ES2910377T3 - Microorganismos de Escherichia coli que tienen la producción de L-triptófano mejorada y método para producir L-triptófano mediante el uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación en una región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 de un operón de triptófano endógeno, en donde el microorganismo recombinante también se modifica para tener un número de copias cromosómicas o intracelulares aumentado de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE, para mejorar así la actividad del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano, excepto para la antranilato sintasa que está codificada por el gen trpE en comparación con el correspondiente microorganismo de Escherichia natural.
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismos de Escherichia coli que tienen la producción de L-triptófano mejorada y método para producir L-triptófano mediante el uso de los mismos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un microorganismo del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada y un método para producir L-triptófano mediante el uso del mismo.
Antecedentes de la técnica
El L-triptófano, un aminoácido esencial, se ha usado ampliamente como aditivo para piensos, materia prima para medicamentos tales como soluciones para infusión y material para alimentos saludables y se ha producido por síntesis química, reacción enzimática, fermentación, etc.
Recientemente, la producción de L-triptófano se lleva a cabo principalmente por fermentación microbiana. En la etapa inicial de industrialización se han usado principalmente cepas resistentes a análogos obtenidas por mutación química. Sin embargo, a medida que las tecnologías de recombinación génica se desarrollaron rápidamente en la década de 1990 y los mecanismos reguladores se entendieron a nivel molecular, se han usado principalmente las cepas recombinantes E. coli y Corynebacterium obtenidas mediante técnicas de ingeniería genética.
La producción de triptófano por parte de los microorganismos comienza con DAHP(3-desoxi-D-arobinoheptulosonato-7-fosfato) producido por la polimerización de PEP (fospoenolpiruvato) que es un intermediario de la glucólisis, con E4P (eritrosa-4-fosfato) que es un intermediario de la vía de las pentosas fosfato. Luego, el triptófano se biosintetiza a partir del corismato a través de la vía biosintética aromática común. Específicamente, el triptófano es sintetizado por antranilato sintasa (EC 4.1.3.27) codificada por el gen trpE, antranilato sintasa (EC 4.1.3.27) y antranilato Pr Pp transferasa (EC 2.4.1.28) codificada por el gen trpD, indol-3-glicerol fosfato sintasa (EC 4.1.1.48) y fosforribosilantranilato isomerasa (EC 5.3.1.24) codificada por el gen trpC y triptófano sintasa (EC 4.2.1.20) codificada por el gen trpB y el gen trpA. El grupo de genes trpEDCBA que media la reacción anterior se coloca en el cromosoma y tiene una estructura de operón que contiene una única región reguladora.
Un operón de triptófano se transcribe activamente para producir una cantidad suficiente de triptófano requerida por la célula. Sin embargo, si el nivel de triptófano en la célula es alto, un represor se une al triptófano y luego el operón de triptófano se inactiva por la unión del represor a la región reguladora del operón, se inhibe así la transcripción. Además, los operones para la biosíntesis de aminoácidos tales como treonina, fenilalanina, leucina, triptófano e histidina tienen otro mecanismo regulador conocido como atenuación (J Bacteriol. (1991) 173, 2328-2340). Como se sabe en la técnica con respecto a la atenuación, en condiciones deficientes en aminoácidos, la estructura del ARNm correspondiente a la región de secuencia específica entre el promotor y el primer gen del operón en el cromosoma, cambia a una estructura ventajosa para el proceso de traducción para promover la expresión de genes de la biosíntesis, pero en condiciones ricas en los aminoácidos, el ARNm transcrito corto forma una estructura tridimensional, denominada "estructura de horquilla, para inhibir el proceso de traducción (J Biol Chem., (1988) 263:609-612).
En la etapa inicial del desarrollo de las cepas productoras de L-triptófano, el objetivo principal era aumentar la eficiencia de la producción a través de la mejora de la actividad enzimática, ya sea al liberar la inhibición por retroalimentación de las enzimas de la vía de biosíntesis del triptófano causada por el producto final, el triptófano o al aumentar el número de copias de los genes del operón de triptófano en el cromosoma o en forma de vector para mejorar la expresión de enzimas biosintéticas de triptófano (Appl. Environ. Microbiol., (1982) 43:289-297; Appl. Microbiol. Biotechnol., (1993) 40:301-305; Trends Biotechnol., (1996) 14:250-256).
Los métodos para impartir la capacidad de producir L-triptófano a los microorganismos incluyen un método para impartir resistencia a los análogos de triptófano o antranilato como producto intermediario mediante mutación química o un método para modificar microorganismos mediante ingeniería genética. Los ejemplos del método de mutación química incluyen los descritos en el registro de patente de Corea núm. 1987-0001813, registro de patente de Corea núm. 0949312 y similares y los ejemplos del método de modificación en base a la ingeniería genética incluyen diversos enfoques que usan una cepa obtenida al mejorar el gen tktA que codifica la transcetolasa o el gen galP que codifica la permeasa de galactosa en la vía de biosíntesis de aminoácidos aromáticos para aumentar el suministro de E4P (eritrosa4-fosfato) o PEP (fosfoenolpiruvato) y reducir la inhibición por retroalimentación de DAHP (3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato) para mejorar la vía de biosíntesis de aromáticos (Trends Biotechnol.,(1996)14:250-256, Microbial Cell Factories (2009) 8:19), o una cepa obtenida al introducir adicionalmente genes del operón de triptófano en el vector o cromosoma (Appl. Environ. Microbiol.,(1982) 43:289-297, Appl. Microbiol. Biotechnol., (1993) 40:301-305).
Sin embargo, aunque el operón de triptófano se introdujo con la liberación de la inhibición por retroalimentación de las enzimas biosintéticas, esos enfoques no lograron un aumento en el rendimiento de producción del triptófano, debido a los mecanismos reguladores tales como la inhibición o atenuación de los genes del operón en nivel de transcripción.
El documento US 4,371,614 divulga una bacteria que comprende un hospedero del género Escherichia deficiente en la enzima triptofanasa que lleva un plásmido con información genética para controlar la producción de L-triptófano que es útil para la producción fermentativa de L-triptófano con altos rendimientos.
