ES2968387T3 - Adenovirus modificados - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un adenovirus oncolítico modificado de serotipo Ad5; una composición farmacéutica que comprende la misma; y un método para tratar el cáncer usando el mismo en el que dicho adenovirus modificado comprende al menos una mutación puntual en la región hipervariable del hexón 7 (mutación HVR7) para evitar la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX); al menos una mutación puntual en el bucle AB de la región del pomo de la fibra (mutación KO1) para evitar la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR); y al menos una mutación puntual en el motivo de unión de la integrina pentona Arg-Gly-Asp (RGD) para evitar la unión del virus con la integrina ανβ3/ανβ5. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Adenovirus modificados

Campo de la invención

La invención se refiere a un adenovirus oncolítico modificado de serotipo Ad5; una composición farmacéutica que comprende al mismo; y un método para tratar el cáncer utilizando el mismo en el que dicho adenovirus modificado comprende al menos una de las mutaciones puntuales en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) para evitar la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX); al menos una de las mutaciones puntuales en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) para evitar la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR); y al menos una de las mutaciones puntuales en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) para evitar la unión del virus con la integrina aVp3/aVp5.

Antecedentes de la invención

La viroterapia contra el cáncer es un campo que emerge rápidamente con el talimogene laherparepvec (T-VEC) basado en el herpes simple tipo 1 como la primera inmunoterapia oncolítica para el melanoma avanzado. Los adenovirus oncolíticos son virus altamente inmunogénicos que a menudo se utilizan en diversas aproximaciones de vacunas contra enfermedades infecciosas. Lo más importante, es que tienen una capacidad excepcional tanto para preparar como para estimular las respuestas inmunes. Además, es probable que la presencia de un adenovirus oncolítico dentro de un tumor y la muerte celular inmunogénica que ocasiona moldee el microambiente tumoral hostil hacia un estado más susceptible para que se produzca una inmunidad anti-tumoral clínicamente relevante, al provocar la expresión de moduladores inmunes del tipo TH1 tal y como IFNg. Sin embargo, la inmunogenicidad de los adenovirus oncolíticos es un arma de doble-filo; La inmunidad antivirus es a menudo tan abrumadora, que anula la respuesta inmune mucho más débil provocada contra los auto-antígenos expresados por el tumor.

El adenovirus 5 (Ad5) es un vector común implementado en numerosos ensayos clínicos para el cáncer y terapias genéticas (clinicaltrials.gov, 2016) debido a que puede manipularse genéticamente y que tolera transgenes grandes. Sin embargo, este serotipo tiene varias características subóptimas que dificultan su uso clínico más amplio. Ad5 es un virus respiratorio común, con tasas de seroprevalencia cercanas al 100 % en determinadas poblaciones - los anticuerpos neutralizantes (nAbs) inactivan rápidamente los vectores terapéuticos administrados sistémicamente. Otras características subóptimas incluyen su extenso secuestro fuera de la diana al bazo y al hígado a través del puente de la proteína hexón viral y los proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs), una interacción que dicta el tropismo es mediada por el factor de coagulación humano 10 (FX).In vitro,Ad5 entra a las células hospederas a través de la interacción entre la proteína de fibra viral y el receptor coxsackie y adenovirus (CAR) que se expresa de manera ubicua dentro de las uniones estrechas en las células epiteliales polarizadas, pero que está regulado-negativamente en cánceres progresivos. Posteriormente, Ad5 se internaliza en las células hospederas a través de las integrinas aVp3/5 mediante endocitosis mediada por clatrina mediada por la proteína base pentona viral.

La percepción del papel de los virus oncolíticos en el tratamiento del cáncer ha cambiado dramáticamente durante la última década, a medida que la inmunoterapia y la estimulación del propio sistema inmune del paciente para dirigir y atacar el cáncer han ganado popularidad. A principios del siglo, los virus oncolíticos se percibían como agentes activos en el tratamiento del cáncer, actuando únicamente a través de su capacidad inherente para lisar células tumorales a través de la oncólisis. Recientemente, su uso como vacunas contra el cáncer ha ganado interés, y su capacidad para liberar antígenos tumorales de las células cancerígenas tras la oncólisis para activar el sistema inmune se reconoce como una característica importante en el diseño de la inmunoterapia definitiva contra el cáncer.

Por lo tanto, los vectores virales se están volviendo cada vez más atractivos en el entorno clínico; sin embargo, la eficacia clínica del serotipo com ún-Ad5-se ve obstaculizada por especificidad-tumoral pobre, extensa administración fuera de la diana e inactivación por la inmunidad innata, lo que requiere estrategias de manipulación innovadoras.

En la presente describimos un vector adenoviral modificado diseñado para superar los inconvenientes anteriores.

Declaraciones de la invención

La presente invención, en sus diversos aspectos, es tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un adenovirus de serotipo Ad5 caracterizado por las modificaciones que comprenden:

a) al menos una de las mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S, E450Q o L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX);

b) al menos una de las mutaciones puntuales S408E o P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR); y

c) al menos una de las mutaciones puntuales D342E o D342A en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en el que dicha mutación previene la unión del virus con la integrina aVp<3>/aVp<5>.

El adenovirus de serotipo Ad5 de acuerdo con la invención es ventajoso ya que su capacidad para infectar tejidos fuera de la diana está gravemente comprometida, de hecho, se previene/inhibe de infectar el hígado y el bazo y también se ve comprometida su capacidad para infectar células del cuerpo de manera extendida. Por lo tanto, el adenovirus se ve comprometido en términos del tejido que puede infectar.

Los adenovirus son virus de tamaño-mediano (90-100 nm), sin envoltura (sin una bicapa lipídica externa) con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN de doble hebra. En humanos, existen 57 serotipos de adenovirus humanos aceptados (Ad-1 a 57) clasificados en siete especies (Adenovirus humanos A a G): A - 12, 18, 31; B - 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55; C -1 , 2, 5, 6, 57; D - 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 54, 56; E - 4; F - 40, 41; y G - 52. Por consiguiente, la referencia en la presente sobre Ad5 se refiere al serotipo 5 de Adenovirus que pertenece a la subclase-C de adenovirus.

Como saben los expertos en la técnica, los viriones de Adenovirus están compuestos de cápsides con forma de icosaedro sin-envoltura que rodean el complejo central viral de ADN-proteína. El hexon es la proteína estructural más abundante, con 240 copias de la molécula trimérica por cápside. Doce copias del trímero de hexón forman cada una de las 20 facetas triangulares de la cápside. Un complejo de proteínas de base pentona y fibra sella los vértices de la cápside y facilita la unión (fibra) e internalización (base de pentona) del virus.

La proteína hexón está altamente conservada entre los diferentes serotipos de adenovirus con la excepción de nueve regiones hipervariables (HVRs). Estas HVRs residen en dos bucles distintos que forman la superficie expuesta de la proteína hexón, las HVRs 1-6 se encuentran dentro del bucle DE1 y las HVRs 7-9 están ubicadas dentro del bucle FG1.

Por consiguiente, la referencia en la presente a al menos una mutación en HVR7 se refiere a una mutación en la región hipervariable 7. Específicamente, dicha al menos una mutación HVR7 previene la interacción con el Factor X de coagulación, limitando así el secuestro fuera de la diana del adenovirus al hígado y mejorando la focalización para atacar a las células cancerígenas.

En una realización preferida, dicha al menos una mutación HVR7 comprende al menos una mutación de sustitución de amino para prevenir la interacción FX seleccionada de uno o más del grupo que comprende: I421G, T423N, E424S, E450Q o L426Y Lo más preferible, dicha al menos una mutación HVR7 comprende adicional o alternativamente al menos una de las mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S y L426Y.

