ES2712951T3

ES2712951T3 - Vacunoterapia

Info

Publication number: ES2712951T3
Application number: ES12772616T
Authority: ES
Inventors: Andrea Pfeifer; Andreas Muhs; Rime Madani; Pavel Vasilyevich Belichenko; William Charles Mobley
Original assignee: AC Immune SA
Current assignee: AC Immune SA
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2019-05-16
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: PT2758071T; SG11201400795UA; EA201400376A1; SI2758071T1; KR20160099732A; EA032494B1; CA2811188C; IL231564A0; MY169574A; WO2013044147A1; AU2012312126A1; BR112014006871A2; NZ622653A; MX2014003325A; PL2758071T3; KR102129220B1; TR201901846T4; EP2758071A1; DK2758071T3; CN104039346A

Abstract

Un péptido antigénico derivado de la proteína beta amiloide para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevención de deterioros o anomalías cognitivas y/o de la memoria en sujetos con síndrome de Down, en donde el péptido antigénico consiste en los restos Aß1-15 y está modificado por un ácido palmítico unido al extremo N- y/o C-terminal del péptido y está reconstituido en un liposoma y dichos sujetos con síndrome de Down aún no han desarrollado placas asociadas a proteínas amiloides en el cerebro.

Description

DESCRIPCION

Vacunoterapia

La presente invencion proporciona medios para tratar la patologfa relacionada con el amiloide en sujetos jovenes o de mediana edad con smdrome de Down (DS). En particular, la presente invencion proporciona fragmented de peptidos antigenicos derivados de la protema amiloide o de la protema semejante a la amiloide para uso en el tratamiento de la demencia semejante a la enfermedad de Alzheimer (AD) en sujetos jovenes o de mediana edad con smdrome de Down (DS).

La patologfa genetica del smdrome de Down (DS) es la trisoirna mas comun y ocurre en uno de cada 700-1000 recien nacidos. Las estimaciones sugieren que el 25% o mas de los individuos con smdrome de Down mayores de 35 anos muestran los signos y smtomas de demencia semejantes al Alzheimer (Stanton L.R y Coetzee R.H, 2004). El porcentaje aumenta con la edad. En el DS, la totalidad o al menos una parte del cromosoma 21 esta presente por triplicado (Antonarakis et al. 2004; Moncaster et al. 2010). En consecuencia, las tres copias del gen de la protema precursora de amiloide (APP) conducen a la generacion de un exceso de p-amiloide (Ap), una de las principales protemas anormales bien conocidas por ser responsables de la enfermedad de Alzheimer (AD) (Ballard et al 2011). Por lo tanto, se sugiere que el Ap tiene un posible papel para la demencia semejante a la AD en la mayona de las personas con DS (Lee et al. 2005;Liu et al. 2005;Gilman et al. 2005).

En las personas con smdrome de Down, los defectos de la memoria semejantes a la AD pueden estar relacionados con varias protemas patologicas, tales como Ap, Tau, Dyrk1A, Apo E, etc. El aumento de Ap ya comienza en la etapa embrionaria, progresa al nacer y continua creciendo al aumentar la edad (Stoltzner et al. 2000). Ademas, los niveles de Ap42 en el lfquido celebroespinal (CSF) fueron mas bajos y los niveles de tau fueron mas altos en las personas mayores (>40 anos) que en las personas mas jovenes con ^{D s}(Tapiola et al. 2001). Una vez que el Ap se deposita en las placas, la Apo E se puede detectar en muchas placas a los 12 anos y aumenta continuamente con la edad (Lemere et al. 1996). Las maranas neurofibrilares (NFTs) se detectan en el cerebro del DS durante la cuarta decada de la vida. Se cree que estas NFT resultan de la acumulacion de tau. Se ha demostrado que la hiperfosforilacion puede ser causada por la sobreexpresion de una quinasa llamada Dyrk1A (quinasa regulada por fosforilacion de tirosina de doble especificidad 1A) (Lemere et al. 1996; Liu et al.2008). Por lo tanto, las personas con DS pueden desarrollar la patologfa relacionada con el amiloide a los 40 anos y la mayona tienen smtomas clmicos similares a los del Alzheimer, tales como declive cognitivo y deterioro de la memoria a los 60 anos (Stanton 2004).

Mientras que los individuos con DS reciben atencion medica principalmente por sus diversos problemas de salud (tales como defectos cardfacos, infecciones e hipotiroidismo), el tratamiento espedfico para los rasgos neuropatologicos, es decir, la discapacidad mental y la deficiencia de la memoria, rara vez se considera. Actualmente, estan en curso solo unos pocos experimentos clmicos, todos tratando de mejorar las capacidades mentales o de reducir el dano nervioso. Los farmacos para tratar el DS tambien se utilizan en la AD y todos actuan sobre el sistema colinergico o la neurotransmision glutamatergica, tales como rivastigmina o donepezilo, unos inhibidores de la colinesterasa y memantina, un antagonista del receptor NMDA (Prasher, 1993; Prasher, 2004). Sin embargo, faltan pruebas de la eficacia para las personas con DS. Actualmente, hay muchos tratamientos modificadores de amiloide en revision, que incluyen la inmunoterapia dirigida contra Ap (Rafii, 2010). Varias vacunas han alcanzado recientemente fases clmicas (Weiner y Frenkel, 2006) despues de haber demostrado una reduccion eficiente de la carga cerebral de Ap y revertir el declive cognitivo en los modelos de raton AD. Por el contrario con la AD, las inmunoterapias dirigidas contra Ap no estan siendo abordadas en el DS.

De los varios enfoques para tratar el deterioro cognitivo en adultos con DS, los estudios existentes que utilizan inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChEls) o antagonistas de los receptores NMDA han mostrado poco o ningun efecto (Fernandez et al., 2007, Hanney et al., 2012). Por el contrario, hay un apoyo significativo para la hipotesis de que el amiloide desempena un papel en el deterioro cognitivo de personas con DS; Netzer y sus colegas mostraron que la alteracion de la division de la APP, por un inhibidor de la Y-secretasa, tiene un efecto beneficioso en la memoria de un modelo de raton DS (Netzer et al., 2010). Estas observaciones se basan en estudios en modelos de raton que muestran que el aumento de dosis genica para APP, la protema parental del peptido Abeta responsable de la deposicion de amiloide, es necesaria para la degeneracion de las neuronas ligadas a la edad que caracteriza al DS y la AD (Salehi et al 2006, 2009). Por lo tanto, seleccionar como diana el amiloide puede ser una estrategia terapeutica prometedora para la prevencion de la progresion de la AD. El desarrollo de una inmunoterapia contra Ap se basa en la hipotesis de que si una molecula se dirige y secuestra el Ap (en forma soluble y como oligomeros) in situ, la molecula puede mejorar la eliminacion de Abeta del cerebro y brindar beneficios clmicos a las personas con DS. Se anticipa que los anticuerpos generados por la vacuna anti-Ap se uniran a los deposited fibrilares de Ap para solubilizar o inhibir finalmente el crecimiento de las placas previas. Los oligomeros Ap se consideran hoy en dfa como la especie Ap mas toxica, lo que perjudica la mayona de las funciones cognitivas en las personas con ^{D s}(Teller et al., 1996).

El documento WO 2007/068411A2 describe metodos y composiciones para el uso terapeutico y diagnostico en el tratamiento de enfermedades y patologfas causadas por protemas amiloides o semejantes a las amiloides, o asociadas con ellas. En particular, el documento WO 2007/068411A2 describe una construccion antigenica que comprende un fragmento de un peptido antigenico Ap, que consiste en una extension, unica o repetitiva de entre 13 y 15 restos de aminoacidos contiguos de la parte N-terminal del peptido Ap reconstituido en un liposoma para uso en el tratamiento de una enfermedad o una condicion asociada a amiloide.

El documento WO 2010/106127A2 describe una composicion antigenica que comprende un antigeno derivado de una protema amiloide o una protema semejante a la amiloide tales como, por ejemplo, beta amiloide, protema prionica, protema tau, alfa-sinuclema, huntingtina, que esta modificado con un resto lipofilo o hidrofobo que facilita la insercion en la bicapa lipfdica de un liposoma para inducir una respuesta inmunitaria independiente de celulas T tras el tratamiento de una enfermedad, condicion o patologfa en un paciente necesitado de tal respuesta independiente de celulas T.

Por lo tanto, existe una necesidad de una terapia de prevencion que trate de prevenir o retardar el desarrollo de smtomas clmicos asociados con patologfas relacionadas con el amiloide en sujetos con smdrome de Down (DS), tales como, particularmente, deterioros o anomaftas cognitivas y/o de la memoria.

En particular, existe una necesidad de un tratamiento de los smtomas clmicos asociados con la patologfa relacionada con el amiloide en sujetos con smdrome de Down (DS), que conduce a una mejona en las capacidades de aprendizaje en sujetos con smdrome de Down (DS) y/o mejona o recuperacion de la memoria y/o capacidades cognitivas.

Dentro del alcance de la presente invencion, se proporcionan medidas y medios que ayudan a satisfacer esta necesidad. En particular, la presente invencion proporciona peptidos antigenicos para uso en terapia de prevencion y en el tratamiento de deterioros cognitivos semejantes a la AD en sujetos ninos y en jovenes o de mediana edad con smdrome de Down.

La presente invencion se define por las reivindicaciones y las siguientes realizaciones:

En una primera realizacion, la presente invencion se refiere a un peptido antigenico derivado de la protema beta amiloide para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomaftas cognitivas de la memoria en sujetos con smdrome de Down, en donde el peptido antigenico consiste en los restos Ap1-15 y esta modificado por un acido palmftico unido al extremo N- y/o C-terminal del peptido y esta reconstituido en un liposoma y dichos sujetos con smdrome de Down aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides en el cerebro .

En una realizacion espedfica, el peptido Ap1-15 esta modificado con cuatro acidos palmfticos unidos al extremo N-y/o C-terminal del peptido.

En otra realizacion espedfica, el peptido Ap1-15 esta modificado con dos acidos palmfticos unidos al extremo N- y/o C-terminal del peptido.

En otras realizaciones diversas, la invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones 1-3, en donde dicho deterioro o anomafta se refiere a un deterioro de la memoria de reconocimiento, un deterioro de la memoria asociativa contextual, un deterioro del aprendizaje asociativo, un deterioro de la memoria declarativa para hechos y eventos, deterioro de la memoria episodica, una disfuncion del lenguaje, un deterioro visuoespacial, una disminucion de las funciones ejecutivas, cambios de personalidad, cambios emocionales, apraxia, deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas, signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones, o una combinacion de los mismos.

En aun otras realizaciones, la invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho sujeto con smdrome de Down es

(a) un sujeto joven o de mediana edad; o

(b) un sujeto de mediana edad; o

(c) un sujeto joven; o

(d) un sujeto de edad infantil, o,

(e) un sujeto menor de 65 anos.

En diversas realizaciones adicionales, la invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho uso

a) conduce a una mejora y/o recuperacion de la memoria; y/o

b) conduce a un aumento de la retencion o una recuperacion completa de la capacidad cognitiva en el sujeto tratado; y/o c) conduce a mejorar o recuperar la memoria y/o la capacidad cognitiva; y/o

d) no induce efectos secundarios indeseados.

En una realizacion espedfica, la invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes para la prevencion del desarrollo de placas asociadas de Ap en el cerebro.

En otra realizacion, la invencion se refiere a una composicion que comprende el peptido antigenico como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores en una cantidad terapeuticamente eficaz junto con un vehmulo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria en sujetos con smdrome de Down, en donde dichos sujetos con smdrome de Down aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides en el cerebro.

En diversas realizaciones espedficas, la invencion se refiere a la composicion para uso segun la realizacion precedente, que comprende un adyuvante, particularmente en donde el adyuvante es el lfpido A, particularmente en donde el adyuvante es un lfpido A destoxificado, particularmente en donde el adyuvante es un lfpido A monofosforilado o difosforilado, alumbre, fosfato calcico, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas.

En otra realizacion espedfica, la presente invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes o a la composicion para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes, para la prevencion de la neurodegeneracion en un sujeto con smdrome de Down

En una realizacion, la presente invencion se refiere al peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes o a la composicion para uso segun una cualquiera de las realizaciones precedentes, para inducir una respuesta inmunitaria contra la protema beta amiloide en un sujeto con Smdrome de Down.

Se describe en la presente memoria un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o la protema semejante a la amiloide, particularmente un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema beta amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico, para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, en particular en sujetos jovenes con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides o protemas semejantes a las amiloides, particularmente placas asociadas de Ap en el cerebro.

Se describe ademas en la presente memoria un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o la protema semejante a la amiloide, particularmente un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema beta amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico, para uso en el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos de mediana edad con smdrome de Down, en particular en sujetos de mediana edad con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides o protemas semejantes a las amiloides, particularmente asociadas de Ap en el cerebro.

Se describe ademas en la presente memoria un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o la protema semejante a la amiloide, particularmente derivado de la protema beta amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico, para uso en el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la Ad y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos jovenes con Smdrome de Down, en particular en sujetos jovenes con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides o protemas semejantes a las amiloides, particularmente asociadas de Ap en el cerebro.

Se describe ademas en la presente memoria un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o la protema semejante a la amiloide, particularmente derivado de la protema beta amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico, para uso en el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la Ad y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en ninos con smdrome de Down, en particular en sujetos ninos con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides o protemas semejantes a las amiloides, particularmente asociadas de Ap en el cerebro.

Se describe ademas en la presente memoria un fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o la protema semejante a la amiloide, particularmente derivado de la protema beta amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico, para uso en la prevencion de la memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos ninos y en jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, en particular en sujetos jovenes con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides o protemas semejantes a las amiloides, particularmente asociadas de Ap en el cerebro.

En particular, el peptido antigenico se administra a un sujeto con smdrome de Down, particularmente a un sujeto con smdrome de Down que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en donde dicho sujeto es menor de 60 anos, particularmente menor de 55 anos, particularmente menor de 50 anos, particularmente menor de 45 anos, particularmente menor de 40 anos, particularmente menor de 35 anos, particularmente menor de 30 anos, particularmente menor de 25 anos, particularmente menor de 20 anos, particularmente menor de 15 anos, particularmente menor de 10 anos, particularmente menor de 5 anos, particularmente menor de 3 anos;

o el peptido antigenico se administra a un sujeto con smdrome de Down, particularmente a un sujeto con smdrome de Down que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en donde dicho sujeto es menor de 35 anos, particularmente menor de 30 anos, particularmente menor de 25 anos, particularmente menor de 20 anos, particularmente menor de 15 anos;

o el peptido antigenico se administra a un sujeto con smdrome de Down, particularmente a un sujeto con smdrome de Down que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en donde dicho sujeto es menor de 15 anos, particularmente menor de 10 anos, particularmente menor de 5 anos, particularmente menor de 3 anos;

o el peptido antigenico se administra a un sujeto con smdrome de Down, particularmente a un sujeto con smdrome de Down que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en donde dicho sujeto es menor de 10 anos, particularmente menor de 5 anos, particularmente entre 0 y 10, particularmente entre 1 y 10, particularmente entre 2 y 10, particularmente entre 3 y 10, particularmente entre 4 y 10, particularmente entre 5 y 10.

El tratamiento con el peptido antigenico como se describe en la presente memoria previene el desarrollo de placas asociadas de Ap en el cerebro, particularmente en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro.

Se contempla ademas en la presente memoria utilizar, el fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o protema semejante a la amiloide, o una composicion que comprende dicho peptido antigenico segun la invencion y como se describe en la presente memoria, en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos ninos y en jovenes o de mediana edad con smdrome de Down que ya han desarrollado placas asociadas de Ap en el cerebro.

El tratamiento con el peptido antigenico como el proporcionado en la presente invencion reduce la cantidad de placas asociadas de Ap en el cerebro, particularmente en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro.

El grupo de pacientes que se va a tratar con el peptido antigenico o la composicion como se describe en la presente memoria puede comprender sujetos jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, particularmente sujetos que son menores de 65 anos, particularmente menores de 60, 55 o 50 anos. En una realizacion, los sujetos con una edad de entre 0 y 65 anos, particularmente de entre 5 y 55 anos, particularmente de entre 10 y 50 anos, particularmente entre 15 y 45 anos, particularmente de entre 20 y 40 anos, particularmente de entre 25 y 35 anos, se pueden tratar con el peptido antigenico o la composicion segun la invencion.

Para los fines de la presente invencion, ninos se refiere a sujetos que son menores de 18 anos, particularmente sujetos con una edad de entre 0 y 18 anos, particularmente de entre 1 y 10, particularmente de entre 2 y 9, particularmente de entre 3 y 9, particularmente de entre 4 y 9, particularmente de entre 5 y 18.

Para los fines de la presente invencion, sujetos jovenes se refiere a sujetos que son menores de 35 anos, particularmente sujetos con una edad de entre 0 y 35 anos particularmente de entre 1 y 30 anos, particularmente de entre 5 y 25 anos.

Para los fines de la presente invencion, sujetos de mediana edad se refiere a sujetos con una edad de entre 36 y 65 anos, particularmente de entre 40 y 60 anos, particularmente de entre 45 y 55 anos.

El tratamiento de un sujeto nino o joven o de mediana edad con smdrome de Down y que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, que utilizan el peptido antigenico o la composicion como se describe en la presente memoria, conduce a una mejora o recuperacion de dichos deterioros o anomalfas, particularmente a la mejora de la memoria, particularmente a la mejora o recuperacion de la memoria de reconocimiento y/o la memoria asociativa contextual.

