ES2643442T3 - Microorganismo que presenta productividad de L-triptófano y método para la producción del L-triptófano mediante la utilización del mismo - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Microorganismo que presenta productividad de L-triptofano y metodo para la produccion del L-triptofano mediante la utilizacion del mismo

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un microorganismo recombinante que presenta una productividad de L-triptofano mejorada y a un metodo de produccion de L-triptofano que utiliza el microorganismo.

Antecedentes de la tecnica

El L-triptofano, un tipo de aminoacido esencial, ha sido ampliamente utilizado como aditivo para piensos y alimentos. El L-triptofano es producido generalmente mediante fermentacion utilizando microorganismos del genero Corynebacterium, Bacillus o Escherichia, y variantes de los mismos. El triptofano se biosintetiza a partir del acido consmico, que es un intermediario comun de la smtesis de los aminoacidos aromaticos. Espedficamente, el L- triptofano es biosintetizado por la accion de cinco enzimas, los cuales son sintetizados por el operon triptofano trpEDCBA a partir del acido consmico producido mediante la ruta comun del acido shikfmico que parte del fosfoenolpiruvato y la D-eritrosa-4-fosfato. En primer lugar, la antranilato sintasa (complejo TrpE-TrpD) actua sobre el acido consmico, sintetizando el acido antramlico, seguido de la accion sobre este de la antranilato fosforibosiltransferasa (TrpD) para sintetizar N-(5'-fosforibosil)-antranilato. A continuacion, la fosforibosilantranilato isomerasa (TrpC) y la indol-3-glicerol fosfato sintasa (TrpC) actuan sobre el N-(5'-fosforibosil)-antranilato, sintetizando indol-3-glicerol-fosfato, seguido de la accion sobre el mismo de la triptofano sintasa (complejo TrpB- TrpA) para sintetizar L-triptofano (fig. 1; Bonggaerts et al., Metab. Eng. 3:289-300, 2O0I).

En E. coli, una protema codificada por un complejo de los genes trpE y trpD forma la antranilato sintasa, sintetizando acido antramlico. El acido antramlico sintetizado reacciona con 5-fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP) mediante la antranilato fosforibosiltransferasa, codificada por el gen trpD, sintetizando de esta manera N-(5'-fosforibosil)- antranilato.

En la presente memoria, la protema codificada por el gen trpD actua como antranilato sintasa en combinacion con la protema codificada por el gen trpE o actua sola como antranilato fosforibosiltransferasa y una cepa de E. coli de tipo salvaje mantiene el equilibrio de dichas dos acciones.

En una cepa de E. coli de tipo salvaje, la concentracion de PRPP que se utiliza como cofactor en la biosmtesis intracelular de triptofano es de aproximadamente 180 pM (Bennett et al., Nat. Chem. Biol. 5:595-599, 2009). En una cepa productora de L-triptofano con biosmtesis mejorada del acido antramlico, la concentracion acumulada extracelularmente de acido intramlico presenta el valor maximo, mientras que la concentracion intracelular de PRPP es muy inferior a la concentracion de acido antramlico. La concentracion baja de PRPP actua como factor limitante en la produccion de N-(5'-fosforibosil)-antranilato, reduciendo la tasa global de smtesis de L-triptofano e incrementando la acumulacion intracelular y extracelular de acido antramlico. De esta manera, la utilizacion de una antranilato fosforibosiltransferasa con afinidad mas alta para PRPP permite evitar la acumulacion intracelular y extracelular del acido antramlico e incrementa la tasa de biosmtesis de L-triptofano.

Entre los informes previos sobre la mejora de las cepas productoras de L-triptofano, todavfa no se encuentra ningun informe de una tecnologfa de mejora de la ruta de biosmtesis que mantenga simultaneamente el equilibrio entre las actividades de la antranilato sintasa y la antranilato fosforibosiltransferasa.

Segun algunos estudios, el valor de Km de E. coli para PRPP es de 50, mientras que el valor de Km de levadura para PRPP es de aproximadamente 22,4±2,6 (Hommel et al., Eur. J. Biochem. 180:33-40, 1989). De esta manera, la afinidad de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura para PRPP es mas elevada que la de la antranilato fosforibosiltransferasa de E. coli. De esta manera, se espera que la utilizacion de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura presentara mayores efectos sobre la prevencion de la acumulacion intracelular y extracelular del acido antramlico e incrementara la biosmtesis del L-triptofano en microorganismos con rutas mejoradas de biosmtesis de L-triptofano.

Durante un intento de mejorar la ruta de biosmtesis del acido consmico y la ruta del operon trp en E. coli para producir una gran cantidad de L-triptofano industrialmente util, los presentes inventores encontraron que, al mejorar las dos rutas anteriormente indicadas, se acumulaba acido antramlico intracelular y extracelularmente, y por este motivo, se produda un cultivo anormal. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los presentes inventores continuaron investigando con la esperanza de que la mejora de la expresion de la antranilato fosforibosiltransferasa en microorganismos con una ruta mejorada de biosmtesis del L-triptofano pudiese evitar la acumulacion intracelular y extracelular de acido intramlico e incrementar la biosmtesis de L-triptofano, completando de esta manera la presente invencion.

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Exposicion Problema tecnico

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar un microorganismo con productividad mejorada de L-triptofano, de expresion mejorada de antranilato fosforibosiltransferasa de levadura (trp4).

Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo de produccion de L-triptofano que utilice el microorganismo anteriormente indicado.

Solucion tecnica

Con el fin de llevar a cabo los objetivos anteriormente indicados, la presente invencion proporciona un microorganismo del genero Escherichia que presenta una productividad mejorada de L-triptofano y que ha sido modificado para expresar antranilato fosforibosiltransferasa de levadura.

La presente invencion proporciona ademas un metodo para producir L-triptofano, comprendiendo el metodo las etapas de cultivar el microorganismo del genero Escherichia y recuperar L-triptofano a partir del cultivo.

Efectos ventajosos

El microorganismo segun la presente invencion puede producir L-triptofano con un alto rendimiento y, de esta manera, puede utilizarse ventajosamente en la industria farmaceutica y en la industria de los piensos, en particular en el campo de los piensos animales.

Descripcion de los dibujos

La fig. 1 es una vista esquematica que muestra la ruta de biosmtesis del L-triptofano en E. coli y las protemas que participan en la misma.

La fig. 2 muestra la homologfa de secuencia de aminoacidos de las antranilato fosforibosiltransferasas de levadura.

La fig. 3 muestra los vectores pCL-Pcji-trpD y pCL-Pcji-trp4.

La fig. 4 muestra una comparacion entre la productividad de L-triptofano tras 40 horas de fermentacion en una cepa parental productora de L-triptofano y en una cepa transformada con el vector pCL-Pcji-trpD o pCL-Pcji- trp4.

La fig. 5 muestra una comparacion entre la acumulacion del precursor del triptofano llamado acido antramlico tras la fermentacion en una cepa parental productora de L-triptofano y en una cepa transformada con el vector pCL- Pcji-trpD o pCL-Pcji-trp4.

La fig. 6 muestra una comparacion entre la productividad de L-triptofano a las 40 horas de fermentacion en una cepa parental productora de L-triptofano y cepas que presentan un casete de expresion de gen trp4 insertado en el genoma.

La fig. 7 muestra una comparacion entre la acumulacion de acido antramlico tras la fermentacion en una cepa parental productora de L-triptofano y cepas que presentan un casete de expresion de gen trp4 insertado en el genoma.

Modo de la invencion

A continuacion en la presente memoria se describe en detalle la presente invencion.

La presente invencion proporciona un microorganismo del genero Escherichia que presenta una productividad mejorada de L-triptofano, que ha sido modificado para expresar antranilato fosforibosiltransferasa de levadura.

