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JP7507093B2 - １７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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JP7507093B2 JP2020550112A JP2020550112A JP7507093B2 JP 7507093 B2 JP7507093 B2 JP 7507093B2 JP 2020550112 A JP2020550112 A JP 2020550112A JP 2020550112 A JP2020550112 A JP 2020550112A JP 7507093 B2 JP7507093 B2 JP 7507093B2
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Description

関連出願
本出願は、２０１８年３月２１日出願の米国仮出願第６２／６４５，９４１号、２０１８年１１月２１日出願の米国仮出願第６２／７７０，２９８号、および２０１８年１２月５日出願の米国仮出願第６２／７７５，５９０号に対する優先権の利益を主張するものである。前述の仮特許出願のそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月１２日に作成されたものであり、名称は１２１３０１－０８４２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１，３７４，０４７バイトである。
１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）は、酵素である１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素（ＨＳＤ１７Ｂ）ファミリーのメンバーであり、このファミリーのメンバーは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける性ホルモン、脂肪酸、および胆汁酸の減少または酸化を含めた種々の機能を有する（Moeller and Adamski (2009) Mol Cell Endocrinol 301: 7）。ＨＳＤ１７Ｂファミリーのメンバーは、組織分布、細胞内局在化、触媒の優先性が異なり、また、ステロイド以外の基質、例として、脂質およびレチノイドの変換も触媒するので、多様な基質特異性を有する（Marchais-Oberwinkler, et al. (2011) J Steroid Biochem Mol Biol 125 (1-2): 66-82）。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、正常なマウス肝臓および培養されたヒト肝細胞における肝臓脂質生成を増強することが実証されている（Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111: 11437）。
肝細胞は、肝臓の実質組織を形成し、エネルギーのための脂質の動員および過剰な脂質を脂肪滴（ＬＤ）の形態で貯蔵することに関与し、これにより肝臓が脂質恒常性に関与する主要な器官になっている。
ＬＤは現在、脂質代謝、膜輸送およびシグナルトランスダクションに関与する生物活性細胞小器官として認識されている。ＬＤは、一般に、中性脂質のコアで構成される（例えば、トリアシルグリセロール（ＴＧ）およびリン脂質／コレステロール単層で囲まれたコレステロールエステルなど）。多数のＬＤ特異的タンパク質が、ＬＤの膜および機能、例えば、ＬＤへの分子の流入およびＬＤからの流出の調節と関連する。優勢な肝細胞ＬＤ関連タンパク質は、タンパク質のペリリピンファミリーのメンバーであるが、低酸素誘導タンパク質２（ＨＩＧ２）、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（patanin-like phospholipase domain-containing 3）（ＰＮＰＬＡ３）、およびＨＳＤ１７Ｂ１３などの非ペリリピンタンパク質もＬＤ関連タンパク質として同定されている（Carr and Ahima (2016) Exp Cell Res 15: 187；Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111: 11437）。
ＬＤの蓄積の増加は、多くの代謝疾患および慢性線維炎症性肝疾患、例えば、肝線維症、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤなどに関連付けられる。ＨＳＤ１７Ｂ１３は、ＮＡＦＬＤを有するヒト対象およびマウスにおいてＬＤの表面に特異的に局在する、最も豊富に発現されるＬＤタンパク質の１つとして同定されている。ＮＡＦＬＤを有する患者およびマウスの肝臓においてＨＳＤ１７Ｂ１３の発現のレベルが上方制御されることも示されている。ＨＳＤ１７Ｂ１３の過剰発現の結果、ＬＤの数およびサイズの増大がもたらされる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３の肝臓での過剰発現により、肝臓における脂質生成およびＴＧ含有量が有意に増大し、それにより、脂肪肝表現型が導かれる。
Moeller and Adamski (2009) Mol Cell Endocrinol 301: 7 Marchais-Oberwinkler, et al. (2011) J Steroid Biochem Mol Biol 125 (1-2): 66-82 Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111: 11437 Carr and Ahima (2016) Exp Cell Res 15: 187；Su, et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111: 11437
慢性線維炎症性肝疾患に対する処置は現在のところ存在しない。慢性線維炎症性肝疾患を有する対象に対する現行の標準治療は、生活様式の改変および関連する共存症、例えば、高血圧症、高脂血症、糖尿病、肥満症などの管理を含む。したがって、慢性線維炎症性肝疾患の有病率は過去１０年にわたって次第に上昇しており、上昇することが予想されるので、慢性線維炎症性肝疾患を有する対象に対する代替処置が当技術分野において必要とされている。
本発明は、１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するため、および／またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害もしくは低減が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば慢性線維炎症性肝疾患に罹患しているもしくは罹患しやすい対象を処置するための本発明のｉＲＮＡ組成物の使用方法も提供する。
したがって、一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡとの相補性領域を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つからの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含むＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡとの相補性領域を含む。
一実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２１３～２４２；２５６～２８７；３６１～３８５；４４７～４８０；４８３～５２９；４８９～５２９；６３０～６５３；６８８～７１１；７５２～７７７；７５３～７７９；７７２～８０６；７８１～８０６；７９１～８５１；８２９～８５８；８７０～８９６；８９３～９３０；９００～９３０；９１０～９３２；９８０～１０９２；１１０１～１１５８；１１７６～１２１０；１３２０～１３５０；１３３５～１３７３；１４５６～１４８２；１５０６～１５３５；１５５８～１５８８；１６９９～１７４０；１７２５～１７５７；２１８２～２２１０；２１９０～２２５４；２１９４～２２１６；２２４０～２３７３；または２２４２～２２６４のいずれか１つと１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２１３～２４２；２５６～２８７；３６１～３８５；４４７～４８０；４８３～５２９；４８９～５２９；６３０～６５３；６８８～７１１；７５２～７７７；７５３～７７９；７７２～８０６；７８１～８０６；７９１～８５１；８２９～８５８；８７０～８９６；８９３～９３０；９００～９３０；９１０～９３２；９８０～１０９２；１１０１～１１５８；１１７６～１２１０；１３２０～１３５０；１３３５～１３７３；１４５６～１４８２；１５０６～１５３５；１５５８～１５８８；１６９９～１７４０；１７２５～１７５７；２１８２～２２１０；２１９０～２２５４；２１９４～２２１６；２２４０～２３７３；または２２４２～２２６４のいずれか１つからの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド７１～９３、１０１～１２３、１０８～１３０、１０９～１３１、１１２～１３４、１２３～１４５；２１３～２３５；２２０～２４２、２５６～２７８；２９２～３１４、２９３～３１５、２９９～３２１、３０１～３２３、３２４～３４６、３４９～３７１、３５０～３７２、３５１～３７３、３５２～３７４；３５３～３７５、３５５～３７７、３５６～３７８、３５７～３７９、３６１～３８３；３６３～３８５、３６５～３８７、４０２～４２４、４２２～４４４、４２３～４４５、４２７～４４９、４２８～４５０、４３１～４５３、４４７～４６９、４８９～５１１、４９０～５１２、５０７～５２９、５４１～５６３、５４７～５６９、５４８～５７０、５８５～６０７、５８９～６１１、５９２～６１４、５９３～６１５、６２０～６４２、６３０～６５２、６３１～６５３、６３２～６５４、６４９～６７１、６７６～６９８、６８８～７１０、７２３～７４５、７２８～７５０、７５２～７７４、７５３～７７５、７５５～７７７、７５７～７７９、７６３～７８５、７６４～７８６、７７２～７９４、７７８～８００、７８０～８０２、７８１～８０３、７９１～８１３、７９２～８１４、７９４～８１６、７９５～８１７、８０７～８２９、８２８～８５０、８２９～８５１；８３２～８５４；８３６～８５８；８３８～８６０；８３９～８６１、８４０～８６２、８３２～８６１；８７０～８９２；８７４～８９６、８９４～９１６；８９５～９１７；８９６～９１８；８９７～９１９；８９８～９２０；８９９～９２１；９００～９２２；９０１～９２３；９０２～９２４；９０６～９２８；９０８～９３０；８９４～９３０；９１０～９３２；９６５～９８７；９６６～９８８９８１～１００３；１００５～１０２７；１００６～１０２８；１０１０～１０３２；１００５～１０３２；１０５２～１０７４；１０９７～１１１９；１１０１～１１２３；１１０２～１１２４；１１０３～１１２５；１１３３～１１５５；１１３５～１１５７；１１３６～１１５８；１０９７～１１２５；１１３３～１１５８；１１７６～１１９８；１１８８～１２１０；１２４３～１２６５；１３１５～１３３７１３２０～１３４２；１３２２～１３４４；１３２５～１３４７；１３２７～１３４９；１３２８～１３５０；１３２０～１５０７；１３３５～１３５７；１３３６～１３５８；１４５８～１４８０；１４５９～１４８１；１４６０～１４８２；１４５８～１４８２；１４９７～１５１９；１４９８～１５２０；１５０６～１５２８；１５１３～１５３５；１５６５～１５８７；１５６６～１５８８；１６１３～１６３５；１６１４～１６３６；１６２２～１６４４；１６４３～１６６５；１６９９～１７２１；１７１７～１７３９；１７１８～１７４０；１７２４～１７４６；１７２５～１７４７；１７２６～１７４８；１７２７～１７４９；１７２８～１７５０；１７１７～１７５０；１７３７～１７５９；１７６８～１７９０；２１８８～２２１０；２１９０～２２１２；２１８８～２２１２；２１９４～２２１６；２１９５～２２１７；２２５０～２２７２；２２３２～２２５４；２２４０～２２６２；２２３２～２２６２；２２４２～２２６４；２２４５～２２６７ ２２４９～２２７１；２２３２～２２７１；２３４７～２３６９；２３５１～２３７３；または２３４７～２３７３のいずれか１つと１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド７１～９３、１０１～１２３、１０８～１３０、１０９～１３１、１１２～１３４、１２３～１４５；２１３～２３５；２２０～２４２、２５６～２７８；２９２～３１４、２９３～３１５、２９９～３２１、３０１～３２３、３２４～３４６、３４９～３７１、３５０～３７２、３５１～３７３、３５２～３７４；３５３～３７５、３５５～３７７、３５６～３７８、３５７～３７９、３６１～３８３；３６３～３８５、３６５～３８７、４０２～４２４、４２２～４４４、４２３～４４５、４２７～４４９、４２８～４５０、４３１～４５３、４４７～４６９、４８９～５１１、４９０～５１２、５０７～５２９、５４１～５６３、５４７～５６９、５４８～５７０、５８５～６０７、５８９～６１１、５９２～６１４、５９３～６１５、６２０～６４２、６３０～６５２、６３１～６５３、６３２～６５４、６４９～６７１、６７６～６９８、６８８～７１０、７２３～７４５、７２８～７５０、７５２～７７４、７５３～７７５、７５５～７７７、７５７～７７９、７６３～７８５、７６４～７８６、７７２～７９４、７７８～８００、７８０～８０２、７８１～８０３、７９１～８１３、７９２～８１４、７９４～８１６、７９５～８１７、８０７～８２９、８２８～８５０、８２９～８５１；８３２～８５４；８３６～８５８；８３８～８６０；８３９～８６１、８４０～８６２、８３２～８６１；８７０～８９２；８７４～８９６、８９４～９１６；８９５～９１７；８９６～９１８；８９７～９１９；８９８～９２０；８９９～９２１；９００～９２２；９０１～９２３；９０２～９２４；９０６～９２８；９０８～９３０；８９４～９３０；９１０～９３２；９６５～９８７；９６６～９８８９８１～１００３；１００５～１０２７；１００６～１０２８；１０１０～１０３２；１００５～１０３２；１０５２～１０７４；１０９７～１１１９；１１０１～１１２３；１１０２～１１２４；１１０３～１１２５；１１３３～１１５５；１１３５～１１５７；１１３６～１１５８；１０９７～１１２５；１１３３～１１５８；１１７６～１１９８；１１８８～１２１０；１２４３～１２６５；１３１５～１３３７１３２０～１３４２；１３２２～１３４４；１３２５～１３４７；１３２７～１３４９；１３２８～１３５０；１３２０～１５０７；１３３５～１３５７；１３３６～１３５８；１４５８～１４８０；１４５９～１４８１；１４６０～１４８２；１４５８～１４８２；１４９７～１５１９；１４９８～１５２０；１５０６～１５２８；１５１３～１５３５；１５６５～１５８７；１５６６～１５８８；１６１３～１６３５；１６１４～１６３６；１６２２～１６４４；１６４３～１６６５；１６９９～１７２１；１７１７～１７３９；１７１８～１７４０；１７２４～１７４６；１７２５～１７４７；１７２６～１７４８；１７２７～１７４９；１７２８～１７５０；１７１７～１７５０；１７３７～１７５９；１７６８～１７９０；２１８８～２２１０；２１９０～２２１２；２１８８～２２１２；２１９４～２２１６；２１９５～２２１７；２２５０～２２７２；２２３２～２２５４；２２４０～２２６２；２２３２～２２６２；２２４２～２２６４；２２４５～２２６７ ２２４９～２２７１；２２３２～２２７１；２３４７～２３６９；２３５１～２３７３；または２３４７～２３７３のいずれか１つからの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド１０８～１３０；１０９～１３１；１０８～１３１；１１２～１３４；２９３～３１５；３０１～３２３；２９３～３２３；３６１～３８３；４０２～４２４；４２３～４４５；４２８～４５０；４２３～４５０；４２８～４５３；４３１～４５３；４８９～５１１；４９０～５１２；４８９～５１２；６４９～６７１；７５３～７７５；７７２～７９４；７９１～８１３；７９２～８１４；７９５～８１７；７９１～８１７；８２９～８５１；８３２～８５４；８３６～８５８；８２９～８５８；８７０～８９２；８７４～８９６；８７０～８９６；８９８～９２０；９００～９２２；９０２～９２４；９０６～９２８；９０８～９３０；９０２～９３０；９１０～９３２；９６６～９８８；１３２８～１３５０；または２１９４～２２１６；２２４２～２２６４；または２２４９～２２７１のいずれか１つと１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド１０８～１３０；１０９～１３１；１０８～１３１；１１２～１３４；２９３～３１５；３０１～３２３；２９３～３２３；３６１～３８３；４０２～４２４；４２３～４４５；４２８～４５０；４２３～４５０；４２８～４５３；４３１～４５３；４８９～５１１；４９０～５１２；４８９～５１２；６４９～６７１；７５３～７７５；７７２～７９４；７９１～８１３；７９２～８１４；７９５～８１７；７９１～８１７；８２９～８５１；８３２～８５４；８３６～８５８；８２９～８５８；８７０～８９２；８７４～８９６；８７０～８９６；８９８～９２０；９００～９２２；９０２～９２４；９０６～９２８；９０８～９３０；９０２～９３０；９１０～９３２；９６６～９８８；１３２８～１３５０；または２１９４～２２１６；２２４２～２２６４；または２２４９～２２７１のいずれか１つからの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。別の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド８９８～９３０と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド８９８～９３０からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド９１０～９３２と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド９１０～９３２からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２１９４～２２１６と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２１９４～２２１６からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２２４２～２２６４と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補性領域は、配列番号１のヌクレオチド２２４２～２２６４からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む。さらに別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は、３’末端に付着したリガンドとコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は、３’末端に付着したリガンドとコンジュゲートしている。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。さらに別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。
一実施形態では、前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーションが制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、ヌクレオチド修飾は、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－フルオロ修飾である。
相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長；１９～３０ヌクレオチド長；１９～２５ヌクレオチド長；または２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
各鎖は、３０ヌクレオチド長以下であり得る、例えば、各鎖は、独立に、１９～３０ヌクレオチド長である；各鎖は、独立に、１９～２５ヌクレオチド長である；各鎖は、独立に、２１～２３ヌクレオチド長である。
ｄｓＲＮＡは、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む少なくとも１つの鎖；または少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む少なくとも１つの鎖を含み得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡ作用剤のセンス鎖の３’末端とコンジュゲートしている。
一実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態では、リガンドは、
である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、以下の概略図に示されるリガンド

とコンジュゲートしており、Ｘは、ＯまたはＳである。
一実施形態では、ＸはＯである。
一実施形態では、相補性領域は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のいずれか１つを含む。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、前記ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し；
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている。
一実施形態では、ｉは０である；ｊは０である；ｉは１である；ｊは１である；ｉおよびｊはどちらも０である；またはｉおよびｊはどちらも１である。別の実施形態では、ｋは０である；ｌは０である；ｋは１である；ｌは１である；ｋおよびｌはどちらも０である；またはｋおよびｌはどちらも１である。
一実施形態では、ＸＸＸはＸ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、ＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’と相補的である。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその付近に存在する、例えば、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位および１３位に存在する。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
によって表される。
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｂ）
（式中、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
さらに別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｃ）
（式中、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｄ）
（式中、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長；１９～３０ヌクレオチド長；１９～２５ヌクレオチド長；または２１～２３ヌクレオチド長であり得る。
各鎖は、３０ヌクレオチド長以下であり得る、例えば、各鎖は、独立に、１９～３０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。
一実施形態では、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤の少なくとも一方の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出；または少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含み得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。一実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態では、鎖は、センス鎖である。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。一実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態では、鎖は、センス鎖である。
一実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態では、鎖は、センス鎖である。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’および３’末端の両方にある。
一実施形態では、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、ｐ’＞０である。別の実施形態では、ｐ’＝２である。
一実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと相補的である。別の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと非相補的である。
一実施形態では、センス鎖は合計２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は合計２３ヌクレオチドを有する。
一実施形態では、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している。別の実施形態では、全てのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。
一実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡ作用剤のセンス鎖の３’末端とコンジュゲートしている。
一実施形態では、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着している１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態では、リガンドは、
である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、以下の概略図に示されるリガンド

とコンジュゲートしており、Ｘは、ＯまたはＳである。
一実施形態では、ＸはＯである。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡ作用剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
（式中、
各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－フルオロ修飾である）
によって表され、
センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
センス鎖は、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤を提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、センス鎖は、３’末端において一価、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１または２のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号８または９のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、センス鎖は、３’末端において一価、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、相補性領域は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つを含む。一実施形態では、作用剤は、ＡＤ－２８８９１７、ＡＤ－２８８９９６、ＡＤ－４１３６３９、ＡＤ－４１３６４４、およびＡＤ－４１３６６９からなる群から選択される。一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、ＡＤ－２８８９１７である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－２８８９９６である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６３９である。一実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６４４である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６６９である
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙される作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤のいずれかを含む細胞、ベクター、および医薬組成物も提供する。ｄｓＲＮＡ作用剤は、緩衝化されていない溶液、例えば、生理食塩水または水中に、あるいは緩衝化された溶液、例えば、アセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、もしくはホスフェート、またはこれらの任意の組合せを含む溶液中に製剤化することができる。一実施形態では、緩衝化された溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物と接触させ、それにより、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することを含む。
細胞は、ヒト対象などの対象内にあり得る。
一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現は少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％阻害される、またはＨＳＤ１７Ｂ１３発現の検出レベル未満に阻害される。
一実施形態では、ヒト対象は、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している。一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態は、慢性線維炎症性肝疾患である。一実施形態では、慢性線維炎症性肝疾患は、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死からなる群から選択される。
一態様では、本発明は、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物を投与し、それにより、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することを含む。
別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置することを含む。
別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象に、予防有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む。
別の態様では、本発明は、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させる方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物を投与し、それにより、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させることを含む。
さらに別の態様では、本発明は、脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物を投与し、それにより、対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害することを含む。
一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象の肝臓における脂肪滴の蓄積を阻害する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象の肝臓における脂肪の蓄積を阻害することを含む。
別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置することを含む。
別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む。
別の態様では、本発明は、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させる方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させることを含む。
別の態様では、本発明は、脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害する方法を提供する。方法は、対象に、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害することを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤または医薬組成物の対象への投与により、ＨＳＤ１７Ｂ１３酵素活性の低下、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質蓄積の減少、ＰＮＰＬＡ３酵素活性の低下、ＰＮＰＬＡ３タンパク質蓄積の減少、ならびに／または対象の肝臓における脂肪の蓄積および／もしくは脂肪滴の増大の低減が引き起こされる。
一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態は、慢性線維炎症性肝疾患である。
一実施形態では、慢性線維炎症性肝疾患は、肝臓における脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死からなる群から選択される。
一実施形態では、慢性線維炎症性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
一実施形態では、対象は、肥満である。
一実施形態では、本発明の方法および使用は、追加的な治療薬を対象に投与することをさらに含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤を対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
作用剤は、対象に静脈内、筋肉内、または皮下投与することができる。一実施形態では、作用剤を対象に皮下投与する。
一実施形態では、本発明の方法および使用は、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のレベルを決定することをさらに含む。
一態様では、本発明は、細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおける作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおける作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、リガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖が、配列番号１または２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８または９のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡとの相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３）
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、項目１または２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４）
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、項目１から３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５）
前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、項目１から３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６）
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、項目１から３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、
前記センス鎖が、配列番号１または２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８または９のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
前記センス鎖が、３’末端に付着したリガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目８）
前記センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、項目７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目９）
前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、項目７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１０）
前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、項目７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１１）
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーションが制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、項目３から１０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１２）
前記ヌクレオチド修飾が、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－フルオロ修飾である、項目１１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１３）
前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、項目１から１２までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１４）
前記相補性領域が、１９～３０ヌクレオチド長である、項目１から１３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１５）
前記相補性領域が、１９～２５ヌクレオチド長である、項目１４に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１６）
前記相補性領域が、２１～２３ヌクレオチド長である、項目１５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１７）
各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、項目１から１６までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１８）
各鎖が独立に、１９～３０ヌクレオチド長である、項目１から１７までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目１９）
各鎖が独立に、１９～２５ヌクレオチド長である、項目１８に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２０）
各鎖が独立に、２１～２３ヌクレオチド長である、項目１８に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２１）
少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む、項目１から２０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２２）
少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む、項目２１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２３）
リガンドをさらに含む、項目１から６までおよび１１から２２までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２４）
前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ作用剤の前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしている、項目２３に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２５）
前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、項目７または２４に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２６）
前記リガンドが、

である、項目２５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２７）
以下の概略図

に示されるリガンドとコンジュゲートしており、ＸがＯまたはＳである、項目２６に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２８）
ＸがＯである、項目２７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目２９）
前記相補性領域が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のいずれか１つを含む、項目２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３０）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －（ＸＸＸ） ｉ －Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －（ＺＺＺ） ｊ －Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’ アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’） ｋ －Ｎ ｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’） ｌ －Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し；
Ｎ ｂ に対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎ ｂ ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３１）
ｉが０である；ｊが０である；ｉが１である；ｊが１である；ｉおよびｊがどちらも０である；またはｉおよびｊがどちらも１である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３２）
ｋが０である；ｌが０である；ｋが１である；ｌが１である；ｋおよびｌがどちらも０である；またはｋおよびｌはどちらも１である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３３）
ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、ＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’と相補的である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３４）
前記ＹＹＹモチーフが、前記センス鎖の切断部位またはその付近に存在する、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３５）
前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位および１３位に存在する、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３６）
式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －ＹＹＹ－Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ’ －Ｎ ａ’ －Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ａ’ －ｎ ｑ’ ５’（ＩＩＩａ）によって表される、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３７）
式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －ＺＺＺ－Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ’ －Ｎ ａ’ －Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ’ －Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ ａ’ －ｎ ｑ’ ５’（ＩＩＩｂ）
（式中、各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
で表される、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３８）
式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －ＸＸＸ－Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ’ －Ｎ ａ’ －Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ ｂ’ －Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ａ’ －ｎ ｑ’ ５’（ＩＩＩｃ）
（式中、各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目３９）
式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －ＸＸＸ－Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －ＺＺＺ－Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ’ －Ｎ ａ’ －Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎ ｂ’ －Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ’ －Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎ ａ’ －ｎ ｑ’ ５’（ＩＩＩｄ）
（式中、各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４０）
前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、項目３０から３９までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４１）
前記相補性領域が、１９～３０ヌクレオチド長である、項目３０から３９までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４２）
前記相補性領域が、１９～２５ヌクレオチド長である、項目４１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４３）
前記相補性領域が、２１～２３ヌクレオチド長である、項目４２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４４）
各鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、項目３０から４３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４５）
各鎖が、独立に、１９～３０ヌクレオチド長である、項目３０から４３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４６）
前記ヌクレオチドに対する修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３０から４５までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４７）
前記ヌクレオチドに対する修飾が、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－フルオロ修飾である、項目４６に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４８）
前記Ｙ’が、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、項目３０から４６までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目４９）
少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む、項目３０から４８までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５０）
少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む、項目３０から４９までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５１）
前記ｄｓＲＮＡ作用剤が、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む、項目３０から５０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５２）
前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、一方の鎖の３’末端にある、項目５１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５３）
前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、項目５２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５４）
前記鎖が、前記センス鎖である、項目５２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５５）
前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、一方の鎖の５’末端にある、項目５１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５６）
前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、項目５５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５７）
前記鎖が、前記センス鎖である、項目５５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５８）
前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、一方の鎖の５’および３’末端の両方にある、項目５１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目５９）
二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位の塩基対がＡＵ塩基対である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６０）
ｐ’＞０である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６１）
ｐ’＝２である、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６２）
ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと相補的である、項目６１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６３）
ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと非相補的である、項目６１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６４）
前記センス鎖が合計２１ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が合計２３ヌクレオチドを有する、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６５）
少なくとも１つのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６６）
全てのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している、項目６５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６７）
前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、項目３０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６８）
前記リガンドが前記ｄｓＲＮＡ作用剤の前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしている、項目３０から６７までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目６９）
前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着している１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、項目６８に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７０）
前記リガンドが、

である、項目６９に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７１）
以下の概略図に示されるリガンド

