EA032494B1

EA032494B1 - N-КОНЦЕВОЙ Аβ1-15 АНТИГЕННЫЙ ПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНДИВИДУУМА С СИНДРОМОМ ДАУНА

Info

Publication number: EA032494B1
Application number: EA201400376A
Authority: EA
Inventors: Андреа ПФАЙФЕР; Андреас МУС; Риме Мадани; Павел Васильевич Беличенко; Уилльям Чарлз Мобли
Original assignee: Ац Иммуне С.А.
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2019-06-28
Also published as: PT2758071T; SG11201400795UA; EA201400376A1; SI2758071T1; KR20160099732A; CA2811188C; IL231564A0; MY169574A; WO2013044147A1; AU2012312126A1; BR112014006871A2; NZ622653A; MX2014003325A; PL2758071T3; ES2712951T3; KR102129220B1; TR201901846T4; EP2758071A1; DK2758071T3; CN104039346A

Abstract

В изобретении описано применение N-концевого Aβ-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений, или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений, или аномалий у индивидуума, причем этот антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки. Кроме того, изобретение также раскрывает способ лечения и/или облегчения нарушений, или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений, или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна (DS) с применением указанных фрагментов антигенного пептида, происходящих из амилоидного белка или амилоидоподобного белка и содержащих эти фрагменты композиций.

Description

Настоящее изобретение относится к средствам лечения связанной с амилоидом патологии у пациентов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна (Ό8). В частности, настоящее изобретение относится к антигенным пептидным фрагментам, происходящим из амилоидного белка или амилоидоподобного белка, которые предназначены для лечения деменции альцгеймеровского типа (ΑΌ) у пациентов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна (Ό8).

Генетическое нарушение, такое как синдром Дауна (Ό8), представляет собой наиболее распространенную трисомию, и оно встречается у одного из 700-1000 новорожденных. По существующим оценкам предполагается, что 25% или более индивидуумов возрастом свыше 35 лет с синдромом Дауна имеют признаки и симптомы деменции альцгеймеровского типа (81ап1оп Ь.К и Сое1хее Р.Н., 2004). Этот процент повышается с возрастом. При Э8 присутствуют три копии всей хромосомы 21 или по меньшей мере ее части (трисомия по хромосоме 21) (АЩопагакй и др., 2004; Мопсайег и др., 2010). В результате присутствия трех копий гена амилоидного белка-предшественника (АРР) происходит образование избытка амилоида-β (Αβ), одного из основных аномальных (патологических) белков, которые, как хорошо известно, ответственны за развитие болезни Альцгеймера (ΑΌ) (Ва11агб и др., 2011). Поэтому выдвинуто предположение о том, что Αβ, по-видимому, играет роль в развитии деменции альцгеймеровского типа у большинства людей с Ό8 (Ьее и др., 2005; Ыи и др., 2005; СИшаи и др., 2005).

У людей с синдромом Дауна дефекты памяти АЭ-подобного типа могут быть связаны с несколькими патологическими белками, такими как Αβ, Таи, Эугк1А. АроЕ и т.д. Повышение уровня Αβ начинается уже на эмбриональной стадии, прогрессирует при рождении и продолжает увеличиваться с возрастом (81о11хпег и др., 2000). Кроме того, было установлено, что в спинномозговой жидкости (СМЖ) уровни Αβ42 ниже, а уровни 1аи выше у более взрослых (>40 лет), чем у более молодых людей с Ό8 (Тарю1а и др., 2001). Поскольку Αβ откладывается в бляшках, ΑроЕ можно выявлять во многих бляшках у пациентов возрастом 12 лет и его содержание постоянно увеличивается с возрастом (Ьетеге и др., 1996). Нейрофибриллярные сплетения (ΝΕΤ) выявляют в головном мозге людей с Ό8 на четвертом десятке жизни. Указанные ΝΕΤ, по-видимому, являются результатом накопления 1аи. Установлено, что гиперфосфорилирование может быть связано со сверхэкспрессией киназы, обозначенной как Оугк1Л (тирозинфосфорилирующая и регулирующая киназа двойной специфичности 1Α) (Ьетеге и др., 1996; Ьш и др., 2008). Таким образом, у людей с Ό8 к 40-летнему возрасту может развиваться связанная с амилоидом патология и у большинства из них к 60-летнему возрасту проявляются клинические симптомы, сходные с симптомами болезни Альцгеймера, такие как снижение когнитивной функции и нарушение памяти (81аи1ои, 2004).

В то время как индивидуумы с Ό8 получают медицинское обслуживание в основном в связи с различными проблемами с их здоровьем (такими как сердечное нарушение, инфекционные болезни и гипотиреоидизм), специфическое лечение нейропатологических признаков, т.е. ментальной недееспособности и дефицита памяти, редко рассматривается. В настоящее время проводится лишь небольшое количество клинических испытаний, все с целью повышения умственных способностей или снижения поражения нервов. Для людей с Ό8 применяют лекарственные средства, предназначенные также для лечения ΑΟ, которые все действуют на холинергическую систему или глутаматергическую нейротрансмиссию, такие как ривастигмин или донепезил, ингибиторы холинэстеразы и мемантин, антагонист ΝΜΌΑрецептора (Ргакйег, 1993; Ртакйег, 2004). Однако данные об их эффективности в отношении людей с Ό8 отсутствуют. В настоящее время рассматривается много модифицирующих амилоид вариантов лечения, включая направленную на Αβ иммунотерапию (Рабл, 2010). В настоящее время несколько вакцин достигли фаз клинических исследований (ХУешег и Егеике1, 2006) после того, как на созданных на мышах моделях ΑΟ было установлено, что они эффективно снижают церебральную нагрузку Αβ и приводят к реверсии снижения когнитивных способностей. В отличие от ΑΟ, для Ό8 не применяют иммунотерапии, направленные на Αβ.

Среди нескольких подходов лечения когнитивного нарушения у взрослых людей с Ό8 исследования, проведенные с использованием ингибиторов ацетилхолинэстеразы (ΑΟιΕΙ) или антагонистов ΝΜΌΑ-рецептора, продемонстрировали лишь невысокую эффективность или отсутствие действие (Еегпапбех и др., 2007, Наппеу и др., 2012). В противоположность этому, получено важное доказательство гипотезы о том, что амилоид играет роль в ухудшении когнитивной функции у людей с Ό8; №1хег с коллегами продемонстрировали на смоделированном на мышах Ό8, что изменение расщепления ΑΡΡ с помощью ингибитора γ-секретазы оказывает благоприятное воздействие на память (№1хег и др., 2010). Эти данные, полученные в исследованиях на мышиных моделях, продемонстрировали, что необходимо наличие повышенного уровня гена ΑΡΡ, т.е. родительского белка пептида Абета, ответственного за отложение амилоида, для связанной с возрастом дегенерации нейронов, что характерно для Ό8 и ΑΟ (8а1еЫ и др., 2006, 2009). Таким образом, направленное воздействие на амилоид может представлять собой перспективную терапевтическую стратегию предупреждения развития ΑΌ. Развитие иммунотерапии, направленной на Αβ, базируется на гипотезе о том, что если молекула оказывает направленное воздействие и секвестирует Αβ (в растворимой форме и в виде олигомеров) ίη кйи, то эта молекула может усиливать удаление Абета из головного мозга и приносить клиническую пользу людям с Ό8. Предполагается, что антитела, образовавшиеся в ответ на обработку анти-Αβ- вакцинами, должны связываться с отложениями

- 1 032494 фибриллярного Αβ, в конце концов, солюбилизируя или ингибируя рост предшественников бляшек (пред-бляшек). В настоящее время олигомеры Αβ рассматриваются как наиболее токсичные виды Αβ, которые больше всех нарушают когнитивные функции у людей с Ό8 (Те11ег и др., 1996).

Таким образом, существует необходимость в превентивной терапии, направленной на предупреждение или замедления развития клинических симптомов, ассоциированных со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (Ό8), в частности, таких, как нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии.

В частности, существует необходимость в лечении клинических симптомов, ассоциированных со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (Ό8), которое приводит к улучшению способности к научению у индивидуумов с синдромом Дауна (Ό8) и/или улучшению или восстановлению памяти и/или когнитивных (познавательных) способностей.

В настоящем изобретении предложены антигенные пептиды, предназначенные для применения в превентивной терапии и для лечения когнитивных нарушений ΑΌ-типа у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна.

Первым вариантом осуществления настоящего изобретения является применение Ν-концевого Αβ 1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

При этом указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как, неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии ΑΌ-типа.

Группа пациентов, подлежащая лечению, - это индивидуумы с синдромом Дауна. Причем эти индивидуумы могут представлять собой:

(а) индивидуумов от молодого до среднего возраста, (б) индивидуумов среднего возраста, (в) индивидуумов молодого возраста, (г) индивидуумов детского возраста.

В частности, они могут иметь возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

В предпочтительном варианте осуществления заявленного применения антигенный пептид Αβ модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с Ν- и/или С-концом пептида.

Причем антигенный пептид Αβ может быть модифицирован с помощью:

а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с Ν- и/или С-концом пептида или

б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с Ν- и/или С-концом пептида.

Описанное в изобретении применение для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна не вызывает воспалительной реакции.

А в предпочтительном варианте применяемый антигенный пептид включен в композицию, содержащую антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом. Причем эта композиция может содержать адъювант.

Вторым объектом данного изобретения является способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида или композиции, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

Причем указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.

Описанный способ может быть предназначен для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение ука

- 2 032494 занному индивидууму антигенного пептида или композиции. При этом указанный индивидуум с синдромом Дауна может быть:

а) индивидуумом от молодого до среднего возраста;

б) индивидуумом среднего возраста;

в) индивидуумом молодого возраста или

г) индивидуумом детского возраста.

В частности, его возраст может составлять менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.

Третьим объектом данного изобретения является способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида или композиции, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

Лечение когнитивных нарушений или аномалий ΆΌ-типа у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна с помощью антигенного пептида, представленного в настоящем описании, обеспечивает терапевтические действия, которые не сопровождаются индукцией нежелательных побочных действий, таких как менингоэнцефалит и микрогеморрагия.

Антигенный пептид, указанный в настоящем описании, выводят из амилоидного белка или амилоидоподобного белка, выбранного из группы, включающей белок-прион, белок 1аи, альфа-синуклеин, хантингтин и амилоид-β или из комбинации, включающей один или несколько вышеуказанных пептидов.

Причем указанный фрагмент антигенного пептида Αβ соответствует Ν-концевой области пептида Αβ, в частности, Ν-концевой области, содержащей по меньшей мере 5, в частности по меньшей мере 6, в частности по меньшей мере 7, в частности по меньшей мере 8, в частности по меньшей мере 9, в частности по меньшей мере 10, в частности по меньшей мере 11, в частности по меньшей мере 12, в частности по меньшей мере 13, в частности по меньшей мере 14, в частности все остатки ΑβΙ-15-фрагмента.