La antranilato fosforibosiltransferasa es un enzima que sintetiza fosforibosil antranilato utilizando acido antramlico y PRPP. En cepas que presentan una productividad mejorada de L-triptofano, la smtesis de acido consmico se incrementa mediante una ruta mejorada del acido shikfmico, resultando en un incremento del acido antramlico. El incremento de la cantidad de acido antramlico se acumula intracelular y extracelularmente, interfiriendo con la actividad fisiologica normal de las celulas e inhibiendo de esta manera la produccion de L-triptofano.

De esta manera, la presente invencion pretende evitar la acumulacion intracelular y extracelular de acido antramlico mediante la mejora de la expresion de la antranilato fosforibosiltransferasa, incrementando de esta manera la biosmtesis de L-triptofano.

En la presente memoria, la presente invencion esta destinada a incrementar adicionalmente la tasa de smtesis de fosforibosil antranilato mediante la utilizacion de antranilato fosforibosiltransferasa de levadura con una afinidad mas elevada para PRPP respecto a una antranilato fosforibosiltransferasa que esta codificada por el gen trpD en E. coli.

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La antranilato fosforibosiltransferasa que se utiliza en la presente invencion se deriva de una levadura y puede observarse que las antranilato fosforibosiltransferasas de diversas especies de levadura presentan una homologfa de secuencias de aminoacidos de 87% o superior (fig. 2). Espedficamente, la antranilato fosforibosiltransferasa que se utiliza en la presente invencion presenta una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1. Sin embargo, la antranilato fosforibosiltransferasa que se utiliza en la presente invencion no se encuentra limitada a la misma, debido a que la secuencia de aminoacidos de un enzima que muestra actividad de antranilato fosforibosiltransferasa puede diferir dependiendo de la especie o cepa de microorganismo. Espedficamente, la antranilato fosforibosiltransferasa que se utiliza en la presente invencion puede ser una variante mutante o artificial que codifica un polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos que comprende una sustitucion, delecion, insercion o adicion de uno o varios aminoacidos en una o mas posiciones de la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 1 o una mutacion silenciosa que provoca un cambio en un aminoacido similar, con la condicion de que la actividad de la antranilato fosforibosiltransferasa pueda mantenerse o incrementarse. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion “varios aminoacidos” se refiere a 2 a 20 aminoacidos, preferentemente 2 a 10 aminoacidos, y mas preferentemente 2 a 5 aminoacidos, dependiendo del tipo o posiciones de los residuos aminoacidos en la estructura tridimensional de la protema. Ademas, las sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de aminoacidos pueden incluir mutantes naturales o variantes artificiales, basadas en diferencias individuales y/o diferencias entre especies del microorganismo que presentan antranilato fosforibosiltransferasa de levadura.

En la presente invencion, la mejora de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura puede conseguirse mediante transformacion con un vector que comprende un polinucleotido codificante de antranilato fosforibosiltransferasa de levadura o mediante insercion del polinucleotido en el cromosoma.

El polinucleotido codificante de antranilato fosforibosiltransferasa de levadura esta representado por la SEC ID n° 9. El polinucleotido puede transformarse en una celula huesped. Para ello, el polinucleotido puede sustituirse con un codon favorecido por la celula huesped, o el extremo N-terminal o C-terminal del mismo puede extenderse o eliminarse, o el codon de inicio del mismo puede modificarse para controlar el nivel de expresion. De esta manera, el polinucleotido de la presente invencion puede presentar una secuencia polinucleotida codificante de una protema que presenta una homologfa de por lo menos 80%, espedficamente de por lo menos 90%, mas espedficamente de por lo menos 95%, en particular espedficamente de por lo menos 97%, respecto a la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 1, con la condicion de que pueda mantener o potenciar la actividad de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura de la variante de la presente invencion. Mas espedficamente, el polinucleotido de la presente invencion puede presentar una secuencia polinucleotida representada por la SEC ID n° 9.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “homologfa” se refiere a la identidad entre dos secuencias de aminoacidos. La homologfa puede determinarse utilizando metodos bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, BLAST 2.0, que calcula parametros tales como la puntuacion, la identidad o la similitud.

Ademas, la secuencia polinucleotida segun la presente invencion puede ser una variante codificante de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura, que puede hibridarse con la secuencia polinucleotida de SEC ID n° 9 o una sonda derivada de la secuencia polinucleotida bajo condiciones restrictivas y que normalmente funciona.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion “condiciones restrictivas” se refiere a condiciones que permiten la hibridacion espedfica entre polinucleotidos. Dichas condiciones restrictivas se describen en detalle en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., editores, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 o en Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, Inc., New York, que describen, por ejemplo, la hibridacion en un tampon de hibridacion (3,5 X SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albumina de suero bovino al 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM) a 65°C. En la presente memoria, SSC es cloruro sodico 0,15 M/citrato sodico 0,15 M (pH 7). Tras la hibridacion, la membrana a la que se transfiere ADN se lava con 2 X SSC a temperatura ambiente y despues se lava con 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a una temperatura de 68°C.

El vector que se utiliza en la presente invencion no se encuentra espedficamente limitado y puede ser cualquier vector conocido de la tecnica, con la condicion de que pueda replicarse en un huesped. Entre los ejemplos de vectores que se utilizan comunmente se incluyen plasmidos, cosmidos, virus y bacteriofagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, el vector fago o vector cosmido que se utiliza en la presente invencion puede ser pWE15, M13, AMBL3, AMBL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, AT11, Charon4A, Charon21A o similar, y el vector plasmido que se utiliza en la presente invencion puede ser de tipo pBR, de tipo pUC, de tipo pBluescriptII, de tipo pGEM, de tipo pTZ, de tipo pCL, de tipo pET o similar. Mas preferentemente, puede utilizarse un vector pACYC177, pCL o pCC1BAC.

Ademas, puede insertarse un nuevo polinucleotido codificante de una protema diana en un locus genetico espedfico en el cromosoma mediante un fragmento de ADN que comprende un polinucleotido para la insercion en el cromosoma bacteriano. La insercion del nuevo polinucleotido en el cromosoma puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido de la tecnica, por ejemplo mediante recombinacion homologa. El polinucleotido para la insercion en el cromosoma segun la presente invencion puede comprender ademas un marcador de seleccion para confirmar si el polinucleotido ha sido insertado en el cromosoma, debido a que puede insertarse en el cromosoma

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mediante recombinacion homologa. El marcador de seleccion puede utilizarse para seleccionar celulas transformadas, es decir, para confirmar si el polinucleotido de interes ha sido insertado. De esta manera, en la presente invencion pueden utilizarse marcadores que confieren fenotipos seleccionables, tales como la resistencia a farmacos, la auxotrofia, la resistencia a agentes citotoxicos o la expresion de protemas de superficie. En un medio tratado con un agente selectivo, solo las celulas que expresan el marcador de seleccion sobreviven o muestran un fenotipo diferente y de esta manera pueden seleccionarse las celulas transformadas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “transformacion” se refiere a introducir un vector que comprende un polinucleotido codificante de una protema diana en una celula huesped de manera que sea capaz de expresar una protema codificada por el polinucleotido en la celula huesped. El polinucleotido transformado puede insertarse y localizarse en el cromosoma de la celula huesped o localizarse fuera del cromosoma, con la condicion de que pueda expresarse en la celula huesped. Ademas, los polinucleotidos incluyen ADN y ARN que codifica la protema diana. Con la condicion de que el polinucleotido pueda introducirse en la celula huesped y expresarse en la misma, puede introducirse en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleotido puede introducirse en la celula huesped en forma de un casete de expresion que es un constructo polinucleotido que incluye todos los elementos necesarios para la autoexpresion. El casete de expresion generalmente incluye un promotor que se encuentra operablemente ligado al marco de lectura abierta (en lo sucesivo en la presente memoria abreviado como “ORF”, por sus siglas en ingles) del gen, una senal de terminacion de transcripcion, un sitio de union ribosomica y una senal de terminacion de la traduccion. El promotor que se utiliza en la presente invencion no se encuentra espedficamente limitado y puede ser cualquier promotor conocido de la tecnica, con la condicion de que inicie la transcripcion del polinucleotido codificante de la protema diana en la celula huesped. Espedficamente, puede utilizarse el promotor de T7, el promotor trc, el promotor tac, el promotor CJ1 (patente coreana n° 0620092), etc. Mas espedficamente, puede utilizarse el promotor trc o el promotor CJ1.