とコンジュゲートしており、
ＸがＯまたはＳである、項目７０に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７２）
ＸがＯである、項目７１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７３）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －（ＸＸＸ） ｉ －Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －（ＺＺＺ） ｊ －Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’） ｋ －Ｎ ｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’） ｌ －Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ ｂ に対する修飾がＹに対する修飾とは異なり、Ｎ ｂ ’に対する修飾がＹ’に対する修飾とは異なる）
で表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７４）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －（ＸＸＸ） ｉ －Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －（ＺＺＺ） ｊ －Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’） ｋ －Ｎ ｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’） ｌ －Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎ ｐ 、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎ ｐ ’＞０であり、少なくとも１つのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ ｂ に対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎ ｂ ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７５）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －（ＸＸＸ） ｉ －Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －（ＺＺＺ） ｊ －Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’） ｋ －Ｎ ｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’） ｌ －Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎ ｐ 、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎ ｐ ’＞０であり、少なくとも１つのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ ｂ に対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎ ｂ ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、
ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７６）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －（ＸＸＸ） ｉ －Ｎ ｂ －ＹＹＹ－Ｎ ｂ －（ＺＺＺ） ｊ －Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’） ｋ －Ｎ ｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’） ｌ －Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
各ｎ ｐ 、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎ ｐ ’＞０であり、少なくとも１つのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎ ｂ およびＮ ｂ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
Ｎ ｂ に対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎ ｂ ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
によって表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、
ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７７）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖が、約１４～約３０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ作用剤であり、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎ ｐ －Ｎ ａ －ＹＹＹ－Ｎ ａ －ｎ ｑ ３’
アンチセンス：３’ｎ ｐ ’－Ｎ ａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎ ａ ’－ｎ ｑ ’５’（ＩＩＩａ）
（式中、
各ｎ ｐ 、ｎ ｑ 、およびｎ ｑ ’は、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
ｎ ｐ ’＞０であり、少なくとも１つのｎ ｐ ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
各Ｎ ａ およびＮ ａ ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である）
によって表され、
前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、
ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７８）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、
前記センス鎖が、配列番号１または２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８または９のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
前記センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
前記アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
前記センス鎖が、３’末端において一価、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目７９）
前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、項目７８に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目８０）
前記相補性領域が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つを含む、項目２、３０、および７３から７９までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目８１）
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙される作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１から８０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
（項目８２）
項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤を含有する細胞。
（項目８３）
項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクター。
（項目８４）
項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤を含む、１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
（項目８５）
前記作用剤が、緩衝化されていない溶液中に製剤化される、項目８４に記載の医薬組成物。
（項目８６）
前記緩衝化されていない溶液が、生理食塩水または水である、項目８５に記載の医薬組成物。
（項目８７）
前記作用剤が、緩衝化された溶液を用いて製剤化されている、項目８４に記載の医薬組成物。
（項目８８）
前記緩衝化された溶液が、アセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、もしくはホスフェート、またはこれらの任意の組合せを含む、項目８７に記載の医薬組成物。
（項目８９）
前記緩衝化された溶液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、項目８７に記載の医薬組成物。
（項目９０）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）発現を阻害する方法であって、前記細胞を項目１から８１までのいずれか一項に記載の作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、それにより、前記細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することを含む方法。
（項目９１）
前記細胞が対象内にある、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記対象がヒトである、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記ＨＳＤ１７Ｂ１３発現が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％阻害される、またはＨＳＤ１７Ｂ１３発現の検出レベル未満に阻害される、項目９０から９２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記ヒト対象が、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態が、慢性線維炎症性肝疾患である、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記慢性線維炎症性肝疾患が、肝臓における脂肪滴の蓄積および／または増大に関連する、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記慢性線維炎症性肝疾患が、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死からなる群から選択される、項目９５に記載の方法。
（項目９８）
対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することを含む方法。
（項目９９）
ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載の作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置することを含む方法。
（項目１００）
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法であって、前記対象に、予防有効量の項目１から３１までのいずれか一項に記載の作用剤または項目３４から３９までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む方法。
（項目１０１）
脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、脂肪症を有する前記対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させることを含む方法。
（項目１０２）
脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害することを含む方法。
（項目１０３）
ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象の肝臓における脂肪滴の蓄積を阻害する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している前記対象の肝臓における脂肪の蓄積を阻害することを含む方法。
（項目１０４）
ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載の作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している前記対象を処置することを含む方法。
（項目１０５）
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法であって、前記対象に、予防有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載の作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む方法。
（項目１０６）
脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させる方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、脂肪症を有する前記対象における慢性肝疾患の発症リスクを低下させることを含む方法。
（項目１０７）
脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害する方法であって、前記対象に、治療有効量の項目１から８１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤または項目８４から８９までのいずれか一項に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与し、それにより、前記対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪を阻害することを含む方法。
（項目１０８）
前記ｄｓＲＮＡ作用剤または前記医薬組成物の前記対象への投与により、ＨＳＤ１７Ｂ１３酵素活性の低下、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質蓄積の減少、ＰＮＰＬＡ３酵素活性の低下、ＰＮＰＬＡ３タンパク質蓄積の減少、ならびに／または対象の肝臓における脂肪の蓄積および／もしくは脂肪滴の増大の低減が引き起こされる、項目９１から１０７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態が、慢性線維炎症性肝疾患である、項目９９から１０８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記慢性線維炎症性肝疾患が、肝臓における脂肪滴の蓄積および／または増大に関連する、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記慢性線維炎症性肝疾患が、肝臓における脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝線維症、脂肪性肝疾患（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死からなる群から選択される、項目１０９に記載の方法。
（項目１１２）
前記慢性線維炎症性肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記対象が肥満である、項目９１から１１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
追加的な治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、項目９１から１１３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記ｄｓＲＮＡ作用剤を前記対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、項目９１から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記作用剤を前記対象に静脈内、筋肉内、または皮下投与する、項目９１から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のレベルを決定することをさらに含む、項目９１から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、
二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つの作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおける作用剤のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
前記ｄｓＲＮＡ作用剤が、リガンドとコンジュゲートしている、ｄｓＲＮＡ作用剤。
図１は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡがアルコール性および非アルコール性肝疾患表現型のリスクの低減に関連付けられることを示す図である。具体的には、図１は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡが、種々の慢性肝疾患の対立遺伝子投与量依存的な低オッズに関連付けられたことを示す。具体的には、アルコール性および非アルコール性肝疾患、硬変症および肝細胞癌のいずれにおいても対立遺伝子投与量依存効果が観察された。オッズ比は、ロジスティック回帰を使用し、年齢、性別、ＢＭＩ、および自己申告による民族性を調整して算出した。
図２Ａは、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３を発現するマウスにおけるＡＤ－２８８９１７の単回投薬の効果を示すグラフである。図２Ｂは、カニクイザルにおけるＡＤ－２８８９１７の単回投薬の効果を示すグラフである。
本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するため、ならびにＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害または低減することが有益であると予想される対象、例えば、肝臓の炎症の軽減が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患しているまたは罹患しやすい対象、例えば、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、肝硬変、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死に罹患しているまたは罹患しやすい対象などを処置するための、本発明のｉＲＮＡ組成物の使用方法も提供する。
ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的とする本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長またはそれ未満、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み得、当該領域は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ作用剤の一方の鎖または両方の鎖は、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長であり、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの領域を有する。一部の実施形態では、より長いアンチセンス鎖を有するそのようなｉＲＮＡ作用剤は、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み得、ここで、センスおよびアンチセンス鎖は、１８～３０個の連続したヌクレオチドの二重鎖を形成する。
本明細書に記載のｉＲＮＡ作用剤の使用により、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解が可能になる。
特に、非常に低い投与量のｉＲＮＡにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が特異的かつ効率的に媒介され、その結果、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の有意な阻害がもたらされる。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害または低減することが有益であると予想される対象、例えば、肝臓の炎症の低減が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患しているまたは罹患しやすい対象、例えば、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、肝硬変、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、および肝細胞壊死に罹患しているまたは罹患しやすい対象などを処置するために有用である。
以下の詳細な説明では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するために、ｉＲＮＡを含有する組成物をどのように作製し、使用するか、ならびにこの遺伝子の発現の阻害および／または低減が有益であると予想される疾患および障害を有する対象を処置するための組成物および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解することができるように、最初にある特定の用語を定義する。さらに、パラメーターの値または値の範囲が記載されている場合はいつでも、記載されている値の間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されていることに留意するべきである。
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書では、１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つよりも多くの要素、例えば、複数の要素を意味する。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書では、「を含むがこれだけに限定されない」という句を意味するように使用され、また、それと互換的に使用される。
「または」という用語は、本明細書では、文脈によりそうでないことが明らかに示されない限り、「および／または」という用語を意味するように使用され、また、それと互換的に使用される。
「約」という用語は、本明細書では、当技術分野における典型的な許容性の範囲内に入ることを意味するように使用される。例えば、「約」は、平均から約２標準偏差と理解することができる。ある特定の実施形態では、約は、±１０％を意味する。ある特定の実施形態では、約は、±５％を意味する。約が連続した数または範囲の前に存在する場合、「約」は連続または範囲内の数のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
「ＨＳＤ１７Ｂ１３」という用語は、「水酸化ステロイド１７－ベータ脱水素酵素１３」、「短鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー１６Ｃメンバー」、「短鎖脱水素酵素／還元酵素９」、「１７－ベータ－ＨＳＤ１３」、「１７β－ＨＳＤ１３」、「ＳＤＲ１６Ｃ３」、「ＳＣＤＲ９」、「短鎖脱水素酵素／還元酵素ファミリー１６Ｃ、メンバー３」、「水酸化ステロイド（１７－ベータ）脱水素酵素１３」、「１７－ベータ－水酸化ステロイド脱水素酵素１３」、「１７－ベータ水酸化ステロイド脱水素酵素」、「ＨＭＦＮ０３７６」、および「ＮＩＩＬ４９７」としても公知であり、特に指定のない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、齧歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、およびモルモットを含むがこれだけに限定されない任意の脊椎動物または哺乳動物供給源に由来する１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型タンパク質をコードする周知の遺伝子を指す。
この用語は、ネイティブなＨＳＤ１７Ｂ１３の少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性を維持するネイティブなＨＳＤ１７Ｂ１３の断片およびバリアントも指す。この用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３の全長のプロセシングされていない前駆形態ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断の結果生じた成熟形態およびタンパク質プロセシングの結果生じた形態を包含する。
ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の２つのバリアント、バリアントＡ（または転写物Ａ）およびバリアントＢ（または転写物Ｂ）が以前に同定された。転写物Ａは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の７つのエクソン全てを含むが、転写物Ｂではエクソン２が読み飛ばされている。ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１７８１３５．４；配列番号１）に見いだすことができ、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３バリアントＢのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿００１１３６２３０．２；配列番号２に見いだすことができる。２０１８年１月１９日出願の米国特許出願第１５／８７５，５１４号、および２０１８年１月１９日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１４３５７号（そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通り、発現される６種の追加的なＨＳＤ１７Ｂ１３転写物（Ｃ～Ｈ、それぞれ配列番号１７、１８、１９、２０、２１、および２２）が同定されている。転写物Ｃでは、転写物Ａと比較してエクソン６が読み飛ばされている。転写物Ｄでは、転写物Ａと比較して、エクソン６のグアニン３’が挿入されており、その結果、エクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。転写物Ｅでは、転写物Ａと比較して、エクソン３と４の間に追加的なエクソンが存在する。ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント保有者においてのみ発現される転写物Ｆでは、転写物Ａと比較して、エクソン６からイントロン６へのリードスルーが存在する。転写物Ｇでは、転写物Ａと比較して、エクソン２が読み飛ばされており、かつ、エクソン６のグアニン３’が挿入されており、その結果、エクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。転写物Ｈでは、転写物Ａと比較して、エクソン３と４の間に追加的なエクソンが存在し、かつ、エクソン６のグアニン３’が挿入されており、その結果、エクソン７におけるフレームシフトおよびエクソン７の中途短縮が生じている。
低レベルで発現される１種の追加的なＨＳＤ１７Ｂ１３転写物も（Ｆ’、配列番号２３）同定されている。転写物Ｆと同じく、転写物Ｆ’も、転写物Ａと比較してエクソン６からイントロン６へのリードスルーを含むが、転写物Ｆとは対照的に、リードスルーは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント遺伝子に存在するチミンの挿入を含まない。各転写物についてのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内のエクソンのヌクレオチド位を以下に提示する。
配列番号１５は、ＨＳＤ１７Ｂ１３野生型ゲノム配列（ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８）のヌクレオチド配列であり、配列番号１６は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ゲノム配列バリアント（ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８；ｒｓ７２６１３５６７－ｃｈｒ４におけるＴの挿入：８７３１０２４１－８７３１０２４０）のヌクレオチド配列である：１２６６６位におけるＴの挿入。
野生型ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子についてホモ接合性の対象においてより広くいきわたっているＨＳＤ１７Ｂ１３転写物のエクソンについての配列番号１５におけるヌクレオチド位。
ｒｓ７２６１３５６７ ＨＳＤ１７Ｂ１３バリアント遺伝子（１２６６６位におけるＴの挿入）についてホモ接合性の対象においてより広くいきわたっているＨＳＤ１７Ｂ１３転写物のエクソンについての配列番号１６におけるヌクレオチド位。
マウスＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子には２種のバリアントが存在する；マウスＨｓｄ１７ｂ１３、転写物バリアント１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿００１１６３４８６．１；配列番号３）に見いだすことができ、マウスＨｓｄ１７ｂ１３、転写物バリアント２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿１９８０３０．２；配列番号４に見いだすことができる。ラットＨｓｄ１７ｂ１３遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＮＭ＿００１００９６８４．１；配列番号５）に見いだすことができる。Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＸＭ＿０１５１３８７６６．１；配列番号６）に見いだすことができる。Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＸＭ＿００５５５５３６７．２；配列番号７）に見いだすことができる。
ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを使用して容易に入手可能である。
「ＨＳＤ１７Ｂ１３」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞において、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子における一塩基多型などのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の天然に存在するＤＮＡ配列バリエーションにより発現される特定のポリペプチドも指す。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子内の多数のＳＮＰが同定されており、それらは、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ（例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/snpを参照されたい)において見いだすことができる。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含めたＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、少なくとも、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の当該部分またはその付近におけるｉＲＮＡにより方向付けられる切断の基質として機能するのに十分に長い。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の標的配列は、約９～３６ヌクレオチド長、例えば、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり得る。上記の範囲および長さの間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図されている。
本明細書で使用される場合、「配列で構成される鎖」という用語は、標準のヌクレオチド命名法を使用して参照される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖で構成されるオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は、それぞれ、一般に、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代理の置換え部分も指し得ることが理解されよう（例えば、表１を参照されたい）。グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルの他の部分での置換えを、そのような置換え部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合の性質の実質的な変更を伴わずに行うことができることを当業者は十分に分かっている。例えば、これだけに限定することなく、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列においてウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドを、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換えることができる。別の例では、オリゴヌクレオチド内の任意の場所のアデニンおよびシトシンを、それぞれグアニンおよびウラシルで置き換えて、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成することができる。そのような置き換え部分を含有する配列は、本発明において特徴付けられる組成物および方法に適している。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ作用剤」、「ｉＲＮＡ作用剤」、「ＲＮＡ干渉作用剤」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本明細書において定義されている用語であるＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介したＲＮＡ転写物の標的化切断を媒介する作用剤を指す。ｉＲＮＡにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスを通じたｍＲＮＡの配列特異的分解が方向付けられる。ｉＲＮＡにより、細胞、例えば、哺乳動物の対象などの対象内の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現がモジュレートされる、例えば、阻害される。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485）。ダイサーは、リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であり、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２塩基３’突出を有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにする（Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363）。次いで、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み入れられ、そこで１つまたは複数のヘリカーゼによりｓｉＲＮＡ二重鎖が巻き戻され、それにより、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309）。妥当な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼにより標的が切断されて、サイレンシングが誘導される（Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成され、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して、標的遺伝子、すなわちＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｓｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、本明細書では上記のＲＮＡｉを指すのためにも使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物体に導入される一本鎖ＲＮＡｉ作用剤であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ作用剤（ｓｓＲＮＡｉ）がＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、アルゴノート２に結合し、次いでそれにより標的ｍＲＮＡが切断される。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５～３０ヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ＲＮＡｉ作用剤の設計および試験は、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１０１，３４８号およびLima et al., (2012) Cell 150: 883-894に記載されている。本明細書に記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれも、本明細書に記載されている、またはLima et al., (2012) Cell 150;: 883-894に記載の方法によって化学修飾された一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用することができる。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書では「二本鎖ＲＮＡｉ作用剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ作用剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」方向を有すると称される２つの逆平行かつ実質的に相補的な核酸鎖で構成される二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により、本明細書ではＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機構を通じた標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの分解が誘発される。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大多数がリボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されている通り、各鎖または両方の鎖が、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ作用剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る；ＲＮＡｉ作用剤は、多数のヌクレオチドにおいて実質的な修飾を含み得る。本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立に、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の作用剤における使用に適した修飾は、本明細書に開示されるまたは当技術分野で公知の全ての型の修飾を含む。ｓｉＲＮＡ型分子に使用されるそのような修飾はいずれも、本明細書の目的および特許請求の範囲に関して「ＲＮＡｉ作用剤」に包含される。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであってよく、約９から３６塩基対までの長さ、例えば、約１５～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さなどにわたり得る。上記の範囲および長さの間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図されている。
二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きな分子の一部であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖によって接続している場合、接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれよりも多くの対合していないヌクレオチドを含み得る。
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が別々のＲＮＡ分子で構成される場合、これらの分子は、共有結合により接続している必要はないが、共有結合により接続していてもよい。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖以外の手段によって共有結合により接続している場合、接続している構造は、「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は同じまたは異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。最大数の塩基対は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在するあらゆる突出を引いたものである。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチド突出を含み得る。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤はｄｓＲＮＡであり、その各鎖は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける３０ヌクレオチド未満、例えば、１７～２７、１９～２７、１７～２５、１９～２５、または１９～２３を含む。別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤はｄｓＲＮＡであり、その各鎖は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける１９～２３ヌクレオチドを含む。一実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長である。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出」という用語は、ｉＲＮＡの二重鎖構造、例えばｄｓＲＮＡから突出している少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸長している場合、またはその逆である場合、ヌクレオチド突出が存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１ヌクレオチドの突出を含み得る；あるいは、突出は、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチドまたはそれよりも多くのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド突出は、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含めたヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得る、またはそれからなり得る。突出は、センス鎖、アンチセンス鎖またはこれらの任意の組合せであり得る。さらに、突出のヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端または両方の末端に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。別の実施形態では、突出のヌクレオチドの１つまたは複数をヌクレオシドチオホスフェートで置き換える。
ある特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、または両方の突出は、１０ヌクレオチド、例えば、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチドまたは１０～１５ヌクレオチド長より長い、延長された長さを含み得る。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のセンス鎖にある。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のアンチセンス鎖にある。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。ある特定の実施形態では、延長された突出は、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。ある特定の実施形態では、延長された突出のヌクレオチドの１つまたは複数をヌクレオシドチオホスフェートで置き換える。
「平滑末端化する（ｂｌｕｎｔ）」または「平滑末端化された（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）」という用語は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、ｄｓＲＮＡの所与の末端に対合していないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方または両方の末端が平滑末端化されていてよい。ｄｓＲＮＡの両方の末端が平滑末端化されている場合、ｄｓＲＮＡが平滑末端化されていると言える。明確にするために、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、両方の末端が平滑末端化されている、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡである。そのような分子は、その全長にわたって二本鎖になることが多い。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡと実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、配列、例えば標的配列、例えば本明細書で定義されているＨＳＤ１７Ｂ１３ヌクレオチド配列と実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的ではない場合、ミスマッチが分子の内部または末端領域にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域内、例えば、ｉＲＮＡの５’および／または３’末端から５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書において定義されている用語であるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「切断領域」という用語は、切断部位のすぐ隣に位置する領域を指す。切断部位は、標的上の切断が起こる部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端の、切断部位のすぐ隣の３塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端の、切断部位のすぐ隣の２塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は具体的にアンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１が結合する部位に存在し、切断領域はヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「相補的」という用語は、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列との関連で記載するために使用される場合、当業者に理解される通り、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとある特定の条件下でハイブリダイズし、二重鎖構造を形成することができることを指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間、その後、洗浄を含み得る（例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。生物体の内側で遭遇する可能性がある生理的に関連性のある条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に応じて２つの配列の相補性の試験に最も適した条件のセットを決定することができる。
ｉＲＮＡ内、例えば本明細書に記載のｄｓＲＮＡ内の相補配列は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、ヌクレオチド配列の一方または両方の全長にわたる塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書では互いに対して「完全に相補的」と称され得る。しかし、本明細書において第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的である場合もあり、二重鎖を３０塩基対までハイブリダイズさせた際に１つまたは複数、しかし一般に５、４、３または２個以下のミスマッチ塩基対を形成するが、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害に最も関連性のある条件下でハイブリダイズする能力は保持する場合もある。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズすると１つまたは複数の一本鎖突出が形成されるように設計されている場合、そのような突出は相補性の決定に関してミスマッチとみなされるべきではない。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとで構成されるｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、それでもなお、本明細書に記載の目的に関して「完全に相補的」と称され得る。
「相補的」配列は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件が満たされる限りにおいては、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよい、またはそれから完全に形成されたものであってもよい。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、これだけに限定されないが、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン塩基対合が挙げられる。
「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」という用語は、本明細書では、それらが使用される文脈から理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間でマッチする塩基、またはｉＲＮＡ作用剤のアンチセンス鎖と標的配列の間でマッチする塩基に関して使用され得る。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡ）の連続した一部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡの少なくとも一部と、配列がＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡの中断されていない一部分と実質的に相補的であれば、相補的である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３配列と完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３配列と実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号１のヌクレオチド配列の等価の領域、または配列番号１の断片と少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンスポリヌクレオチドは標的ＨＳＤ１７Ｂ１３配列と相補的であり、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって、配列番号８のヌクレオチド配列の等価の領域、または配列番号８のいずれか１つの断片と少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３配列と実質的に相補的であり、その全長にわたって、表２、３、７、８、１０、１１、もしくは１３のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチド配列の等価の領域、または表２、３、７、８、１０、１１、もしくは１３のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つの断片と少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的、または１００％相補的である連続したヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
「阻害すること」という用語は、本明細書で使用される場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
「ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害すること」という句は、本明細書で使用される場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする任意のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（例えば、マウスＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、ラットＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、サルＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子、またはヒトＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子など）ならびにＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のバリアントまたは突然変異体の発現の阻害を含む。
「ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害すること」は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば、少なくとも約２０％の阻害などを含む。ある特定の実施形態では、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害である。
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡレベルまたはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質レベルに基づいて評価することができる。ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現は、例えば、循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベル、または肝臓試料などの組織試料中のＨＳＤ１７Ｂ１３の酵素活性に間接的に基づいて評価することもできる。阻害は、これらの変数の１つまたは複数の絶対的なレベル、または対照レベルと比較した相対的なレベルの低下によって評価することができる。対照レベルは、当技術分野において利用される任意の型の対照レベル、例えば、投薬前のベースラインレベル、または処置していないもしくは対照（例えば、緩衝剤のみの対照もしくは不活性な作用剤対照など）を用いて処置した同様の対象、細胞、もしくは試料から決定されたレベルであってよい。
一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子が転写され、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞の群から単離することができる、または当該第１の細胞または細胞の群において検出することができるＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡの量の、第１の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのような処理をしていない第２の細胞または細胞の群（対照細胞）と比較した減少によって評価する。
阻害の度合いは、
で表すことができる。
ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ作用剤と細胞を接触させること」という句は、本明細書で使用される場合、細胞を任意の可能な手段によって接触させることを含む。ＲＮＡｉ作用剤と細胞を接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｉＲＮＡと細胞を接触させること、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいてｉＲＮＡと細胞を接触させることを含む。接触させることは、直接または間接的に行うことができる。したがって、例えば、方法を個々に実施することによってＲＮＡｉ作用剤を細胞と物理的に接触させることもでき、あるいは、ＲＮＡｉ作用剤を、その後にＲＮＡｉ作用剤と細胞の接触が可能になるまたは引き起こされる状況に置くこともできる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞を接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ作用剤と一緒にインキュベートすることによって行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞を接触させることは、例えば、ＲＮＡｉ作用剤を細胞が位置する組織もしくはその付近に注射することによって、またはＲＮＡｉ作用剤を、別の領域、例えば、血流もしくは皮下空間に、作用剤がその後、接触させようとする細胞が位置する組織に到達するように注射すことによって行うことができる。例えば、ＲＮＡｉ作用剤は、ＲＮＡｉ作用剤を目的の部位、例えば肝臓に方向付けるリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含有し、かつ／またはそれとカップリングしていてよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける接触させる方法の組合せも可能である。例えば、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡｉ作用剤と接触させ、その後、対象に移植することもできる。
一実施形態では、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞への取り込みまたは吸収を容易にするまたはもたらすことによって「導入すること」または「ｉＲＮＡを細胞に送達すること」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、援助なしの拡散性もしくは能動的細胞プロセスを通じて、または補助的な作用剤もしくはデバイスによって行うことができる。ｉＲＮＡの細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるものであってよい。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける導入に関しては、ｉＲＮＡを組織部位に注射することまたは全身投与することができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達は、その内容全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３２，４０１号および同第５，６０７，６７７号、ならびに米国公開第２００５／０２８１７８１号に記載されているものなどのベータ－グルカン送達系によって行うこともできる。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法を含む。別の手法は本明細書において以下に記載されており、かつ／または当技術分野で公知である。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの薬学的に活性な分子を封入する脂質層で構成される小胞である。ＬＮＰは、例えば、その内容全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「対象」は、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、およびチンパンジーなど）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）を含めた哺乳動物、または鳥類（例えば、アヒルまたはガチョウ）などの動物である。
ある実施形態では、対象は、本明細書に記載の通り、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される疾患、障害もしくは状態について処置もしくは評価されたヒト；ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される疾患、障害もしくは状態のリスクがあるヒト；ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される疾患、障害もしくは状態を有するヒト；および／またはＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される疾患、障害もしくは状態に対する処置を受けているヒトなどのヒトである。
一実施形態では、対象は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）Ｉ１４８Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してホモ接合性である。一実施形態では、対象は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）Ｉ１４４Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４４Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してホモ接合性である。一実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子に関してホモ接合性である。別の実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。さらに別の実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子およびＨＳＤ１７Ｂ１３の機能喪失型バリアントをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアント、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡの保有者ではない。
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現および／またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生に付随する１つまたは複数の症状、例えば、慢性線維炎症性肝疾患、例えば、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、肝細胞壊死、および／または肝細胞癌などのＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患の緩和または好転を含むがこれだけに限定されない、有益なまたは所望の結果を指す。「処置」は、処置が行われない場合に予測される生存と比較した生存の延長も意味し得る。
「下げる」という用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患に関しては、そのようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれよりも大きい低下であり得る。ある特定の実施形態では、低下は、少なくとも２０％である。「下げる」は、対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のレベルに関しては、そのような障害を有さない個体に関して正常な範囲内であるとして許容されるレベルまで下がることであることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「防止」または「防止すること」は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害またはその状態に関して使用される場合、対象がそのような疾患、障害、または状態に付随する症状、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現の症状、例えば、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、肝細胞壊死、および／または肝細胞癌などを発症する可能性の低減を指す。疾患、障害もしくは状態が発症できないこと、またはそのような疾患、障害もしくは状態に付随する症状の発症の低減（例えば、その疾患または障害に関して臨床的に許容される尺度で少なくとも約１０％）、または、（例えば、数日、数週間、数カ月または数年）遅延した、症状の遅延が示されること（例えば、肝臓における脂質蓄積および／もしくは肝臓における脂肪滴の増大の低減）が有効な防止とみなされる。
本明細書で使用される場合、「ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患」という用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質産生によって引き起こされる、またはそれに関連する疾患または障害である。「ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患」という用語は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子発現またはタンパク質の活性の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を含む。
一実施形態では、「ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患」は、慢性線維炎症性肝疾患である。「慢性線維炎症性肝疾患」は、慢性の肝臓の炎症および／または線維症に関連するあらゆる疾患、障害、または状態である。慢性線維炎症性肝疾患の非限定的な例としては、例えば、肝臓の炎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、肝細胞壊死、および／または肝細胞癌が挙げられる。
「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与した場合に、疾患を有効に処置する（例えば、既存の疾患または疾患の１つもしくは複数の症状を減弱させること、好転させることまたは維持することによって）のに十分であるＲＮＡｉ作用剤の量を含むものとする。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ作用剤、作用剤の投与の仕方、疾患およびその重症度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば先行するまたは同時に行われる処置の型、ならびに処置される対象の他の個々の特性に応じて変動し得る。
「予防有効量」は、本明細書で使用される場合、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与した場合に、疾患または疾患の１つもしくは複数の症状を防止するまたは好転させるのに十分であるｉＲＮＡの量を含むものとする。疾患を好転させることは、疾患の過程を遅くすることまたは後に発症する疾患の重症度を低下させることを含む。「予防有効量」は、ｉＲＮＡ、作用剤の投与の仕方、疾患のリスクの度合い、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば先行するまたは同時に行われる処置の型、および処置される患者の他の個々の特性に応じて変動し得る。
「治療有効量」または「予防有効量」は、任意の処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でいくらかの所望の局所的または全身効果を生じさせるＲＮＡｉ作用剤の量も含む。本発明の方法において使用されるｉＲＮＡは、そのような処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比を生じさせるのに十分な量で投与することができる。
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、良好な医学的判断の範囲内に入り、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト対象および動物対象の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
「薬学的に許容される担体」という句は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助物質（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または対象の化合物を１つの器官もしくは体の一部から別の器官もしくは体の一部に運ぶもしくは輸送することに関与する溶媒を封入する材料などを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、処置される対象に対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；（４）粉末化トラガント；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム（magnesium state）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど；（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックスなど；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコールなど；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸など（２３）血清構成成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなど；ならびに（２２）医薬製剤に使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられる。
「試料」という用語は、本明細書で使用される場合、対象から単離された同様の流体、細胞、または組織の集合、ならびに対象内に存在する流体、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液、血漿、脳脊髄液、眼の体液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官または局在領域由来の試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の一部、またはそれらの器官内の体液もしくは細胞に由来してもよい。ある特定の実施形態では、試料は、肝臓（例えば、肝臓全体または肝臓のある特定のセグメントまたは肝臓内のある特定の型の細胞、例えば、肝細胞など）に由来してもよい。一部の実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象から抜き取られた血液または血漿を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡが本明細書に記載されている。一実施形態では、ｉＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害する。一実施形態では、ｉＲＮＡ作用剤は、細胞、例えば肝細胞など、例えば、対象、例えば、慢性線維炎症性肝疾患、障害、または状態、例えば、例えば肝臓における脂肪滴の蓄積および／もしくは増大ならびに／または肝臓の線維症に関連する疾患、障害、または状態を有するヒトなどの哺乳動物内の肝細胞などにおけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。
ｄｓＲＮＡは、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現下で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド長またはそれ未満（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド長またはそれ未満）である。標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、標的遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、または鳥類の標的遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲもしくは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づく方法によって、またはタンパク質に基づく方法によって、例えば、ウエスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技法を使用する免疫蛍光法分析などによってアッセイして少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列と実質的に相補的な、および一般に、完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖と相補的な領域を含み、したがって、２つの鎖は適切な条件下で組み合わせるとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所に記載の通りおよび当技術分野で公知の通り、ｄｓＲＮＡの相補配列は、別々のオリゴヌクレオチドであるのとは対照的に、単一の核酸分子の自己相補的な領域としても含有され得る。
一般に、二重鎖構造は、１５から３０塩基対の間の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。上記の範囲および長さの間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図されている。
同様に、標的配列との相補性領域は、１５から３０ヌクレオチドの間の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長である。上記の範囲および長さの間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図されている。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に、約１５～約３０ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長であり、例えば、各鎖は、独立に、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５から約２３ヌクレオチドの間の長さ、または約２５から約３０ヌクレオチドの間の長さである。一般に、ｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質としての機能を果たすのに十分に長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチドよりも長いｄｓＲＮＡがダイサーの基質としての機能を果し得ることが当技術分野で周知である。これも当業者には認識される通り、切断の標的とされるＲＮＡの領域は、より大きなＲＮＡ分子、多くの場合、ｍＲＮＡ分子の一部であることが多い。関連性がある場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉにより方向付けられる切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質になることを可能にするのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続した配列である。
二重鎖領域、例えば、約９～３６塩基対、例えば、約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の二重鎖領域がｄｓＲＮＡの主要な機能的部分であることも当業者には認識されよう。したがって、一実施形態では、３０塩基対よりも大きな二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、所望のＲＮＡを切断の標的とする例えば１５～３０塩基対の機能的な二重鎖にプロセシングされるようになるという範囲内で、ｄｓＲＮＡである。したがって、一実施形態ではｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることが当業者には認識されよう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現を標的とするために有用なｉＲＮＡ作用剤は、標的細胞においてより大きなｄｓＲＮＡの切断によって生成されない。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチド突出、例えば、１、２、３、または４ヌクレオチドをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端化した対応物と比べて予想外に優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチド突出は、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含めたヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得る、またはそれからなり得る。突出は、センス鎖、アンチセンス鎖またはこれらの任意の組合せに存在し得る。さらに、突出のヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端または両方の末端に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察される当技術分野で公知の標準の方法によって、例えば、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用することによって合成することができる。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階手順を使用して調製することができる。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を別々に調製する。次いで、構成成分の鎖をアニーリングする。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、液相または固相有機合成または両方を使用して調製することができる。有機合成により、通常ではないヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点がもたらされる。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、液相または固相有機合成または両方を使用して調製することができる。
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列およびアンチセンス配列を含む。センス鎖配列は、表２、３、７、８、１０、１１または１３のいずれか１つに提示されている配列の群から選択され、センス鎖のアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド配列は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様では、２つの配列の一方は２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列の一方が、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現下で生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。そのように、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、一方のオリゴヌクレオチドは表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおいてセンス鎖（パッセンジャー鎖）として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として記載される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は別々のオリゴヌクレオチドに含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチドに含有される。
表２、３、７、８、１０、１１、または１３の配列は、修飾された配列、修飾されていない配列、コンジュゲートしていない配列、および／またはコンジュゲートした配列として記載されているが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、修飾されていない、コンジュゲートしていない、ならびに／または本明細書に記載されているものと異なって修飾された、および／もしくはコンジュゲートした、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに記載されている配列のいずれか１つを含み得ることが理解されよう。
約２０から２３塩基対の間、例えば、２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であると認められていることを当業者は十分に分かっている（Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20: 6877-6888）。しかし、他者により、より短いまたはより長いＲＮＡ二重鎖構造も有効であり得ることが見いだされている（Chu and Rana (2007) RNA 14: 1714-1719；Kim et al. (2005) Nat Biotech 23: 222-226）。上記の実施形態では、本明細書で提示されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、長さが最短で２１ヌクレオチドである少なくとも１つの鎖を含み得る。一方または両方の末端のほんの数ヌクレオチドが引かれた、より短い二重鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることを合理的に予測することができる。したがって、本明細書に提示される配列の１つに由来し、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が全配列を含むｄｓＲＮＡと約５、１０、１５、２０、２５、または３０％阻害以下異なる、少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれよりも多くの連続したヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡが本発明の範囲内に入ることが意図されている。
さらに、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに記載のＲＮＡにより、ＨＳＤ１７Ｂ１３転写物内のＲＩＳＣ媒介性切断を受けやすい部位が同定される。そのように、本発明は、この部位内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡにより特定の部位内の任意の場所での転写物の切断が促進されれば、そのｉＲＮＡはＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするといえる。そのようなｉＲＮＡは、一般に、遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から取った追加的なヌクレオチド配列とカップリングする本明細書に提示される配列の１つからの少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含む。
標的配列は一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列の、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を方向付けることに関する適性は広範に変動する。本明細書で示されている種々のソフトウェアパッケージおよびガイドラインにより、任意の所与の遺伝子標的に対する最適な標的配列の同定に関するガイダンスが提供されるが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」を文字通りまたは比喩的に（例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏを含む）標的ＲＮＡ配列に置いて、そのサイズ範囲内で標的配列としての機能を果し得る配列を同定するという経験的手法も取ることができる。選択された任意の所与の標的サイズに関して可能性のある配列の完全なセットが同定されるまで、配列「ウインドウ」を最初の標的配列の位置から１ヌクレオチド上流または下流に連続して移動させることにより、次の潜在的な標的配列を同定すすることができる。このプロセスを、最適に機能する配列を同定するために系統的合成および同定された配列の試験（本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のアッセイを使用する）と併せることにより、ｉＲＮＡ作用剤を用いて標的化した場合に標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定することができる。したがって、本明細書において同定される配列は有効な標的配列を表すが、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に連続して「ウインドウを歩くように移動」して、等しいまたはより良好な阻害特性を有する配列を同定することにより、阻害効率のさらなる最適化を実現することができることが意図されている。
さらに、本明細書において同定される任意の配列に対して、系統的にヌクレオチドの付加または除去のいずれかを行って、より長いまたはより短い配列を生成し、生成された配列を、より長いまたはより短いサイズのウインドウをその点から標的ＲＮＡから上方または下方に歩くように移動することによって試験することにより、さらなる最適化を実現することができることが意図されている。再度、新しい候補標的を生成するためのこの手法を、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の阻害アッセイにおけるこれらの標的配列に基づくｉＲＮＡの効果についての試験と併せることにより、阻害効率のさらなる改善を導くことができる。さらになお、そのような最適化された配列を、例えば、本明細書に記載のもしくは当技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、突出の付加もしくは変化、または当技術分野で公知のおよび／もしくは本明細書で考察されている他の修飾によって調整して、分子を発現阻害剤としてさらに最適化することができる（例えば、血清の安定性または循環半減期の増大、熱安定性の増大、膜貫通送達の増強、特定の位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増大、エンドソームからの放出の増大）。
本明細書に記載のｉＲＮＡ作用剤は、標的配列に対して１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は相補性領域の中央に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは相補性領域の５’または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチド以内に制限されることが好ましい。例えば、２３ヌクレオチドのｉＲＮＡ作用剤に関しては、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の領域と相補的である鎖は、一般に、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にはいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含有するｉＲＮＡがＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害において有効であるかどうかを決定することができる。ミスマッチを有するｉＲＮＡのＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の阻害における有効性の考察は、特に、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の特定の相補性領域が集団内で多型配列バリエーションを有することが分かっている場合に重要である。
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている化学修飾および／またはコンジュゲーションを含まない。別の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特性が増強されるように化学修飾されている。本発明のある特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本発明のｉＲＮＡは、全体ではないが大部分が修飾されており、５、４、３、２、または１つ以下の修飾されていないヌクレオチドを含み得る。
本発明の一部の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されており、ｉＲＮＡ作用剤は、２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む（例えば、９個以下の２’－フルオロ修飾、８個以下の２’－フルオロ修飾、７個以下の２’－フルオロ修飾、６個以下の２’－フルオロ修飾、５個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、５個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、３個以下の２’－フルオロ修飾、または２個以下の２’－フルオロ修飾）。例えば、一部の実施形態では、センス鎖は、２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む（例えば、３個以下の２’－フルオロ修飾、または２個以下の２’－フルオロ修飾）。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む（例えば、５個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、または２個以下の２’－フルオロ修飾）。
本発明の他の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されており、ｉＲＮＡ作用剤は、２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む（例えば、９個以下の２’－フルオロ修飾、８個以下の２’－フルオロ修飾、７個以下の２’－フルオロ修飾、６個以下の２’－フルオロ修飾、５個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、５個以下の２’－フルオロ修飾、４個以下の２’－フルオロ修飾、３個以下の２’－フルオロ修飾、または２個以下の２’－フルオロ修飾）。
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’－リン酸または５’－リン酸模倣体をさらに含む。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’－リン酸模倣体をさらに含む。特定の実施形態では、５’－リン酸模倣体は、５’－ビニルリン酸（５’－ＶＰ）である。
本発明において特徴付けられる核酸は、これにより参照により本明細書に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているものなどの当技術分野において十分に確立された方法によって合成および／または修飾することができる。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結）もしくは３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは拡張されたパートナーのレパートリーと塩基対合する塩基での置換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、もしくはコンジュゲートした塩基；糖修飾（例えば、２’位または４’位）もしくは糖の置換え；および／または、リン酸ジエステル連結の修飾または置換えを含めた骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載の実施形態において有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、これだけに限定されないが、修飾された骨格を含有するまたは天然のヌクレオシド間連結を含有しないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしてはとりわけ、骨格にリン原子を有さないＲＮＡが挙げられる。本明細書の目的に関して、および当技術分野において時々参照される通り、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドともみなされ得る。一部の実施形態では、修飾ｉＲＮＡはヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、ならびに、ヌクレオシド単位の近接する対が３’－５’から５’－３’にまたは２’－５’から５’－２’に連結した逆極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。本発明の一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤は、遊離酸の形態である。本発明の他の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤は、塩の形態である。一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤は、ナトリウム塩の形態である。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤がナトリウム塩の形態である場合、作用剤中に存在するリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てに対して対イオンとしてナトリウムイオンが作用剤中に存在する。リン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結の実質的に全てがナトリウム対イオンを有する作用剤は、ナトリウム対イオンを伴わないリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結を５個、４個、３個、２個、または１個以下含む。一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤がナトリウム塩の形態である場合、作用剤中に存在するリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の全てに対して対イオンとしてナトリウムイオンが作用剤中に存在する。
上記のリン含有連結の調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６，２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；および米国特許ＲＥ３９４６４が挙げられ、これらのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
リン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結（一部ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他を有するものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられ、これらのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡに使用するための、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち骨格が新規の基で置き換えられた適切なＲＮＡ模倣体が意図されている。妥当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための塩基単位は維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられる、これらのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。本発明のｉＲＮＡへの使用に適した追加的なＰＮＡ化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載されている。
本発明において特徴付けられる一部の実施形態は、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号のホスホロチオエート骨格、およびヘテロ原子骨格、具体的には－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［ネイティブなリン酸ジエステル骨格は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－で表される］を有するオリゴヌクレオシド、ならびに上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書で特徴付けられるＲＮＡは、上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡは、１つまたは複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書で特徴付けられるｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの１つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニルもしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ここで、ｎおよびｍは１から約１０までである。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態的性質を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において下の実施例に記載されている２’－ＤＭＡＯＥとしても公知の２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。さらなる例示的な修飾として、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これらの３つのファミリーのＲ異性体およびＳ異性体の両方）；２’－アルコキシアルキル；および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾をｉＲＮＡのＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位または２’－５’連結ｄｓＲＮＡおよび５’末端ヌクレオチドの５’位において行うことができる。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が挙げられ、これらのうちのいくつかは本出願と共同所有される。前述のそれぞれの内容全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のｉＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野では多くの場合、単に「塩基」と称される）の修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン（daazaadenine）、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどを含む。さらなる核酸塩基として、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されているもの； The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613によって開示されているもの、およびSanghvi, Y S. , Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明において特徴付けられるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含めた５置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に例示的な塩基置換である。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号が挙げられ、これらのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のｉＲＮＡは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾されていてもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を接続する追加の架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造により、リボースが３’末端構造コンフォメーションに有効に「ロック」される。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加により、血清中でのｓｉＲＮＡ安定性が増大し、オフターゲットの効果が減少することが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3): 833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12): 3185-3193）。
本発明のｉＲＮＡは、１つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾されていてもよい。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含み、それにより、二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続する。したがって、一部の実施形態では、本発明の作用剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を接続する追加の架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造により、リボースが３’末端構造コンフォメーションに有効に「ロック」される。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加により、血清中でのｓｉＲＮＡ安定性が増大し、オフターゲットの効果が減少することが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3): 833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12): 3185-3193）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定することなく、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド作用剤は、４’～２’架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’～２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、これだけに限定されないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）が挙げられる。前述のそれぞれの内容全体は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示している追加的な代表的な米国特許および米国特許公開としては、これだけに限定されないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，５２５，１９１号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第６，９９８，４８４号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０８４，１２５号；同第７，３９９，８４５号；同第７，４２７，６７２号；同第７，５６９，６８６号；同第７，７４１，４５７号；同第８，０２２，１９３号；同第８，０３０，４６７号；同第８，２７８，４２５号；同第８，２７８，４２６号；同第８，２７８，２８３号；ＵＳ２００８／００３９６１８；およびＵＳ２００９／００１２２８１が挙げられ、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
前述の二環式ヌクレオシドはいずれも、例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含め、１つまたは複数の立体化学的な糖立体配置を有するように調製することができる（ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）。
本発明のｉＲＮＡは、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾されていてもよい。本明細書で使用される場合、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、拘束エチルヌクレオチドは、Ｓコンフォメーションにあり、本明細書では「Ｓ－ｃＥｔ」と称される。
本発明のｉＲＮＡは、１つまたは複数の「コンフォメーションが制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素またはリボースのＣ３炭素と－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮによりリボース環が安定なコンフォメーションにロックされ、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性が増大する。リンカーは、酸素が安定性および親和性に関して最適な位置に置かれ、その結果、リボース環の歪みが少なくなるのに十分な長さのものである。
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示している代表的な刊行物としては、これだけに限定されないが、米国特許公開第２０１３／０１９０３８３号；およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３６８６８が挙げられ、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである１つまたは複数の単量体を含む。ＵＮＡは、アンロックド非環式核酸であり、糖の結合のいずれかが除去されており、それにより、アンロックド「糖」残基が形成されている。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’－Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素の間の炭素－酸素－炭素共有結合）が除去されている単量体も包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素の間の炭素－炭素共有結合）が除去されている（これによって参照により本明細書に組み込まれるNuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい）。
ＵＮＡの調製を教示している代表的な米国公開としては、これだけに限定されないが、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１４，２２７号；および米国特許公開第２０１３／００９６２８９号；同第２０１３／００１１９２２号；および同第２０１１／０３１３０２０号が挙げられる。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定化させる修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’’－リン酸、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）およびその他を挙げることができる。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／００５８６１号に見いだすことができる。
本発明のｉＲＮＡの他の修飾としては、ＲＮＡｉ作用剤のアンチセンス鎖における５’リン酸または５’リン酸模倣体、例えば、５’末端リン酸またはリン酸模倣体が挙げられる。適切なリン酸模倣体は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されている。
ある特定の具体的な実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙される作用剤の群から選択される、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害する作用剤である。これらの作用剤はいずれも、リガンドをさらに含み得る。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明のある特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年１１月１６日出願のＷＯ２０１３／０７５０３５に開示されている化学修飾を伴う作用剤を含む。
したがって、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的遺伝子（すなわちＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ作用剤を提供する。ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む。ＲＮＡｉ作用剤の各鎖は１２～３０ヌクレオチド長にわたり得る。例えば、各鎖は、１４～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長であり得る。一実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長である。一実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、一般には、二重鎖である二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成し、これは、本明細書では「ＲＮＡｉ作用剤」とも称される。ＲＮＡｉ作用剤の二重鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２７～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さ、または２１～２３ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端に１つまたは複数の突出領域および／またはキャップ形成基を含有し得る。突出は、１～６ヌクレオチド長、例えば、２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、または１～２ヌクレオチド長であり得る。突出は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いことの結果であり得る、または、同じ長さの２つの鎖がずれていることの結果であり得る。突出は、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、または標的とされる遺伝子配列と相補的であり得るまたは別の配列であり得る。第１および第２の鎖は、例えば、ヘアピンを形成するための追加的な塩基によって、または他の非塩基リンカーによって接合していてもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤の突出領域内のヌクレオチドは、それぞれ独立に、２’－糖修飾されたもの、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せを含むが、これだけに限定されない、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端の突出配列であり得る。突出は、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、または標的とされる遺伝子配列と相補的であり得るまたは別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’－突出または３’－突出はリン酸化されていてよい。一部の実施形態では、突出領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは同じであっても異なってもよい。一実施形態では、突出は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’－突出はアンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’－突出はセンス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ作用剤は、単一の突出のみを含有し得、それにより、ＲＮＡｉの全体的な安定性に影響を及ぼすことなくＲＮＡｉの干渉活性を強化することができる。例えば、一本鎖突出は、センス鎖の３’末端またはその代わりに、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置するまたはその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチド突出を有し、５’末端は平滑である。理論に制約されることを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端における非対称の平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端突出は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖ローディングに好都合である。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、１９ヌクレオチド長の両末端平滑鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、２０ヌクレオチド長の両末端平滑鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、２１ヌクレオチド長の両末端平滑鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖と２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｆ修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ作用剤の一方の末端は平滑であり、他方の末端は、２ヌクレオチド突出を含む。２ヌクレオチド突出はアンチセンス鎖の３’末端にあることが好ましい。
２ヌクレオチド突出がアンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得、ここで、３つのヌクレオチドのうち２つは突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含め、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基が、独立に、例えば交互のモチーフとして、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾されている。必要に応じて、ＲＮＡｉ作用剤は、リガンド（ＧａｌＮＡｃ３が好ましい）をさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチド（１位）から始まり、第１の鎖の１位～２３位は少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基の長さであり、３’末端ヌクレオチドから始まり、センス鎖の１位～２３位と対合して二重鎖を形成する位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、最大６つの連続した３’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、それにより、１～６ヌクレオチドの３’一本鎖突出が形成され；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０～３０個の連続したヌクレオチドを含み、それにより、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’突出を形成し；センスおよびアンチセンス鎖を最大の相補性でアラインメントした場合、少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドがアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それにより、センスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二重鎖の領域が形成され；かつ、アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入された際に標的遺伝子発現が低減するように、アンチセンス鎖の少なくとも１９個のリボヌクレオチド長に沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり；かつ、センス鎖は、３個の連続したヌクレオチドにおいて３つの２’－Ｆ修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有し、モチーフの少なくとも１つは切断部位またはその付近に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその付近の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ作用剤は、長さが少なくとも２５および最大２９ヌクレオチドである第１の鎖および長さが最大３０ヌクレオチドであり、５’末端から１１位、１２位、１３位の３個の連続したヌクレオチドにおける３つの２’－Ｏ－メチル修飾を有する少なくとも１つのモチーフを有する第２の鎖を含み；第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端は平滑末端を形成し、第２の鎖はその３’末端が第１の鎖よりも１～４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ作用剤が哺乳動物細胞に導入された際に標的遺伝子発現が低減するように、少なくとも１９ヌクレオチドの第２の鎖の長さに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、かつ、ＲＮＡｉ作用剤のダイサーによる切断の結果、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減する。必要に応じて、ＲＮＡｉ作用剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖は、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有し、モチーフの１つはセンス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のアンチセンス鎖は、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する少なくとも１つのモチーフも含み得、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその付近に存在する。
１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するＲＮＡｉ作用剤に関しては、アンチセンス鎖の切断部位は、一般には５’末端から１０位、１１位および１２位の近くである。したがって、３つの同一の修飾を有するモチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得、計数はアンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから開始される、または、計数はアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから開始される。アンチセンス鎖の切断部位は、５’末端から、ＲＮＡｉの二重鎖領域の長さに応じても変化し得る。
ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する少なくとも１つのモチーフを含有し得；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその付近に３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖とアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合、センス鎖とアンチセンス鎖を、センス鎖における３つのヌクレオチドという１つのモチーフおよびアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドという１つのモチーフが少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有するように、すなわち、センス鎖におけるモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つがアンチセンス鎖におけるモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するようにアラインメントすることができる。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複していてもよく、３つのヌクレオチド全てが重複していてもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖は、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有するモチーフを１つよりも多く含有し得る。第１のモチーフは鎖の切断部位またはその付近に存在し得、他のモチーフはウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。「ウイング修飾」という用語は、本明細書では、同じ鎖の切断部位またはその付近のモチーフとは分離された、鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに近接しているか、または少なくとも１つもしくは複数のヌクレオチドにより分離されている。モチーフが互いのすぐ隣にある場合には、モチーフの化学的性質は互いに異なり、モチーフが１つまたは複数のヌクレオチドにより分離されている場合には、化学的性質は同じであっても異なってもよい。２つまたはそれよりも多くのウイング修飾が存在してよい。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位またはその付近にある第１のモチーフに対して一端に存在してもよく、リードモチーフの両側に存在してもよい。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ作用剤のアンチセンス鎖は、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有するモチーフを１つよりも多く含有し得、モチーフの少なくとも１つは鎖の切断部位またはその付近に存在する。このアンチセンス鎖は、１つまたは複数のウイング修飾も、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様のアラインメントで含み得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、一般には、鎖の３’末端、５’末端または両方の末端の最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、一般には、鎖の３’末端、５’末端または両方の末端の二重鎖領域内に最初の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれが少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、これらのウイング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に位置し、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれが少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖とアンチセンス鎖を、それぞれ一方の鎖に由来する２つの修飾が二重鎖領域の一方の末端に位置し、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するように；それぞれ一方の鎖に由来する２つの修飾が二重鎖領域の他方の末端に位置し、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するように；一方の鎖の２つの修飾がリードモチーフのそれぞれの側に位置し、二重鎖領域内に１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するようにアラインメントすることができる。
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含め、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが修飾されていてよい。各ヌクレオチドは、同じ修飾で修飾されていてもよく、異なる修飾で修飾されていてもよく、それらの修飾として、連結していないリン酸酸素の一方もしくは両方および／または連結しているリン酸酸素の１つもしくは複数の１つもしくは複数の変更；リボース糖の構成物、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大規模な置換え；天然に存在する塩基の修飾または置換え；ならびにリボース－リン酸骨格の置換えまたは修飾を挙げることができる。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で繰り返される位置、例えば、塩基の修飾、またはリン酸部分、またはリン酸部分の連結していないＯに存在する。一部の場合では、修飾は核酸内の対象の位置の全てに存在するが、多くの場合、そうはならない。例として、修飾は、３’または５’末端位のみに存在し得る、末端領域内、例えば、鎖の末端ヌクレオチドの位置、または最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドにおいてのみ存在し得る。修飾は、二本鎖領域内、一本鎖領域内、またはその両方において存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域においてのみ存在し得る、またはＲＮＡの一本鎖領域内にのみ存在し得る。例えば、連結していないＯ位におけるホスホロチオエート修飾は、一方の末端または両方の末端においてのみ存在し得る、末端領域内、例えば、鎖の末端ヌクレオチドの位置または最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドにおいてのみ存在し得る、あるいは二本鎖および一本鎖領域内、特に末端において存在し得る。１つまたは複数の５’末端がリン酸化されていてよい。
例えば、安定性を増強すること、特定の塩基を突出に含めること、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代理を一本鎖突出、例えば５’もしくは３’突出、もしくはその両方に含めることが可能であり得る。例えば、プリンヌクレオチドを突出に含めることが望ましい場合がある。一部の実施形態では、３’または５’突出の塩基の全部または一部が、例えば、本明細書に記載の修飾で修飾されていてよい。修飾としては、例えば、当技術分野で公知である修飾を用いた、リボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりのデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を挙げることができる。突出は標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されている。鎖は、１つよりも多くの修飾を含有し得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾されている。
一般には少なくとも２つの異なる修飾がセンス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、または他のものであり得る。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の修飾を有し、各修飾が一方の鎖の交互のヌクレオチドに存在するモチーフを指す。交互のヌクレオチドとは、１つおきのヌクレオチド毎に１つまたは３ヌクレオチド毎に１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれヌクレオチドに対する修飾の１つの型を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互モチーフに含有される修飾の型は同じであっても異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれヌクレオチドに対する修飾の１つの型を表す場合、交互パターン、すなわち、１つおきのヌクレオチドに対する修飾は同じものであってよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれは、交互モチーフ内のいくつかの修飾の可能性、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」、「ＢＤＢＤＢＤ・・・」または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などから選択することができる。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしたセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なって修飾された基に対応するようなものであってよく、逆もまた同じである。例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖においてセンス鎖とアンチセンス鎖が対合している場合、二重鎖領域内で、センス鎖における交互モチーフは鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で始まってよく、アンチセンス鎖における交互モチーフは鎖の５’から３’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で始まってよい。別の例として、二重鎖領域内で、センス鎖における交互モチーフは鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まってよく、アンチセンス鎖における交互モチーフは鎖の５’から３’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まってよく、したがって、センス鎖とアンチセンス鎖の間に修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖における最初に２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対するシフトを有する、センス鎖における最初に２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンを含む、すなわち、センス鎖塩基における２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと対合する。および逆もまた同じである。センス鎖の１位は２’－Ｆ修飾で始まってよく、アンチセンス鎖の１位は２’－Ｏ－メチル修飾で始まってよい。
３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つまたは複数のモチーフをセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に導入することにより、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンが中断される。３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つまたは複数のモチーフをセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に導入することによるこのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンの中断により、驚いたことに、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性が増強される。
一実施形態では、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有するモチーフを鎖のいずれかに導入する場合、当該モチーフの隣のヌクレオチドの修飾は、当該モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の部分は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有するモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙという修飾とは異なる、モチーフ「ＹＹＹ」の隣のヌクレオチドに対する修飾を表し、ＮａとＮｂは同じで修飾あっても異なる修飾であってもよい。あるいは、ウイング修飾が存在する場合にはＮａおよび／またはＮｂは存在してもしなくてもよい。
ＲＮＡｉ作用剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾がセンス鎖またはアンチセンス鎖または両方の鎖の任意のヌクレオチドに対して鎖の任意の位置において存在してよい。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドに存在してよい；各ヌクレオチド間連結修飾はセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖において交互パターンで存在してよい；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は両方のヌクレオチド間連結修飾を交互パターンで含有してよい。センス鎖におけるヌクレオチド間連結修飾の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても異なってもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対するシフトを有してよい。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、６－８ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉは、突出領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、突出領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を有する２つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間連結修飾はまた、突出ヌクレオチドが二重鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと連結するように作製することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全ての突出ヌクレオチドがホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を通じて連結していてよく、必要に応じて、突出ヌクレオチドを突出ヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドと連結する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が存在してよい。例えば、末端の３ヌクレオチドの間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在してよく、ここで、３つのヌクレオチドのうち２つは突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは突出ヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドである。これらの末端３ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端にあってよい。
一実施形態では、２ヌクレオチド突出はアンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し、ここで、３つのヌクレオチドのうち２つは突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドである。必要に応じて、ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに有し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、標的とのミスマッチ、二重鎖内のミスマッチ、またはこれらの組合せを含む。ミスマッチは、突出領域内または二重鎖領域内に存在し得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらの傾向に基づいて（例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーに基づいて、最も単純な手法は、個々の対ごとに対を調査することであるが、近接または同様の解析も使用することができる）順位づけることができる。解離の促進に関しては、Ａ：ＵがＧ：Ｃよりも好ましく、Ｇ：ＵがＧ：Ｃよりも好ましく、Ｉ：ＣがＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準または標準以外の対形成（本明細書の他の箇所に記載の通り）が標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対形成よりも好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成が標準対形成よりも好ましい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するために、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば、非標準または標準以外の対形成またはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択される、アンチセンス鎖の５’末端から、二重鎖領域内の最初の１、２、３、４、または５塩基対のうちの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端から、二重鎖領域内の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から、二重鎖領域内の最初の１、２または３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から、二重鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に、デオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列、例えば２つのｄＴヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
（式中、
ｉおよびｊは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立に、０～６であり；
各Ｎａは、独立に、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立に、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＮｂとＹは同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表す）
によって表すことができる。ＹＹＹは全てが２’－Ｆ修飾ヌクレオチドであることが好ましい。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその付近に存在する。例えば、ＲＮＡｉ作用剤が１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその付近に存在し得（例えば、６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位または１１位、１２位、１３位に存在し得）、計数は、５’末端から最初のヌクレオチドから開始される；または必要に応じて、計数は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから開始される。
一実施形態では、ｉは１であり、ｊは０である、またはｉは０でありｊは１である、またはｉおよびｊはどちらも１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表すことができる：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立に、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６であることが好ましい。各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれ互いと同じであっても異なってもよい。