En particular, el tratamiento de un sujeto nino o joven o de mediana edad con smdrome de Down y que padece de deterioros o anomaKas cognitivas, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, que utilizan el peptido antigenico o la composicion como se describe en la presente memoria, conduce a un aumento de la retencion o una recuperacion completa de la capacidad de memoria cognitiva en el sujeto tratado.

El tratamiento de los deterioros o anomalfas cognitivas semejantes a la AD en sujetos ninos y jovenes o de mediana edad con smdrome de Down con el peptido antigenico, como se describe en la presente memoria, muestra los efectos terapeuticos como se describen en la presente memoria sin inducir efectos secundarios indeseados tales como la meningoencefalitis y la microhemorragia.

El sujeto puede ser un sujeto de edad infantil, particularmente un sujeto joven, particularmente un sujeto de mediana edad como se define en la presente memoria, con smdrome de Down y que padece de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente de memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro.

El tratamiento con el peptido antigenico o la composicion como se describe en la presente memoria, previene el desarrollo de placas asociadas de Ap en el cerebro, particularmente en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, en sujetos con smdrome de Down, particularmente en el cerebro de sujetos jovenes o de mediana edad, particularmente en el cerebro de sujetos en edad infantil, particularmente en el cerebro de sujetos jovenes, particularmente en el cerebro de sujetos de mediana edad, con smdrome de Down.

El peptido antigenico como se describe en la presente memoria se puede derivar de una protema amiloide o protema semejante a la amiloide seleccionada del grupo que consiste en protema prionica, protema tau, alfa-sinuclema, huntingtina y p-amiloide o una combinacion de uno o mas de los peptidos anteriores. .

Dicho fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente a la parte N-terminal que comprende al menos 5, particularmente al menos 6, particularmente al menos 7, particularmente al menos 8, particularmente al menos 9, particularmente al menos 10, particularmente al menos 11, particularmente al menos 12, particularmente al menos 13, particularmente al menos 14, particularmente todos los restos de aminoacidos del fragmento Ap1-15.

El fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte N-terminal del peptido Ap que comprende al menos 5, particularmente al menos 6, particularmente al menos 7, particularmente al menos 8, particularmente al menos 9, particularmente al menos 10, particularmente al menos 11, particularmente al menos 12, particularmente al menos 13, particularmente al menos 14, particularmente al menos 15, particularmente todos los restos de aminoacidos del fragmento Ap1-16, el fragmento Ap1-17, el fragmento Ap1-18, el fragmento Ap1-19, el fragmento Ap1-20, el fragmento Ap1-22, el fragmento Ap1-23, el fragmento Ap1-24, el fragmento Ap1-25 o el fragmento Ap1-26, o el fragmento Ap3-15.

En la alternativa, el fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte C-terminal del peptido Ap que comprende al menos 5, particularmente al menos 6, particularmente al menos 7, particularmente al menos 8, particularmente al menos 9, particularmente al menos 10 , particularmente al menos 11, particularmente al menos 12, particularmente al menos 13, particularmente al menos 14, particularmente al menos 15, particularmente todos los restos de aminoacidos del fragmento Ap20-40 o Ap20-42, el fragmento Ap21-40 o Ap21-42, el fragmento Ap22-40 o Ap22-42, el fragmento Ap23-40 o Ap23-42, el fragmento Ap24-40 o Ap24-42, el fragmento Ap25-40 o Ap25-42, el fragmento Ap26-46 o Ap27-42, o el fragmento Ap27-40 o Ap27-42, o el Ap29-40.

En la alternativa, el fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte media del peptido Ap que comprende al menos 5, particularmente al menos 6, particularmente al menos 7, particularmente al menos 8, particularmente al menos 9, particularmente al menos 10, particularmente al menos 11, particularmente al menos 12, particularmente al menos 13, particularmente al menos 14, particularmente al menos 15, particularmente todos los restos de aminoacidos del fragmento Ap15-35, particularmente el fragmento Ap20-35.

En particular, el fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte central del peptido Ap, particularmente el fragmento Ap14-29; o

el fragmento de peptido antigenico Ap puede corresponder a la parte C-terminal del peptido Ap, particularmente el fragmento del extremo C-terminal Ap22-35.

En la alternativa, se puede utilizar el fragmento de longitud completa Ap1-39, Ap1-40, o Ap1-42.

El fragmento de peptido antigenico Ap como se describe en la presente memoria puede contener uno o mas restos de aminoacidos modificados o no naturales.

Tambien se contempla en la presente memoria el uso de fragmentos de peptidos antigenicos Ap, que no son fragmentos que consisten en una extension unica o repetitiva de entre 13 y 15 restos de aminoacidos contiguos de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente no son fragmentos, en donde dicha extension contigua de 13 a 15 restos de aminoacidos se obtiene del fragmento del extremo N-terminal 1-16 o 1-17 del peptido Ap, particularmente de la parte N-terminal del peptido Ap seleccionado del grupo que consiste en los restos 1-15, 1-14, y 1-13, que consiste particularmente en un antigeno del peptido AP^1-15como indica la secuencia SEQ ID NO: 1 y A p^a (*¹⁴) como se da en la secuencia SEQ ID NO:3 descrita en el documento WO 2007/068411.

El peptido antigenico como se describe en la presente memoria se puede presentar reconstituido en un vetnculo tal como, por ejemplo, una vesmula, un cuerpo en partmulas o una molecula, pero particularmente reconstituido en un liposoma.

En particular, el peptido antigenico como se describe en la presente memoria se puede presentar en un conjunto ordenado unico o repetitivo en la superficie del vetnculo o liposoma.

Dicho conjunto ordenado altamente repetitivo en la superficie del vetnculo o liposoma puede comprender al menos 10 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo, particularmente al menos 50 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vehfculo, particularmente al menos 100 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo, particularmente al menos 200 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo, particularmente al menos 300 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo; particularmente al menos 400 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo, particularmente al menos 500 unidades antigenicas repetitivas/molecula de vetnculo.

La composicion antigenica como se describe en la presente memoria puede comprender un antfgeno conformacional, particularmente un antfgeno Ap como se describe en la presente memoria, en donde mas del 30%, particularmente mas del 40%, particularmente mas del 50%, particularmente mas del 60%, particularmente mas del 70%, particularmente mas del 80%, particularmente mas del 90%, particularmente mas del 95% y tiasta el 100% esta en una conformacion de lamina beta.

En particular, la composicion puede comprender el peptido antigenico como se describe en la presente memoria en una cantidad terapeuticamente eficaz junto con un vetnculo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas de la memoria en sujetos con Smdrome de Down.

En la alternativa, la composicion puede comprender el peptido antigenico de la invencion como se describe en la presente memoria en una cantidad terapeuticamente eficaz junto con un vetnculo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable, para uso en el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de los deterioros o anomalfas cognitivas en sujetos con smdrome de Down.

En particular, dicta memoria y/o deterioro cognitivo se originan en el Npocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro.

La composicion que comprende el peptido antigenico como se describe en la presente memoria en una cantidad terapeuticamente eficaz junto con un vetnculo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable se puede utilizar en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para tiectios y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desintiibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones.

En particular, dictio deterioro o anomalfa se refiere a la memoria de reconocimiento.

Dictio peptido antigenico para uso en mejorar o recuperar la memoria de reconocimiento en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dictio peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-15, Ap1-16 , Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22, o Ap1-23.

En particular, dictio peptido antigenico consiste en restos de aminoacidos Ap1-15.

En la alternativa, dictio peptido antigenico para uso en mejorar o recuperar la memoria de reconocimiento en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dictio peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos.

En particular, dictio deterioro o anomalfa se refiere a la memoria asociativa contextual.

En particular, dictio peptido antigenico para uso en mejorar o recuperar la memoria asociativa contextual en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dictio peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-15 , Ap1-16, Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22, o Ap1-23.

En particular, dicho deterioro o anoma^a se refiere al aprendizaje asociativo.

Dicho peptido antigenico para uso en mejorar o recuperar el aprendizaje asociativo en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-15, Ap1-16 , Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22, o Ap1-23.

En particular, dicho peptido antigenico consiste en restos de aminoacidos Ap1-15.

En otra alternativa, dicho peptido antigenico para uso en mejorar o recuperar el aprendizaje asociativo en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte C-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap20-36 , Ap20-40, Ap20-42, Ap21-36, Ap2l-40, Ap21-42, Ap22-36, Ap22-40 o Ap22-42.

En particular, dicho peptido antigenico consiste en restos de aminoacidos Ap22-35.

La formacion y estabilizacion de la conformacion deseada del peptido antigenico se puede conseguir presentando el peptido antigenico unido a, o incorporado o reconstituido, parcial o totalmente, en un vehmulo tal como, por ejemplo, una vesmula, un cuerpo en partmulas o molecula o cualquier otro medio que pueda servir adecuadamente como vehmulo/adyuvante para el peptido antigenico. En particular,

el peptido antigenico se puede unir a, o incorporarse o reconstituirse en el vehmulo a traves de interacciones debiles tales como, por ejemplo, las interacciones de Van der Waals, interaccion hidrofoba o electrostatica, o una combinacion de dos o mas de dichas interacciones, de manera que el peptido se presente en la superficie del vehmulo con una conformacion espedfica, que se mantiene y estabiliza restringiendo dicho peptido antigenico en su libertad de movimiento tridimensional, de modo que se evitan o restringen severamente los cambios conformacionales.

Cuando se utiliza una vesmula, una partmula o un cuerpo en partmulas como un vehmulo/adyuvante tal como, por ejemplo, un liposoma, la composicion del peptido antigenico se puede elegir de manera que su carga neta total sea identica a la de la superficie del vehmulo/adyuvante al cual esta unico el peptido. Siendo las fuerzas de repulsion electrostaticas efectivas entre la superficie del vehmulo/adyuvante cargado identica y el peptido antigenico, pero particularmente la superficie del vehmulo con carga identicamente y los restos de aminoacidos que constituyen el peptido antigenico y mas particularmente la superficie del vehmulo cargado identicamente y los restos de aminoacidos cargados identicamente comprendidos en el peptido antigenico, puede conducir a que el peptido antigenico tome una conformacion definida, altamente espedfica y estabilizada que garantiza una alta actividad biologica. Como resultado, el peptido antigenico es expuesto y presentado en una conformacion que es altamente biologicamente activa, ya que permite que el sistema inmune del organismo objetivo interactue libremente con los determinantes antigenicos contenidos en la construccion antigenica en la conformacion biologicamente activa, que conduce a una respuesta inmunitaria fuerte y espedfica de la conformacion, que da como resultado, por ejemplo, en un alto tftulo de anticuerpos en el organismo objetivo.

La respuesta inmunogenica puede ser aumentada adicionalmente utilizando un liposoma como un vehmulo, liposoma que puede funcionar como un adyuvante para aumentar o estimular la respuesta inmunitaria en el animal o ser humano objetivo que va a ser tratado con la vacuna terapeutica segun la invencion. Opcionalmente, el liposoma puede contener, ademas, un adyuvante adicional tal como, por ejemplo, lfpido A, alumbre, fosfato de calcio, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas, pero particularmente un lfpido A destoxificado, tal como un lfpido A monofosforilado o difosforilado, o cualquier otro adyuvante que se pueda utilizar adecuadamente dentro del alcance de la presente invencion, tal como, por ejemplo, alumbre, fosfato de calcio, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas, LPS, CpG ODN, Pam2cSK4, Pam3CSK4, dsRNA, ssRNA, muramil dipeptido, Quil Q, QS-21.

Los liposomas que se pueden utilizar en las composiciones descritas en la presente memoria incluyen aquellas conocidas por los expertos en la tecnica. Se puede utilizar cualquiera de los lfpidos estandar utiles para preparar liposomas. Se pueden utilizar liposomas bicapa y multicapa estandar para preparar composiciones como se describe en la presente memoria. Si bien se puede utilizar cualquier metodo para preparar liposomas conocido por un experto en la tecnica, los liposomas que mas se prefieren estan preparados de acuerdo con el metodo de Alving et al., Infect. Immun. 60: 2438-2444, 1992, (Lauer et al. 1992) El liposoma puede tener una funcion dual por cuanto puede ser usado como un vehmulo que comprende la construccion supramolecular como se describe anteriormente en la presente memoria y, al mismo tiempo, funciona como un adyuvante para aumentar o estimular la respuesta inmunitaria en el animal o ser humano objetivo que va a ser tratado con la vacuna terapeutica descrita en la presente memoria.

Opcionalmente, el liposoma puede contener, ademas, un adyuvante adicional o un inmunomodulador o ambos, tal como, por ejemplo, lfpido A, alumbre, fosfato de calcio, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas, pero particularmente un lfpido A, mas particularmente un lfpido A destoxificado, tal como lfpido A monofosforilado o difosforilado, o alumbre.

El liposoma puede estar compuesto de constituyentes seleccionados del grupo que consiste en dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPEA), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y colesterol.

Se contempla ademas en la presente memoria utilizar como una sustitucion para los ftpidos cationicos en la membrana liposomal, ftpidos anionicos seleccionados del grupo que consiste en:

a. diacil-fosfoftpidos con grupos de cabeza fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, L-a-fosfatidilinositol-4-fosfato o acido fosfatfdico;

b. liso-fosfoftpidos con grupos de cabeza fosfatidilglicerol, fosfatidilserina o acido fosfaftdico, y

c. cardiolipina, diliso-cardiolipina, monoliso-cardioliplna.

En un aspecto, se contempla utilizar como una sustitucion para los ftpidos anionicos en la membrana liposomal, los ftpidos cationicos seleccionados del grupo que consiste en:

a. diacil-fosfoftpidos con grupos de cabeza 3-trimetilamonio-propano, 3-dimetilamonio-propano, 3-etilfosfocolina o 3-fosfatidiletanolamina; y

b. D-eritro-esfingosina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, bromuro de N-[1- (2,3-dimiristiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil) amonio, 1-propanamio N,N,N-trimetil-2bis[(1-oxo-9-octedecenil)oxi]-(Z,Z) metil sulfato o 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] hidrocloruro de colesterol.

En particular, las cadenas lipfdicas unidas a los grupos de cabeza anteriores pueden

a. ser saturadas o insaturadas,

b. variar en longitud desde (CH²)n en donde n esta entre 3 y 24, y

estar sustituidas simetrica o asimetricamente.

La composicion antigenica como se describe en la presente memoria puede comprender una preparacion de liposomas y un adyuvante, particularmente ftpido A, alumbre, fosfato de calcio, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas, pero particularmente un ftpido A, mas particularmente un ftpido A destoxificado, tal como, ftpido A monofosforilado o difosforilado, o alumbre.

La composicion liposomal descrita en la presente memoria que comprende un peptido Ap unido con restos lipofilos incrustados en liposomas como se describe en la presente memoria se puede preparar segun la metodologfa descrita en la presente memoria.

Cuando se utilizan liposomas como vehftculo/adyuvante, el peptido antigenico como se describe en la presente memoria se puede modificar ademas por acoplamiento a un resto lipofilo o hidrofobo que facilita la insercion en la bicapa lipfdica del vehftculo de liposoma/adyuvante. Dicho resto hidrofobo puede ser un acido graso, un triglicerido, un diglicerido, un esteroide, un esfingoftpido, un glicoftpido o un fosfoftpido.

En particular, el resto lipofilo o hidrofobo puede ser un grupo alquilo o un acido graso con una cadena principal de carbono de al menos 1 atomo de carbono, particularmente de al menos 2 atomos de carbono, particularmente de al menos 3 atomos de carbono, particularmente de al menos 4 carbonos atomos, particularmente de al menos 6 atomos de carbono, particularmente de al menos 8 atomos de carbono, particularmente de al menos 12 atomos de carbono, particularmente de al menos 16 atomos de carbono.

Los restos lipofilos o hidrofobos pueden ser acidos grasos, trigliceridos y fosfoftpidos, en donde la cadena principal de carbono del acido graso tiene al menos 4 atomos de carbono, particularmente los restos lipofilos que tienen acidos grasos con una cadena principal de carbono de al menos aproximadamente 14 atomos de carbono y hasta aproximadamente 24 atomos de carbonos, mas particularmente restos hidrofobos que tienen una cadena principal de carbono de al menos 14 atomos de carbono. Ejemplos de restos hidrofobos incluyen, pero no se limitan a, acido palmftico, acido estearico, acido minstico, acido laurico, acido oleico, acido linoleico, acido linolenico y colesterol o DSPE. Particularmente, el resto hidrofobo es acido palmftico.

En particular, la composicion antigenica como se describe en la presente memoria comprende un antfgeno de peptido que comprende dos restos de acido palmftico, particularmente cuatro restos de acido palmftico.

La palmitoilacion, mientras proporciona un anclaje para el peptido en la bicapa del liposoma, debido a la longitud relativa reducida del resto de acido graso Cmo conduce a que el peptido sea presentado, expuesto en, o en estrecha proximidad a la superficie del liposoma. Por lo tanto, las celulas que procesan el anftgeno tendran que tomar todo el liposoma con el peptido.

