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CN117660448B - 一种产l-色氨酸菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

一种产l-色氨酸菌株的高通量筛选方法 Download PDF

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CN117660448B CN202311484595.8A CN202311484595A CN117660448B CN 117660448 B CN117660448 B CN 117660448B CN 202311484595 A CN202311484595 A CN 202311484595A CN 117660448 B CN117660448 B CN 117660448B
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Abstract

本发明公开了一种产L‑色氨酸菌株的高通量筛选方法。本发明通过将产L‑色氨酸菌株的发酵液和M9培养基去培养一个指示菌株(指示菌株为含有表达质粒pSC101‑Ptac5‑7‑sfgfp的Escherichia coli BL21(DE3):ΔtrpR)，载体pSC101‑Ptac5‑7‑sfgfp上包含阻遏蛋白TrpR；该阻遏蛋白和两分子的L‑色氨酸结合，然后与杂合启动子Ptac5‑7上的trpO8序列结合，从而抑制下游基因的表达；绿色荧光基因sfgfp，用来产生荧光；以及杂合启动子Ptac5‑7用来表达sfgfp基因。本发明还设计并构建了一种响应L‑色氨酸的杂合启动子Ptac5‑7，在0～5g/L的L‑色氨酸浓度范围内，随着L‑色氨酸浓度的增加，该杂合启动子Ptac5‑7的表达强度逐渐减弱。

Description

一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
L-色氨酸(L-Tryptophan)，又称β-吲哚基丙氨酸,是人体的必须氨基酸之一。L-色氨酸作为一种多功能的芳香族氨基酸，能参与体内多种活性物质及调节因子的合成，因此在食品、药品和动物饲料等领域被广泛应用。在食品行业中，L-色氨酸可以作为抗氧化剂，用于鱼类保险以及延缓一些食品的变质；也可作为食品添加剂，加快面包的发酵；还可作为调味剂，以及营养强化剂。在饲料行业中，L-色氨酸作为饲料添加剂，可以使饲料中植物蛋白的利用率明显提高，不仅可以促进动物生长，而且能够增强猪、牛等动物泌乳期泌乳。在医药行业，L-色氨酸因在体内代谢生成5-羟色胺，不仅能够促进C-球蛋白的产生，增强机体抗病能力，而且可以作用于中枢神经，因此可以用作抗抑郁剂、镇定剂等；同时，L-色氨酸还可以与铁剂维生素合用来增强运动型贫血的疗效，与组氨酸合用可治疗消化道溃疡。L-色氨酸还可作为抗虫剂应用于农业生产中；以及L-色氨酸具有荧光吸收性，可对环境中有毒金属离子进行检测。
目前，针对产氨基酸菌株有多种筛选策略：1.基于营养缺陷型菌株的筛选策略；2.基于生物传感器的筛选策略，其中包括:(1)酶反应耦合生物传感器，(2)基于融合蛋白的生物传感器，(3)基于转录因子的生物传感器，(4)基于核糖开关的生物传感器；3.基于翻译的筛选策略，其中包括:(1)基于氨基酸类似物的策略，(2)基于稀有密码子的策略，(3)基于氨酰tRNA合成酶的策略，(4)筛选非标准氨基酸过量生产者的策略。
由于L-色氨酸是一种胞外产物，随着发酵过程的进行，产生的L-色氨酸会及时地排出到胞外，而传感器需要在胞内表达，所以目前对于产L-色氨酸菌株，并未有一种合理高效的高通量筛选方法，这样极大的限制了高产L-色氨酸菌株的构建，从而限制了L-色氨酸的发展。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法，目的在于解决缺少高效的高通量筛选L-色氨酸高产菌种的方法的问题。
本发明提供的第一个技术方案是一种响应L-色氨酸的杂合启动子，所述杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述杂合启动子在Ptac启动子基础上改造而来，通过将TrpR-L-trp识别的一系列trpO序列插入到Ptac启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的不同区域，获得7条杂合启动子序列，分别是Ptac5-1、Ptac5-2、Ptac5-3、Ptac5-4、Ptac5-5、Ptac5-6和Ptac5-7，对应的核苷酸序列分别SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.4，经过在不同浓度的L-色氨酸条件下构建的杂合启动子的表达强度检测，筛选得到序列如SEQ ID NO.4所示的杂合启动子。阻遏蛋白TrpR和两分子的L-色氨酸结合形成TrpR-L-trp，然后识别杂合启动子Ptac5-7上的trpO8序列(如SEQ ID NO.6所示)并结合，从而抑制下游基因的表达。进而，序列如SEQ ID NO.4所示的杂合启动子可用于依据TrpR-L-trp的浓度调控其驱动表达的基因的转录强度。
本发明提供的第二个技术方案为一种指示质粒，所述指示质粒为含有第一个技术方案所述的杂合启动子、trpR基因和荧光报告基因的表达载体，所述荧光报告基因通过所述杂合启动子调控表达，所述trpR基因表达的trpR蛋白与L-色氨酸结合通过杂合启动子抑制所述荧光报告基因的转录，所述指示质粒能够用于感应L-色氨酸的浓度线性调控荧光报告基因的转录强度。荧光报告基因位于杂合启动子下游，受所述杂合启动子驱动表达。