Como saben los expertos en la técnica, los vectores adenovirales tienen un tropismo natural que conduce a una distribución extendida del vector. Se cree que la entrada de adenovirus del grupo C, como Ad5, en las células implica una unión de alta afinidad del virus a la célula mediante la interacción de la proteína de fibra viral con el receptor de coxsackievirus-adenovirus (CAR). Por lo tanto, para el propósito de la terapia anti-cáncer, el direccionamiento de vectores adenovirales a tejidos específicos o tipos de células requiere la modificación del tropismo normal del vector para mejorar la especificidad.

La infección adenoviral comienza con el reconocimiento de los receptores de la célula hospedera por medio de proteínas especializadas en la superficie viral, es decir, la proteína de fibra del adenovirus y, en particular, el dominio carboxi-terminal globular de la proteína de fibra del adenovirus, denominado el dominio de nudo carboxi-terminal. Por consiguiente, la referencia en la presente a un nudo de una proteína de fibra adenoviral es una referencia al dominio carboxi-terminal globular de la proteína de fibra del adenovirus.

Por consiguiente, la referencia a al menos una mutación KO1 se refiere a al menos una mutación en el bucle AB de la región del nudo de fibra. Específicamente, dicha al menos una mutación KO1 impide que el virus se una al CAR. En una realización preferida, dicha al menos una mutación KO1 comprende al menos una mutación puntual para prevenir la unión a CAR seleccionada de una o más del grupo que comprende: S408E o P409A. Más preferiblemente, dicha mutación puntual comprende mutaciones puntuales S408E y P409A.

La base de pentona del adenovirus contiene cinco secuencias Arg-Gly-Asp e integrinas de unión alfa v beta 3 y alfa v beta 5 (aVp<3>/aVp<5>) para promover la infección viral al permitir la internalización del virus. Mediante la prevención de esta interacción, hemos descubierto que se reduce la focalización fuera del sitio al bazo, promoviendo así la focalización específica al tumor y, además, se produce una liberación amortiguadora de citocinas pro-inflamatorias que, de lo contrario, conducen a una respuesta inmune adversa del hospedero cuando se utilizan en el contexto de la terapia anti-cáncer.

Por consiguiente, la referencia a al menos una mutación RGD se refiere a al menos, al menos una mutación en el motivo de unión de pentona integrina a Arg-Gly-Asp (mutación RGD) en la que dicha mutación previene la unión del virus con integrina aVp<3>/aVp<5>. En una realización preferida, dicha al menos una mutación RGD comprende al menos una mutación puntual seleccionada de una o más del grupo que comprende: D342E o D342A para producir RGE o RGA, respectivamente. Lo más preferible es que dicha mutación puntual sea D342E para producir r Ge .

En aún otra realización preferible, dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir al menos una modificación focalizada al cáncer que se dirige selectivamente a las células tumorales, en particular, a tipos específicos de células tumorales. Como apreciarán los expertos en la técnica, mediante la incorporación de las mutaciones descritas en la presente para modificar el tropismo natural del adenovirus y también la introducción de al menos una modificación/secuencia de focalización, dicho adenovirus tiene la especificidad tumoral mejorada y ha reducido la focalización fuera del sitio, reduciendo así los efectos-secundarios no deseados. Los expertos en la técnica conocen ejemplos de modificaciones/secuencias focalizadas al cáncer tales como, pero no limitadas a, péptidos (que contienen) NGR para unirse a la aminopeptidasa N, en particular adenovirus (Ads) que llevan NGR en el bucle HI de la proteína de fibra adenoviral; péptidos (que contienen) YSA para unirse al marcador de pan-cáncer EphA2, en particular adenovirus que llevan YSA en la fibra quimérica, lo que da como resultado una fuerte transducción de células cancerígenas positivas para EphA2 pero no negativas para EphA2; anticuerpos del factor de crecimiento, en particular el enlace químico de estas fracciones diana, por ejemplo, bFGF, EGFR, anticuerpos (por ejemplo, Cetuximab, Herceptina, Avastin o similares) contra el adenovirus utilizando, por ejemplo, enlaces avidina/biotina; y enzimas que degradan la matriz que una vez unidas (típicamente, enlazadas químicamente, por ejemplo, enlace mediante hialuronidasa) al exterior del virus, degradan la membrana extracelular y, por lo tanto, permiten que el virus penetre más eficientemente en el microambiente del tumor.

En una realización preferida, dicha modificación focalizada al cáncer comprende la inserción o expresión de un péptido de unión a integrina avp6 (identificado utilizando técnicas convencionales, tales como técnicas de unión a secuencias y homología) tal como la secuencia del péptido A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) en el virus o por el virus, respectivamente, e, idealmente, dentro o en el bucle HI del nudo de fibra viral (este virus modificado se denominará en lo sucesivo como Ad5.3D.A20). A20 se derivó originalmente de la proteína de la cápside VP1 del virus de la enfermedad de pies-y-boca (FMDV) y tiene una afinidad nativa alta por la integrina avp6. La integrina avp6 se expresa en un tercio de los cánceres de ovario y en una variedad de otros cánceres epiteliales y no es detectable en tejidos adultos sanos. Por lo tanto, como apreciarán los expertos en la técnica, a través de la expresión e incorporación de esta secuencia en el adenovirus modificado, el adenovirus modificado puede focalizarse selectivamente a cánceres que sobreexpresan integrina avp6 tales como, pero no limitados a, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer cervical, cáncer de cabeza y cuello, cáncer oral, cáncer de laringe, cáncer de piel, cáncer de mama, cáncer de riñón y cáncer colorrectal.

El experto apreciará que los homólogos, ortólogos o derivados funcionales de las mutaciones citadas también encontrarán uso en el contexto de la presente invención. Así, por ejemplo, la presente invención abarca mutaciones que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o similares. Además, puede ser posible reemplazar un aminoácido por otro de "tipo" similar. Por ejemplo, se puede reemplazar un aminoácido hidrofóbico con otro utilizando un programa como el programa CLUSTAL para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y encuentra el alineamiento óptimo al insertar espacios en cualquiera de las secuencias según corresponda. Es posible calcular la identidad o similitud de los aminoácidos (identidad significa conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo. Un programa como BLASTx va a alinear el tramo más largo de secuencias similares y va a asignar un valor al ajuste. De esta manera es posible obtener una comparación donde se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis están contemplados en la presente invención.

En aún otra realización preferible, dicho vector de adenovirus (Ad5.3D.A20) comprende:

a) al menos una de las mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S, E450Q o L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX);

b) al menos una de las mutaciones puntuales S408E o P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR);

c) al menos una de las mutaciones puntuales D342E o D342A en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en el que dicha mutación previene la unión del virus con la integrina avp<3>/avp<5>; e

d) inserción o expresión de la secuencia peptídica de A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) en el bucle HI del nudo de fibra viral.

Aún más preferiblemente dicho vector de adenovirus (Ad5.3D.A20) comprende:

a) mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S y L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX);

b) mutaciones puntuales S408E y P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor coxsackie y adenovirus (CAR);

c) mutación puntual D342E en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (para producir la mutación RGE) en la que dicha mutación previene la unión del virus con integrina avp3/avp5; e

d) inserción o expresión de la secuencia peptídica de A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) en el bucle HI del nudo de fibra viral.

En el vector viral anterior de la invención eliminamos con éxito los tropismos nativos de Ad5 mediante la mutación de las proteínas principales de la cápside: hexón, fibra y pentona. Se generó una columna vertebral del vector basado en Ad5 desorientado triple (Ad5.3D), con modificaciones en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7), bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) y motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp. (mutación RGD) con mutaciones de sustitución en residuos de aminoácidos responsables de la unión al factor de coagulación 10 (FX), al receptor de coxsackie y adenovirus (CAR) y a las integrinas avp3/5, respectivamente.

