Después de la finalización de reacción (~ 3 h), se extinguió la mezcla con adición de Na2SO3 sólido y se agitó la mezcla resultante durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla de reacción con DCM (300 ml) y se lavó con agua (2 * 100 ml) seguido por disolución saturada de NaHCO3 (1 * 50 ml), agua (1 * 30 ml) y finalmente con salmuera (1 * 50 ml). Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4 anhidro y se eliminó el disolvente a vacío. La purificación por cromatografía en columna de gel de sílice del material en bruto proporcionó una mezcla de diastereómeros, que se separaron mediante HPLC prep. Rendimiento: - 6 g de 517A en bruto - pico-1 (sólido blanco), 5,13 g (96%). 1H-RMN (DMSO, 400MHz): 8= 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72- 1,67(m, 4H). CL-EM -[M+H]-266,3, [M+NH4 ]-283,5 presente, HPLC-97,86%. Estereoquímica confirmada mediante rayos X.

Síntesis de 518

Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 505, se obtuvo el compuesto 518 (1,2 g, 41%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (CDCh, 400 MHz): 8 = 7,35-7,33 (m, 4H), 7,30-7,27 (m, 1H), 5,37 5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m, 7H), 2,06-2,00 (m, 8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (m. a., 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%.

Procedimiento general para la síntesis del compuesto 519

Se añadió una disolución del compuesto 518 (1 eq.) en hexano (15 ml) gota a gota a una disolución enfriada con hielo de LAH en THF (1 M, 2 eq.). Después de completarse la adición, se calentó la mezcla a 40°C a lo largo de 0,5 h, luego se enfrió de nuevo en un baño de hielo. Se hidrolizó la mezcla cuidadosamente con Na2SO4 acuoso saturado, luego se filtró a través de celite y se redujo hasta un aceite. La cromatografía en columna proporcionó 519 puro (1,3 g, 68%) que se obtuvo como un aceite incoloro. 13C-RMN 8 = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; EM de electropulverización (+ve): Peso molecular para C44H80NO2 (M H)+ calc. 654,6, hallado 654,6.

Las formulaciones preparadas mediante o bien el método convenciónal o bien el método sin extrusión pueden caracterizarse de manera similar. Por ejemplo, las formulaciones normalmente se caracterizan mediante inspección visual. Deben ser disoluciones translúcidas blanquecinas libres de agregados o sedimentos. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas de lípidos pueden medirse mediante dispersión de luz usando, por ejemplo, un instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE. UU.). Las partículas deben tener un tamaño de aproximadamente 20-300 nm, tal como 40-100 nm. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNbc en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de colorante. Una muestra del ARNbc formulado puede incubarse con un colorante de unión a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo disruptor de la formulación, por ejemplo, Triton-X100 al 0,5%. El ARNbc total en la formulación puede determinarse mediante la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, en relación con una curva patrón. La fracción atrapada se determina restando el contenido de ARNbc “libre” (tal como se mide por la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido total de ARNbc. El porcentaje de ARNbc atrapado es normalmente > 85%. Para la formulación de SNALP, el tamaño de partícula es de al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 110 nm y al menos 120 nm. El intervalo adecuado es típicamente de al menos 50 nm a al menos 110 nm, de al menos 60 nm a al menos 100 nm o de al menos 80 nm a al menos 90 nm.

Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, materiales microparticulados, materiales nanoparticulados, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. En algunas implementaciones, las formulaciones orales son aquellas en las que los ARNbc presentados en la divulgación se administran junto con uno o más tensioactivos y quelantes potenciadores de la penetración. Los tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos biliares/sales adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, sodio). En algunas implementaciones, se usan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación a modo de ejemplo es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de la penetración adicionales incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los ARNbc presentados en la divulgación pueden suministrar por vía oral, en forma granular incluyendo partículas secadas por pulverización, o completada para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de ARNbc incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas, polulanos, celulosas y almidones derivatizados con DEAE. Los agentes complejantes adecuados incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, pamino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cinaoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Se describen en detalle formulaciones orales para ARNbc y su preparación en la patente estadounidense 6.887.906, la publicación estadunidense n.° 20030027780 y la patente estadounidense n.° 6.747.014.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Se prefieren particularmente formulaciones que seleccionan como diana el hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como carcinoma hepático.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los principios activos con el/los portadore(es) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, conformando el producto.

Las composiciones de la presente descripción pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitarse a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgación también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.

C. Formulaciones adicionales

i. Emulsiones

Las composiciones de la presente descripción pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que habitualmente superan los 0,1 |im de diámetro (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad de o bien agua en aceite (w/o) o bien aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa está finamente dividida y se dispersa como gotitas diminutas en una fase oleosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase oleosa está finamente dividida y se dispersa como gotitas diminutas en una fase acuosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo que puede estar presente como disolución en o bien la fase acuosa, la fase oleosa o bien por sí mismo como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que se componen de más de dos tales fases como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no ofrecen. Las emulsiones múltiples en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.

Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión está bien dispersa en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma por medio de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, tal como es el caso de las cremas y bases de pomadas de tipo emulsión. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes pueden clasificarse ampliamente en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes que se producen de manera natural, bases de absorción y sólidos finamente dispersos (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes activos de superficie, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisados en la bibliografía (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel H^c., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199). Los tensioactivos son normalmente anfifílicos y comprenden una parte hidrófila y otra hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila con respecto a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos pueden clasificarse en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich ⁿG. y Ansel ^hC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, ⁿY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285).

Los emulsionantes que se producen de manera natural usados en las formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción presentan propiedades hidrófilas, de manera que pueden absorber agua para formar emulsiones w/o pero conservan sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. También se han usado sólidos finamente divididos como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.

Una gran variedad de materiales no emulsionantes también se incluyen en las formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p.

335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas que se producen de manera natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua formando disoluciones coloidales que estabilizan las emulsiones al formar películas interfaciales fuertes alrededor de las gotitas de la fase dispersa y al aumentar la viscosidad de la fase externa.

Dado que las emulsiones a menudo contienen varios componentes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden favorecer fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones incorporan a menudo conservantes. Los conservantes de uso común incluidos en las formulaciones de emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico y ácido bórico. También se añaden antioxidantes comúnmente a las formulaciones de emulsión para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.

La aplicación de formulaciones de emulsión por medio de las vías dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Se han usado muy ampliamente formulaciones de emulsión para suministro oral debido a su facilidad de formulación, así como a su eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, ⁿY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes a base de aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite y las preparaciones nutritivas ricas en grasas se encuentran entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones o/w.

ii. Microemulsiones

En una implementación, las composiciones de ARNi y los ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y anfífilo que es una sola disolución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una disolución acuosa de tensioactivo y luego añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, también se han descrito microemulsiones como dispersiones termodinámicamente estables e isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas activas de superficie (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente por medio de una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo de agua en aceite (w/o) o de aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y del tensioactivo usado y de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y las colas de hidrocarburos de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 1985, p.

271).

El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado extensamente y ha proporcionado un conocimiento completo, para un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p.

335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.

Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, oleil éteres de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con cotensioactivos. El cotensioactivo, habitualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película de tensioactivo y, en consecuencia, creando una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas del tensioactivo. Sin embargo, pueden prepararse microemulsiones sin el uso de cotensioactivos y se conocen en la técnica sistemas de microemulsión autoemulsionantes sin alcohol. La fase acuosa puede ser normalmente, pero no se limita a, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.

Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Se han propuesto microemulsiones a base de lípidos (tanto o/w como w/o) para mejorar la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan las ventajas de una solubilización del fármaco mejorada, protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral con respecto a formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y disminución de la toxicidad (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo, pueden formarse microemulsiones espontáneamente cuando sus componentes se juntan a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos o ARNi termolábiles. Las microemulsiones también han resultado eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión de la presente divulgación faciliten la absorción sistémica aumentada de ARNi y ácidos nucleicos a partir del tracto gastrointestinal, así como también mejoren la absorción celular local de ARNi y ácidos nucleicos.

Las microemulsiones de la presente divulgación también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y mejorar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente divulgación. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones de la presente divulgación pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorías amplias: tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha comentado anteriormente.

iii. Micropartículas

Un agente de ARNi de la divulgación puede incorporarse en una partícula, por ejemplo, una micropartícula. Pueden producirse micropartículas mediante secado por pulverización, pero también pueden producirse mediante otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado en lecho fluido, secado al vacío o una combinación de estas técnicas.

IV. Potenciadores de la penetración

En una implementación, se emplean diversos potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficaz de ácidos nucleicos, particularmente ARNi, a la piel de los animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución tanto en forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, normalmente sólo los fármacos solubles en lípidos o lipófilos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que va a atravesarse se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipófilos.

Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de la penetración se describe a continuación con mayor detalle.