При этом массив, состоящий из большого количества повторов, на поверхности липосомы может содержать 10 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 50 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 100 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 200 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 300 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 400 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 500 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя.

Антигенная композиция, представленная в настоящем описании, может содержать конформационный антиген, в частности антиген Αβ, представленный в настоящем описании, в котором более 30%, в частности более 40%, в частности более 50%, в частности более 60%, в частности более 70%, в частности более 80%, в частности более 90%, в частности более 95% и вплоть до 100%, находится в бетаскладчатой конформации.

При использовании липосомы, в качестве носителя, композицию антигенного пептида можно выбирать таким образом, чтобы ее общий чистый заряд был идентичен заряду на поверхности носителя/адъюванта, к которому пептид присоединен. Электростатические силы отталкивания, которые обладают эффективностью между одинаково заряженной поверхностью носителя/адъюванта и антигенного пептида, но в частности, между одинаково заряженной поверхностью носителя и аминокислотными остатками, из которых состоит антигенный пептид, и более предпочтительно между одинаково заряженной поверхностью носителя и одинаково заряженными аминокислотными остатками, из которых состоит антигенный пептид, могут приводить к тому, что антигенный пептид приобретает определенную высокоспецифическую и стабилизированную конформацию, которая гарантирует высокую биологическую активность. В результате этого антигенный пептид экспонируется и презентуется в конформации, которая обладает высокой биологической активностью и позволяет иммунной системе целевого организма свободно взаимодействовать с антигенными детерминантами, входящими в антигенную конструкцию в биологически активной конформации, что приводит к сильному и специфическому для конформации иммунному ответу, выражающемуся, например, в образовании высокого титра антител в целевом организме.

Иммунный ответ можно дополнительно усиливать при использовании липосомы в качестве носителя, поскольку липосома может функционировать в качестве адъюванта, усиливающего или стимулирующего иммунный ответ в организме животного- или человека-мишени, подлежащего лечению с помощью терапевтической вакцины, предлагаемой в изобретении. Липосома необязательно может содержать также дополнительный адъювант, такой, например, как липид Α, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно детоксифицированный липид Α, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид Α, или любой другой адъювант, такой, например, как квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, ЬР8, ΘΌΝ (олигодинуклеотид) СрС. Рат2С8К4, Рат3С8К4, άδΡΗΚ, 88ΡΗΚ, мурамилдипептид, Οιιίΐ О, 08-21.

- 3 032494

Ц8-21.

Липосомы, которые можно применять в композициях, включают липосомы, известные специалистам в данной области. Можно использовать любые стандартные липиды, применяемые для приготовления липосом. Для создания композиций можно применять стандартные состоящие из двух или нескольких слоев липосомы. Хотя можно применять любой метод приготовления липосом, известный специалистам в данной области, наиболее предпочтительные липосомы получают согласно методу, описанному у АМпд и др., 1пГес1. 1ттип. 60, 1992, с. 2438-2444, (Ьаиег и др., 1992), публикации включены в настоящее описании в качестве ссылки. Липосома может обладать двойной функцией, поскольку ее можно использовать в качестве носителя, содержащего надмолекулярную конструкцию, описанную выше, и в тоже время функционировать в качестве адъюванта, предназначенного для усиления или стимуляции иммунного ответ в организме животного- или человека-мишени, подлежащего лечению с помощью терапевтической вакцины. Липосома может необязательно содержать дополнительный адъювант или иммуномодулятор или оба указанных агента, таких, например, как липид А, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно липид А, более конкретно детоксифицированный липид А, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид А, или квасцы.

Липосома может состоять из компонентов, выбранных из группы, включающей димиристоилфосфатидилхолин (ЭМРС). димиристоилфосфатидилэтаноламин (ΌΜΡΕΑ), димиристоилфосфатидилглицерин (ΌΜΡ6) и холестерин.

В качестве замены катионных липидов в мембране липосом можно применять анионные липиды, выбранные из группы, включающей:

а) диацилфосфолипиды с головными группами фосфотидилглицерина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, Ь-ц-фосфатидилинозит-4-фосфата или фосфатидной кислоты;

б) лизофосфолипиды с головными группами фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина или фосфатидной кислоты и

в) кардиолипин, дилизокардиолипин, монолизокардиолипин.

В качестве замены анионных липидов в мембране липосом можно также применять катионные липиды, выбранные из группы, включающей:

а) диацильные фосфолипиды с головными группами 3-триметиламмонийпропана, 3диметиламмонийпропана, 3-этилфосфохолина или 3-фосфатидилэтаноламина; и

б) Ό-эритросфингозин, бромид диметилдиоктадециламмония, бромид Ν-[1-(2,3димиристилокси)пропил]-Н,№диметил-Н-(2-гидроксиэтил)аммония, метилсульфат НН^триметил-2бис-[(1-оксо-9-октадеценил)окси]-(2,2)-1-пропанамминия или гидрохлорид 3-[Ν-(Ν',Ν'диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина.

Липидные цепи, присоединенные к указанным выше головным группам, могут быть:

а) насыщенными или ненасыщенными,

б) их длина может варьировать от (СН₂)_п, где п обозначает 3-24, и они могут быть симметрично или асимметрично замещенными.

Итак, антигенная композиция, представленная в настоящем описании, может содержать липосомный препарат и адъювант, в частности, липид А, квасцы, фосфат кальция, интерлейкин 1 и/или микрокапсулы из полисахаридов и белков, но предпочтительно липид А, более предпочтительно детоксифицированный липид А, такой как монофосфорильный или дифосфорильный липид А, или квасцы.

Липосомную композицию, которая содержит пептид Αβ, сшитый с липофильными фрагментами, встроенными в липосомы, указанные в настоящем описании, можно получать с помощью методологии, указанной в настоящем описании.

Когда липосомы применяют в качестве носителя/адъюванта, то антигенный пептид можно дополнительно модифицировать путем сшивания с липофильным или гидрофобным фрагментом, который облегчает встраивание в липидный бислой липосомы, представляющей собой носитель/адъювант. Указанный гидрофобный фрагмент может представлять собой жирную кислоту, триглицерид, диглицерид, стероид, сфинголипид, гликолипид или фосфолипид.

Липофильный или гидрофобный фрагмент может представлять собой алкильную группу или жирную кислоту с углеродным каркасом, содержащим по меньшей мере 1 атом углерода, в частности по меньшей мере 2 атома углерода, в частности по меньшей мере 3 атома углерода, в частности по меньшей мере 4 атома углерода, в частности по меньшей мере 6 атомов углерода, в частности по меньшей мере 8 атомов углерода, в частности по меньшей мере 12 атомов углерода, в частности по меньшей мере 16 атомов углерода.

Липофильные или гидрофобные фрагменты могут представлять собой жирные кислоты, триглицериды и фосфолипиды, в частности, жирные кислоты, в которых углеродный каркас жирной кислоты содержит по меньшей мере 4 атома углерода, в частности, липофильные фрагменты, включающие жирные кислоты, углеродный каркас которых состоит по меньшей мере примерно из 14 атомов углерода и вплоть примерно до 24 атомов углерода, более предпочтительно гидрофобные фрагменты, углеродный каркас которых состоит по меньшей мере из 14 атомов углерода. Примерами гидрофобных фрагментов являются пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, миристиновая кислота, лауриновая кислота, олеиновая

- 4 032494 кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота и холестерин или Ό8ΡΕ (1,2-дистеароилглицеро-3фосфатидилэтаноламин). Пальмитоилирование, создающее якорь для пептида в бислое липосомы благодаря относительно небольшой длине остатка С_16:0-жирной кислоты, приводит к тому, что пептид презентуется (экспонируется) на поверхности липосомы или непосредственно вблизи ее поверхности. Таким образом, клетки, в которых процессируется антиген, должны включать полную липосому с пептидом.

Антигенные конструкции могут содержать пептиды, модифицированные путем пэгилирования (с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) или модифицированного полиэтиленгликоля) или модифицированные с помощью других методов, например, с использованием пальмитиновой кислоты, как описано выше, полиаминокислот (например, полиглицина, полигистидина), полисахаридов (например, полигалактуроновой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолида, хитина, хитозана), синтетических полимеров (полиамиды, полиуретаны, сложные полиэфиры) или сополимеров (например, поли(метакриловой кислоты) и Ы-(2-гидрокси)пропилметакриламида) и т.п.

Если для получения антигенной конструкции применяют ПЭГ, то свободный конец ПЭГ может быть ковалентно присоединен к молекуле фосфатидилэтаноламина (при этом жирная кислота может представлять собой миристиновую, пальмитиновую, стеариновую, олеиновую кислоту и т.д. или их комбинацию). Эту надмолекулярную структуру можно реконструировать в липосомах, содержащих фосфолипиды и холестерин (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, холестерин в различных молярных соотношениях). Можно применять другие фосфолипиды. Липид А можно применять в концентрации примерно 40 мкг/пмоль фосфолипидов.

Итак, антигенные конструкции могут содержать последовательность антигенного пептида, указанную выше, ковалентно связанную по меньшей мере с одним с пэгилированным лизином на каждом конце, но предпочтительно с 1 или 2 на каждом конце. Длина цепи ПЭГ (полиэтиленгликоль) может варьировать от п=8 до п=150000 или более, предпочтительно от п=10 до п=80000, более предпочтительно от п=10 до п=10000. Длина цепи ПЭГ может не превышать п=45, предпочтительно находится в диапазоне от п=5 до п=40, более предпочтительно находится в диапазоне от п=10 до п=30 и еще более предпочтительно п=10.

Возможно осуществление последующей инсерции (пост-инсерции) других типов пептидов (например, антигенов) и/или типов адъювантов в наружный слой предварительно полученных липосом в различных концентрациях, как это описано в заявке ΕΡ 10188832, содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Метод пост-инсерции заключается в том, что предварительно получают липосомы в растворе и модифицируют антигенные пептиды помощью гидрофобных фрагментов, в результате чего модифицированный антигенный пептид приобретает мицеллярную форму. Метод дополнительно предусматривает высвобождение антигенных пептидов из мицелл путем индукции разрушения мицелл с последующей интеграцией в предварительно созданную липосому. Указанный процесс интеграции опосредуется гидрофобными взаимодействиями модифицированного антигена и/или адъюванта с (фосфо)липидным бислоем липосом. В частности, солюбилизацию модифицированного антигенного пептида и/или адъюванта в наружном слое липосом осуществляют без использования какойлибо химической реакции или дополнительной модификации молекулы посредством растворения солюбилизированного антигенного пептида или адъюванта (первоначально присутствующего в мицеллярной форме) при концентрации поверхностно-активного вещества, более низкой, чем критическая концентрация мицеллообразования. Затем находящийся в свободной форме антигенный пептид или адъювант интегрируют в наружный слой липосом посредством солюбилизации их гидрофобных доменов с помощью ацильного фрагмента фосфолипидов. Таким методом получают партию пустых (незагруженных) липосом, которые можно загружать в зависимости от потребностей.