Las construcciones antigenicas de la presente invencion pueden comprender peptidos modificados mediante pegilacion (utilizando polietilenglicol (PEG) o polietilenglicol modificado), o modificado a traves de otros metodos tales como por acido palmftico, como se describe anteriormente en la presente memoria, poliaminoacidos (p. ej., poliglicina, polihistidina), polisacaridos (p. ej., acido poligalacturonico, acido polilactico, poliglicolido, quitina, quitosano), poftmeros sinteticos (poliamidas, poliuretanos, poliesteres) o copoftmeros (p. ej. poli(acido metacnlico) y N-(2-hidroxi) propil metacrilamida ) y similares.

Si se utiliza PEG en la preparacion de la construccion antigenica, el terminal libre de PEG se puede unir covalentemente a una molecula de fosfatidiletanolamina (donde el acido graso puede ser: minstico, palmttico, estearico, oleico, etc. o una combinacion de los mismos). Esta estructura supramolecular se puede reconstituir en liposomas que consisten en fosfolfpidos y colesterol (fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, colesterol en diversas relaciones molares). Se pueden utilizar otros fosfolfpidos. El lfpido A se puede utilizar a una concentracion de aproximadamente 40 pg/pmol de fosfolfpidos. En particular, las construcciones antigenicas descritas en la presente memoria pueden comprender una secuencia peptfdica antigenica como se describe anteriormente en la presente memoria, unidas covalentemente a lisina pegilada al menos una en cada terminal, pero particularmente 1 o 2 en cada terminal. La longitud de la cadena de PEG (polietilenglicol) puede variar desde n=8 a n=150000 o mas, particularmente desde n=10 a n=80000, mas particularmente desde n=10 a n=10000. En una realizacion espedfica de la invencion, la longitud de la cadena de PEG no es mayor que n=45, particularmente entre n=5 y n=40, mas particularmente entre n=10 y n=30, y aun mas particularmente n=10.

En particular, el antfgeno del peptido Ap esta modificado con dos acidos palmfticos unidos a los extremos N- y/o C-terminal de la molecula peptidica.

Tambien se contempla en la presente memoria la post-insercion de diferentes tipos de peptidos (p. ej., antigenos) y/o tipos de adyuvantes en la capa externa de liposomas preformados en diferentes concentraciones como se describe en la solicitud EP2632434. Este metodo de post-insercion comprende la pre-formacion de liposomas en disolucion y la modificacion de peptidos antigenicos a traves de restos hidrofobos, de manera que el peptido antigenico modificado esta disponible en una forma micelar. El metodo comprende ademas la liberacion de los peptidos antigenicos de las micelas induciendo a la descomposicion micelar seguida por la integracion en el liposoma preformado. Este procedimiento de integracion es impulsado por las interacciones hidrofobas del antfgeno modificado y/o el adyuvante con la bicapa (fosfo)lipfdica de los liposomas. En particular, la solubilizacion del peptido antigenico modificado y/o adyuvante en la capa externa de los liposomas se logra sin la ayuda de ninguna reaccion qrnmica o modificacion adicional de la molecula, diluyendo el peptido antigenico solubilizado o adyuvante (presentado inicialmente en forma micelar), por debajo de la concentracion micelar cntica del tensioactivo. La forma libre del peptido antigenico o adyuvante se integra despues en la capa externa de los liposomas debido a la solubilizacion de sus dominios hidrofobos en el resto acilo de los fosfolfpidos. Por lo tanto, el metodo proporciona una cantidad de "liposomas vados" que estan disponibles para cargarlos segun las necesidades respectivas.

En particular, este metodo de post-insercion para preparar una construccion antigenica basada en liposomas que comprende un peptido antigenico de la invencion y como se describe en la presente memoria modificado a traves de restos hidrofobos reconstituidos en un liposoma, comprende las etapas de i) preparar liposomas en disolucion; ii) preparar un peptido antigenico modificado anadiendo a los extremos N- y/o C-terminal de la molecula peptfdica al menos un resto hidrofobo; iii) solubilizar el peptido antigenico modificado en presencia de un tensioactivo; iv) diluir el peptido solubilizado y, opcionalmente, un adyuvante por debajo de la concentracion micelar cntica (CMC) del tensioactivo; y v) cargar los liposomas preformados con el peptido antigenico solubilizado diluido y, opcionalmente, el adyuvante, anadiendo dicho peptido antigenico y, opcionalmente, dicho adyuvante a la preparacion liposomal preformada y solubilizar el peptido anadido y, opcionalmente, el adyuvante anadido en la capa externa de los liposomas, particularmente sin la ayuda de ninguna reaccion qrnmica o modificacion adicional de la molecula.

Como se emplea en esta memoria, el termino "concentracion micelar cntica", tambien conocido como CMC, se define como la concentracion de tensioactivos por encima de la cual se forman micelas espontaneamente. Tras la introduccion de tensioactivos (o cualesquiera materiales de superficie activa) en un sistema, los tensioactivos se repartiran inicialmente en la interfaz, reduciendo asf la energfa libre del sistema a) reduciendo la energfa de la interfaz (calculada como area x tension superficial) y b) eliminando las partes hidrofobas del tensioactivo del contacto con el agua. Posteriormente, cuando el recubrimiento superficial por los tensioactivos aumenta y la energfa libre de la superficie (tension superficial) disminuye y los tensioactivos comienzan a agregarse en micelas, disminuye asf de nuevo la energfa libre del sistema disminuyendo el area de contacto de las partes hidrofobas del tensioactivo con el agua. Al alcanzar la CMC, cualquier adicion adicional de tensioactivos solo aumentara el numero de micelas. (IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997)).

Ventajosamente, este metodo conduce a altos rendimientos de la incorporacion del peptido y/o adyuvante con una visualizacion molecular unica en el liposoma frente a la capa externa de la bicapa del liposoma. En particular, al menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y hasta el 100% del peptido antigenico reconstituido esta presente en la superficie del liposoma, insertado en la bicapa lipfdica a traves de sus restos hidrofobos.

El metodo da como resultado ademas preparaciones de liposomas que muestran una distribucion de tamano homogenea con un mdice de polidispersidad en el intervalo de entre 0,4 y 0,6, particularmente de 0,45 a 0,55, particularmente de 0,5. Ademas, el metodo y las construcciones permiten una alta biodisponibilidad del peptido y/o adyuvante para el sistema inmune y, como consecuencia, una respuesta inmunitaria mejorada. La degradacion del adyuvante, p. ej., la degradacion de MPLA se minimiza o no se presenta en absoluto y, por lo tanto, se proporciona una reproducibilidad de lote aumentada. Las construcciones preparadas por el metodo anterior son estables, capaces de filtracion esteril y no inducen respuestas inmunitarias laterales.

Por consiguiente, se describe ademas en la presente memoria una construccion antigenica que comprende un peptido antigenico descrito en la presente memoria para uso como se describe en la presente memoria reconstituido en un liposoma, en donde al menos el 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y hasta el 100% del peptido antigenico reconstituido esta presente en la superficie del liposoma, insertado en la bicapa lipfdica a traves de sus restos hidrofobos.

En particular, se describe una preparacion liposomal que comprende dicha construccion antigenica, cuya preparacion muestra una distribucion de tamano homogenea con un mdice de polidispersidad en el intervalo de entre 0,4 y 0,6, particularmente de 0,45 a 0,55, particularmente de 0,5.

El peptido antigenico se puede presentar en la superficie de la molecula vehmulo en un conjunto ordenado altamente repetitivo, particularmente un conjunto ordenado repetitivo que comprende al menos 10 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo, particularmente al menos 50 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo, particularmente al menos 100 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo, particularmente al menos 200 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo, particularmente al menos 300 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo; particularmente al menos 400 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo, particularmente al menos 500 unidades antigenicas repetitivas/molecula vehmulo.

Ademas, se puede utilizar en los metodos un anticuerpo, como se describe en la presente memoria, para el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros de memoria y/o cognitivos que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, particularmente deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje, tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en un terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos, que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones, en sujetos ninos yjovenes o de mediana edad con smdrome de Down, cuyo anticuerpo ha sido generado en respuesta a una cualquiera de las construcciones antigenicas descritas en la presente memoria. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un diacuerpo, un anticuerpo camelido o un fragmento funcional de cualquiera de los anticuerpos anteriores, cuyo fragmento tiene sustancialmente la misma actividad biologica en terminos de tratamiento de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas como el anticuerpo del que se deriva dicho fragmento.

Ademas, se puede utilizar en los metodos un anticuerpo, como se describe en la presente memoria, para el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la AD y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros de memoria y/o cognitivos que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, particularmente deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje, tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en un terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos, que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones, en ninos con smdrome de Down, cuyo anticuerpo ha sido generado en respuesta a una cualquiera de las construcciones antigenicas descritas en la presente memoria. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un diacuerpo, un anticuerpo camelido o un fragmento funcional de cualquiera de los anticuerpos anteriores, cuyo fragmento tiene sustancialmente la misma actividad biologica en terminos de tratamiento de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas como el anticuerpo del que se deriva dicho fragmento.

En la alternativa, se puede utilizar en los metodos un anticuerpo, como se describe en la presente memoria, para el tratamiento, y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomalfas cognitivas de la memoria, particularmente de la memoria semejante a la A d y/o deterioros o anomalfas cognitivas, particularmente deterioros de memoria y/o cognitivos que se originan en el hipocampo del cerebro, particularmente deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje, tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en un terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tales como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones, en sujetos ninos con smdrome de Down, cuyo anticuerpo ha sido generado en respuesta a una cualquiera de las construcciones antigenicas descritas en la presente memoria. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo completamente humano, un diacuerpo, un anticuerpo camelido o un fragmento funcional de cualquiera de los anticuerpos anteriores, cuyo fragmento tiene sustancialmente la misma actividad biologica en terminos de tratamiento de memoria y/o deterioros o anomalfas cognitivas como el anticuerpo del que se deriva dicho fragmento.

En particular, el fragmento de peptido antigenico derivado de la protema amiloide o protema semejante a la amiloide se puede utilizar en un metodo como se describe en la presente memoria para el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros cognitivos de la memoria que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro.

Se describe ademas en la presente memoria un metodo para tratar y/o aliviar y/o prevenir deterioros o anomalfas de la memoria en un sujeto con smdrome de Down que comprende administrar a dicho sujeto un peptido antigenico o una composicion como se describe en la presente memoria.

Se describe tambien un metodo para tratar y/o aliviar y/o prevenir deterioros o anomalfas cognitivas en un sujeto con smdrome de Down que comprende administrar a dicho sujeto un peptido antigenico o una composicion como se describe en la presente memoria.

En particular, dicho deterioro o anomalfa se refiere a la memoria de reconocimiento.

En particular, dicho peptido antigenico para uso en un metodo para mejorar o recuperar la memoria de reconocimiento en sujetos con smdrome de Down se deriva de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-15, Ap1-16, Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22 o Ap1-23.

Dicho peptido antigenico para uso en un metodo para mejorar o recuperar la memoria de reconocimiento en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos.

En particular, dicho deterioro o anomalfa se refiere a la memoria asociativa contextual.

En la alternativa, dicho peptido antigenico para uso en un metodo para mejorar o recuperar la memoria asociativa contextual en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-l5, Ap1-16, Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22, o Api-23.

En particular, dicho deterioro o anomalfa se refiere al aprendizaje asociativo.

Dicho peptido antigenico para uso en un metodo para mejorar o recuperar el aprendizaje asociativo en sujetos con smdrome de Down se puede derivar de la parte N-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap1-15, Ap1-16, Ap1-17, Ap1-18, Ap1-19, Ap1-20, Ap1-22, o Ap1-23.

Se describe ademas en la presente memoria un agente activo, que es un agente de inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de agentes de inmunoterapia incluyen agentes inflamatorios, factores biologicos, protemas reguladoras inmunitarias, anticuerpos humanos y humanizados y farmacos de inmunoterapia, tal como AZT y otros nucleotidos derivados o modificados. Las moleculas pequenas tambien se pueden emplear como agentes en la presente invencion.

Se describe ademas en la presente memoria un peptido antigenico para uso en un metodo para mejorar o recuperar el aprendizaje asociativo en sujetos con smdrome de Down derivado de la parte C-terminal del peptido Ap, particularmente dicho peptido antigenico consiste en todos o parte de los restos de aminoacidos Ap20-36, Ap20-40, Ap20-42, Ap21-36, Ap21-40, Ap21-42, Ap22-36, Ap22-40 o Ap22-42.

En particular, dicho peptido antigenico consiste en los restos de aminoacidos Ap22-35.

Los peptidos antigenicos que son particularmente utiles para mejorar y/o recuperar el aprendizaje asociativo en sujetos con smdrome de Down tal como, por ejemplo, un peptido antigenico que consiste en los restos de aminoacidos Ap22-35, se puede combinar con uno o mas compuestos biologicamente activos, que tienen un efecto positivo en la memoria de reconocimiento y/o la memoria asociativa contextual.

En particular, dicho sujeto con smdrome de Down, es un sujeto joven o de mediana edad.

En la alternativa, dicho sujeto es un sujeto joven; o

dicho sujeto es un sujeto de edad infantil.

En particular, dichos sujetos son menores de 60 anos, particularmente menores de 55 anos, particularmente menores de 50 anos, particularmente menores de 45 anos, particularmente menores de 40 anos, particularmente menores de 35 anos, particularmente menores de 30 anos, particularmente menores de 25 anos, particularmente menores de 20 anos, particularmente menores de 15 anos, particularmente menores de 10 anos, particularmente menores de 5 anos, particularmente menores de 3 anos.

El termino "anticuerpo" o "anticuerpos" como se utilizan en la presente memoria, es un termino reconocido en la tecnica y se entiende que se refiere a moleculas o fragmentos activos de moleculas que se unen a antigenos conocidos, particularmente a moleculas de inmunoglobulina y a partes inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union que se une inmunoespedficamente a un antfgeno. La inmunoglobulina segun la invencion puede ser de cualquier tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o clase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclases de moleculas de inmunoglobulina.

"Anticuerpos", dentro del alcance de la presente invencion, pretende incluir anticuerpos monoclonales, policlonales, quimericos, de cadena simple, biespedficos, simianizados, anticuerpos humanos y humanizados, asf como fragmentos activos de los mismos. Ejemplos de fragmentos activos de moleculas que se unen a antigenos incluyen los fragmentos Fab y F(ab')², que incluyen los productos de una biblioteca de expresion de inmunoglobulina Fab y fragmentos de union a epttopo de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente.

Estos fragmentos activos se pueden derivar de un anticuerpo como se describe en la presente memoria mediante un numero de tecnicas. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales purificados se pueden escindir con una enzima, tal como pepsina, y sometidos a filtracion en gel HpLC. La fraccion adecuada que contiene fragmentos Fab se puede recoger y concentrar despues por filtracion de membrana y similares. Para una descripcion adicional de las tecnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, vease por ejemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23: 1011 1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121: 663-69, Academic Press, 1986.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina donadora no humana, estando derivadas el resto de las porciones derivadas de inmunoglobulina de la molecula, de una (o mas) inmunoglobulina(s) humana(s). Ademas, los restos de soporte del marco se pueden alterar para conservar la afinidad de union. Los metodos para obtener "anticuerpos humanizados" son bien conocidos por los expertos en la tecnica. (vease, p. ej., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci EE.UU., 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9: 421 (1991)).

Un "anticuerpo humanizado" se puede obtener tambien mediante un nuevo enfoque de ingeniena genetica que permite la produccion de anticuerpos policlonales de tipo humano madurados por afinidad en animales grandes, tales como, por ejemplo, conejos.

El termino "anticuerpo monoclonal" tambien es bien reconocido en la tecnica y se refiere a un anticuerpo que se produce en masa en el laboratorio a partir de un unico clon y que reconoce solamente un antfgeno. Los anticuerpos monoclonales se preparan tfpicamente fusionando una celula B productora de anticuerpos normalmente de vida corta con una celula de crecimiento rapido, tal como una celula cancerosa (denominada a veces celula "inmortal"). La celula dbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rapidamente, creando un clon que produce grandes cantidades del anticuerpo.

El termino "memoria y/o deterioros y anomalfas cognitivas" se refiere principalmente a los smtomas clmicos asociados con la patologfa relacionada con el amiloide en sujetos con smdrome de Down (DS), pero particularmente a los deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo, la corteza prefrontal y/o corteza entorrinal del cerebro. Ejemplos de dicha memoria y/o deterioro cognitivo son, p. ej., pero sin estar limitados a ello, deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje, tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en un terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos, que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones.

El termino "deterioro de la memoria" se refiere ademas a la caractenstica cardinal del DS y es a menudo su manifestacion mas temprana. Incluso cuando no es la dolencia principal, los deficits de memoria se pueden iniciar en la mayona de los pacientes con DS en el momento de la presentacion. El patron de deterioro de la memoria en el DS es bastante distintivo. La memoria declarativa para hechos y eventos, que depende de las estructuras temporales mediales, tal como la corteza entorrinal y el hipocampo, se ve profundamente afectada en el DS, mientras que los sistemas subcorticales que soportan la memoria de procedimiento estan relativamente a salvo hasta muy tarde en el curso de la enfermedad.

La memoria episodica esta mas profundamente deteriorada en pacientes jovenes con DS, comparada con la memoria para hechos tales como vocabulario y conceptos (memoria semantica), que a menudo se deteriora algo mas tarde. Dentro de la memoria episodica, hay una distincion entre recuerdo inmediato (p. ej., entrenamiento mental de un numero de telefono), memoria para eventos recientes (que entra en juego una vez que se debe recordar el material que se ha apartado de la conciencia) y memoria de eventos mas remotos. La memoria para eventos recientes, atendida por el hipocampo, la corteza entorrinal en el lobulo temporal medial, se deteriora prominentemente en pacientes jovenes con DS. Por el contrario, la memoria inmediata (codificada en las cortezas prefrontales) se conserva en etapas tempranas, como son las memorias que se consolidan por largos penodos de tiempo (anos), que se pueden recordar en ausencia del funcionamiento hipocampal.