El documento US 2009/239269 divulga una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y tiene la capacidad de producir un L-aminoácido tal como L-lisina, L-treonina y L-triptófano y está modificada para potenciar la actividad de la descarboxilasa del ácido glutámico. La bacteria se cultiva en un medio para producir y acumular L-aminoácidos en el medio o en las células de la bacteria y luego se recoge el L-aminoácido del medio o de las células.
El documento WO 2005/049808 divulga la producción de L-treonina y L-isoleucina al cultivar una bacteria que pertenece al género Escherichia.
El documento EP 0165614 divulga un plásmido híbrido que comprende un promotor de triptófano y un gen de betagalactosidasa, por ejemplo, pTREZI, que cuando está contenido en un microorganismo hospedero tal como E. coli puede producir beta-galactosidasa en grandes cantidades.
El documento WO 84/00380 divulga un vector de expresión adecuado para la producción de proteínas de fusión. El vector incluye una secuencia de nucleótidos que comprende en fase desde el extremo 5'; un promotor-operador de trp, un sitio de unión al ribosoma de trpE, un gen estructural que comprende un gen trpE o una porción 5' del mismo y un gen que codifica para un polipéptido heterólogo en donde la secuencia de nucleótidos no incluye un atenuador trp. El gen estructural puede incluir además una porción 3' de un gen trpE corriente abajo del gen que codifica el polipéptido heterólogo.
Divulgación
Problema técnico
Los presentes inventores han desarrollado un método para liberar la inhibición o atenuación de los genes del operón de triptófano a nivel de transcripción en una cepa productora de L-triptófano y un método capaz de potenciar las enzimas biosintéticas de triptófano mediante el uso del mismo. Además, para resolver el problema de que el rendimiento de producción de cepas productoras de triptófano no aumenta debido a la acumulación de antranilato a medida que aumenta el operón de triptófano, los presentes inventores han construido una cepa productora de triptófano que tiene un mayor rendimiento de producción y bajo nivel de acumulación de antranilato al expresar el grupo de genes distintos del gen que codifica la antranilato sintasa (TrpE) entre los genes del operón de triptófano como una forma que es un mecanismo regulador insensibilizado tal como la inhibición por retroalimentación o el mecanismo de inhibición.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un microorganismo del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada mediante la modificación para desensibilizar la inhibición o atenuación del operón de triptófano y reducir la acumulación de antranilato.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir L-triptófano mediante el uso del microorganismo del género Escherichia.
Solución técnica
Para lograr los objetivos anteriores, una modalidad de la presente invención proporciona un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación en una región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 de un operón de triptófano endógeno, en donde el microorganismo recombinante también se modifica para tener un número de copias cromosómicas o intracelulares aumentado de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE, para mejorar así la actividad del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano, excepto para la antranilato sintasa que está codificada por el gen trpE en comparación con el correspondiente microorganismo de Escherichia natural.
Otra modalidad de la presente invención también proporciona un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar el microorganismo recombinante del género Escherichia descrito anteriormente en condiciones adecuadas para la producción de L-triptófano.
Efectos ventajosos
El microorganismo recombinante producido de acuerdo con la presente invención elimina la acumulación excesiva de antranilato en el mismo y puede usarse ventajosamente para producir L-triptófano con alto rendimiento.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una vista esquemática que representa los genes del operón de triptófano, una región reguladora de los genes en el cromosoma de E. coli y la forma de eliminación del gen descrito en la presente invención.
A) Genes del operón de triptófano y una región reguladora del mismo en el cromosoma de E. coli (Ptrp); B) Una forma Ptrp;
C) Una forma en donde se elimina el péptido líder que codifica el gen trpL (DtrpL); y
D) Una forma en donde se eliminan el gen trpL que codifica el péptido líder y el atenuador (Dtrp_att).
La figura 2 muestra un vector pCL-GFP usado para medir la intensidad de una región reguladora de la expresión del operón de triptófano.
La figura 3 muestra el vector pINT17E-Patt-trpDCBA para introducir los genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA en el cromosoma para aumentar el número de copias de los genes.
Modo para la invención
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle.
Una modalidad de la presente invención proporciona un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación en una región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 de un operón de triptófano endógeno, en donde el microorganismo recombinante también se modifica para tener un número de copias cromosómicas o intracelulares aumentado de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE, para mejorar así la actividad del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano, excepto para la antranilato sintasa que está codificada por el gen trpE en comparación con el correspondiente microorganismo de Escherichia natural.
En una modalidad adicional, el microorganismo recombinante descrito en el presente documento tiene una modificación adicional en la región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3 en la región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1.
En determinadas modalidades del microorganismo recombinante descrito en el presente documento, el gen trpD codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37, el gen trpC codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 38, el gen trpB codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 y el gen trpA codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40.
Como se usa en el presente documento, el término "operón de triptófano" u "operón de Trp" significa el operón completo que incluye todos los genes trpEDCBA. El operón de triptófano tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 9.
Como se usa en el presente documento, el término "grupo de genes de la biosíntesis de triptófano" significa un grupo de genes que consiste en una combinación de dos o más de trpD, trpC, trpB y trpA que son genes del operón de triptófano. Específicamente, el grupo de genes de la biosíntesis de triptófano puede ser un grupo de genes trpDCBA que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 10. En el presente documento, el gen trpD codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37; el gen trpC codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 38; el gen trpB codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 y el gen trpA codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40. La mejora de la actividad del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano, excepto la antranilato sintasa que es codificada por el gen trpE del operón de triptófano, se lleva a cabo para resolver el problema de que el rendimiento de producción del triptófano no aumenta debido a la acumulación de antranilato a medida que se mejora el operón de triptófano.