他の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は、式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ-Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中、
ｋおよびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各Ｎａ’は、独立に、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立に、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表す）
によって表すことができる。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその付近に存在する。例えば、ＲＮＡｉ作用剤が１７～２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得、計数は、５’末端から最初のヌクレオチドから開始される；または必要に応じて、計数は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから開始される。Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは１１位、１２位、１３位に存在することが好ましい。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１であり、ｌは０であり、またはｋは０であり、ｌは１であり、またはｋおよびｌはどちらも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表すことができる：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ ’は、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立に、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６であることが好ましい。
他の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０であり、アンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はそれぞれ互いと同じであっても異なってもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されていてよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾されている。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、具体的には、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔである場合、鎖の９位、１０位および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含有し得、計数は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始される、または必要に応じて、計数は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから開始され；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の逆の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得；ＸＸＸおよびＺＺＺは、それぞれ独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得、計数は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始される、または必要に応じて、計数は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから開始され；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の逆の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本発明の方法において使用するためのＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み得、各鎖が１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ-Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、それぞれが存在してもしなくてもよく、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表す）
によって表される。
一実施形態では、ｉは０であり、ｊは０である；またはｉは１であり、ｊは０である；またはｉは０であり、ｊは１である；またはｉおよびｊはどちらも０である；またはｉおよびｊはどちらも１である。別の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０である；またはｋは１であり、ｌは０である；ｋは０であり、ｌは１である；またはｋおよびｌはどちらも０である；またはｋおよびｌはどちらも１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖の例示的な組合せとして、以下の式が挙げられる：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’ｎｑ’５’（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立に、１～１０個、１～７個、１～５個または１～４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０個、０～７個、０～１０個、０～７個、０～５個、０～４個、０～２個または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立に、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ’はそれぞれ独立に、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）のＸ、ＹおよびＺはそれぞれ互いと同じであっても異なってもよい。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つがＹ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成していてもよい。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成している；または、３つ全てのＹヌクレオチドが全て対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成している。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つがＺ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成していてよい。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成している；または３つ全てのＺヌクレオチドの全てが対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成している。
ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つがＸ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成していてよい。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成している；または３つ全てのＸヌクレオチドが全て対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成している。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドに対する修飾はＹ’ヌクレオチドに対する修飾とは異なり、Ｚヌクレオチドに対する修飾はＺ’ヌクレオチドに対する修飾とは異なり、かつ／またはＸヌクレオチドに対する修飾はＸ’ヌクレオチドに対する修飾とは異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており、センス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている（下記）。別の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤が式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートしている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される二重鎖を少なくとも２つ含有する多量体であり、二重鎖はリンカーによって接続されている。リンカーは切断可能なものまたは切断不可能なものであり得る。必要に応じて、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖のそれぞれは同じ遺伝子もしくは２つの異なる遺伝子を標的とし得る；または二重鎖のそれぞれは２つの異なる標的部位の同じ遺伝子を標的とし得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される二重鎖を３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多く含有する多量体であり、二重鎖はリンカーによって接続されている。リンカーは切断可能なものまたは切断不可能なものであり得る。必要に応じて、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖のそれぞれは同じ遺伝子もしくは２つの異なる遺伝子を標的とし得る；または二重鎖のそれぞれは２つの異なる標的部位の同じ遺伝子を標的とし得る。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ作用剤が５’末端において互いと連結しており、３’末端の一方または両方が必要に応じてリガンドとコンジュゲートしている。作用剤のそれぞれは同じ遺伝子もしくは２つの異なる遺伝子を標的とし得る；または作用剤のそれぞれは２つの異なる標的部位の同じ遺伝子を標的とし得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、２’－フルオロ修飾を含有するヌクレオチドを少数、例えば、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを１０個またはそれ未満含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ作用剤は、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個または０個含有し得る。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖に、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを１０個、例えば、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを４個含有し、アンチセンス鎖に、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを６個含有する。別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖に、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを６個、例えば、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを４個含有し、アンチセンス鎖に、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを２個含有する。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、２’－フルオロ修飾を含有するヌクレオチドを非常に少数含有し得る、例えば、２’－フルオロ修飾を含有するヌクレオチドを２個またはそれ未満含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ作用剤は、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを２個、１個または０個含有し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを２個、例えば、センス鎖に２－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを０個、およびアンチセンス鎖に２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチドを２個含有し得る。
種々の刊行物に本発明の方法において使用することができる多量体ＲＮＡｉ作用剤が記載されている。そのような刊行物としては、ＷＯ２００７／０９１２６９、米国特許第７８５８７６９号、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０が挙げられ、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
下により詳細に記載されている通り、１つまたは複数の炭水化物部分とＲＮＡｉ作用剤のコンジュゲーションを含有するＲＮＡｉ作用剤により、ＲＮＡｉ作用剤の１つまたは複数の性質を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分をＲＮＡｉ作用剤の修飾されたサブユニットに付着させる。例えば、ｄｓＲＮＡ作用剤の１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、炭水化物リガンドが付着した別の部分、例えば、非炭水化物（環式が好ましい）担体で置き換えることができる。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換え修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環式担体は、炭素環式環系、すなわち、環原子の全てが炭素原子であるものであってもよく、複素環式環系、すなわち、１つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であるものであってもよい。環式担体は、単環式環系であってもよく、２つまたはそれよりも多くの環、例えば、融合した環を含有してもよい。環式担体は、完全飽和型環系であってもよく、１つまたは複数の二重結合を含有してもよい。
リガンドをポリヌクレオチドに担体を介して付着させることができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点」、好ましくは２つの「骨格付着点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「係留付着点」を含む。「骨格付着点」とは、本明細書で使用される場合、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸骨格、または修飾リン酸骨格、例えば、硫黄含有骨格に担体を組み入れるために利用可能であり、かつそれに適した結合を指す。「係留付着点」（ＴＡＰ）とは、一部の実施形態では、選択された部分を接続する、環式担体の構成物である環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点をもたらす原子とは異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であってよい。必要に応じて、選択された部分を、介在する係留によって環式担体と接続する。したがって、環式担体は、多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含む、または一般に、別の化学的実体、例えば、リガンドを構成物である環に組み入れるまたは係留するために適した結合をもたらす。
ＲＮＡｉ作用剤をリガンドと担体を介してコンジュゲートすることができ、ここで、担体は、環式基であっても非環式基であってもよく、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択されることが好ましく、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択されることが好ましい。
本発明の別の実施形態では、ｉＲＮＡ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、各鎖が１４～４０ヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ作用剤は、式（Ｌ）：
によって表すことができる。
式（Ｌ）において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ独立に、２’－Ｏ－アルキル、２’置換アルコキシ、２’置換アルキル、２’－ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含有するヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ２’－ＯＭｅ修飾を含有する。ある特定の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆ修飾を含有する。ある特定の実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’の少なくとも１つが２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾を含有する。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位）の向かい側の部位に位置する、熱により不安定化するヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２位～８位のヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一例では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端から１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、熱により不安定化する修飾を有し、当該修飾として、脱塩基修飾；二重鎖における向かい側のヌクレオチドとのミスマッチ；および２’－デオキシ修飾などの糖修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。ある特定の実施形態では、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖における向かい側のヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）
からなる群から選択される脱塩基修飾；ならびにｉｉｉ）
（式中、Ｂは、修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である）からなる群から選択される糖修飾からなる群から選択される、熱により不安定化する修飾を有する。ある特定の実施形態では、Ｃ１の熱により不安定化する修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；必要に応じて、ミスマッチ対の少なくとも１つの核酸塩基は、２’－デオキシ核酸塩基である。一例では、Ｃ１の熱により不安定化する修飾は、ＧＮＡまたは
である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’はそれぞれ独立に、２’－ＯＭｅ修飾の立体的かさ高さよりも小さいまたはそれと等しい立体的かさ高さをヌクレオチドにもたらさす修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的かさ高さは、修飾の立体的効果の合計を指す。ヌクレオチドの修飾の立体的効果を決定するための方法は当業者には公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位におけるもの、または非リボースヌクレオチドに対する修飾、非環式ヌクレオチド、またはリボース糖の２’位と同様もしくは等価のヌクレオチドの骨格であってよく、２’－ＯＭｅ修飾の立体的かさ高さよりも小さいまたはそれと等しい立体的かさ高さをヌクレオチドにもたらす。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’はそれぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｆ、および２’－Ｆ－５’－メチルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｔ１は、ＤＮＡである。ある特定の実施形態では、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡである。ある特定の実施形態では、Ｔ２’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。ある特定の実施形態では、Ｔ３’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、およびｑ１は、独立に、４～１５ヌクレオチド長である。
ｎ５、ｑ３、およびｑ７は独立に、１～６ヌクレオチド長である。
ｎ４、ｑ２、およびｑ６は独立に、１～３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は、０である。
ｑ５は、独立に、０～１０ヌクレオチド長である。
ｎ２およびｑ４は独立に、０～３ヌクレオチド長である。
あるいは、ｎ４は、０～３ヌクレオチド長である。
ある特定の実施形態では、ｎ４は０であり得る。一例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１である。別の例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１であり、センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、ｎ４、ｑ２、およびｑ６はそれぞれ１である。
ある特定の実施形態では、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６はそれぞれ１である。
ある特定の実施形態では、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｃ１はセンス鎖の５’末端の１４位～１７位にあり、ｎ４は１である。ある特定の実施形態では、Ｃ１はセンス鎖の５’末端の１５位にある。
ある特定の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から始まる。一実施例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１と等しい。
ある特定の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から始まる。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１と等しい。
例示的な実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から始まり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から始まる。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から始まり、ｑ６は１と等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から始まり、ｑ２は１と等しい。
ある特定の実施形態では、Ｔ１’とＴ３’は１１ヌクレオチド長隔てられている（すなわち、Ｔ１’およびＴ３’ヌクレオチドを計数しない）。
ある特定の実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１と等しく、修飾は、２’位または２’－ＯＭｅリボースよりも小さい立体的かさ高さをもたらす非リボース、非環、もしくは骨格における位置におけるものである。
ある特定の実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１と等しく、修飾は、２’位または２’－ＯＭｅリボースよりも小さいもしくはそれと等しい立体的かさ高さをもたらす非リボース、非環、もしくは骨格における位置におけるものである。
ある特定の実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例では、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１はセンス鎖の５’末端から１１位にあり、ｎ２は１である。例示的な実施形態では、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位のセンス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１である。
ある特定の実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位から始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、ｑ４は１である。
例示的な実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にあり、例えば、センス鎖が１９～２２ヌクレオチド長である場合、センス鎖の５’末端から１１位にあり、ｎ２は１である；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２は１と等しく、Ｔ１’に対する修飾は、リボース糖の２’位または２’－ＯＭｅリボースよりも小さい立体的かさ高さをもたらす非リボース、非環、もしくは骨格における位置におけるものである；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位におけるものであり、ｑ４は１である；ならびにＴ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６は１と等しく、Ｔ３’に対する修飾は、２’位または２’－ＯＭｅリボースよりも小さいもしくはそれと等しい立体的かさ高さをもたらす非リボース、非環、もしくは骨格における位置におけるものである。
ある特定の実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位から始まり、ｑ４は２である。
ある特定の実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位から始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、ｑ４は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；必要に応じて、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加的なＴＴが伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；必要に応じて、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加的なＴＴが伴う；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。
ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端リン酸（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、または５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル
であり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、トランス－ビニルホスフェート、
）、５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、シス－ビニルホスフェート、
）のいずれか、またはそれらの混合物であってよい。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－Ｐを含む。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－ＰＳを含む。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－ＶＰを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－Ｅ－ＶＰを含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－Ｚ－ＶＰを含む。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２を含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－ＰＳ２を含む。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２を含む。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖に５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルを含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ ＲＮＡ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せであり得る。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２も含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－Ｐはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、および標的化リガンドも含む。
ある特定の実施形態では、５’－ＶＰはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳ２はアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－Ｐはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＶＰはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳ２はアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－ＯＭｅであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－Ｐはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＶＰはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳ２はアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’－Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－Ｐおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－Ｐはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＶＰはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－ＰＳ２および標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－ＰＳ２はアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
ある特定の実施形態では、Ｂ１は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’－ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’－ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’－Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’－Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’－Ｆであり、ｑ７は１である；センス鎖の１位～５位（センス鎖の５’末端から計数する）内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から計数する）の１位および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾が伴う。ＲＮＡｉ作用剤は、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよび標的化リガンドも含む。ある特定の実施形態では、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルはアンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドはセンス鎖の３’末端にある。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；ならびに
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位～１１位、１３位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位～１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と；
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位、５位、９位、１１位～１３位、１５位、１７位、１９位、２１位、および２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位～８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位、および２２位における２’Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ｄｓＲＮＡ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位～１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位～１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～６位、８位、１０位、および１２位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、７位および９位における２’－Ｆ修飾、および１１位におけるデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位～６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～６位、８位、１０位、１２位、１４位、および１６位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、９位、１１位、１３位、および１５位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位～４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～９位および１２位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および１０位および１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位～１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位～１１位、および１３位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、および１４位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位、５位～７位、９位、１１位～１３位、１５位、１７位～１９位、および２１位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、および１９位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および３位、５位、７位、９位～１１位、１３位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、４位、６位、７位、９位、１１位～１３位、１５位、１７位、および１９位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾、および２４位および２５位におけるデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～６位、８位、および１２位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位および９位～１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位～５位、７位、８位、１０位～１３位、１５位、および１７位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～６位、８位、および１２位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位および９位～１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位～５位、７位、１０位～１３位、１５位、および１７位～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ作用剤は、
（ａ）
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に付着したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝リンカーを通じて付着した３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位～４位、６位、および１０位～１９位における２’－ＯＭｅ修飾、および５位および７位～９位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位の間、およびヌクレオチド２位と３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１位、３位～５位、７位、１０位～１３位、１５位、および１７位～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から計数する）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位の間、ヌクレオチド２位と３位の間、ヌクレオチド１９位と２０位の間、およびヌクレオチド２０位と２１位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（５’末端から計数する）
を有するアンチセンス鎖と
を含み、
ＲＮＡｉ作用剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
ある特定の実施形態では、本発明の方法において使用するためのｉＲＮＡは、表２、３、７、８、１０、１１、または１３に列挙される作用剤から選択される作用剤である。一実施形態では、作用剤は、ＡＤ－２８８９１７である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－２８８９９６である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６３９である。一実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６４４である。別の実施形態では、作用剤は、ＡＤ－４１３６６９である。これらの作用剤は、リガンドをさらに含み得る。
ＩＶ．リガンドとコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ＲＮＡにｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを増強する１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートを化学的に連結することに関する。そのような部分としては、これだけに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660: 306-309；Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20: 533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10: 1111-1118；Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259: 327-330；Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75: 49-54）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654；Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937）などが挙げられる。
一実施形態では、リガンドにより、リガンドが組み入れられるｉＲＮＡ作用剤の分布、標的化または寿命が変更される。好ましい実施形態では、リガンドにより、選択された標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、体の区画、例えば、細胞区画もしくは器官区画、組織、器官または領域に対して、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して増強された親和性がもたらされる。好ましいリガンドは、二重鎖核酸における二重鎖対形成には関与しない。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、もしくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンもしくはヒアルロン酸）；または脂質などを挙げることができる。リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などであってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（アクリル酸２－エチル）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドは、標的化群、例えば、細胞または組織標的化作用物質、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化群は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン型糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識されたマーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進因子（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環式化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。リガンドは、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなども含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ－κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ作用剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タキサン（taxon）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡに付着したリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターは、脂肪親和性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合性物質、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的なＰＫモジュレーターとしては、これだけに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも血清タンパク質に結合することが公知であり、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格内に多数のホスホロチオエート連結を含む約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもリガンドとして（例えば、ＰＫをモジュレートするリガンドとして）本発明に適する。さらに、血清構成成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも本明細書に記載の実施形態においてＰＫをモジュレートするリガンドとして使用するのに適している。
本発明のリガンドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、連結性分子のオリゴヌクレオチドへの付着に由来するものなどのペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドを使用することによって合成することができる（下記）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに付着する連結性部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本発明のコンジュゲートに使用するオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成の技法によって都合よく常套的に作製することができる。そのような合成のための設備は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含めたいくつかのベンダーによって販売されている。それに加えて、またはその代わりに、そのような合成のための当技術分野で公知の任意の他の手段を使用することができる。同様の技法を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製することも公知である。
リガンドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド、およびリガンド－本発明の配列特異的連結したヌクレオシドを有する分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、適切なＤＮＡ合成機において、標準のヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または連結性部分をすでに有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに有するリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する構成要素を利用してアセンブルすることができる。
連結性部分をすでに有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的連結したヌクレオシドの合成は、一般には完了しており、次いで、リガンド分子を連結性部分と反応させて、リガンドとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結したヌクレオシドを、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において常套的に使用される標準のホスホラミダイトおよび非標準のホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用する自動合成機によって合成する。
Ａ．脂質コンジュゲート
一実施形態では、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合性リガンドにより、コンジュゲートを体の標的組織、例えば、腎臓ではない標的組織に分布させることが可能になる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であり得る。ＨＳＡに結合する他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大させることができ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。
脂質に基づくリガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合を阻害する、例えば調節することができる。例えば、ＨＳＡへの結合がより強力な脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓にターゲティングされる可能性は低く、したがって、体内から取り除かれる可能性が低い。コンジュゲートを腎臓にターゲティングするためにはＨＳＡへの結合があまり強力でない脂質または脂質に基づくリガンドを使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに十分な親和性で結合し、したがって、コンジュゲートは好ましくは腎臓ではない組織に分布することが好ましい。しかし、親和性はＨＳＡ－リガンド結合が逆転できないほど強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するまたは全く結合せず、したがって、コンジュゲートは好ましくは腎臓に分布する。脂質に基づくリガンドの代わりにまたはそれに加えて、腎臓細胞にターゲティングされる他の部分を使用することもできる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖している細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型、例えば、がん細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を処置するために特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養分が挙げられる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過作用剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過作用剤、好ましくはヘリックス細胞透過作用剤である。作用剤は両親媒性であることが好ましい。例示的な作用剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたは偽性ペプチド連結、およびＤ－アミノ酸の使用を含め、改変されたものであってよい。ヘリックス作用剤は、アルファヘリックス作用剤であることが好ましく、これは親油性および疎油性相を有することが好ましい。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも称される）は、天然のペプチドと同様の定義された三次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ作用剤への付着により、例えば細胞による認識および吸収の増強により、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼすことができる。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋結合したペプチドであり得る。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２９７７）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２９７８）も標的化部分になり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２９７９））およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９８０））が送達ペプチドとして機能することができることが見いだされている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Lam et al., Nature, 354: 82-84, 1991）から同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされ得る。細胞標的化のために組み入れられた単量体単位を介してｄｓＲＮＡ作用剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸から約４０アミノ酸までの長さにわたり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増大させるまたはコンフォメーション性を方向付けるために構造的修飾を有してよい。下記の構造的修飾のいずれも利用することができる。
本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状であっても環状であってもよく、また、特定の組織へのターゲティングを容易にするために、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されていてよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドをターゲティングする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７もしくはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンもしくはバクテネシン）、または、ただ１つもしくは２つの優位を占めるアミノ酸だけを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９もしくはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１およびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物とコンジュゲートしたｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける核酸の送達、ならびに本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏにおける治療的使用に適した組成物に有利である。本明細書で使用される場合、「炭水化物」は、それ自体が少なくとも６個の炭素原子を有し、各炭素原子に酸素、窒素もしくは硫黄原子が結合した１つもしくは複数の単糖単位（直鎖状、分枝、もしくは環状であってよい）で構成される炭水化物である化合物；または、それぞれが少なくとも６個の炭素原子を有し、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合した１つもしくは複数の単糖単位（直鎖状、分枝、または環状であってよい）で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖および約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、または約９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖は、Ｃ５およびそれを上回る（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）糖を含み；二糖および三糖は、２つまたは３つの単糖単位を有する糖を含む（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：
別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態では、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
本明細書に記載の実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、これだけに限定されないが、
（ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である）
が挙げられる。
本発明のある特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ作用剤に一価リンカーを介して付着している。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ作用剤に二価リンカーを介して付着している。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、本発明のｉＲＮＡ作用剤に三価リンカーを介して付着している。
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、本明細書に記載のｉＲＮＡ作用剤、例えば、ｄｓＲＮＡ作用剤のセンス鎖の３’または５’末端に付着した１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ作用剤は、二本鎖ＲＮＡｉ作用剤の複数のヌクレオチドに複数の一価リンカーを通じてそれぞれ独立に付着した複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ作用剤の２つの鎖が、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖によって接続し、複数の対合していないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する１つのより大きな分子の一部である場合、ヘアピンループ内の対合していないヌクレオチドはそれぞれが独立に、一価リンカーを介して付着したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでよい。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、これだけに限定されないが、ＰＫモジュレーターおよび／または細胞透過ペプチドなどの上記の１つまたは複数の追加的なリガンドをさらに含む。
本発明における使用に適した追加的な炭水化物コンジュゲート（およびリンカー）としては、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６２０号および同第ＷＯ２０１４／１７９６２７号に記載されているものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートまたはリガンドをｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに、切断可能なものであっても切断不可能なものであってもよい種々のリンカーを用いて付着させることができる。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の２つの部分を接続する、例えば、化合物の２つの部分を共有結合により付着させる有機部分を意味する。リンカーは、一般には、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、またはこれだけに限定されないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル（alkynylhererocyclylalkynyl）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（alkynylhereroaryl）などの原子鎖を含み、１つまたは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環式によって中断または終結されていてもよく；Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個、３～２４個、４～２４個、５～２４個、６～２４個、６～１８個、７～１８個、８～１８個の原子、７～１７個、８～１７個、６～１６個、７～１７個、または８～１６個の原子である。
切断可能な連結基とは、細胞の外部では十分に安定であるが、標的細胞に進入すると、切断されてリンカーが合わせて保持していた２つの部分を放出する連結基である。好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、標的細胞内または第１の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣するまたは表すように選択することができる）では、対象の血液中または第２の参照条件下（例えば、血液または血清中で見いだされる条件を模倣するまたは表すように選択することができる）よりも少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくはそれよりも大きな、または少なくとも約１００倍の速さで切断される。
切断可能な連結基は、切断作用因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断作用因子は、細胞の内部において血清または血液中よりも広くいきわたっているまたはより高いレベルもしくは活性で見いだされる。そのような分解性作用因子の例としては、例えば酸化的もしくは還元的酵素を含めた特定の基質に対して選択されるもしくは基質特異性を有さない酸化還元因子、または、酸化還元で切断可能な連結基を還元によって分解することができる、細胞内に存在するメルカプタンなどの還元因子；エステラーゼ；エンドソーム、または酸性環境を創出することができる作用因子、例えば、ｐＨ５もしくはそれ未満をもたらす作用因子；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的なものであってよい）、およびホスファターゼとして作用することにより、酸により切断可能な連結基を加水分解もしくは分解することができる酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な連結基は、ｐＨの影響を受けやすいものであり得る。ヒト血清のｐＨは７．４であり、一方、細胞内ｐＨの平均はわずかに低く、約７．１～７．３にわたる。エンドソームは５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは約５．０のさらにいっそう酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それにより、リガンドからカチオン性脂質を細胞の内部に、または細胞の所望の区画中に放出する切断可能な連結基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカーに組み入れられる切断可能な連結基の型は、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質と連結することができる。肝細胞ではエステラーゼが豊富であり、したがって、当該リンカーは肝細胞においてエステラーゼが豊富でない細胞型よりも効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎臓皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合にはペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
一般に、候補の切断可能な連結基の適性は、分解性作用因子（または条件）の候補連結基を切断する能力を試験することによって評価することができる。候補の切断可能な連結基を、血液中でまたは他の非標的組織と接触した際の切断に抵抗する能力について試験することも望ましい。したがって、第１条件と第２の条件の間での相対的な切断の受けやすさを決定することができ、この場合、第１の条件は、標的細胞における切断が示されるように選択し、第２の条件は、他の組織または生体液、例えば、血液または血清における切断が示されるように選択する。評価は、無細胞系で、細胞内で、細胞培養下で、器官もしくは組織培養下で、または動物全体において行うことができる。無細胞または培養条件において最初の評価を行うこと、および動物全体においてさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、細胞内（または細胞内条件が模倣されるように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）では、血液または血清（または細胞外条件が模倣されるように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍の速さで切断される。
ｉ．酸化還元で切断可能な連結基
一実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化時に切断される、酸化還元で切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。候補の切断可能な連結基が適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化作用剤と共に使用するのに適しているかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法に頼ることができる。例えば、候補を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または他の還元剤と一緒に、当技術分野で公知の試薬を使用してインキュベートし、それにより細胞、例えば、標的細胞内で観察されることになる切断速度を模倣することによって評価することができる。候補を血液または血清条件が模倣されるように選択された条件下で評価することもできる。一実施形態では、候補化合物は血液中で最大約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、細胞内（または細胞内条件が模倣されるように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）では、血液（または細胞外条件が模倣されるように選択されたｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下）と比較して少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍の速さで分解される。候補化合物の切断速度を細胞内環境が模倣されるように選択された条件下で標準の酵素カイネティクスアッセイを使用して決定し、細胞外環境が模倣されるように選択された条件と比較することができる。
ｉｉ．リン酸に基づく切断可能な連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸に基づく切断可能な連結基を含む。リン酸に基づく切断可能な連結基は、リン酸基を分解するまたは加水分解する作用物質によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する作用物質の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補を、上記のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｉｉ．酸により切断可能な連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸により切断可能な連結基を含む。酸により切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸により切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５もしくはそれ未満（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、もしくはそれ未満）である酸性環境において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官により、酸により切断可能な連結基の切断環境がもたらされ得る。酸により切断可能な連結基の例としては、これだけに限定されないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸により切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に付着した炭素がアリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどである場合である。これらの候補を、上記のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｖ．エステルに基づく連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルに基づく切断可能な連結基を含む。エステルに基づく切断可能な連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルに基づく切断可能な連結基の例としては、これだけに限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルである切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補を、上記のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｖ．ペプチドに基づく切断性基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドに基づく切断可能な連結基を含む。ペプチドに基づく切断可能な連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドに基づく切断可能な連結基は、アミノ酸間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドをもたらすペプチド結合である。ペプチドに基づく切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質をもたらす特別な型のアミド結合である。ペプチドに基づく切断基は、一般に、アミノ酸間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドに基づく切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣り合うアミノ酸のＲ基である。これらの候補を、上記のものと類似した方法を使用して評価することができる。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物とコンジュゲートしている。本発明の組成物および方法のリンカーを伴うｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、これだけに限定されないが、
（ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である）
が挙げられる。
本発明の組成物および方法のある特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のいずれかの構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーとコンジュゲートしている：
（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、独立に、出現毎に、０～２０を表し、反復単位は同じであっても異なってもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ独立に、出現毎に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立に、出現毎に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結されていてよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ独立に、出現毎に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表す；すなわち、それぞれ独立に、出現毎に、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸の側鎖である。標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ作用剤との使用には、式（ＸＬＩＸ）：
（式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）
のものなどの三価のコンジュゲート性ＧａｌＮＡｃ誘導体が特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、これだけに限定されないが、上で式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして記載されている構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示している代表的な米国特許としては、これだけに限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号；同第６，２９４，６６４号；同第６，３２０，０１７号；同第６，５７６，７５２号；同第６，７８３，９３１号；同第６，９００，２９７号；同第７，０３７，６４６号；同第８，１０６，０２２号が挙げられ、そのそれぞれの内容全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物の全ての位置が一様に修飾されている必要はなく、実際は、上述の修飾の１つよりも多くがｉＲＮＡの単一の化合物、またはさらには単一のヌクレオシドに組み入れられていてよい。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、本発明に関しては、それぞれが少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合ではヌクレオチドで構成される２つまたはそれよりも多くの化学的に別個の領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、一般には、少なくとも１つの領域を含有し、ｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大が付与されるようにＲＮＡが修飾されている。ｉＲＮＡの追加的な領域がＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての機能を果し得る。例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化の結果、ＲＮＡ標的の切断がもたらされ、それにより、遺伝子発現のｉＲＮＡによる阻害の効率が著しく増強される。したがって、キメラｄｓＲＮＡを使用した場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡを用いて同等の結果を得ることができることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、関連する当技術分野で公知の核酸ハイブリダイゼーション技法によって常套的に検出することができる。
ある特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾されていてよい。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを増強するためにいくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための手順は科学文献において入手可能である。そのような非リガンド部分には、脂質部分、例えば、コレステロール（Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365 (1): 54-61；Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10: 111；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923）などが含まれている。そのようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示している代表的な米国特許は上に列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基を、コンジュゲートしようとする分子と、妥当なカップリングまたは活性化試薬を使用して反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体になお結合しているＲＮＡを用いてか、またはＲＮＡの切断後に液相において実施することができる。一般にはＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により純粋なコンジュゲートがもたらされる。
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの、細胞、例えば、ヒト対象（例えば、脂質代謝の障害を有する対象などの、それを必要とする対象）などの対象内の細胞への送達は、いくつかの異なるやり方で実現することができる。例えば、送達は、細胞を本発明のｉＲＮＡとｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで接触させることによって実施することができる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達はまた、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接実施することもできる。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達は、ｉＲＮＡをコードし、その発現を方向付ける１つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施することができる。これらの代替を以下でさらに考察する。
一般に、核酸分子を送達する（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）任意の方法を本発明のｉＲＮＡとの使用に適合させることができる（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるAkhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2 (5): 139-144およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達に関しては、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮すべき因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的な影響の防止、および標的組織における送達された分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的な影響は、局所投与によって、例えば、組織に直接注射するもしくは埋め込むこと、または調製物を局部的に投与することによって最小化することができる。処置部位への局所投与により、作用剤の局所的濃度が最大になり、そうでなければ作用剤によって害される可能性があるまたは作用剤を分解する可能性がある作用剤の全身組織への曝露が限定され、また、投与されるｉＲＮＡ分子の総用量をより少なくすることが可能になる。いくつかの研究により、ｉＲＮＡを局所的に投与した場合に遺伝子産物が上首尾にノックダウンされることが示されている。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24: 132-138）およびマウスにおける網膜下注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9: 210-216）のどちらによっても、加齢黄斑変性症の実験モデルにおける血管新生が防止されることが示されている。さらに、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射により、腫瘍体積が低下し（Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11: 267-274）、腫瘍を有するマウスの生存を延長することができる（Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14: 343-350；Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15: 515-523）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの局所送達を用いた成功（Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32: e49；Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12: 59-66；Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3: 18；Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129: 521-528；Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 17270-17275；Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93: 594-602）および鼻腔内投与による肺への局所送達を用いた成功（Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14: 476-484；Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279: 10677-10684；Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11: 50-55）も示されている。疾患を処置するためにｉＲＮＡを全身投与することに関しては、ＲＮＡを修飾すること、あるいは、薬物送達システムを使用して送達することができる；どちらの方法も、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解が防止されるように作用する。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾により、ｉＲＮＡ組成物を標的組織にターゲティングすることを可能にし、望ましくないオフターゲットの効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子をコレステロールなどの親油基との化学的コンジュゲーションによって修飾して、細胞内取り込みを増強し、分解を防止することができる。例えば、親油性コレステロール部分とコンジュゲートした、ＡｐｏＢを対象とするｉＲＮＡをマウスに全身注射し、その結果、肝臓および空腸の両方におけるａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンがもたらされた（Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432: 173-178）。ｉＲＮＡとアプタマーのコンジュゲーションにより、前立腺がんのマウスモデルにおける腫瘍成長が阻害され、腫瘍退縮が媒介されることが示されている（McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015）。代替の実施形態では、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用してｉＲＮＡを送達することができる。正に荷電したカチオン性送達系により、ｉＲＮＡ分子（負に荷電した）の結合が容易になり、また、負に荷電した細胞膜における相互作用が増強されて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みが可能になる。カチオン性脂質、デンドリマー、もしくはポリマーをｉＲＮＡに結合させること、またはｉＲＮＡを包む小胞もしくはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129 (2): 107-116を参照されたい）。小胞またはミセルの形成により、全身投与した場合のｉＲＮＡの分解がさらに防止される。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与する方法は当業者の能力の範囲内に十分に入る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるSorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327: 761-766；Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1291-1300；Arnold, AS et al., (2007) J. Hypertens. 25: 197-205を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Sorensen, DR., et al (2003), supra；Verma, UN. et al., (2003), supra）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」（Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441: 111-114）、カルジオリピン（Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321-328；Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26: 1087-1091）、ポリエチレンイミン（Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print；Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472-487）、およびポリアミドアミン（Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61-67；Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16: 1799-1804）が挙げられる。一部の実施形態では、全身投与のためにｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号に見いだすことができる。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12: 5-10；Skillern, A., et al., 国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１３号、Conrad、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２２１１４号、およびConrad、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて一過性（およそ数時間～数週間）または持続的（数週間～数カ月またはそれよりも長い）であり得る。これらの導入遺伝子は、直鎖状構築物、環状プラスミド、または組込み型ベクターもしくは非組込み型ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子は、遺伝性になるように染色体外プラスミドとして構築することもできる（Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1292）。
ｉＲＮＡの個々の鎖を発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。例えばｄｓＲＮＡを生成するために２つの別々の鎖を発現させる場合、２つの別々の発現ベクターを標的細胞に同時導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡの個々の鎖それぞれを、両方が同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写することができる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡをリンカーポリヌクレオチド配列によって接合した逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現させ、したがって、ｄｓＲＮＡはステム・ループ構造を有する。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載のｉＲＮＡを発現させるための組換え構築物を作出することができる。真核細胞発現ベクターが当技術分野で周知であり、いくつかの商業的な供給源から入手可能である。一般には、所望の核酸セグメントを挿入するための都合のよい制限部位を含有するそのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現性ベクターの送達は、全身性、例えば、静脈内または筋肉内投与によるものなど、患者から外植された標的細胞への投与、その後の患者への再導入によるもの、または、所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段であってよい。
本明細書に記載の方法および組成物と共に利用することができるウイルスベクター系としては、これだけに限定されないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれだけに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、またはアビポックス、例えば、カナリアポックスもしくは鶏痘などのポックスウイルスベクター；ならびに（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが細胞のゲノムに組み入れられるようになるまたはならない。構築物は、所望であれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含んでよい。あるいは、構築物を、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み入れることができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物には、一般に、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが必要である。ベクターおよび構築物を考察するための他の態様が当技術分野で公知である。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。したがって、一実施形態では、肝細胞などの細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列からの１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号７のヌクレオチド配列からの１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ作用剤；および、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書に提示される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７のヌクレオチド配列からの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、肝細胞などの細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するｄｓＲＮＡ作用剤であって、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと１、２、または３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ作用剤；および、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書に提示される。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ作用剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は、表２、３、７、８、１０、１１、または１３のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つからの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
本発明のｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、慢性線維炎症性疾患を処置するために有用である。
そのような医薬組成物は、送達方式に基づいて製剤化される。１つの例は、非経口送達による、例えば静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）による全身投与用に、または皮下送達用に製剤化されている組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ注入などによる肝臓への注入による肝臓への直接送達用に製剤化されている組成物である。本発明の医薬組成物は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与することができる。一般に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲内、一般に、１日当たり体重１キログラム当たり約１～５０ｍｇの範囲内に入る。一般には、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。
反復投薬レジメンは、治療量のｉＲＮＡを定期的に、例えば、２日に１回～１年に１回などで投与することを含み得る。ある特定の実施形態では、ｉＲＮＡを、およそ１週間に１回、７～１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回（四半期に１回）、４カ月に１回、５カ月に１回、または６カ月に１回投与する。
最初の処置レジメンの後、処置をより低頻度で施行することができる。
疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれだけに限定されない、ある特定の因子が、対象を有効に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが当業者には理解されよう。さらに、対象を治療有効量の組成物を用いて処置することは、単回処置または一連の処置を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡについての有効な投与量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の推定を、本明細書の他の箇所に記載の通り、従来の方法体系を使用して、または妥当な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏにおける試験に基づいて行うことができる。
マウス遺伝学の進歩により、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の低減が有益であると予想されるＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態などの種々のヒト疾患を研究するためのいくつかのマウスモデルが生成されてきた。そのようなモデルを、ｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏにおける試験のため、ならびに治療有効用量を決定するために使用することができる。そのようなモデルを、ｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏにおける試験のため、ならびに治療有効用量を決定するために使用することができる。適切なマウスモデルは当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、高脂肪食（ＨＦＤ；西洋食とも称される）、メチオニン－コリン欠乏（ＭＣＤ）食、または高脂肪（１５％）、高コレステロール（１％）食（ＨＦＨＣ）を摂食させたマウスおよびラット、肥満（ｏｂ）遺伝子に突然変異を含有する肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Wiegman et al., (2003) Diabetes, 52: 1081-1089）；ＬＤＬ受容体のホモ接合性ノックアウトを含有するマウス（ＬＤＬＲ－／－マウス；Ishibashi et al., (1993) J Clin Invest 92 (2): 883-893）；食餌誘導性アテローム性動脈硬化症マウスモデル（Ishida et al., (1991) J. Lipid. Res., 32: 559-568）；ヘテロ接合性リポタンパク質リパーゼノックアウトマウスモデル（Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest. 96 (6): 2555-2568）；コリン欠乏、Ｌ－アミノ酸限定、高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を摂食させたマウスおよびラット（Matsumoto et al. (2013) Int. J. Exp. Path. 94: 93-103）；高トランス脂肪、コレステロール食（ＨＴＦ－Ｃ）を摂食させたマウスおよびラット（Clapper et al. (2013) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 305: G483-G495）；高脂肪、高コレステロール、胆汁酸塩食（ＨＦ／ＨＣ／ＢＳ）を摂食させたマウスおよびラット（Matsuzawa et al. (2007) Hepatology 46: 1392-1403）；ならびに高脂肪食＋フルクトース（３０％）水を摂食させたマウスおよびラット（Softic et al. (2018) J. Clin. Invest. 128 (1)-85-96）が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、局所的処置が望ましいのか全身処置が望ましいのかに基づいて、および処置される領域に基づいて、いくつかのやり方で投与することができる。投与は、局部的（例えば、経皮吸収パッチによるもの）、肺へのもの、例えば、ネブライザーによるものを含めた、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送によるもの；気管内、鼻腔内、表皮および経皮的、経口的または非経口的であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入；皮下、例えば、埋め込まれたデバイスを介したもの；または頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内もしくは脳室内投与を含む。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の細胞または組織が標的とされる様式で送達することができる。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象への筋肉内投与に適する。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象への静脈内投与に適する。本発明の一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、例えば、２９ｇまたは３０ｇの針を使用した対象への皮下投与に適する。
本発明の医薬組成物は、生理食塩水または水などの緩衝化されていない溶液中、あるいはアセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、もしくはホスフェートまたはこれらの任意の組合せを含む緩衝溶液などの緩衝溶液中の本発明のＲＮＡｉ作用剤を含み得る。
一実施形態では、例えば皮下投与に適した組成物などの本発明の医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の本発明のＲＮＡｉ作用剤を含む。ＰＢＳの適切な濃度としては、例えば、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５ｍＭ、９ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭ、または約１０ｍＭのＰＢＳが挙げられる。本発明の一実施形態では、本発明の医薬組成物は、約５ｍＭのＰＢＳ（例えば、０．６４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、４．３６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、８５ｍＭのＮａＣｌ）の溶液中に溶解させた本発明のＲＮＡｉ作用剤を含む。上記の範囲および値の中間の値も本発明の一部であることが意図されている。さらに、上記の値のいずれかの組合せを上限および／または下限として使用した値の範囲が含まれることが意図されている。
本発明の医薬組成物のｐＨは、約５．０～約８．０、約５．５～約８．０、約６．０～約８．０、約６．５～約８．０、約７．０～約８．０、約５．０～約７．５、約５．５～約７．５、約６．０～約７．５、約６．５～約７．５、約５．０～約７．２、約５．２５～約７．２、約５．５～約７．２、約５．７５～約７．２、約６．０～約７．２、約６．５～約７．２、または約６．８～約７．２であり得る。上記の範囲および値の中間の範囲および値も本発明の一部であることが意図されている。
本発明の医薬組成物の重量オスモル濃度は、例えば、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば、５０から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２５０から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、３００から４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、５０から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２５０から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、３００から３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、５０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２５０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、５０から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２５０から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、３００から３２５ｍＯｓｍ／ｋｇの間、３００から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、５０から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２５０から３００の間、５０から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、７５から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１００から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１２５から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１５０から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、１７５から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２００から２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９５、３００、３０５、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、または約４００ｍＯｓｍ／ｋｇなど、皮下投与に適し得る。上記の範囲および値の中間の範囲および値も本発明の一部であることが意図されている。
本発明のＲＮＡｉ作用剤を含む本発明の医薬組成物は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０ｍＬの医薬組成物を含有するバイアル中に存在し得る。本発明の医薬組成物中のＲＮＡｉ作用剤の濃度は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１３０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２３０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３３０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４３０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または約５００ｍｇ／ｍＬであり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物中のＲＮＡｉ作用剤の濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬである。上記の範囲および値の中間の値も本発明の一部であることが意図されている。
本発明の医薬組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤を遊離酸の形態で含み得る。本発明の他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤をナトリウム塩の形態などの塩の形態で含み得る。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤がナトリウム塩の形態である場合、作用剤中に存在するリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てに対して対イオンとしてナトリウムイオンが作用剤中に存在する。リン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結の実質的に全てがナトリウム対イオンを有する作用剤は、ナトリウム対イオンを伴わないリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結を５個、４個、３個、２個、または１個以下含む。一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ作用剤がナトリウム塩の形態である場合、作用剤中に存在するリン酸ジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の全てに対して対イオンとしてナトリウムイオンが作用剤中に存在する。
局部的投与用の医薬組成物および製剤としては、経皮吸収パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋なども有用であり得る。適切な局部用製剤としては、本発明において特徴付けられるｉＲＮＡを脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性物質などの局部的送達剤と混和させた製剤が挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジル（distearolyphosphatidyl）コリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明において特徴付けられるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入することができる、または、リポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成させることができる。あるいは、ｉＲＮＡを、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成させることができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、これだけに限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプリン酸、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩が挙げられる。局部用製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号に詳しく記載されている。
Ａ．膜様分子アセンブリを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法において使用するためのｉＲＮＡは、膜様分子アセンブリ、例えば、リポソームまたはミセルとして送達するために製剤化することができる。マイクロエマルションに加えて、薬物の製剤化のために研究され、使用されている多くの組織化された界面活性物質構造がある。これらとしては、単層、ミセル、二重層および小胞が挙げられる。リポソームなどの小胞には、薬物送達の観点からそれらによってもたらされる特異性および作用の持続時間が理由で大きな関心が寄せられている。本発明において使用される場合、「リポソーム」という用語は、球状二重層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性物質で形成された膜および水性の内部を有する単層または多層小胞を含む。水性部分は、送達しようとする組成物（例えば、ｉＲＮＡ）を含有する。親油性物質は水性の内部を水性の外部から隔離し、一般にはｉＲＮＡ組成物を含まないが、一部の例では、ｉＲＮＡ組成物を含む場合がある。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、同じくらい効率的には細胞壁と融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてマクロファージによって取り込まれる。
インタクトな哺乳動物の皮膚を横断するためには、脂質小胞が、それぞれ直径５０ｎｍ未満の一連の細孔を、適切な経皮勾配の影響の下で通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、そのような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームは、活性成分の作用部位への輸送および送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームは細胞膜と同化し始め、リポソームと細胞の同化が進行するにつれ、リポソームの内容物が細胞に流入し、そこで活性薬剤が作用し得る。
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達方式として広範囲にわたる調査の焦点になってきた。局部的投与に関して、リポソームにより他の製剤に対していくつかの利点が示されるというエビデンスが増えている。そのような利点としては、投与された薬物の全身吸収が高いことに関連する副作用の低減、投与された薬物の所望の標的への蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多種多様な薬物を皮膚に投与できることが挙げられる。
いくつかの報告により、高分子量ＤＮＡを含めた作用剤を皮膚に送達するリポソームの能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含めた化合物が皮膚に投与されている。大多数の適用の結果、表皮上層の標的化がもたらされた。
ｉＲＮＡ作用剤を含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分を界面活性剤に溶解させ、その結果、脂質成分とのミセルを形成させる。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであってよい。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有してよく、非イオン性であってよい。例示的な界面活性剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ｉＲＮＡ作用剤調製物を、脂質成分を含むミセルに添加する。脂質上のカチオン性基がｉＲＮＡ作用剤と相互作用し、ｉＲＮＡ作用剤の周囲に凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤を、例えば透析によって除去して、ｉＲＮＡ作用剤のリポソーム調製物を得る。
必要であれば、凝縮を補助する担体化合物を凝縮反応の間に、例えば、制御添加によって添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であってよい。凝縮に有利になるようにｐＨも調整することができる。
ポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を送達ビヒクルの構造的な構成要素として組み入れる、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを作出するための方法は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／３７１９４にさらに記載されている。リポソーム形成は、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8: 7413-7417, 1987；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号；Bangham, et al. M. Mol. Biol.23: 238, 1965；Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557: 9, 1979；Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978；Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775: 169, 1984；Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728: 339, 1983；およびFukunaga, et al. Endocrinol. 115: 757, 1984に記載されている例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するための妥当なサイズの脂質凝集体を調製するための一般に使用される技法としては、超音波処理、および凍結融解とそれに加えて押出しが挙げられる（例えば、Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858: 161, 1986を参照されたい）。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的一様な凝集体が望ましい場合には、微少溶液操作を使用することができる（Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775: 169, 1984）。これらの方法を、ｉＲＮＡ作用剤調製物をリポソーム中にパッケージングするために容易に適合させることができる。
リポソームは、２つの広範なクラスに入る。カチオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームに内部移行する。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームが破裂し、それらの内容物が細胞質内に放出される（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985）。
ｐＨ感受性であるまたは負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなく、ＤＮＡを閉じ込める。ＤＮＡと脂質はどちらも同様に荷電しているので、複合体の形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、あるＤＮＡがこれらのリポソームの水性の内部に閉じ込められる。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層に送達するためにｐＨ感受性リポソームが使用されている。標的細胞において外因性遺伝子の発現が検出された（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
リポソーム組成物の１つの主要な型は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の型のリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてリポソームを細胞に導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号および同第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Felgner, J. Biol. Chem.269: 2550, 1994；Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90: 11307, 1993；Nabel, Human Gene Ther. 3: 649, 1992；Gershon, Biochem.32: 7143, 1993；およびStrauss EMBO J.11: 417, 1992が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン界面活性物質およびコレステロールを含む系も、薬物の皮膚への送達におけるそれらの有用性を決定するために調査されている。シクロスポリン－Ａをマウス皮膚の真皮に送達するためにＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。結果から、そのような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリン－Ａの皮膚の異なる層への沈着を容易にすることに有効であることが示される（Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466）。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、この用語は、本明細書で使用される場合、リポソームに組み入れられると、そのような特殊化された脂質を欠くリポソームと比べて循環寿命の増強をもたらす１つまたは複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含む、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているリポソームである。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、当技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増強は、網内系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると考えられている（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42；Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765）。
１つまたは複数の糖脂質を含む種々のリポソームが当技術分野で公知である。Papahadjopoulos et al.（Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）により、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールのリポソームの血中半減期を改善する能力が報告された。これらの所見は、Gabizon et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949）によって詳しく説明された。どちらもAllen et al.による米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４には、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al.）には、スフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームがＷＯ９７／１３４９９（Lim et al）に開示されている。
一部の実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜と融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と同じくらい効率的には融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてマクロファージによって取り込まれ、ｉＲＮＡ作用剤をマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームの別の利点としては、天然のリン脂質から得られたリポソームは生体適合性かつ生分解性であること；リポソームには広範囲の水および脂質可溶性薬物を組み入れることができること；リポソームによりそれらの内部区画に封入されたｉＲＮＡを代謝および分解から保護することができることが挙げられる（Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p.245）。リポソーム製剤の調製に関する重要な考察は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水性体積である。
核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に荷電した脂質と融合することができ、その結果、ｉＲＮＡ作用剤の送達をもたらす脂質－核酸複合体を形成する小さなリポソームを形成するために、正に荷電した合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルロキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用することができる（例えば、ＤＯＴＭＡの説明およびそのＤＮＡとの使用に関してはFelgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8: 7413-7417, 1987および米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を、負に荷電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する正に荷電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生組織培養細胞に送達するための有効な作用剤である。十分に正に荷電したリポソームを使用すると、得られる複合体の正味の電荷も正になる。このように自然発生的に調製される正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に付着し、原形質膜と融合し、機能的な核酸を、例えば組織培養細胞に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）は、ＤＯＴＭＡとは、オレオイル部分がエーテル連結ではなくエステルによって連結しているという点で異なる。
他の報告されたカチオン性脂質化合物は、例えば、２つの型の脂質のうちの１つとコンジュゲートしたカルボキシスペルミンを含めた、種々の部分とコンジュゲートしたものを含み、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照されたい）などの化合物を含む。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム中に製剤化されているコレステロールを用いた脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）を含む（Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun.179: 280, 1991を参照されたい）。ポリリシンとＤＯＰＥをコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリシンは血清の存在下でのトランスフェクションにおいて有効であることが報告されている（Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065: 8, 1991）。ある特定の細胞株に関しては、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡを含有する組成物よりも低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションをもたらすといえる。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ならびにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載されている。
リポソーム製剤は、局部的投与に特に相応しく、リポソームは、他の製剤に対していくつかの利点を示す。そのような利点としては、投与された薬物の全身吸収が高いことに関連する副作用の低減、投与された薬物の所望の標的への蓄積の増加、およびｉＲＮＡ作用剤を皮膚に投与できることが挙げられる。一部の実行では、リポソームは、ｉＲＮＡ作用剤を表皮細胞に送達するために使用され、ｉＲＮＡ作用剤の皮膚組織、例えば、皮膚への透過を増強するためにも使用される。例えば、リポソームを局部的に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局部的送達は文書で証明されている（例えば、Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol.2, 405-410およびdu Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265；Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6: 682-690, 1988；Itani, T. et al. Gene 56: 267-276． 1987；Nicolau, C. et al. Meth. Enz.149: 157-176, 1987；Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.101: 512-527, 1983；Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851-7855, 1987を参照されたい）。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン界面活性物質およびコレステロールを含む系も、薬物の皮膚への送達におけるそれらの有用性を決定するために調査されている。薬物をマウス皮膚の真皮に送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。ｉＲＮＡ作用剤を用いたそのような製剤は、皮膚科学的障害を処置するために有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製することができる。そのような変形可能性により、リポソームが、リポソームの平均半径よりも小さなポアを通って透過することが可能になり得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性物質を標準のリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｉＲＮＡを皮膚内のケラチノサイトに送達するために、ｉＲＮＡを含むトランスファーソームを、例えば皮下に、感染によって送達することができる。インタクトな哺乳動物の皮膚を渡るために、脂質小胞は、それぞれが直径５０ｎｍ未満の一連の細孔を適切な経皮勾配の影響の下で通過しなければならない。さらに、脂質の性質に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適化性であり得（例えば、皮膚における孔の形状に適応する）、自己修復性であり得、断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達し得、また、多くの場合、自己負荷性である。
本発明に適用できる他の製剤は、ＷＯ２００８／０４２９７３に記載されている。
トランスファーソームは、リポソームのさらに別の型であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるため、脂肪滴よりも小さな孔を通って容易に透過することができる脂肪滴と記載することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応できる、例えば、自己最適化性であり（皮膚における孔の形状に適応する）、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達し、また、多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するために、表面縁活性化因子、通常は界面活性物質を標準のリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同じくらい有効であることが示されている。
界面活性物質は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームなどの製剤に広く適用される。天然および合成の両方の多くの異なる型の界面活性物質の性質を分類および順位付ける最も一般的なやり方は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用することによるものである。親水基（「頭部」としても公知）の性質により、製剤に使用される異なる界面活性物質をカテゴリー化するための最も有用な手段がもたらされる（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
界面活性物質分子がイオン化されない場合、非イオン界面活性物質に分類される。非イオン界面活性物質は、医薬および化粧製品に広く適用され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８までにわたる。非イオン界面活性物質としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化されたエステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシ化された／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性物質は非イオン界面活性物質クラスの最も一般的なメンバーである。
界面活性物質分子が、水中に溶解または分散した際に負電荷を有する場合、当該界面活性物質はアニオン性に分類される。アニオン界面活性物質としては、セッケンなどのカルボン酸塩、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸およびエトキシ化アルキル硫酸などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸塩などのスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウリン酸塩およびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン界面活性物質クラスの最も重要なメンバーは、アルキル硫酸およびセッケンである。
界面活性物質分子が、水中に溶解または分散した際に正電荷を有する場合、当該界面活性物質はカチオン性に分類される。カチオン界面活性物質としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩がこのクラスで最も使用されているメンバーである。
界面活性物質分子が正電荷または負電荷のいずれも有する能力を有する場合、当該界面活性物質は、両性に分類される。両性界面活性物質としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤およびエマルションにおける界面活性物質の使用は総説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
本発明の方法において使用するためのｉＲＮＡは、ミセル製剤として提供することもできる。「ミセル」は、本明細書では、両親媒性分子が球状構造に配置され、したがって、分子の疎水性部分が全て内向きに方向付けられ、親水性部分が周囲水相と接触したままになる、特定の型の分子アセンブリと定義される。環境が疎水性である場合には逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡ、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合することによって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレイン酸、モノラウリン酸塩、ボリジ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよび薬学的に許容されるその塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリシン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時にまたはその後に添加することができる。混合ミセルは、成分の実質的にあらゆる種類の混合で形成されるが、より小さなサイズのミセルをもたらすためには勢いのある混合で形成される。
１つの方法では、ＲＮＡｉおよび少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物を調製する。次いで、第１のミセル組成物を少なくとも３つのミセル形成化合物と混合して、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ＲＮＡｉ、アルカリ金属アルキル硫酸塩およびミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、その後、残りのミセル形成化合物を、勢いよく混合しながら添加することによってミセル組成物を調製する。
フェノールまたはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定化し、細菌の成長から保護することができる。あるいは、フェノールまたはｍ－クレゾールをミセル形成成分とともに添加することができる。混合ミセル組成物の形成後にグリセリンなどの等張化剤を添加することもできる。
ミセル製剤を噴霧剤として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れ、ディスペンサーに噴射剤を装填することができる。噴射剤は、ディスペンサー中では圧力の下で液体の形態である。水性相と噴射剤相が１つになる、すなわち、１つの相が存在するように成分の比を調整する。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば定量式弁を通じて分配する前にディスペンサーを振ることが必要である。分配用量の医薬作用剤が定量式弁から細かい噴霧として噴射される。
噴射剤は、水素を含有するクロロフルオロカーボン、水素を含有するフルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルを含み得る。ある特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用することができる。
必須成分の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔を通じた吸収に関しては、多くの場合、投与量を、例えば、注射によるまたは胃腸管を通じた投与の少なくとも２倍または３倍に増加させることが望ましい。
Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡ作用剤を脂質製剤、例えばＬＮＰ、または他の核酸－脂質粒子中に完全に封入することができる。
本明細書で使用される場合、「ＬＮＰ」という用語は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、一般には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）の凝集を防止する脂質を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の循環寿命の延長を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身適用に非常に有用である。本明細書で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、プラスミドＤＮＡが脂質小胞内に封入された核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、これは、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載の封入された凝縮剤－核酸複合体を含む。本発明の粒子は、一般には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より一般には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より一般には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も一般的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子として存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
ある特定の実施形態では、脂質と薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質とｄｓＲＮＡの比）は、約１：１から約５０：１まで、約１：１から約２５：１まで、約３：１から約１５：１まで、約４：１から約１０：１まで、約５：１から約９：１まで、または約６：１から約９：１までの範囲内に入る。上記の範囲の間の範囲も本発明の一部であることが意図されている。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－塩化ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－臭化ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザネジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはこれらの混合物であってよい。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％または約４０ｍｏｌ％までを構成し得る。
ある特定の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み込まれる２００８年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載されている。
ある特定の実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、粒径は６３．０±２０ｎｍであり、ｓｉＲＮＡ／脂質比は０．０２７である。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはこれらの混合物を含むがこれだけに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であってよい。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％から約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％までであってよい。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートした脂質は、例えば、限定することなく、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）を含めたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはこれらの混合物であってよい。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃｉ８）であってよい。粒子の凝集を防止するコンジュゲートした脂質は、粒子中に存在する総脂質の０ｍｏｌ％から約２０ｍｏｌ％または約２ｍｏｌ％までであってよい。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、コレステロールを、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌ％でさらに含む。
ＬＮＰ０１
ある特定の実施形態では、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（参照により本明細書に組み込まれる２００８年３月２６日出願の米国特許出願第１２／０５６，２３０号を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（例えば、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれのエタノール中ストック溶液を以下の通り調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６のストック溶液を、例えば、４２：４８：１０モル比で合わせることができる。合わせた脂質溶液を水性ｄｓＲＮＡ（例えば、酢酸ナトリウム、ｐＨ５中）と、最終的なエタノール濃度が約３５～４５％になり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように混合することができる。一般には、混合すると脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子が自然発生的に形成される。所望の粒径分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用し、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押出し成形することができる。一部の場合では、押出しステップを省略することができる。エタノール除去および同時の緩衝剤交換を、例えば透析または接線流濾過によって実現することができる。緩衝剤は、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４に交換することができる。
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
追加的な例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を以下の表に提示する。

ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、２００９年４月１５日出願の国際公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号に記載されている。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号；２００９年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号；２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第６１／１８５，７１２号；２００９年７月２４日出願の米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号；２００９年９月３日出願の米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号、および２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号に記載されている。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日出願の米国特許仮出願第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第６１／１８５，８００号、および２０１０年６月１０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号に記載されている。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に記載されている。
Ｃ１２－２００を含む製剤は、これにより参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号および２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号に記載されている。
経口投与用の組成物および製剤は、散剤もしくは顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニタブレットを含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。一部の実施形態では、経口製剤は、本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡが１つまたは複数の透過増強界面活性物質およびキレート剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性物質としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカノイック酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプリン酸、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、透過増強剤の組合せ、例えば、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩の組合せを使用する。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。別の透過増強剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡは、経口的に、噴霧される乾燥粒子を含めた顆粒形態で、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子が形成されるように錯化させて送達することができる。ｄｓＲＮＡ錯化剤としては、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（pollulan）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な錯化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリル酸、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡおよびそれらの調製物の経口製剤は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号、米国公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳しく記載されている。
非経口、実質内（脳内）、髄腔内、脳室内または肝内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、ならびに、これだけに限定されないが、透過増強剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などの他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
本発明の医薬組成物としては、これだけに限定されないが、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤が挙げられる。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および自己乳化型半固体を含むがこれだけに限定されない種々の構成成分から生成することができる。肝癌などの肝障害を処置する場合には、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
単位剤形で都合よく提供することができる本発明の医薬製剤は、医薬品産業において周知の従来の技法に従って調製することができる。そのような技法は、活性成分を医薬担体または賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細に分割された固体担体またはその両方と一様にかつ密接に関連させ、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、これだけに限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐剤、および浣腸などの多くの可能性のある剤形のいずれかに製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁剤は、安定剤も含有し得る。
１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は当技術分野で公知である。Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン界面活性剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79)は、ポリマーグリコールを用いたポリスチレン粒子の親水性コーティングにより、血中半減期が有意に増強されることに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の付着によって修飾された合成リン脂質がSears（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235)は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が有意に増大することを実証する実験を記載している。Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、そのような知見を、他のＰＥＧ－誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ－ＰＥＧに拡張させた。外面にＰＥＧ部分が共有結合したリポソームがFisherに対する欧州特許第ＥＰ ０ ４４５ １３１ Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４に記載されている。１～２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法がWoodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）ならびにMartin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）により記載されている。いくつかの他の脂質－ポリマーコンジュゲートを含むリポソームがＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（どちらもMartin et al.に対するもの）ならびにＷＯ９４／２００７３（Zalipsky et al.）に開示されている。ＰＥＧで修飾されたセラミド脂質を含むリポソームがＷＯ９６／１０３９１（Choi et al）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al.）および米国特許第５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）には、表面において機能的部分でさらに誘導体化することができるＰＥＧを含有するリポソームが記載されている。
核酸を含むいくつかのリポソームは、当技術分野で公知である。Thierry et al.に対するＷＯ９６／４００６２には、高分子量の核酸をリポソームに封入するための方法が開示されている。Tagawa et al.に対する米国特許第５，２６４，２２１号には、タンパク質が結合したリポソームが開示されており、そのようなリポソームの内容物にｄｓＲＮＡを含めることができることが主張されている。Rahman et al.に対する米国特許第５，６６５，７１０号には、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに封入するある特定の方法が記載されている。Love et al.に対するＷＯ９７／０４７８７には、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームが開示されている。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し製剤化することができる。エマルションは、一般には、１つの液体が別の液体中に通常は直径が０．１μｍを超える液滴の形態で分散した不均一な系である（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.) ,New York, NY； Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. , New York, N.Y. , volume 1, p. 199；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335；Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい）。エマルションは、多くの場合、互いに密接に混合し分散した２つの不混和性液相で構成される二相系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかであり得る。大量の油相中に水相が微細に分割され、微小な液滴として分散している場合、得られる組成物は油中水（ｗ／ｏ）エマルションと称される。あるいは、大量の水相中に油相が微細に分割され、微小な液滴として分散している場合、得られる組成物は水中油（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相に加えて、追加的な構成成分、および、水相、油相中に溶液として、またはそれ自体が別の相として存在し得る活性な薬物を含有し得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤も必要に応じてエマルション中に存在してよい。医薬エマルションはまた、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合などの、２つよりも多くの相で構成される多層エマルションであってもよい。そのような複合製剤では、多くの場合、単純な二成分エマルションではもたらされないある特定の利点がもたらされる。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴に小さな水滴が封入されている多層エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油性連続相中の安定化された水の小球中に封入された油滴の系により、ｏ／ｗ／ｏエマルションがもたらされる。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことを特徴とする。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散され、乳化剤という手段または製剤の粘度によってこの形態で維持される。エマルションの相はいずれも、エマルション様式の軟膏基剤およびクリーム剤のように、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する他の手段では、エマルションのいずれの相にも組み入れることができる乳化剤の使用が必要である。乳化剤は、４つのカテゴリーに広範に分類することができる：合成界面活性物質、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散した固体（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい）。
表面活性剤としても公知である合成界面活性物質は、エマルションの製剤への広い適応性が見いだされており、文献において概説されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照されたい）。界面活性物質は、一般には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分とを含む。界面活性物質の親水性と疎水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製において界面活性物質をカテゴリー化し、選択することにおける有益なツールである。界面活性物質は、親水基の性質：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性に基づいて異なるクラスに分類することができる（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照されたい）。
エマルション製剤に使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが挙げられる。吸収基剤は、例えば、無水ラノリンおよび親水性ワセリンなど、親水性を有し、したがって、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成することができるが、依然としてそれらの半固体コンシステンシーを保持する。微細に分割された固体も、特に界面活性物質と組み合わせて、粘性調製物において良好な乳化剤として使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウムおよびコロイドケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性粘土、色素および炭素またはグリセリルトリステアレートなどの非極性固体が挙げられる。
多種多様な非乳化材料もエマルション製剤に含まれ、エマルションの性質に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪性エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が挙げられる（Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然に存在するゴムおよび合成ポリマー、例えば、多糖（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーガム、カラヤゴム、およびトラガント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）など、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中で分散または膨潤して、分散相液滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することによっておよび外相の粘度を増大させることによってエマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、多くの場合、微生物の成長を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどのいくつかの成分を含有するので、これらの製剤には、多くの場合、保存剤が組み入れられる。エマルション製剤に含められる、一般に使用される保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸のエステルが挙げられる。製剤の劣化を防止するために抗酸化剤も一般にエマルション製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤の相乗剤であり得る。
皮膚科学的、経口および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法が文献において概説されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC.. 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化しやすさ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点での有効性が理由で非常に広く使用されている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい）。鉱油に基づく緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養素調製物が一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料に含まれる。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物をマイクロエマルションとして製剤化する。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液剤である、水、油および両親媒性物質の系と定義することができる（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい）。一般には、マイクロエマルションは、まず油を水性界面活性物質溶液中に分散させ、次いで、十分な量の第４の構成成分、一般に、中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成させることによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される２つの不混和性液体の熱力学的に安定な、等方性に清澄な分散とも記載されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルションは、一般に、油、水、界面活性物質、補助界面活性物質および電解質を含む３～５種の構成成分の組合せによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型であるか水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性物質の性質ならびに界面活性物質分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
状態図を利用する現象学的手法が広範囲にわたって研究されており、マイクロエマルションをどのように製剤化するかに関する包括的な知見が当業者にもたらされている（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245；Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションにより、水不溶性薬物が自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に可溶化するという利点がもたらされる。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性物質としては、これだけに限定されないが、単独でまたは補助界面活性物質と組み合わせた、イオン界面活性物質、非イオン界面活性物質、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。補助界面活性物質は、通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールであり、界面活性物質フィルムを透過し、したがって、界面活性物質分子の間で生成される空隙に起因した不規則なフィルムを創出することによって界面流動性を増大させる働きをする。しかし、マイクロエマルションは、補助界面活性物質を使用せずに調製することができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系が当技術分野で公知である。水相は、これだけに限定されないが、一般には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセリン、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であってよい。油相としては、これだけに限定されないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和型ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料を挙げることができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化、および薬物吸収の増強の観点から特に興味深い。脂質に基づくマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）により、ペプチドを含む薬物の経口生物学的利用能が増強されることが提唱されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390；Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照されたい）。マイクロエマルションにより、薬物可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、膜流動性および透過性の界面活性物質に誘導される変更に起因する薬物吸収の増強の可能性、調製のしやすさ、固体剤形と比べた経口投与のしやすさ、臨床的効力の改善、ならびに毒性の低減という利点がもたらされる（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの構成成分が外界温度で一緒になると自然発生的に形成し得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはｉＲＮＡを製剤化する場合に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた、化粧品への適用および医薬適用のどちらにおいても活性構成成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤により、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身吸収の増大が容易になり、ならびに、ｉＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞内取り込みが改善されることが予想される。
本発明のマイクロエマルションは、製剤の性質を改善するため、ならびに本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を増強するために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および透過増強剤などの追加的な構成成分および添加剤も含有し得る。本発明のマイクロエマルションに使用される透過増強剤は、５つの広範なカテゴリー－界面活性物質、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート化非界面活性物質のうちの１つに属するものと分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらのクラスはそれぞれ上記されている。
ｉｉｉ．微小粒子
本発明のＲＮＡｉ作用剤を、粒子、例えば、微小粒子に組み入れることができる。微小粒子は、噴霧乾燥によって作出することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技法の組合せを含めた他の方法によって作出することもできる。
ｉｖ．透過増強剤
一実施形態では、本発明は、核酸、特にｉＲＮＡの動物の皮膚への効率的な送達をもたらすために種々の透過増強剤を使用する。大多数の薬物は溶液中にイオン化された形態とイオン化されていない形態の両方で存在する。しかし、通常、脂質可溶性または親油性薬物のみが容易に細胞膜を渡る。非親油性薬物は、細胞膜を、渡るべき膜を透過増強剤で処理すれば渡ることができることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横切る拡散を補助することに加えて、透過増強剤はまた、親油性薬物の透過性も増強する。
透過増強剤は、５つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性物質、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート化非界面活性物質のうちの１つに属するものと分類することができる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい）。上述の透過増強剤のクラスのそれぞれを以下により詳細に記載する。
界面活性物質（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解すると、溶液の表面張力または水溶液と別の液体の間の界面張力を低下させ、その結果、粘膜を通じたｉＲＮＡの吸収を増強させる化学的実体である。これらの透過増強剤としては、胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい）；ならびにＦＣ－４３などのパーフルオロ化合物エマルション（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）が挙げられる。
透過増強剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプリン酸、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ－ブチル）、ならびに、それらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレイン酸エステル、ラウリン酸エステル、カプリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、リノール酸エステルなど）が挙げられる（例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照されたい）。
胆汁の生理的役割として、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の容易化が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002；Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照されたい）。種々の天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成の誘導体が透過増強剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語は、あらゆる天然に存在する胆汁の構成成分ならびにあらゆるそれらの合成の誘導体を含む。適切な胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92；Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25；Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照されたい）。
キレート剤は、本発明に関連して使用される場合、金属イオンと複合体を形成することによって金属イオンを溶液から取り除き、その結果、粘膜を通じたｉＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる。最も特徴付けられているＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるので、キレート剤は、本発明における透過増強剤としてのそれらの使用に関して、ＤＮａｓｅ阻害剤としての機能も果たすというさらなる利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。適切なキレート剤としては、これだけに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９およびベータ－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006；Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、非キレート化非界面活性物質透過増強化合物は、キレート剤または界面活性物質としての活性をわずかに示すが、それにもかかわらず、消化粘膜を通じたｉＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照されたい）。このクラスの透過増強剤としては、例えば、不飽和型環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）が挙げられる。
ｉＲＮＡの取り込みを細胞レベルで増強する作用剤も本発明の医薬組成物および他の組成物に添加することができる。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Junichi et al、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリシンなどのポリカチオン分子（Lollo et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１）も、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを増強することが公知である。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、とりわけ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２－ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントンなどのテルペンを含めた他の作用剤を、投与された核酸の透過を増強するために利用することができる。
ｖ．担体
本発明のある特定の組成物では、担体化合物も製剤に組み入れられる。本明細書で使用される場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体は生物活性を有さない）が、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を、例えば、生物活性のある核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進することによって低下させるｉｎ ｖｉｖｏプロセスによって核酸として認識される核酸またはその類似体を指し得る。核酸と担体化合物を、一般には後者の物質を過剰に、同時投与することにより、肝臓、腎臓または他の循環外レザバーにおいて回収される核酸の量の実質的な減少がもたらされる可能性があり、これはおそらく、担体化合物と核酸の共通の受容体に対する競合に起因する。例えば、部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡをポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または４－アセトアミド－４’イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与した場合、肝臓組織における部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収が減少し得る（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121；Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体の場合もあり固体の場合もあり、計画された投与の様式を考慮して、核酸および所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わせた場合に所望のかさ、一貫性などがもたらされるように選択される。典型的な医薬担体としては、これだけに限定されないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害には反応しない、非腸管外投与に適した薬学的に許容される有機または無機賦形剤も本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。適切な薬学的に許容される担体としては、これだけに限定されないが、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局部的投与のための製剤としては、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体の油基剤中の核酸の溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含有し得る。核酸と有害には反応しない、非腸管外投与に適した薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
適切な薬学的に許容される賦形剤としては、これだけに限定されないが、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に慣習的に見いだされる他の補助構成成分をそれらの技術分野で確立された使用レベルでさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤などの、追加的な適合性の薬学的に活性な材料を含有し得る、または、本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤化することにおいて有用な追加的な材料、例えば、色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤などを含有し得る。しかし、そのような材料を添加する場合、当該材料は、本発明の組成物の構成成分の生物活性に過度に干渉すべきでない。製剤は、滅菌し、所望であれば、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁剤は、安定剤も含有し得る。
一部の実施形態では、本発明において特徴付けられる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態の処置において有用である１つまたは複数の作用剤を含む。そのような作用剤の例としては、これだけに限定されないが、
ピリドキシン、ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン変換酵素阻害剤）、例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）；アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（ＡＲＢ）（例えば、ロサルタンカリウム、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．のＣｏｚａａｒ（登録商標）など）、例えば、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ）；ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、スタチン）；カルシウム結合物質、例えば、セルロースリン酸ナトリウム（Ｃａｌｃｉｂｉｎｄ）；利尿薬、例えば、ヒドロクロロチアジド（Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ）などのチアジド系利尿薬；ＰＰＡＲγアゴニストピオグリタゾンなどのインスリン感作物質、リラグルタチドなどのｇｌｐ－１ｒアゴニスト、ビタミンＥ、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、および腎／肝移植；または前述のいずれかの組合せが挙げられる。
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性の影響と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の処方に使用することができる。本発明における本明細書で特徴付けられる組成物の投与量は、一般に、毒性をほとんどまたは全く伴わない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明において特徴付けられる方法において使用されるあらゆる化合物に関して、細胞培養アッセイから治療有効用量を最初に推定することができる。細胞培養物において決定されたＩＣ５０を含む（すなわち、症状の最大半量阻害が実現される試験化合物の濃度）、化合物または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の循環血漿中濃度範囲を実現する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を実現する）ために、動物モデルにおいて用量を処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
上記の通り、本発明において特徴付けられるｉＲＮＡは、それらの投与に加えて、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現によって媒介される病理学的プロセスの処置において有効な他の公知の作用剤と組み合わせて投与することができる。いずれにしても、投与を行う医師が、当技術分野で公知であるまたは本明細書に記載されている有効性の標準尺度を使用して観察された結果に基づいてｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
カチオン性脂質の合成：
本発明において特徴付けられる核酸－脂質粒子に使用される化合物、例えば、カチオン性脂質などはいずれも、公知の有機合成技法によって調製することができる。置換基は全て、別段の指定のない限り下で定義される通りである。
「アルキル」とは、１個から２４個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝、非環式または環式、飽和型の脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和型直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ、飽和型分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和型環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、不飽和型環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
「アルケニル」とは、隣り合う炭素原子の間の少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義したアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランス異性体のどちらも含む。代表的な直鎖および分枝アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」とは、隣り合う炭素の間の少なくとも１つの三重結合をさらに含有する上で定義した任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」とは、下で定義される通り、付着点の炭素がオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルがアシル基である。
「複素環」とは、飽和型、不飽和型、または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１つまたは２つのヘテロ原子を含有し、窒素および硫黄ヘテロ原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が必要に応じて四級化されていてもよい、上記の複素環のいずれかがベンゼン環と融合した二環式環を含めた、５員～７員の単環式または７員～１０員の二環式複素環式環を意味する。複素環は任意のヘテロ原子または炭素原子を介して付着していてよい。複素環としては、下で定義されるヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
「必要に応じて置換されたアルキル」、「必要に応じて置換されたアルケニル」、「必要に応じて置換されたアルキニル」、「必要に応じて置換されたアシル」、および「必要に応じて置換された複素環」という用語は、置換されている場合、少なくとも１つの水素原子が置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合では、２つの水素原子が置き換えられている。この点について、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘおよび－ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ここで、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは同じであるかまたは異なり、独立に、水素、アルキルまたは複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基のそれぞれが、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘおよび－ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つまたは複数でさらに置換されていてもよい。
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
一部の実施形態では、本発明において特徴付けられる方法では、保護基の使用が必要な場合がある。保護基方法体系は当業者に周知である（例えば、PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照されたい）。簡単に述べると、保護基は、本発明に関しては、官能基の望ましくない反応性を低減または排除する任意の基である。保護基を官能基に付加して、ある特定の反応の間のその官能基の反応性を遮蔽し、次いで、保護基を除去して元の官能基を露出させることができる。一部の実施形態では、「アルコール保護基」を使用する。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減または排除する任意の基である。保護基は、当技術分野で周知の技法を使用して付加および除去することができる。
式Ａの合成：
ある特定の実施形態では、本発明において特徴付けられる核酸－脂質粒子を、式Ａ：
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立に、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれが必要に応じて置換されていてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立に、低級アルキルである、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって必要に応じて置換された複素環式環を形成していてもよい）のカチオン性脂質を使用して製剤化する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上記の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２によって作製することができ、ここで、置換基は全て、別段の指定のない限り上で定義された通りである。
脂質Ａ（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立に、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれが必要に応じて置換されていてもよく、Ｒ３およびＲ４は、独立に、低級アルキルである、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって必要に応じて置換された複素環式環を形成していてもよい）はスキーム１に従って調製することができる。ケトン１および臭化物２は、購入することもでき、当業者に公知の方法に従って調製することもできる。１および２の反応により、ケタール３がもたらされる。ケタール３をアミン４で処理することにより、式Ａの脂質がもたらされる。式Ａの脂質は、式５の有機塩を用いて対応するアンモニウム塩に変換することができ、ここで、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸、硫酸などから選択されるアニオン対イオンである。
あるいは、ケトン１出発材料をスキーム２に従って調製することができる。グリニャール試薬６およびシアン化物７は、購入することもでき、当業者に公知の方法に従って調製することもできる。６および７の反応により、ケトン１がもたらされる。ケトン１から対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に記載されている通りである。
ＭＣ３の合成：
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は以下の通りであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を室温で終夜撹拌した。溶液を希塩酸で洗浄し、その後、水性炭酸水素ナトリウムで希釈した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、溶媒をｒｏｔｏｖａｐで除去した。残留物を、１～５％メタノール／ジクロロメタン溶出勾配を使用してシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製された産物を含有する画分を混ぜ合わせ、溶媒を除去し、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成：
ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を、以下のスキーム３を使用して実施した：
５１５の合成：
二首ＲＢＦ（１Ｌ）中、無水ＴＨＦ ２００ｍｌ中ＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ＴＨＦ ７０ｍＬ中５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を０℃、窒素雰囲気下でゆっくりと添加した。完全に添加した後、反応混合物を室温まで温め、次いで、４時間にわたって加熱して還流させた。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後（ＴＬＣによる）、混合物を０℃まで冷却し、飽和型Ｎａ２ＳＯ４溶液を慎重に添加することでクエンチした。反応混合物を室温で４時間にわたって撹拌し、濾別した。残留物をＴＨＦで十分に洗浄した。濾液と洗浄液を混合し、ジオキサン４００ｍＬおよび濃ＨＣｌ２６ｍＬで希釈し、室温で２０分間撹拌した。真空下で揮発性を取り除いて、５１５の塩酸塩を白色固体としてもたらした。収量：７．１２ｇ 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (広幅, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
５１６の合成：
２５０ｍＬの二首ＲＢＦ中、乾燥ＤＣＭ １００ｍＬ中の化合物５１５の撹拌した溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。乾燥ＤＣＭ ５０ｍＬ中Ｎ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと添加した後、反応混合物を室温まで温めた。反応の完了後（ＴＬＣによって２～３時間）、混合物を１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和型ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次いで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を蒸発させて、粗製材料をもたらし、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して５１６を粘着性の塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H).ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）。
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、５００ｍＬの一首ＲＢＦ中、アセトンおよび水（１０：１）２２０ｍＬの溶液中に溶解させ、それに、Ｎ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、次いで、ｔｅｒｔ－ブタノール中ＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％溶液４．２ｍＬを室温で添加した。反応の完了後（約３時間）、固体Ｎａ２ＳＯ３を添加することで混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、その後、飽和型ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、および最終的に鹹水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空中で除去した。粗製材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製によりジアステレオマーの混合物がもたらされ、それを、プレップＨＰＬＣによって分離した。収量：－６ｇ粗製５１７Ａ－ピーク－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）。1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H).ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５の存在、ＨＰＬＣ－９７．８６％。立体化学はＸ線によって確認された。
５１８の合成：
化合物５０５の合成に関して記載されているものと類似の手順を使用して、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色の油として得た。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
化合物５１９の合成の一般的な手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中化合物５１８（１ｅｑ）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２ｅｑ）中ＬＡＨの氷冷溶液に滴下様式で添加した。完全に添加した後、混合物を０．５時間にわたって４０℃で加熱し、次いで、氷浴で再度冷却した。混合物を、飽和型水性Ｎａ２ＳＯ４を用いて慎重に加水分解させ、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して濾過し、還元させて油にした。カラムクロマトグラフィーにより純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）がもたらされ、これは、無色の油として得られた。13C NMR = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1;エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２の分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５４．６、実測値６５４．６。
標準の方法または押出しを用いない方法のいずれによって調製された製剤も同様の様式で特徴付けることができる。例えば、製剤は、一般には、目視検査によって特徴付けられる。製剤は、凝集体または沈降物を含まない白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質－ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＳＡ）を使用して光散乱によって測定することができる。粒子のサイズは約２０～３００ｎｍ、例えば、４０～１００ｎｍであるべきである。粒径分布は単峰形になるべきである。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度、ならびに閉じ込められた画分は色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化ｄｓＲＮＡの試料を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合性色素と一緒に、製剤を破壊する界面活性物質、例えば、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００の存在下または不在下でインキュベートすることができる。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線と比べた、界面活性物質を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。閉じ込められた画分は、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性物質の不在下でのシグナルによって測定される）を引くことによって決定される。閉じ込められたｄｓＲＮＡのパーセントは、一般には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤に関しては、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、一般には、およそ少なくとも５０ｎｍ～およそ少なくとも１１０ｎｍ、およそ少なくとも６０ｎｍ～およそ少なくとも１００ｎｍ、またはおよそ少なくとも８０ｎｍ～およそ少なくとも９０ｎｍである。
ＶＩ．本発明の方法
本発明は、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明の組成物を使用して、対象内の細胞などの細胞、例えば肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減および／または阻害する方法も提供する。方法は、細胞を、本発明のＲＮＡｉ作用剤またはｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持する。
本発明は、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明の組成物ならびにパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子を標的とするｉＲＮＡ作用剤および／またはＰＮＰＬＡ３を標的とするｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を使用して、対象内の細胞などの細胞、例えば肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３発現を低減および／または阻害する方法も提供する。
さらに、本発明は、対象内の細胞などの細胞、例えば肝細胞における脂肪滴の蓄積および／または増大を阻害する方法を提供する。方法は、細胞を、本発明のＲＮＡｉ作用剤またはｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物ならびにＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ作用剤および／またはＰＮＰＬＡ３を標的とするｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞を、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持する。
遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の低減は、当業者にとって常套的な方法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してＨＳＤ１７Ｂ１３のｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって；ウエスタンブロッティング、免疫学的技法などの当業者にとって常套的な方法を使用してＨＳＤ１７Ｂ１３のタンパク質レベルを決定することによって、決定することができる。ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の低減は、ＨＳＤ１７Ｂ１３の生物活性の低下、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３の酵素活性の低下および／または血漿もしくは組織試料中の脂質、トリグリセリド、コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＩＤＬ－Ｃおよび総コレステロールを含む）、もしくは遊離の脂肪酸のうちの１つもしくは複数の減少、ならびに／または肝臓における脂肪の蓄積および／もしくは脂肪滴の増大の低減を測定することによって間接的に評価することもできる。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする適切な作用剤は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第：２０１７／０３４０６６１号に記載されている。
本発明の方法では、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて接触させることができる、すなわち、細胞は対象内にあってよい。
本発明の方法を使用した処置に適した細胞は、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（および、一部の実施形態ではＰＮＰＬＡ３遺伝子）を発現するあらゆる細胞であり得る。本発明の方法における使用に適した細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（例えば、ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（例えば、ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはスイギュウ細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞またはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であり得る。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。
ＨＳＤ１７Ｂ１３発現は、細胞において、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または約１００％阻害される。好ましい実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現は少なくとも２０％阻害される。
一部の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現も、細胞において、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または約１００％阻害される。好ましい実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現は少なくとも２０％阻害される。
一実施形態では、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ方法は、対象に、ｉＲＮＡを含有する組成物であって、ｉＲＮＡが、処置される哺乳動物のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む、組成物を投与することを含み得る。
別の実施形態では、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ方法は、対象に、第１のｉＲＮＡ作用剤および第２のｉＲＮＡ作用剤を含有する組成物であって、第１のｉＲＮＡが、処置される哺乳動物のＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、第２のｉＲＮＡが、処置される哺乳動物のＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む、組成物を投与することを含み得る。
処置される生物体がヒトなどの哺乳動物である場合、組成物を、経口経路、腹腔内経路、または、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、および局部投与（頬側および舌下を含む）を含めた非経口経路を含むがこれだけに限定されない、当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。ある特定の実施形態では、組成物を静脈内注入または注射によって投与する。ある特定の実施形態では、組成物を皮下注射によって投与する。
一部の実施形態では、投与は、デポ注射によるものである。デポ注射では、長期間にわたってｉＲＮＡを一貫して放出することができる。したがって、デポ注射により、所望の効果、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３の所望の阻害、または治療もしくは予防効果を得るために必要な投薬頻度を減少させることができる。デポ注射では、より一貫した血清中濃度ももたらされ得る。デポ注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポ注射は、皮下注射である。
一部の実施形態では、投与は、ポンプによるものである。ポンプは、外部ポンプであっても外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。ある特定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外注入のために使用することができる。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
本発明のｉＲＮＡは、例えば適切な緩衝溶液中など、医薬組成物中に存在し得る。緩衝溶液は、アセテート、シトレート、プロラミン、カーボネート、もしくはホスフェート、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよび容量オスモル濃度は、対象への投与に適するように調整することができる。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与することができる。
投与形式は、局所的処置が望ましいのか全身処置が望ましいのかに基づいて、および処置される領域に基づいて選択することができる。投与の経路および部位は、標的化が増強されるように選択することができる。
一態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与し、それにより、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害することを含む。
一部の実施形態では、方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与し、それにより、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害することを含む。別の実施形態では、方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するための、本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ作用剤またはそのような作用剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物および哺乳動物の細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与し、それにより、細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することを含む。一実施形態では、方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を投与することを含む。
一態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための、本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはそのような作用剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子およびＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ作用剤またはそのような作用剤を含む医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはそのような作用剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
遺伝子発現の低減は、当技術分野において公知の任意の方法によって、および本明細書に記載の方法、例えばｑＲＴ－ＰＣＲによって評価することができる。タンパク質産生の減少は、当技術分野において公知の任意の方法によって、および、本明細書に記載の方法、例えばＥＬＩＳＡ、酵素活性によって評価することができる。
本発明は、脂肪肝に関連する疾患、障害、または状態を有するまたはそれが発症しやすい対象に、本発明のｉＲＮＡ作用剤、ｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物またはｉＲＮＡを含むベクターを投与することを含む治療および予防方法も提供する。
一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えばＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を有する対象を処置する方法を提供する。
本発明の処置方法（および使用）は、対象、例えばヒトに、治療有効量の、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を投与し、それにより、対象を処置することを含む。
一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば慢性線維炎症性疾患を有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象に、予防有効量の、ｄｓＲＮＡ作用剤またはｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を投与し、それにより、対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む。
一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態は、慢性線維炎症性肝疾患である。慢性線維炎症性肝疾患の非限定的な例としては、がん、例えば、がん、例えば、肝細胞癌、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。
本発明は、脂肪肝に関連する疾患、障害、または状態を有するまたはそれが発症しやすい対象に、本発明のｉＲＮＡ作用剤、ｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物またはｉＲＮＡを含むベクター、およびＰＮＰＬＡ３を標的とするｉＲＮＡ作用剤、そのようなｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物またはそのようなｉＲＮＡを含むベクターを投与することを含む治療および予防方法も提供する。
本発明は、対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減および／または阻害が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば、慢性線維炎症性疾患を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物の使用も提供する。
別の態様では、本発明は、対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３を発現に関して低減および／または阻害することが有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を処置するための医薬の製造における、ＨＳＤ１７Ｂ１３を遺伝子として標的とする本発明のｉＲＮＡ作用剤、例えばｄｓＲＮＡまたはＨＳＤ１７Ｂ１３を遺伝子として標的とするｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば慢性線維炎症性疾患を有する対象における少なくとも１つの症状を防止するための、予防有効量の、本発明のｉＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物の使用も提供する。
別の態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば慢性線維炎症性疾患を有する対象における少なくとも１つの症状を防止するための医薬の製造における、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ作用剤、例えばｄｓＲＮＡまたはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減および／または阻害が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患、例えば、慢性線維炎症性疾患を処置するための、治療有効量の、本発明のｉＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物とＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはそのような作用剤を含む医薬組成物との組合せの使用も提供する。
一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば慢性線維炎症性疾患を有する対象における少なくとも１つの症状を防止するための、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ作用剤、例えばｄｓＲＮＡ、またはＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物と、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはそのような作用剤を含む医薬組成物との組合せの使用も提供する。
慢性線維炎症性肝疾患、例えばＮＡＳＨなどのＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象、例えば、ヒト対象を処置するための本発明の組合せ方法は、ＰＮＰＬＡ３のサイレンシングにより脂肪症（すなわち、肝臓脂肪）が低減すると同時に、ＨＳＤ１７Ｂ１３のサイレンシングにより炎症および線維症が低減するような対象を処置するために有用である。例えば、ゲノムワイド関連研究により、ＰＮＰＬＡ３のサイレンシングとＨＳＤ１７Ｂ１３のサイレンシングにはＮＡＳＨの病状を低減する相加効果があることが実証された。実際に、保護的な機能喪失型ＨＳＤ１７Ｂ１３対立遺伝子が、病原性ＰＮＰＬＡ３対立遺伝子を有する対象におけるＮＡＳＨの低有病率に関連することが見いだされた。ＮＡＳＨのリスクが低い、野生型ＰＮＰＬＡ３対立遺伝子を有する対象では、機能喪失型ＨＳＤ１７Ｂ１３対立遺伝子が付加的に存在することにより、はるかに大きな保護が付与された。
したがって、一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば、慢性線維炎症性肝疾患（例えば、がん、例えば、肝細胞癌、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＨＳＤ１７Ｂ１３関連疾患を有する対象を処置する方法を提供する。一実施形態では、慢性線維炎症性肝疾患は、ＮＡＳＨである。
本発明の組合せ処置方法（および使用）は、対象、例えば、ヒト対象に、治療有効量の、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、および、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を投与し、それにより、対象を処置することを含む。
一態様では、本発明は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される障害、例えば慢性線維炎症性疾患、例えば、ＮＡＳＨを有する対象における少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象に、予防有効量の、ｄｓＲＮＡ作用剤またはＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を投与し、それにより、対象における少なくとも１つの症状を防止することを含む。
一実施形態では、対象は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）Ｉ１４８Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してホモ接合性である。一実施形態では、対象は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）Ｉ１４４Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４４Ｍバリエーションをコードする遺伝子に関してホモ接合性である。一実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子に関してホモ接合性である。別の実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。さらに別の実施形態では、対象は、機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする遺伝子およびＨＳＤ１７Ｂ１３の機能喪失型バリアントをコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｒｓ７２６１３５６７バリアントの保有者ではない。
本発明のある特定の実施形態では、方法は、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現の低減が有益であると予想される対象を同定することを含み得る。方法は、一般に、対象由来の試料がＰＮＰＬＡ３Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントをコードする核酸を含むか否かを決定することを含む。方法は、対象由来の試料がＩ１４８Ｍバリエーションを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする第１の核酸および機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質をコードする第２の核酸、ならびに／またはＩ１４８Ｍバリエーションを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質および機能的なＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質を含むか否かを決定し、第１および第２の核酸の両方が検出された場合、ならびに／または両方のタンパク質が検出された場合に、対象を、ＨＳＤ１７Ｂ１３を阻害することによって肝疾患を処置または阻害する候補に分類することにより、対象をａＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することによって肝疾患を処置または阻害する候補に分類することも含み得る。
バリアントであるＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントは、本明細書に記載のＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントおよびＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントのいずれであってもよい。ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントは、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、配列決定などの任意の適切な手段によって検出することができる。
一部の実施形態では、方法は、対象が、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントに関してホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるかを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントに関してホモ接合性である。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８ＭｅｔバリアントまたはＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントに関してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８Ｍｅｔバリアントに関してホモ接合性である。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８Ｍｅｔバリアントに関してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントに関してホモ接合性である。一部の実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４４Ｍｅｔバリアントに関してヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、対象は、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の機能喪失型バリエーションをコードするいかなる遺伝子も含まない。本明細書および２０１７年１０月１１日出願の米国仮出願第６２／５７０，９８５号に記載されているものを含めたＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の機能喪失型バリエーションにより肝疾患－保護効果が付与されると考えられ、さらに、この保護効果がバリアントＰＮＰＬＡ３ Ｉｌｅ１４８Ｍバリエーションの存在下で増強されると考えられる。
一部の実施形態では、方法は、対象が肥満であるかどうかを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、対象は、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０ｋｇ／ｍ２を超える場合、肥満である。肥満症は、肝疾患を有するまたはそれが発症するリスクがある対象の特性であり得る。一部の実施形態では、方法は、対象が脂肪肝を有するかどうかを決定することをさらに含む。脂肪肝は、肝疾患を有するまたはそれが発症するリスクがある対象の特性であり得る。一部の実施形態では、方法は、対象が肥満であり、脂肪肝を有するかどうかを決定することをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「非アルコール性脂肪性肝疾患」は、「ＮＡＦＬＤ」という用語と互換的に使用され、１日当たり２０ｇｍ未満のアルコール摂取の存在下で大血管脂肪症が存在することによって定義される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国における最も一般的な肝疾患であり、一般に、インスリン抵抗性／２型糖尿病および肥満症に関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪症、脂肪性肝炎、硬変症、および時には肝細胞癌によって顕在化する。ＮＡＦＬＤの概説については、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるTolman and Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Risk. Manag., 3(6):1153-1163を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「脂肪症」、「肝脂肪症」、および「脂肪性肝疾患」という用語は、肝細胞内へのトリグリセリドおよび他の脂肪の蓄積を指す。
本明細書で使用される場合、「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」という用語は、肝臓内の脂肪の蓄積によって引き起こされる肝臓の炎症および損傷を指す。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と称される状態の群の一部である。ＮＡＳＨは、アルコール性肝疾患と似ているが、アルコールをほとんどまたは全く飲まない人において生じる。ＮＡＳＨの主要な特徴は、炎症および損傷と一緒に、肝臓内の脂肪である。ＮＡＳＨを有する人の大多数が、体調がよく、肝臓の問題を有することに気づかない。それにもかかわらず、ＮＡＳＨは、重症の恐れがあり、肝臓が恒久的に損傷を受け、傷痕が残り、もはや適正に機能することができない硬変症に至る恐れがある。ＮＡＳＨは、通常、まず、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの、常套的な血液検査パネルに含まれる肝臓検査値に上昇を有することがわかる人において疑われる。さらなる評価により肝疾患の明らかな根拠（例えば、薬物適用、ウイルス性肝炎、またはアルコールの過剰な使用など）が示されない場合、および肝臓のｘ線または画像化試験により脂肪が示された場合には、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの診断をもたらし、ＮＡＳＨを単純な脂肪肝と分別するための唯一の手段は肝臓生検である。
本明細書で使用される場合、「硬変症」という用語は、組織学的に定義され、線維症および正常な肝臓アーキテクチャから構造的に異常な小結節への変換を特徴とするびまん性肝臓プロセスである。
本明細書で使用される場合、「血清脂質」という用語は、血液中に存在する任意の主要な脂質を指す。血清脂質は、血液中に、遊離形態で、またはタンパク質複合体、例えばリポタンパク質複合体の一部としてのいずれかで存在し得る。血清脂質の非限定的な例としては、トリグリセリド（ＴＧ）、コレステロール、例えば、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）および中間密度リポタンパク質コレステロール（ＩＤＬ－Ｃ）などを挙げることができる。
一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３（および、一部の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３）の発現の低減が有益であると予想される対象は、例えば、２型糖尿病および糖尿病前症、または肥満症を有する対象；血液中にコレステロールなどの脂肪を高レベルで有する、または高血圧を有する対象；メタボリックシンドロームを含めたある特定の代謝障害を有する対象；急速な体重減少を有する対象；Ｃ型肝炎感染症などのある特定の感染症を有する対象、またはいくつかの毒素に曝露した対象である。一実施形態では、ＨＳＤ１７Ｂ１３（および、一部の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３）の発現の低減が有益であると予想される対象は、例えば、中年またはそれよりも高齢の対象；ラテンアメリカ系、非ラテンアメリカ系白人、またはアフリカ系米国人である対象；コルチコステロイドおよび制がん薬などのある特定の薬物を服用している対象である。
対象に、ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的とする第１のｄｓＲＮＡ作用剤およびＰＮＰＬＡ３を標的とする第２のｄｓＲＮＡ作用剤を投与することを含む本発明の方法（および使用）では、第１および第２のｄｓＲＮＡ作用剤は、同じ組成物に製剤化することも異なる組成物に製剤化することもでき、対象に、同じ組成物として投与することも別の組成物として投与することもできる。
一実施形態では、本発明の方法において使用するための「ｉＲＮＡ」は、「二重標的化ＲＮＡｉ作用剤」である。「二重標的化ＲＮＡｉ作用剤」という用語は、第１の標的ＲＮＡ、すなわちＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」方向を有すると称される２つの逆平行の実質的に相補的な核酸鎖で構成される二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を含む第１のｄｓＲＮＡ作用剤を含む分子と、第２の標的ＲＮＡ、すなわち、ＰＮＰＬＡ３遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」方向を有すると称される２つの逆平行の実質的に相補的な核酸鎖で構成される二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を含む第２のｄｓＲＮＡ作用剤を含む分子が共有結合により付着したものを指す。本発明の一部の実施形態では、二重標的化ＲＮＡｉ作用剤により、本明細書ではＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機構を通じて、第１および第２の標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解が誘発される。
ｄｓＲＮＡ作用剤は、対象に約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。一般には、適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇおよび約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。
ｉＲＮＡは、ある期間にわたって、定期的に静脈内注入によって投与することができる。ある特定の実施形態では、最初の処置レジメン後に、処置をより低頻度で施行することができる。
ｉＲＮＡの投与により、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画におけるＨＳＤ１７Ｂ１３レベルを少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも約９９％またはそれよりも大きく低下させることができる。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡの投与により、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画におけるＨＳＤ１７Ｂ１３レベルを少なくとも２０％低下させることができる。
ｉＲＮＡの投与により、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画におけるＰＮＰＬＡ３レベルを少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも約９９％またはそれよりも大きく低下させることができる。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡの投与により、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画におけるＰＮＰＬＡ３レベルを少なくとも２０％低下させることができる。
ｉＲＮＡの完全な用量を投与する前に、患者に、５％インフュージョンリアクションなどのより小さな用量を投与し、アレルギー反応などの有害作用についてモニタリングすることができる。別の例では、患者を、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファまたはＩＮＦ－アルファ）レベルの上昇などの望ましくない免疫賦活作用についてモニタリングすることができる。
あるいは、ｉＲＮＡを皮下に、すなわち、皮下注射によって投与することができる。所望の１日用量のｉＲＮＡを対象に送達するために１回または複数回の注射を使用することができる。注射をある期間にわたって繰り返すことができる。投与を定期的に繰り返すことができる。ある特定の実施形態では、最初の処置レジメン後に、処置をより低頻度で施行することができる。反復投薬レジメンは、治療量のｉＲＮＡを、例えば、２日に１回または１年に１回など、定期的に投与することを含み得る。ある特定の実施形態では、ｉＲＮＡをおよそ１週間に１回、７～１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、四半期に１回）、４カ月に１回、５カ月に１回、または６カ月に１回、投与する。
一実施形態では、方法は、本明細書で特徴付けられる組成物を、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２、または約３６時間にわたって低減するように投与することを含む。一実施形態では、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現が、長期の持続時間、例えば、少なくとも約２、３、４日間またはそれよりも長く、例えば、約１週間、２週間、３週間、または４週間またはそれよりも長くにわたって低減する。
別の実施形態では、方法は、本明細書で特徴付けられる組成物を、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２、または約３６時間にわたって低減するように投与することを含む。一実施形態では、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、長期の持続時間、例えば、少なくとも約２、３、４日間またはそれよりも長く、例えば、約１週間、２週間、３週間、または４週間またはより長くにわたって低減する。
本明細書で特徴付けられる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子（および、一部の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子）のＲＮＡ（一次またはプロセシングされたもの）を特異的に標的とすることが好ましい。ｉＲＮＡを使用してこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を本明細書に記載の通り調製および実施することができる。
本発明の方法に従ったｄｓＲＮＡの投与により、脂質代謝の障害を有する患者における、そのような疾患または障害の重症度、徴候、症状、および／またはマーカーの低減をもたらすことができる。これに関して「低減」とは、そのようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の処置または防止の有効性は、例えば、疾患の増悪、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の軽減、生活の質、処置効果を持続させるために必要な薬物適用の用量、疾患マーカーまたは処置されるもしくは防止の標的とされる所与の疾患に妥当な任意の他の測定可能なパラメーターのレベルを測定することによって評価することができる。そのようなパラメーター、またはパラメーターの任意の組合せのいずれか１つを測定することによって処置または防止の有効性をモニタリングすることは、当業者の能力の範囲内に十分に入る。例えば、脂質代謝の障害の処置の有効性を、例えば、１つまたは複数の血清脂質レベル、例えば、トリグリセリドレベルの周期的なモニタリングによって評価することができる。後の読み取りと最初の読み取りを比較することにより、処置が有効であるかどうかの指標が医師にもたらされる。そのようなパラメーター、またはパラメーターの任意の組合せのいずれか１つを測定することによって処置または防止の有効性をモニタリングすることは、当業者の能力の範囲内に十分に入る。ｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与に関連して、脂質代謝の障害「に対して有効」とは、臨床的に妥当な様式での投与の結果、少なくとも統計的に有意な割合の患者に、症状の改善、治癒、疾患の軽減、寿命の延長、生活の質の改善、または脂質代謝の障害の処置および関連する原因に詳しい医師によって効果的であると一般に認識される他の効果などの有益な効果がもたらされることを示す。
処置または防止効果は、病状の１つまたは複数のパラメーターに統計的に有意な改善がある場合に、またはそうでなければ予測される症状の悪化または発症がないことによって明らかである。例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の好都合な変化、および好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれよりも大きな好都合な変化により、有効な処置が示される。所与のｉＲＮＡ薬物またはその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で公知の通り、所与の疾患に関する実験動物モデルを使用して判断することもできる。
本発明は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現またはＨＳＤ１７Ｂ１３の低減および／または阻害が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を処置するための本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物を、他の医薬品および／または他の治療方法と、例えば、例えばこれらの障害を処置するために現在使用されているものなどの、公知の医薬品および／または公知の治療方法と組み合わせて使用するための方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明は、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３発現およびＰＮＰＬＡ３発現の低減および／または阻害が有益であると予想される対象、例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態（例えば、ＮＡＳＨ）を有する対象を処置するための本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物およびＰＮＰＬＡ３を標的とするｉＲＮＡ作用剤を、他の医薬品および／または他の治療方法と、例えば、例えばこれらの障害を処置するために現在使用されているものなどの、公知の医薬品および／または公知の治療方法と組み合わせて使用するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物を、例えば、ピリドキシン、ＡＣＥ阻害薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤）、例えば、血圧を低下させるためのベナゼプリル作用剤、例えば、利尿薬、ベータ遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルファ遮断薬、アルファ－２受容体アンタゴニスト、混合アルファおよびベータ遮断薬、中枢アゴニスト、末梢性アドレナリン作用阻害剤、および血管拡張薬；またはコレステロールを低減するための作用剤、例えば、スタチン、選択的コレステロール吸収阻害剤、樹脂；脂質低下治療；インスリン感作物質、例えば、ＰＰＡＲγアゴニストピオグリタゾンなど；ｇｌｐ－１ｒアゴニスト、例えば、リラグルタチドなど；ビタミンＥ；ＳＧＬＴ２阻害剤；またはＤＰＰＩＶ阻害剤；または前述のいずれかの組合せと組み合わせて投与する。一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ作用剤または医薬組成物を、膜貫通６スーパーファミリーメンバー２（ＴＭ６ＳＦ２）遺伝子の発現および／または活性を阻害する作用剤、例えば、ＴＭ６ＳＦ２遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ作用剤と組み合わせて投与する。
ｉＲＮＡ作用剤と追加的な治療剤および／または処置は、同時におよび／または同じ組合せで、例えば、皮下に投与することもでき、追加的な治療剤を別の組成物の一部としてまたは別の時間に、および／または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の別の方法によって投与することもできる。
ＶＩＩ．キット
本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、１つまたは複数のＲＮＡｉ作用剤および使用に関する指示、例えば、細胞を本発明のＲＮＡｉ作用剤または医薬組成物とＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害するために有効な量で接触させることによって細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害することに関する指示を含む。キットは、必要に応じて、細胞をＲＮＡｉ作用剤と接触させるための手段（例えば、注射デバイス）、またはＨＳＤ１７Ｂ１３の阻害を測定するための手段（例えば、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｍＲＮＡおよび／またはＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質の阻害を測定するための手段）をさらに含み得る。ＨＳＤ１７Ｂ１３の阻害を測定するためのそのような手段は、対象由来の試料、例えば、血漿試料などを得るための手段を含み得る。本発明のキットは、必要に応じて、ＲＮＡｉ作用剤を対象に投与するための手段または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含み得る。
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明において特徴付けられるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、限定されるものではない。
（実施例１）
ｉＲＮＡの設計、合成、および選択
この実施例では、ＨＳＤ１７Ｂ１３ ｉＲＮＡ作用剤を設計、合成、および選択するための方法を記載する。
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書において具体的に示されていない場合、そのような試薬は、分子生物学用の試薬の任意の供給者から分子生物学に適用するための標準の品質／純度で入手することができる。
バイオインフォマティクス
ヒト水酸化ステロイド１７－ベータ脱水素酵素１３遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１３；ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿１７８１３５．４；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３４５２７５）ならびにカニクイザル由来の毒性学種ＨＳＤ１７Ｂ１３オルソログ：ＸＭ＿００５５５５３６７．２を標的とするｓｉＲＮＡのセットを、カスタムのＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ｓｉＲＮＡ設計は全て、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３転写物に対する完全なマッチおよびカニクイザルオルソログと完全にまたはほぼ完全にマッチするサブセットを有する。ヒトＮＭ＿１７８１３５ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン４は２３９７塩基の長さを有する。ｓｉＲＮＡ設計のセットのための理論的根拠および方法は以下の通りである：１０位から末端までのあらゆる潜在的な２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについての予測される有効性を、脊椎動物遺伝子の多様なセットを標的とする数千種の別個のｓｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンの直接測定から導かれたランダムフォレストモデルを用いて決定した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり検索に使用して、ｓｉＲＮＡとヒトトランスクリプトーム内の全ての潜在的なアラインメントの間のミスマッチの数および位置を測定した。本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２位～９位と定義されるシード領域内のミスマッチ、ならびに本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０位～１１位と定義されるｓｉＲＮＡの切断部位に追加の重み付けを行った。ミスマッチの相対的な重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位に至るまでの他の位置に対して、２．８、１．２、１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について特異性スコアを、重み付けされたミスマッチそれぞれの値を合計することによって算出した。ヒトおよびカニクイザルにおけるアンチセンススコアが＞＝２であり、予測される有効性が＞＝５０％ノックダウンであったｓｉＲＮＡに優先性を与えた。
センス鎖およびアンチセンス鎖配列の修飾されていないヌクレオチド配列の詳細な一覧を表２に示す。
センス鎖およびアンチセンス鎖配列の修飾されたヌクレオチド配列の詳細な一覧を表３に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣｏｓ－７（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター）、初代ヒト肝細胞、および初代カニクイザル肝細胞のスクリーニング
細胞培養物およびトランスフェクション：
Ｃｏｓ－７（ＡＴＣＣ）を、３８４ウェルプレート中、ウェル当たり５μｌの、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中に希釈した１ｎｇ／μｌのＨＳＤ１７Ｂ１３ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、プラス０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１１６６８－０１９）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４つの反復実験で添加することによってトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３５μｌをｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートし、その後、ホタル（トランスフェクション対照）およびウミシイタケ（標的配列と融合したもの）ルシフェラーゼ測定を行った。単一用量実験を５０ｎＭで実施した。
初代ヒト肝細胞（ＢｉｏＩＶＴ）を、３８４ウェルプレート中、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭプラス０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４つの反復実験で添加することによってトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次いで、約１５×１０３個の細胞を含有するＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰプレーティング培地（ＢｉｏＩＶＴ）５０μｌをｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行った。単一用量実験を５０ｎＭで実施した。
初代カニクイザル肝細胞（ＢｉｏＩＶＴ）を、３８４ウェルプレート中、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭプラス０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４つの反復実験で添加することによってトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有するＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰプレーティング培地（ＢｉｏＩＶＴ）５０μｌをｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行った。単一用量実験を５０ｎＭで実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離：
ＲＮＡを、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームにおいて自動プロトコールを使用して単離した。簡単に述べると、溶解／結合緩衝剤７０μｌおよび磁気ビーズ３μｌを含有する溶解緩衝剤１０μｌを、細胞と共にプレートに添加した。プレートを、電磁気振とう機において室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズに結合したＲＮＡを洗浄緩衝剤Ａ １５０μｌで２回洗浄し、洗浄緩衝剤Ｂで１回洗浄した。次いで、ビーズを溶出緩衝剤１５０μｌで洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｃａｔ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり１０×緩衝剤１μｌ、２５×ｄＮＴＰ ０．４μｌ、１０×ランダムプライマー１μｌ、逆転写酵素０．５μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μｌおよびＨ２Ｏ ６．６μｌを含有するマスターミックス１０μｌを上で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁気振とう機において室温で１０分間インキュベートし、その後、３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）中、ウェル当たり２μｌのｃＤＮＡおよび５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（４３２６３１７Ｅ）および０．５μｌのＨＳＤ１７Ｂ１３ヒトプローブ（Ｈｓ０１０６８１９９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）または０．５μｌのＣｙｎｏ ＧＡＰＤＨ（カスタム）および０．５μｌのＨＳＤ１７Ｂ１３ Ｃｙｎｏプローブ（Ｍｆ０２８８８８５１＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）のいずれかに添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）においてリアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。相対的な倍率変化を算出するために、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を使用して解析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して正規化した。
表４は、示されているｉＲＮＡ作用剤を用いてトランスフェクトしたＣｏｓ－７（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター）細胞における５０ｎＭ単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、無処理の細胞と比べた残存メッセージのパーセントとして表されている。
表５は、示されているｉＲＮＡ作用剤を用いてトランスフェクトした初代ヒト肝細胞における５０ｎＭ単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、無処理の細胞と比べた残存メッセージのパーセントとして表されている。
表６は、示されているｉＲＮＡ作用剤を用いてトランスフェクトした初代カニクイザル肝細胞における５０ｎＭ単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、無処理の細胞と比べた残存メッセージのパーセントとして表されている。
1L96の化学構造は以下の通りである:

（実施例２）
ｉＲＮＡの設計、合成、および選択
この実施例では、追加的なＨＳＤ１７Ｂ１３ ｉＲＮＡ作用剤を設計、合成、および選択するための方法を記載する。
バイオインフォマティクス
ヒト水酸化ステロイド１７－ベータ脱水素酵素１３遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１３；ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿１７８１３５．４；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３４５２７５）ならびにカニクイザル由来の毒性学種ＨＳＤ１７Ｂ１３オルソログ：ＸＭ＿００５５５５３６７．２を標的とするｓｉＲＮＡのセットを、カスタムのＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ｓｉＲＮＡ設計は全て、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３転写物に対する完全なマッチおよびカニクイザルオルソログと完全にまたはほぼ完全にマッチするサブセットを有する。ヒトＮＭ＿１７８１３５ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン４は２３９７塩基の長さを有する。ｓｉＲＮＡ設計のセットのための理論的根拠および方法は以下の通りである：１０位から末端までのあらゆる潜在的な２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについての予測される有効性を、脊椎動物遺伝子の多様なセットを標的とする数千種の別個のｓｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンの直接測定から導かれたランダムフォレストモデルを用いて決定した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり検索に使用して、ｓｉＲＮＡとヒトトランスクリプトーム内の全ての潜在的なアラインメントの間のミスマッチの数および位置を測定した。本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２位～９位と定義されるシード領域内のミスマッチ、ならびに本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０位～１１位と定義されるｓｉＲＮＡの切断部位に追加の重み付けを行った。ミスマッチの相対的な重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位に至るまでの他の位置に対して、２．８、１．２、１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について特異性スコアを、重み付けされたミスマッチそれぞれの値を合計することによって算出した。ヒトおよびカニクイザルにおけるアンチセンススコアが＞＝２であり、予測される有効性が＞＝５０％ノックダウンであったｓｉＲＮＡに優先性を与えた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣｏｓ－７（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３ベクター）および初代カニクイザル肝細胞のスクリーニング
Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ
Ｃｏｓ－７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で、ほぼ集密になるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから放出させた。複数用量実験を１０ｎＭおよび０．１ｎＭで実施した。ｓｉＲＮＡおよびｐｓｉＣＨＥＣＫ２－ＨＳＤ１７Ｂ１３（ＸｈｏＩ－ＮｏｔＩ部位にクローニングされたＮＭ＿１７８１３５）プラスミドトランスフェクションを、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖および５μｌ（５ｎｇ）のｐｓｉＣＨＥＣＫ２－ＨＳＤ１７Ｂ１３プラスミドをウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭプラス０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）と一緒に添加することによって行い、次いで、室温で１５分間インキュベートした。次いで、混合物を細胞に添加し、それを新鮮な完全培地３５μｌに再懸濁させた。トランスフェクトされた細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートした。
ｓｉＲＮＡおよびｐｓｉＣＨＥＣＫ２－ＨＳＤ１７Ｂ１３プラスミドをトランスフェクトした４８時間後に、ホタル（トランスフェクション対照）およびウミシイタケ（ＨＳＤ１７Ｂ１３標的配列と融合したもの）ルシフェラーゼを測定した。まず、培地を細胞から取り出した。次いで、培養培地体積と等しいＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ２０μｌを各ウェルに添加し、混合することによってホタルルシフェラーゼ活性を測定した。混合物を室温で３０分間インキュベートした後、発光（５００ｎｍ）をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定して、ホタルルシフェラーゼシグナルを検出した。室温のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ ２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを１０～１５分間インキュベートした後、発光を再度測定して、ウミシイタケルシフェラーゼシグナルを決定した。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔによりホタルルシフェラーゼシグナルがクエンチされ、ウミシイタケルシフェラーゼ反応に関する発光が持続した。各ウェル内のウミシイタケ（ＨＳＤ１７Ｂ１３）シグナルをホタル（対照）シグナルに対して正規化することによってｓｉＲＮＡ活性を決定した。次いで、ｓｉＲＮＡ活性の大きさを、同じベクターをトランスフェクトしたがｓｉＲＮＡで処理しなかったまたは非標的化ｓｉＲＮＡで処理した細胞と相対させて評価した。全てのトランスフェクションをｎ＝２またはそれよりも多くで行った。
細胞培養およびトランスフェクション
初代カニクイザル肝細胞（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ／ＩＶＴ）を、３８４ウェルプレート中、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭプラス０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８－１５０）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に、各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４つの反復実験で添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクトした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有するＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰプレーティング培地（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ／ＩＶＴ）４０μｌをｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行った。複数用量実験を１０ｎＭおよび０．１ｎＭで実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離
ＲＮＡを、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームにおいて自動プロトコールを使用して単離した。簡単に述べると、溶解／結合緩衝剤７０μｌおよび磁気ビーズ３μｌを含有する溶解緩衝剤１０μｌを、細胞と共にプレートに添加した。プレートを、電磁気振とう機において室温で１０分間インキュベートし、次いで、磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズに結合したＲＮＡを洗浄緩衝剤Ａ １５０μｌで２回洗浄し、洗浄緩衝剤Ｂで１回洗浄した。次いで、ビーズを溶出緩衝剤１５０μｌで洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、Ｃａｔ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成
反応当たり１０×緩衝剤１μｌ、２５×ｄＮＴＰ ０．４μｌ、１０×ランダムプライマー１μｌ、逆転写酵素０．５μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μｌおよびＨ２Ｏ ６．６μｌを含有するマスターミックス１０μｌを上で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁気振とう機において室温で１０分間インキュベートし、その後、３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
ｃＤＮＡ ２μｌを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）中、ウェル当たりＣｙｎｏ ＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡ－３’（配列番号４４８３）、リバースプライマー：５’－ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣ－３’（配列番号４４８４）、プローブ：５’ＨＥＸ－ＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ－３’ＢＨＱ－１（配列番号４４８５））０．５μｌ、およびＨＳＤ１７Ｂ１３カニクイザルプローブ（Ｍｆ０２８８８８５１＿ｍ１）０．５μｌおよびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）５μｌを含有するマスターミックスに添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）においてリアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。相対的な倍率変化を算出するために、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を使用して解析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して正規化した。
結果
表７にＨＳＤ１７Ｂ１３ ＥＬＦ７ ＧＮＡ７の修飾された配列を提示する。表８にＨＳＤ１７Ｂ１３ ＥＬＦ７ ＧＮＡ７の修飾されていない配列を提示する。Ｃｏｓ－７および初代カニクイザル肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ＥＬＦ７ ＧＮＡ７の修飾された配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの１０ｎＭスクリーニングからの結果を表９に要約する。
同様に、表１０にＨＳＤ１７Ｂ１３ ＮｏｎＦ ＤＮＡの修飾された配列を提示する。表１１にＨＳＤ１７Ｂ１３ ＮｏｎＦ ＤＮＡの修飾されていない配列を提示する。表１２には、Ｃｏｓ－７および初代カニクイザル肝細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ１３ ＮｏｎＦ ＤＮＡの修飾された配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの１０ｎＭスクリーニングの結果が示されている。「ＮｏｎＦ」は、これらのＲＮＡｉ作用剤がフルオロ修飾を欠くことを示す。