El casete de expresion puede encontrarse en forma de un vector de expresion autorreplicable. Ademas, el polinucleotido puede introducirse en la celula huesped por sf solo y ligarse operablemente a la secuencia necesaria para la expresion en la celula huesped.

El microorganismo de la presente invencion incluye cualquier organismo procariotico, con la condicion de que pueda producir L-triptofano. Por ejemplo, puede incluir un microorganismo perteneciente al genero Escherichia, el genero Erwinia, el genero Serratia, el genero Providencia, el genero Corynebacterium o el genero Brevibacterium. Espedficamente, el microorganismo de la presente invencion es un microorganismo perteneciente al genero Escherichia. Mas espedficamente, es Escherichia coli.

Con el fin de que el microorganismo de la presente invencion produzca L-triptofano, la actividad de por lo menos un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste de antranilato sintasa (trpE), fosfoglicerato deshidrogenasa (serA), 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa (aroG), 3-deshidroquinato sintasa (aroB), shikimato deshidrogenasa (aroE), shikimato quinasa (aroL), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (aroA), corismato sintasa (aroC), prefenato deshidratasa, corismato mutasa y triptofano sintasa (trpAB), en el microorganismo, puede potenciarse adicionalmente, o la actividad de la corismato mutasa/prefenato deshidratasa o corismato mutasa/prefenato deshidrogenasa en el microorganismo puede atenuarse adicionalmente. Ademas, el microorganismo de la presente invencion puede modificarse de manera que uno o mas de antranilato sintasa y fosfoglicerato deshidrogenasa se liberen de la inhibicion por retroalimentacion por L-triptofano y L-serina.

En un ejemplo espedfico de la presente invencion, se transformo E. coli con un vector que comprendfa el gen (trp4) codificante de la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura representada por la SEC ID n° 1 y la cepa construida se denomino CA04-2006 y se deposito en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Honje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Corea del Sur)), una autoridad internacional de depositos, el 8 de abril de 2013, bajo el numero de acceso KCCM11408P.

Ademas, la presente invencion proporciona un metodo para producir L-triptofano, que comprende las etapas de: cultivar un microorganismo del genero Escherichia que presenta productividad de L-triptofano, que ha sido modificado para expresar una antranilato fosforibosiltransferasa de levadura que presenta la secuencia de aminoacidos indicada en SEC ID n° 1 y recuperar el L-triptofano a partir del cultivo.

El procedimiento de cultivo en la presente invencion puede llevarse a cabo en medio adecuado y bajo condiciones de cultivo conocidas de la tecnica. Este procedimiento de cultivo puede ser facilmente modificado por cualquier experto en la materia segun el tipo de cepa seleccionada. Entre los ejemplos del procedimiento de cultivo se incluyen, aunque sin limitacion, cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo alimentado por lotes.

El medio y las condiciones de cultivo que se utilizan en el cultivo del microorganismo de la presente invencion pueden ser cualesquiera de los utilizados generalmente en el cultivo de microorganismos del genero Escherichia, aunque deben satisfacer correctamente los requisitos del microorganismo de la presente invencion.

En una realizacion espedfica, el microorganismo de la presente invencion puede cultivarse en un medio convencional que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, aminoacidos, vitaminas y similares

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adecuados, bajo condiciones aerobicas, ajustando simultaneamente la temperatura, el pH y similares.

Entre las fuentes de carbono que pueden utilizarse en la presente invencion se incluyen carbohidratos, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, sorbitol, alcoholes y acidos organicos, tales como alcohol de azucar, glicerol, acido piruvico, acido lactico y acido cftrico, y aminoacidos, tales como acido glutamico, metionina y lisina, aunque no se encuentran limitadas a ellos. Ademas, pueden utilizarse fuentes de nutrientes organicos naturales, tales como hidrolizados de almidon, melaza, melaza residual, salvado de arroz, mandioca, bagazo y licor de maceracion del mafz, aunque sin limitacion de las mismas. Espedficamente, pueden utilizarse carbohidratos tales como glucosa y melazas pretratadas esteriles (es decir, melazas convertidas en azucares reducidos), aunque sin limitacion a los mismos. Ademas, pueden utilizarse sin limitacion cantidades adecuadas de otras fuentes de carbono. Entre las fuentes de nitrogeno que pueden utilizarse en la presente invencion se incluyen fuentes de nitrogeno inorganico, tales como amonio, sulfato amonico, cloruro amonico, acetato amonico, carbonato amonico y nitrato amonico; aminoacidos, tales como acido glutamico, metionina y glutamina, y fuentes de nitrogeno organico, tales como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura, extracto de malta, licor de maceracion del mafz, hidrolizado de casema, harina de pescado o su producto digerido, torta de soja desgrasada o su producto digerido, etc. Estas fuentes de nitrogeno pueden utilizarse solas o en combinacion, aunque sin limitacion a las mismas. El medio puede contener, como fuentes de fosforo, fosfato de potasio monobasico, fosfato de potasio dibasico y las sales correspondientes que contienen sodio. El medio puede contener compuestos inorganicos puede contener cloruro sodico, cloruro de calcio, cloruro ferrico, sulfato de magnesio, sulfato ferrico, sulfato de manganeso y carbonato de calcio, aunque sin limitacion a los mismos. Ademas, el medio puede contener aminoacidos, vitaminas y precursores adecuados. Estas fuentes o precursores pueden anadirse al medio por lotes o en continuo.

Pueden anadirse al medio durante el cultivo de una manera adecuada, compuestos tales como hidroxido amonico, hidroxido de potasio, amonio, acido fosforico y acido sulfurico para ajustar el pH del medio de cultivo. Ademas, durante el cultivo, puede utilizarse un agente antiespumante, tal como ester de poliglicol de acido graso, para suprimir la formacion de burbujas. Ademas, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado aerobico, puede inyectarse en el medio de cultivo oxfgeno o gas que contiene oxfgeno. Ademas, con el fin de mantener el medio de cultivo en un estado anaerobico o no aerobico, no se inyecta ningun gas, o puede inyectarse gas nitrogeno, hidrogeno o dioxido de carbono, al medio de cultivo. El medio de cultivo tfpicamente se mantiene a una temperatura de entre 27°C y 37°C, y espedficamente de entre 30°C y 35°C. El cultivo del microorganismo puede continuarse hasta obtener el nivel deseado de la sustancia util. Espedficamente, el periodo de cultivo puede ser de entre 10 y 100 horas.

El metodo de la presente invencion puede comprender ademas purificar o recuperar el L-triptofano producido en la etapa de cultivo. El procedimiento de purificacion o recuperacion puede llevarse a cabo mediante la purificacion o recuperacion del L-triptofano deseado a partir del medio de cultivo utilizando un metodo adecuado, por ejemplo un metodo de cultivo por lotes, continuo o alimentado por lotes.

En lo sucesivo en la presente memoria, la presente invencion se describira en mayor detalle haciendo referencia a ejemplos. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos se proporcionan con fin ilustrativo y no pretenden ser limitativos del alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: construccion de vector recombinante que comprende el promotor CJ1 y el gen trpD de E. coli o el gen trp4 de una levadura

1-1: preparacion de fragmento de promotor CJ1

Con el fin de obtener un fragmento de ADN que comprende el promotor CJ1, se llevo a cabo una reaccion en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo abreviada “PCR”) utilizando, a modo de molde, el plasmido pECCG117-CJ1 ((patente US n° 8048648) que comprende el promotor CJ1. La reaccion de PCR se llevo a cabo utilizando un kit de premezcla de PCR HL (BIONEER, en lo sucesivo) y cebadores de SEC ID n° 2 y 3 bajo las condiciones siguientes: 30 ciclos, consistiendo cada uno de desnaturalizacion a 94°C durante 30 s, hibridacion a 55°C durante 30 s y alargamiento a 72°C durante 30 s.