Unos microorganismos productores de L-triptófano pueden ser cualquier microorganismo procariótico o eucariótico siempre que tenga una productividad de L-triptófano. Los ejemplos de este microorganismo pueden incluir microorganismos que pertenecen al género Escherichia, el género Erwinia, el género Serratia, el género Providencia, el género Corynebacterium y el género Brevibacterium. El microorganismo de uso en la invención es un microorganismo que pertenece al género Escherichia y más específicamente E. coli. Más específicamente, la cepa de E. coli de la presente invención puede ser una cepa que mantiene la 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato sintasa (aroG) que se libera para la inhibición por retroalimentación, o que tiene actividades mejoradas de enzimas de la vía de biosíntesis aromática tales como 3-deshidroquinato sintetasa (AroB), shikimato deshidrogenasa (AroE), shikimato quinasa (AroL), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (AroA) o corismato sintasa (AroC) o actividad mejorada de fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA) o transcetolasa (TktA) para mejorar el suministro de los intermediarios, serina y PRPP, de la vía de biosíntesis del triptófano. Además, la cepa de E. coli de la presente invención puede ser una cepa que tiene prefenato deshidratasa y corismato mutasa (PheA) inactivadas en la vía de biosíntesis aromática o prefenato deshidrogenasa, corismato mutasa (tyrA), triptofanasa (tnaA) y transportador de triptófano (tnaB, mtr) inactivados.
Más específicamente, el microorganismo recombinante de la presente invención es la cepa de E. coli recombinante CA04-2004 (número de acceso: KCCM11246P).
Como se usa en el presente documento, el término "región reguladora de la expresión" del operón de triptófano endógeno significa una región que incluye un promotor, un péptido líder y un atenuador endógeno. De acuerdo con la invención, la región reguladora de la expresión tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1.
Como se usa en el presente documento, el término "péptido líder" significa un péptido de bajo peso molecular que está codificado por la secuencia líder corriente arriba del codón de inicio del gen. De acuerdo con la invención, el péptido líder tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 y un polipéptido que se expresa por el péptido líder puede ser una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 4. Este péptido líder funciona para formar la estructura de horquilla cuando la concentración de triptófano es alta, al promover así la formación de la estructura del atenuador endógeno para terminar la transcripción de genes de la biosíntesis de triptófano.
Como se usa en el presente documento, el término "eliminar" significa eliminar parte o la totalidad de una secuencia de nucleótidos desde el codón de inicio hasta el codón de parada del gen diana, o la secuencia de nucleótidos de una región reguladora del mismo, del cromosoma.
Como se usa en el presente documento, el término "atenuador endógeno" significa una región que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3, que excluye el promotor y el péptido líder en la región reguladora de la expresión que causa el mecanismo de atenuación.
Los métodos para mejorar la expresión de genes incluyen: 1) un método para aumentar el número de copias cromosómicas o intracelulares de los genes o 2) un método para reemplazar el promotor cromosómico de los genes con un promotor exógeno fuerte o modificar el promotor cromosómico a un promotor fuerte.
Los ejemplos del método para aumentar el número de copias incluyen un método para introducir el gen en un vector para mejorar la expresión del gen. Los ejemplos de un vector que puede usarse en la presente invención incluyen vectores de plásmidos tales como plásmidos de tipo pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL y pET. Los vectores que pueden usarse en la presente invención no se limitan particularmente a, y pueden usarse, cualesquiera vectores de expresión conocidos. Específicamente, pueden usarse los vectores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 o pMW118. Lo más preferente, pueden usarse los vectores pACYC177, pCL y pCC1BAC.
Mientras tanto, los ejemplos de promotores exógenos fuertes incluyen, pero no se limitan a, promotores conocidos tales como los promotores trc, lac y tac. Además, la modificación del promotor cromosómico a un promotor fuerte puede realizarse al eliminar parte o la totalidad del péptido líder y/o eliminar además parte o la totalidad del atenuador endógeno como se describe anteriormente, pero no se limita a ello.
En una modalidad específica de la presente invención, se produjo un microorganismo productor de L-triptófano recombinante del género Escherichia al eliminar parte o la totalidad del péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en la región reguladora de la expresión que tiene un secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 en el operón de triptófano endógeno y al eliminar parte o la totalidad del atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3 para aumentar la capacidad de producir L-triptófano. Además, el microorganismo productor de L-triptófano recombinante se produjo al mejorar aún más las actividades de las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NOS: 37, 38, 39 y 40, que están codificadas por el grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA que excluye el gen trpE que codifica la antranilato sintasa al aumentar el número de copias cromosómicas o intracelulares de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE. El microorganismo recombinante producido se depositó con el número de acceso KCCM11246P.
Otra modalidad de la presente invención también proporciona un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar el microorganismo productor de L-triptófano recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada descrito en el presente documento.
En un aspecto específico, la presente invención proporciona un método que comprende cultivar un microorganismo productor de L-triptófano recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada, que se ha modificado para eliminar parte o la totalidad del péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en la región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 en un operón de triptófano endógeno y eliminar parte o la totalidad del atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la s Eq ID NO: 3 de manera que para aumentar la capacidad de producir L-triptófano y mejorar aún más las actividades de las proteínas que están codificadas por el operón de triptófano al mejorar la expresión del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA, que excluye el gen trpE que codifica la antranilato sintasa al aumentar el número de copias cromosómicas o intracelulares de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE.
Los medios y las condiciones de cultivo que se usan en el cultivo del microorganismo de la presente invención pueden ser cualquiera de aquellos que se usan en el cultivo de microorganismos que pertenecen al género Escherichia, pero estos deben satisfacer adecuadamente los requisitos del microorganismo de la presente invención. Específicamente, el microorganismo de la presente invención puede cultivarse en un medio convencional que contiene fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, aminoácidos, vitaminas y similares adecuadas en condiciones aeróbicas mientras se ajusta la temperatura, el pH y similares.
Las fuentes de carbono que pueden usarse en la presente invención incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol; alcoholes tales como alcohol de azúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico y ácido cítrico y aminoácidos tales como ácido orgánico, ácido glutámico, metionina y lisina. Además, pueden usarse fuentes naturales de nutrientes orgánicos tales como hidrolizados de almidón, melaza, melaza residual, salvado de arroz, mandioca, bagazo y licor de maceración del maíz. Específicamente, pueden usarse carbohidratos tales como glucosa y melazas pretratadas estériles (es decir, melazas convertidas en azúcares reducidos). Además, pueden usarse sin limitación cantidades adecuadas de otras fuentes de carbono.