（実施例３）
ＮＡＳＨからの保護をなす機能喪失型突然変異の同定
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝臓の脂肪蓄積および炎症を特徴とする進行性疾患であり、硬変症に至る恐れがある。ＮＡＳＨは、２０２０年までの肝移植の主要な駆動因子であることが予測される。肝臓に関連する死亡率は、線維症の増悪にしたがって指数関数的に上昇する。
ＨＳＤ１７Ｂ１３のスプライスバリアント（ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡ）は、ステロイド基質に対する酵素活性が低下した不安定な短縮されたタンパク質をもたらし、したがって、ＨＳＤ１７Ｂ１３の機能喪失型バリアントである。ＨＳＤ１７Ｂ１３：ｒｓ７２６１３５６７：ＴＡは、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の低減に再現性よく関連付けられ、図１に示されている通り、このバリアントは、アルコール性および非アルコール性肝疾患、硬変症および肝細胞癌のリスクの有意な低下に対立遺伝子投与量依存的に関連する。
したがって、肝細胞において発現されるＨＳＤ１７Ｂ１３は、ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現を阻害し、機能喪失型バリアントｒｓ７２６１３５６７：ＴＡを模倣するｄｓＲＮＡ作用剤を使用するＮＡＳＨおよび他の慢性肝疾患の処置の魅力的な標的である。
（実施例４）
ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性
Ａ．マウスにおいて異所的に発現されたヒトＨＳＤ１７Ｂ１３に対するヒト／ＮＨＰ交差反応性ｓｉＲＮＡの有効性
マウス（ｎ＝３／群）に、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を注射した。ＡＡＶ注射の１４日後、マウスに、ＡＤ－２８８９１７を単回３ｍｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。投与の１０日後、肝臓におけるヒトＨＳＤ１７Ｂ１３発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、ＰＢＳを注射した対照動物のヒトＨＳＤ１７Ｂ１３発現に対して正規化した。図２Ａに示されている通り、ＡＤ－２８８９１７の単回投薬により、ヒトＨＳＤ１７Ｂ１３の発現が有効に阻害される。
Ｂ．非ヒト霊長類における内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３に対するヒト／ＮＨＰ交差反応性ｓｉＲＮＡの有効性
カニクイザル（ｎ＝３／群）に、ＡＤ－２８８９１７を単回３ｍｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。二重鎖１投与の２１日後、肝臓生検材料における内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、ＰＢＳを注射した対照動物の内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３発現に対して正規化した。図２Ｂに示されている通り、ＡＤ－２８８９１７の単回投薬により、内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現が有効に阻害される。
（実施例５）
ＨＳＤ１７Ｂ１３を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性
カニクイザル（ｎ＝３／群）に、表１３に列挙される作用剤を単回３ｍｇ／ｋｇ用量または単回１０ｍｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。二重鎖投与の２１日後、肝臓生検材料（左葉および右葉）における内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、ＰＢＳを注射した対照動物の内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３発現に対して正規化した。表１４に示されている通り、試験した作用剤全ての単回３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量により、内因性ＨＳＤ１７Ｂ１３の発現が有効に阻害された。