El vector Ad5.3D se generó utilizando técnicas de recombinación homóloga y se proporcionó con un título viral alto utilizando una línea celular complementaria diseñada para rescatar al adenovirus comprometido. La combinación de tres mutaciones de ablación del tropismo bloqueó completamente la entrada celular a través de las integrinas avp3/5, CAR y FXin vitro.Además, como prueba de principio, modificamos aún más el adenovirus mediante la incorporación de una secuencia de focalización adicional para dirigir preferentemente e infectar a células tumorales cancerígenas específicas, concretamente avp6, mediante la incorporación genética de un péptido heterólogo de unión a integrina avp6 (A20, NAVPNLRGDLQVLAQKVART; SEQ ID NO: 1) dentro del bucle HI del nudo de fibra viral (Ad5.3D.A20). El adenovirus Ad5.3D.A20 se propagó utilizando células 296-p6 las cuales se diseñaron para sobreexpresar p6.

La integrina avp6 se expresa en un tercio de los cánceres de ovario y en una variedad de otros cánceres epiteliales y es no-detectable en tejidos adultos sanos. Ad5.3D.A20 transdujo eficientemente líneas celulares de cáncer de ovario aVp6+ y cultivos ex vivo de EOC derivados de ascitis clínica primaria, incluso en presencia de ascitis altamente neutralizante. El perfil de biodistribuciónin vivode Ad5.3D.A20 después de la administración sistémica en ratones no portadores de tumores se alteró notablemente en comparación con Ad5, con una expresión reducida de luciferasa en todos los órganos fuera de la diana y una carga genómica viral reducida log-7 en el hígado. Además, se evaluó la eficacia anti-tumoral de Ad5.3D.A20 oncolítico (OAd5.3D.A20) después de la administración intraperitoneal en ratones inmunocomprometidos portadores de xenoinjertos intraperitoneales EOC 3KOV3(-p6). El tratamiento oncolítico con OAd5.3D.A2o mejoró la supervivencia general en comparación con el tratamiento con Ad5.

En consecuencia, el adenovirus Ad5.3D es un vector viral que, mediante la incorporación de otra mutación focalizada específica al cáncer, representa una interesante plataforma dirigida para el tratamiento del cáncer y la adenoviroterapia.

En aún otra realización preferida, dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir al menos un transgén que codifica para una molécula o agente tal como, pero no limitado a, un agente terapéutico. Por lo tanto, esta realización se refiere a la administración de un agente, intracelularmente, para ejercer una acción terapéutica sobre la célula cancerígena diana. Los ejemplos de un agente pueden incluir un agente que estimula directamente una respuesta inmune, por ejemplo GM-CSF, IL-12; un agente para estimular indirectamente el sistema inmune, por ejemplo, un anticuerpo (o fragmentos de un anticuerpo) que codifica para un inhibidor del punto de control inmune para inhibir un correpresor tal como CTLA-4, PD-L1, PD1 o Lag3; una construcción de anticuerpo biespecífico de interacción con células T (BiTE); una construcción de anticuerpo biespecífico de interacción con las células asesinas naturales (BiKE); un agente que sensibiliza los tumores a una inmunoterapia basada en células, por ejemplo, codificando para CD19; un agente que agota las células T reguladoras dentro de los microambientes tumorales. codificando para anticuerpos anti-CD25; un agente que sensibiliza un tumor a la radioterapia o para la imagenología, por ejemplo, codificando para el simportador de sodio/yoduro (NIS) o el receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2)). Alternativamente, el transgén puede codificar para un agente terapéutico que sea directamente tóxico para una célula tumoral, por ejemplo, codificando para el transgén de Expresión Reducida en Células Inmortalizadas (REIC/DKK3), o una enzima que sensibiliza una célula cancerígena mediante la conversión de un profármaco no-tóxico en un fármaco tóxico, por ejemplo, citosina desaminasa, nitroreductasa, timidina cinasa. En el funcionamiento de la invención se pueden utilizar otros transgenes conocidos en la técnica y útiles en el tratamiento del cáncer.

Aún en una realización preferible adicional, dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una deleción de 24-pares de bases dl922-947 (mutación A24) en el gen E1A para restringir la replicación viral a células defectuosas en pRB.

Aún más preferiblemente, dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una única adición de base de adenina en la posición 445 dentro del dominio de retención del retículo endoplasmático (ER) en E3/19K (mutación T1) para potencia oncolítica mejorada.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona el adenovirus tal como se define en la presente para uso como un medicamento.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona el adenovirus tal como se define en la presente para su uso en el tratamiento del cáncer.

Lo más preferiblemente, el cáncer al que se hace referencia en la presente incluye uno cualquiera o más de los siguientes cánceres: cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conectivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células-T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-ENison, cáncer suprarrenal, cáncer de ano, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uretra, cáncer de cerebro, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de médula espinal, cáncer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del tracto gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer de ojo, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de páncreas endocrino, glucagonoma, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatidiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labio, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer pleural, cáncer de glándula salival, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.

Los compuestos para uso en medicina generalmente se van a proporcionar en una composición farmacéutica o veterinaria y, por lo tanto, de acuerdo con un cuarto aspecto más de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el adenovirus como se define en la presente y un portador, adyuvante, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los excipientes farmacéuticos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para la administración por cualquier vía adecuada, por ejemplo, oral, bucal, nasal o bronquial (inhalado), transdérmica o parenteral y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica.

La composición se puede preparar asociando al adenovirus definido anteriormente con el portador. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima al adenovirus con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto. La invención se extiende a métodos para preparar una composición farmacéutica que comprende traer un adenovirus como se define anteriormente en conjunto o asociación con un portador o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

La referencia en la presente a una "cantidad eficaz" del adenovirus o una composición que lo comprende es aquella que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado, tal como la muerte de células cancerígenas. Se entiende que la dosis efectiva va a depender de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Normalmente, la cantidad eficaz la determina quienes administran el tratamiento.

En las reivindicaciones a continuación y en la descripción anterior de la invención, excepto donde el contexto requiera lo contrario debido al lenguaje expreso o implicación necesaria, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprendiendo" o "que comprende" se utilizan en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características indicadas, pero no para excluir la presencia o adición de características adicionales en diversas realizaciones de la invención.

Las características preferibles de cada aspecto de la invención pueden ser como se describen en relación con cualquiera de los otros aspectos.

Otras características de la presente invención resultarán evidentes a partir de los siguientes ejemplos. En términos generales, la invención se extiende a cualquier característica novedosa, o cualquier combinación novedosa divulgada en esta especificación (incluidas las reivindicaciones y figuras adjuntas). Por lo tanto, se debe entender que los rasgos, números enteros, características, compuestos o fragmentos químicos descritos en conjunto con un aspecto particular, realización o ejemplo de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en la presente, a menos que sea incompatible con el mismo.

Además, a menos que se indique lo contrario, cualquier característica divulgada en la presente puede ser reemplazada por una característica alternativa que sirva para el mismo propósito o uno similar.

A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta especificación, el singular abarca el plural a menos que el contexto requiera lo contrario. En particular, donde se utiliza el artículo indefinido, se debe entender que la especificación contempla tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario.

A continuación, se describirá una realización de la presente invención a modo de ejemplo únicamente con referencia a lo siguiente, en el que:

Figura 1. Vectores generados. (A) Titulaciones virales y tropismos esperados de Ad5 y triplemente desorientado, vector re-orientado a integrina avp6, Ad5.3D.A20. (B) Mapa del vector oncolítico Ad5.3D.A20. (C) Modelado 3D predictivo comparativo del nudo de fibra del adenovirus serotipo 5 (Ad5) y del nudo de fibra de Ad5.3D.A20 modificado con el péptido A20 (NAVPNLRGDLQVLAQKVART; SEQ ID NO: 1) inserción en el bucle HI (en verde). CAR, receptor de coxsackie y adenovirus; FX, factor de coagulación 10; HVR7, mutación de unión a FX en la región hipervariable 7 del hexón; KO1, mutación de unión al CAR en el bucle AB del nudo de fibra; Luc, transgén de luciferasa; vp, partícula viral.