Las fuentes de nitrógeno que pueden usarse en la presente invención incluyen fuentes de nitrógeno inorgánico tales como amoníaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio, acetato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio; aminoácidos tales como ácido glutámico, metionina y glutamina y fuentes orgánicas de nitrógeno tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, licor de maíz, hidrolizado de caseína, harina de pescado o su producto digerido, torta de soja desgrasada o su producto digerido, etc. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse solas o en combinación.
El medio puede contener, como fuentes de fósforo, fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico y las sales correspondientes que contienen sodio. Los compuestos inorgánicos que pueden usarse en la presente invención incluyen cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de hierro, sulfato de magnesio, sulfato de hierro, sulfato de manganeso y carbonato de calcio. Además, el medio puede contener aminoácidos, vitaminas y precursores adecuados. Estos medios o precursores pueden añadirse al medio de manera por lotes o continua. Compuestos tales como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico pueden añadirse al medio de manera adecuada durante el cultivo para ajustar el pH del medio de cultivo. Además, durante el cultivo, puede usarse un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graso para suprimir la formación de burbujas. Además, para mantener el medio de cultivo en un estado aeróbico, puede inyectarse oxígeno o gas que contiene oxígeno en el medio de cultivo. Además, para mantener el medio de cultivo en un estado anaeróbico o no aeróbico, no se inyecta gas, o puede inyectarse nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono en el medio de cultivo.
El medio de cultivo se mantiene típicamente a una temperatura que varía de 27 °C a 37 °C y más específicamente de 30 °C a 35 °C. El cultivo del microorganismo puede continuar hasta que se obtenga el nivel deseado de la sustancia útil. Específicamente, el período de cultivo puede ser de 10-100 horas.
El método de la presente invención puede comprender, además, purificar o recuperar el L-aminoácido producido en la etapa de cultivo. El proceso de purificación o recuperación puede realizarse al purificar o recuperar el L-aminoácido deseado del medio de cultivo mediante el uso de un método adecuado, por ejemplo, un método de cultivo por lote, continuo o alimentación por lote.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalles adicionales con referencia a los ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de un vector de fusión que comprende GFP y una región reguladora de la expresión de la que se eliminó un péptido líder, para liberar una regulación de la expresión para la biosíntesis de triptófano Como se muestra en la figura 1, para amplificar una región reguladora de la expresión que comprende una eliminación del gen trpL que codifica un péptido líder (L) (la región reguladora de la expresión se denomina en lo sucesivo "DtrpL", correspondiente a la figura 1C) en una región reguladora de la expresión del operón de triptófano que está compuesto por un promotor (P), el péptido líder (L) y un atenuador (A), la reacción en cadena de la polimerasa (se denomina en lo sucesivo, "PCR") se realizó mediante el uso del ADN cromosómico de una cepa E. coli W3110 (adquirida de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC); número de acceso de GenBank AC000091) como plantilla.
Específicamente, un fragmento de 155 pb que tiene un sitio de enzima de restricción KpnI en la región 5' se amplificó mediante PCR con la polimerasa Pfu mediante el uso de los cebadores 1 y 2 en las siguientes condiciones: 30 ciclos, cada uno de los cuales que consiste en desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibridación a 58 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos. Mientras tanto, un fragmento de 105 pb que tiene un sitio de enzima de restricción EcoRVen la región 3' se amplificó por PCR mediante el uso de los cebadores 3 y 4 en las condiciones descritas anteriormente. Los fragmentos de a Dn obtenidos se recuperaron mediante el uso del estuche GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y después se usaron como plantillas para la PCR cruzada.
Para hacer el DtrpL, se realizó una PCR cruzada mediante el uso de los dos fragmentos de ADN como plantilla y los cebadores 1 y 4. Específicamente, un fragmento de 245 pb (SEQ ID NO: 5) se amplificó mediante PCR en las condiciones descritas anteriormente. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción KpnI y EcoRV y luego se ligó con pCL1920GFP (SEQ ID NO: 8) que se trató con las mismas enzimas de restricción, al construir así pCL-DtrpL GFP.
Para amplificar una región reguladora de la expresión que comprende una eliminación de los genes que codifican el péptido líder (L) y el atenuador (A) (la región reguladora de la expresión se denomina en lo sucesivo "Dtrp_att") en la región reguladora de la expresión del operón de triptófano, un fragmento de 148 pb (SEQ ID NO: 6) que tiene un sitio de la enzima de restricción KpnI en la región 5' y un sitio de la enzima de restricción EcoRV en la región 3' se amplificó por PCR mediante el uso del ADN cromosómico de la cepa E. coli W3110 como una plantilla y los cebadores 1 y 5. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción KpnI y EcoRV y luego se ligó con pCL1920GFP que se trató con las mismas enzimas de restricción, al construir así pCL-Dtrp_att-GFP.
Además, para hacer un vector que tiene una región reguladora de la expresión natural para usar como control en experimentos posteriores, un fragmento de 290 pb que tiene un sitio de la enzima de restricción KpnI en la región 5' y un sitio de la enzima de restricción EcoRV en la región 3' se amplificó por PCR mediante el uso del ADN cromosómico de la cepa E. coli W3110 como plantilla y los cebadores 1 y 4. El fragmento amplificado se trató con las enzimas de restricción KpnI y EcoRV y luego se ligó con pCL1920GFP que se trató con las mismas enzimas de restricción, al construir así pCL-Ptrp-GFP.