Claims (54)

  1. 細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡとの相補性領域を含み、前記相補性領域が、配列番号４４９９に由来する、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、各鎖が、３０ヌクレオチド長以下であり、前記ｄｓＲＮＡ作用剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ作用剤。
  2. 細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードするｍＲＮＡとの相補性領域を含み、前記相補性領域が、配列番号４４９７、４５０１および４５０５のうちのいずれか１つに由来する、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、各鎖が、３０ヌクレオチド長以下であり、前記ｄｓＲＮＡ作用剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ作用剤。
  3. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、または前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾を含む、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  4. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖が、３’末端に付着したリガンドとコンジュゲートしている、請求項１から３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  5. 前記センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、または前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  6. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、アンロックドヌクレオチド、コンフォメーションが制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  7. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、および／または、グリコール修飾ヌクレオチドを含む、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  8. 前記相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長、１９～３０ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  9. 各鎖が独立に、１９～３０ヌクレオチド長である、各鎖が独立に、１９～２５ヌクレオチド長である、または各鎖が独立に、２１～２３ヌクレオチド長である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  10. 少なくとも一方の鎖が３’突出を含み、前記３’突出が、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドを含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  11. リガンドをさらに含む、請求項１から３までおよび請求項５から１０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  12. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ作用剤の前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしている、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  13. 前記リガンドが、一価リンカー、二価リンカー、または三価分枝リンカーを通じて付着している１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、請求項１１または１２に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  14. 前記リガンドが、