在某些实施方式中，所述trpR基因来源于E.coli BL21(DE3)，所述的trpR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在某些实施方式中，所述荧光报告基因为sfgfp基因，所述的sfgfp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在某些实施方式中，所述指示质粒同时含有pSC101复制子以及抗性基因。
进一步，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因。
在某些实施方式中，所述指示质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的第三个技术方案是一种指示菌株，所述指示菌株含有第一个技术方案所述的杂合启动子或第二个技术方案所述的指示质粒，能够通过荧光表达强度用于线性反应所在培养基中L-色氨酸的浓度。
在某些实施方式中，所述指示菌株的宿主细胞为敲除基因组上trpR基因的大肠杆菌。
进一步，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli K12 MG1655，E.coli K12W3110等
本发明提供的第四个技术方案是一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法，将第三个技术方案所述的指示菌株接入分别含有M9培养基与多株待筛选菌株发酵液的混合液中培养，所述待筛选菌株发酵液的L-色氨酸的含量水平线性调控所述指示菌株的荧光表达水平，进而通过荧光表达水平来显示待筛选菌株发酵液的L-色氨酸的含量水平，以筛选出产L-色氨酸的菌株。
在某些实施方式中，用M9培养基配置不同浓度梯度的L-色氨酸与指示菌株的荧光表达水平建立线性方程，通过所述线性方程计算待筛选菌株发酵液的L-色氨酸的浓度。
在某些实施方式中，L-色氨酸菌株的发酵液和M9培养基(含葡萄糖)混合的比例为1:1。
本发明提供的第五个技术方案为第一个技术方案所述的杂合启动子、第二个技术方案所述的指示质粒、第三技术方案所述的指示菌株或第四个技术方案所述的方法在L-色氨酸生产菌株高通量筛选中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明设计并构建了出一个杂合启动子Ptac5-7，相比于天然启动子Ptrp，该启动子响应L-色氨酸的浓度范围为在0～5g/L的L-色氨酸，并且呈现良好的线性关系。大肠杆菌中的天然启动子Ptrp受到L-色氨酸的调控表达，但是Ptrp启动子响应L-色氨酸的浓度范围窄，仅添加0.01g/L的L-色氨酸，该启动子的表达强度便被抑制一半，因此过于灵敏。而Ptac启动子在大肠杆菌中属于强启动子且表达稳定，因此选择Ptac启动子进行改造获得杂合启动子，杂合启动子Ptac5-7受到TrpR-L-trp影响进而抑制其驱动的荧光报告基因的转录强度，并且转录强度与TrpR-L-trp的浓度有良好的线性关系，因此杂合启动子Ptac5-7在0～5g/L的L-色氨酸浓度范围内，其表达强度与L-色氨酸浓度呈现良好的线性关系。
本发明还设计一种含有上述杂合子的指示质粒，其trpR基因表达的trpR蛋白与L-色氨酸结合通过杂合启动子线性调控荧光报告基因的转录强度。
本发明还设计一种含有上述指示质粒的指示菌株，指示菌株表达的trpR蛋白可以与培养基中L-色氨酸结合杂合通过杂合启动子调控荧光报告基因的表达强度，启动子驱动荧光表达的水平与培养基中L-色氨酸浓度呈现良好的线性关系，R2为0.9984。因此将上述指示菌株接入含有不同待筛选菌发酵液和M9培养基的混合液中，待筛选菌株的发酵液的L-色氨酸浓度调控荧光表达水平，进而通过荧光表达水平反向推测出待筛选菌株的发酵液的L-色氨酸含量，以构建一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法，本发明的筛选方法可以利用96孔板实现简单快速地筛选出高产L-色氨酸的菌株。
附图说明
图1为不同浓度的L-色氨酸条件下Ptac5-7启动子的表达强度。
图2为不同浓度的L-色氨酸条件下其他杂合启动子的表达强度；(1)杂合启动子Ptac5-1在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(2)杂合启动子Ptac5-2在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(3)杂合启动子Ptac5-3在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(4)杂合启动子Ptac5-4在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(5)杂合启动子Ptac5-5在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(6)杂合启动子Ptac5-6在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度。
图3为不同浓度的L-色氨酸及TrpR蛋白对Ptrp启动子表达强度的影响；(1)启动子Ptrp在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(2)在不表达TrpR的情况下，启动子Ptrp在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度。
图4为不同浓度的L-色氨酸及TrpR蛋白对Ptac启动子表达强度的影响；(1)启动子Ptac在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度；(2)在不表达TrpR的情况下，启动子Ptac在不同浓度的L-色氨酸中的表达强度。