Cebador 1:
5' TTAGGTACCGGCGCACTCCCGTTCTGGATA 3' (SEQ ID NO: 11);
Cebador 2:
5' ACTGCCCGTTGTCGATACCCTTTTTACGT 3' (SEQ ID NO: 12);
Cebador 3:
5' TCGACAACGGGCAGTGTATTCACCATG 3' (SEQ ID NO: 13);
Cebador 4:
5' AATGATATCTGTTATTCTCTAATTTTGTT 3' (SEQ ID NO: 14);
Cebador 5:
5' AATGATATCACCCTTTTTACGTGAACTTG 3' (SEQ ID NO: 15).
Ejemplo 2: Medición del nivel de expresión de GFP
Cada uno de los vectores pCL-DtrpL_GFP, pCL-Dtrp_att-GFP y pCL-Ptrp_GFP preparados en el ejemplo 1 se transformó en E. coli W3110 natural y la cepa productora triptófano E. coli KCCM10812P y luego se midieron las intensidades de GFP en las cepas.
La cepa original E. coli KCCM10812P (registro de patente de Corea núm. 10-0792095) usada en este ejemplo es una cepa derivada de una variante de E. coli que tiene productividad de L-fenilalanina (KFCC 10066, publicación de patente de Corea núm. 1985-0001232). Específicamente, KCCM10812P es una cepa de E. coli recombinante que tiene productividad de L-triptófano, en donde la cepa se ha modificado para recuperar la auxotrofia del triptófano, para inactivar los genes pheA, trpR, mtr y tnaAB y para mutar los genes aroG y trpE.
Específicamente, cada una de las cepas se inoculó en 25 ml de medio M9 (que contiene 0,5 % de glucosa 2 g/l de extracto de levadura y además que contiene 0,1 g/l de tirosina y 0,1 g/l de fenilalanina en el caso de KCCM10812) en un matraz de 250 ml a una relación de volumen de 1/100 (v/v) y se cultivó a 37 °C hasta alcanzar una DO
predeterminada. Las cepas cultivadas se recuperaron mediante centrifugación y se lavaron una vez con 1xTE y se midió la GFP mediante el uso del lector de microplacas multimodo Synergy HT (Biotek, EE. UU.).
Los resultados de la medición se muestran en la tabla 1 a continuación. La DO1 y DO3 en la tabla 1 indican los valores de DO medidos a 600 nm mediante el uso de un espectrofotómetro UV mini-1240 (Shimadzu) después de diluir cada uno de los productos de cultivo a una concentración adecuada.
Como se muestra en la figura 1, en el caso de la cepa W3110 natural, con respecto a la Ptrp como 1, la intensidad relativa de Dtrp_att (que comprende una eliminación del péptido líder y el atenuador) fue aproximadamente 7 veces a un valor de DO de 1 (DO1) y 10 veces a un valor de DO de 3 (DO3) y la intensidad relativa de DtrpL que comprende una eliminación de solo el péptido líder fue aproximadamente 1,5-2 veces mayor que la de la región reguladora natural (Ptrp). En comparación con esto, en el caso de la cepa productora de L-triptófano KCCM 10812P, con respecto a la de Ptrp tomada como 1, la intensidad relativa de Dtrp_att (que comprende una eliminación del péptido líder y el atenuador) fue de aproximadamente 19 veces a un valor de DO de 1 (DO1) y 27 veces a un valor de DO de 3 (DO3) y la intensidad relativa de DtrpL que comprende una eliminación de solo el péptido líder fue aproximadamente 4 veces mayor que la de la región reguladora natural (Ptrp). Dichos resultados indican que la eliminación del péptido líder o del atenuador conduce a un aumento en la expresión, aunque este aumento de la expresión en la cepa natural es más débil que en la cepa productora de L-triptófano.
Tabla 1
Ejemplo 3: Construcción de vectores que tienen operón de triptófano (trpEDCBA) cuya región reguladora de la expresión fue reemplazada
En base a los resultados del ejemplo 2, para construir una cepa de E. coli cuyos genes del operón de triptófano se mejoraron mediante el uso de un vector, se amplificó un fragmento de 6564 pb (SEQ ID NO: 9) mediante el uso del ADN cromosómico de la cepa original E. coli KCCM10812P como plantilla y los cebadores 6 y 7 en las condiciones de PCR descritas anteriormente.
El fragmento de ADN amplificado se recuperó mediante el uso del estuche GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y luego se trató con las enzimas de restricción EcoRV y HindIII. Para la clonación con el fragmento de ADN preparado, cada uno de los vectores pCL-Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL_GFP y pCL-Ptrp_GFP se trató con EcoRV y HindIII para eliminar la región de GFP, al obtener así fragmentos de 4291 pb. Cada uno de los vectores preparados se ligó con el inserto y luego se introdujo en E. coli DH5a por transformación, al construir así los vectores pCL-Dtrp att-trpEDCBA, pCL-DtrpL_trpEDCBA y pCL-Ptrp_trpEDCBA.
Cebador 6:
5' CCCGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC 3' (SEQ ID NO: 16);
Cebador 7:
5' GGGAAGCTTAAAGGATCCGTGGGATTAACTGCGCGTCGCCGCTTT 3' (SEQ ID NO: 17).
Ejemplo 4: Construcción de vectores cuya región reguladora de la expresión fue reemplazada y que tenían grupo de genes de la biosíntesis de triptófano (trpDCBA) que excluyen trpE
Para construir vectores al reemplazar la región de GFP de los vectores pCL-Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL_GFP y pCL-Ptrp_GFP preparados en el ejemplo 1 con trpDCBA, cada uno de los vectores pCL Dtrp_att-GFP, pCL-DtrpL_GFP y pCL-Ptrp GFP se trató con EcoRV y HindIII para eliminar la región de GFP, al obtener así fragmentos de 4291 pb. Luego, para construir cepas de E. coli cuyos genes trpDCBA del operón de triptófano se potenciaron mediante el uso de un vector, se amplificó un fragmento de 5002 pb (SEQ ID NO: 10) por PCR mediante el uso del ADN cromosómico de la cepa original E. coli KCCM10812P como plantilla y los cebadores 7 y 8.