Figura 2. Ablación de los tropismos de receptores nativos. (A) Unión de vectores Ad5 y Ad5.3D.A20 con replicacióndeficiente al receptor de coxsackie y adenovirus (CAR). La proporción de expresión del transgén viral de Ad5.3D.A20 en relación con Ad5 se indica arriba de las barras. (B) Unión de Ad5 con replicación-deficiente y variante de Ad5 mutada en HVR7 al factor de coagulación 10 (FX0 se evaluó en ensayos de luciferasa al infectar células en presencia de FX humano con (+) o sin (-) anticoagulante X-bp durante 3 h a 37 °C. HVR7, mutación de unión a FX. Significancia estadística: ns, p?0.05; **, p<0.01.

Figura 3. Evaluaciónin vitrode la focalización a integrina aVp6. Eficiencia de transducción de vectores de tipo-silvestre con replicación-deficiente (Ad5) y triplemente-desorientado, re-orientado a integrina (Ad5.3D.A20) en (A) células de cáncer de mama aVp6+ BT-20 y (B) células de cáncer de ovario epitelial primario aVp6+ (EOC) del paciente 004. (C) Expresión de luciferasa mediante vectores oncolíticos (T1/A24) en células infectadas avp6-bajo/CAR+ SKOV3 y avp6-alto/CAR+ SKOV3-p6 (células SKOV3 producidas internamente con expresión retroviral de avp6). (D) Inhibición de la competencia de la entrada celular mediada por integrina avp6. El 10% más alto de células SKOV3-p6 que expresanavp6 se clasificaron mediante FACS, se sub-cultivaron e infectaron. IgG, control normal de IgG de ratón; 10D5, anticuerpo bloqueador de la función anti-avp6. La proporción de expresión del transgén viral se indica arriba de las barras. Significancia estadística ns, p>0.05; *, p < 0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

Figura 4. El efecto de la ascitis ovárica maligna en la transducción del vector exvivo.(A) Cuantificación de anticuerpos anti-Ad5 en veinte muestras clínicas de ascitis ovárica (OAS) y suero de control de un voluntario masculino sano (línea negra continua) mediante ELISA. Las líneas horizontales indican una unión del 50% y 100% de abs anti-Ad5 en el suero de control. (B) Especificidad por el antígeno de los anticuerpos anti-Ad5 en ascitis y suero mediante Western blot. Eficiencia de transducción del vector, de los vectores con replicación-defectuosa (Ad5) y Ad5.3D.A20, en ausencia y presencia de diluciones variables de ascitis del paciente 004 con cáncer de ovario en (C) células BT-20 y (D) cultivo primario ex vivo de células epiteliales de cáncer de ovario del paciente 004. Las células se pre-incubaron con concentraciones ascendentes de ascitis y se infectaron.

Figura 5. Biodistribución de vectores con replicación-defectuosa a las 72 h después de la administración sistémica. (A) Cronograma de estudio de la biodistribución y (B) imagenología in vivo de la biodistribución del virus Ad5.3D.A20 con replicación-defectuosa (Ad5) y triplemente-desorientado, 3 días después de la inyección intravenosa. Cuantificación de la señal de luminiscencia total del panel B: en (C) todo el cuerpo, (D) hígado, 335 (E) bazo, (F) pulmones, (G) ovarios y (H) corazón, i.p., intraperitoneal; IVIS, sistema de imagenología in vivo; p.i., post-infección; vp, partícula viral. Las barras de error representan el error estándar de la media; n=5/grupo; ns, p>0.05; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.

Figura 6. Número de copias del genoma viral en órganos fuera de la diana después de la administración sistémica. Número de copias del genoma del adenovirus de tejidos extirpados en la figura 5: (A) hígado, (B) bazo, (C) pulmones, (D) ovarios y (E) corazón mediante qPCR para el gen de hexón después de la administración sistémica del vector. Los datos se normalizaron y analizaron mediante ANOVA de una-vía y comparaciones múltiples de Sidak pruebapost hocen GraphPad Prism. Las barras de error representan el error estándar de la media; n = 5/grupo; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; p<0.0001; ns, no hay diferencias estadísticamente significativas. Los números debajo de las gráficas indican una disminución del número de veces del grupo Ad5.3D.A20 en relación con el grupo Ad5.

Figura 7. Estudio de la eficacia oncolítica: administración intraperitoneal de los vectores oncolíticos en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario. (A) Cronograma de estudio. Se implantaron xenoinjertos intraperitoneales de células de cáncer de ovario humano (SKOV3 y SKOV3-D6) en ratones inmuno-comprometidos (n = 5/grupo), luego se trataron con 3 dosis de Ad5 oncolítico intravenoso o triplemente desorientado, re-orientado a integrina Ad5.3D.A20, en los días 14, 16 y 18. Las imágenes del mapa de calor de luminiscencia (B, D) y la cuantificación de la luminiscencia corporal total (C, E) se determinó a las 349 48 h después del primer tratamiento (Día 16) y a los 7 días después del primer tratamiento (Día 21). La supervivencia global de los animales inoculados con células (F) SKOV3 (avp6-bajo/CAR+) y (G) SKOV3-p6 (avp6-alto/CAR+) y luego tratados con virus, como anteriormente, se muestra como una curva de supervivencia de Kaplan-Meyer hasta el último punto final del estudio a los 101 días. i.p, intraperitoneal; IVIS, sistema de imagenología in vivo; vp, partícula viral *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001. IVIS, Sistema de Imagenología In Vivo.

Figura 8. Estudio de biodistribución: Imágenes de mapas de calor de intensidad de luminiscencia exvivo.Hígado, bazo, pulmones, ovarios y corazón se recolectaron inmediatamente post-mortem de animales que habían sido inoculados por vía intravenosa con (A) PBS (control), los vectores (B) Ad5.Luc o (C) Ad5.3D.A20. Los órganos se sumergieron en D-luciferina y se tomaron imágenes en un generador de imágenes IVIS. El color del tejido indica la intensidad de luminiscencia relativa emitida por el transgén de luciferasa; las escalas se normalizaron para excluir la luminiscencia de fondo. (D) Disminución de veces de la luminiscencia total (fotones/segundo) en relación con Ad5.Luc. La intensidad de luminiscencia media del grupo Ad5.Luc se dividió por la luminiscencia media en cada órgano en el grupo Ad5.3D.A20. El valor medio del grupo de control de PBS se restó de todos los valores.

Figura 9. Estudio de biodistribución: Inmunohistoquímica en secciones de hígado fijadas con formalina y embebidas en parafina. (A) Tinción con hematoxilina-eosina para la visualización de las estructuras celulares y tinción de hígado de ratón utilizando un anticuerpo de control de isotipo IgG de conejo (1 |jg/mL), un anticuerpo anti-CAR primario de conejo (1:100) y un anticuerpo primario de conejo anti-ITGB6 (aVp6) (1:10). (B) Tinción de células hepáticas infectadas con Ad5 en animales infectados con los vectores Ad5 o Ad5.3D.A20, utilizando un anticuerpo primario de conejo anti-Ad5 (1 jg/mL). Se utilizó DAB como sustrato, las secciones se contratiñeron en hematoxilina, se montaron en cubreobjetos y se observaron bajo un microscopio óptico.