图5为不同浓度的L-色氨酸条件下质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR上荧光表达强度。
图6为其他几种氨基酸对Ptac5-7启动子表达强度的影响。
图7为产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法的技术路线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步说明，以使本领域内的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。(下面所述引物序列在附表中)
材料与方法
M9培养基：MgSO4：0.24g/L,CaCl2：0.011g/L，NaPO4·12H2O：17.1g/L，KH2PO4：3g/L，葡萄糖：4g/L(可随着实验的需求变化)，NaCl：0.5g/L，NH4Cl：1g/L。
质粒与细胞：菌株Escherichia coli BL21(DE3)为商业化菌株。引物序列合成、试剂购买及基因测序验证均在上海生物生工公司购买和完成。
质粒pEcCpf1、pcrEG均公开在如下文章中：Zhu X,Wu Y,Lv X.Combining CRISPR–Cpf1 and Recombineering Facilitates Fast and Efficient Genome Editing inEscherichia coli[J].ACS Synthetic Biology,2022(5):11.DOI:10.1021/acssynbio.2c00041.质粒pEcCpf1、pcrEG在MolecularCloud质粒共享平台的号码分别为：Cat.no:MC_0101275、Cat.no:MC_0101277。
检测方法：
L-色氨酸使用高效液相色谱法进行检测，试剂配制及程序如下：
流动相的配制方法：A相：3.01g/L无水乙酸钠，200μL三乙胺，5mL四氢呋喃，定容至1L，用乙酸调pH至7.2；B相：3.01g/L无水乙酸钠定容至200mL，用乙酸调pH至7.2，再加400mL甲醇，400mL乙腈。
HPLC检测方法：HPLC型号为Agilent 1260高效液相色谱仪。利用OPA试剂对样品进行衍生化，色谱柱为Agilent C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，其中使用的是紫外检测器(UVD)，将UVD的检测波长设置为338nm，设置左右两侧柱温为40℃。表1-2为设定的程序。
OPA：100g OPA+9mL硼酸缓冲液(0.4mol/L，pH 10.2，用NaOH调节)，1mL乙腈，100μL巯基丙酸。
硼酸：0.4mol/L，pH 10.2，用NaOH调节。
表1运行程序
表2L-色氨酸的进样程序
P1-A-1：OPA，P1-A-2：水，P1-A-3：水，P1-A-4：硼酸，P1-A-5：水
荧光表达水平检测：SfGFP荧光蛋白的激发波长为：488nm，发射波长为：507nm。其中，由于培养基也会有一定的荧光数值，所以检测荧光的方式如下：
其中，FPbg为培养基的背景荧光，ODbg为培养基的背景OD。
引物信息如下表3：
表3
实施例1
一、构建转化菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR
利用CRISPR/Cpf1技术敲除野生型菌株E.coli BL21(DE3)的trpR基因，得到菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR。敲除trpR基因的具体操作可参考文献“Combining CRISPR-Cpf1 and Recombineering Facilitates Fast and Efficient Genome Editing inEscherichia coli”。
二、构建pSC101-Ptrp-sfgfp质粒和pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR质粒
首先构建pSC101-Ptrp-sfgfp质粒。利用引物trpR-F和trpR-R以E.coli BL21(DE3)为模板通过PCR扩增出trpR片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，然后利用引物sfgfp-F和sfgfp-R以pcrEG质粒为模板通过PCR扩增出sfgfp片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，最后利用引物pSC101-liF和pSC101-liR以pEcCpf1质粒为模板扩增出载体片段。最后将trpR片段、sfgfp片段和载体片段三个片段连接构建成质粒pSC101-Ptrp-sfgfp。
利用引物pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR-liF和pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR-liR以pSC101-Ptrp-sfgfp质粒为模板通过PCR构建质粒pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR(pSC101-Ptrp-gfp质粒上删除trpR基因)。其中，pSC101-Ptrp-sfgfp质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，质粒pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