Los tensioactivos (o “agentes activos de superficie”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se mejora la absorción de ARNi a través de la mucosa. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres alquílicos C1-20 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo) y mono- y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (véanse, por ejemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

El papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Brunton, capítulo 38 en: The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman & Gilman, 9a ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Diversas sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de la penetración. Por tanto, el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes de la bilis que se producen de manera natural, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietilen-9-lauril éter (POE) (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Los agentes quelantes, tal como se usan en relación con la presente divulgación, pueden definirse como compuestos que eliminan iones metálicos de la disolución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se mejora la absorción de los ARNi a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración en la presente divulgación, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de ADNasa, ya que la mayoría de las ADN nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis y, por tanto, se ven inhibidos por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315 339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato, 5-metoxisalicilato y homovanilato de sodio), derivados de N-acilo de colágeno, lauril éter-9 y derivados de N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (véanse, por ejemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Tal como se usa en el presente documento, los compuestos potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes pueden definirse como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que, no obstante, mejoran la absorción de ARNi a través de la mucosa alimentaria (véanse, por ejemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1-alquenilaza-ciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

También pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente divulgación agentes que mejoran la captación de ARNi a nivel celular. Por ejemplo, también se sabe que lípidos catiónicos, tales como la lipofectina (Junichi et al, patente estadounidense n.° 5.705.188), derivados catiónicos de glicerol y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731), mejoran la captación celular de ARNbc. Los ejemplos de reactivos de transfección comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), reactivo de transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza) o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), reactivo de transfección TransFast™ (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marsella, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), reactivo de transfección TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE. UU.), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), EE. UU.), reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección de Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.), Sure-FECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.) o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE. UU.), entre otros.

Pueden utilizarse otros agentes para mejorar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y mentona.

v. Portadores

Ciertas composiciones de la presente divulgación incorporan también compuestos portadores en la formulación. Tal como se usa en el presente documento, “compuesto portador” o “portador” puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no presenta actividad biológica per se) pero se reconoce como ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros reservorios extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente de fosforotioato en el tejido hepático puede reducirse cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.

vi. Excipientes

A diferencia de un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente” es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona teniendo en cuenta la forma prevista de administración, de modo que proporcione el volumen, la consistencia, etc. deseados cuando se combina con un ácido nucleico y los demás componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).

También pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente divulgación. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes o disoluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de manera perjudicial con los ácidos nucleicos. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

vii. Otros componentes

Las composiciones de la presente divulgación pueden contener además otros componentes auxiliares que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles y adicionales tales como, por ejemplo, agentes antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente divulgación, tales como colorantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente divulgación. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionan perjudicialmente con el/los ácido(s) nucleico(s) de la formulación.

Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.

En algunas implementaciones, las composiciones farmacéuticas presentadas en el presente documento incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes que funcionan mediante un mecanismo distinto de ARNi y que son útiles para tratar un trastorno del metabolismo lipídico. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, un agente antiinflamatorio, un agente antiesteatosis, un agente antiviral y/o antifibrosis. Además, otras sustancias comúnmente usadas para proteger el hígado, tales como la silimarina, también pueden usarse junto con los ARNi descritos en el presente documento. Otros agentes útiles para tratar enfermedades hepáticas incluyen telbivudina, entecavir e inhibidores de la proteasa tales como telaprevir y otros dados a conocer, por ejemplo, en Tung et al., publicación de solicitud estadounidense n.os 2005/0148548, 2004/0167116 y 2003/0144217; y en Hale et al., publicación de solicitud estadounidense n.° 2004/0127488.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren compuestos que presentan altos índices terapéuticos.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y los estudios con animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de las composiciones presentadas en el presente documento se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos presentados en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

Además de su administración, tal como se comentó anteriormente, los ARNi presentados en el presente documento pueden administrarse en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de ANGPTL3. En cualquier caso, el médico que administra puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNi basándose en los resultados observados usando medidas convencionales de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.

VI. Métodos

La presente divulgación también proporciona métodos de uso de un ARNi de la divulgación y/o una composición que contiene un ARNi de la divulgación para reducir y/o inhibir la expresión de ANGPTL3 en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un ARNbc de la divulgación y mantener la célula durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de ANGPTL3, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de ANGPTL3 en la célula. La reducción en la expresión génica puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse una reducción en la expresión de ANGPTL3 determinando el nivel de expresión de ARNm de ANGPTL3 usando métodos rutinarios para un experto habitual en la técnica, por ejemplo, transferencia de tipo Northern, qRT-PCR; determinando el nivel de proteína de ANGPTL3 usando métodos rutinarios para un experto habitual en la técnica, tales como inmunotransferencia de tipo Western, técnicas inmunológicas. También puede evaluarse una reducción en la expresión de ANGPTL3 indirectamente midiendo una disminución en la actividad biológica de ANGPTL3, por ejemplo, una disminución en el nivel de lípidos séricos, triglicéridos, colesterol y/o ácidos grasos libres.

En los métodos de la divulgación, la célula puede ponerse en contacto in vitro o in vivo, es decir, la célula puede estar dentro de un sujeto.

Una célula adecuada para el tratamiento usando los métodos de la divulgación puede ser cualquier célula que exprese un gen de ANGPTL3. Una célula adecuada para su uso en los métodos de la divulgación puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de primate (tal como una célula humana o una célula de primate no humano, por ejemplo, una célula de mono o una célula de chimpancé), una célula distinta de primate (tal como una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de camello, una célula de llama, una célula de caballo, una célula de cabra, una célula de conejo, una célula de oveja, una célula de hámster, una célula de cobaya, una célula de gato, una célula de perro, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de león, una célula de tigre, una célula de oso o una célula de búfalo), una célula de ave (por ejemplo, una célula de pato o una célula de ganso) o una célula de ballena. En una implementación, la célula es una célula humana, por ejemplo, una célula de hígado humana.

La expresión de ANGPTL3 se inhibe en la célula en al menos aproximadamente el 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o aproximadamente el 100%. Los métodos in vivo de la divulgación pueden incluir administrar a un sujeto una composición que contiene un ARNi, donde el ARNi incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen de ANGPTL3 del mamífero que va a tratarse. Cuando el organismo que va a tratarse es un mamífero tal como un ser humano, la composición puede administrarse por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, las vías oral, intraperitoneal o parenteral, incluyendo administración intracraneal (por ejemplo, intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, por vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En cierta implementación, las composiciones se administran por infusión o inyección intravenosa. En cierta implementación, las composiciones se administran por inyección subcutánea.

En algunas implementaciones, la administración es por medio de una inyección de depósito. Una inyección de depósito puede liberar el ARNi de manera constante a lo largo de un período de tiempo prolongado. Por tanto, una inyección de depósito puede reducir la frecuencia de dosificación necesaria para obtener el efecto deseado, por ejemplo, una inhibición deseada de ANGPTL3, o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de depósito también puede proporcionar concentraciones séricas más constantes. Las inyecciones de depósito pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En implementaciones preferidas, la inyección de depósito es una inyección subcutánea.

En algunas implementaciones, la administración es por medio de una bomba. La bomba puede ser una bomba externa o una bomba implantada quirúrgicamente. En ciertas implementaciones, la bomba es una bomba osmótica implantada subcutáneamente. En otras implementaciones, la bomba es una bomba de infusión. Puede usarse una bomba de infusión para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales. En implementaciones preferidas, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otras implementaciones, la bomba es una bomba implantada quirúrgicamente que suministra el ARNi al hígado.

El modo de administración puede elegirse basándose en si se desea un tratamiento local o sistémico y basándose en el área que va a tratarse. La vía y el sitio de administración pueden elegirse para mejorar el direccionamiento.

En un aspecto, la presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3 en un mamífero. Los métodos incluyen administrar al mamífero una composición que comprende un ARNbc que selecciona como diana un gen de ANGPTL3 en una célula del mamífero y mantener el mamífero durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen de ANGPTL3, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de ANGPTL3 en la célula. La reducción de la expresión génica puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica y mediante métodos, por ejemplo, qRT-PCR, descritos en el presente documento. La reducción de la producción de proteínas puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica y mediante métodos, por ejemplo, ELISA, descritos en el presente documento. En una implementación, una muestra de biopsia hepática por punción sirve como material tisular para monitorizar la reducción de la expresión del gen y/o proteína de ANGPTL3.

La presente divulgación proporciona además métodos de tratamiento de un sujeto que lo necesita. Los métodos de tratamiento incluyen la administración de un ARNi de la invención a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de ANGPTL3, en una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNi que selecciona como diana un gen de ANGPTL3 o una composición farmacéutica que comprende un ARNi que selecciona como diana un gen de ANGPTL3.

Un ARNi de la divulgación puede administrarse como “ARNi libre”. Se administra un ARNi libre en ausencia de una composición farmacéutica. El ARNi desnudo puede estar en una disolución tampón adecuada. La disolución tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En una implementación, la disolución tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH y la osmolaridad de la disolución tampón que contiene el ARNi pueden ajustarse de modo que sean adecuados para la administración a un sujeto.

Alternativamente, un ARNi de la divulgación puede administrarse como una composición farmacéutica, tal como una formulación liposomal de ARNbc.