В частности, указанный метод пост-инерции для получения антигенной конструкции на основе липосом, включающей антигенный пептид, представленный в настоящем описании, который в различных вариантах модифицирован с помощью гидрофобных остатков, реконструированных в липосоме, может включать следующие стадии, на которых I) получают липосомы в растворе; II) получают модифицированный антигенный пептид путем добавления к Ν- и/или С-концу молекулы пептида по меньшей мере одного гидрофобного фрагмента; III) солюбилизируют модифицированный антигенный пептид в присутствии поверхностно-активного вещества; IV) разводят солюбилизированный пептид и необязательно адъювант до концентрации более низкой, чем критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) поверхностно-активного вещества; и V) загружают полученные липосомы разведенным солюбилизированным антигенным пептидом и необязательно адъювантом с получением предварительного препарата липосом и солюбилизируют добавленный пептид и необязательно адъювант в наружном слое липосом предпочтительно без помощи какой-либо химической реакции или дополнительной модификации молекулы.

В контексте настоящего описания понятие критическая концентрация мицеллообразования, которую обозначают также, как ККМ означает концентрацию поверхностно-активных веществ, выше которой происходит спонтанное образование мицелл. При интродукции поверхностно-активных веществ (или любых поверхностно-активных соединений) в систему поверхностно-активные вещества должны сначала распределиться в поверхности раздела фаз, что приводит к снижению свободной энергии систе

- 5 032494 мы посредством а) снижения энергии поверхности раздела фаз (рассчитанной как площадь х поверхностное натяжение) и б) предупреждения контакта с водой гидрофобных участков поверхностно-активного вещества. Затем, когда поверхность, охваченная поверхностно-активными веществами, возрастает, а свободная энергия поверхности (поверхностное натяжение) снижается и начинается агрегация поверхностно-активных веществ в мицеллы, вновь понижается свободная энергия системы в результате уменьшения области контакта гидрофобных участков поверхностно-активного вещества с водой. После достижения ККМ любое дополнительное введение поверхностно-активных веществ сразу должно увеличивать количество мицелл (ШРАС. Сотрепбшт оГ Сйет1са1 Тегтто1оду, 2-ое изд., изд-во В1аск\\е11 δοίοηΙίΓίο РиЬНсайопк, ОхГогб, 1997).

Важно, что этот метод приводит к высоким уровням включения пептида и/или адъюванта с уникальным молекулярным дисплеем, представляющим собой облицовку липосомы, на поверхности наружного слоя бислоя липосом. В частности, по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и вплоть до 100% реконструированного антигенного пептида присутствует на поверхности липосомы в виде конструкции, встроенной в липидный бислой посредством ее гидрофобных фрагментов.

Метод позволяет получать также препараты липосом с гомогенным распределением размеров, что характеризуется индексом полидисперсности от 0,4 до 0,6, в частности от 0,45 до 0,55, в частности 0,5. Кроме того, метод и конструкции позволяют обеспечивать высокую биодоступность пептида и/или адъюванта для иммунной системы и в результате обеспечивают повышенный иммунный ответ. Расщепление адъюванта, например, расщепление МРЬА, минимизируется или отсутствует, что обеспечивает высокую воспроизводимость партий. Конструкции, полученные с использованием указанного выше метода, являются стабильными, пригодными для стерилизации фильтрацией и не индуцируют побочные иммунные ответы.

Таким образом, антигенная конструкция может содержать антигенный пептид, в реконструированной в липосоме форме, в которой по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% и вплоть до 100% этого пептида присутствует на поверхности липосомы, который встроен в липидный бислой липосомы посредством его гидрофобных фрагментов.

Итак, липосомный препарат содержит указанную антигенную конструкцию, причем для препарата характерно гомогенное распределение размеров, при этом индекс полидисперсности составляет от 0,4 до 0,6, в частности от 0,45 до 0,55, в частности 0,5.

При этом антигенный пептид может презентоваться на поверхности молекулы-носителя в виде массива, состоящего из большого количества повторов, в частности, состоящего из повторов массива, который содержит по меньшей мере 10 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 50 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 100 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 200 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 300 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 400 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя, в частности по меньшей мере 500 повторяющихся антигенных единиц/молекулу носителя.

Понятие антитело или антитела в контексте настоящего описания имеет известное с данной области значение и относится к молекулам или активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, прежде всего к молекулам иммуноглобулинов и к иммунологически активным фрагментам молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулам, которые содержат сайт связывания, иммуноспецифически связывающийся с антигеном. Иммуноглобулин может представлять собой любой тип (1дС, 1дМ, Ι§Ό, 1дЕ, 1дА и 1дУ) или класс (1§С1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 и 1дА2) или подкласс молекулы иммуноглобулина.

К антителам относятся моноклональные антитела, поликлональные, химерные, одноцепочечные, биспецифические, симианизированные (включающие участки обезьяньих антител), человеческие и гуманизированные антитела, а также их активные фрагменты. Например, к активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, относятся ЕаЬ- и Е(аЬ')₂-фрагменты, включая продукты экспрессионной библиотеки ЕаЬ-фрагментов иммуноглобулинов, и связывающиеся с эпитопом фрагменты любых антител и их указанных фрагментов.

Указанные активные фрагменты можно получать из антитела с помощью многочисленных методик. Например, очищенные моноклональные антитела можно расщеплять ферментом, таким как пепсин, и подвергать ЖХВР-гель-фильтрации. Затем соответствующую фракцию, содержащую ЕаЬ-фрагменты, можно собирать и концентрировать с помощью фильтрации через мембрану и т.п. Дополнительное описание общих методик выделения активных фрагментов антител см., например, у Κίκην В. А. и др. 1. Ыиск Меб. 23, 1982, с. 1011-1019; Воиккеаих и др., МеИобк Еп/уто1оду, 121, изд-во, Асабетю Ргекк, 1986, с. 663-669.

Понятие гуманизированное антитело относится к типу сконструированного антитела, в котором СОВ получены из иммуноглобулина организма-донора кроме человека, остальные выведенные из иммуноглобулина области получают из одного (или нескольких) человеческого(их) иммуноглобулина(ов).

- 6 032494

Кроме того, поддерживающие каркас остатки (остатки каркасного участка) можно изменять для сохранения аффинности к связыванию. Методы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Оиееп и др., Ргос. №111 Асаб 8с1 И8Л, 86, 1989, с. 1002910032 (1989), Нобдкоп и др., Вю/Тесйпо1оду, 9, 1991, с. 421).

Гуманизированное антитело можно получать также с помощью нового подхода генетической инженерии, который позволяет получать напоминающие человеческие поликлональные антитела с созревшей аффинностью в крупных животных, таких, например, как кролики.

Понятие моноклональное антитело хорошо известно в данной области и относится к антителу, которое в больших количествах получают в лабораторных условиях из индивидуального клона и которое распознает только один антиген. Моноклональные антитела, как правило, создают путем слияния продуцирующей антитела В-клетки, как правило, с коротким временем жизни, с быстро растущей клеткой, такой как раковая клетка (иногда ее называют иммортализованной клеткой). Образовавшаяся гибридная клетка или гибридома быстро размножается, создавая клон, который продуцирует антитело в больших количествах.

Понятие нарушения и аномалии памяти и/или когнитивные нарушения и аномалии относится прежде всего к клиническим симптомам, ассоциированным со связанной с амилоидом патологией у индивидуумов с синдромом Дауна (08). но, в частности, к нарушениям и аномалиям, которые возникают в гиппокампе и/или префронтальной области коры головного мозга, и/или энторинальной области коры головного мозга. Примерами указанных нарушений и аномалий памяти и/или когнитивных нарушений являются (но, не ограничиваясь только ими) нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или речевая дисфункция, такая как афазия, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации (навигации) в незнакомой и знакомой местности, и/или пониженные исполнительные функции, такие как апатия, растормаживание, социальная изоляция, плохая рассудительность, сложности с планированием, и/или плохое абстрактное мышление, и/или изменения особенностей характера, и/или эмоциональные изменения, такие как апатия, возбуждение и психоз, и/или апраксия, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения, и/или другие неврологические признаки, включая пирамидные и экстрапирамидные синдромы, а также миоклонические судороги или припадки.

Понятие нарушение памяти относится также к кардинальной особенности Ώ8, которая часто проявляется раньше других симптомов. Даже, когда отсутствуют первичные жалобы, дефицит памяти может быть выявлен у большинства пациентов с Ώ8 в момент обследования врачом. Схема нарушения памяти при Ώ8 является очень характерной. При Ώ8 поражается главным образом декларативная память на факты и события, которая зависит от медиальных теменных структур, таких как энторинальная область коры головного мозга и гиппокамп, в то время как подкорковые системы, поддерживающие процессуальную память, в определенной степени сохраняются до поздних стадий развития болезни.

Эпизодическая память нарушается более выражено у молодых пациентов с Ώ8 по сравнению с памятью на факты, такие как словарный запас и понятия (семантическая память), которая часто нарушается несколько позднее. В эпизодической памяти существует различие между немедленным воспроизведением (например, мысленное повторение номера телефона), памятью на недавно произошедшие события (которая начинает играть роль, когда должен быть воспроизведен материал, который удален из сознания) и памятью на более ранние эпизоды. У молодых пациентов с Ώ8 значительно нарушается память на недавно произошедшие события, которая обеспечивается гиппокампом, энторинальной областью коры головного мозга в медиальной теменной доле. В противоположность этому, непосредственная память (которая зависит от префронтальной коры головного мозга) сначала сохраняется, поскольку относится к видам памяти, которые формируются в течение длительных периодов времени (лет) и которые можно воспроизводить в отсутствии функции гиппокампа.

Нарушения процессуальной памяти проявляется только у пациентов среднего возраста с Ώ8. Речевая дисфункция, нарушения исполнительной функции и других доменов когнитивных функций развиваются с различной скоростью в процессе развития болезни. Гетерогенность клинического проявления Ώ8, вероятно, отражает вариабельное топографическое распределение патологических поражений в головном мозге. Речевая дисфункция, такая как афазия, является общим симптомом Ώ8 и первые проявления речевой дисфункции, как правило, включают затруднения в поиске слов, многословие и пониженный словарный запас при спонтанной речи, и аномию в тестах на сопоставление названий. Эти дисфункции могут прогрессировать вплоть до включения связанных с парафазией ошибок, убогого содержания речи и нарушенного понимания. Однако пациенты могут, как правило, дословно повторять фразы вплоть до полного развития болезни.

Сложности с речью при Ώ8 часто обозначают как афазию типа Вернике и Брока. При использовании скоростного теста, в котором требуется создать за одну минуту перечень слов, пациентов с Ώ8 относят к существенно худшей категории (например, перечень животных), чем при использовании скоростного буквенного теста (например, перечня слов, начинающихся на букву Р). Это отражает специфиче

- 7 032494 ский дефицит семантической памяти.