El producto de PCR (en lo sucesivo en la presente memoria denominado “fragmento PCJ1”) se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 1% y despues se recogio una banda con el tamano deseado mediante elucion.

1-2: preparacion de fragmentos de los genes trpD y trp4

Con el fin de obtener el ORF del gen trpD, se obtuvo la cepa W3110 derivada de E. coli K-12 de tipo salvaje del Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos y con el fin de obtener el ORF del gen trp4, se obtuvo una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) del American Type Culture Collection.

A partir de las cepas se prepararon ADN genomicos utilizando un kit de extraccion de ADN genomico (QIAGEN). Utilizando el ADN genomico de E. coli a modo de molde, se amplifico un fragmento de ADN (1.607 pb) correspondiente al ORF del gen trpD de SEC ID n° 6 mediante PCR utilizando los cebadores de SEC ID n° 4 y n° 5.

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Ademas, utilizando el ADN genomico de una levadura, se amplifico un fragmento de ADN (1.154 pb) correspondiente al ORF del gen trp4 de SEC ID n° 9 mediante PCR utilizando los cebadores de SEC ID n° 7 y n° 8. Los productos de PCR (en lo sucesivo denominados “fragmento de trpD’ y “fragmento de trp4", respectivamente) se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y despues se recogieron mediante elucion las bandas que presentaban el tamano deseado.

1-3: construccion de los vectores recombinantes pCL-Pn.n-trpD y pCL-Pc.n-trp4

El fragmento Pcji preparado en el Ejemplo 1-1 y un vector pCL1920 se trataron con el enzima de restriccion EcoRI y despues se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Cada uno de los fragmentos de ADN se ligo en el vector utilizando un kit de ligacion rapida de ADN (ROCHE en lo sucesivo) durante 30 minutos y despues se transformo en celulas de E. coli DH5a en una placa LB que contema espectinomicina y se seleccionaron las celulas transformadas.

Las celulas seleccionadas se inocularon en 20 ml de medio lfquido LB que contema espectinomicina con un asa de platino y se cultivaron durante la noche, despues de lo cual se recolecto un ADN plasirndico utilizando un kit de extraccion plasirndica (QIAGEN en lo sucesivo). Se determino el tamano del vector recombinante mediante tratamiento con el enzima de restriccion EcoRI (datos no mostrados) y se identifico el clon mediante la realizacion de un PCR utilizando los cebadores de SEC ID n° 2 y n° 3. El vector recombinante se denomino "pCL- Pcj1".

El fragmento de trpD o el fragmento de trp4 preparados en el Ejemplo 1-2 y el vector pCL-P. se trataron con los enzimas de restriccion EcoRV y PstI, y despues se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se ligo cada uno de los fragmentos de ADN en el vector utilizando un kit de ligacion rapida de ADN (ROCHE, en lo sucesivo) durante 30 minutos y despues se transformaron en celulas de E. coli DH5a. Las celulas transformadas se seleccionaron de la manera indicada anteriormente y se recolecto un ADN plasirndico de la manera indicada anteriormente. Se determinaron los tamanos de los vectores recombinantes mediante el tratamiento con los enzimas de restriccion EcoRI y PstI (datos no mostrados) y se identificaron los clones mediante la realizacion de PCR utilizando los cebadores de SEC ID n° 2 y n° 5. Los vectores recombinantes eran "pCL-Poj1-trpD" y "pCL-Poj1-trp4", respectivamente (fig. 3).

Ejemplo 2: construccion de cepa productora de L-triptofano transformada con el vector recombinante pCL- Pn.n-trpD or pCL-Pn.i1-trp4

Se introdujo cada uno de los vectores recombinantes pCL-Poj-i-trpD y pCL-Poj1-trp4 construidos en el Ejemplo 1, en una cepa parental productora de L-triptofano utilizando reactivo TSS (por sus siglas en ingles, solucion de transformacion y almacenamiento) suministrado por EPICENTRE.

En el presente ejemplo, se utilizo E. coli KCCM11166P como cepa parental productora de L-triptofano. E. coli KCCM11166P es una cepa productora de L-triptofano construida a partir de E. coli KCCM10812P (patente coreana n° 10-0792095) y se caracteriza porque el gen tehB cromosomico ha sido inactivo y la actividad de la NAD quinasa ha sido incrementada (publicacion de patente coreana abierta a inspeccion publica n° 10-2012-0083795).

Se inoculo un asa de platino de la cepa parental productora de L-triptofano en 4 ml de medio LB y se cultivo durante 3 horas, seguido de centrifugacion. Se anadieron 50 ng del vector plasmido pCL-Poj-i-trpD o del vector plasmido pCL-Poj1-trp4 y 100 pl de reactivo TSS y se mezclaron suficientemente con las celulas separadas. A continuacion, se introdujeron las celulas en la cepa parental productora de L-triptofano mediante una tecnica de transformacion en una sola etapa (Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2172-2175, 1989), y las cepas se sembraron en una placa con LB que contema espectinomicina y se seleccionaron las cepas transformadas. Para confirmar las cepas transformadas, se aislo ADN plasirndico a partir de las cepas transformadas y se trataron con enzimas de restriccion y se sometieron a PCR de la manera indicada en el Ejemplo 1-3. Las cepas transformadas se denominaron "Con/pCL-PCj1-trpD" y "Con/pCL-PCj1-trp4", respectivamente.

Ejemplo 3: comparacion de la productividad de L-triptofano y la actividad fisiologica de diferentes cepas transformadas

Las cepas transformadas que se prepararon en el Ejemplo 2 se cultivaron en matraces Erlenmeyer utilizando el medio de titulacion de triptofano mostrado en la Tabla 1, a continuacion, y se analizaron las productividades de L- triptofano de las mismas.

Tabla 1: composicion del medio producto de L-triptofano (por cada litro)

Componente

Contenido (g/l)

Glucosa

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KH2PO4

0,3

K2HPO4

0,6

(NH4)2SO4

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MgsO4-7H2O

1

Citrato sodico

5

Extracto de levadura

2,5

L-tirosina

0,1

L-fenilalanina

0,15

NaCl

2,5

Carbonato de calcio

40

Se inoculo un asa de platino de cada una de las cepas parental productora de L-triptofano (Con), Con/pCL-Poj1-trpD yCon/pCL-Pcji-trp4 cultivadas durante la noche en medio LB solido en un incubador a 37°C, en 25 ml del medio de titulacion mostrado en la Tabla 1, anteriormente, y despues se cultivo cada una de las cepas en un incubador a 37°C y a 200 rpm durante 40 horas. Se muestran los resultados en las Tablas 2 y 3, a continuacion.

Tabla 2: comparacion entre la productividad de triptofano de la cepa productora de L-triptofano y la cepa que

expresaba el gen trpD o el gen trp4 en un vector

Cepa

L-triptofano (g/l) acido antramlico (mg/l)

Con/pCL

6,9±0,5 722±62

Con/pCL-Poj1-trpD

8,0±0,4 42±13

Con/pCL-Poj1-trp4

10,3±2,4 28±1

Tabla 3: comparacion entre la actividad fisiologica de la cepa productora de L-triptofano y la cepa que expresaba el

gen trpD o el gen trp4 en un vector

Cepa

Densidad celular (DO600) Tasa de consumo de glucosa (g/l-h-1)

Con/pCL

18,2±0,7 1,78±0,03

Con/pCL-Poj1-trpD

19,1±1,4 1,76±0,05

Con/pCL-Poj1-trp4

20,7±1,5 1,67±0,06

Tal como puede observarse en la Tabla 2, anteriormente, la cepa parental productora de L-triptofano produjo 6,9 g/l de L-triptofano durante 40 horas de cultivo pero las cepas Con/pCL-Pcji-trp4 y Con/pCL-Pcji-trp4 produjeron 8,0 g/l y 10,3 g/l de L-triptofano, respectivamente, y de esta manera, mostraron incrementos de productividad de L- triptofano de 1,1 g/l y 3,4 g/l, respectivamente, en comparacion con la cepa parental (incrementos de 16% y 49%, respectivamente).