Figura 10. Estudio piloto: Localización de tumores y tasa de captación en ratones NOD/SCID. 1*107de células SKOV3-p6/animal se implantaron i.p. el día 0 y se sacrificaron dos ratones en cada punto de tiempo: en los días 7, 14, 21 y 48/49 (último punto final). Se midió el tamaño aproximado del tumor y se cuantificó el volumen de ascitis.

Figura 11. Estudio de eficacia oncolítica: Caracterización de tumores de punto final. (A) Número de copias del genoma viral (por 40 ng de ADN) y (B) expresión génica de integrinaav¡36 (ITGB6)en tumores post-mortem en OAd5 y OAd5.3D.A20 de las cohortes SKOV3 y SKOV3-p6 mediante qpCR. El nivel de expresión de avp6 se muestra en relación con el ratón #1 del grupo de PBS del control negativo en la cohorte SKOV3, utilizandoACTBhumano (pactina) como control endógeno.

Figura 12. Actividad de transducción de Ad5.3D.A20 y Ad5 que expresan luciferasa en líneas celulares de cáncer de páncreas. Los niveles de expresión de avp6 y hCAR se determinaron en ASPC-1 (A), BxPc (B), CFPAC (C), PANC10-05 (D), SW1990 (E), PANC0403 (F), SUIT-2 (G), MiPaCa2 (H) y líneas celulares de cáncer de páncreas PT45 (I). Las células se infectaron con 5,000 vp/célula de virus expresando luciferasa y se cuantificó la expresión del transgen y se corrigió para la proteína celular total 48 horas después de la infección.

Figura 13. Actividad de transducción de Ad5.3D.A20 y Ad5 que expresan luciferasa en líneas celulares de cáncer de esófago. Los niveles de expresión de avp6 y hCAR se determinaron en células de cáncer de esófago Kyse-30. Las células se infectaron con 5,000 vp/célula de virus expresando luciferasa y se cuantificó la expresión del transgén y se corrigió para la proteína celular total 48 horas después de la infección.

Figura 14: actividad de transducción de Ad5.3D.A20 y Ad5 que expresan luciferasa en líneas celulares de cáncer de mama. Los niveles de expresión de avp6 y hCAR se determinaron en células de cáncer de mama BT-20 (A), BT-474 (B), MDA-MB-361 (C) y MDA-MB-231 (D). Las células se infectaron con 5,000 vp/célula de virus expresando luciferasa y se cuantificó la expresión del transgén y se corrigió para la proteína celular total 48 horas después de la infección.

Figura 15: actividad de transducción de Ad5.3D.A20 y Ad5 que expresan luciferasa en líneas celulares de cáncer de pulmón. Los niveles de expresión de avp6 y hCAR se determinaron en células de cáncer de pulmón A427 (A), A549 (B) y NCI-H460 (C). Las células se infectaron con 5,000 vp/célula de virus expresando luciferasa y se cuantificó la expresión del transgén y se corrigió para la proteína celular total 48 horas después de la infección.

Figura 16: actividad oncolítica de Ad5.3D.A20 y Ad5 de replicación deficiente y oncolítica (O) en líneas celulares de cáncer de páncreas y de mama. Las líneas celulares de cáncer de páncreas Suit 2 (avp6alto/hCARalto), MiCaPa2 (avp6bajo/hCARalto), pAnC0403 (avp6valto/hCARalto) y PT45 (avp6neg/hCARalto) y las líneas celulares de cáncer de mama BT-20 (avp6alto/hCARneg) y MDA-MB-231 (avp6neg/hCARalto) se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 20,000 células/pocillo. Las células se infectaron con 5,000 vp/célula y la viabilidad celular se cuantificó cada 24 horas utilizando un ensayo de viabilidad celular estándar MTS. Como se esperaba, los vectores con replicación deficiente no mostraron efectos perjudiciales sobre la viabilidad celular, mientras que la actividad de muerte celular (oncolítica) de OAd5.3D.A20 y OAd5 estaba directamente relacionada con la presencia/ausencia de avp6 y hCAR celular.

Materiales y métodos

Vectores de adenovirus, líneas celulares y ascitis clínica

Todos los vectores generados expresaban luciferasa (Luc) y se basaban en un genoma Ad5 de tipo silvestre capturado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Todas las modificaciones genéticas se introdujeron en los BACs mediante métodos de recombinación homóloga de AdZ (Stanton et al., 2008) como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2016). Los virus se produjeron en células T-Rex 293 o HEK293-p6 (virus modificados con A20). Los vectores de replicación-deficiente llevan una deleción completa del genE1/E3,mientras que los vectores oncolíticos tienen una deleción de 24-pares de basesdl922-947(A24) (Fueyo et al., 2000) en el genE1Apara restringir la replicación viral a células defectuosas en pRB (Sherr, 1996), y mutación T1, una adición de una única base de adenina en la posición 445 dentro del dominio de retención del retículo endoplásmico (ER) enE3/19Kpara mejorar la potencia oncolítica (Gros et al., 2008). La secuencia peptídica deA20 heteróloga (NAVPNLRGDLQVLAQKVART; SEQ ID NO: 1) de FMDV se insertó genéticamente en el bucle HI del nudo de fibra. Se produjeron virus de alta titulación en células T-REx-293 o HEK293-p6, en esencia como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2015, Uusi-Kerttula et al., 2016).

La línea celular SKOV3-p6 se generó internamente. El plásmido pBABE-p6 selectivo para puromicina con la inserción del gen¡36(#13596; Addgene) se transfectó en una línea celular empaquetadora 293Phoenix utilizando Effectene. Después de 48 h, se cosechó el retrovirus, se filtró y se utilizó para infectar células SKOV3; se seleccionaron células que expresan integrina avp6 en presencia de 5 jg/m L de puromicina. El permiso para la recolección y el cultivo de células COE primarias a partir de ascitis se concedió a través de una solicitud de biomateriales del Wales Cancer Bank, referencia WCB 14/004. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección. Se recolectaron muestras clínicas de ascitis de pacientes sometidos a tratamiento para cáncer de ovario avanzado en el Velindre Cancer Centre, Cardiff y se anonimizaron. Las células se procesaron y sub-cultivaron como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2015, Uusi-Kerttula et al., 2016).

Ensayos in vitro

La expresión del receptor de la superficie celular se evaluó mediante citometría de flujo como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2016), utilizando un clon 10D5 anti-avp6 y un clon de anticuerpo RmcB anti-CAR, seguido de un IgG secundario F(ab')2-de cabra a-ratón (H+L) AlexaFluor647 IgG. La presencia de anticuerpos anti Ad5 en ascitis ovárica y suero se determinó esencialmente de acuerdo con un método ELISA reportado anteriormente (Stallwood et al., 2000). La especificidad por el antígeno de los anticuerpos se evaluó mediante Western blot.

La eficiencia de la transducción celularin vitrose evaluó en ensayos del gen reportero de luciferasa esencialmente como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2015, Uusi-Kerttula et al., 2016) en un lector de placas multimodal, y las unidades de luz relativas (RLU) se normalizaron a la concentración de proteína total en cada pocillo (RLU/mg). Para evaluar el efecto del FX sobre la eficiencia de la transducción, los medios de transducción se suplementaron con 10 pg/mL de FX humano. El tropismo del vector para los receptores celulares se evaluó en ensayos de inhibición de la competencia como se describió anteriormente (Uusi-Kerttula et al., 2016), utilizando anticuerpo antiavp6 (10 pg/mL; clon 10D5, Millipore) o IgG de control anti-ratón normal (10 pg/mL; Santa Cruz). Los ensayos de neutralización implicaron un paso de pre-incubación en diluciones 2-veces seriadas (1:40-1:2.5, correspondiente a una concentración final de 2.5-40 %) de OAS libre de células.