El fragmento de ADN amplificado se recuperó mediante el uso del estuche GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea) y luego se trató con las enzimas de restricción EcoRV y HindIII. El vector preparado y el inserto se ligaron entre sí y luego se introdujeron en E. coli DH5a por transformación, al construir así los vectores pCL-Dtrp att-trpDCBA, pCL-DtrpL_trpDCBA y pCL-Ptrp_trpDCBA.
Cebador 8:
5' AAAGATATCATGGCTGACATTCTGCTGCT 3' (SEQ ID NO: 18).
Ejemplo 5: Construcción de vectores que tienen un bajo número de copias de genes del operón de triptófano que tienen diversas regiones reguladoras de la expresión
Un vector típico que se expresa con un bajo número de copias en E. coli es pCC1BAC (Epicentre, EE. UU.). Para expresar los genes del operón de triptófano con bajo número de copias mediante el uso de este vector, los pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, pCL-DtrpL_trpEDCBA, pCL-Ptrp_trpEDCBA, pCL-Dtrp_att-trpDCBA, pCL-DtrpL_trpDCBA y pCL-Ptrp_trpDCBA preparados en los ejemplos 3 y 4 se digirieron con la enzima de restricción HindIII.
Los fragmentos de ADN resultantes se sometieron a electroforesis en agarosa y luego se cortaron de acuerdo con su tamaño y se recuperaron mediante el uso del estuche GeneAllR Expin™ GEL SV (Seúl, Corea). A continuación, cada uno de los fragmentos se ligó con el vector pCC1BAC (digerido en el sitio de HindIII) y luego se introdujo en E. coli DH5a por transformación.
Cada una de las cepas transformadas se extendió en medio sólido LB Cm (placa de agar LB cloranfenicol) y se seleccionaron las cepas que tienen resistencia a Cm, al construir así los vectores pBAC-Dtrp_att-trpEDCBA, pBAC-DtrpL_trpEDCBA, pBAC-Ptrp_trpEDCBA, pBAC-Dtrp_att-trpDCBA, pBAC-DtrpL_trpDCBA y pBAC-Ptrp_trpDCBA. Ejemplo 6: Construcción de la cepa de E. coli en la que se inactivó el gen pheA
Para construir una cepa cercana a una cepa productora de triptófano a partir de la cepa E. coli W3110 natural, el gen pheA (ID del gen en NCBI: 12934467) que codifica la corismato mutasa/prefenato deshidratasa (CM-PDT) se inactivó mediante eliminación a través de recombinación homóloga. La CM-PDT es una enzima en la primera etapa para producir fenilalanina a partir de corismato, y se usó la eliminación del gen pheA para inhibir la vía de biosíntesis de fenilalanina. Para esta eliminación se usó el método de inactivación de una etapa (desarrollado por Datsenko KA y otros), técnica de mutagénesis mediante el uso de recombinasa roja lambda (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 6 de junio de 2000;97(12):6640-5). Como marcador para confirmar la inserción en los genes, se usó el gen de resistencia al cloranfenicol de pUCprmfmloxC (publicación de patente de Corea abierta a inspección pública núm.
2009-0075549).
Se amplificó un fragmento génico de aproximadamente 1200 pb por PCR mediante el uso del vector pUCprmfmloxP como plantilla y los cebadores 9 y 10, que tienen una parte del gen pheA y una parte de la secuencia de nucleótidos del gen de resistencia al cloranfenicol del vector pUCprmfmloxP.
Cebador 9:
5'-GGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTTTTTATTGATAACAAAAAGGCAACACTAGGTGACACTATAGAACGCG -3' (SEQ ID NO: 19);
Cebador 10:
5'-AACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTTCCCCTAACTCTTTCAATTAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 20).
El fragmento de ADN obtenido por la amplificación por PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y luego se eluyó y se usó como plantilla en la PCR secundaria. La PCR secundaria se realizó de manera que las regiones 5' y 3' del fragmento de ADN primario tuviera 20 pares de bases de nucleótidos complementarios. Además, se amplificó por PCR un fragmento génico de aproximadamente 1300 pb mediante el uso del producto de PCR primario eluido como plantilla y los cebadores 11 y 12, que incluyen las regiones 5' y 3' del gen pheA. El fragmento de ADN resultante se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y luego se eluyó y se usó en recombinación.
Cebador 11:
5'-GAATGGGAGGCGTTTCGTCGTGTGAAACAGAATGCGAAGACGAACAATAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGC -3' (SEQ ID NO: 21);
Cebador 12:
5-GGCACCTTTTCATCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGGTAACAGCCCAATACCTTCATT -3' (SEQ ID NO: 22).
De acuerdo con el método desarrollado por Datsenko KA y otros, la cepa E. coli W3110 transformada con el vector pKD46 se convirtió en un estado competente y luego se transformó con el fragmento génico de 1300 pb obtenido por PCR. La cepa que tiene resistencia al cloranfenicol se seleccionó en medio LB. La PCR se realizó mediante el uso de los cebadores 13 y 14 y el producto de la amplificación de la PCR tenía un tamaño de aproximadamente 2500 pb, lo que indica que el gen pheA se eliminó en la cepa.
Cebador 13:
5'- TTGAGTGTATCGCCAACGCG -3' (SEQ ID NO: 23);
Cebador 14:
5'- AAAGCCGCGTGTTATTGCGT -3' (SEQ ID NO: 24).
El vector pKD46 se eliminó de la cepa recombinante primaria que tiene resistencia al cloranfenicol y después se introdujo un vector pJW168 en la cepa y el gen marcador de cloranfenicol se eliminó de la cepa (Gene, (2000) 247,255-264). La cepa resultante fue un producto de amplificación de aproximadamente 500 pb obtenido por PCR mediante el uso de los cebadores 13 y 14, lo que indica que se logró la eliminación del gen diana. La cepa construida se denominó "E. coli W3110 trpA1".