Снижение зрительно-пространственного восприятия является еще одним проявляющимся рано признаком Ό8, который иногда является очень заметным в момент описания врачом случая. Нарушения зрительно-пространственного восприятия проявляется в виде неспособности положить предметы в нужное место предметов и сложности ориентации в незнакомой и знакомой местности. Более поздними признаками являются визуальная агнозия (неспособность распознавать объекты) и прозоагнозия (неспособность распознавать лица).

Нарушение исполнительной функции также встречается у пациентов с Ό8. Эти симптомы включают плохую критическую самооценку (интуитивное понимание) и пониженную способность к абстрактному мышлению. По мере развития болезни, как правило, происходят изменения личности (такие как развитие апатии, социальной невовлеченности и растормаживания), возникает плохая рассудительность и способность к планированию и неспособность завершать задачи. В этом случае может дополнительно присутствовать также депрессия, которую может оказаться трудным диагностировать при установлении деменции.

Пониженная критическая оценка собственного дефекта (анозогнозия) является другой характерной особенностью Ό8. Для пациентов нередко характерным является отрицание или недооценка их дефектов и попытка их объяснения, когда им на них указывают. Для воссоздания точной истории решающее значение имеет опрашивание дополнительного участника событий, например, супруга. Фактически, часто член семьи обращает внимание медиков на когнитивное нарушение. Снижение критической самооценки возрастает с течением времени по мере усиления общей серьезности болезни, и оно может ассоциироваться с нарушениями поведения; пациенты с относительно сохранившейся критической самооценкой с большей вероятностью могут подвергаться депрессии, в то время как пациенты с более нарушенной критической оценкой, вероятно, должны быть возбужденными, расторможенными и иметь признаки психического расстройства. Возникновение нарушений поведения, включая возбуждение, агрессию, аномальную подвижность и психоз (галлюцинации, навязчивые идеи, синдромы ошибочной идентификации), может приводить к выраженному состоянию психического перенапряжения (дистрессу) пациента и членов его семьи, и, как правило, проявляется на более поздних стадиях Ό8.

Более молодые пациенты с Ό8, как правило, характеризуются при обследовании нормальным неврологическим состоянием за исключением когнитивной функции. Хотя у пациентов с Ό8 встречаются пирамидные и экстрапирамидные моторные синдромы, миоклонические судороги или припадки, они, как правило, проявляются на поздней стадии болезни. Аналогично этому, видимые простым глазом признаки (хватательный рефлекс, симптомы хоботка, симптом противодержания) и невоздержанность, являются скорее поздними, чем ранними особенностями Ό8.

Иммуногенная композиция может представлять собой терапевтическую вакцину, которая содержит антигенную конструкцию, представленную выше в настоящем описании, в терапевтически или профилактически эффективном количестве, и ее можно приготавливать в виде жидкого раствора или суспензии для инъекций, или также в твердой форме, которую требуется солюбилизировать перед инъекцией, включенную в состав, например, описанного ниже набора, предназначенного для применения композиции.

Понятие терапевтически или профилактически эффективное количество относится к количеству антитела, пептида, соединения или фармацевтической композиции, которое при введении человеку или животному является достаточным для оказания терапевтического действия или профилактического действия на человека или животного. Специалист в данной области легко может определять эффективное количество с помощью общепринятых процедур.

Иммуногенную композицию можно вводить человеку или животному, в частности, человеку или животному с синдромом Дауна, имеющему когнитивные нарушения или аномалии ΑΌ-типа, в частности нарушения или аномалии, возникающие в гиппокампе и/или префронтальной области коры головного мозга, и/или энторинальной области коры головного мозга, для индукции иммунного ответа у человека или животного, для облегчения симптомов ΑΌ-типа, ассоциированных с заболеванием, или для восстановления состояния, присущего здоровым индивидуумам, которые не поражены заболеванием.

Поскольку фактически у всех людей с синдромом Дауна могут в конце концов в определенный момент жизни возникать когнитивные нарушения ΑΟ-типа, также целесообразно вводить указанную вакцину людям с синдромом Дауна до проявления нарушений ΑΟ-типа. В этом случае вакцина может действовать в качестве средства для профилактического лечения.

Иммуногенную композицию можно вводить человеку или животному с использованием любых стандартных путей введения. Как правило, композицию можно вводить с использованием местного, орального, ректального, назального или парентерального (например, внутривенного, подкожного или внутримышечного) пути введения. Кроме того, композицию можно включать в обеспечивающие пролонгированное высвобождение матрицы, например, из биоразложимых полимеров, полимеры можно имплантировать в область, в которую требуется осуществлять введение, например, в область опухоли. Метод предусматривает введение однократной дозы, введение повторных доз с предварительно установленными временными интервалами и пролонгированное введение в течение предварительно определен

- 8 032494 ного периода времени.

В конкретном варианте осуществления изобретения антигенную конструкцию, в частности иммуногенную композицию, которая содержит антигенную конструкцию в терапевтически эффективном количестве, вводят в виде повторяющихся доз, прежде всего 1-15 доз, более предпочтительно 2-10 доз, более предпочтительно 3-7 доз и еще более предпочтительно 4-6 доз, с временными интервалами, составляющими 1-10 недель, предпочтительно с временными интервалами, составляющими 1-6 недель, более предпочтительно с временными интервалами, составляющими 1-4 недели и еще более предпочтительно с временными интервалами 2-3 недели. Иммунный ответ оценивают в полученных образцах сыворотки через приемлемый промежуток времени после ревакцинации, предпочтительно через 3-10 дней после ревакцинации, более предпочтительно через 4-8 дней после ревакцинации и более предпочтительно через 5-6 дней после ревакцинации, и определяют иммуногенность антигенной конструкции с помощью известной методологии, прежде всего с помощью одного из обычно применяемых иммуноанализов, таких, например, как ЕЬ18А.

В частности, композицию антигенного пептида вводят парентерально, предпочтительно с помощью внутрибрюшинной, внутривенной, подкожной и внутримышечной инъекции.

Доза композиции должна зависеть от состояния, подлежащего лечению, конкретной применяемой композиции и других клинических факторов, таких как вес, размер и состояние пациента, площадь поверхности тела, конкретное соединение или композиция, подлежащее/подлежащая введению, другие одновременно применяемые лекарственные средства и путь введения.

Иммуногенную композицию можно вводить в сочетании с другими биологически активными субстанциями и процедурами, предназначенными для лечения симптомов, ассоциированных с синдромом Дауна. Другие биологически активные субстанции могут быть компонентами той же композиции, которая уже содержит иммуногенную композицию, в форме смеси, при этом иммуногенную композицию и другую биологически активную субстанцию перемешивают в фармацевтически приемлемом растворителе и/или носителе или смешивают с ним, или они могут присутствовать отдельно в виде компонента других композиций, которые могут поступать в продажу отдельно или вместе в форме состоящего из компонентов набора.

Иммуногенную композицию можно вводить в сочетании с другой(ими) биологически активной(ыми) субстанцией или субстанциями поочередно или последовательно. Например, иммуногенную композицию можно вводить одновременно с первой дополнительной биологически активной субстанцией или последовательно после или до введения указанной композиции. Если выбрана приемлемая схема, при которой более одной дополнительной обладающей биологической активностью субстанции вводят в сочетании по меньшей мере с одной иммуногенной композицией, то соединения или субстанции можно частично вводить одновременно, частично последовательно в различных комбинациях.

Смеси могут содержать помимо фармацевтической композиции, биологически активную субстанцию, такую, например, как известные соединения, применяемые для медикаментозного лечения симптомов ΑΌ-типа у детей или индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна.

Другая биологически активная субстанция или соединение может обладать биологическим действием, опосредуемым таким же или сходным механизмом, что и иммуногенная композиция или обладать неродственным механизмом действия или сочетанием родственных и/или неродственных механизмов действия.

Как правило, другое биологически активное соединение может представлять собой антитела к антигенному пептиду и связывающиеся с ним, которые указаны в настоящем описании, или соединения, применяемые для медикаментозного лечения неврологических нарушений, такие как энхансеры нейтронной трансмиссии, психотерапевтические лекарственные средства, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, блокаторы кальциевых каналов, биогенные амины, транквилизаторы на основе бензодиазепинов, усилители синтеза, накопления или высвобождения ацетилхолина, агонисты постсинаптического рецептора ацетилхолина, ингибиторы моноаминоксидазы-А или -В, антагонисты рецептора Ν-метил-Оаспартатглутамата (ΝΜΟΑ), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антиоксиданты и антагонисты серотонергического рецептора.

В частности, смесь может содержать по меньшей мере одно другое биологически активное соединение, выбранное из группы, состоящей из соединений против окислительного стресса, антиапоптозных соединений, хелаторов металлов, ингибиторов репарации ДНК, таких как пирензепин и его метаболиты, 3-амино-1-пропансульфоновой кислоты (3АР8), 1,3-пропандисульфоната (1,3РИ8), активаторов секретаз, ингибиторов β- и γ-секретаз, тау-белков, нейромедиаторов, разрушителей β-складчатой конформации, противовоспалительных молекул или ингибиторов холинэстеразы (С11Е1). таких как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, и других лекарственных средств и пищевых добавок, в сочетании с терапевтической вакциной и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.

Смеси могут содержать также ниацин или мемантин в сочетании с иммуногенной композицией и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.

Смеси могут содержать атипичные антипсихотические средства, такие, например, как клозапин,

- 9 032494 зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, предназначенные для лечения позитивных и негативных психотических симптомов, включая галлюцинации, навязчивые идеи, нарушения мышления (проявляющиеся в выраженной непоследовательности действий, психическом расстройстве, расстройстве ассоциативного мышления) и эксцентричное или неорганизованное поведение, а также ангедонию, пониженную эмоциональную реакцию, апатию и отказ от общества, в сочетании с иммуногенной композицией и/или терапевтической вакциной и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или эксципиентом.

Другие соединения, которые можно применять в смесях в сочетании с фармацевтической композицией описаны, например, в АО 2004/058258 (см. прежде всего на с. 16 и 17), включая мишени терапевтических лекарственных средств (с. 36-39), алкансульфоновые кислоты и алкансерную кислоту (с. 39-51), ингибиторы холинэстеразы (с. 51-56), антагонисты ΝΜΌΑ-рецептора (с. 56-58), эстрогены (с. 58-59), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (с. 60-61), антиоксиданты (с. 61-62), агонисты рецепторов, активируемых пероксисомальными пролифераторами (ΡΡΛΚ) (с. 63-67), средства, понижающие уровень холестерина (с. 68-75); ингибиторы амилоида (с. 75-77), ингибиторы образования амилоида (с. 77-78), хелаторы металлов (с. 78-79), антипсихотические средства и антидепрессанты (с. 8082), пищевые добавки (с. 83-89) и соединения, повышающие доступность биологически активных субстанций в головном мозге (см. с. 89-93) и пролекарства (с. 93 и 94), указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки, но прежде всего соединения, упомянутые на указанных выше страницах.