Estudiosin vivo

Todos los experimentos con animales se realizaron en la Mayo Clinic, Rochester, EE. UU. Para mantener la coherencia de los resultados, todos los animales tenían 7 semanas de edad y fueron emparejados por sexo; Se eligieron ratones hembra debido a la facilidad de alojamiento. Todo el manejo e inyecciones de los animales se realizó por una tecnóloga veterinaria experimentada, la Sra. Jill M. Thompson, de acuerdo con las regulaciones locales.

El estudio de biodistribución de vectores con replicación-deficiente se realizó en ratones albinos B6 de tipo silvestre (B6N-Tyr°'Brd/BrdCrCrl) (n = 5/grupo) debido a la viabilidad de su pelaje blanco para el seguimiento de la luciferasa. Los virus se inyectaron en la vena lateral de la cola a 1 * 1011 vp. Todos los ratones fueron sacrificados después de la imagenología IVIS a las 72 h post-infección mediante inhalación de CO<2>y los órganos se cosecharon para su análisis. El estudio de eficacia se realizó en ratones NOD/SCID inmunocomprometidos (n = 5/grupo). El cronograma de tratamiento se optimizó por primera vez en un estudio piloto (n = 8). Se implantaron i.p. 1 * 107 células SKOV3-p6 en el día 0 y se sacrificaron a dos ratones los días 7, 14, 21 y 48/49 (último punto final). La expresión de CAR y avp6 en los tumores en cada punto de tiempo se evaluó mediante citometría de flujo. En el estudio de eficacia oncolítica, a los ratones NOD/SCID se les realizó un xenoinjerto i.p. con 1 * 107 células SKOV3 o SKOV3-p6 en el día 0. Luego se trató a los ratones (n = 5/grupo) con una inyección i.p. de 1 * 1010 vp de OAds (PBS, OAd5 y OAd5.3D.A20) en los días 14, 16 y 18. El punto final primario era la supervivencia global (%). La captación del vector se monitoreó cuantificando la señal de luminiscencia emitida por el transgén de luciferasa en un generador de imágenes Xenogen IVIS 200 (PerkinElmer). El número de copias del genoma viral en los órganos primarios fuera de la diana y tumores de punto final se cuantificó mediante qPCR. El nivel de expresión del gen avp6 en tumores de punto final se cuantificó mediante qPCR.

Breve protocolo del ensayo de viabilidad celular

Para los ensayos de viabilidad celular, se utilizó el ensayo de Proliferación Celular CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Se sembraron 20,000 o 30,000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células se infectaron con 5,000 partículas virales por célula (vp/célula) durante 3 horas en medio libre de suero. Las células viables se determinaron a las 24, 48, 72, 96 y 144 horas después de la infección, añadiendo 20 pl de reactivo CellTiter 96 AQueous One Solution por pocillo. La absorbancia se midió en 490 nm después de 2 horas de incubación en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se calculó el % de células viables en relación con las células no tratadas. Los resultados son la media, n=3, las barras de error representan la desviación estándar.

Análisis estadístico

Todas las figuras y análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism versión 6.03. Los ensayosin vitroy exvivose analizaron mediante pruebas-t no pareadas de dos-colas o ANOVA de una-vía con comparaciones múltiples de Dunnett pruebaposthoc. In vivolos datos se normalizaron y analizaron mediante ANOVA de una-vía con comparaciones múltiples de Sidak pruebaposthoc.La supervivencia global (%) después del tratamiento oncolítico se muestra como una curva de supervivencia de Kaplan-Meier; las proporciones de supervivencia se analizaron mediante la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Todas las pruebas: ns, p > 0,05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.

Resultados

Generamos y produjimos variantes oncolíticas y de titulación viral alta con replicación-defectuosa de un novedoso vector Ad5.3D.A20 con tres mutaciones de desorientación y una inserción del péptido A20 que re-orienta el vector a las células que expresan integrina avp6 (Fig. 1). Las múltiples manipulaciones genéticas no tuvieron un impacto significativo en la titulación. El modelado predictivo en la plataforma SWISS147 MODEL indicó una protrusión del péptido A20 dentro del bucle HI inmunodominante (Fig. 1C).

La eficiencia de transducción de vectores con replicación-deficiente se evaluó en líneas celulares que expresan cantidades variables de CAR e integrina avp6. Las mutaciones desorientadoras de Ad5.3D.A20 abolieron por completo la entrada a través de CAR en las células CHO-CAR (CAR+), mientras que Ad5 transdujo estas células de manera eficiente (Fig. 2A). La mutación HVR7 abolió la transducción del vector a través de FX (Fig. 2B). Como se esperaba, FX aumentó significativamente la transducción de Ad5 en estas células en comparación con las condiciones de cultivo libres de FX (Fig. 2B; panel derecho). Por el contrario, la adición de FX humano en el medio de cultivo no tuvo ningún efecto sobre la eficiencia de transducción del vector de control Ad5.HVR7 con la unión a FX eliminada en células CHO-K1 (Fig. 2B; panel izquierdo). Además, la transducción mejorada observada para Ad5 se revirtió mediante la adición de un exceso molar de 3:1 de proteína que interactúa con el dominio-Gla, anticoagulante X-bp, que se une a e inactiva a FX en el medio (Fig. 2B, panel derecho). Por el contrario, el agotamiento de FX no afectó la transducción del vector Ad5.HVR7 (Fig. 2B, panel izquierdo).

Se ha confirmado que la integrina avp6 es el receptor de entrada primario para Ad5.3D.A20, triplemente desorientado y re-orientado a integrina (Fig. 3). Ad5.3D.A20 transdujo células de cáncer de mama avp6+/CAR- BT-20 con una eficiencia 305-veces mayor (Fig. 3A; p = 0.0270) y células primarias EOC004 (avp6+/CAR-) con una eficiencia 69 veces mayor (Fig. 3B; p=0.0090) con respecto a Ad5. Además, una variante oncolítica del vector Ad5.3D.A20 transdujo células SKOV3-p6 (avp6-alto/CAR+) con una eficiencia ~5 veces mayor en relación con las células SKOV3 que expresan niveles bajos de avp6 (avp6-bajo/CAR+, Fig.3C; p<0.0001), confirmando que las modificaciones oncolíticas no habían comprometido la interacción del péptido A20:avp6. Los ensayos de competencia que utilizaron un anticuerpo anti-avp6 (10D5) inhibieron significativamente la transducción mediante el vector Ad5.3D.A20 (169 Fig. 3D; p= 0.0010), lo que confirma la selectividad para avp6.

Se cribaron muestras clínicas de ascitis ovárica (OAS) de veinte pacientes para detectar la presencia de anticuerpos anti-Ad5 mediante ELISA. Las titulaciones de abs anti-Ad5 en ascitis ovárica maligna se examinaron frente a la titulación de anticuerpos anti-Ad5 en suero de un voluntario adulto sano (Fig. 4A). Se encontró que una proporción igual de pacientes tenía titulaciones de anticuerpos más bajos y más altos que el suero de control (Fig. 4A, línea discontinua negra). Se eligió la ascitis del paciente 001 (OAS001) para ensayos de neutralización subsecuentes debido a su titulación de anticuerpos similar al del suero de control. Los anticuerpos en OAS001 y en suero de control parecían específicos para la proteína de la fibra, mientras que la proteína más abundante de la cápside, el hexón, se reconoció solamente en niveles muy bajos en Western blot utilizando partículas virales desnaturalizadas (Fig. 4B). El efecto neutralizante de OAS001 sobre la eficiencia de transducción de Ad5.3D.A20 se evaluó en células primarias avp6+/CAR- EOC004. Ad5.3D.A20 mostró una eficiencia de transducción superior (hasta 902-veces mayor) en relación con Ad5 en concentraciones de OAS de 2.5, 5 y 10%, mientras que Ad5 no transdujo estas células a niveles detectables (Fig. 4C).