Ejemplo 7: Construcción de la cepa de E. coli a partir de la cual se inactivó el gen tnaAB
A partir de la cepa E. coli W3110 trpA1 construida en el ejemplo 6, el operón tnaAB (ID del gen en NCBI: 12933600, 12933602) que consiste en el gen tnaA que codifica la triptofanasa y el gen tnaB que codifica el importador de triptófano se eliminó mediante recombinación homóloga. Debido a esta eliminación, puede bloquearse la vía de degradación del triptófano después de su producción, y puede prevenirse la afluencia de triptófano que se secreta al medio en las células, al impartir así las propiedades de cepas productoras de triptófano. Para esta eliminación, se amplificó por PCR un fragmento génico de aproximadamente 1200 pb de la misma manera que se describe en el ejemplo 6 mediante el uso del vector pUCprmfmloxP como plantilla junto con los cebadores 15 y 16, que tienen una porción del gen tnaAB y una porción de la secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a cloranfenicol del vector pUCprmfmloxP. Además, el fragmento de ADN obtenido por amplificación por PCR se amplificó además por PCR en la misma manera que se describe en el ejemplo 6 mediante el uso de los cebadores 17 y 18, al obtener así un fragmento génico de 1300 pb.
Cebador 15:
5'-TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCAGCACAAAAAGGTGACACTATAGAACGCG -3' (SEQ ID NO: 25);
Cebador 16:
5'-ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGTAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 26);
Cebador 17:
5'-TGATTTCCTGAGAGGCAAGAAGCCAGCGAATGGCTGGCTTCTTGAAGGATTTAGCCAAATTTAGGTAACA -3' (SEQ ID NO: 27);
Cebador 18:
5'-AATCGGTATAGCAGATGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAATGGA -3' (SEQ ID NO: 28).
Para eliminar los genes tnaAB, la cepa E. coli W3110 trpA1 en donde se introdujo el vector pKD46 se hizo competente y se construyó en la misma manera descrita en el ejemplo 6 y luego el fragmento génico de 1300 pb obtenido por PCR se transformó en la cepa de E. coli. La cepa que tiene resistencia al cloranfenicol se seleccionó en medio LB. La PCR se realizó mediante el uso de los cebadores 19 y 20 y el producto de amplificación de la PCR tenía un tamaño de aproximadamente 5400 pb, que indica que los genes tnaAB se eliminaron en la cepa.
Cebador 19:
5'- CGGGATAAAGTAAAACCAGG -3' (SEQ ID NO: 29);
Cebador 20:
5'- CGGCGAAGGTAAGTTGATGA -3' (SEQ ID NO: 30).
El vector pKD46 se eliminó de la cepa recombinante primaria que tiene resistencia al cloranfenicol en la misma manera descrita en el ejemplo 6 y luego el gen marcador de cloranfenicol se eliminó de la cepa. La cepa resultante fue un producto de amplificación de aproximadamente 550 pb obtenido por PCR mediante el uso de los cebadores 19 y 20, que indica que se logró la eliminación del gen deseado. La cepa construida se denominó "E. coli W3110 trpA2".
Ejemplo 8: Identificación de la productividad de L-triptófano de cepas que tienen operón de triptófano que tiene diversos patrones de expresión
Las cepas de E. coli transformadas con los vectores preparados de acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 3, 4 y 5. Los efectos de la variante de E. Coli se evaluaron mediante el uso de W3110 trpA2 preparada en los ejemplos 6 y 7 como cepa original y su fuente de carbono fue glucosa.
Para evaluar el título, cada cepa se inoculó con un asa de platino y se cultivó durante la noche en medio sólido LB. Luego, se inoculó un asa de platino de cada cepa en 25 ml de medio que contenía glucosa, la composición del medio se muestra en la tabla 2 a continuación. Después de la inoculación, cada cepa se incubó a 37 °C y 200 rpm
durante 48 horas. Los resultados se muestran en la tabla 3 a continuación. Todos los resultados se registraron como el promedio de los resultados de tres matraces.
Tabla 2
___________________
Tabla 3
Como puede verse en los resultados de la tabla 3 anterior, en el caso en el que la cepa original E. coli W3110 trpA2 se transformó con una combinación de varios vectores, si solo se mejoró continuamente el operón de triptófano, no hubo efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano apareció mientras se acumulaba antranilato. Por el contrario, la cepa modificada para potenciar el operón de Trp y trpDCBA mostró un efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano junto con una disminución en la acumulación de antranilato, en comparación con la cepa en donde solo se potenció el operón de triptófano. Por lo tanto, se confirmó que una disminución en la acumulación de antranilato es una forma efectiva de aumentar el rendimiento de producción de L-triptófano en cepas productoras de triptófano.
Ejemplo 9: Identificación de la productividad de L-triptófano de cepas que tienen operón de triptófano que tiene diversos patrones de expresión
Los vectores construidos de acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos 3, 4 y 5 se introdujeron en la cepa original productora de L-triptófano E. coli KCCM10812P de acuerdo con la combinación que se muestra en la tabla 5 a continuación. Los títulos de las cepas se evaluaron mediante el uso de glucosa como una fuente de carbono. Como resultado, parece que no solo es importante la potenciación de trpDCBA, sino también la potenciación del operón de triptófano, de manera similar a los resultados del ejemplo 8. Así, se evaluaron los efectos sobre las cepas productoras de triptófano.
Para evaluar el título, cada cepa se inoculó con un asa de platino y se cultivó durante la noche en medio sólido LB. Luego, se inoculó un asa de platino de cada cepa en 25 ml de medio que contiene glucosa, la composición del
medio se muestra en la tabla 4 a continuación. Después de la inoculación, cada cepa se incubó a 37 °C y 200 rpm durante 48 horas. Los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación. Todos los resultados se registraron como el promedio de los resultados de tres matraces.
Tabla 4
________________
Tabla 5
Como puede verse en los resultados de la tabla 5 anterior, en el caso en que la cepa original E.coli KCCM10812P se transformó con una combinación de diversos vectores, si solo se mejoró continuamente el operón de triptófano, no
apareció efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano mientras se acumulaba antranilato. Por el contrario, parece que la cepa modificada al potenciar el operón mediante el uso del vector pCL y al potenciar el trpDCBA mediante el uso del vector pBAC mostró un efecto positivo en el rendimiento de producción del triptófano junto con una disminución en la acumulación de antranilato, en comparación con la cepa en la que solo se mejoró el operón de triptófano. Por lo tanto, se confirmó que una disminución en la acumulación de antranilato es una forma efectiva de aumentar el rendimiento de producción de L-triptófano en cepas productoras de triptófano.