Ademas, tal como puede observarse en la Tabla 3, anteriormente, las cepas transformadas eran similares a la cepa parental productora de L-triptofano en terminos de tasa de consumo de glucosa o crecimiento celular, y la acumulacion del producto secundario de la fermentacion acetato en la cepa transformada tambien era similar o inferior a la observada en la cepa parental productora de L-triptofano (datos no mostrados). De esta manera, pudo observarse que las cepas transformadas mostraban una actividad fisiologica sustancialmente similar a la de la cepa parental productora de L-triptofano.

En particular, en la cepa parental productora de L-triptofano, con frecuencia aparece el fenomeno de que no se mantiene la fermentacion normal debido a la fermentacion anormal que implica la acumulacion del acido antramlico durante la misma. De esta manera, durante la fermentacion de la cepa parental productora de L-triptofano resulta importante controlar los factores de fermentacion a fin de evitar la acumulacion excesiva del acido antramlico y desventajosamente resulta necesario un seguimiento continuo. De esta manera, una cepa productora de L-triptofano en la que se acumule menos el acido antramlico se considera importante en el aspecto de que puede reducir la frecuencia de la fermentacion anormal. Tal como puede observarse en las Tablas 2 y 3, las cepas transformadas que expresaban el gen trpD o el gen trp4 por parte del vector pCL mostraron una menor acumulacion de acido antramlico que con la cepa productora de L-triptofano.

A partir de una comparacion entre las cepas transformadas que expresaban antranilato fosforibosiltransferasa de E. coli y antranilato fosforibosiltransferasa de levadura, respectivamente, pudo observarse que la cepa transformada que expresaba el gen trp4 con afinidad elevada para PRPP era mejor en terminos de incremento de la actividad de L-triptofano y de reduccion de la acumulacion del acido antramlico.

De esta manera, puede concluirse que, en el caso de que se utilice la cepa transformada que expresa el gen trp4 para producir L-triptofano, puede producirse el L-triptofano con una productividad mas elevada y que la productividad global de L-triptofano puede mantenerse a un nivel elevado mediante el mantenimiento de una estabilidad de la fermentacion mas elevada.

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Ejemplo 4: transformacion del vector recombinante pCL-Pc.n-trp4 en cepas productoras de L-triptofano y comparacion de la productividad de L-triptofano en diferentes cepas transformadas

Con el fin de examinar si el efecto descrito en el Ejemplo tambien aparece en otras cepas productoras de L- triptofano, se transformaron los vectores pCL-Pcji-trp4 en las cepas y se comparo la productividad de L-triptofano entre las cepas transformadas de la misma manera que en el Ejemplo 3.

Las cepas de E. coli productoras de L-triptofano utilizadas en el presente ejemplo fueron KCCM10805P (patente coreana n° 0850853) y KCCM10814P (patente coreana n° 0838036). La cepa mutante de E. coli KCCM10805P es una cepa de E. coli productora de L-triptofano derivada de la cepa de E. coli productora de L-triptofano CJ285 (publicacion de patente coreana n° 10-2005-0059685) que presenta resistencia al analogo del triptofano llamado hidroxamato de triptofano y que se caracteriza porque el gen nrfE que participa en la reduccion del nitrito ha sido inactivado mediante recombinacion homologa. La cepa mutante de E. coli KCCM10814P es una cepa de E. coli productora de L-triptofano derivada de CJ285 y que se caracteriza porque el gen yjeO codificante de una protema requerida para sintetizar una membrana interna ha sido delecionado.

4-1: construccion de diversas cepas productoras de L-triptofano transformadas con el vector recombinante pCL-Pr.n- trp4

Se introdujo el vector recombinante pCL-Poj1-trp4 en las cepas productoras de L-triptofano KCCM10805P y KCCM10814P de la manera indicada en el Ejemplo 2 para construir cepas transformadas. Las cepas transformadas se denominaron "KCCM10805P/pCL-Poj1-trp4" y "KCCM10814P/pCL-Poj1-trp4", respectivamente.

4-2: comparacion entre la productividad de L-triptofano de diversas cepas productoras de L-triptofano transformadas con el vector recombinante pCL-Pn.n-trp4

Las cepas transformadas construidas en el Ejemplo 4-1, anteriormente, se cultivaron en matraces Erlenmeyer de la manera indicada en el Ejemplo 3 y se compararon las productividades de L-triptofano de las mismas. En la Tabla 4, a continuacion, se muestran los resultados de la comparacion.

Tabla 4

Cepa

L-triptofano (g/l) Acido antramlico (mg/l)

Con/pCL

6,5±0,5 833±100

Con/pCL-Poj1-trp4

10,2±0,5 45±12

KCCM10805P

8,7±0,3 356±82

KCCM10805P/pCL-Poj1-trp4

9,6±0,6 67±12

KCCM10814P

8,2±0,9 484±114

KCCM10814P/pCL-Poj1-trp4

9,8±0,5 63±11

Tal como puede observarse en la Tabla 4, anteriormente, en el caso de que se expresase el gen trp4 de levadura en las tres cepas productoras de L-triptofano por los vectores, se incremento la productividad de L-triptofano en aproximadamente 0,9 a 3,7 g/l. Ademas, se demostro que, al expresar el gen trp4 de levadura en las tres cepas productoras de L-triptofano por los vectores, se redujo en gran medida la cantidad de acido antramlico. Lo anterior sugiere que la expresion del gen trp4 de levadura en la cepa productora de L-triptofano presenta los efectos de incrementar la productividad de L-triptofano de la cepa, suprimiendo simultaneamente la acumulacion de acido antramlico en la cepa.

Ejemplo 5: construccion de cepa productora de L-triptofano recombinante que presenta el promotor CJ1 y el gen trp4 introducido en el cromosoma de la cepa productora de L-triptofano

En la cepa Con/pCL-Poj1-trp4 construida en el Ejemplo 3, la cepa transformada puede perder el plasmido durante la division celular y, de esta manera, puede perder el casete de expresion del gen trp4. En este caso, la cepa transformada vuelve a ser la cepa productora de L-triptofano, indicando que resulta diffcil mantener establemente el casete de expresion del gen trp4. Ademas, existe el riesgo de que le marcador de seleccion de resistencia a antibiotico en el plasmido pueda introducirse en el genoma de la cepa parental productora de L-triptofano, generando una cepa mutante con resistencia al antibiotico.

Por este motivo, en la presente invencion, unicamente se inserto el casete de expresion del gen trp4 en el locus genico ybiX en el genoma de la cepa parental productora de L-triptofano con el fin de resolver dicho problema.

5-1: construccion de vector que comprende el fragmento Pn.n-trp4 y el gen de cloranfenicol acetiltransferasa

Como marcador de seleccion para confirmar la seleccion del casete de expresion del gen trp4 en el genoma, se utilizo el gen de cloranfenicol acetiltransferasa que proporciona resistencia al cloranfenicol. Para ello, se utilizo el

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vector pUCprmfmloxC (publicacion de patente coreana abierta al publico n° 2009-0075549) que comprende el gen de cloranfenicol acetiltransferasa.