Los sujetos que se beneficiarían de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen de ANGPTL3 son aquellos que tienen un trastorno del metabolismo lipídico, por ejemplo, un trastorno hereditario del metabolismo lipídico o un trastorno adquirido del metabolismo lipídico. En una implementación, un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico tiene hiperlipidemia. En otra implementación, un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico tiene hipertrigliceridemia. El tratamiento de un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen de ANGPTL3 incluye tratamiento terapéutico (por ejemplo, un sujeto que tiene xantomas eruptivos) y tratamiento profiláctico (por ejemplo, el sujeto que no tiene xantomas eruptivos o un sujeto puede estar en riesgo de desarrollar xantomas eruptivos).

La divulgación proporciona además métodos para el uso de un ARNi o una composición farmacéutica del mismo, por ejemplo, para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción y/o inhibición de la expresión de ANGPTL3, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico, en combinación con otros productos farmacéuticos y/u otros métodos terapéuticos, por ejemplo, con productos farmacéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, los que se emplean actualmente para el tratamiento de estos trastornos. Por ejemplo, en ciertas implementaciones, un ARNi que selecciona como diana ANGPTL3 se administra en combinación con, por ejemplo, un agente útil en el tratamiento de un trastorno del metabolismo lipídico tal como se describe en otra parte del presente documento. Por ejemplo, agentes adicionales adecuados para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción de la expresión de ANGPTL3, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno del metabolismo lipídico, pueden incluir agentes que reducen uno o más lípidos séricos. Los ejemplos no limitativos de tales agentes pueden incluir inhibidores de la síntesis de colesterol, tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa, por ejemplo, estatinas. Las estatinas pueden incluir atorvastatina (Lipitor), fluvastatina (Lescol), lovastatina (Mevacor), lovastatina de liberación prolongada (Altoprev), pitavastatina (Livalo), pravastatina (Pravachol), rosuvastatina (Crestor) y simvastatina (Zocor). Otros agentes útiles en el tratamiento de un trastorno del metabolismo lipídico pueden incluir agentes secuestrantes de bilis, tales como colestiramina y otras resinas; inhibidores de la secreción de VLDL, tales como niacina; antioxidantes lipofílicos, tales como Probucol; inhibidores de acil-CoA colesterol acil transferasa; antagonistas del receptor farnesoide X; activadores de la proteína activadora de la escisión de la proteína de unión reguladora de esteroles (SCAP); inhibidores de la proteína microsomal de transferencia de triglicéridos (MTP); péptido relacionado con ApoE; y anticuerpos terapéuticos contra ANGPTL3. Los agentes terapéuticos adicionales también pueden incluir agentes que elevan las lipoproteínas de alta densidad (HDL), tales como inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP). Además, los agentes terapéuticos adicionales también pueden incluir suplementos dietéticos, por ejemplo, aceite de pescado. El ARNi y los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse al mismo tiempo y/o en la misma combinación, por ejemplo, por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición separada o en momentos separados y/o mediante otro método conocido en la técnica o descrito en el presente documento.

En una implementación, el método incluye la administración de una composición presentada en el presente documento de manera que la expresión del gen de ANGPTL3 diana disminuya, tal como durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32 o aproximadamente 36 horas. En una implementación, la expresión del gen de ANGPTL3 diana disminuye durante un período prolongado, por ejemplo, al menos unos dos, tres, cuatro días o más, por ejemplo, aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas o más.

Preferiblemente, los ARNi útiles para los métodos y las composiciones presentados en el presente documento seleccionan como diana específicamente los ARN (primarios o procesados) del gen de ANGPTL3 diana. Las composiciones y los métodos para inhibir la expresión de estos genes usando ARNi pueden prepararse y realizarse tal como se describe en el presente documento.

La administración del ARNbc según los métodos de la divulgación puede dar como resultado una reducción de la gravedad, los signos, los síntomas y/o los marcadores de tales enfermedades o trastornos en un paciente con un trastorno del metabolismo lipídico. Por “reducción” en este contexto quiere decirse una disminución estadísticamente significativa en tal nivel. La reducción puede ser, por ejemplo, de al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aproximadamente un 100%.

La eficacia del tratamiento o la prevención de la enfermedad puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la progresión de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, la reducción del dolor, la calidad de vida, la dosis de un medicamento requerida para mantener el efecto del tratamiento, el nivel de un marcador de enfermedad o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad dada que está tratándose o seleccionándose como diana para la prevención. Se encuentra dentro de la capacidad de un experto en la técnica monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo uno cualquiera de tales parámetros, o cualquier combinación de parámetros. Por ejemplo, la eficacia del tratamiento de un trastorno del metabolismo lipídico puede evaluarse, por ejemplo, mediante la monitorización periódica de uno o más niveles de lípidos séricos. Las comparaciones de las lecturas posteriores con las lecturas iniciales proporcionan al médico una indicación de si el tratamiento es eficaz. Se encuentra dentro de la capacidad de un experto en la técnica monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo uno cualquiera de tales parámetros, o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un ARNi que selecciona como diana ANGPTL3 o una composición farmacéutica del mismo, “eficaz contra” un trastorno del metabolismo lipídico indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tal como una mejora de los síntomas, una cura, una reducción de la enfermedad, la prolongación de la vida, la mejora de la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por médicos familiarizados con el tratamiento del trastorno del metabolismo lipídico y las causas relacionadas.

Un tratamiento o efecto preventivo es evidente cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado patológico, o cuando no empeoran ni se desarrollan síntomas cuando de otro modo se anticiparían. Como ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferiblemente al menos el 20%, 30%, 40%, 50% o más, puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco de ARNi dado o de una formulación de ese fármaco también puede juzgarse usando un modelo animal experimental para la enfermedad dada tal como se conoce en la técnica. Cuando se usa un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se observa una reducción estadísticamente significativa en un marcador o síntoma.

Alternativamente, la eficacia puede medirse por una reducción en la gravedad de la enfermedad tal como determina un experto en la técnica del diagnóstico basándose en una escala de clasificación de la gravedad de la enfermedad clínicamente aceptada, como solo un ejemplo, la puntuación de Child-Pugh (a veces la puntuación de Child-Turcotte-Pugh). Cualquier cambio positivo que dé como resultado, por ejemplo, la disminución de la gravedad de la enfermedad medida usando la escala apropiada, representa un tratamiento adecuado usando un ARNi o una formulación de ARNi tal como se describe en el presente documento.

Puede administrarse a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNbc, tal como de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2,5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 4,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 9,5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

En otras implementaciones, por ejemplo, cuando una composición de la invención comprende un ARNbc tal como se describe en el presente documento y una N-acetilgalactosamina, puede administrarse a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNbc, tal como una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/mg, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg.

Por ejemplo, puede administrarse a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNbc, tal como aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg.

El ARNi puede administrarse mediante infusión intravenosa a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de un periodo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o aproximadamente 25 minutos. La administración puede repetirse, por ejemplo, de manera regular, tal como bisemanalmente (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menor frecuencia. Por ejemplo, después de la administración bisemanalmente durante tres meses, la administración puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más. La administración del ARNi puede reducir los niveles de ANGPTL3, por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente en al menos aproximadamente el 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o al menos aproximadamente el 99% o más.

Antes de la administración de una dosis completa del ARNi, puede administrarse a los pacientes una dosis más pequeña, tal como una reacción de infusión al 5%, y monitorizarse para detectar efectos adversos, tales como una reacción alérgica. En otro ejemplo, el paciente puede monitorizarse para detectar efectos inmunoestimuladores no deseados, tales como niveles aumentados de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa o INF-alfa).

Alternativamente, el ARNi puede administrarse por vía subcutánea, es decir, mediante inyección subcutánea. Pueden usarse una o más inyecciones para suministrar la dosis diaria deseada de ARNi a un sujeto. Las inyecciones pueden repetirse a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 días. La administración puede repetirse, por ejemplo, de manera regular, tal como bisemanalmente (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menos frecuencia. En alguna implementación, una sola dosis de ARNi va seguida por dosificación mensual. En algunas implementaciones, la dosificación puede comprender una fase de carga de múltiples dosis en días consecutivos.

A menos que se identifique otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de los ARNi y métodos presentados en la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.

Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretende que sean limitativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Síntesis de ARNi

Fuente de reactivos

Cuando la fuente de un reactivo no se facilita específicamente en el presente documento, tal reactivo puede obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular a una calidad/pureza convencional para su aplicación en biología molecular.

Transcritos

Se llevó a cabo el diseño de ARNi para identificar ARNip que seleccionan como diana el transcrito de ANGPTL3 humano anotado en la base de datos de NCBI Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) y un transcrito de ANGPTL3 de macaco cangrejero (Macaca fascicularis; en adelante “cyno”) producido por medio de secuenciación de ADNc preparado a partir de ARN de hígado. La secuenciación del ARNm de ANGPTL3 de cyno se realizó internamente, y la secuencia del ARNm se muestra en SEQ ID NO: 9.