Ejemplo 10: Construcción de cepa en donde se aumentó el número de copias del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA en el cromosoma y disminuyó la acumulación de antranilato
En base a los resultados del ejemplo 9, para aumentar el número de copias del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA en el cromosoma, se construyó un vector.
Específicamente, pCL-Dtrp att-trpDCBA descrito en el ejemplo 5 se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI para obtener Dtrp_att-trpDCBA y luego se ligó con plNT17E tratado con las mismas enzimas de restricción, al obtener así pINT17E-Patt-trpDCBA. Para introducir pINT17E-Patt-trpDCBA en la cepa original productora de triptófano E. coli KCCM10812P para aumentar el número de copias del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA, el pKD46 que se usa en el método de inactivación de una etapa (desarrollado por Datsenko KA y otros), una técnica de mutagénesis mediante el uso de recombinasa roja lambda, de acuerdo con el ejemplo 6. Como marcador para confirmar la inserción en los genes, se usó el gen de resistencia al cloranfenicol de pUCprmfmloxC. Específicamente, la cepa original, en la que se introdujo pKD46, se transformó con pINT17E-PatttrpDCBA y luego se cultivó a 37 °C durante 1-2 días para obtener colonias. Para confirmar si pINT17E-Patt-trpDCBA se insertó correctamente en el cromosoma de las colonias obtenidas, se amplificó un fragmento de aproximadamente 2000 pb por PCR mediante el uso de los cebadores 21 y 22.
Cebador 21:
5' TATTTGCTGTCACGAGCAGG 3' (SEQ ID NO: 31);
Cebador 22:
5' AGTTCCGGCATACAACCGGCTT 3' (SEQ ID NO: 32).
El pKD46 se eliminó de la cepa recombinante primaria que tiene resistencia al cloranfenicol y luego se introdujo el plásmido pJW168 para eliminar el gen marcador de cloranfenicol de la cepa (Gene, (2000) 247, 255-264). Un producto de amplificación de aproximadamente 5000 pb obtenido por PCR mediante el uso de los cebadores 23 y 24 y un producto de amplificación de aproximadamente 6500 pb obtenido por PCR mediante el uso de los cebadores 25 y 26, demostró que trpDCBA se coloca continuamente al seguir el operón de triptófano que se coloca endógenamente en el cromosoma. Esta cepa se denominó "KCCM10812P/ trpDCBA".
Cebador 23:
5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' (SEQ ID NO: 33);
Cebador 24:
5' CTGTTGGGCGGAAAAATGAC 3' (SEQ ID NO: 34);
Cebador 25:
5' TGATCGCCAGGGTGCCGACG 3' (SEQ ID NO: 35);
Cebador 26:
5' CCCTATAGTGAGTCGTATTA 3' (SEQ ID NO: 36).
Para insertar adicionalmente una copia en la cepa preparada anteriormente en la que se incrementó el número de copias de trpDCBA, se introdujo el pKD46 en la cepa KCCM10812P/trpDCBA preparada anteriormente. Luego, el vector pINT17E-Patt-trpDCBA se introdujo en KCCM10812P/trpDCBA/pKD46, al construir así una cepa que tiene dos copias de trpDCBA insertadas en el cromosoma. Esta cepa construida se denominó "KCCM10812P/2trpDCBA". Esta cepa se depositó en el Centro de cultivo de microorganismos de Corea (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemungu, Seúl, Corea), una autoridad de depósito internacional, el 29 de diciembre de 2011 con el número de acceso KCCM11246P.
Ejemplo 11: Examen del efecto de la cepa productora de L-triptófano que tiene actividades aumentadas de proteínas que están codificadas por el grupo de genes de la biosíntesis de triptófano trpDCBA
De acuerdo con el método descrito en el ejemplo 10, se evaluó el título de KCCM10812P/trpDCBA mediante el uso de glucosa como fuente de carbono. El KCCM10812P/trpDCBA se obtuvo mediante la introducción adicional de trpDCBA en la cepa productora de triptófano E. coli KCCM10812P para mejorar las actividades de algunas enzimas de la vía de biosíntesis del triptófano.
Para evaluar el título, la cepa se inoculó mediante un asa de platino y se cultivó durante la noche en medio sólido LB. Luego, se inoculó un asa de platino del cultivo de la cepa en 25 ml de un medio de titulación en matraz, la composición del medio se muestra en la tabla 4 anterior. Después de la inoculación, la cepa se cultivó a 37 °C y 200
Claims (7)
1. Un microorganismo recombinante del género Escherichia que tiene una productividad de L-triptófano mejorada, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación en una región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un péptido líder que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en una región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 de un operón de triptófano endógeno, en donde el microorganismo recombinante también se modifica para tener un número de copias cromosómicas o intracelulares aumentado de los genes del operón de triptófano trpD, trpC, trpB y trpA, pero no trpE, para mejorar así la actividad del grupo de genes de la biosíntesis de triptófano, excepto para la antranilato sintasa que está codificada por el gen trpE en comparación con el correspondiente microorganismo de Escherichia natural.
2. El microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación adicional a la región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3 en la región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1.
3. El microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen trpD codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37, el gen trpC codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 38, el gen trpB codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39, y el gen trpA codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40.
4. El microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo recombinante es una cepa de E. coli.
5. Un método para producir L-triptófano, que comprende cultivar el microorganismo recombinante como se reivindica en la reivindicación 1 en condiciones adecuadas para la producción de L-triptófano.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el microorganismo recombinante tiene una modificación adicional a la región reguladora de la expresión del operón de triptófano, en donde la modificación es una eliminación parcial o total de un atenuador endógeno que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3 en la región reguladora de la expresión que tiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el microorganismo recombinante es una cepa de E.
coli.
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