Los deterioros de la memoria de procedimiento aparecen solo en pacientes de mediana edad con DS. La disfuncion en el lenguaje, la funcion ejecutiva y otros dominios cognitivos se desarrollan a tasas variables a lo largo del curso de la enfermedad. La heterogeneidad de la presentacion clmica del DS refleja presumiblemente una distribucion topografica variable de la carga de la patologfa cerebral. La disfuncion del lenguaje, que es la afasia, es un smtoma comun del DS, y las primeras manifestaciones de la disfuncion del lenguaje generalmente incluyen dificultades para encontrar palabras, circunlocucion y vocabulario reducido en el habla espontanea y con anomia en los ensayos de denominacion de confrontacion. Esto puede progresar para incluir errores parafasicos, contenido del habla empobrecida y comprension deteriorada. Sin embargo, los pacientes generalmente pueden repetir frases literalmente hasta que la enfermedad este bastante avanzada. Las dificultades del lenguaje en el DS se han descrito a menudo como el tipo de afasia de Wernicke y Broca. Cuando se les pide que generen listas de palabras en un minuto de tiempo, los pacientes con DS se comportan significativamente peor en una prueba de fluidez semantica (p. ej., listas de animales) que en una prueba de fluidez de letra (p. ej., listas de palabras que comienzan con F). Esto refleja el deficit espedfico en la memoria semantica.

La perdida de habilidades visuoespaciales es otra caractenstica temprana del DS que a veces puede ser bastante prominente en la presentacion. Los deterioros visuoespaciales se manifiestan como la mala colocacion de los artfculos y la dificultad de navegar en un primer terreno desconocido y luego familiar. La agnosia visual (incapacidad para reconocer objetos) y la prosopagnosia (incapacidad para reconocer caras) son caractensticas posteriores.

El deterioro en la funcion ejecutiva se observa tambien en pacientes con DS. Estos smtomas incluyen una percepcion pobre y una capacidad reducida para el razonamiento abstracto. A medida que la enfermedad progresa, los cambios de personalidad (tal como apatfa, desconexion social y desinhibicion), falta de juicio y planificacion, y una incapacidad para completar las tareas que surgen tfpicamente. La depresion superpuesta, que puede ser diffcil de diagnosticar en el contexto de la demencia, tambien se puede presentar de esta manera.

La percepcion reducida de los deficits (anosognosia) es otro rasgo caractenstico del DS. No es raro que los pacientes nieguen o subestimen sus deficits y ofrezcan explicaciones cuando se les senala. Entrevistar a un historiador colateral, tal como un conyuge, es fundamental para obtener un historial preciso. De hecho, a menudo es el miembro de la familia quien lleva la queja del deterioro cognitivo a la atencion medica. La perdida de percepcion aumenta a lo largo del tiempo junto con la gravedad general de la enfermedad, y se puede asociar con trastornos del comportamiento; aquellos con una percepcion relativamente conservada son mas susceptibles de estar deprimidos, mientras aquellos con una percepcion mas deteriorada son susceptibles de estar agitados, desinhibidos y presentan caractensticas psicoticas. La aparicion de trastornos del comportamiento, que incluye agitacion, agresion, deambular y psicosis (alucinaciones, delirios, smdromes de identificacion erronea) puede conducir a una angustia significativa para el paciente y los miembros de la familia, y se ve tfpicamente en etapas posteriores del DS.

Los pacientes mas jovenes con DS tienen generalmente un examen neurologico normal, excepto para el examen cognitivo. Mientras los signos motores piramidales y extrapiramidales, mioclomas y convulsiones ocurren en pacientes con DS, estos son tfpicamente signos de la etapa avanzada. De forma similar, los signos de liberacion frontal (agarre, reflejo hocico, gegenhalten) y la incontinencia son caractensticas tardfas, mas que tempranas, del DS.

La composicion inmunogenica descrita en la presente memoria, que puede ser una vacuna terapeutica, comprende la construccion antigenica

como se describe anteriormente en la presente memoria en una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz y se puede preparar como una disolucion lfquida, o como una suspension inyectable, o si no en una forma solida adecuada para la solubilizacion antes de la inyeccion en el contexto de, por ejemplo, un kit para hacer uso de la presente composicion, como se describe a continuacion.

Una "cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz" se refiere a la cantidad de anticuerpo, peptido, compuesto o composicion farmaceutica que, cuando se administra a un ser humano o animal, conduce a un efecto terapeutico o profilactico en dicho ser humano o animal. La cantidad efectiva se determina facilmente por un experto en la tecnica siguiendo los procedimientos de rutina.

La composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se puede administrar a un ser humano o animal, particularmente a un ser humano o animal con smdrome de Down que padece de deterioros o anomaKas cognitivas semejantes a la AD, particularmente deterioros o anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, para inducir una respuesta inmunitaria en dicho ser humano o animal para aliviar dichos smtomas semejantes a la a D asociados con la enfermedad o para recuperar una condicion encontrada en individuos sanos que no estan afectados por la enfermedad.

Ya que practicamente todas las personas con Smdrome de Down padeceran finalmente deterioros cognitivos semejantes a la AD en algun momento de la vida, sera beneficioso tambien administrar dicha vacuna a las personas con Smdrome de Down antes de la manifestacion de los deterioros semejantes a la AD. Dicha vacuna actuana entonces como un tratamiento preventivo.

La composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se puede administrar a un ser humano o a un animal por cualquier via de administracion estandar adecuada. En general, la composicion se puede administrar por via topica, oral, rectal, nasal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea o intramuscular). Ademas, la composicion se puede incorporar en matrices de cesion prolongada tales como polfmeros biodegradables, implantandose los polfmeros en la proximidad del sitio en que se desea la aplicacion, por ejemplo, en el sitio de un tumor. El metodo incluye la administracion de una dosis unica, la administracion de dosis repetidas en intervalos de tiempo predeterminados y la administracion prolongada durante un penodo de tiempo predeterminado.

La construccion antigenica descrita en la presente memoria, particularmente una composicion inmunogenica que comprende dicha construccion antigenica en una cantidad terapeuticamente eficaz, se administra en dosis repetidas, en particular en 1 a 15 dosis, mas particularmente en 2 a 10 dosis, mas particularmente en 3 a 7 dosis y aun mas particularmente en 4 a 6 dosis, en intervalos de tiempo de entre 1 y 10 semanas, particularmente en intervalos de tiempo de entre 1 y 6 semanas, mas particularmente en intervalos de tiempo de entre 1 y 4 semanas, y aun mas particularmente en intervalos de tiempo de entre 2 y 3 semanas. La respuesta inmunitaria se monitoriza tomando muestras de sueros en un momento adecuado despues del refuerzo, particularmente de 3 a 10 dfas despues del refuerzo, mas particularmente de 4 a 8 dfas despues del refuerzo y mas particularmente de 5 a 6 dfas despues del refuerzo y determinando la inmunogenicidad de la construccion antigenica utilizando metodologfa conocida, particularmente uno de los inmunoensayos comunmente utilizados, tal como por ejemplo un ensayo ELISA.

En particular, la composicion del peptido antigenico descrita en la presente memoria se administra mediante inyeccion parenteral, particularmente por via intraperitoneal, intravenosa, subcutanea e intramuscular.

La dosificacion de la composicion dependera de la condicion que esta siendo tratada, de la composicion particular utilizada y otros factores clmicos tales como el peso, tamano y el estado del paciente, la superficie corporal, el compuesto o la composicion particular a administrar, otros farmacos que se administren de forma concurrente, y la via de administracion.

La composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se puede administrar en combinacion con otras sustancias biologicamente activas y procedimientos para el tratamiento de los smtomas asociados con el smdrome de Down. Las otras sustancias biologicamente activas pueden ser parte de la misma composicion que ya comprende la composicion inmunogenica como se describe en la presente memoria, en forma de una mezcla, en donde la composicion inmunogenica y la otra sustancia biologicamente activa se mezclan entre sf o con el mismo disolvente y/o vehmulo farmaceuticamente aceptables o se pueden proporcionar por separado como parte de composiciones separadas, que se pueden ofrecer por separado o juntas en forma de un kit de partes.

La composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se puede administrar simultaneamente con la otra sustancia o sustancias biologicamente activas, intermitentemente o sucesivamente. Por ejemplo, la composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se puede administrar simultaneamente con una primera sustancia adicional biologicamente activa o sucesivamente despues o antes de la administracion de dicha composicion. Si se elige un plan de aplicacion donde se administra mas de una sustancia adicional biologicamente activa junto con al menos una de las composiciones inmunogenicas descritas en la presente memoria, los compuestos o sustancias se pueden administrar parcialmente de manera simultanea, parcialmente de manera sucesiva en diversas combinaciones.

Ademas, se describen por lo tanto en la presente memoria mezclas de una composicion inmunogenica como se describe en la presente memoria y, opcionalmente, ademas una o mas sustancias adicionales biologicamente activas en una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz, asf como los metodos de uso de tal composicion como se describe en la presente memoria, o mezclas de los mismos para la prevencion y/o el tratamiento terapeutico y/o el alivio de los efectos de la patologfa relacionada con el amiloide en sujetos ninos, o en jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, particularmente para mejorar o recuperar los deterioros o anomalfas de la memoria, particularmente deterioros y anomalfas que se originan en el hipocampo y/o la corteza prefrontal y/o la corteza entorrinal del cerebro, particularmente para mejorar o recuperar los deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatia, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos, que incluyen signos piramidales y extrapiramidales asf como mioclomas o convulsiones.

Las mezclas descritas en la presente memoria pueden comprender, ademas de una composicion inmunogenica como se describe en la presente memoria, una sustancia biologicamente activa tal como, por ejemplo, compuestos conocidos utilizados en la medicacion de los smtomas semejantes a la AD en sujetos ninos, o en jovenes o de mediana edad con el smdrome de Down.

La otra sustancia o compuesto biologicamente activo puede ejercer su efecto biologico mediante el mismo o un mecanismo similar como la composicion inmunogenica descrita en la presente memoria o mediante un mecanismo de accion no relacionado o mediante una multiplicidad de mecanismos de accion relacionados y/o no relacionados.

Generalmente, el otro compuesto biologicamente activo puede incluir anticuerpos generados contra y que se unen a un peptido antigenico como se describe en la presente memoria o compuestos utilizados en la medicacion de patologfas neurologicas tal como potenciadores de la transmision de neutrones, farmacos psicoterapeuticos, inhibidores de la acetilcolinesterasa, bloqueantes de los canales de calcio, aminas biogenicas, tranquilizantes del grupo de las benzodiazepinas, intensificadores de la smtesis, almacenamiento o liberacion de acetilcolina, agonistas de receptores postsinapticos de acetilcolina, inhibidores de la monoaminooxidasa A o B, antagonistas del receptor de N-metil-D-aspartato glutamato, farmacos antiinflamatorios no esteroideos, antioxidantes y antagonistas de los receptores serotogenicos.

En particular, la mezcla como se describe en la presente memoria puede comprender al menos otro compuesto biologicamente activo seleccionado del grupo que consiste en compuestos contra el estres oxidativo, compuestos antispoptoticos, agentes quelantes metalicos, inhibidores de la reparacion del DNA tales como pirenzepina y metabolitos, acido 3-amino-1-propanosulfonico (3APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), activadores de secretasa, inhibidores de la p- y Y-secretasa, moduladores de la p- y Y-secretasa, protemas tau, neurotransmisores, rompedores de laminas p, moleculas antiinflamatorias o inhibidores de la colinesterasa (ChEI) tales como tacrina, rivastigmina, donepezilo y/o galantamina y otros farmacos y suplementos nutritivos, junto con una vacuna terapeutica segun la invencion y, opcionalmente, un vehmulo y/o un diluyente y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las mezclas como se describen en la presente memoria pueden comprender ademas niacina o mementina junto con una composicion inmunogenica como se describe en la presente memoria y, opcionalmente, un vehmulo y/o un diluyente y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las mezclas pueden comprender "antipsicoticos atfpicos" tales como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina para el tratamiento de smtomas psicoticos positivos y negativos que incluyen alucinaciones, delirios, trastornos del pensamiento (manifestados por una marcada incoherencia, descarrilamiento, tangencialidad) y comportamiento extrano o desorganizado, asf como anhedonia, afecto aplanado, apatfa y aislamiento social, junto con una composicion inmunogenica y/o una vacuna terapeutica segun la invencion y, opcionalmente, un vehmulo y/o un diluyente y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Otros compuestos que se pueden utilizar adecuadamente en mezclas en combinacion con la composicion inmunogenica descrita en la presente memoria se describen, por ejemplo, en el documento WO2004/058258 (veanse especialmente las paginas 16 y 17), que incluyen dianas terapeuticas de farmacos (paginas 36-39), acidos alcanosulfonicos y acido alcanolsulfurico (paginas 39-51), inhibidores de la colinesterasa (paginas 51-56), antagonistas del receptor de NMDA (paginas 56-58), estrogenos (paginas 58-59), farmacos antiinflamatorios no esteroideos (paginas 60-61), antioxidantes (paginas 61-62), agonistas de receptores activados de proliferadores de peroxisoma (PPAR) (paginas 63-67), agentes de disminucion del colesterol (paginas 68-75); inhibidores amiloides (paginas 75-77), inhibidores de la formacion de amiloides (paginas 77-78), agentes quelantes metalicos (paginas 78 79), antipsicoticos y antidepresivos (paginas 80-82), suplementos nutricionales (paginas 83-89) y compuestos que aumentan la disponibilidad de sustancias biologicamente activas en el cerebro (veanse las paginas 89-93) y profarmacos (paginas 93 y 94), pero especialmente los compuestos mencionados en las paginas anteriormente indicadas.

Se describe ademas en la presente memoria una construccion antigenica que comprende un peptido Ap que no contiene un epftopo de celulas T y, por lo tanto, esta libre de efectos secundarios potenciales, tales como complicaciones neurologicas causadas por un sistema de complemento sobreactivado. Esto se puede conseguir administrando un antfgeno de un peptido Ap, particularmente un antfgeno de un peptido Ap palmitoilado, mas particularmente el antfgeno del peptido Ap-M⁵palmitoilado, pero especialmente el antfgeno de peptido Ap-M⁵palmitoilado, Ap-M⁵en combinacion con un inhibidor del complemento.

El inhibidor del complemento puede ser un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el Receptor 1 del complemento humano soluble, anti-protema C5 del complemento humano tal como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado anti C5 o un fragmento monocatenario de un anticuerpo monoclonal humanizado, inhibidor N de C1-esterasa e inhibidor natural de C1 humana.

El antigeno del peptido amiloide modificado tal como, por ejemplo, el antigeno de peptido beta 1-15 amiloide se puede sintetizar siguiendo el metodo descrito en (Nicolau et al. 2002). El enfoque descrito en Nicolau et al se puede modificar sintetizando primero el peptido antigenico que luego se modifica ademas por un injerto en resina de un resto lipofilo o hidrofobo, en los restos del aminoacido terminal del peptido previamente formado. En particular, un aminoacido protegido, particularmente un aminoacido protegido con Fmoc, se une a una resina utilizando la qmmica de acoplamiento conocida. Se retira el grupo protector y se une un segundo resto de aminoacido protegido. Despues, se utilizan la smtesis de peptidos automatizada estandar que utiliza la qmmica de proteccion conocida, particularmente la qmmica Fmoc/tBu, y grupos protectores de la cadena lateral estandar para sintetizar el peptido antigenico Ap, particularmente el peptido antigenico Api^-15mediante el acoplamiento de los aminoacidos 1 a 15 de la protema amiloide AP^1-42para producir el fragmento peptfdico con una secuencia dada. En una etapa final, se unen dos aminoacidos protegidos adicionales al fragmento peptidico en crecimiento. Los grupos Mtt en las cadenas laterales de los dos primeros y los dos ultimos aminoacidos se pueden escindir a continuacion selectivamente y unir a acido palmftico. Despues del lavado de la resina, se retira el grupo protector y la resina se escinde de forma simultanea, seguido de las desprotecciones de cadenas laterales utilizando la metodologfa estandar. El producto final se puede obtener a continuacion en alta pureza y confirmar su identidad mediante metodos conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, la espectrometna de masas por electropulverizacion.

El peptido antigenico amiloide Ap modificado, particularmente el peptido antigenico AP^1-15modificado se puede reconstituir en una construccion que consiste en liposomas, particularmente liposomas preparados de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPEA), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y colesterol, que contienen opcionalmente lfpido A monofosforilado.

Tambien se contempla en la presente memoria utilizar como una sustitucion para los lfpidos cationicos en la membrana liposomal, lfpidos anionicos seleccionados del grupo que consiste en:

a. diacil-fosfolfpidos con grupos de cabeza de fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, L-a-fosfatidilinositol-4-fosfato o acido fosfatfdico;

b. liso-fosfolfpidos con grupos de cabeza de fosfatidilglicerol, fosfatidilserina o acido fosfatfdico, y

c. cardiolipina, dilisocardiolipina, monolisocardiolipina

En un aspecto, se contempla utilizar como una sustitucion para los lfpidos anionicos en la membrana liposomal, los lfpidos cationicos seleccionados del grupo que consiste en:

a. diacil-fosfolfpidos con grupos de cabeza de 3-trimetilamonio-propano, 3-dimetilamonio-propano, 3-etilfosfocolina o 3-fosfatidiletanolamina;

a. ser saturadas o insaturadas,

b. variar en longitud desde (CH²)n en donde n esta entre 3 y 24, y

estar sustituidas simetricamente o asimetricamente.