Utilizando pCL-Pcji-trp4 construido en el Ejemplo 1-3 como molde, se llevo a cabo una PCR con cebadores de SEC ID n° 10 y n° 11 para preparar un fragmento Pcji-trp4. El fragmento preparado y el vector pUCprmfmloxC se trataron con los enzimas de restriccion Kpnl y Spel y despues se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se ligo cada uno de los fragmentos de aDn en el vector utilizando un kit de ligacion rapida de ADN (ROCHE, en lo sucesivo) durante 30 minutos y despues se transformaron en celulas de E. coli DH5a. Las celulas transformadas se seleccionaron en un medio LB solido que contema cloranfenicol. La colonia seleccionada se cultivo en medio LB lfquido y se recupero el ADN plasirndico, se trato con un enzima de restriccion y se secuencio, confirmando que se habfa construido correctamente un vector que comprendfa el gen Poj1-trp4 y el gen de cloranfenicol acetiltransferasa. El vector confirmado se denomino "pmlox-Cmt-PCj1-trp4".

5-2: preparacion de fragmento de ADN para insertar un fragmento de ADN que comprende el gen PC.n-trp4 y el gen de cloranfenicol acetiltransferasa en el locus genico ybiX

El gen ybiX (ID genico 12930961) es un gen la funcion del cual no ha sido aclarada y es conocido que la delecion del gen conduce a un incremento del nivel intracelular de ATP (Hara et al., FEMS Microbiol.Lett. 297:217-224, 2009). Es conocido que, aunque se deleciona el gen ybiX de una cepa de E. coli, la actividad fisiologica de la cepa de E. coli no resulta muy influenciada. De esta manera, en la presente invencion, se inserto el casete de expresion del gen trp4 en el locus genico ybiX en el genoma de la cepa parental productora de L-triptofano.

Se preparo el fragmento del casete de expresion de trp4 en el locus genico ybiX mediante la realizacion de una PCR utilizando el plasmido pmlox-Cmt-Pd-trp4, construido en el Ejemplo 5-1, como molde, y los cebadores de SEC ID n° 12 y n° 13. El fragmento de ADN preparado se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Utilizando el fragmento de ADN sometido a electroforesis como molde, se llevo a cabo nuevamente una PCR con los cebadores de SEC ID n° 14 y n° 15. El fragmento de ADN resultante se sometio a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.

El fragmento de ADN preparado es un fragmento que comprende una secuencia de 100 pb igual al gen ybiX en cada uno de los extremos 5' y 3' y puede insertarse en el locus genico ybiX en el genoma de la cepa productora de L- triptofano utilizando la recombinasa. Se midio la concentracion del fragmento de ADN preparado utilizando NanoDrop (Thermo SCIENTIFIC). El fragmento de ADN preparado se denomino “ybiX: :Cm-PCj1-trp4", y la secuencia del mismo esta representada por la SEC ID n° 16.

5-3: insercion del casete de expresion de antranilato fosforibosiltransferasa de levadura de PC.n-trp4 en el locus genico ybiX de la cepa productora de L-triptofano

Se inserto el casete de expresion del gen trp4 en el locus genico ybiX utilizando la recombinasa. Para dicha insercion, se utilizo la tecnica de inactivacion en una sola etapa utilizando la recombinasa lambda Red desarrollada por Datsenko K.A. et al. (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645, 2000).

Se transformo el plasmido vector pKD46 que expresaba la recombinasa lambda Red, en la cepa productora de L- triptofano (KCCM 10812P) de la manera indicada en el Ejemplo 2. La cepa productora de L-triptofano transformada con el vector pKD46 se selecciono en un medio LB solido que contema ampicilina. Con el fin de inducir la expresion de la recombinasa lambda Red, se cultivo la cepa productora de L-triptofano seleccionada que habfa sido transformada con el vector pKD46, en 20 ml de un medio LB lfquido que contema 5 mM de arabinosa. Tras alcanzar la densidad de las celulas 5x108 celulas/ml, se recuperaron las celulas y se lavaron tres veces con una solucion de glicerol frio al 10%.

Se introdujeron mediante electroporacion 500 ng del fragmento de ADN ybiX::Cm-PcJi-trp4 preparado en el Ejemplo 5-2, en la cepa productora de L-triptofano resultante. En la cepa productora de L-triptofano en la que se habfa introducido un fragmento de ADN, se insertaron el gen de resistencia al cloranfenicol y el casete de expresion del gen trp4, en el locus genico ybiX mediante recombinacion homologa causada por la recombinasa lambda Red. Debido a que dicha cepa mostraba resistencia al cloranfenicol, se selecciono en un medio LB solido que contema cloranfenicol. La cepa seleccionada se sometio a PCR de colonias utilizando cebadores de SEC ID n° 17 y n° 18 y, como resultado, se confirmo que el fragmento Cm-PCj1-trp4 habfa sido insertado en el locus genico ybiX de la cepa.

Debido a que el vector pKD46 presenta un origen de replicacion sensible a la temperatura, seguidamente se incubo la cepa seleccionada a una temperatura de 40°C o superior para eliminar el vector pKD46 de las celulas. Se confirmo dicha eliminacion por el hecho de que la cepa seleccionada no crecfa en un medio LB solido que contema ampicilina.

A continuacion, con el fin de eliminar el gen de resistencia al cloranfenicol del genoma de la cepa productora de L- triptofano, se introdujo el plasmido pJW168 (Palmeros et al., Gene 247:255-264, 2000) en la cepa de la manera indicada en el Ejemplo 2. Con el fin de expresar la recombinasa Cre a partir del plasmido pJW168 introducido, se sembro isopropil-p-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en un medio LB solido que contema ampicilina y se selecciono

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una cepa. De la cepa seleccionada, se elimino el gen de resistencia al cloranfenicol mediante recombinacion genetica causada por la recombinasa Cre en la posicion loxP mutante y se confirmo dicha eliminacion utilizando cebadores de SEC ID n° 17 y n° 18. La cepa confirmada tal como se ha indicado anteriormente era una cepa productora de L-triptofano en la que se habfa insertado el casete de expresion del gen trp4 y se denomino "Con/ybiX::Pcji-trp4".

Ejemplo 6: comparacion de la productividad de L-triptofano y la actividad fisiologica de una cepa transformada en la que se habia insertado un casete de expresion del gen trp4 en el cromosoma

La cepa transformada preparada en el Ejemplo 5 se cultivo en un matraz Erlenmeyer utilizando el medio de titulacion de triptofano mostrado en la Tabla 1, anteriormente, y se analizo la productividad de L-triptofano del mismo.

Un asa de platino de cada una de las cepas parentales productoras de L-triptofano (Con) y la cepa Con/ybiX::Pcji- trp4 cultivada durante la noche en un medio LB solido en un incubador a 37°C se inoculo en 25 ml del medio de titulacion mostrado en la Tabla 1, anteriormente, y despues se cultivo en un incubador a 37°C y a 200 rpm durante 40 horas. Los resultados del cultivo se muestran en las Tablas 5 y 6, a continuacion.

Tabla 5: comparacion entre la productividad de triptofano de la cepa parental productora de L-triptofano y de la cepa en la que se habia insertado el casete de expresion del gen trp4 en el cromosoma

Cepa

L-triptofano (g/l) Acido antramlico (mg/l)

Con

6,3±1,5 579±32

Con/ybiX::Poj1-trp4

9,5±1,2 31±18

Tabla 5: comparacion entre la actividad fisiologica de la cepa parental productora de L-triptofano y de la cepa en la que se habia insertado el casete de expresion del gen trp4 en el cromosoma

Cepa

Densidad celular (DO600) Tasa de consumo de glucosa (g/l-h-1)

Con

17,7±1,3 1,50±0,08

Con/ybiX::Poj1-trp4

19,3±1,6 1,54±0,07

Tal como puede observarse en la Tabla 5, anteriormente, la cepa parental produjo 6,3 g/l de L-triptofano durante 40 horas de cultivo, mientras que la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 produjo 9,2 g/l de L-triptofano y, de esta manera, mostro un incremento de la productividad de L-triptofano de 2,9 g/l (incremento de 46%) en comparacion con la cepa parental.