El diseño usó los siguientes transcritos de la colección de NCBI: Humano - NM_014495.2 (SEQ ID NO: 1); ratón -NM_013913.3 (SEQ ID NO: 2). Todos los dúplex de ARNip se diseñaron de manera que compartían el 100% de identidad con los transcritos humanos y de cyno enumerados. Un subconjunto de dúplex de sírNa , que se describe a continuación, también compartía el 100% de identidad con el transcrito de ANGPTL3 de ratón (Mus musculus) que se encuentra en la base de datos de NCBI Gene.

Diseño de ARNip, especificidad y predicción de eficacia

La especificidad predicha de todos los 19 meros posibles se predijo a partir de cada secuencia. Entonces, se seleccionaron 19 meros candidatos que carecían de repeticiones de más de 7 nucleótidos. Estos 977 ARNip humanos/de cyno candidatos y un subconjunto de 38 que también coincidían con los de ratón (“ARNip candidatos humanos/de cyno/de ratón”) se usaron en una búsqueda exhaustiva contra el transcriptoma humano (definido como el conjunto de registros NM_ y XM_ dentro del conjunto humano NCBI Refseq) usando un algoritmo exhaustivo de “fuerza bruta” implementado en la secuencia de comandos de python 'BruteForce.py'. A continuación, la secuencia de comandos analizó las alineaciones de transcrito-oligo para generar una puntuación basada en la posición y el número de apareamientos erróneos entre el ARNip y cualquier posible transcrito ‘inespecífico'. La puntuación inespecífica se pondera para enfatizar las diferencias en la región “semilla” de los ARNip, en las posiciones 2-9 desde el extremo 5' de la molécula. Cada par de oligo-transcrito de la búsqueda de fuerza bruta recibió una puntuación de apareamiento erróneo sumando las puntuaciones de apareamiento erróneo individuales; los apareamientos erróneos en las posiciones 2-9 se contaron como 2,8, los apareamientos erróneos en las posiciones del sitio de escisión 10-11 se contaron como 1,2 y los apareamientos erróneos en la región 12-19 se contaron como 1,0. Se llevó a cabo una predicción inespecífica adicional comparando la frecuencia de heptámeros y octómeros derivados de 3 hexámeros distintos derivados de semillas de cada oligo. Los hexámeros de las posiciones 2-7 en relación con el inicio 5' se usaron para crear 2 heptámeros y un octómero. Se creó el ‘heptámero 1' añadiendo una A 3' al hexámero; se creó el ‘heptámero 2' añadiendo una A 5' al hexámero; se creó el octómero añadiendo una A los extremos tanto 5' como 3' del hexámero. Se calculó previamente la frecuencia de octómeros y heptámeros en el 3'UTRoma humano (definido como la subsecuencia del transcriptoma de la base de datos Refseq de NCBI donde el final de la región codificante, el ‘CDS', está claramente definido). La frecuencia de octómeros se normalizó a la frecuencia de heptámeros utilizando la mediana del valor del intervalo de frecuencias de octómeros. Entonces se calculó una ‘mirSeedScore' calculando la suma de ((3 X recuento de octómeros normalizado) (2 X recuento de heptámero 2) (1 X recuento de heptámero 1)).

Ambas hebras de ARNip se asignaron a una categoría de especificidad según las puntuaciones calculadas: una puntuación por encima de 3 se califica como altamente específica, igual a 3 como específica y entre 2,2 y 2,8 como moderadamente específica. La clasificación se llevó a cabo por la especificidad de la hebra antisentido. Entonces, se seleccionaron los dúplex del conjunto humano/cyno con oligos antisentido que carecían de coincidencias de semillas de mARNi, puntuaciones de 3 o mejores, menos del 65% de contenido global de GC, sin GC en la primera posición, 4 o más U o A en la región de semillas y GC en la decimonovena posición. También se seleccionaron dúplex del conjunto humano/cyno/ratón con oligos antisentido que tenían puntuaciones de 2 o mejores, menos del 65% de contenido global de GC y sin GC en la primera posición.

Selección de secuencias de ARNip

Se sintetizó un total de 47 oligos de ARNip sentido y 47 antisentido derivados del conjunto humano/cyno y se formaron en dúplex. Se sintetizó un total de 15 ARNip sentido y 15 antisentido derivados del conjunto humano/cyno/ratón y se formaron en dúplex.

Síntesis de secuencias de ANGPTL3

Las secuencias de ANGPTL3 se sintetizaron en un sintetizador MerMade 192 a una escala de o bien 1 o bien 0,2 |imol. Se sintetizaron hebras individuales con modificaciones de 2'O-metilo para el cribado in vitro basado en transfección. Para su uso en ensayos de cribado de captación libre, se prepararon conjugados de GalNAc 3' con modificaciones químicas de 2'F y 2'-O-metilo. En estos diseños, el resto GalNAc se colocó en el extremo 3' de la hebra sentido. La secuencia antisentido tenía 23 nucleótidos de longitud y también contenía modificaciones químicas de 2'F y 2'O-metilo con dos uniones fosforotioato en el extremo 3'.

En un conjunto de hebras individuales y dúplex de 21 meros, se aplicó química ‘endolight' tal como se detalla a continuación.

• Todas las pirimidinas (citosina y uridina) en la hebra sentido se modificaron con nucleótidos de 2'-O-metilo (2' O-metil C y 2'-O-metil U) •

• En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes (hacia la posición 5') al nucleósido de ribo A se reemplazaron por sus correspondientes nucleósidos de 2'-O-metilo.

• Se introdujo una extensión de dTsdT de dos bases en el extremo 3' de las secuencias tanto sentido como antisentido.

Para secuencias sentido de 21 meros conjugadas con GalNAc y secuencias antisentido de 23 meros complementarias, se sintetizaron hebras individuales modificadas con 2'F y 2'O-metilo. La síntesis se realizó sobre un soporte de CPG modificado con GalNAc para la hebra sentido y de CPG modificado con soporte universal para la secuencia antisentido a una escala de 1 |imol. Se aplicó el motivo de secuencia denominado TOFFEE, en el que la hebra sentido contenía un motivo modificado con 2'F de tres nucleótidos en las posiciones 9, 10 y 11 y, en la antisentido, se incluyó un motivo modificado con 2'O-metilo en las posiciones 11, 12 y 13.

Síntesis, escisión y desprotección

La síntesis de las secuencias de ANGPTL3 uso síntesis de oligonucleótidos con soporte sólido usando química de fosforamidita. Para las secuencias endolight de 21 meros, se usó un CPG de desoxitimidina como soporte sólido, mientras que para los conjugados de GalNAc, se usó un soporte sólido de GalNAc para la hebra sentido y un CPG universal para la hebra antisentido.

La síntesis de las secuencias anteriores se realizó a una escala de o bien 1 o bien 0,2 |im en placas de 96 pocillos. Las disoluciones de amidita se prepararon a una concentración de 0,1 M y se usó etiltiotetrazol (0,6 M en acetonitrilo) como activador.

Las secuencias sintetizadas se escindieron y se desprotegieron en placas de 96 pocillos, usando metilamina en la primera etapa y reactivo de fluoruro en la segunda etapa. Para las secuencias que contienen nucleósidos de 2'F y GalNAc, se modificaron las condiciones de desprotección. Las secuencias después de la escisión y la desprotección se precipitaron usando una mezcla de acetona:etanol (80:20) y los sedimentos se resuspendieron en tampón acetato de sodio 0,2 M. Las muestras de cada secuencia se analizaron mediante CL-EM para confirmar la identidad, UV para la cuantificación y un conjunto seleccionado de muestras mediante cromatografía IEX para determinar la pureza.

Purificación, desalinización y apareamiento

Las secuencias de ANGPTL3 se precipitaron y purificaron en un sistema AKTA Purifier usando una columna Sephadex. El ANGPTL3 se ejecutó a temperatura ambiente.

La inyección y recogida de muestras se realizó en placas de 96 pocillos con pocillos que tenían una profundidad de 1,8 ml. Se recogió en el eluyente un solo pico correspondiente a la secuencia de longitud completa. Se analizó la concentración de las secuencias de ANGPTL3 desaladas (mediante medición de UV a A260) y la pureza (mediante HPLC de intercambio iónico). Las hebras individuales complementarias se combinaron entonces en una relación estequiométrica de 1:1 para formar dúplex de ARNip.

Ejemplo 2. Cribado in vitro

Cultivo celular y transfecciones

Se cultivaron células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) hasta casi la confluencia a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2 en RPMI (ATCC) suplementado con FBS al 10%, estreptomicina y glutamina (ATCC) antes liberarse de la placa por tripsinización. La transfección se llevó a cabo añadiendo 14,8 |il de Opti-MEM más 0,2 |il de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. n.° de cat. 13778-150) a 5 |il de dúplex de ARNip por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Entonces se añadieron 80 |il de medio de crecimiento completo sin antibiótico que contenía ~2 * 104 células Hep3B a la mezcla de ARNip. Las células se incubaron durante o bien 24 o bien 120 horas antes de la purificación del ARN. Ser realizaron experimentos de una sola dosis a una concentración de dúplex final de 10 nM y 0,1 nM y se realizaron experimentos de respuesta a la dosis a una concentración de dúplex final de 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 y 0,00001 nM, a menos que se establezca otra cosa.