Se pueden utilizar liposomas con lfpido A como adyuvante para preparar la vacuna antiamiloide. Se mezclan dimiristoilfosfatidilcolina, glicerol y colesterol, particularmente en una relacion molar de 0,9:1,0:0,7. Se anade despues un inmunomodulador fuerte tal como, por ejemplo, lfpido A monofosforilado a una concentracion adecuada, particularmente a una concentracion de entre 30 y 50 mg por mmol, mas particularmente de 40 mg por mmol de fosfolfpidos. Se anade despues el peptido antigenico Ap modificado en una relacion molar de peptido a fosfolfpidos de entre 1:30 y 1:200, particularmente a una relacion molar de entre 1:50 y 1:120, mas particularmente de 1:100. Los disolventes se retiran, por ejemplo, a traves de la evaporacion, y la pelfcula resultante se hidrata con una disolucion tampon esteril como, por ejemplo, PBS.

Tambien se pueden preparar liposomas mediante la tecnica de inyeccion a contracorriente como se describe, por ejemplo, en (Wagner et al. 2002). Durante la inyeccion de disoluciones de lfpidos en un sistema tampon acuoso, los lfpidos tienden a formar "precipitados", seguidos de la autocolocacion en vesfculas. El tamano de las vesfculas obtenidas depende de factores tales como la concentracion del lfpido, la velocidad de agitacion, la velocidad de inyeccion y la eleccion de lfpidos. El sistema de preparacion puede consistir en un modulo de inyeccion a contracorriente, recipientes para la fase polar (p. ej., una disolucion tampon de PBS), un recipiente de disolucion de etanol/lfpido y un dispositivo de presion, pero particularmente un dispositivo de presion de nitrogeno. Mientras la disolucion acuosa o polar se bombea a traves del modulo de inyeccion a contracorriente, la disolucion etanol/lfpido se inyecta en la fase polar variando las presiones aplicadas. Se describen diversos metodos de produccion de las construcciones antigenicas de liposomas en el documento WO2007/068411.

Por consiguiente, la composicion liposomal para uso en el metodo descrito en la presente memoria se puede preparar para comprender un Ap1-15 palmitoilado, particularmente un Ap1-15 tetrapalmitoilado junto con ftpido A monofosforilado (MPLA) como un adyuvante.

Se pueden administrar por v^a subcutanea de cuatro a diez, particularmente de cinco a seis dosis de la composicion liposomal y semanalmente o cada dos semanas a un sujeto que se va a vacunar. Se pueden obtener y analizar las sondas de plasma periodicamente para los tftulos de IgG.

La eficacia de la composicion liposomal de la invencion como un inmunogeno en sujetos ninos yjovenes o de mediana edad con smdrome de Down y el potencial terapeutico para tratar los deficits de memoria en dichos sujetos se podna demostrar en un modelo animal relevante para el smdrome de Down. En particular, se utilizaron ratones Ts65Dn que son ampliamente aceptados como un modelo animal para el DS. Los ratones Ts65Dn ejercen un triplicado del cromosoma 16 murino, que alberga el gen APP murino (Davisson et al. 1993; Netzer et al.2010). Estos ratones transgenicos muestran 1,5 veces aumentado el Ap murino (Hunter et al. 2004) y demuestran deficits de comportamiento en varias tareas de memoria (Belichenko et al. 2009).

Se pudo demostrar en la presente invencion que la composicion liposomal de la invencion indujo tftulos elevados de anticuerpos y que dichos anticuerpos permanecen elevados incluso 40 dfas despues de la ultima inmunizacion. Por lo tanto, como se describe en la presente memoria la composicion liposomal es capaz de inducir una respuesta inmunitaria fuerte y de romper la autotolerancia hada Ap en sujetos tratados con smdrome de Down.

Se mostro ademas que la composicion liposomal de la invencion y como se describe en la presente memoria es capaz de inducir en ratones jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, tftulos de IgG tan altos como en sujetos de un grupo control sin smdrome de Down. La composicion liposomal como se describe en la presente memoria induce tftulos aumentados de anticuerpos del isotipo IgG2a en comparacion con el grupo control, mientras que los tftulos de anticuerpos de los isotipos IgG1 e IgG2b son comparables en el tratamiento y el grupo control. Los tftulos de anticuerpos de clase IgM son mas bajos en el grupo de tratamiento en comparacion con el grupo control. Este nivel de IgM ligeramente inferior puede ser causado por el sistema inmunitario alterado de ratones con smdrome de Down. La composicion liposomal es, por lo tanto, capaz de superar el deterioro de la respuesta inmunitaria adaptativa hacia Ap descrito en personas con DS (Monsonego et al. 2001).

La composicion liposomal de la invencion y como se describe en la presente memoria tambien es segura y no induce a efectos secundarios indeseados. En particular, el tratamiento con la composicion liposomal no conduce a la activacion celular del cerebro, tal como la activacion de astrocitos o microglia.

Se mostro que la composicion liposomal de la invencion y como se describe en la presente memoria da como resultado una relacion de discriminacion mas alta en el modelo animal que indica que el tratamiento condujo a una mejona significativa de la memoria en los animales tratados.

La composicion liposomal como se describe en la presente memoria se mostro ademas en un ensayo que consiste en sesiones de entrenamiento, nemotecnicas y contextuales para dar como resultado una congelacion mejorada en el modelo animal que alcanza niveles comparables a los observados en los animales control. Esto sugiere que la inmunizacion fue eficiente y mejoro la capacidad de memoria de los animales modelo.

La composicion liposomal como se describe en la presente memoria es asf capaz de recuperar los deficits de memoria en sujetos ninos y jovenes o de mediana edad que padecen de smdrome de Down, en particular en sujetos ninos y jovenes o de mediana edad con smdrome de Down, que aun no han desarrollado placas asociadas de Ap en el cerebro. Los pacientes que padecen de smdrome de Down presentan anomaftas cognitivas, tales como deterioro de la memoria y actividades anormales.

La composicion liposomal como se describe en la presente memoria es ademas capaz de recuperar los deficits de memoria en sujetos ninos yjovenes o de mediana edad que padecen de smdrome de Down, en particular en sujetos ninos yjovenes o de mediana edad con smdrome de Down, que han desarrollado ya placas asociadas de Ap en el cerebro.

En una realizacion, el tratamiento con la composicion liposomal puede mejorar o recuperar el deficit de memoria en un sujeto nino o en un joven a de edad mediana con smdrome de Down, particularmente deterioros de la memoria de reconocimiento y/o deterioros de la memoria asociativa contextual y/o deterioros del aprendizaje asociativo y/o deterioros de la memoria declarativa para hechos y eventos y/o deterioros de la memoria episodica y/o disfuncion del lenguaje, tal como afasia y/o deterioros visuoespaciales, tal como la mala colocacion de los artmulos y la dificultad para navegar en un terreno desconocido y familiar y/o disminucion de las funciones ejecutivas, tal como apatfa, desinhibicion, aislamiento social, falta de juicio, dificultades con la planificacion y/o pobre razonamiento abstracto y/o cambios de personalidad y/o cambios emocionales tal como apatfa, agitacion y psicosis y/o apraxia y/o deterioros en la realizacion de tareas motoras aprendidas y/u otros signos neurologicos que incluyen signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1, muestra una presentacion esquematica de la vacuna ACI-DS-01, que es una vacuna basada en liposomas con antigeno Ap1-15 de raton tetrapalmitoilado y MPLA como adyuvante. Estan subrayados los tres aminoacidos diferentes entre el Ap1-15 humano y de raton.

Figura 2, muestra los niveles de anticuerpos anti-Ap de raton en ratones Ts65Dn inmunizados con la vacuna ACI-DS-01. A y B) Se detectaron tftulos de IgG anti-Ap40 o 42 de raton en el plasma de ratones inmunizados con ACI-DS-01. Los tftulos inducidos se observaron despues de la segunda inmunizacion y se mantuvieron altos incluso 40 dfas despues de la 6a inyeccion en comparacion con ratones inmunizados con liposomas vados. No hubo diferencia entre los tftulos medidos de ratones 2N y Ts65Dn. C a F) Se detectaron isotipos IgG despues de la 4a inmunizacion. G) Los tftulos de IgM fueron escasamente mas bajos en los ratones Ts65Dn. H) Se detectaron los mismos niveles de tftulos de IgG anti-MPLA en todos los ratones inmunizados con ACI-DS-01. Las graficas representan la media ±SD. (n=20 2N-ACI-DS-01, n=15 Ts65Dn-ACI-DS-01, n=18 2N-Vado y n=11 Ts65Dn-Vado. Las graficas representan la media ±SD).

Figura 3, muestra la eficacia de la inmunizacion en el rendimiento de la memoria. La diferencia en la actividad locomotora espontanea entre los ratones 2N y Ts65Dn permanecio similar despues de la inmunizacion. B) Los ratones inmunizados con ACI-DS-01 mostraron un significativo mdice de reconocimiento mejorado (RI) en el reconocimiento de objetos nuevos en comparacion con el grupo tratado con la vacuna vada. C) En el condicionamiento del miedo, los ratones inmunizados mostraron una significacion ftmite para un mayor nivel de congelacion durante la sesion contextual. Las graficas representan la media ±SD. (n=202N-ACI-DS-01, n=13 Ts65Dn ACI-DS-01, n=182N-Vado y n=11 Ts65Dn-Vado).

Figura 4, muestra el nivel de Ap40 en ratones tratados con la vacuna ACI-DS-01. A) En la corteza, el nivel de Ap40 fue escasamente mayor en los ratones Ts65Dn en comparacion con los 2N. La vacuna ACI-DS-01 mostro una tendencia a disminuir los niveles de Ap42 y Ap40 en la corteza y el hipocampo. Los niveles de Ap42 y Ap40 en el cerebelo mostraron una disminucion estadfsticamente significativa despues del tratamiento con ACI-DS-01. Las graficas representan la media ±SD. (n=10 2N-ACI-DS-01, n=10 Ts65Dn ACI-DS-01, n=8 2N-Vado y n=5 Ts65Dn-Vado). B y C) Correlacion entre la relacion Ap-40/42 en la corteza o el cerebelo con el RI. D) El nivel de los tftulos de IgG anti-Ap se correlaciona debilmente con el nivel de Ap40 en el plasma de ratones Ts65Dn tratados con ACI-DS-01. E) Correlacion significativa entre el nivel de IgG anti-Ap y el RI.

(n=192N ACI-DS-01, n=13 Ts65Dn ACI-DS-01, n=182N-Vado y n=11 Ts65Dn-Vado).

Figura 5, muestra estudios de la reaccion inflamatoria. A) Peso corporal y cerebral. B) Imagenes confocales de inmunorreactividad de GFAP (izquierda) y CD45 (derecha) en ratones 2N y Ts65Dn tratados. Las flechas apuntan a celulas microgliales individuales positivas para CD45. La densidad optica de la inmunorreactividad de GFAP se cuantifico y no revelo diferencias entre los grupos. n=4 de cada grupo.

Figura 6, muestra secciones de muestras de cerebro humano con DS inmuno-tenidas con sueros de ratones inmunizados con ACI-DS-02. El area positiva indica que el anticuerpo derivado de ACI-DS-02 se une a las placas amiloides en el cerebro de las personas con DS. La tincion fue similar a la tincion obtenida con 6E10, un anticuerpo anti-beta amiloide disponible comercialmente y con el anticuerpo derivado de ACI-24. La vacuna ACI-24 corresponde a la vacuna ACI-DS-01 con la diferencia de que el antfgeno utilizado en ACI-24 es una secuencia humana de Ap1-15, mientras que la vacuna ACI-DS-01 contiene como antfgeno una secuencia de raton de Ap1-15 (para los tres aminoacidos diferentes en esos dos antfgenos, vease la Figura 1). No se observo tincion cuando se incubo una seccion con sueros de ratones inmunizados con PBS.

Figura 7, muestra el aprendizaje de ratones TS65Dn inmunizados con la vacuna ACI-DS-02 en el ensayo de condicionamiento del miedo. Los ratones TS65Dn inmunizados con ACI-DS-02 mostraron una mayor congelacion durante la sesion de adquisicion en comparacion con los ratones TS65Dn inmunizados con PBS, particularmente despues del tercer estfmulo condicionado (CS).

Las graficas representan la media ±SD. (n=7 Ts65Dn-ACI-DS-02, n=7 2N-PBS y n=4 Ts65Dn-PBS. Las graficas representan la media ±SD).

Figura 8, muestra secciones de muestras de cerebro humano con DS inmuno-tenidas con sueros de ratones inmunizados con ACI-DS-03. El area positiva indica que el anticuerpo derivado de ACI-DS-03 se une a las placas amiloides en el cerebro de las personas con DS. La tincion fue similar a la tincion obtenida con 6E10, un anticuerpo anti-beta amiloide disponible comercialmente, y con el anticuerpo derivado de ACI-24. La vacuna ACI-24 corresponde a la vacuna ACI-DS-01 con la diferencia de que el antfgeno utilizado en ACI-24 es una secuencia humana de Ap1-15, mientras que la vacuna ACI-DS-01 contiene como antfgeno una secuencia de raton de Ap1-15 (para los tres aminoacidos diferentes en esos dos antfgenos, vease la Figura 1). No se observo tincion cuando se incubo la seccion con sueros de ratones inmunizados con PBS.

Figura 9, muestra los analisis morfologicos de ratones Ts65Dn inmunizados con la vacuna ACI-DS-01. A) Numero de celulas ChAT+ en el septum medio y B) las densidades opticas fueron similares en todos los grupos. C) el area del cuerpo celular para ChAT+_aumento en ratones Ts65Dn inmunizados con ACI-DS-01 en comparacion con los Ts65Dn tratados con la vacuna vada. (n=42N-Vado, n=4 Ts65Dn-Vado, n=42N-ACI-DS-01 y n=4 Ts65Dn-ACI-DS-01. Las graficas representan la media ±SD).

Ejemplos

Ejemplo 1 Metodologfa general

1.1 Animales:

Se utilizaron ratones Ts65Dn (n=30) conocidos como un modelo de raton DS (Davisson et al. 1993) y el control de edad similar 2N (n=40). En la fecha de inicio, los ratones utilizados teman 5 meses de edad. Al final del estudio (inmunizacion y ensayos de comportamiento), los ratones teman 9 meses de edad. Por lo tanto, todas las muestras recogidas en el sacrificio son de ratones de 9 meses de edad.

Los Ts65Dn recien nacidos tienen una letalidad elevada (alrededor del 6%) principalmente debido a malformaciones cardfacas congenitas (Randall 2006, Moore 2006). Sin embargo, los ratones pueden sobrevivir incluso hasta de 18 a 24 meses. En nuestro estudio, se observo una tasa de mortalidad del 15%. Los ratones supervivientes presentan una disminucion de tamano del 20% comparado con los companeros de camada normales. Los ratones mas gravemente afectados que murieron al nacer, no sobreviven para ser analizados, dando como resultado subestimaciones del impacto de los genes trisomicos en algunos fenotipos (es decir, defecto cardfaco). Sin embargo, para nuestra preocupacion, los ratones supervivientes representan un modelo adecuado de DS para analizar patologfas amiloides y semejantes a la AD.

En el modelo de raton DS utilizado para estos estudios, los ratones muestran niveles aumentados de amiloide a la edad de 4 meses (Hunter 2004). A una edad de 9 meses, el nivel de beta amiloide alcanza 3 veces el nivel normal como se predice en vista de las tres copias del gen APP. Similar a las personas con DS, el envejecimiento es un factor importante para la deposicion de amiloide en los cerebros Ts65Dn. A pesar de la acumulacion de amiloide relacionada con la edad, los ratones TS65Dn no desarrollan placas. Sin embargo, replican fielmente la degeneracion de las poblaciones neuronales que se ven en la AD y en las personas con smdrome de Down (Salehi et al., 2009)

Tomados en conjunto, las caractensticas del DS en el modelo de raton utilizado comprenden la presencia de protemas patologicas y aspectos fenotfpicos; es decir, la carga de amiloide y el deterioro cognitivo. Por lo tanto, los ratones Ts65Dn pueden recapitular exactamente los procedimientos patogenos del DS. Dado que estos ratones comienzan a acumular amiloide a un nivel comparable a los humanos a los 6 meses de edad, la edad de los ratones modelo se compara con los pacientes humanos con DS en un rango de edades desde jovenes o de mediana edad.

Los ratones utilizados para el estudio de inmunizacion con la vacuna ACI-DS-01 fueron la colonia de raton Ts65Dn mantenida durante mas de 10 generaciones cruzando hembras B6EiC3Sn-Ts(1716)65Dn (Laboratorio Jackson, Bar Harbor, ME) con machos B6EiC3SnF1/JA/a (Laboratorio Jackson). Este plan de reproduccion se utilizo porque los ratones trisomicos se reproducen muy mal o nada en absoluto cuando son consangumeos, los antecedentes de B6C3 han sido los mas exitosos. Para distinguir ratones 2N de Ts65Dn, se extrajo ADN genomico de muestras de la cola. Se utilizo un protocolo de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa (proporcionado por el Laboratorio Jackson) para medir la expresion del gen Mx1, que esta presente en tres copias en Ts65Dn. Se utilizaron ratones machos en todos los estudios. Eran de 4 /- 0,3 meses de edad al inicio del estudio.