Ademas, tal como puede observarse en la Tabla 6, anteriormente, la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 era similar a la cepa parental en terminos de tasa de consumo de glucosa y de crecimiento celular, al igual que la cepa transformada en la que se habfa introducido con el vector el casete de expresion del gen trp4. Ademas, la acumulacion del producto secundario de fermentacion acetato en la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 era similar o inferior que la medida en la cepa parental (datos no mostrados).

De esta manera, pudo observarse que la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 mostraba una actividad fisiologica sustancialmente similar a la de la cepa parental productora de L-triptofano, al igual que la cepa transformada que presentaba la cepa transformada en la que se habfa introducido con el vector el casete de expresion del gen trp4. Ademas, se observo que la acumulacion de acido antramlico en la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 durante la fermentacion se redujo en gran medida en comparacion con la observada en la cepa parental productora de L-triptofano, al igual que el caso de la cepa transformada que presentaba la cepa transformada en la que se habfa introducido con el vector el casete de expresion del gen trp4. Por lo tanto, puede concluirse que, en el caso de que se utilice la cepa Con/ybiX::Poj1-trp4 para producir L-triptofano, puede producirse L-triptofano con una productividad mas elevada y puede mantenerse la productividad global del L-triptofano a un nivel elevado mediante el mantenimiento de una estabilidad de la fermentacion mas elevada.

Numero de acceso

Autoridad de deposito: Korean Culture Center of Microorganisms (Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos).

Numero de acceso: KCCM11408P.

Fecha de deposito 8 de abril de 2013.

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TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPOSITO DE MICROORGANISMOS PARA LOS FINES DEL PROCEDIMIENTO DE PATENTES,

FORMULARIO INTERNACIONAL

A: CJ CheilJedang Corporation CJ CHEILJEDANG CENTER, 330, DONGHO-RO,

JUNG-GU, SEOUL 100-400, REPUBLICA DE COREA

RECEPCION EN EL CASO DE UN ORIGINAL expedido con arreglo a la Regla 7.1 por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL identificada al pie de la presente pagina

I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO

Referencia de identificacion proporcionada por el DEPOSITANTE :

Escherichia coli CA04-2006

Numero de acceso proporcionado por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL: KCCM11408P

II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O PROPUESTA DE DESIGNACION TAXONOMICA

El microorganismo identificado en la seccion I., anteriormente, estaba acompanada de:

□ una descripcion cientifica

□ una propuesta de designacion taxonomica (Senale con una cruz segun proceda)

III. RECEPCION Y ACEPTACION

La presente Autoridad Depositaria Internacional acepta el microorganismo identificado en la seccion I. anteriormente, que fue recibida por la misma el 8 de abril de 2013 (fecha del deposito original)1

IV. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL

Nombre: Korean Culture Center of Microorganisms

Direccion: 361-221, Yurim B/D Hongje-1-dong Seodaemun-gu SEOUL 120-091 Republica de Corea

Firma(s) de la persona(s) con poder para representar la Autoridad Depositaria Internacional o de el(los) funcionario(s) autorizado(s):

Fecha: 8 de abril de 2013. [Figura sello en el original]

1 En caso de aplicacion de la Regla 6.4(d), dicha fecha es la fecha en la que se adquirio el estatuto de autoridad depositaria internacional; en el caso de un deposito realizado fuera del Tratado de Budapest posteriormente a la adquisicion del estatuto de autoridad depositaria internacional convertido a un deposito dentro del Tratado de Budapest, dicha fecha es la fecha en la que el microorganismo ha sido recibido por la autoridad depositaria internacional.

Modelo BP/4

Pagina unica

KOREAN CULTURE CENTER OF MICROORGANISMS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CJ Cheiljedang Corporation

<120> Microorganismos que presentan productividad de L-triptofano y metodo para la produccion de L-triptofano mediante la utilization de los mismos

<130> 20.126025

<140> 14785937.5 <141> 2014-04-16

<150> KR 10-2013-0041547 <151> 2013-04-16

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 380 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1

Met Ser Glu Ala Thr Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Lys Leu Leu Ala Ser 15 10 15

Pro Pro Gin Leu Ser Ser Thr Asp Leu His Asp Ala Leu Leu Val lie 20 25 30

Leu Ser Leu Leu Gin Lys Cys Asp Thr Asn Ser Asp Glu Ser Leu Ser 35 40 45

lie Tyr Thr Lys Val Ser Ser Phe Leu Thr Ala Leu Arg Val Thr Lys 50 55 60

Leu Asp His Lys Ala Glu Tyr lie Ala Glu Ala Ala Lys Ala Val Leu 65 70 75 80

Arg His Ser Asp Leu Val Asp Leu Pro Leu Pro Lys Lys Asp Glu Leu 85 90 95

His Pro Glu Asp Gly Pro Val lie Leu Asp lie Val Gly Thr Gly Gly 100 105 110

Asp Gly Gin Asn Thr Phe Asn Val Ser Thr Ser Ala Ala lie Val Ala 115 120 125

Ser Gly lie Gin Gly Leu Lys lie Cys Lys His Gly Gly Lys Ala Ser 130 135 140

Thr Ser Asn Ser Gly Ala Gly Asp Leu lie Gly Thr Leu Gly Cys Asp

145 150 155 160

Met Phe Lys Val Asn Ser Ser Thr Val Pro Lys Leu Trp Pro Asp Asn 165 170 175

Thr Phe Met Phe Leu Leu Ala Pro Phe Phe His His Gly Met Gly His 180 185 190

Val Ser Lys lie Arg Lys Phe Leu Gly lie Pro Thr Val Phe Asn Val 195 200 205

Leu Gly Pro Leu Leu His Pro Val,Ser His Val Asn Lys Arg lie Leu 210 215 220

Gly Val Tyr Ser Lys Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala Ala 225 230 235 240

Leu Val Tyr Pro Gly Ser Glu Thr Phe lie Val Trp Gly His Val Gly 245 250 255

Leu Asp Glu Val Ser Pro lie Gly Lys Thr Thr Val Trp His lie Asp 260 265 270

Pro Thr Ser Ser Glu Leu Lys Leu Lys Thr Phe Gin Leu Glu Pro Ser 275 280 285

Met Phe Gly Leu Glu Glu His Glu Leu Ser Lys Cys Ala Ser Tyr Gly 290 295 300

Pro Lys Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Glu Glu Val Leu Ser Gly Lys 305 310 315 320

Tyr His Leu Gly Asp Asn Asn Pro He Tyr Asp Tyr lie Leu Met Asn 325 330 335

Thr Ala Val Leu Tyr Cys Leu Ser Gin Gly His Gin Asn Trp Lys Glu 340 345 350

Gly lie lie Lys Ala Glu Glu Ser lie His Ser Gly Asn Ala Leu Arg 355 360 365

Ser Leu Glu His Phe He Asp Ser Val Ser Ser L6u 370 375 380

<210>2 <211> 24

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para Pcjl-F-EcoRI

<400> 2

cagaattcca ccgcgggctt attc 24 <210>3

5

10

15

20

25

30

35

40

<211> 39 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para Pcj1-R-EcoRI <400> 3

gagaattcgt agatatctta atctcctaga ttgggtttc 39

<210>4 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para trpD-F-EcoRV <400> 4

atcatggctg acattctgct gctc 24

<210>5 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para trpD-R-PstI <400> 5

cactgcagtt accctcgtgc cgccagtg 28

<210>6 <211> 1596 <212> ADN <213> Escherichia coli

<400>6

atggctgaca ttctgctgct cgataatatc gactctttta cgtacaacct ggcagatcag ttgcgcagca atgggcataa cgtggtgatt taccgcaacc atattccggc gcaaacctta attgaacgcc tggcgaccat gagcaatccg gtgctgatgc tttctcctgg ccccggtgtg ccgagcgaag ccggttgtat gccggaactc ctcacccgct tgcgtggcaa gctgcccatt attggcattt gcctcggaca tcaggcgatt gtcgaagctt acgggggcta tgtcggtcag gcgggcgaaa ttctccacgg taaagcctcc agcattgaac atgacggtca ggcgatgttt gccggattaa caaacccgct gccggtggcg cgttatcact cgctggttgg cagtaacatt