    を含む、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  15. 以下の概略図



    に示されるリガンドとコンジュゲートしており、ＸがＯまたはＳである、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  16. 前記アンチセンス鎖が、配列番号４４９７、４４９９、４５０１および４５０５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  17. 式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し；
    Ｎｂが存在する場合には、Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’が存在する場合には、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なる）
    によって表され、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている、請求項１から１６までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  18. ｉが０である；ｊが０である；ｉが１である；ｊが１である；ｉおよびｊがどちらも０である；またはｉおよびｊがどちらも１である、かつ／またはｋが０である；ｌが０である；ｋが１である；ｌが１である；ｋおよびｌがどちらも０である；またはｋおよびｌはどちらも１である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  19. ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、ＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’と相補的である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  20. 前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位および１３位に存在し、前記センス鎖における前記ＹＹＹモチーフの３個のヌクレオチドの少なくとも１個が、前記アンチセンス鎖における前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフの３個のヌクレオチドの少なくとも１個と塩基対を形成する、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  21. 式（ＩＩＩ）が、
    （ａ）式（ＩＩＩａ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、ｎ ｑ ’、ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’の各々は請求項１７において定義された通りであり、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）；
    （ｂ）式（ＩＩＩｂ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、ｎ ｑ ’、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’の各々は請求項１７において定義された通りであり、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）；
    （ｃ）式（ＩＩＩｃ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、ｎ ｑ ’、ＸＸＸ、ＹＹＹ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＹ’Ｙ’Ｙ’の各々は請求項１７において定義された通りであり、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）；または
    （ｄ）式（ＩＩＩｄ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、ｎ ｐ 、ｎ ｐ ’、ｎ ｑ 、ｎ ｑ ’、ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’の各々は請求項１７において定義された通りであり、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）によって表される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  22. ＨＳＤ１７Ｂ１３をコードする前記ｍＲＮＡの部分と相補的な領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長、１９～３０ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長である、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  23. 各Ｙが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１７から２１まで、および請求項１７を直接的にもしくは間接的に引用する場合の請求項２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  24. 少なくとも一方の鎖が３’突出を含み、前記３’突出が、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドを含む、請求項１から２３までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  25. 前記ｄｓＲＮＡ作用剤が、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  26. 前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、前記アンチセンス鎖の３’末端、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の５’末端および／または前記センス鎖の５’末端にある、請求項２５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  27. 前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、少なくとも一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある、請求項２５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  28. 前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが、前記センス鎖のヌクレオチドとＡＵ塩基対を形成する、請求項１から２７までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  29. ｐ’＞０またはｐ’＝２である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  30. （ａ）ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと相補的である、または（ｂ）ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’突出ヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと非相補的である、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  31. 前記センス鎖が合計２１ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が合計２３ヌクレオチドを有する、請求項１から３０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  32. （ａ）ｎｐ’の少なくとも１つのヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している、または（ｂ）ｎｐ’の全てのヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結している、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  33. 式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
    （式中、
    （ａ）ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、各ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
    Ｎｂが存在する場合には、Ｎｂに対する修飾がＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’が存在する場合には、Ｎｂ’に対する修飾がＹ’に対する修飾とは異なり、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている；
    （ｂ）ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’ヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
    Ｎｂが存在する場合には、Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’が存在する場合には、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしている；
    （ｃ）ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’ヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
    Ｎｂが存在する場合には、Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’が存在する場合には、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価リンカー、二価リンカー、または三価分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃである；
    （ｄ）ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に、０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’ヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；
    Ｎｂが存在する場合には、Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’が存在する場合には、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価リンカー、二価リンカー、または三価分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃである；あるいは
    （ｅ）ｉ＝０、ｊ＝０、ｋ＝０、およびｌ＝０であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、存在してもしなくてもよく、それぞれ独立に、突出ヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に、０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’ヌクレオチドが隣接ヌクレオチドとホスホロチオエート連結によって連結しており；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾されているかもしくは修飾されていない、またはその組合せである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、ここで、ＮａおよびＮａ’が独立に２～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合には、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
    Ｎ ｂ 、およびＮ ｂ ’は不存在であり；
    ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立に、３個の連続したヌクレオチドに対する３つの同一の修飾を有する１つのモチーフを表し、前記修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドとコンジュゲートしており、前記リガンドが、一価リンカー、二価リンカー、または三価分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃである）
    で表される、請求項１から３２までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  34. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
    前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、独立に、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－フルオロ修飾、および／または、グリコール修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、
    前記センス鎖が、３’末端において一価リンカー、二価リンカーまたは三価分枝リンカーを通じて付着した１つまたは複数のＧａｌＮＡｃとコンジュゲートしている、請求項１から３２までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  35. （ａ）前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４４９９の配列からなり、前記センス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４４９８の配列からなる；
    （ｂ）前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４４９７の配列からなり、前記センス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４４９６の配列からなる；
    （ｃ）前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４５０１の配列からなり、前記センス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４５００の配列からなる；または、
    （ｄ）前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４５０５の配列からなり、前記センス鎖ヌクレオチド配列が、配列番号４５０４の配列からなる、
    請求項１から３４までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  36. 前記センス鎖が、ｕｓａｓｃａｕｃＡｆａＧｆＡｆＣｆｕａａｕｃｕｕｇｕｕ（配列番号４４８６）を含み、前記アンチセンス鎖がａｓＡｆｓｃａａｇ（Ａｇｎ）ｕｕａｇｕｃＵｆｕＧｆａｕｇｕａｓｇｓｕ（配列番号４４８７）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ａｇｎ）が、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図



    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  37. 前記センス鎖が、ｃｓｇｓｕａｕｇＣｆａＧｆＡｆＡｆｕａｕｕｃａａｕｕｕ（配列番号４４９０）を含み、前記アンチセンス鎖がａｓＡｆｓａｕｕＧｆ（Ａｇｎ）ａｕａｕｕｃＵｆｇＣｆａｕａｃｇｓａｓｕ（配列番号４４９１）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ａｇｎ）が、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図


    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  38. 前記センス鎖が、ｃｓｇｓｕａｕｇＣｆａＧｆＡｆＡｆｕａｕｕｃａａｕｕｕ（配列番号４４９２）を含み、前記アンチセンス鎖が、ａｓＡｆｓａＵｆｕＧｆ（Ａｇｎ）ａｕａｕＵｆｃＵｆｇＣｆａＵｆａＣｆｇｓａｓｕ（配列番号４４９３）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ａｇｎ）が、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図



    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  39. 前記センス鎖が、ｃｓｕｓａｃａｕＣｆａＡｆＧｆＡｆｃｕａａｕｃｕｕｇｕ（配列番号４４９４）を含み、前記アンチセンス鎖が、ａｓＣｆｓａａｇａ（Ｔｇｎ）ｕａｇｕＣｆｕＵｆｇＡｆｕｇｕａｇｓｕｓｇ（配列番号４４９５）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図



    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ作用剤。
  40. 細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）作用剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列５′－ａｓｕｓｇｃｕｕＵｆｕＧｆＣｆＡｆｕｇｇａｃｕａｕｃｕ－３′（配列番号４４８８）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列５′－ａｓＧｆｓａｕａｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｇｃＡｆａＡｆａｇｃａｕｓｕｓｃ－３′（配列番号４４８９）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図



    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯであり、
    前記各鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、ｄｓＲＮＡ作用剤。
  41. 請求項１から４０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤を含有する細胞。
  42. 請求項１から４０までのいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ作用剤を含む、１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  43. 前記作用剤が、緩衝化されていない溶液、生理食塩水、水、緩衝化された溶液、アセテート緩衝溶液、シトレート緩衝溶液、プロラミン緩衝溶液、カーボネート緩衝溶液、ホスフェート緩衝溶液、リン酸緩衝食塩水において製剤化されている、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 細胞における１７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）発現の阻害における使用のための、請求項４２に記載の医薬組成物。
  45. 前記細胞がヒト対象内にありまたは肥満であるヒト対象内にある、請求項４４に記載の医薬組成物。
  46. 対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の阻害、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象の処置、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状の防止、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクの低下、脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪の阻害、あるいはＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害に罹患している対象の肝臓における脂肪滴の蓄積の阻害における使用のための、請求項４２に記載の医薬組成物。
  47. 対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３の発現の阻害、ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態に罹患している対象の処置、ＨＳＤ１７Ｂ１３遺伝子の発現の低減が有益であると予想される疾患、障害または状態を有する対象における少なくとも１つの症状の防止、脂肪症を有する対象における慢性肝疾患の発症リスクの低下、脂肪症に罹患している対象における脂肪症から脂肪性肝炎への増悪の阻害、あるいはＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害に罹患している対象の肝臓における脂肪滴の蓄積の阻害の方法における使用のための、請求項４２に記載の医薬組成物、およびＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ作用剤を含む医薬組成物を含む組み合わせ物。
  48. ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態を処置することが、ＨＳＤ１７Ｂ１３酵素活性の低下、ＨＳＤ１７Ｂ１３タンパク質蓄積の減少、ＰＮＰＬＡ３酵素活性の低下、ＰＮＰＬＡ３タンパク質蓄積の減少、ならびに／または前記対象の肝臓における脂肪の蓄積および／もしくは脂肪滴の増大の低減を含む、請求項４６に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７に記載の組み合わせ物。
  49. 前記ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、または状態が、慢性線維炎症性肝疾患、肝臓における脂肪滴の蓄積および／または増大に関連する慢性線維炎症性肝疾患、肝臓における脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝線維症、脂肪性肝疾患（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、肝細胞壊死、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む、請求項４６または４８に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７または４８に記載の組み合わせ物。
  50. 少なくとも１つの追加的な治療薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項４６、４８または４９のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７から４９までのいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  51. 前記ｄｓＲＮＡ作用剤の用量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである、請求項４６および４８から５０までのいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７から５０までのいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  52. 前記医薬組成物または前記組み合わせ物が、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために製剤化されている、請求項４６および４８から５１までのいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７から５１までのいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  53. 前記対象におけるＨＳＤ１７Ｂ１３のレベルが決定されている、請求項４６および４８から５２までのいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物または請求項４７から５２までのいずれか一項に記載の組み合わせ物。
  54. ＨＳＤ１７Ｂ１３に関連する疾患、障害、もしくは状態、慢性線維炎症性肝疾患、肝臓における脂肪滴の蓄積および／もしくは増大に関連する慢性線維炎症性肝疾患、肝臓の炎症、肝線維症、脂肪性肝疾患（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、ＨＣＶ関連硬変症、薬物性肝障害、肝細胞壊死、または肥満症、肝臓における脂肪の蓄積、または肝細胞壊死を罹患している対象を処置することにおける使用のための組成物であって、
    前記組成物がｄｓＲＮＡ作用剤を含み、前記ｄｓＲＮＡ作用剤がセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列５′－ａｓｕｓｇｃｕｕＵｆｕＧｆＣｆＡｆｕｇｇａｃｕａｕｃｕ－３′（配列番号４４８８）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列５′－ａｓＧｆｓａｕａｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｇｃＡｆａＡｆａｇｃａｕｓｕｓｃ－３′（配列番号４４８９）を含み、
    前記ａ、ｇ、ｃおよびｕが、それぞれ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆが、それぞれ、２’－フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり、
    前記（Ｔｇｎ）が、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）であり、
    前記ｓが、ホスホロチオエート連結であり、
    リガンドが、以下の概略図



    に示される前記センス鎖の３’末端とコンジュゲートしており、ＸがＯであり、
    前記各鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、組成物。
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