1.2 Preparacion de la vacuna-Preparacion de una construccion antigenica basada en liposomas

Codigo de la Secuencia peptidica antigenica3 Secuencia Ap Conformacion del peptido vacuna antigenico en la vacuna (%) medida por ATR-IR

ACI-DS-01 H-Lys(Pal)-Lys (Pal) -Asp-Ala-Glu-Phe-Gly- Raton Api-15b (SEQ 73% lamina beta 19%

His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-GIn- ID NO:2) espiral aleatoria 0% helice Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH alfa o bucles 8% helices beta

ACI-DS-02 H-Lys(Pal)-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly- Ser humano AP22-35 67% lamina beta 21%

Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Lys(Pal)-OH (SEQ ID NO:4) y espiral aleatoria 0% hdice raton AP22-35 (SEQ alfa o bucles 12% helices ID NO:5) beta

ACI-DS-03 H-Lys(Pal)-Lys(Pal)-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe- Ser humano AP14-29 57% lamina beta 19%

Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly- (SEQ ID NO:6) y espiral aleatoria 12% Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH raton Ap 14-29 (SEQ helice alfa o bucles 11% ID NO:7) helices beta

Las secuencias de peptidos se presentan en codigos de tres letras; Pal significa resto palmitoilado;

bEstan subrayados los tres aminoacidos diferentes entre el AP1-15 humano y de raton y se muestran en la Figura 1.

La construccion antigenica del liposoma se produce segun el metodo descrito en el documento WO2007/068411. Los peptidos palmitoilados se prepararon por los Laboratorios PolyPeptide (Strasbourg, Francia). En resumen, las vacunas liposomales se prepararon solubilizando dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatodilglicerol (DMPG), colesterol y lfpido A monofosforilado (MPLA), (todos de Avanti Polar Lipids, AL, EE.UU.), en relaciones molares 9:1:7:0,05, respectivamente, en etanol a 60°C. La disolucion de Kpido/etanol se diluyo en PBS a pH 7,4, permitiendo la formacion de vesmulas multicapa. La preparacion resultante se concentro despues por ultrafiltracion (Vivaflow 200 100000 MWCO, Polietersulfona), con un caudal de 200 ml/min y el volumen de reaccion se redujo con una etapa de ultrafiltracion. La disolucion concentrada se sometio ademas a dialisis en un dispositivo Vivaflow 200 donde se realizo un intercambio de volumen 10x con PBS a pH 7,4. Los liposomas multilamelares se sometieron despues a homogeneizacion [7 ciclos a 1,034x108-1,38x108 Pa (15000-20000 Psi)], seguidos de 3 ciclos de extrusion secuencial a traves de filtros de policarbonato (Whatman) con un tamano de poro de 0,2 pm y un diametro de 47 mm. Tanto las etapas de homogeneizacion como la de extrusion se realizaron en un EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canada). Los liposomas unilamelares resultantes sin antigeno se diluyeron en PBS a pH 7,4 y se calentaron a 60°C antes de la adicion del peptido. El peptido palmitoilado se disolvio en PBS a pH 11,4 con 5,0% (p-OG). Para la preparacion de las vacunas ACI-DS-01, a C|-DS-02 y ACI-DS-03, se utilizaron los peptidos antigenicos correspondientes a 1,33, 0,67 y 1,06 mg/ml, respectivamente. La disolucion resultante comprendfa una concentracion de detergente por encima de su concentracion micelar critica (CMC) de 0,73% (peso/volumen). Esta disolucion peptfdica se inyecto despues en las disoluciones de liposomas a 60°C y se agito durante 30 minutos, dando como resultado una disolucion que tiene una concentracion final de p-OG muy por debajo de su concentracion micelar critica. La descomposicion micelar del detergente induce la incorporacion del antfgeno palmitoilado en la superficie de los liposomas formados previamente. Esta disolucion liposomal con antfgeno se concentro despues a traves de ultrafiltracion y se sometio a un intercambio de volumen 10x con PBS a pH 7,4 mediante diafiltracion (ambas en una polietersulfona de 100000 MWCO con un flujo de 200 ml/min). Los liposomas resultantes se filtraron despues de forma esteril dos veces pasando a traves de filtros de jeringa de policarbonato de 0,2 pm y se almacenaron a 5°C. La relacion molar de peptido a lfpido en la vacuna fue de 1:100.

1.3 Inmunizacion con la vacuna ACI-DS-01

Todos los ratones recibieron inmunizaciones subcutaneas (s.c.) con 200 pl de ACI-DS-01 (51,2 pg por dosis de Pal1-15, peptido Ap1-15 tetrapalmitoilado) o la vacuna de liposomas vados. Se realizaron un total de seis inyecciones los dfas 1, 14, 28, 42, 56, 70 y 110. En los mismos dfas, se realizaron sangnas en la cola justo antes de la primera inyeccion de la vacuna en el dfa -1 (antes de la sangna), dfa 56 (14 dfas despues de la 4a inyeccion) y en el sacrificio, dfa 110 (40 dfas despues de la 6a inyeccion). Los ratones se sacrificaron al final del estudio a la edad de 9 meses y se recogieron los cerebros.

1.4 Cuantificacion de anticuerpos Ap espedficos de raton despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Se determinaron mediante ELISA las respuestas de IgG espedficas para Ap1-42. Brevemente, las placas se recubrieron con 10 pg/ml de Ap1-42 de raton (Bachem H5966, lote: 1013710, 1028321 o 1033165) o Ap1-40 de raton (Bachem H5638, lote: 1013645) durante la noche a 4°C. Despues de lavar con PBS-Tween 20 al 0,05% y bloquear con BSA al 1%, se anadieron a las placas diluciones seriadas de plasma y se incubaron a 37°C durante dos horas.

Se utilizaron como control positivo el anticuerpo anti-Ap 4G8 (Covance SIG-39220, lote: 08EC00905, 1 mg/ml diluido 4000) y suero de un C57BL/6JOIaHsd (Harlan) inmunizado con tres inyecciones del mismo lote de ACI-DS-01. Despues del lavado, las placas se incubaron con anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Immunoresearch West Grove, PA, EE.UU., Cat. N°115-055-164 Lote 87821, vial diluido a 1/4000) durante dos horas a 37°C. Despues del lavado final, las placas se incubaron durante 2 horas y media con sustrato AP (pNPP) y se leyeron a 405 nm utilizando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como densidad optica (O.D).

1.5 Ensayos de comportamiento despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Todos los ratones se expusieron a la misma serie de ensayos de comportamiento comenzando alrededor de los 8 meses de edad. Cada raton se manipulo durante 10 minutos, dos veces al dfa, durante los 7 dfas que precedieron a los ensayos y durante 3 dfas en medio de los ensayos. Los ensayos se realizaron en los dfas indicados (segun la ultima inmunizacion) y en el siguiente orden: actividad locomotora (comenzando el dfa 11), tarea de reconocimiento de objetos nuevos con un retraso de 24h (comenzando el dfa 18), laberinto en T (comenzando el dfa 25), y el ensayo de condicionamiento del miedo contextual (comenzando el dfa 34). Todas los ensayos de comportamiento tuvieron lugar durante el ciclo de luz diurna entre las 7:00 a.m. y 7:00 p.m. y se realizaron a temperatura ambiente (22°C). El dfa del ensayo, los ratones se mantuvieron en sus jaulas hogar durante la fase de luz diurna en la misma sala experimental durante 2h para la habituacion. Como un indicador de ansiedad durante cada ensayo, tambien se midio el numero de sedimentos fecales y gotas de orina. Para minimizar las senales olfativas del experimento anterior, cada aparato se limpio a fondo con etanol al 10% despues de cada ocupacion del animal. El manejo y todos los ensayos de comportamiento se realizaron de una forma ciega, sin revelar el genotipo y el tratamiento al investigador que maneja los ratones.

1.5.1 Ensayo de la actividad locomotora espontanea despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

La actividad locomotora espontanea se monitorizo utilizando camaras de actividad de plexiglas (modelo MED-OFA-MS; Med Associates) (27,9x27,9x20 cm) y el software de monitoreo de actividad (Activity Monitor, version 4.3.6). Como se describe en Belichenko et al., (Belichenko et al. 2009; Belichenko et al. 2007), los ratones se colocaron en el centro de la camara bajo condiciones de luz ambiental brillante y la actividad se monitorizo durante 10 minutos en tres experimentos separados. Se determinaron las medias para la distancia total, velocidad, tiempo total de actividad, recuentos totales de actividad y actividad vertical.

1.5.2 Tarea de reconocimiento de objetos nuevos despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Utilizamos el protocolo de Bevins y Besheer (Bevins y Besheer, 2006; O'Doherty et al. 2005): una tarea de aprendizaje de un experimento que no coincide con la muestra para estudiar la memoria de reconocimiento de dos objetos de muestra en un entorno para estudiar la memoria y el aprendizaje con un retraso de 24h. Antes de la prueba, los ratones se habituaron en una camara de plexiglas negro (31x24x20 cm) durante 10 minutos durante 2 dfas consecutivos bajo condiciones de luz ambiental tenue. La actividad de los ratones a la edad de 8 meses durante la tarea de reconocimiento de objetos se registro con una camara de video. Primero, se colocaron dos objetos identicos en la camara, como describio anteriormente (Bevins y Besheer, 2006; O'Doherty et al. 2005). Se coloco un raton en el punto medio de la pared opuesta a los objetos de muestra. Despues de 10 minutos de explorar los objetos, el raton se devolvio a la colonia durante 24h. Para analizar el reconocimiento de objetos, se colocaron en la camara un objeto familiar y un objeto nuevo y el raton se coloco de nuevo en la camara durante 3 minutos para explorar los objetos. El reconocimiento de objetos se midio en un solo experimento. Los datos se determinaron utilizando observaciones directas de grabaciones de video. Los resultados fueron: 1) tiempo medio de exploracion total de los objetos de la muestra, tanto nuevos como familiares, y 2) relacion de discriminacion (interaccion del objeto nuevo/interaccion total con ambos objetos).

1.5.3 Ensayo del laberinto en T despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Se utilizaron ratones a la edad de 8 meses. Utilizamos un protocolo modificado de Deacon y Rawlins (Deacon y Rawlins, 2006) y una tarea de alternancia continua en un laberinto en T para evaluar la funcion hipocampal. El laberinto estaba hecho de vidrio acnlico opaco (Plexiglas) como se describe (Deacon y Rawlins, 2006) con una puerta corredera adicional al comienzo del brazo de partida. Durante el ensayo, se coloco un raton al comienzo del brazo de partida, con su parte trasera hacia la puerta corredera cerrada. Despues se abrieron todas las puertas, el raton corrio hacia abajo por el brazo de partida para elegir o el brazo objetivo derecho o el izquierdo. Despues de que las cuatro patas del raton hubieran entrado en un brazo objetivo, la puerta corredera del otro brazo objetivo se cerro durante 5s, y despues todas las puertas correderas se abrieron de nuevo, permitiendo que los ratones volvieran al brazo de partida. La actividad del laberinto en T se monitoreo hasta que los ratones terminaron 10 alternancias. Este procedimiento se repitio durante 3 dfas consecutivos, para un total de 30 experimentos. La puntuacion de la alternancia espontanea se definio como el numero de alternancias de izquierda a derecha y de derecha a izquierda, expresado como un porcentaje del numero total de posibles alternancias durante la sesion. Los resultados se promediaron tanto para las puntuaciones de alternancia como para el tiempo empleado.

1.5.4 Ensayo de condicionamiento del miedo contextual despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

El condicionamiento del miedo contextual y nemotecnico se llevo a cabo para la evaluacion del aprendizaje y la recuperacion dependientes del miedo. El ensayo se realizo utilizando camaras de Coulbourn Instruments (Whitehall, PA, EE.UU.). En el primer d^a, los animales se colocaron en una camara (Contexto A) durante 3 minutos para el registro de base, seguido de cinco emparejamientos de tono-choque. El choque (0,5 mA, 2 segundos) se administro despues del tono (70 dB, 2 kHz, 20 segundos) en cada emparejamiento de estfmulo condicionado/incondicionado. En el segundo dfa, se utilizo una camara nueva (Contexto B; nueva sala, nuevo entorno olfativo, nueva textura de suelo, inserciones de plastico azul para paredes, fuente adicional de luz azul y senales visuales) para el ensayo nemotecnico. Despues de un penodo de tono previo de 3 minutos, se presentaron tres tonos sin choques a los animales durante un penodo de ensayo de 3 minutos. En el ultimo dfa del experimento, los ratones se colocaron en el Contexto A durante 5 minutos sin ningun estfmulo condicionado o incondicionado (Saxe et al. 2006). Se definio la congelacion como la falta total de movimiento durante un mmimo de 0,75 segundos, medido mediante el software FreezeFrame (Actimetrics, Evanston, IL). Se describio el porcentaje de congelacion en cada periodo.

1.6 Medicion de pesos corporales y cerebrales despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Despues de todos los ensayos de comportamiento, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sodico (200 mg/kg, i.p.) (Laboratorios Abbott), se pesaron y se perfundieron transcardialmente durante 1 minuto con cloruro sodico al 0,9% (10 ml) y despues durante 10 minutos con paraformaldefudo al 4% en PBS 0,1 M, pH 7,4 (100 ml). Despues de la perfusion, se retiro el cerebro inmediatamente. Se registro el peso del cerebro (incluidos los bulbos olfativos, corteza, hipocampo, cerebelo, tronco encefalico y la medula espinal cervical a traves de C1-C2). El cerebro se coloco despues en fijador hasta su uso posterior.

1.7 Inmunofluorescencia para la reaccion inflamatoria despues de la inmunizacion con ACI-DS-01

Se preincubaron las secciones del cerebro con leche desnatada al 5% en PBS 0,1 M con Triton X-100 al 0,3%. Despues, se incubaron las secciones durante la noche a 4°C con el anticuerpo de conejo anti-protema acida fibrilar glial (GFAP) de vaca (DAKO, Glostrup, Dinamarca) a una dilucion de 1:500, o con el anticuerpo policlonal anti-CD45 de rata (Pharmingen) a una dilucion de 1:5000. Se realizaron las siguientes incubaciones (1h cada una y a temperatura ambiente); con un anticuerpo secundario anti-conejo de burro biotinilado (1:200; Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, EE.UU.) y con estreptavidina conjugada con isotiocianato de fluorescema (FITC) (1:500; Jackson ImmunoResearch Labs). Se realizo un enjuague con PBS (3 veces, cada 20 min) entre las incubaciones descritas anteriormente. Las secciones se montaron en el portaobjetos de vidrio de microscopio y se cubrieron con un cubreobjetos utilizando glicerol al 90% en tampon de fosfato 0,1 M, pH 7,4. Para controlar la especificidad de la tincion de anticuerpos, las secciones seleccionadas se sometieron al mismo protocolo pero sin incluir los anticuerpos primarios. No se observo inmunofluorescencia en las secciones control. Se examinaron y se escanearon las rodajas en un microscopio confocal Radiance 2000 (Bio-Rad, Hertfordshire, Reino Unido) unido a un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800. El laser era un laser de gas mixto de argon/cripton con longitudes de onda de excitacion para FITC a 488 nm(A). Se utilizo el software LaserSharp (Bio-Rad) para establecer condiciones optimas para la recoleccion de imagenes. Las condiciones optimas para las imagenes confocales de GFAP-inmunoreactividad (IR) o CD45-IR fueron las siguientes: la lente era un objetivo 20x (Nikon; Plan Apo 20x/0,75); la potencia del laser era del 10% o 20%; el aumento fue de 34,7; el desfase fue de 0,0; el factor de zoom fue 3; la velocidad de escaneo fue de 500 lrneas/s; cada seccion optica fue escaneada tres veces y despues se empleo el filtrado de Kalman para reducir el ruido; el tamano de la imagen fue de 512x512 pfxeles y el tamano del pixel fue de 0,48x0,48 pm.

1.8 Analisis estadfstico despues de la inmunizacion con ACI-DS-01.

Los datos se muestran como media ± desviacion estandar (SD) o error estandar de la media (SEM). El analisis estadfstico se realizo mediante la prueba t desapareada de dos colas. Se considero significativa una probabilidad de p <0,05.

Ejemplo 2 La inmunizacion con ACI-DS-01 produjo anticuerpos anti-Ap de raton

La vacuna liposomal ACI-DS-01 se preparo segun la metodologfa SupraAntigen™ (WO 2005/081872, WO2007/068411) con peptido Ap1-15 tetrapalmitoilado de raton (Palm1-15), H-Lys(Pal)-Lys(Pal)-Asp-Ala-Glu-Phe-Gly-His-Asp-Ser-Gly-Phe-Glu-Val-Arg-His-Gln-Lys(Pal)-Lys(Pal)-OH incrustado en liposomas junto con ftpido A monofosforilado (MPLA), (Figura 1). Se administraron seis dosis de ACI-DS-01 por via subcutanea y cada dos semanas a ratones machos Ts65Dn y ratones control de la misma edad (2N). El analisis del plasma recogido despues de la 4' dosis, mostro tftulos robustos de IgG contra Ap40 o Ap42 de raton en los ratones inmunizados de los grupos tanto Ts65Dn como 2N (Figura 2A y 2B). Los anticuerpos inducidos por la vacuna permanecieron elevados incluso 40 dfas despues de la ultima inmunizacion. No se detectaron tftulos en ratones inmunizados con liposomas vacfos sin el antfgeno (Figura 2A y 2B). Por lo tanto, ACI-DS-01 fue capaz de romper la autotolerancia hacia Ap en el modelo de raton DS.