Антигенная конструкция может содержать пептид Αβ, который не содержит Т-клеточный эпитоп и поэтому не обладает потенциальной способностью вызывать побочные действия, такие как неврологические осложнения, связанные со сверхактивированной системой комплемента. Это можно обеспечивать путем введения антигена, представляющего собой пептид Αβ, предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Αβ, более предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Αβ1-15, но наиболее предпочтительно антигена, представляющего собой пальмитоилированный пептид Αβ1-15, в сочетании с ингибитором системы комплемента.

Ингибитор системы комплемента может представлять собой соединение, выбранное из группы, состоящей из растворимого рецептора 1 человеческого комплемента, антитела к человеческому белку системы комплемента С5, такого, например, как гуманизированное моноклональное антитело к С5 или одноцепочечный фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, ингибитора-Ν С1-эстеразы и встречающегося в естественных условиях ингибитора человеческого С1.

Модифицированный амилоидный пептидный антиген, такой, например, как антиген, представляющий собой пептид амилоида бета 1-15, можно синтезировать с помощью метода, описанного у Νίοοίαιι и др., 2002. Подход, описанный у Νίοοίαιι с соавторами, можно модифицировать, осуществляя сначала синтез антигенного пептида, который затем модифицируют путем осуществления прививки на смоле липофильного или гидрофобного фрагмента к концевым аминокислотным остаткам ранее полученного пептида. В частности, защищенную аминокислоту, прежде всего защищенную с помощью Ртос аминокислоту, присоединяют к смоле с помощью известных методов химического сочетания. Защитную группу удаляют и сшивают со вторым защищенным аминокислотным остатком. Затем применяют стандартный автоматический пептидный синтез с использованием известной процедуры химической защиты, в частности Ртос/1Ви-химии, и стандартных защитных групп боковых цепей для синтеза антигенного Αβпептида, прежде всего антигенного Ав1-15-пептида, путем сочетания аминокислот 1-15 амилоидного белка Αβ1-42 с получением пептидного фрагмента с требуемой последовательностью. На конечной стадии для удлинения пептидного фрагмента связывают две дополнительные аминокислоты. Затем Мйгруппы боковых цепей первых двух и последних двух аминокислот можно избирательно отщеплять и сшивать с пальмитиновой кислотой. После промывки смолы защитную группу удаляют и одновременно отщепляют смолу с последующим удалением защитных групп боковых цепей с помощью стандартной методологии. После этого получают конечный продукт высокой чистоты и его идентичность подтверждают известными в данной области методами, такими, например, как массспектрометрия с использованием электроспрея.

Модифицированный амилоидный антигенный Αβ-пептид, в частности, модифицированный антигенный Αβ1-15-пептид, можно реконструировать в конструкции, состоящей из липосом, прежде всего липосом на основе димиристоилфосатидиохолина (ЭМРС), димиристоилфосфатидилэтаноламина (ΌΜΡΕΑ), димиристоилфосфатидилглицерина (ΌΜΡΟ) и холестерина, необязательно содержащих монофосфорильный липид Α.

В качестве замены катионных липидов в мембране липосом возможно применение анионных липидов, выбранных из группы, состоящей из:

а) диацилфосфолипидов с головными группами фосфотидилглицерина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, Ь-ц-фосфатидилинозит-4-фосфата или фосфатидной кислоты;

б) лизофосфолипидов с головными группами фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина или фосфатидной кислоты и

в) кардиолипина, дилизокардиолипина, монолизокардиолипина.

- 10 032494

В качестве замены анионных липидов в мембране липосом возможно применение катионных липидов, выбранных из группы, состоящей из:

а) диацильных фосфолипидов с головными группами 3-триметиламмонийпропана, 3диметиламмонийпропана, 3-этилфосфохолина или 3-фосфатидилэтаноламина; и

б) Ό-эритросфингозина, бромида диметилдиоктадециламмония, бромида Ν-[1-(2,3димиристилокси)пропил]-^№диметил-№(2-гидроксиэтил)аммония, метилсульфата ННЮтриметил-2бис-[(1-оксо-9-октадеценил)окси]-(2,2)-1-пропанамминия или гидрохлорида 3-[Ν-(Ν',Ν'диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина.

Липидные цепи, присоединенные к указанным выше головным группам, могут быть

а) насыщенными или ненасыщенными,

б) их длина может варьировать от (СН₂)_П, где η обозначает 3-24, и они могут быть симметрично или асимметрично замещенными.

Липосомы с добавлением липида А можно применять в качестве адъюванта для приготовления противоамилоидной вакцины.

Димиристоилфосфатидилхолин, -глицерин и холестерин смешивают, в частности в молярном соотношении 0,9:1,0:0,7. Затем добавляют сильный иммуномодулятор, такой, например, как монофосфорильный липид А, в приемлемой концентрации, прежде всего в концентрации от 30 до 50 мг на ммоль, более предпочтительно 40 мг на 1 ммоль фосфолипидов. Затем добавляют модифицированный антигенный Αβ-пептид в молярном соотношении пептида и фосфолипидов от 1:30 до 1:200, прежде всего в молярном соотношении от 1:50 до 1:120, более предпочтительно 1:100. Растворители удаляют, например, выпариванием, и образовавшуюся пленку гидрируют стерильным буферным раствором, таким как ЗФР.

Липосомы можно получать также методом инъекции в перекрестном потоке, который описан, например, у ХУадпег и др., 2002. При инъекции липидных растворов в водной буферной системе липиды имеют тенденцию образовывать осадки (преципитаты) с последующей самоагрегацией в пузырьки. Размер полученных пузырьков зависит от таких факторов как концентрация липида, скорость перемешивания, скорость инъекции и выбор липидов. Предназначенная для получения система может состоять из модуля для инъекции в перекрестном потоке, емкостей для полярной фазы (например, раствор ЗФРбуфера), емкости для этанольного/липидного раствора и устройства для создания давления, но предпочтительно устройства для создания давления азота. В то время как водный или полярный раствор нагнетают насосом через модуль для перекрестной инъекции, этанольный/липидный раствор инъецируют в полярную фазу с помощью различных величин прилагаемого давления. Различные методы получения липосомных антигенных конструкций описаны в ХУО 2007/068411.

Так получают липосомную композицию, которая содержит пальмитоилированный Αβ1-15, в частности, тетрапальмитоилированный Αβ1-15, в сочетании с монофосфорильным липидом А (МРЬА) в качестве адъюванта.

Индивидууму, подлежащему вакцинации, можно вводить подкожно еженедельно или через две недели четыре-десять, в частности пять-шесть, доз липосомной композиции. Можно периодически получать образцы крови и анализировать в отношении титра 1дС.

Эффективность липосомной композиции в качестве иммуногена при введении детям и индивидуумам от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна и ее терапевтический потенциал в отношении лечения дефицита памяти у указанных индивидуумов можно демонстрировать на созданной на животных модели синдрома Дауна. В частности, применяли мышей линии Τδ65Όη, которых широко используют в качестве животной модели Ό8. У мышей линии Τδ65Όη имеет место трипликация мышиной хромосомы 16, которая содержит мышиный ген АРР (Όανίδδοη и др., 1993; №1хсг и др., 2010). У таких трансгенных мышей в 1,5 раза повышено содержание мышиного Ав (Нийег и др., 2004) и у них обнаружены нарушения поведения при оценке с помощью нескольких тестов на запоминание (Вейсйепко и др., 2009).

Липосомная композиция индуцирует повышенные титры антител, и титры указанных антител сохраняются на повышенном уровне даже через 40 дней после иммунизации. Таким образом, липосомная композиция, представленная в настоящем описании, может индуцировать сильный иммунный ответ и разрушает самотолерантность к Ав у обработанных индивидуумов с синдромом Дауна.

Продемонстрировано также, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает также способностью индуцировать у мышей с синдромом Дауна от молодого до среднего возраста титры 1дС такого же уровня, который присутствует у животных из контрольной группы без синдрома Дауна. Липосомная композиция индуцирует более высокие титры антител изотипа 1дС2а по сравнению с контрольной группой, в то время как титры антител изотипа 1дС1 и 1дС2Ь оказались сопоставимыми в обработанной и контрольной группе. Титры антител класса 1дМ оказались ниже в обработанной группе по сравнению с контрольной группой. Эти несколько более низкие титры 1дМ могут быть обусловлены измененной иммунной системой у мышей с синдромом Дауна. Таким образом, липосомная композиция позволяет преодолевать нарушенный адаптивный иммунный ответ на Ав, описанный у людей с Ό8 (Мопкопедо и др., 2001).

Липосомная композиция, представленная в настоящем описании, является также безопасной и не индуцирует нежелательные побочные действия. В частности, обработка липосомной композицией не

- 11 032494 приводит к клеточной активации в головном мозге, например, активации астроцитов или микроглии.

На животной модели установлено, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обеспечивает более высокий уровень способности к различению, что свидетельствует о том, что лечение приводит к существенному улучшению памяти у обработанных животных.

На животной модели при изучении с помощью теста, состоящего из сеансов по обучению, проверке условного рефлекса на сигнал (подсказку) и обстановку (контекст), установлено также, что липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обеспечивает повышенную способность к замиранию (к нахождению в состоянии без движения), достигающую уровня, сопоставимого с уровнем, обнаруженным у контрольных животных. Это позволяет предположить, что иммунизация является эффективной и повышает способность к запоминанию у подопытных животных.

Таким образом, липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает способностью восполнять дефициты памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна, в частности, у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, у которых еще не образовались ассоциированные с Αβ бляшки в головном мозге. У пациентов с синдромом Дауна присутствуют когнитивные аномалии, такие как нарушение памяти и аномальная активность.

Липосомная композиция, представленная в настоящем описании, обладает также способностью восполнять дефициты памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста, страдающих синдромом Дауна, в частности, у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, у которых уже образовались ассоциированные с Αβ бляшки в головном мозге.