Transfección de captación libre

Se combinaron 5 |il de cada ARNip conjugado con GalNac en PBS se combinó con 4*104 hepatocitos de macaco cangrejero crioconservados recién descongelados resuspendidos en 95 |il de medio In Vitro Gro CP (In Vitro Technologies-Celsis, Baltimore, MD) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La mezcla se incubó durante aproximadamente 24 horas a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2. Los ARNip se sometieron a prueba a concentraciones finales de 500 nM, 100 nM y 10 nM para determinar la eficacia de los ensayos de captación libre. Para los exámenes de respuesta a la dosis, las concentraciones finales de ARNip fueron 500 nM, 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0,8 nM, 0,16 nM, 0,032 nM y 0,0064 nM.

Aislamiento de ARN total usando el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, n.° de pieza: 610-12)

Las células se recogieron y lisaron en 150 |il de tampón de lisis/unión y luego se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm usando un instrumento Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado fue la misma durante todo el proceso). Se añadieron diez microlitros de perlas magnéticas y 80 |il de mezcla de tampón de lisis/unión a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas magnéticas se capturaron usando un soporte magnético y el sobrenadante se eliminó sin perturbar las perlas. Después de eliminar el sobrenadante, se añadieron las células lisadas a las perlas restantes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se lavaron las perlas magnéticas 2 veces con 150 |il de tampón de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas se capturaron de nuevo y se eliminó el sobrenadante. Entonces se lavaron las perlas con 150 |il de tampón de lavado B, se capturaron y se eliminó el sobrenadante. A continuación, se lavaron las perlas con 150 |il de tampón de elución, se capturaron y se eliminó el sobrenadante. Se permitió que las perlas se secaran durante 2 minutos. Después del secado, se añadieron 50 |il de tampón de elución y se mezcló durante 5 minutos a 70°C. Las perlas se capturaron en un imán durante 5 minutos. Se retiraron 40 |il de sobrenadante y se añadieron a otra placa de 96 pocillos.

Síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, n ° de catálogo 4368813)

Una mezcla maestra de 2 |il de tampón 10X, 0,8 |il de dNTP 25X, 2 |il de cebadores al azar, 1 |il de transcriptasa inversa, 1 |il de inhibidor de ARNasa y 3,2 |il de H2O por reacción se añadió a 10 |il de ARN total. Se generó ADNc usando un termociclador C-1000 o S-1000 de Bio-Rad (Hercules, CA) a través de las siguientes etapas: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 s, mantenimiento a 4°C.

PCR en tiempo real

Se añadieron 2 |il de ADNc a una mezcla maestra que contenía 0,5 |il de sonda GAPDH TaqMan (n.° de catálogo de Applied Biosystems 4326317E), 0,5 |il de sonda ANGPTL TaqMan (n.° de catálogo de Applied Biosystems Hs00205581_ml) y 5 |il de mezcla maestra de sonda Lightcycler 480 (n.° de catálogo de Roche 04887301001) por pocillo en 50 placas de 384 pocillos (n.° de catálogo de Roche 04887301001). La PCR en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando el ensayo AACt(RQ). Cada dúplex se sometió a prueba en dos transfecciones independientes y cada transfección se sometió a ensayo por duplicado, a menos que se indique lo contrario en las tablas de resumen.

Para calcular el cambio en veces relativo, se analizaron los datos en tiempo real usando el método de AACt y se normalizaron a ensayos realizados con células transfectadas con AD-1955 10 nM o células transfectadas de manera simulada. Se calcularon las CI50 usando un modelo de ajuste de 4 parámetros usando XLFit y se normalizaron a células transfectadas con AD-1955 o células vírgenes a lo largo del mismo intervalo de dosis, o a su propia dosis más baja. La secuencia de AD-1955, usada como control negativo, selecciona como diana luciferasa y tiene la siguiente secuencia:

sentido:

cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 14);

antisentido:

UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 15).

Exámenes de viabilidad

Se midió la viabilidad celular los días 3 y 6 en células HeLa y Hep3B después de la transfección con ARNip 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05 nM. Las células se sembraron en placa a una densidad de 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Cada ARNip se sometió a ensayo por triplicado y se calculó el promedio de los datos. Se incluyeron ARNip que seleccionan como diana PLK1 y AD-19200 como controles positivos para determinar la pérdida de viabilidad, y células transfectadas con AD-1955 y de manera simulada como controles negativos. PLK1 y AD-19200 dan como resultado una pérdida de viabilidad dependiente de la dosis. Para medir la viabilidad, se añadieron 20 |il de CellTiter Blue (Promega) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos después de 3 o 6 días y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Luego se leyeron las placas en un espectrofotómetro (Molecular Devices) a 560 ex./590 em. La viabilidad se expresó como el valor promedio de unidades de luz de tres transfecciones repetidas /- desviación estándar. La viabilidad relativa se evaluó en primer lugar calculando el promedio de las tres transfecciones repetidas y luego normalizando las células transfectadas de manera simulada. Los datos se expresan como % de células viables.

Tabla 1: Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de secuencias de ácido nucleico.

cu

Los nucleótidos en minúsculas (a, u, g, c) son nucleótidos de 2'-O-metilo; s es una unión fosfotiorato.

Tabla 4. Resultados de un examen de una sola dosis usando secuencias de ARNbc de ANGPTL3

Tabla 5. Resultados del examen de respuesta a la dosis para secuencias de ARNbc de ANGPTL3

^oCÜ

_o CC ^{£ O} _O

^{< ~of)} _cO ^G _{e £)} ^’Eo^' _ocO CL

O

" OD) _üQ ZCL

< _"0_D) ce _u ^‘■O^D

(/) tO -t->; ^{c 0} _(/ ⁾ ₎’cCO o

^c0_CO)

^_0^Q)

_"0_D) _(c0e ^‘o£0£)

_{ü C0O)}h~ j e _Q

El símbolo “x” indica que la secuencia contiene un conjugado de GalNAc.

Los nucleótidos en minúscula (a, u, g, c) son nucleótidos de 2'-O-metilo; Nf (por ejemplo, Af) es un nucleótido de 2'-fluoro; s es una unión fosfotiorato; L96 indica un ligando de GalNAc.

Tabla 12. Resultados del examen de respuesta a la dosis para secuencias de ARNbc de ANGPTL3 conjugados con GalNac

Tabla 13. Resultados del examen de una sola dosis usando las secuencias enumeradas en la tabla 10.

Tabla 14. Resultados de un examen de respuesta a la dosis usando un subconjunto de secuencias de la tabla 13.

Tabla 15. ID de pares de dúplex para los que se sintetizó y se sometió a prueba tanto una versión conjugada con GalNac como una no conjugada

Pruebas in vivo

Ejemplo 3

Artículos de prueba

Se realizaron experimentos in vivo usando secuencias de ARNbc de la invención. La secuencia de ARNbc usada en los experimentos fue AD-52981 conjugada con GalNac (“ANG”, secuencia sentido: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO: 657); secuencia antisentido: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO: 842)). La secuencia de ARNbc usada como control negativo fue AD-48399B1 conjugada con luciferasa (“Luc”, secuencia sentido: CfaCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAfL96 (SEQ ID NO: 1728), secuencia antisentido: uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgUfgsAfsu (SEQ ID NO: 1729)). También se usó como control negativo AD-1955 conjugada con GalNal que contenía modificaciones de 2'-metilo y 2'-fluoro alternas. Procedimiento experimental

Las secuencias de ARNbc se sometieron a prueba en ratones C57BL/6 (WT) y ob/ob. Los ratones WT recibieron cinco dosis diarias de ARNbc en PBS, Luc a 20 mg/kg o ANG a 5 o 20 mg/kg; y los ratones ob/ob recibieron cinco dosis diarias de NPL formuladas con Luc a 20 mg/kg o ANG a 20 mg/kg. Todos los artículos de prueba se administraron mediante inyección subcutánea según el procedimiento mostrado en la figura 1. Específicamente, se administraron cinco dosis diarias de los artículos de prueba en cinco días consecutivos (día 0, 1, 2, 3 y 4), y se recogieron muestras de sangre 5, 3 o 1 día(s) antes de la administración, así como los días 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 15, 18, 21, 25, 30, 37, 45 y 50 después de la administración. Las muestras de sangre recogidas se usaron para medir la expresión de proteína ANGPTL3 usando un ensayo ELISA. También se midieron los niveles de triglicéridos (TG), colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDLc), colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDLc) y colesterol total (TC) en suero usando un analizador Olympus.

Resultados

En la figura 2, panel A, se muestran los niveles de ANGPTL3 murina (mANGPTL3, proteína medida en ratones WT después de la administración de control o ANG a 5 o 20 mg/kg). También se muestran en la figura 2, panel B, los niveles de proteína mANGPTL3 medidos en ratones ob/ob después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que, para ratones tanto WT como ob/ob, la administración de ANG da como resultado una disminución de los niveles de proteína mANGPTL3, en comparación con los controles.