Se inoculó por vía intravenosa a ratones que no eran portadores de tumores para evaluar el tropismo del vectorin vivo,en particular, el efecto de las tres mutaciones desorientadoras sobre la biodistribución del vector (Fig.5A). Ad5 mostró una localización intensa en el área hígado y bazo, mientras que la luminiscencia del vector Ad5.3D.A20 fue indetectable a las 72 h (Fig. 5B). Los animales inoculados con Ad5 tuvieron una luminiscencia de todo el cuerpo significativamente mayor que los animales de control tratados con PBS (p<0.0001) o Ad5.3D.A20 (p<0.0001) (Fig. 5C). Se extirpó y cuantificó el hígado, el bazo, los pulmones, los ovarios y el corazón para luminiscenciaex vivo(para mapas de calor de luminiscencia, véase la figura 8A-C). Los hígados de los animales desafiados con Ad5 emitieron significativamente más luminiscencia que los grupos de control de PBS o de Ad5.3D.A20 (ambos p <0.0001) (Fig. 5D). De manera similar, Ad5.3D.A20 tuvo una expresión del transgén significativamente reducida en el bazo, los pulmones, los ovarios y el corazón, en relación con Ad5 (Fig. 5E-H; p <0.0001 para todos). Para los cambios de veces en la intensidad de la luminiscencia en cada órgano, véase la figura 8D.

La confirmación de que las modificaciones en Ad5.3D.A20 dieron como resultado un secuestro reducido de 196 de virus en múltiples tejidos normales se confirmó mediante la cuantificación de la carga viral en órganos fuera de la diana mediante qPCR. El número de copias del genoma de Ad5.3D.A20 fue 10 millones de veces menor en el hígado en relación con el Ad5 (Fig. 6A; p <0.0001). De manera similar, el número de copias del genoma de Ad5.3D.A20 fue más de 700-veces menor en el bazo en comparación con Ad5 (Fig. 6B; p <0.0001). Además, el vector Ad5.3D.A20 mostró perfiles fuera de la diana mejorados en todos los órganos en relación con Ad5, con una carga viral de 105, 104 y 103 menor en los pulmones, el corazón y los ovarios, respectivamente (Fig. 6C-E). La desorientación exitosa del hígado debido a nuestras modificaciones genéticas de Ad5 está respaldada por la tinción inmunohistoquímica de secciones del hígado, las cuales mostraron altos niveles de expresión de CAR, mientras que avp6 fue indetectable (figura 9A). La confirmación de los efectos de desorientación de las modificaciones genéticas en Ad5.3D.A20 está proporcionada por la observación de que las secciones de hígado de ratones mostraron tinción positiva para las proteínas de la cápside de Ad en el grupo Ad5, pero no en hígados de los ratones que habían sido desafiados con el vector Ad5.3D.A20 (figura 9B).

Para evaluar la eficacia de la re-orientación de avp6 en un modelo de cáncerin vivo,se establecieron xenoinjertos de cáncer de ovario humano avp6-alto/CAR-SKOV3-p6 en ratones NOD/SCID inmunocomprometidos. Los animales desarrollaron grandes tumores sólidos en el sitio de la inyección de las células y en varios sitios dentro de la cavidad peritoneal dentro de los 14 días posteriores a la implantación intra-peritoneal de células SKOV3-p6 y, para el día 49, los tumores se diseminaron a través de la cavidad peritoneal con la acumulación de grandes volúmenes de ascitis. Los tumores mantuvieron una alta expresión de avp6 (para citometría de flujo, véase la figura 10). Con base en estas observaciones, realizamos estudios de eficacia de viroterapia administrando tres dosis intravenosas de variantes oncolíticas de Ad5 y Ad5.3D.A20 en los días 14, 16 y 18 post-implantación de avp6-bajo/CAR-SKOV3 y avp6-alto/CAR - SKOV3-P6.

La imagenología IVIS a las 48 h después de la primera dosis de tratamiento de viroterapia (día 16) mostró una luminiscencia extendida a través de la región abdominal en animales tratados con el vector oncolítico Ad5, con mayor intensidad en la región del hígado/bazo, tanto en los modelos de xenoinjerto SKOV3 como SKOV3-p6 (Fig. 7B). Esta distribución se mantuvo, pero a menor intensidad, 5 días después, en el día 21 (Fig. 7D). Por el contrario, el vector Ad5.3D.A20 223, sin embargo, mostró una localización muy selectiva, con una luminiscencia general significativamente reducida en relación con Ad5, lo es consistente con una desorientación exitosa de los tejidos notumorales. Para ambos modelos SKOV3 y SKOV3-p6, la cuantificación de la luminiscencia corporal total mostró que la absorción del vector Ad5.3D.A20 era significativamente menor que la de Ad5 tanto en el día 16 (Fig. 7C; p<0.05 y <0.01, respectivamente) como en el día 21 (Figura 7E; p<0.0001).

Se observó actividad anti-tumortanto para Ad5 oncolítico como para Ad5.3D.A20 oncolítico en el modelo de xenoinjerto SKOV3 (Fig. 7F). De acuerdo con un efecto selectivo de tumores mejorado de Ad5.3D.A20, los cinco ratones tratados con Ad5.3D.A20 todavía estaban vivos en el último punto de tiempo de 101 días, mientras que los animales tratados con Ad5 solamente sobrevivieron hasta 70 días.

Realizamos ensayos de transducción adicionales en un rango de líneas celulares cancerígenas de origen pancreático (Fig. 12), esofágico (Fig. 13), de mama (Fig. 14) y de pulmón (Fig. 15). Todos los tipos de células se analizaron primero para la expresión de avp6 y hCAR (histogramas en cada figura). 7/9 de líneas celulares pancreáticas (ASPC-1, BxPc, CFPAC, PANC 10.05, SW1990,<p>A<n>C 0403 y Suit2 expresaron avp6 en niveles variables y pudieron transducirse eficientemente con Ad5.3D.A20 (Fig. 12A-G). Por el contrario, las células MiPaCa2 (Fig. 12H) y PT45 (Fig. 12I) expresaron muy poco o nada de avp6 y fueron poco permisivas a la transducción mediada por Ad5.3D.A20, como se podría predecir. Las líneas celulares esofágicas Kyse-30 expresaron altos niveles de avp6 y fueron altamente permisivas a la transducción mediada por Ad5.3D.A20 (Fig. 13). En las líneas celulares de cáncer de mama analizadas, 3 de las 4 líneas celulares analizadas (BT-20, BT-474 y MDA-MB361) expresaron avp6 en diversos grados y fueron permisivas a la transducción mediada por Ad5.3D.A20 (Fig. 14A-C), mientras que a la inversa la falta de expresión de avp6 en células MDA-MB-231 hizo que las células fueran no-infecciosas para Ad5.3D.A20 (Figura 14D). En las 3 líneas celulares de cáncer de pulmón analizadas (A427, A549 y NCI-H460, Fig. 15A-C), avp6 estaba ausente y las células eran refractivas a la transducción mediada por Ad5.3D.A20.