Se analizaron las subclases de IgG en plasma de ratones inmunizados con ACI-DS-01 despues de la 4a inmunizacion. El ELISA realizado con Ap40 mostro que el grupo Ts65Dn tema tftulos de IgG2a mas altos que el grupo 2N (Figura 2D), mientras que no hubo diferencia entre los dos grupos para los tftulos de IgG1 e IgG2b (Figura 2C y 2E) (ANOVA de una via, post hoc de Tukey; P=0,05). Los tftulos de IgG3 fueron mas bajos en el grupo Ts65Dn (Figura 2F) (ANOVA de una via, post hoc de Tukey; P <0,001). Los tftulos de IgM fueron ligeramente mas bajos, pero significativos, en los ratones Ts65Dn en comparacion con los ratones 2N (Figura 2G). Allf (ANOVA de una via, post hoc de Tukey; P=0,05). Se obtuvieron resultados similares en el ELISA realizado con Ap42 (datos no mostrados).

Es poco probable que los niveles mas bajos de algunos de los tttulos mencionados anteriormente en ratones Ts65Dn se deban a la capacidad de respuesta inmunitaria de Ts65Dn, ya que el nivel de IgG anti-MPLA fue comparable en todos los ratones (Figura 2H).

Ejemplo 3 La inmunizacion con ACI-DS-01 recupero el deficit de memoria de los ratones Ts65Dn

Los ratones Ts65Dn presentan muchas caractensticas de anomaUas cognitivas del DS, tal como deterioro de la memoria y actividades anormales. Para investigar la eficacia de la vacuna ACI-DS-01, se llevo a cabo una serie de ensayos de comportamiento dos semanas despues de la ultima inmunizacion. Los ratones realizaron los ensayos en el siguiente orden; campo abierto, reconocimiento de objetos, laberinto en T y condicionamiento del miedo.

El analisis del ensayo de campo abierto mostro que los ratones Ts65Dn tienen una actividad locomotora espontanea significativamente mayor en comparacion con los ratones 2N (datos no mostrados). Despues de la inmunizacion con ACI-DS-01, los ratones Ts65Dn continuaron siendo significativamente mas activos que los ratones 2N tratados con ACI-DS-01 (Fig. 3A, prueba t desapareada de una cola; p=0,0004). En el laberinto en T, los ratones 2N y Ts65Dn no mostraron diferencias significativas en la relacion de la alteracion o en la duracion de la alteracion, ni antes del tratamiento ni despues del tratamiento (datos no mostrados).

Se midio la capacidad de memoria espacial en el reconocimiento de objetos (ORT). Los ratones Ts65Dn ejercen una relacion de discriminacion debil y, por lo tanto, reconocen mal el objeto nuevo. Los ratones Ts65Dn tratados con ACI-DS-01 mostraron una relacion de discriminacion mas alta que indica que el tratamiento condujo a una mejona significativa de la memoria (Fig. 3B, prueba t desapareada de una cola; p=0,03. ANOVA de una via, genotipo, P=0,12, vacuna, P=0,002. Interaccion P=0,54). Curiosamente, se observaron los mismos resultados en el grupo 2N.

El ensayo de condicionamiento del miedo consiste en sesiones de entrenamiento, nemotecnicas y contextuales. Se observo el mismo nivel de congelacion en todos los grupos durante el entrenamiento o la sesion nemotecnica (Figura 3C). Durante la sesion contextual, los ratones Ts65Dn tratados con la vacuna vacfa (solo el liposoma, sin antfgeno) mostraron un porcentaje de congelacion menor que los ratones 2N control. Por el contrario, despues de la inmunizacion, los ratones Ts65Dn demostraron una congelacion mejorada y alcanzaron un nivel comparable a los ratones 2N (prueba t desapareada de una cola; P=0,04. (ANOVA de una via, genotipo, P=0,01, vacuna, P=0,16. Interaccion P=0,33). Esto sugiere que la inmunizacion fue eficiente y mejoro la capacidad de memoria de los ratones Ts65Dn.

En resumen, estos resultados indican que el tratamiento con ACI-DS-01 puede recuperar el deficit de memoria de los ratones Ts65Dn.

Ejemplo 4 Mecanismo de la vacuna ACI-DS-01 para mejorar la deficiencia cognitiva.

Para abordar la pregunta sobre el efecto de los anticuerpos inducidos por ACI-DS-01 en el nivel de Ap, se realizo ELISA utilizando extractos de protemas del hipocampo, la corteza y el cerebelo. Ninguna de estas regiones mostro una diferencia significativa en los niveles de Ap despues del tratamiento con ACI-DS-01; ni para Ap40 ni para Ap42 (Figura 4A). Vale la pena senalar que la relacion Ap-40/42 en la corteza y el cerebelo esta correlacionado significativamente con un mdice de reconocimiento mas alto (RI) (Figura 4B y 4C. Corteza; correlacion de Pearson r=-0,3248, P=0,0.03. Cerebelo; correlacion de Pearson r=-0,4127, P=0,009). Estos resultados sugieren que la Ap-40/42 podna ser responsable del deficit cognitivo. Un analisis adicional mostro que Ap42 era detectable en el plasma. Por el contrario, un aumento del nivel de Ap40 en el plasma parecio estar asociado con los valores mas altos de IgG anti-Ap medidos en el grupo de ratones Ts65Dn tratados con ACI-DS-01 (Figura 4D; correlacion de Pearson r=0,51, P=0,09). Ademas, el RI esta correlacionado con los tttulos de IgG anti-Ap (Figura 4E; correlacion de Pearson r=0,3154, P=0,007).

Estos resultados sugieren que los anticuerpos inducidos por ACI-DS-01 pueden eliminar el Ap del cerebro al plasma, que puede conducir despues a una mejora de la memoria.

Ejemplo 5 Morfologfa de las neuronas en modelos de raton del smdrome de Down

Se analizaron el tamano, el numero y la densidad optica de la neurona colinergica en el cerebro anterior basal (BFCN). Se tineron dos secciones del nivel del BFCN con el anticuerpo ChAT (Millipore, Cat#AB144P, lote#2010060). Se escaneo el area del septum medio (MS) en un microscopio confocal para la evaluacion cuantitativa. Se calcularon los siguientes parametros 1) densidad de celulas ChAT+ en el MS; 2) area de las neuronas individuales ChAT+, y 3) media de la densidad optica de ChAT en neuronas individuales. Se captaron imagenes de las neuronas colinergicas en el septum medio y se utilizo el software ImageJ para contar el numero de neuronas, revelar la densidad optica de la tincion y delinear el area del cuerpo celular.

Resultados: El numero de celulas ChAT+ en el septum medio y la densidad optica fue similar en los ratones 2N y Ts65Dn tratados con la vacuna vacfa (Figura 9A y 9B).

El numero de celulas ChAT+ en el septum medio fue similar en ratones 2N y Ts65Dn tratados con ACI-DS-01 (Figura 9A) (2N-Vado=27,5±7,2 por 100 micrometros de seccion; Ts65Dn-Vado=23,9±7,0; 2N-ACI-DS-01=36,6±4,6; Ts65Dn-ACI-DS-01=20,9±6,6). La densidad optica de la tincion en celulas individuales ChAT+ en el septum medio tambien fue similar en ratones 2N y Ts65Dn tratados con ACI-DS-01 (Figura 9B) (2N-Vado=79,9±3,5 unidad arbitraria; Ts65Dn-Vado=74,7±2,6; 2N-ACI-DS-01=71,9±2,6; Ts65Dn-ACI-DS-01=75,8±4,5). El area del cuerpo celular ChAT+ en el septum medio fue mas baja en ratones Ts65Dn que en 2N (Figura 9C). El area del cuerpo celular ChAT+ en el septum medio de los ratones tratados con Ts65Dn-ACI-DS-01 aumento significativamente en comparacion con los Ts65Dn vados tratados con veldculo (Ts65Dn-Vado=179±6 microm2; Ts65Dn-ACI-DS-01=201±8, p=0,031). Los ratones 2N y Ts65Dn tratados con ACI-DS-01, teman un area similar del cuerpo celular (2N-ACI-DS-01=208±8 microm2; Ts65Dn-ACI-DS-01=201±8, p=0,55) (Figura 9C). Esto senala la recuperacion del area del cuerpo celular en celulas ChAT+ en el septum medio tras el tratamiento con ACI-DS-01. De manera equivalente, estos resultados son una indicacion de la seguridad de la vacuna ACI-DS-01 ya que el numero de celulas ChAT+ no cambio despues de la inmunizacion con la vacuna. Estos estudios morfologicos mostraron una menor atrofia de las neuronas despues de la inmunizacion con ACI-DS-01, que indica que esta vacuna se podna utilizar para la prevencion de la neurodegeneracion.

Ejemplo 6 La seguridad de la vacuna liposomal ACI-DS-01.

Para determinar si la inmunizacion con ACI-DS-01 puede inducir problemas de seguridad, se registraron el peso corporal, la observacion general y los marcadores de inflamacion en los ratones. Antes del tratamiento, los ratones Ts65Dn teman un peso corporal significativamente menor que los ratones 2N (ANOVA, post hoc de Tukey, p=0,001). La inmunizacion no altero significativamente el peso corporal (Figura 5A). Los pesos cerebrales fueron similares en los cuatro grupos de ratones (Figura 5A). Los resultados de la inmunohistoqmmica no mostraron diferencias en el numero de celulas astrogliales positivas para la protema acida fibrilar glial (GFAP) o de celulas microgliales positivas para CD45. Los resultados obtenidos fueron similares en la corteza y el hipocampo (Figura 5). Estos resultados indican que la vacunacion con ACI-DS-01 no indujo una respuesta inflamatoria.

Para verificar la especificidad de los anticuerpos inducidos por ACI-DS-01, se llevo a cabo un estudio de reaccion cruzada. Se tineron las secciones del cerebro de 2N y Ts65Dn con el antisuero de ratones 2N tratados con ACI-DS-01.

En resumen, estos signos indican que ACI-DS-01 es una vacuna segura.

Ejemplo 7: Metodologfa general para experimentos con las vacunas ACI-DS-02 y ACI-DS-03

7.1 Inmunizacion con la vacuna ACI-DS-02 y ACI-DS-03

Los ratones macho Ts65Dn (Jax laboratory B6EiC3Sn.BLiA-Ts(1716)65Dn/DnJ) de 4±0,3 meses de edad al inicio del estudio, recibieron inmunizaciones subcutaneas (s.c.) con 200 j l de ACI-DS-02 (18,6 |jg por dosis de peptido Ap22-39 dipalmitoilado) (n=6, ratones Ts65Dn) o PBS (n=4, ratones Ts65Dn). Se realizaron un total de cuatro inyecciones los dfas 1, 14, 28 y 42. Se realizaron las sangnas en la cola una semana despues de cada inmunizacion; dfa 7, 21, 35 y 49.

Se realizo el mismo procedimiento para la inmunizacion con la vacuna ACI-DS-03 (38,6 jg por dosis de Pal14-29, peptido Ap14-29 tetrapalmitoilado) (n=7, ratones Ts65Dn) o PBS (n=4, ratones Ts65Dn).

Los ratones de la camada control (n=7, ratones 2N) recibieron inyecciones similares pero con PBS.

7.2 Cuantificacion de anticuerpos Ap espedficos de raton

Se determinaron mediante ELISA las respuestas de IgG espedficas para Ap1-42. Brevemente, las placas se recubrieron con 10 jg/m l de Ap1-42 humano (Bachem H1368, lote: 1000255) durante la noche a 4°C. Despues de lavar con PBS-Tween 20 al 0,05% y bloquear con BSA al 1%, se anadieron a las placas diluciones seriadas de plasma y se incubaron a 37°C durante dos horas. Se utilizo como control positivo el anticuerpo anti-Ap 6E10 (6E10 de Covance SIG-39320, lote: 09GC01254, un vial, 1 mg/ml diluido 1000x). Despues del lavado, las placas se incubaron con anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Immunoresearch West Grove, PA, EE.UU., Cat. N°115-055-164 Lote 87821, vial diluido a 1/4000) durante dos horas a 37°C. Despues del lavado final, las placas se incubaron durante 2 horas y media con sustrato AP (pNPP) y se leyeron a 405 nm utilizando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como densidad optica (O.D).

7.3 Ensayos de comportamiento

Todos los ratones fueron expuestos a la misma serie de ensayos de comportamiento comenzando alrededor de los 6±0,3 meses de edad. Todos los ensayos de comportamiento tuvieron lugar durante el ciclo de luz diurna entre las 7:00 a.m. y 7:00 p.m. y se realizaron a temperatura ambiente (22°C).

7.3.1 Tarea de reconocimiento espacial de objetos

Antes del ensayo, los ratones se habituaron en una camara de polipropileno gris (diametro 40 cm, altura 32,4 cm) durante 10 minutos sin ningun objeto bajo condiciones de luz ambiental tenue. Al dfa siguiente, y durante la sesion de aprendizaje, se presentaron (10 minutes) dos objetos identicos (cubo de Lego o botella de vidrio negro) en un lado del laberinto. El ensayo de retencion se realizo 3 horas despues del aprendizaje, uno de los objetos identicos se mueve al lado opuesto del laberinto y se presenta durante l0 min. Todas las sesiones se grabaron con el software de seguimiento de video Ethovision XT 8.0. Los parametros medidos incluyeron el tiempo medio de exploracion total de los objetos de la muestra, tanto nuevos como familiares, y la relacion de discriminacion (interaccion del objeto nuevo/interaccion total con ambos objetos).

7.3.2 Tarea de memoria del Laberinto de agua

Se llevo a cabo el laberinto de agua para analizar la memoria a largo plazo. Como un ensayo de habituacion, los ratones se sometieron en el primer dfa a un laberinto de agua (diametro: 165 cm, altura: 64 cm) con una plataforma visible nemotecnica (diametro 11 cm, altura: 37 cm). Este ensayo consistio en 5 experimentos de 120 segundos cada uno con 30 minutos de intervalo entre ensayos. El 6° experimento final se llevo a cabo sin la plataforma visible nemotecnica. Al dfa siguiente, los ratones se sometieron a 4 dfas de entrenamiento con una plataforma oculta. En cada dfa, los ratones realizaron 6 experimentos cada uno de 120 segundos y con un intervalo entre experimento de 30 minutos. Al comienzo de un experimento, se coloca un raton en el agua frente al borde del tanque, en uno de los 4 puntos de inicio (noreste, sureste, suroeste y noroeste). Se cambian los puntos de partida de experimento a experimento, mientras que la plataforma de escape esta fija (cuadrante oeste) a lo largo del experimento. Si el raton encuentra la plataforma en 120 segundos, se le permite permanecer en la plataforma durante 15 segundos. Si no logra encontrar la plataforma en 120 segundos, se detiene el experimento y el raton se grna cuidadosamente a la plataforma y se deja allf durante 15 segundos. Los parametros medidos incluyeron el tiempo de latencia de escape (sg) empleado en las diferentes partes del laberinto, numero de entradas en cada cuadrante del laberinto, distancia recorrida (cm) en cada cuadrante del laberinto, distancia al area objetivo (cm), % de tiempo en cada cuadrante, % de tiempo en la plataforma objetivo extendida en forma de corona circular durante el experimento de sonda, numero de cruces de la plataforma objetivo extendida en forma de corona circular durante el experimento de sonda y la velocidad (cm/s).

7.3.3 Ensayo de condicionamiento del miedo contextual

Se llevo a cabo el condicionamiento del miedo contextual y nemotecnico para la evaluacion del aprendizaje y la recuperacion dependientes del miedo. El ensayo se realizo utilizando camaras de Med Associates Instruments. En el primer dfa, los ratones se colocaron en una camara (Contexto A) durante 2 minutos para el registro de base, seguido de cuatro emparejamientos de tono-choque (estfmulos condicionados, CS). El estfmulo de choque a 30 segundos del estfmulo de tono (5000 Hz, 80 dB) co-termino con 2 segundos de descarga en la pata (0,7 mA) en cada emparejamiento de estfmulo condicionado/incondicionado. En el segundo dfa, los ratones se colocaron en el contexto A durante 5 minutos sin ningun estfmulo condicionado o incondicionado. En el ultimo dfa del experimento, se utilizo una camara nueva (Contexto B; nueva sala, nuevo entorno olfativo, nueva textura de suelo, inserciones de plastico azul para paredes, fuente adicional de luz azul y senales visuales) para los ensayos nemotecnicos. Despues de un pertedo de tono previo de 2 minutos, se presentaron tres tonos sin choques a los animales durante el pertedo de ensayo de 8 minutos. Se definio la congelacion como la falta total de movimiento durante un mmimo de 0,75 segundos. Se describio el porcentaje de congelacion en cada periodo.

7.4 Inmuno-tincion de placas amiloides en muestras de cerebro humano con DS con anticuerpos anti-Ap inducidos por las vacunas ACI-d S-02 y ACI-DS-03.