En la figura 3, panel A, se muestran los niveles de LDL-c medidos en ratones WT después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. En la figura 3, panel B, se muestran los niveles de LDL-c medidos en ratones ob/ob después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de ANG provoca una disminución de los niveles de LDL-c, particularmente en ratones ob/ob, en comparación con los controles.

En la figura 4, panel A, se muestran los niveles de triglicéridos medidos en ratones WT después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. En la figura 4, panel B, se muestran los niveles de triglicéridos medidos en ratones ob/ob después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de ANG provoca una disminución de los niveles de triglicéridos, particularmente en ratones ob/ob, en comparación con los controles.

En la figura 5, paneles A y B, se muestran los niveles de colesterol total (TC) medidos en ratones WT y ob/ob, respectivamente, después de la administración de control o ANG a 20 mg/kg. Los datos indican que la administración de ANG provoca una disminución moderada de los niveles de TC en ratones ob/ob, pero no en ratones WT. De manera similar, la administración de ANG provoca una disminución moderada de los niveles de HDL-c en ratones ob/ob, pero no en ratones WT, tal como se muestra en los gráficos de la figura 6.

Ejemplo 4

Artículo de prueba

Se sometió a prueba el efecto de una sola inyección de secuencia de ARNbc de la invención sobre el nivel de proteína ANGPTL3. La secuencia de ARNbc usada en el experimento fue AD-52981 conjugada con GalNac (“ANG”, secuencia sentido: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO: 657); secuencia antisentido: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO: 842)). Se usó PBS como control negativo.

Procedimiento experimental

Las secuencias de ARNbc se sometieron a prueba en ratón transgénico para PCS humana caracterizado por expresión específica del hígado del gen de PCSK9 humano de longitud completa. A los ratones transgénicos para PCS humana se les dosificó AD-52981 o PBS usando una sola inyección subcutánea. Los ratones se dividieron en cuatro grupos, consistiendo cada grupo en dos machos y dos hembras. Cada grupo recibió una inyección de PBS o una dosis de 5 mg/kg, 20 mg/kg o 60 mg/kg de AD-52981. Se recogieron muestras de sangre el día 1 y el día 0 antes de la dosificación, y a las 72 horas después de la dosificación. Se midieron los niveles de proteína ANGPTL3 mediante ELISA y se compararon con los niveles en el día 1 y el día 0 antes de la dosificación.

Resultados

En la figura 7 se muestran los niveles de proteína ANGPTL3 murina (mANGPTL3) medidos en ratones transgénicos para PCS humana. Los datos mostrados se expresan en relación con el control de PBS y representan un promedio para 2 machos y 2 hembras en cada grupo. Las barras de erros representan la desviación estándar. Los datos indican que la administración de una sola inyección de AD-52981 reduce los niveles de proteína ANGPTL3 en los ratones de una manera dependiente de la dosis, disminuyendo la dosis de 60 mg/kg los niveles de proteína ANGPTL3 más de cinco veces (véase la figura 7).

SECUENCIAS SEQ ID NO: 1

>gi|41327750|ref|NM_014495.2| proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) de Homo sapiens, ARNm

T T C CAGAAGAAAACAGT T CCACGTTGCTTGAAATTGAAAATCAAGATAAAAATGT TCACAAT TAAGCTCCT TCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATCATTTGATTCTCTATCTC CAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGA CATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACGAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATT TGATCAGTCTTTTTATGATCTATCGCTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAA CTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAA AGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAAT TCAAAATCAACCTGAAACTCCAGAACACCCAGAAGTAACTTCACTTAAAACTTTTGTAGAAAAACAAGATA ATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACCGTGGAAGACCAATATAAACAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATA AAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAGGACTAGTATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCC AAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTG CTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCT CAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGG ATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGT TGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGG AAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCT AGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATC ACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGA GAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTATC TTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAG AAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAATTTAAACATTAACCTCATTCCAAGTTAATGT GGTCTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAAGCTTGAGAAATAGATTTTTTTTATCTTAAAGTCACT GTCTATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCGTTTACATTTCTCAATCAAAATTCT TATAATACTATTTGTTTTAAATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCACAATCTAGATTATAATC AATAGGTGAACTTATTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAATTTAGAGACTTTTATTTTAAAAGGCATCATAT GAGCTAATATCACAACTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTACTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATAC AGAGGACTGGTAATTGTACAGTTCTTAAATGTTGTAGTATTAATTTCAAAACTAAAAATCGTCAGCACAGA GTATGTGTAAAAATCTGTAATACAAATTTTTAAACTGATGCTTCATTTTGCTACAAAATAATTTGGAGTAA ATGTTTGATATGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGAATTAAATACTGTATTAAAATAAGTTCGCTGT CTTTAAACAAATGGAGATGACTACTAAGTCACATTGACTTTAACATGAGGTATCACTATACCTTATT

SEQ ID NO: 2

>gi|297278846|ref|XM_001086114.2| PREDICHA: proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3) de Macaca mulatta, ARNm

ATATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGTTGCTTGAAATTGAAAATC AGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGACCA AGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAA TTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATT AATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAAT C AAAGAAGAAGAAAAGGAACT GAGAAGAAC TACATATAAACTACAAGT CAAAAATGAAGAGG TAAAGAATA TGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAA TAT T TAGAAGAG CAAC TAAC TAACTTAAT TCAAAATC AACCTGAAACT CCAGAACATCCAGAAG TAAC T TC ACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATA AGCAATTAAACCAACAGCACAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAA CCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAAT AAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTG GCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTAICAGGTAAAACC TGTCTAAGGAGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAG GCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTAC GAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAA ACCAACTATACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTT GGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGT GGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATCTAAGCCA GAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTT GAT C CAT C CAACAGAT T CAGAAAGC TT TGAATGAACTGAGGCAAAT T TAAAAGGCAATAAAT TAAACAT TA AACTCATTCCAAGTTAATGTGGTTTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAGGCTTGAGAAATAGATT TTTTTATCTTAAAGTCACTGTCAATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCATTTAC ATTTCTCAATCAAAATTCCTACAACACTATTTGTTTTATATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGT CGCAATCTAAATTATAATCAACAGGTGAACTTACTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAACTTAGAGACTTTA ATTTTAAAAGTCATCATATGAGCTAATATCACAATTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTTTTCTTGTTAAAAC TCTAAACTTGACTAAATAAAGAGGACTGATAATTATACAGTTCTTAAATTTGTTGTAATATTAATTTCAAA ACTAAAAATTGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATATAAATTTTTAAACTGATGCCTCATTTTG CTACAAAATAATCTGGAGTAAATTTTTGATAGGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGGATTAAATACT GTATTAAAATAGGTTCGCTGTCTTTTAAACAAATGGAGATGATGATTACTAAGTCACATTGACTTTAATAT GAGGTATCACTATACCTTA

SEQ ID NO: 3

>gi|142388354|ref|NM_013913.3| proteína 3 de tipo angiopoyetina (Angptl3) de Mus musculus, ARNm

CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTC CTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTC AGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTC ATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTT GATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAAC TACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGA GTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATT CTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAA CAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAA AAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCA AGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGC CGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCC AAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGC TCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTT GGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGA AAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTG GCTGAGATTGCTGGCAATATCCCIGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCA CAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAG AAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTAC TGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCGAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGA AGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGT AATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGA TCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATC

SEQ ID NO: 4

>gi|68163568|ref|NM_001025065.1| proteína 3 de tipo angiopoyetina (Angptl3) de Rattus norvegicus, ARNm