三、构建pSC101-Ptac-sfgfp质粒和pSC101-Ptac-sfgfp-QtrpR质粒
构建pSC101-Ptac-sfgfp质粒和pSC101-Ptac-sfgfp-QtrpR质粒。利用引物pSC101-Ptac-sfgfp-liF和pSC101-Ptac-sfgfp-liR分别以质粒pSC101-Ptrp-sfgfp和质粒pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR为模板，通过PCR构建质粒pSC101-Ptac-sfgfp和质粒pSC101-Ptac-sfgfp-QtrpR。其中pSC101-Ptac-sfgfp质粒和pSC101-Ptac-sfgfp-QtrpR质粒的核苷酸序列如SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
四、设计并构建响应L-色氨酸的杂合启动子及表达质粒
以Ptac启动子为基础，将多个TrpR-L-trp复合物识别的trpO序列插入到Ptac启动子的不同位置，分别利用5-1-F/5-1-R、5-2-F/5-2-R、5-3-F/5-3-R、5-4-F/5-4-R、5-5-F/5-5-R、5-6-F/5-6-R、5-7-F/5-7-R这7对引物以pSC101-Ptrp-sfgfp质粒为模板进行PCR而得到7个质粒：pSC101-Ptac5-1-sfgfp、pSC101-Ptac5-2-sfgfp、pSC101-Ptac5-3-sfgfp、pSC101-Ptac5-4-sfgfp、pSC101-Ptac5-5-sfgfp、pSC101-Ptac5-6-sfgfp、pSC101-Ptac5-7-sfgfp，7个杂合启动子分别为：Ptac5-1、Ptac5-2、Ptac5-3、Ptac5-4、Ptac5-5、Ptac5-6、Ptac5-7。七个杂合启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
五、检测不同浓度的L-色氨酸条件下构建的杂合启动子的表达强度
为了检测不同浓度的L-色氨酸对杂合启动子表达的影响，将质粒pSC101-Ptac5-1-sfgfp、pSC101-Ptac5-2-sfgfp、pSC101-Ptac5-3-sfgfp、pSC101-Ptac5-4-sfgfp、pSC101-Ptac5-5-sfgfp、pSC101-Ptac5-6-sfgfp、pSC101-Ptac5-7-sfgfp分别转化至菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR中，然后将带有质粒的菌株分别在含有不同浓度的L-色氨酸(0～5g/L)的M9培养基中进行培养，12h时测量荧光表达情况(见附图1-2)。如图1所示，随着培养基中L-色氨酸浓度的增加(0～5g/L)，Ptac5-7启动子的表达强度逐渐减弱，其表达强度与L-色氨酸浓度呈现良好的线性关系。如图2所示：Ptac5-1、Ptac5-2、Ptac5-3、Ptac5-4、Ptac5-5、Ptac5-6这6个杂合启动子的表达在0～5g/L的L-色氨酸浓度范围内均没有良好的线性关系。
六、构建pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR质粒
为了探究表达TrpR蛋白对Ptac5-7启动子的影响，将质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp上的trpR基因删除，利用引物pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR-liF/pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR-liR以pSC101-Ptac5-7-sfgfp质粒为模板，进行PCR得到质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR。所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
七、检测不同浓度的L-色氨酸条件下Ptrp启动子的表达强度
为了检测不同浓度的L-色氨酸对Ptrp启动子表达的影响以及TrpR蛋白对Ptrp启动子的表达影响，将质粒pSC101-Ptrp-sfgfp和质粒pSC101-Ptrp-sfgfp-QtrpR转化到菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR中，然后将带有质粒的菌株分别在含有不同浓度的L-色氨酸的M9培养基中进行培养，12h时测量荧光表达情况(见附图3)。如图所示，Ptrp启动子的表达受到L-色氨酸浓度的调控，且0.01g/L的L-色氨酸使得Ptrp启动子的表达受到50％多的抑制。当不表达TrpR蛋白时，Ptrp启动子的表达强度很高并且不受到L-色氨酸浓度的影响。
八、检测不同浓度的L-色氨酸条件下Ptac启动子的表达强度
为了检测不同浓度的L-色氨酸对Ptac启动子表达的影响以及TrpR蛋白对Ptac启动子的表达影响，将质粒pSC101-Ptac-sfgfp和质粒pSC101-Ptac-sfgfp-QtrpR转化到菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR中，然后将带有质粒的菌株分别在含有不同浓度的L-色氨酸的M9培养基中进行培养，12h时测量荧光表达情况(见附图4)。如图所示，Ptac启动子的表达不受到L-色氨酸浓度的影响，但是将TrpR蛋白在质粒上删除后，Ptac启动子的表达强度降低一半，但不受L-色氨酸浓度的影响。