60

120

180

240

300

360

420

5

10

15

20

25

30

ccggccggtt

taaccatcaa cgcccatttt aatggcatgg tgatggcagt acgtcacgat 480

gcggatcgcg

tttgtggatt ccagttccat ccggaatcca ttctcaccac ccagggcgct 540

cgcctgctgg

aacaaacgct ggcctgggcg cagcagaaac tagagccagc caacacgctg 600

caaccgattc

tggaaaaact gtatcaggcg cagacgctta gccaacaaga aagccaccag 660

ctgttttcag

cggtggtgcg tggcgagctg aagccggaac aactggcggc ggcgctggtg 720

agcatgaaaa

ttcgcggtga gcacccgaac gagatcgccg gggcagcaac cgcgctactg 780

gaaaacgcag

cgccgttccc gcgcccggat tatctgtttg ctgatatcgt cggtactggc 840

ggtgacggca

gcaacagtat caatatttct accgccagtg cgtttgtcgc cgcggcctgt 900

gggctgaaag

tggcgaaaca cggcaaccgt agcgtctcca gtaaatctgg ttcgtccgat 960

ctgctggcgg

cgttcggtat taatcttgat atgaacgccg ataaatcgcg ccaggcgctg 1020

gatgagttag

gtgtatgttt cctctttgcg ccgaagtatc acaccggatt ccgccacgcg 1080

atgccggttc

gccagcaact gaaaacccgc accctgttca atgtgctggg gccattgatt 1140

aacccggcgc

atccgccgct ggcgttaatt ggtgtttata gtccggaact ggtgctgccg 1200

attgccgaaa

ccttgcgcgt gctggggtat caacgcgcgg cggtggtgca cagcggcggg 1260

atggatgaag

tttcattaca cgcgccgaca atcgttgccg aactgcatga cggcgaaatt 1320

aaaagctatc

agctcaccgc agaagacttt ggcctgacac cctaccacca ggagcaactg 1380

gcaggcggaa

caccggaaga aaaccgtgac attttaacac gtttgttaca aggtaaaggc 1440

gacgccgccc

atgaagcagc cgtcgctgcg aacgtcgcca tgttaatgcg cctgcatggc 1500

catgaagatc tacgacagag

tgcaagccaa tcaccgcact tgcgcaaacc ggcggcacga gttcttgagg tactgcgcag gggtaa tggttccgct 1560 1596

<210>7 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para trp4-F-EcoRV <400>7

atcatgtccg aggcgacttt gctatc 26

<210>8 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para trp4-R-PstI <400> 8

gtctgcagct acaaggagct cacactatct ataaag 36

<210>9 <211> 1143 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

5

10

15

20

25

30

atgtccgagg

cgactttgct atcttacacc aagaaattat tggcttctcc gccgcaattg 60

agtagcacag acctacacga

tgcgttgctg gttatattaa gtcttttgca aaaatgtgat 120

acaaatagcg

atgagagtct ttccatctat accaaagttt cgagttttct cacggccttg 180

agagttacta

aacttgatca caaggctgaa tacattgcgg aagctgcaaa ggctgtgctc 240

agacattccg

accttgttga tctaccttta cccaagaagg acgaattaca cccggaagat 300

ggaccagtaa

tcttagatat tgtaggtact ggtggtgacg gacagaatac ttttaatgtt 360

tccacgtctg

ctgctatcgt tgcctccgga attcagggcc taaaaatttg taagcacggt ■ 420

ggtaaagctt

ctacatccaa tagtggagct ggtgacctaa ttggaacttt aggctgtgac 480

atgttcaagg ttaattcatc

gacagtgccc aaactttggc ctgataatac gttcatgttt 540

ctacttgctc

ctttttttca tcatggaatg ggccacgttt ctaagatacg caaatttctt 600

ggaattccga

ctgttttcaa cgtactggga ccacttctac atccagttag ccacgtaaac 660

aagagaatat

tgggcgttta ctcaaaggaa cttgcgcctg aatatgccaa ggcagccgct 720

ttggtatatc

caggaagcga aacttttata gtttggggac atgttgggtt agacgaagta 780

tcacctatag

gcaaaactac tgtctggcat attgatccga catcgtccga acttaaattg 840

aagaccttcc

aattagaacc ttctatgttt ggtttagaag aacacgagtt gtcgaagtgt 900

gcttcatacg gccctaaaga

gaatgcgaga attctaaaag aagaagtctt gtccggcaag 960

taccaccttg

gcgacaataa tcctatttat gactacatct tgatgaacac cgccgtgtta 1020

tattgtttaa gccaaggtca

ccagaactgg aaggaaggga tcattaaggc agaagaaagc 1080

atacattctg gtaatgcatt

acgttcttta gaacacttta tagatagtgt gagctccttg 1140

tag

1143

<210> 10 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para Pcj1-F-KpnI <400> 10

caggtaccca ccgcgggctt attc 24

<210> 11 <211> 36 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para trp4-R-SpeI <400> 11

gtactagtct acaaggagct cacactatct ataaag 36

<210> 12 <211> 70 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para GI-ybiX-Cm-F

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<400> 12

tcgcgaacaa ctggaacaag ccgaatgggt ggatggacgc gtcaccaccg ataggcctag 60

gatgcatatg 70

<210> 13 <211> 70 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para GI-ybiX-trp4-R <400> 13

acaggatctc ttcactttcg ccgtagcggc ttttcagcga ctgaatattg ccaaaacagc 60

caagctttac 70

<210> 14 <211> 70 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para GI-ybiX-F <400> 14

atgatgtacc acattcccgg cgtgttatcg ccacaggacg tcgctcgttt tcgcgaacaa 60

ctggaacaag 70

<210> 15 <211> 70 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador para GI-ybiX-R <400> 15

tcagatctcc gaccattccc gcagcagatt atgataaaga ttaagcagcg acaggatctc 60

ttcactttcg 70

<210> 16 <211> 2824 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> ybiX::Cm-PCJ1-trp4

<400> 16

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Microorganismo recombinante del genero Escherichia con productividad mejorada de L-triptofano, en el que el microorganismo recombinante ha sido modificado para expresar antranilato fosforibosiltransferasa de

   5 levadura.
2. 2. Microorganismo recombinante del genero Escherichia segun la reivindicacion 1, en el que la antranilato fosforibosiltransferasa de levadura presenta una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1.

   10
3. 3. Microorganismo recombinante del genero Escherichia segun la reivindicacion 1, en el que la modificacion se consigue mediante transformacion con un vector que comprende un polinucleotido codificante de la antranilato fosforibosiltransferasa o mediante la insercion del polinucleotido en un cromosoma.

   15 4. Microorganismo recombinante del genero Escherichia segun la reivindicacion 3, en el que el polinucleotido

   presenta una secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID n° 9.
4. 5. Microorganismo recombinante del genero Escherichia segun la reivindicacion 1, en el que el microorganismo del genero Escherichia es Escherichia coli.

   20
5. 6. Metodo de produccion de L-triptofano, que comprende las etapas de:

   cultivar un microorganismo recombinante del genero Escherichia que presenta una productividad mejorada de L-triptofano segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y

   25 recuperar L-triptofano a partir del cultivo.

   imagen1

   >osit)-antranitato

   IWMiji

   L-glutamina

   Antramfato sintasa, complejo TrpE-TrpD

   acido L-glutamico

   + iruvato

   5-fosforibosil 1-pirofosfato, PRPP

   Antranilato fosforibosiltransferasa, TrpD

   Fosfato

   Fosforibosilantramlato isomerasa, TrpC

   lndol-3-ghcerol fosfato sintasa, TrpC

   CO

   | Trlptd

   Glicerol-3-fosfato •4-^'! Triptofano sintasa, complejo TrpB-TrpA

   L-serma

   Triptofano sintasa, complejo TrpB-TrpA

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   imagen5