Липосомная композиция может облегчать или восполнять дефицит памяти у детей и индивидуумов от молодого до среднего возраста с синдромом Дауна, в частности, нарушения опознавательной памяти и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или речевую дисфункцию, такую как афазия, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или пониженные исполнительные функции, такие как апатия, растормаживание, социальная изоляция, плохая рассудительность, сложности с планированием и/или плохое абстрактное мышление, и/или изменения особенностей характера, и/или эмоциональные изменения, такие как апатия, возбуждение и психоз, и/или апраксия, и/или нарушения способности исполнять усвоенные задачи на выполнение движения, и/или другие неврологические признаки, включая пирамидные и экстрапирамидные синдромы, а также миоклонические судороги или припадки.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическое изображение вакцины АС1-Э8-01, которая представляет собой вакцину на основе липосом с тетрапальмитоилированным мышиным Αβ1-15 в качестве антигена и МРЬА в качестве адъюванта. Подчеркнуты аминокислотные различия между человеческим и мышиным Αβ1-15;

на фиг. 2 - титры антител к мышиному Ар 1-15 у мышей линии Τδ65Όη, иммунизированных вакциной АС1-Э8-01. На А и Б) - титры 1§С к мышиному Αβ40 или Αβ42, обнаруженные в плазме мышей, иммунизированных АС1-О8-01. Индуцированные титры были обнаружены после второй иммунизации и сохранялись на высоком уровне даже через 40 дней после 6-й инъекции по сравнению с мышами, иммунизированными незагруженной липосомой. Не обнаружено различия между титрами, измеренными у мышей линий 2Ν и Τδ65Όη. На В-Е) - изотипы 1§С. обнаруженные после 4-й иммунизации. Ж) 1дМтитры оказались заметно более низкими у мышей линии Τδ65Όη. З) - одинаковые уровни титров 1§С к ΜΡΕΑ обнаружены у всех мышей, иммунизированных ΑΟ-ϋδ-01. На графиках представлены средние значения±СКО (η=20 2Ν- ΑСI-^8-01. η=15 Τ565^η-ΑСI-^8-01. η=18 2Юнезагруженная (обработка незагруженной вакциной) и η=11 Т5б5Эп-незагруженная. На графиках представлены средние значения±СКО);

на фиг. 3 - данные об эффективности иммунизации в отношении способности к запоминанию. Различие в спонтанной локомоторной активности между мышами линий 2Ν и Τδ65Όη оставалось на прежнем уровне после иммунизации. Б) У мышей, иммунизированных ΑΟ-Οδ-01, обнаружено существенное увеличение коэффициента узнавания (Ш) нового объекта по сравнению с группой, обработанной незагруженной вакциной. В) В опыте по оценке условно-рефлекторной реакции страха у иммунизированных мышей обнаружен пограничный уровень значимости для более высокого уровня замирания в процессе контекстуального сеанса. На графиках представлены средние значения±СКО (η=20 2Ν-ΑΟ-Ό8-01, η=13 Τδ65Όη ΑΟ-Ό8-01, η=18 2Юнезагруженная и η=11 Τ865^η-незагруженная);

на фиг. 4 - данные об уровнях Αβ40 у мышей, обработанных вакциной ΑΟ-Ό8-01. А) - в коре головного мозга уровень Αβ40 оказался заметно выше у мышей линии Τδ65Όη по сравнению с мышами линии 2Ν. При применении вакцины Αί.Ί-Ο8-01 обнаружена тенденция к снижению уровней Αβ42 и Αβ40 в коре головного мозга и гиппокампе. Обнаружено статистически значимое снижение уровней Αβ42 и Αβ40 в мозжечке после обработки ΑΟ-Ό8-01. На графиках представлены средние значения±СКО (η=10 2Ν-ΑΟ-Ό8-01, η=10 Τδ65Όη ΑΟ-Ό8-01, η=8 2Юнезагруженная и η=5 Τ865^η-незагруженная).

- 12 032494

На Б и В) - данные, демонстрирующие корреляцию между соотношением уровней Αβ40/42 в коре головного мозга или мозжечке и величиной КТ Г) - данные, демонстрирующие слабую корреляцию между титрами 1дС к Αβ и уровнем Αβ40 в плазме мышей линии Τδ65Όη, обработанных АС1-Э8-01. Д) - данные, демонстрирующие выраженную корреляцию между титром 1§С к Αβ и величиной ΒΙ, (η=19 2Ν АС1Ό8-01, η=13 Τδ65Όη ΑΟ-Ό8-01, η=18 2№незагруженная и η=11 Т8б5Пп-незагруженная);

на фиг. 5 - результаты исследований воспалительной реакции. А) - данные о массе тела и головного мозга. Б) - изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа иммунореактивности ΟΡΑΡ (слева) и ΟΌ45 (справа) у обработанных мышей линии 2Ν и Τδ65Όη. Стрелками указаны индивидуальные СО45-позитивные микроглиальные клетки. Оптическую плотность иммунореактивности ΟΡΑΡ определяли количественно, и установлено отсутствие различия между группами. η=4 для каждой группы;

на фиг. 6 - срезы образцов головного мозга людей с Ό8, полученные после иммуноокрашивания сывороткой мышей, иммунизированных ΑΟΙ-Ό8-02. Наличие позитивно окрашенных областей свидетельствуют о том, что антитело, образовавшееся в ответ на обработку Αί.Ί-Ό8-02. связывается с амилоидными бляшками в головном мозге людей с Ό8. Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным при использовании 6Е10, т.е. поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и при использовании антитела, полученного в ответ на обработку вакциной ΑΟΙ-24. Вакцина ΑΟ-24 соответствует вакцине Αί.Ί-Ό8-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ΑΟΙ-24, имеет последовательность человеческого Αβ1-15, а вакцина ΑΟΙ-Ό8-01 содержит последовательность мышиного Αβ1-15 в качестве антигена (данные о трех аминокислотных различиях в этих двух антигенах представлены на фиг. 1). Не обнаружено окрашивания, когда срез инкубировали с сывороткой из мышей, иммунизированных ЗФР;

на фиг. 7 - результаты обучения мышей линии Τ865Όη, иммунизированных вакциной ΑΟΙ-Ό8-02, полученные в тесте по оценке условно-рефлекторной реакции страха. У мышей линии Τ865Όη, иммунизированных ΑΟΙ-Ό8-0, обнаружен более высокий уровень замирания в сеансе по обучению (научению) по сравнению с мышами линии Τ865Όη, иммунизированными ЗФР, в частности, после третьего условнорефлекторного стимула (С8). На графиках представлены средние значения±СКО (η=7 Τ565Όη-ΑΟΙ-Ό802, η=7 2Ν-3ΦΡ и η=4 Τδ65Όη-3ΦΡ. На графиках представлены средние значения±СКО);

на фиг. 8 - срезы образцов головного мозга людей с Ό8, полученные после иммуноокрашивания сывороткой мышей, иммунизированных ΑΟΙ-Ό8-03. Наличие позитивно окрашенных областей свидетельствуют о том, что антитело, образовавшееся в ответ на обработку ΑΡΊ-Οδ-ίΑ связывается с амилоидными бляшками в головном мозге людей с Ό8. Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6Е10, т.е. поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с использованием антитела, полученного в ответ на обработку вакциной ΑΟΙ-24. Вакцина ΑΟΙ-24 соответствует вакцине ΑΟ-Οδ-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ΑΟ-24, имеет последовательность человеческого Αβ1-15, а вакцина ΑСI-^8-01 содержит последовательность мышиного Αβ1-15 в качестве антигена (данные о трех аминокислотных различиях в этих двух антигенах представлены на фиг. 1). Не обнаружено окрашивания, когда срез инкубировали с сывороткой из мышей, иммунизированных ЗФР;

на фиг. 9 - результаты морфологического анализа мышей Τδ65Όη, иммунизированных вакциной ΑСI-^8-01. Во всех группах оказались очень сходными: А) - количество СйΑΤ⁺-клеток (клетки, положительные по холинацетилтрансферазе) в медиальной перегородке и Б) - оптическая плотность. В) - результаты, демонстрирующие, что площадь тела ΟιΑΤ' -клеток возрастала у мышей линии Τδ65Όη, иммунизированных ΑСI-^8-01, по сравнению с мышами линии Τδ65Όη, обработанными незагруженной вакциной (η=4 2№незагруженная, η=4 Τ865^η-незагρуженная, η=4 2N-ΑСI-^8-01 и η=4 Τ^Οη-ΑΟΌ8-01. На графиках представлены средние значения±СКО).

Примеры

Пример 1. Общая методология.

1.1. Животные.

Применяли мышей линии Τδ65Οη, которых, как известно, используют при создании мышиной модели Όδ (Όανίδδοη и др., 1993) (η=30), и возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2Ν (η= 40). В момент начала исследования возраст мышей составлял 5 месяцев. В конце опыта (иммунизация и оценка поведения) возраст мышей составлял 9 месяцев. Таким образом, все образцы, взятые после умерщвления, были получены из 9-месячных мышей.

Для новорожденных мышей линии Τδ65Όη характерна повышенная смертность (около 6%) главным образом из-за врожденных пороков сердца (ВаМаЛ, 2006, Мооге, 2006). Однако продолжительность жизни мышей может составлять вплоть до 18-24 месяцев. В настоящем исследовании показатель смертности составлял 15%. Размер выживших мышей был на 20% меньше, чем размер здорового приплода. Мыши с наиболее серьезными поражениями, которые погибали при рождении, не учитывались при анализе выживаемости, что приводило к недооценке воздействия генной трисомии на некоторые фенотипические признаки (т.е. дефект сердца). Однако для концепции настоящего изобретения выжившие мыши представляли собой адекватную модель Ό8 для анализа связанных с амилоидом патологий и патологий ΑΌтипа.

При использовании мышиной модели Ό8, которую применяли в указанных исследованиях, у мышей обнаружены повышенные уровни амилоида в возрасте 4 месяца (Нийег, 2004). В возрасте 9 месяцев

- 13 032494 уровень амилоида бета превышал в 3 раза нормальный уровень, как это и предсказывалось, учитывая присутствие трех копий гена АРР. Как и у людей с 1)8. старение представляет собой важный фактор отложения амилоида в головном мозге мышей линии Τδ65[)η. Несмотря на связанное с возрастом накопление амилоида. у мышей линии Τ865Ώπ не развивались бляшки. Однако у них имело место точное воспроизведение дегенерации популяции нейронов. наблюдаемой при ΑΏ и у людей с синдромом Дауна (8а1еЫ и др.. 2009).

В совокупности. особенности 1)8. обнаруженные на применяемой мышиной модели. включают присутствие патологических белков и фенотипических аспектов; т.е. наличие амилоидной нагрузки и когнитивного нарушения. Таким образом. мыши линии Τδ65[)η позволяют точно воспроизводить патогенные процессы. характерные для 1)8. Поскольку у этих мышей в возрасте 6 месяцев начинается накопление амилоида на уровне. сопоставимом с уровнем у людей. то возраст подопытных мышей соответствовал людям с синдромом Дауна от молодого до среднего возраста.

Мыши. которых применяли для опыта по иммунизации с использованием вакцины АС1-В8-01. представляли собой мышей линии Τδ65[)η из колонии. которую поддерживали в течение более 10 поколений путем скрещивания самок линии В6Е1С38п-Т8(1716)65Пп (фирма 1аскзоп ЕаЪога1огу. Бар-Харбор. шт. Мэн) с самцами линии В6Е1С38п Ι'1/.Ι А/а (фирма 1аск§оп ЕаЪога1огу). Указанную схему скрещивания применяли потому. что при родственном спаривании мыши с трисомией размножались очень плохо или не размножались совсем; фон В6С3 оказался наиболее эффективным. Для того чтобы отличать мышей линии 2Ν от мышей линии Τδ65[)η. из образцов. полученных из хвоста. экстрагировали геномную ДНК. Применяли протокол количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (предоставленный фирмой 1аск§оп БаЪога1огу) для количественной оценки экспрессии гена Мх1. который присутствовал в виде трех копий у мышей Τδ65Ώπ. Во всех опытах использовали самцов мышей. Их возраст в начале исследования составлял 4±0.3 месяца.

1.2. Получение вакцин - получение антигенной конструкции на основе липосом.