九、检测不同浓度的L-色氨酸条件下质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR上荧光表达强度
为了检测不同浓度的L-色氨酸下TrpR蛋白对Ptac5-7启动子的表达影响，将质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp-QtrpR转化到菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR中，然后将带有质粒的菌株在含有不同浓度的L-色氨酸的M9培养基中进行培养，12h时测量荧光表达情况(见附图5)。如图所示，当不表达trpR基因时，L-色氨酸不影响Ptac5-7启动子的表达。
十、检测其他氨基酸对Ptac5-7启动子的表达影响
为了探究Ptac5-7启动子的正交性，参考本实施例第五部分的方法，在M9培养基中添加不同浓度的L-组氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-苏氨酸(浓度范围均为0～5g/L)，本实施例对其他氨基酸对启动子Ptac5-7的表达影响进行检测。如图6所示，这四种氨基酸均不会对启动子Ptac5-7的表达造成明显的影响，进而说明本发明的杂合启动子对于L-色氨酸的响应具有较好的针对性。
实施例2：对产L-色氨酸菌株进行高通量筛选
如图7所示，TrpR基因表达含阻遏蛋白TrpR；该阻遏蛋白和两分子的L-色氨酸结合，然后与杂合启动子Ptac5-7上的trpO8序列结合，从而抑制绿色荧光基因sfgfp基因的表达，L-色氨酸的含量越高，结合形成的TrpR-L-trp的量越大，进而对sfgfp基因表达的抑制效果越明显，进而荧光表达水平越低。因此，以此作为高通量筛选的依据，具体技术方案如下：
参照实施例1构建转化菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR，使用CRISPR/Cpf1技术将野生型E.coli BL21(DE3)基因组上的trpR基因进行删除。
参照实施例1构建指示质粒pSC101-Ptac5-7-sfgfp，并将指示质粒转入到转化菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR中得到指示菌株E.coli BL21(DE3):ΔtrpR+pSC101-Ptac5-7-sfgfp。
用M9培养基配置不同浓度梯度的L-色氨酸(0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L)，使用上述配置的不同浓度梯度的含L-色氨酸的M9培养基，培养基中需加入卡那霉素。利用96孔板培养指示菌株，其中每个孔里加入200μL的培养基，可以转接2μL的菌液或者是直接接种单菌落。孔板培养12h后检测荧光表达水平。若接种量大，可缩短孔板培养时间，建立荧光表达水平和L-色氨酸含量的线性方程。
将不同产L-色氨酸菌株(待筛选菌株)的发酵液与用M9培养基混合，培养基中需加入卡那霉素。利用96孔板培养指示菌株，其中每个孔里加入200μL的混合培养基，可以转接2μL的菌液或者是直接接种单菌落，孔板培养12h后检测荧光表达水平，通过荧光表达水平的高低判断不同产L-色氨酸菌株的发酵液中L-色氨酸产量的高低。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种响应L-色氨酸的杂合启动子，其特征在于，所述杂合启动子的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
2.一种指示质粒，其特征在于，所述指示质粒为含有权利要求1所述的杂合启动子、trpR基因和荧光报告基因的表达载体，所述的trpR基因来源于大肠杆菌，所述荧光报告基因通过所述杂合启动子调控表达，所述trpR基因表达的trpR蛋白与L-色氨酸结合并通过所述杂合启动子抑制所述荧光报告基因的转录，所述指示质粒能够用于感应L-色氨酸的浓度线性调控荧光报告基因的转录强度。
3.根据权利要求2所述的指示质粒，其特征在于，所述的trpR基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的指示质粒，其特征在于，所述指示质粒同时含有pSC101复制子以及抗性基因。
5.根据权利要求2～4任一项所述的指示质粒，其特征在于，所述指示质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种指示菌株，其特征在于，所述指示菌株是含有权利要求2～5任一项所述的指示质粒的微生物，能够通过荧光表达强度反应所处环境中L-色氨酸的浓度；所述微生物为敲除基因组上trpR基因的大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的指示菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli K12 MG1655或E.coli K12 W3110。
8.一种产L-色氨酸菌株的高通量筛选方法，其特征在于，将权利要求6或7所述的指示菌株接入含有培养基与待筛选菌株发酵液的混合液中培养，通过混合液的荧光强度来表征待筛选菌株发酵液的L-色氨酸的含量水平，以筛选出产L-色氨酸的菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基是M9培养基。
10.权利要求2～5任一项所述的指示质粒、权利要求6或7所述的指示菌株或权利要求8或9所述的方法在L-色氨酸生产菌株高通量筛选中的应用。
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