Para evaluar la actividad de muerte celular de las versiones oncolíticas de Ad5.3D.A20, se realizaron ensayos de viabilidad celular en líneas celulares de cáncer de páncreas en avp6alto (Suit2, Panc0403) y avp66bajo (MiPaCa2) o avp6neg (PT45) (Fig. 16). Las células se infectaron con 5,000 vp/célula de ya sea Ad5 o Ad5.3D.A20 con replicación deficiente o Ad5 o Ad5.3D.A20 oncolítico (O). Como se esperaba, los vectores con replicación deficiente no mediaron ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular, mientras que se demostró que la actividad de muerte celular de los vectores oncolíticos mostraba una buena correlación con la expresión de avp6. De manera similar, en la línea celular de cáncer de mama triple negativa BT-20 avp6alto/hCARneg, la presencia de altos niveles de avp6 junto con la falta de hCAR dio como resultado que solamente OAd5.3D.A20 fuera capaz de mediar eficientemente la muerte celular. Por el contrario, en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 avp6neg/hCARalto, OAd5 solamente podía matar células de manera eficiente debido a la presencia de hCAR y la ausencia de avp6.

Discusión

Describimos un nuevo vector adenoviral oncolítico selectivo de tumores, Ad5.3D.A20, al que se le eliminan todos los tropismos nativos conocidos y se re-orienta a un marcador pronóstico de cáncer sobre-expresado - la integrina avp6. La integrina avp6 es una diana prometedora para aplicaciones terapéuticas contra el cáncer debido a su expresión en cánceres transformados agresivamente.

En el presente estudio, una forma de replicación-defectuosa del vector Ad5.3D.A20 desorientó con éxito la captación viral por parte de las células a través de vías de captación viral nativas (Fig. 2), en lugar de re-orientar selectivamente a las células aVp6+,in vitroy exvivo(Fig. 3). Aunque las interacciones que limitan la eficacia que se producen en la administración sistémica de los vectores adenovirales pueden, en teoría, pasarse por alto mediante la administración intracavitaria del vector, a través de la vía i.p., en la práctica esta aproximación presenta desafíos ya que el Ad5 de tipo-silvestre es secuestrado por nAbs anti-Ad5 en el fluído ascítico. Por lo tanto, evaluamos la eficiencia de transducción de Ad5.3D.A20 en presencia de OAS con niveles pre-existentes altos de nAbs anti-Ad5 (Fig. 4A). A diferencia de Ad5, Ad5.3D.A20 mantuvo su capacidad para transducir células avp6+, incluso a concentraciones de OAS relativamente altas (Fig. 4C).

La eficacia clínica de los vectores Ad5 con cápsides no modificadas también está significativamente limitada por el secuestro de tejido fuera de la diana, particularmente en el hígado. Demostramos que Ad5.3D.A20 alteró con éxito la biodistribución del vector Ad5in vivo.En ratones libres de tumores, Ad5.3D.A20 con replicación-deficiente demuestra una biodistribución mejorada en comparación con el Ad5 parental, con una expresión del transgén viral significativamente reducida en el hígado, el bazo y los pulmones (Fig. 5), y un menor número de copias del genoma viral en todos los órganos fuera de la diana 274 en comparación con Ad5 (Fig. 6).

Para probar la eficacia de una forma oncolítica de nuestro vector Ad5.3D.A20 desorientado/re-orientado, establecimos un modelo de xenoinjerto i.p. ortotópico de cáncer de ovario humano en ratones inmunocomprometidos. La bio distribución más localizada de la expresión transgénica codificada-viralmente de Ad5.3D.A20 oncolítico después de la administración intraperitoneal fue consistente con una reducción del secuestro fuera de la diana y/o la absorción selectiva del virus por los tumores (Fig. 7B-E). Esto fue respaldado por la supervivencia superior de los animales tratados con Ad5.3D.A20 en relación con Ad5, en un modelo de xenoinjerto SKOV3 (Fig. 7F).

La administración de Ad5.3D o Ad5.3D.A20 presenta una opción de tratamiento prometedora para el cáncer avanzado, resistente a la quimioterapia o el cáncer aVp6+, en particular, pero no exclusivamente, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de esófago y cáncer de mama, respectivamente. Este vector proporciona una plataforma importante que, en última instancia, podría modificarse para aplicaciones de terapia viral de precisión.

Referencias

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Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un adenovirus de serotipo Ad5 caracterizado por las modificaciones que comprenden:

a) al menos una de las mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S, E450Q o L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX); b) al menos una de las mutaciones puntuales S408E o P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR); y c) al menos una de las mutaciones puntuales D342E o D342A en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en el que dicha mutación previene la unión del virus con integrina avp<3>/avp<5>.

2. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha mutación HVR7 comprende o consiste en al menos una de las siguientes mutaciones puntuales: I421G, T423N, E424S y L426Y.

3. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mutación KO1 comprende o consiste en mutaciones puntuales S408E y P409A.

4. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mutación RGD es D342E, para producir RGE.

5. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir al menos una modificación o secuencia focalizada al cáncer que se dirige selectivamente a las células tumorales.

6. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho adenovirus comprende al menos un motivo peptídico (que contiene) NGR para unirse a la aminopeptidasa N, en el que dicho NGR está en el bucle HI de la proteína de fibra adenoviral; o al menos un motivo peptídico (que contiene) YSA para unirse al marcador de pan-cáncer EphA2, en el que dicho YSA está en la fibra quimérica, o al menos un anticuerpo focalizado al cáncer o al menos un anticuerpo del factor de crecimiento o al menos una enzima que degrada la matriz.

7. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha modificación focalizada al cáncer comprende inserción o expresión de un péptido de unión a integrina avp6 o la secuencia del péptido A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) dentro o por el virus.

8. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha secuencia peptídica A20 se inserta o se expresa en el bucle HI del nudo de fibra viral.

9. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho adenovirus (Ad5.3D.A20) comprende:

a) al menos una de las mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S, E450Q o L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX); b) al menos una de las mutaciones puntuales S408E o P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor de coxsackie y adenovirus (CAR);

c) al menos una de las mutaciones puntuales D342E o D342A en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en el que dicha mutación previene la unión del virus con integrina avp<3>/avp<5>; e

d) inserción o expresión de la secuencia peptídica de A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) en el bucle HI del nudo de fibra viral.

10. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el adenovirus modificado (Ad5.3D.A20) comprende: a) mutaciones puntuales I421G, T423N, E424S y L426Y en la región hipervariable 7 del hexón (mutación HVR7) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el factor de coagulación 10 (FX);

b) mutaciones puntuales S408E y P409A en el bucle AB de la región del nudo de fibra (mutación KO1) en el que dicha mutación previene la unión del virus con el receptor coxsackie y adenovirus (CAR);

c) mutación puntual D342E en el motivo de unión de pentona a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) para producir la mutación RGE en la que dicha mutación previene la unión del virus con integrina aVp3/aVp5; e

d) inserción o expresión de la secuencia peptídica de A20 NAVPNLRGDLQVLAQKVART (SEQ ID NO: 1) en el bucle HI del nudo de fibra viral.

11. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el adenovirus se modifica adicionalmente para incluir al menos un transgén que codifica para una molécula o agente terapéutico.

12. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una deleción de 24-pares de bases dl922-947 (mutación A24) en el gen E1A para restringir la replicación viral a células defectuosas en pRB.

13. El adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho adenovirus se modifica adicionalmente para incluir una única adición de base de adenina en la posición 445 dentro del dominio de retención del retículo endoplásmico (ER) en E3/19K (mutación T1) para potencia oncolítica mejorada.

14. Un adenovirus de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso como medicamento.

15. Un adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para uso en el tratamiento del cáncer.

16. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende: cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conectivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de garganta, cáncer oral, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células-T, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer suprarrenal, cáncer de ano, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uretra, cáncer de cerebro, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de médula espinal, cáncer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del tracto gastrointestinal, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer de ojo, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de páncreas endocrino, glucagonoma, cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejido blando, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatidiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labio, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer de laringe, cáncer pleural, cáncer de glándulas salivales, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.

17. Una composición farmacéutica que comprende el adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y un portador, adyuvante, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende llevar el adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en conjunto o asociación con un portador o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.