GACGTTCCAAATTGCTTGAAATTGAATAATTGAAACAAAAATGCACACAATTAAGCTGCTCCTTTTTGTTG TTCCTCTAGTAATTTCGTCCAGAGTTGATCCAGACCTTTCGCCATTTGATTCTGTACCGTCAGAGCCAAAA TCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGTCTTAA AGATTTTGTCCATAAGACAAAGGGACAAATTAATGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTGTT T T T AT GACC T AT C AC T T C AAAC C AAT GAAAT C AAAG AAG AGG AAAAGG AGC T AAGAAG AAC C AC AT C TAAA C TAC AAG T TAAAAAC GAAGAG G T G AAGAAT AT GT C AC T T GAAC T G AAC T C AAAG C T T G AAAG T C T AC T GG A GGAGAAGATGGCGCTCCAACACAGAGTCAGGGCTTTGGAGGAACAGCTGACCAGCTTGGTTCAGAACCCGC CTGGGGCTCGGGAGCACCCAGAGGTAACGTCACTTAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGATAACAGCATAAGA GAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAATATAAACAACTAAGTCAACAGCACATTCAGATAAAAGAAATAGA AAATCAGCTCAGAAAGACTGGCATTCAAGAACCCACTGAAAATTCTCTTTATTCTAAACCAAGAGCACCAA GAACTACTCCCCCTCTTCATCTGAAGGAAGCAAAAAATATAGAACAAGATGATCTGCCTGCTGACTGCTCT GCCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCGTGTATACTATTAGACCAAGCAGCTCTCAAGTGTTTAA TGTCTACTGTGACACCCAATCAGGCACTCCACGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCTCAAAACT TCAACCAAACGTGGGAAAACTACGAAAAGGGTTTTGGGAGGCTTGATGGTAAAGTGATTTCCTTGCATCAC TCACTTATCTGTTGATTTAATAGTATTAGTTGGGTGTGTTGACACAGGCCTGAGACCATAGCGCTTTTGGG CAAGGGGGGAGGAGGAGCAGCAGGTGAATTGAAAGTTCAAGACCAGTCTGGGCCACACATTGATACTCCTT CTCGACATTAAGAATTATAAATTAAGCAGCAATTATAAAATGGGCTGTGGAAATGTAACAATAAGCAAAAG CAGACCCCAGTCTTCATAAAACTGATTGGTAAATATTATCCATGATAGCAACTGCAATGATCTCATTGTAC TTATCACTACTGCATGCCTGCAGTATGCTTGTTGAAACTTAATTCTATAGTTCATGGTTATCATAAGTCTT ATTAAGGAACATAGTATACGCCATTGGCTCTAGTGAGGGGCCATGCTACAAATGAGCTGCAAAGATAGCAG TATAGAGCTCTTTCAGTGATATCCTAAGCACAACGTAACACAGGTGAAATGGGCTGGAGGCACAGTTGTGG TGGAACACGCGGCCAGCAGGACACTGGGACTGATCCCCAGCAGCACAAAGAAAGTGATAGGAACACAGAGC GAGAGTTAGAAGGGACAGGGTCACCGTCAGAGATACGGTGTCTAACTCCTGCAACCCTACCTGTAATTATT CCATATTATAAACATATACTATATAACTGTGGGTCTCTGCATGTTCTAGAATATGAATTCTATTTGATTGT AAAACAAAACTAT AAAAAT AAGTAAAAAAATAAAAAATAAACAGATAC T T AAAAT C AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 5 Complemento inverso de SEQ ID NO: 1

AATAAGGTATAGTGATACCTCATGTTAAAGTCAATGTGACTTAGTAGICATCTCCATTTGTTTAAAGACAG CGAACTTATTTTAATACAGTATTTAATTCTGCTTCATTAGGTTTCATAAATAAATCATATCAAACATTTAC TCCAAATTATTTTGTAGCAAAATGAAGCATCAGTTTAAAAATTTGTATTACAGATTTTTACACATACTCTG TGCTGACGATTTTTAGTTTTGAAATTAATACTACAACATTTAAGAACTGTACAATTACCAGTCCTCTGTAT TTAGTCAAGTTTAGAGTTTTAACAAGAGTACTAGTTTTTTAAACTGGGAAAGTTGTGATATTAGCTCATAT GATGCCTTTTAAAATAAAAGTCTCTAAATTTTTTATTTAGAAAAGTTATTTAATAAGTTCACCTATTGATT ATAATCTAGATTGTGACCATCTAAAATTGATTCCCACATCACAAAATTTAAAACAAATAGTATTATAAGAA TTTTGATTGAGAAATGTAAACGGTATTCTTTAAGGTTATGTGATTGTATGTTTAATCTTAAATAGACAGTG ACTTTAAGATAAAAAAAATCTATTTCTCAAGCTTTCTCTTAAGGATTTAATACCAGATTATTAGACCACAT TAACTTGGAATGAGGTTAATGTTTAAATTATTGCCTTTTAAATTTGCCTCAGTTCATTCAAAGCTTTCTGA ATCTGTTGGATGGATCAACATTTTGGTTGATTTTATAGAGTATAACCTTCCATTTTGAGACTTCCAAGATA ATCCTCTTCTCCTCTCTGGCTTAGATTTTGCTCTTGGTTTGTTATATTTACCATTTAGGTTGTTTTCTCCA CACTCATCATGCCACCACCAGCCTCCTGAATAACCCTCTGGACAGTTGAAGTGTCCTTTTGCTTTGTGATC CCAAGTAGAAAACACCAAATCTTTGTTTTCCGGGATTGCATTGGGGACATTGCCAGTAATCGCAACTAGAT GTAGCGTATAGTTGGTTTCGTGATTTCCCAAGTAAAAAGAATATTCAATATAATGTTTGTTGTCTTTCCAG TCTTCCAACTCAATTCGTAAAACATAATTAGATTGCTTCACTATGGAGTATATCTTCTCTAGGCCCAACCA AAATTCTCCATCAAGCCTCCCAAAACCATATTTGTAGTTCTCCCACGTTTCATTGAAGTTTTGTGATCCAT CTATTCGATGTTGAATTAATGTCCATGGACTACCTGATATAACATCACAGTAGACATGAAAAACTTGAGAG TTGCTGGGTCTGATGGCATACATGCCACTTGTATGTTCACCTCTGTTATAAATGGTGGTACATTCAGCAGG AATGCCATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAACTGAAGAAAGGGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGCT TGGAAGATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATACTAGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATT TGACTATGCTGTTGGTTTAATTGTTTATATTGGTCTTCCACGGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATC TTGTTTTTCTACAAAAGTTTTAAGTGAAGTTACTTCTGGGTGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTA AGTTAGTTAGTTGCTCTTCTAAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCA AGTTTTGAGTTGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGTAGTTCT TCTCAGTTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGCGATAGATCATAAAAAGACTGATCAAATA TGTTGAGTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTCGTCTTATGGACAAAGTCTTTAAGACCATGTCCC AACTGAAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATCGTCTAACATAGCMATCTTGATTTTGGCTCTGGAGA TAGAGAATCAAATGATGAATTGTCTTGATCAATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGA GCTTAATTGTGAACATTTTTATCTTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTTTTCTTCTGGAA

SEQ ID NO: 6 Complemento inverso de SEQ ID NO: 2

TAAGGTATAGTGATACCTCATATTAAAGTCAATGTGACTTAGTAATCATCATCTCCATTTGTTTAAAAGAC AGCGAACCTATTTTAATACAGTATTTAATCCTGCTTCATTAGGTTTCATAAATAAATCCTATCAAAAATTT ACTCCAGATTATT T TGTAGCAAAATGAGGCATCAGTTTAAAAATT TATAT TACAGAT T T T TACACATAC T C TGTGCTGACAATTTTTAGTTTTGAAATTAATATTACAACAAATTTAAGAACTGTATAATTATCAGTCCTCT TTATTTAGTCAAGTTTAGAGTTTTAACAAGAAAACTAGTTTTTTAAACTGGGAAAATTGTGATATTAGCTC ATATGATGACTTTTAAAATTAAAGTCTCTAAGTTTTTTATTTAGAAAAGTTATTTAGTAAGTTCACCTGTT GATTATAATTTAGATTGCGACCATCTAAAATTGATTCCCACATCACAAAATATAAAACAAATAGTGTTGTA GGAATTTTGATTGAGAAATGTAAATGGTATTCTTTAAGGTTATGTGATTGTATGTTTAATCTTAAATTGAC AGTGACTTTAAGATAAAAAAATCTATTTCTCAAGCCTTCTCTTAAGGATTTAATACCAGATTATTAAACCA CATTAACTTGGAATGAGTTTAATGTTTAATTTATTGCCTTTTAAATTTGCCTCAGTTCATTCAAAGCTTTC TGAATCTGTTGGATGGATCAACATTTTGGTTGATTTTATAGAGTATAACCTTCCATTTTGAGACTTCCAGG ATAATCCTCTTCTCCGCTCTGGCTTAGATTTTGTTCTTGGTTTGTTATATTTACCATTTAGGTTGTTTTCT CCACACTCATCATGCCACCACCAGCCTCCTGAATAACTCTCTGGACAGCTGAAGTGTCCTTTTGCTTTGTG ATCCCAAGTAGAAAACACCAAATCTTTGTTTTCCGGGATTGCATTGGGGACATTGCCAGTAATCTTAACTA CATGTAGCGTATAGTTGGTTTCGTGATTTCCCAAGTAAAAAGAATATTCAATATAATGTTTGTTGTCTTTC CAGTCTTCCAACTCAATTCGTAAAACGTAATTAGATTGCTTCACTATGGAGTATATCTTCTCTAGGCCCAA CCAGAATTCTCCATCAAGCCTCCCGAAACCATATTTGTAGTTCTCCCACGTTTCATTGAAGTTTTGTGATC CATCTATTCTCCTTAGACAGGTTTTACCT GATACAACAT CACAG TAGACAT GAAAAAC T T GAGAGT T GCTG GGTCTGATGGCATACATGCCACTTATATGTTCACCTCTATTGTAAATGGTGGTACAATCAGCAGGAATGCC ATCATGTTTTACATTTCTTATTTCATTCAGCTGAAGAAAGGGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGCTTGGAAG ATAGAGAAATTTCTGTGGGTTCTTGAATATTAGTCATTCTGAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATTTGACTG TGCTGTTGGTTTAATTGCTTATATTGTTCTTCCACAGTCTGGAGAAGGTCTTTGATGCTATTATCTTGTTT TTCTACAAAACTTTTAAGTGAAGTTACTTCTGGATGTTCTGGAGTTTCAGGTTGATTTTGAATTAAGTTAG TTAGTTGCTCTTCTAAATATTTCACTTTTTGTTGAAGTAGAATTTTTTCTTCTAGGAGGCTTTCAAGTTTT GAGTTGAGTTCAAGTGACATATTCTTTACCTCTTCATTTTTGACTTGTAGTTTATATGTAGTTCTTCTCAG TTCCTTTTCTTCTTCTTTGATTTCACTGGTTTGCAGTGATAGATCATAAAAAGACTGATCAAATATGTTGA GTTTTTGAAATATGTCATTAATTTGGCCCTTAGTCTTATGGACAAAGTCTTTAAGACCATGTCCCAACTGA AGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTTACATCGTCTAACATAGCAAATCTTGATTTTGGCTCTGGAGATACAGA ATCAAATGATGAATTGTCTTGGTCAATTCTGGAGGAAATAACTAGAGGAACAATAAAAAGAAGGAGCTTAA TTGTGAACATTTTTATCCTGATTTTCAATTTCAAGCAACGTGGAACTGTGTTCTTCTGGAAGCAGACCTAG ACTTCTTAACTCTATATAT