Код вакцины	Последовательность антигенного пептида³	Последовательность Αβ	Конформация антигенного пептида в вакцине (%) по данным ΑΤΚ-ΙΚ (инфракрасная спектроскопия нарушенного полного отражения)
АС1ГО8-01	Н-Ту8(Ра1)-Ьу8(Ра1)-А8р- А1а-61и РЬе-61у-Н18-А8р- 8ег-61у-Р11е-61и-Уа1-Аг§Н18-61п-Ьу8(Ра1)Ьу8(Ра1)-ОН	мышиный А31-15^ь (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 2)	73% бета-складка 19% случайная спираль 0% альфа-спираль и петли 8% бета-повороты
АС1ГО8-02	Н-Ту8(Ра1)-61и-А8р-Уа161у-8ег-А8п-Ьу5-61у-А1а11е-11е-Сг1у-Теи-Ме1- Ьу8(Ра1)-ОН	человеческий (8Е0 ГО ΝΟ: 4) и мышиный (8ЕС2 ГО ΝΟ: 5) Αβ22-35	67% бета-складка 21% случайная спираль 0% альфа-спираль и петли 12% бета-повороты
АС1ГО8-03	Н-Ту8(Ра1)-Ьу8(Ра1)-Н18- 61п-Ту8-Ьеи-Уа1-Р11е- РЬе-А1а-61и-А8р-Уа1- 61у-8ег-А8п-Ьу5-61у- Ту8(Ра1)-Ьу8(Ра1)-ОН	человеческий (8Еф ГО ΝΟ: 6) и мышиный (8Еф ГО ΝΟ: 7) Αβ14-29	57% бета-складка 19% случайная спираль 12% альфа-спираль и петли 11% бета-повороты

^а Пептидные последовательности представлены в трехбуквенном коде; Ра1 обозначает пальмитоилированный остаток.

^ь Три аминокислотных различия в последовательности человеческого и мышиного Αβ1-15 подчеркнуты и представлены на фиг. 1.

Липосомную антигенную конструкцию получали согласно методу. описанному в АО 2007/068411. Пальмитоилированные пептиды получали на фирме Ро1урерйбе ЕаЪога1ог1ез (Страсбург. Франция). В целом липосомные вакцины получали путем солюбилизации димиристоилфосфатидилхолина (1)МРС). димиристоилфосфатидилглицерина (ОМРО). холестерина и монофосфорильного липида А (МРБА) (все препараты получали от фирмы АмапО Ро1аг 1лрц|8 1пс. шт. Алабама. США) в молярном соотношении 9:1:7:0.05 соответственно в этаноле при 60°С. Липид/этанольный раствор разводили в ЗФР. рН 7.4. давая образоваться многослойным пузырькам. Затем полученный препарат концентрировали ультрафильтрацией (устройство \лма11о\с 200 с полиэфирсульфоновой мембраной с МАСО (молекулярновесовой предел) 100000) со скоростью потока 200 мл/мин и реакционный объем уменьшали с помощью стадии ультрафильтрации. Концентрированный раствор дополнительно подвергали диализу с помощью устройства \луа11о\у 200. в котором осуществляли замену 10-кратного объема на ЗФР. рН 7.4. Затем многослойные липосомы гомогенизировали (7 циклов при давлении 15000-20000 фунтов/кв.дюйм) с последующим осуществление трех циклов экструзии через поликарбонатные фильтры (фирма АБа1шап) с размером пор 0.2 мкм и диаметром 47 мм. Как стадии гомогенизации. так и экструзии осуществляли с помощью устройства Еши181Е1ех-С5 (фирма Ауезйп. Канада). Образовавшиеся однослойные липосомы без антигена разводили в ЗФР рН 7.4 и нагревали до 60°С перед добавлением пептида. Пальмитоилированный пептид растворяли в ЗФР. рН 11.4. дополненном 5.0% (β-ОО). Для приготовления вакцин АС1-О8-01. АС1-О8-02 и АС1-Э8-03 использовали соответствующие антигенные пептиды в концентрации 1.33. 0.67 и 1.06 мг/мл

- 14 032494 соответственно. Образовавшийся раствор содержал поверхностно-активное вещество в концентрации, превышающей его критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), составляющую 0,73% (мас./об.). Затем этот пептидный раствор инъецировали в растворы липосом при 60°С и перемешивали в течение 30 мин, получая раствор с конечной концентрацией β-ΟΟ, существенно более низкой, чем его критическая концентрация мицеллобразования. Разрушение состоящих из поверхностно-активного вещества мицелл индуцирует включение пальмитоилированного антигена на поверхность ранее сформированных липосом. Затем указанный раствор липосом с антигеном концентрировали путем ультрафильтрации и осуществляли замену 10-кратного объема на ЗФР, рН 7,4 посредством диафильтрации (оба процесса осуществляли с помощью устройства с полиэфирсульфоновой мембраной с М\УСО 100000 со скоростью потока 200 мл/мин). Затем образовавшиеся липосомы дважды стерилизовали фильтрацией, пропуская через шприцевые 0,2-микрометровые поликарбонатные фильтры и хранили при 5°С. Молярное соотношение пептида и липида в вакцине составляло 1:100.

1.3. Иммунизация вакциной АС1-И8-01.

Всех мышей иммунизировали путем подкожного (8.е.) введения 200 мкл АС1-И8-01 (51,2 мкг на дозу Ра11-15, тетрапальмитоилированный пептид Αβ1-15) или незагруженной липосомной вакцины. В целом осуществляли шесть инъекций в дни 1, 14, 28, 42, 56, 70 и 110. В эти же дни получали образцы крови из хвостовой вены непосредственно перед первой инъекцией вакцины в день -1 (предварительный образец крови), в день 56 (через 14 дней после 4-й инъекции) и при умерщвлении в день 110 (через 40 дней после 6-й инъекции). Мышей умерщвляли в конце эксперимента в возрасте 9 месяцев и изымали головной мозг.

1.4. Количественная оценка специфических в отношении мышиного Αβ антител после иммунизации с помощью АС1-И8-01.

Специфические в отношении Αβ1-42 ответы в виде 1дО определяли с помощью ЕЬ18А. В целом метод состоял в следующем: планшеты сенсибилизировали с помощью 10 мкг/мл мышиного Αβ1-42 (фирма Васйеш Н5966, лот: 1013710, 1028321 или 1033165) или мышиного Αβ1-40 (фирма Васйеш Н5638, лот: 1013645) в течение ночи при 4°С. После отмывки с помощью ЗФР-0,05% Твин 20 и блокады с помощью 1% БСА в планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Антитело к Αβ 408 (фирма Соуапсе 8Ю-39220, лот: 08ЕС00905, 1 мг/мл, разведенное в 4000 раз) и сыворотку мышей линии С57ВЬ/61О1аН8б (фирма Наг1ап), иммунизированных с помощью трех инъекций той же партии АС1-И8-01, применяли в качестве положительного контроля. После отмывки планшеты инкубировали с конъюгированным со щелочной фосфатазой (АР) антимышиным антителом в виде 1дО (фирма 1аск§оп 1шшипоге8еагсй, Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, США, каталожный №115-055-164, лот 87821, содержимое пробирки разведенное в соотношении 1/4000) в течение 2 ч при 37°С. После конечной отмывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом для АР (ρΝΡΡ) и считывали при 405 нм с помощью планшет-ридера для ЕЫ8А. Результаты выражали в виде оптической плотности (ОП).

1.5. Поведенческие опыты после иммунизации с помощью АС1-И8-01.

Всех мышей подвергали одинаковым сериям поведенческих опытов, начиная исследования после достижения примерно 8-месячного возраста. Каждую мышь держали в руках по 10 мин дважды в день в течение 7 дней, предшествующих исследованию, и в течение 3 дней между опытами. Опыты осуществляли в указанные дни (относительно последней иммунизации) и в следующем порядке: локомоторная активность (начало в день 11), задача на узнавание нового объекта, отсроченное на 24 ч (начало в день 18), Т-лабиринт (начало в день 25) и контекстуальной тест на условно-рефлекторную реакцию страха (начало в день 34). Все поведенческие опыты проводили в течение светового дня между 7:00 А.М. и 7:00 Р.М. и при комнатной температуре (22°С). В день опыта мышей выдерживали в их собственных клетках в течение светлой фазы суток в том же экспериментальном помещении в течение 2 ч для адаптации. В качестве показателя состояния беспокойства (страха) во время каждого опыта оценивали также количество фекальных шариков и капель мочи. Для снижения до минимума ольфакторных меток, сохранившихся с предыдущего опыта, каждое устройство тщательно чистили с помощью 10% этанола после каждого нахождения в нем животного. Уход за животными и все поведенческие опыты осуществляли вслепую, не предоставляя исследователю, осуществляющему уход за мышами, сведений о генотипе и варианте обработки.

1.5.1. Тест на спонтанную локомоторную активность после иммунизации с помощью АС1-И8-01.

Мониторинг спонтанной локомоторной активности осуществляли в камерах из плексигласа, предназначенных для оценки активности (модель МЕИ-ОЕА-М8; фирма Меб А55оаа1е5) (27,9*27,9*20 см), и с использованием программы для мониторинга активности (Асбуйу МопИог, версия 4.3.6). Как описано у Вейсйепко с соавторами (Вейсйепко и др., 2009; Вейсйепко и др., 2007), мышей помещали в центр камеры в условия яркого освещения и осуществляли мониторинг активности в течение 10 мин, проводя три независимых опыта. Определяли средние величины суммарного расстояния, скорости, суммарного времени активности, уровней суммарной активности и вертикальной активности (проявляющейся в виде стойки у животных).

- 15 032494

1.5.2. Задача на узнавание нового объекта после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

При создании изобретения использовали протокол Всуиъ и ВсШссг (Ββνίηδ и ВсШссг. 2006; О'Эо11сг1у и др., 2005): осуществляли тест по научению с одной попытки с использованием несоответствующего образца для изучения опознавательной памяти в отношении двух объектов-образцов, находящихся в одинаковых условиях, оценивая научение и память через 24 ч (отсрочка на 24 ч). Перед тестированием мышам давали адаптироваться в черной камере из плексигласа (31 ><24*20 см) в течение 10 мин в течение 2 последовательных дней в условиях регулирования освещенности окружающей среды. Активность мышей возрастом 8 месяцев при решении задачи по узнаванию регистрировали с помощью видеокамеры. Сначала в камеру помещали два идентичных объекта, согласно описанному ранее методу (Ββνίηκ и ВсШссг. 2006; О'Эо11ег1у и др., 2005). Мышь помещали у середины стены напротив объектов-образцов. После того, как мыши давали в течение 10 мин исследовать объекты, ее возвращали в колонию на 24 ч. Для теста по узнаванию объекта в камеру помещали один известный объект и один новый объект, и мышь вновь вносили в камеру и давали исследовать объекты в течение 3 мин. Узнавание объекта оценивали по одному опыту. Данные получали на основе непосредственного изучения результатов видеонаблюдения. В качестве результатов служили: 1) среднее значение суммарного времени исследования образцов-объектов как нового, так и знакомого, и 2) коэффициент дискриминации (контакт с новым объектом/суммарный контакт с обоими объектами).