Se tineron secciones de cerebro de personas con DS con anticuerpos anti-Ap derivados de la vacuna en sueros obtenidos de ratones inmunizados con la vacuna ACI-DS-02. Se utilizo un conjunto de sueros de cinco ratones c57BL/6 inmunizados con la vacuna ACI-DS-02 a una dilucion de 1/100 para el procedimiento de inmuno-tincion. Brevemente, se incubaron criosecciones de 10 pm de un individuo con DS de 59 anos de edad en paraformaldetudo al 4% (Sigma-Aldrich, 252549) durante 20 minutos. Despues de la incubacion en acido formico al 70% (Merck, 1.00264.1000) y Triton X-100 al 10% (Sigma, 234729) cada una durante 15 minutos, se bloquearon las secciones durante 2 horas en suero de cabra normal al 10% (NGS, Invitrogen, 6210072) en PBST (PBS mas Triton X-100 al 0,5%). La incubacion con el anticuerpo primario (sueros de ratones inmunizados) en PBST con NGS al 10% se realizo durante la noche. Al dfa siguiente, y despues de lavar en PBSA, se incubaron las secciones con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton AffiniPure conjugada con Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch, 115-545-146). Las secciones se montaron en ProLong Gold (Invitrogen, P36931). Como control positivo, se utilizo el anticuerpo primario anti-Ap 6E10 (Covance, SIG-39320, anti-Ap contra el extremo N-terminal de Ap utilizando una dilucion de 1:10000). Se utilizaron sueros de ratones c57BL/6 inmunizados con PBS como control negativo. Se utilizaron sueros de ratones c57BL/6 inmunizados con ACI-24 como un control. La vacuna ACI-24 corresponde a la vacuna ACI-DS-01 con la diferencia de que el antfgeno utilizado en ACI-24 es una secuencia Ap1 -15 humana, mientras que la vacuna ACI-DS-01 contiene la secuencia Ap1-15 de raton como el antfgeno (para los tres aminoacidos diferentes en esos dos antfgenos, vease la Figura 1).

7.5 Analisis estadfstico

Los datos se muestran como media ± desviacion estandar (SD) o error estandar de la media (SEM). Se realizo el analisis estadfstico mediante una prueba t desapareada de dos colas o ANOVA utilizando GraphPad Prism version 5. Se considero significativa una probabilidad de p <0,05.

Ejemplo 8 La inmunizacion con ACI-DS-02 produjo anticuerpos anti-Ap humanos

Se administraron cuatro dosis de ACI-DS-02 por via subcutanea y cada dos semanas a ratones machos Ts65Dn y ratones control 2N de la misma edad. El analisis del plasma recogido 7 dfas despues de cada dosis, mostro tftulos de IgG contra Ap42 humano en los ratones inmunizados de los grupos tanto Ts65Dn como 2N (datos no mostrados). Los tftulos de IgG de ratones Ts65Dn inmunizados con ACI-DS-02 fueron significativamente diferentes de los inmunizados con PBS en los dfas 21 y 35 (ANOVA de una via, post hoc de Tukey, P=0,01 y 0,05 respectivamente). Por lo tanto, ACI-DS-02 fue capaz de romper la autotolerancia hacia Ap en el modelo de raton DS.

Se analizaron los tftulos de IgM en plasma de ratones inmunizados con la vacuna ACI-DS-02. El ELISA realizado con Ap42 mostro que el grupo Ts65Dn inmunizado tema tftulos de IgM mas altos que el grupo inmunizado con PBS el dfa 7, el dfa 35 y el dfa 49 (ANOVA de una via, post hoc de Tukey, P<0,01, P<0,05 y P<0,01 respectivamente, datos no mostrados.)

Ejemplo 8 Los anticuerpos anti-Ap humanos derivados de ACI-DS-02 reconocen las placas amiloides del DS

El experimento de inmuno-tincion mostro que los anticuerpos derivados de ACI-DS-02 se unen a las placas amiloides en las muestras del cerebro de personas con DS (Figura 6). La tincion fue similar a la tincion obtenida con 6E10, un anticuerpo anti-beta amiloide disponible comercialmente, y con anticuerpo derivado de ACI-24. La vacuna ACI-24 corresponde a la vacuna ACI-DS-01 con la diferencia de que el antfgeno utilizado en ACI-24 es una secuencia Ap1-15 humana, mientras que la vacuna ACI-DS-01 contiene la secuencia Ap1-15 de raton como el antigeno (para los tres aminoacidos diferentes en esos dos antigenos, vease la Figura 1). No se observo tincion cuando se incubo una seccion con sueros de ratones inmunizados con PBS. Este resultado indica que la inmunizacion con la vacuna ACI-DS-02 induce anticuerpos que reconocen las placas amiloides en el cerebro de las personas con DS.

Ejemplo 9 ACI-DS-02 mejora el aprendizaje asociativo en el ensayo de condicionamiento del miedo

Durante el ensayo de acondicionamiento, los ratones Ts65Dn inmunizados con la vacuna ACI-DS-02 mostraron una tendencia a niveles mas altos de congelacion despues de recibir cada estfmulo condicionado (Figura 7A). Fue significativamente diferente la congelacion mejorada del grupo Ts65Dn inmunizado con PBS, solo en el tercer estfmulo condicionado (CS3) (ANOVA bidireccional, tiempo, P<0,0001, una tendencia para la vacuna (P=0,09), los ensayos posteriores de Bonferroni mostraron P=0,05 en el CS3).

Se sabe que la sesion de aprendizaje esta mediada por un mecanismo dependiente de la plasticidad sinaptica (Johansen 2011). Sin embargo, se sabe que la memoria del miedo previamente adquirida (sesiones de contexto, nemotecnicas y de extincion) esta mediada por un mecanismo neuronal diferente. Este resultado sugiere que la inmunizacion con ACI-DS-02 mejoro la fase de adquisicion/entrenamiento de condicionamiento del miedo durante el cual se produce el aprendizaje.

Ejemplo 10 La inmunizacion con ACI-DS-03 produjo anticuerpos anti-Ap humanos.

Se administraron cuatro dosis de ACI-DS-03 por via subcutanea y cada dos semanas a ratones machos Ts65Dn y ratones control 2N de la misma edad. El analisis del plasma recogido 7 dfas despues de cada dosis, mostro tftulos de IgG contra Ap42 humano en los ratones inmunizados de los grupos tanto Ts65Dn como 2N (datos no mostrados). Los tftulos de IgG de ratones Ts65Dn inmunizados con ACI-DS-03 fueron significativamente diferentes de los inmunizados con PBS en el dfa 21 (ANOVA de una via, post hoc de Tukey, P=0,05). Por lo tanto, ACI-DS-03 fue capaz de romper la autotolerancia hacia Ap en el modelo de raton DS.

Se analizaron los tftulos de IgM en plasma de ratones inmunizados con la vacuna ACI-DS-03. El ELISA realizado con Ap42 mostro que el grupo Ts65Dn inmunizado tema tftulos de IgM mas altos que el grupo inmunizado con PBS en los dfas 7 y 49 (ANOVA de una via, post hoc de Tukey, P<0,001 y P<0,01 respectivamente (datos no mostrados).

Ejemplo 11 Los anticuerpos anti-Ap humanos derivados de ACI-DS-03 reconocen las placas amiloides del DS

El experimento de inmuno-tincion mostro que los anticuerpos derivados de ACI-DS-03 se unen a las placas amiloides en el cerebro de las personas con DS (Figura 8). La tincion fue similar a la tincion obtenida con 6E10, un anticuerpo anti-beta amiloide disponible comercialmente, y con anticuerpo derivado de ACI-24. La vacuna ACI-24 corresponde a la vacuna ACI-DS-01 con la diferencia de que el antfgeno utilizado en ACI-24 es una secuencia Ap1-15 humana, mientras que la vacuna ACI-DS-01 contiene la secuencia Ap1-15 de raton como el antfgeno (para los tres aminoacidos diferentes en esos dos antfgenos, vease la Figura 1). No se observo tincion cuando se incubo la seccion con sueros de ratones inmunizados con PBS. Este resultado indica que la inmunizacion mediante la vacuna ACI-DS-03 induce anticuerpos que reconocen las placas amiloides en el cerebro de las personas con DS.

Ejemplo 12 Espectroscopfa infrarroja de reflectancia total atenuada

Se analizaron las muestras liposomales en el cristal de ZnSe con una peftcula delgada hidratada con D²O de 15 pl. Se obtuvieron los espectros con un espectrometro BRUKER TENSOR 27 FTIR equipado con un detector de telururo de mercurio-cadmio enfriado con nitrogeno ftquido y unido a un dispositivo BioATR-II. Para cada espectro, se recogieron 2000 escaneos utilizando el cristal de ATR limpio como espectro de fondo con una resolucion de 2 cm-1, promediado y procesado por FT. Los lfmites de plegado de frecuencia superior e inferior fueron 4000 cm-1 y 900 cm-1. Se purgo continuamente la camara de la muestra con aire seco y todas las medidas se realizaron a 25°C. Despues, los espectros adquiridos se cortaron en la region amida I, la lmea base se corrigio y se marco. Se aplicaron tecnicas de estrechamiento [segunda derivada y autodesconvolucion de Fourier (FSD)] para revelar los componentes superpuestos de la banda ancha de la amida I. Se realizo una asignacion cualitativa de la conformacion secundaria principal desde las bandas principales detectadas utilizando los siguientes rangos de frecuencia en D²O: lamina b 1613-1637 cm-1, espiral aleatoria 1637-1646 cm-1, a-helice/bucles 1646-1662 cm-1, helices b 1662-1682 cm-1, lamina b antiparalela 1682-1698 cm'1. Se realizo un analisis cuantitativo por ajuste de curvas con la aplicacion correspondiente en el software OPUS, que utiliza las bandas identificadas en la 2' derivada y los espectros f Sd como valores iniciales para los componentes individuales. Se supuso que los picos de los componentes teman una forma mixta gaussianaloretziana. El procedimiento de repeticion se llevo a cabo fijando las frecuencias y permitiendo variar las anchuras de pico, las intensidades y las formas y despues, para el segundo procedimiento de repeticion, tambien se permitio variar las frecuencias. Las estimaciones de la estructura secundaria se hicieron calculando el % del area de la region amida I total para cada banda de la estructura secundaria, suponiendo absortividades molares iguales de los diferentes componentes.

Lista de Referencias

1. Antonarakis,S.E., Lyle,R., Dermitzakis,E.T., Reymond,A., Deutsch,S., 2004. Chromosome 21 and down syndrome: from genomics to pathophysiology. Nat. Rev. Genet. 5, 725-738.

2. Ballard,C., Gauthier,S., Corbett,A., Brayne,C., Aarsland,D., Jones,E., 2011. Alzheimer's disease. Lancet. 377, 1019 1031.

3. Belichenko,N.P., Belichenko,P.V., Kleschevnikov,A.M., Salehi,A., Reeves,R.H., Mobley,W.C., 2009. The "Down syndrome critical region" is sufficient in the mouse model to confer behavioral, neurophysiological, and synaptic phenotypes characteristic of Down syndrome. J Neurosci. 29, 5938-5948.

4. Belichenko,P.V., Kleschevnikov,A.M., Salehi,A., Epstein,C.J., Mobley,W.C., 2007. Synaptic and cognitive abnormalities in mouse models of Down syndrome: exploring genotype-phenotype relationships. J Comp. Neurol. 504, 329-345.

5. Bevins,R.A., Besheer,J., 2006. Object recognition in rats and mice: a one-trial non-matching-to-sample learning task to study 'recognition memory'. Nat. Protoc. 1, 1306-1311.

6. Davisson,M.T., Schmidt,C., Reeves,R.H., Irving,N.G., Akeson,E.C., Harris,B.S., Bronson,R.T., 1993. Segmental trisomy as a mouse model for Down syndrome. Prog. Clin. Biol. Res. 384, 117-133.

7. Deacon,R.M., Rawlins,J.N., 2006. T-maze alternation in the rodent. Nat. Protoc. 1, 7-12.

8. Gilman,S., Koller,M., Black,R.S., Jenkins,L., Griffith,S.G., Fox,N.C., Eisner,L., Kirby,L., Boada,R.M., Forette,F., Orgogozo,J.M., 2005. Clinical effects of A{beta} immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology.

9. Hunter,C.L., Bimonte-Nelson,H.A., Nelson,M., Eckman,C.B., Granholm,A.C., 2004. Behavioral and neurobiological markers of Alzheimer's disease in Ts65Dn mice: effects of estrogen. Neurobiol. Aging. 25, 873-884.

10. Johansen I.P., Cain C.K.,Ostroff L.E and LeDoux J.E., 2011. Molecular Mechanisms of Fear Learning and Memory. Cell 147

11. Lee,M., Bard,F., Johnson-Wood,K., Lee,C., Hu,K., Griffith,S.G., Black,R.S., Schenk,D., Seubert,P., 2005. Abeta42 immunization in Alzheimer's disease generates Abeta N-terminal antibodies. Ann. Neurol. 58, 430-435.

12. Lemere,C.A., Blusztajn,J.K., Yamaguchi,H., Wisniewski,T., Saido,T.C., Selkoe,D.J., 1996. Sequence of deposition of heterogeneous amyloid beta-peptides and APO E in Down syndrome: implications for initial events in amyloid plaque formation. Neurobiol Dis. 3, 16-32.

13. Liu,F., Grundke-Iqbal,I., Iqbal,K., Oda,Y., Tomizawa,K., Gong,C.X., 2005. Truncation and activation of calcineurin a by calpain I in Alzheimer disease brain. J. Biol. Chem. 280, 37755-37762.

14. Liu,F., Liang,Z., Wegiel,J., Hwang,Y.W., Iqbal,K., Grundke-Iqbal,I., Ramakrishna,N., Gong,C.X., 2008. Overexpression of Dyrk1A contributes to neurofibrillary degeneration in Down syndrome. FASEB J. 22, 3224-3233.

15. Moncaster,J.A., Pineda,R., Moir,R.D., Lu,S., Burton,M.A., Ghosh,J.G., Ericsson,M., Soscia,S.J., Mocofanescu,A., Folkerth,R.D., Robb,R.M., Kuszak,J.R., Clark,J.I., Tanzi,R.E., Hunter,D.G., Goldstein,L.E., 2010. Alzheimer's disease amyloid-beta links lens and brain pathology in Down syndrome. PLoS One 5, e10659.

16. Monsonego,A., Maron,R., Zota,V., Selkoe,D.J., Weiner,H.L., 2001. Immune hyporesponsiveness to amyloid beta

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un peptido antigenico derivado de la protema beta amiloide para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomaftas cognitivas y/o de la memoria en sujetos con smdrome de Down, en donde el peptido antigenico consiste en los restos Ap1-15 y esta modificado por un acido palmftico unido al extremo N- y/o C-terminal del peptido y esta reconstituido en un liposoma y dichos sujetos con smdrome de Down aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides en el cerebro.

2. El peptido antigenico de la reivindicacion 1, en donde el peptido Ap1-15 esta modificado con cuatro acidos palmfticos unidos al extremo N- y/o C-terminal del peptido.

3. El peptido antigenico de la reivindicacion 1, en donde el peptido Ap1-15 esta modificado con dos acidos palmfticos unidos al extremo N- y/o C-terminal del peptido.

4. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho deterioro o anomafta se refiere a un deterioro de la memoria de reconocimiento, un deterioro de la memoria asociativa contextual, un deterioro del aprendizaje asociativo, un deterioro de la memoria declarativa para hechos y eventos, deterioros de la memoria episodica, una disfuncion del lenguaje, un deterioro visoespacial, una disminucion de las funciones ejecutivas, cambios de personalidad, cambios emocionales, apraxia, deterioros para realizar tareas motoras aprendidas, signos piramidales y extrapiramidales, asf como mioclomas o convulsiones, o una combinacion de los mismos.

5. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en donde dicho sujeto con smdrome de Down es

(a) un sujeto joven o de mediana edad; o

(b) un sujeto de mediana edad; o

(c) un sujeto joven; o

(d) un sujeto de edad infantil, o,

(e) un sujeto menor de 65 anos.

6. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en donde dicho uso a) conduce a una mejora y/o recuperacion de la memoria; y/o

d) no induce efectos secundarios indeseados.

7. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6 para la prevencion del desarrollo de placas asociadas a Ap en el cerebro.

8. Una composicion que comprende el peptido antigenico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 en una cantidad terapeuticamente eficaz junto con un vehmulo y/o excipiente farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento y/o alivio y/o prevencion de deterioros o anomaftas cognitivas y/o de la memoria en sujetos con smdrome de Down, en donde dichos sujetos con smdrome de Down aun no han desarrollado placas asociadas a protemas amiloides en el cerebro.

9. La composicion para uso segun la reivindicacion 8, que comprende un adyuvante.

10. La composicion para uso segun la reivindicacion 9, en donde el adyuvante es el ftpido A.

11. La composicion para uso segun la reivindicacion 10, en donde el adyuvante es un ftpido A destoxificado.

12. La composicion para uso segun la reivindicacion 9, en donde el adyuvante es ftpido A monofosforilado o difosforilado, alumbre, fosfato de calcio, interleucina 1 y/o microcapsulas de polisacaridos y protemas.

13. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para la prevencion de la neurodegeneracion en un sujeto con smdrome de Down.

14. El peptido antigenico para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para inducir una respuesta inmunitaria contra la protema beta amiloide en un sujeto con smdrome de Down.