SEQ ID NO: 7 Complemento inverso de SEQ ID NO: 3

CAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTC CTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTC AGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTC ATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTT GATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAAC TACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGA GTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATT CTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAA CAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAA AAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCA AGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGC CGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCC AAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGC TCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTT GGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGA AAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTG GCTGAGATTGCTGGCAATATCCCTGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCA CAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAG AAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTAC TGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGA AGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGT AATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGA TCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATC

SEQ ID NO: 8 Complemento inverso de SEQ ID NO: 4 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATTTTAAGTATCTGTTTATTTTTTATTTTTTTACTTATTTTTATA GTTTTGTTTTACAATCAAATAGAATTCATATTCTAGAACATGCAGAGACCCACAGTTATATAGTATATGTT TATAATATGGAATAATTACAGGTAGGGTTGCAGGAGTTAGACACCGTATCTCTGACGGTGACCCTGTCCCT TCTAACTCTCGCTCTGTGTTCCTATCACTTTCTTTGTGCTGCTGGGGATCAGTCCCAGTGTCCTGCTGGCC GCGTGTTCCACCACAACTGTGCCTCCAGCCCATTTCACCTGTGTTACGTTGTGCTTAGGATATCACTGAAA GAGCTCTATACTGCTATCTTTGCAGCTCATTTGTAGCATGGCCCCTCACTAGAGCCAATGGCGTATACTAT GTTCCTTAATAAGACTTATGATAACCATGAACTATAGAATTAAGTTTCAACAAGCATACTGCAGGCATGCA GTAGTGATAAGTACAATGAGATCATTGCAGTTGCTATCATGGATAATATTTACCAATCAGTTTTATGAAGA CTGGGGTCTGCTTTTGCTTATTGTTACATTTCCACAGCCCATTTTATAATTGCTGCTTAATTTATAATTCT TAATGTCGAGAAGGAGTATCAATGTGTGGCCCAGACTGGTCTTGAACTTTCAATTCACCTGCTGCTCCTCC TCCCCCCTTGCCCAAAAGCGCTATGGTCTCAGGCCTGTGTCAACACACCCAACTAATACTATTAAATCAAC AGATAAGTGAGTGATGCAAGGAAATCACTTTACCATCAAGCCTCCCAAAACCCTTTTCGTAGTTTTCCCAC GTTTGGTTGAAGTTTTGAGAGCCATCTTTCCGGTGTTGAATTAATGTCCGTGGAGTGCCTGATTGGGTGTC ACAGTAGACATTAAACACTTGAGAGCTGCTTGGTCTAATAGTATACACGCCACTTGTATGTTCACCTCTGT TATAAATGGCAGAGCAGTCAGCAGGCAGATCATCTTGTTCTATATTTTTTGCTTCCTTCAGATGAAGAGGG GGAGTAGTTCTTGGTGCTCTTGGTTTAGAATAAAGAGAATTTTCAGTGGGTTCTTGAATGCCAGTCTTTCT GAGCTGATTTTCTATTTCTTTTATCTGAATGTGCTGTTGACTTAGTTGTTTATATTGTTCTTCCACACTCT GGAGGAGTTCTCTTATGCTGTTATCTTGCTGTTCTACAAAACTTTTAAGTGACGTTACCTCTGGGTGCTCC CGAGCCCCAGGCGGGTTCTGAACCAAGCTGGTCAGCTGTTCCTCCAAAGCCCTGACTCTGTGTTGGAGCGC CATCTTCTCCTCCAGTAGACTTTCAAGCTTTGAGTTCAGTTCAAGTGACATATTCTTCACCTCTTCGTTTT TAACTTGTAGTTTAGATGTGGTTCTTCTTAGCTCCTTTTCCTCTTCTTTGATTTCATTGGTTTGAAGTGAT AGGTCATAAAAACACTGATCAAATATGTTGAGCTTCTGAAATATGTCATTAATTTGTCCCTTTGTCTTATG GACAAAATCTTTAAGACCATGACCCAGCTGCAGGAGGCCATTGGCTAAAATTTTGACATCATCCAACATAG CAAATCTTGATTTTGGCTCTGACGGTACAGAATCAAATGGCGAAAGGTCTGGATCAACTCTGGACGAAATT ACTAGAGGAACAACAAAAAGGAGCAGCTTAATTGTGTGCATTTTTGTTTCAATTATTCAATTTCAAGCAAT TTGGAACGTC

SEQ ID NO: 9

Proteína 3 de tipo angiopoyetina (Angptl3) de Macaca fascicularis, ARNm

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de proteína 3 de tipo angiopoyetina (ANGPTL3), que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido,

en el que la hebra sentido y hebra antisentido forman una región de complementariedad de al menos 17 nucleótidos de longitud,

en el que dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado,

en el que al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido modificado con 2'-amino, y

en el que dicho ARNbc comprende un ligando que comprende un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc),

en el que la hebra antisentido comprende al menos 17 nucleótidos contiguos que difieren en no más de tres nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de:

(a) 5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3' (nucleótidos 274-296 de SEQ ID NO: 1);

(b) 5'-AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU-3' (nucleótidos 273-295 de SEQ ID NO: 1); o

(c) 5'-AGACUGAUCAAAUAUGUUG-3' (nucleótidos 276-294 de SEQ ID NO: 1).

2. ARNbc según la reivindicación 1, en el que el ARNbc comprende al menos una unión internucleotídica fosforotioato o metilfosfonato.

3. ARNbc según la reivindicación 1, en el que el derivado de GalNAc (N-acetilgalactosamina) se une a través de un enlazador ramificado bivalente o trivalente.

4. ARNbc según la reivindicación 1, en el que las hebras sentido y antisentido comprenden las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en

5'-CAUAUUUGAUCAGUCUUUUUA-3' (SEQ ID NO: 387) y

5'-UAAAAAGACUGAUCAAAUAUGUU-3' (SEQ ID NO: 572);

5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3' (SEQ ID NO: 287) y

5'-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3' (SEQ ID NO: 472);

5'-AACAUAUUUGAUCAGUCUUUU-3' (SEQ ID NO: 303) y

5'-AAAAGACUGAUCAAAUAUGUUGA-3' (SEQ ID NO: 488);

5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3' (SEQ ID NO: 39) y

5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGU-3' (SEQ ID NO: 101);

5'-CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3' (SEQ ID NO: 294) y

5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3' (SEQ ID NO: 479);

5'-UCAACAUAUUUGAUCAGUCUU-3' (SEQ ID NO: 358) y

5'-AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU-3' (SEQ ID NO: 543); y

5'-CAACAUAUUUGAUCAGUCU-3' (SEQ ID NO: 64) y

5'-AGACUGAUCAAAUAUGUUG-3' (SEQ ID NO: 126).

5. Célula aislada que contiene el ARNbc según la reivindicación 1.

6. Composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de ANGPTL3, que comprende el ARNbc según la reivindicación 1.

7. Método in vitro de inhibición de la expresión de ANGPTL3 en una célula, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la célula con el ARNbc según la reivindicación 1; y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de ANGPTL3, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de ANGPTL3 en la célula.

8. ARNbc según la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción de la expresión de ANGPTL3.

9. ARNbc para su uso según la reivindicación 8, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en un trastorno del metabolismo lipídico, hipertrigliceridemia, obesidad, hiperlipidemia, aterosclerosis, diabetes, enfermedad cardiovascular y arteriopatía coronaria.

10. ARNbc para su uso según la reivindicación 8, en el que el ARNbc es para ser administrado a una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.

11. ARNbc para su uso según la reivindicación 8, en el que un producto terapéutico adicional va a ser administrado al sujeto.

ARNbc para su uso según la reivindicación 11, en el que el producto terapéutico adicional es una estatina.