1.5.3. Тестирование с использованием Т-лабиринта после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

Для опыта использовали мышей 8-месячного возраста. При создании изобретения для оценки функции гиппокампа применяли модифицированный протокол, предложенный Эеасоп и Яа\\!т<> (Эеасоп и ВаМтк, 2006), и задачу с непрерывным чередованием в Т-лабиринте. Лабиринт был сделан из прозрачного акрилового стекла (плексиглас), как описано у Эеасоп и ΚαΜίηδ, 2006, с дополнительной скользящей дверцей в начале стартового рукава. При выполнении теста мышь помещали в начало исходного рукава спиной к закрытой скользящей дверце. После того, как открывали все дверцы, мышь бежала вдоль стартового рукава, выбирая, либо правый, либо левый целевой рукав. После того, как все четыре лапы мыши входили в один из целевых рукавов, скользящую дверцу, ведущую в другой целевой рукав, закрывали на 5 с, а затем все скользящие дверцы вновь открывали, давая мышам вернуться в стартовый рукав. Активность в Т-лабиринте оценивали до тех пор, пока мыши не завершали 10 чередований. Эту процедуру повторяли в течение 3 последовательных дней, осуществляя в общей сложности 30 опытов. Балл спонтанных чередований определяли как количество чередований направлений поиска слеванаправо и справа-налево, его выражали в виде процента от общего количества возможных чередований в процессе сеанса. Результаты представляли собой средние значения как баллов чередований, так и затраченного времени.

1.5.4. Контекстуальный тест на условно-рефлекторную реакцию страха после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

Для изучения зависящего от страха научения и воспроизведения осуществляли выработку зависящей от контекста (контекстуальной) и сигнала (подсказки) условно-рефлекторной реакции страха. Тест осуществляли с использованием камеры фирмы Сои1Ьоит 1п81гитеп18 (Уайтхолл, шт. Пенсильвания, США). В первый день животных помещали в камеру (контекст А) на 3 мин для оценки исходного уровня, после чего на них воздействовали звуковым сигналом, спаренным с шоковым воздействием. Вызывающий шок электрический импульс (0,5 мА, 2 с) подавали после звукового сигнала (70 дБ, 2 кГц, 20 с) в каждой паре условно-рефлекторный/безусловно-рефлекторный стимул. Во второй день для осуществления опыта с использованием подсказки применяли новую камеру (контекст Б; новое помещение, новое ольфакторное окружение, новая текстура пола, синие пластиковые вставки для стен, дополнительный источник синего цвета и визуальные сигналы). После 3-минутного периода, предшествующего подаче звукового сигнала, на животных воздействовали в течение 3-минутного периода тестирования тремя звуковыми сигналами без шоковых воздействий. В последний день эксперимента мышей помещали в контекст А на 5 мин без воздействия каким-либо условно-рефлекторным или безусловно-рефлекторным стимулом (8ахе и др., 2006). Состояние замирания определяли как полное отсутствие движения в течение как минимум 0,75 с при оценке с помощью программы ЕгеехеРгате (фирма Асйте1г1с8, Эванстон, шт. Иллинойс). Получали данные о проценте замирания в каждый период времени.

1.6. Оценка массы тела и головного мозга после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

После проведения всех поведенческих опытов мышей подвергали глубокой анестезии пентобарбиталом натрия (200 мг/кг, ί.ρ.) (фирма АЬЬой ЬаЬогаЮпек), взвешивали и осуществляли транскардиальную перфузию в течение 1 мин с использованием 0,9% хлорида натрия (10 мл), а затем в течение 10 мин с использованием 4% параформальдегида в 0,1 М ЗФР, рН 7,4 (100 мл). После перфузии немедленно изымали головной мозг. Определяли массу головного мозга (включая обонятельные луковицы, кору, гиппокамп, мозжечок, ствол головного мозга и шейный отдел (С1-С2) спинного мозга). Затем головной мозг помещали в фиксатор и хранили в нем до дальнейшего применения.

1.7. Применение иммунофлуоресценции для выявления воспалительной реакции после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

Срезы головного мозга предварительно инкубировали с 5% обезжиренного молока в 0,1 М ЗФР с

- 16 032494

0,3% Тритон Х-100. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим антителом к коровьему глиальному фибриллярному кислому белку (СТАР) (фирма ΌΑΚΘ, Глоструп, Дания), разведенным в соотношении 1:500, или с поликлональным крысиным антителом к СЭ45 (фирма РНапшпдсп). разведенным в соотношении 1:5000. Осуществляли следующие инкубации (по 1 ч каждая при комнатной температуре): с биотинилированным ослиным антикроличьим вторичным антителом (1:200; фирма 1аскзоп 1ттипоКс8сагс11 ЬаЬз, Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, США) и с конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) стрептавидином (1:500; фирма 1аскзоп 1ттипоВе8еагс1 ЬаЬз). В промежутке между указанными выше инкубациями осуществляли промывку с помощью ЗФР (3 раза, каждый раз по 20 мин). Срезы монтировали на стеклянные предметные стекла для микроскопа и накрывали покровными стеклами, используя 90% глицерина в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. Для контроля специфичности окрашивания антителом отобранные срезы подвергали такому же протоколу обработки, но без первичных антител. Иммунофлуоресценция не выявлена в контрольных срезах. Срезы обследовали и сканировали с помощью конфокального микроскопа ВаФапсе 2000 (фирма Βίο-Ваб, Хартфордшир, Великобритания), присоединенного к флуоресцентному микроскопу ΝίΚοη ЕсНрзе Е800. Лазер представлял собой лазер на смеси газов аргона и криптона с длиной волны возбуждения для ФИТЦ 488 нм (λ). Применяли программу ЬазегЗЬагр (фирма Βίο-Ваб) для создания оптимальных условий для регистрации изображений. Оптимальными условиями для конфокального изображения СТАР-иммунореактивности (1В) или СИ45-1В были следующие: 20-кратные линзы объектива (фирма ΝίΚοη; Р1ап Аро 20х/0.75); мощность лазера 10 или 20%; коэффициент усиления - 34,7; сдвиг - 0,0; масштабный множитель - 3; скорость сканирования - 500 линий/с; каждый оптический срез сканировали трижды и применяли фильтрацию по Калману для уменьшения шума; размер изображения составлял 512x512 пикселей и размер пикселя был 0,48^0,48 мкм.

1.8. Статистический анализ после иммунизации с помощью АС1-Э8-01.

Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (СКО) или среднеквадратичная ошибка среднего арифметического (стандартная ошибка) (8ЕМ). Статистический анализ осуществляли на основе неспаренного двустороннего ΐ-критерия. Вероятность р<0,05 рассматривали как значимую.

Пример 2. Иммунизация с помощью АС1-Э8-01 приводит к образованию антител к мышиному Αβ.

Липосомную вакцину АС1-Э8-01 приготавливали согласно методологии ЗиртаАпйдеп™ (\УО 2005/081872, \УО 2007/068411) с применением тетрапальмитоилированного мышиного пептида Αβ1-15 (Ра1т1-15), Н-Еу8(Ра1)-Еу8(Ра1)-А8р-А1а-61и-РЬе-61у-Н18-А8р-8ег-61у-РЬе-61и-Уа1-Агд-Н18-О1п-Еу8(Ра1)Ьу8(Ра1)-ОН, встроенного в липосомы наряду с монофосфорильным липидом А (МРЬА) (фиг. 1). Шесть доз АС1-Э8-01 вводили подкожно и через две недели самцам мышей линии Т8б5Ип и контрольным мышам соответствующего возраста (линия 2Ν). Анализ плазмы, собранной после 4-й дозы, продемонстрировал присутствие высоких титров 1дО к мышиному А[140 или А[142 у мышей из групп, иммунизированных как Т8б5Ип, так и 2Ν (фиг. 2А и 2Б). Титры индуцированных обработкой вакциной антител оставались повышенными даже через 40 дней после последней иммунизации. Никаких титров не обнаружено у мышей, иммунизированных незагруженной липосомой без антигена (фиг. 2А и 2Б). Таким образом, АС1-Э8-01 обладает способностью нарушать самотолерантность к Ав на мышиной модели Ό8.

Анализировали подклассы 1дО в плазме мышей, иммунизированных АС1-Э8-01, после 4-й иммунизации. Осуществление ЕЬ18А с А[140 позволило установить, что в Т865Ип-группе титры 1дО2а были выше, чем в 2№группе (фиг. 2Г), в то время как не было обнаружено разницы между двумя группами в отношении титров 1дС1 и 1дО2Ь (фиг. 2В и 2Д) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р=0,05). Титры 1дС3 оказались более низкими в Т865Ип-группе (фиг. 2Е) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р<0,001). Титры 1дМ у мышей линии Т865Ип оказались несколько более низкими, но не статистически значимо, по сравнению с мышами линии 2Ν (фиг. 2Ж) (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р=0,05). Аналогичные результаты получали при осуществлении ЕЬ18А с А[142 (данные не представлены).

Маловероятно, что указанные выше более низкие уровни титров некоторых подклассов антител, обнаруженные у мышей линии Т8650п, являются результатом способности мышей линии Т865Ип давать иммунный ответ, поскольку титры 1дС к МРЬА были сопоставимы у всех мышей (фиг. 23).

Пример 3. Иммунизация с помощью АС1-Э8-01 восстанавливает дефицит памяти у мышей линии Т865Ип.

У мышей линии Т865Ип присутствует много признаков присущих Ό8 когнитивных аномалий, таких как нарушение памяти и аномальная активность. Для изучения эффективности вакцины АС1-Э8-01 осуществляли серию поведенческих тестов через 2 недели после последней иммунизации. Мышей подвергали тестированию в следующем порядке: открытое поле, узнавание объекта, Т-лабиринт и условнорефлекторная реакция страха.

Анализ результатов теста в открытом поле продемонстрировал, что мыши линии Т865Ип обладают существенно более высокой спонтанной локомоторной активностью по сравнению с мышами линии 2Ν (данные не представлены). После иммунизации с использованием АС1-Э8-01 мыши линии Т865Ип продолжали сохранять существенно более высокую активность по сравнению с обработанными АС1-Э8

- 17 032494 мышами линии 2Ν (фиг. 3А, неспаренный односторонний 1-критерий; р=0,0004). При изучении в Τлабиринте у мышей линий 2Ν и Τκ65Όη обнаружено отсутствие существенного различия как в отношении баллов чередований, так и затраченного на чередование времени ни до, ни после обработки (данные не представлены).

Способность к пространственному запоминанию оценивали с помощью теста на узнавание объекта (ОКТ). Для мышей линии Τκ65Όη характерен низкий коэффициент дискриминации и поэтому плохая способность к узнаванию нового объекта. После обработки мышей линии Τκ65Όη с помощью АС1-Э8-01 у них обнаружен более высокий коэффициент дискриминации, свидетельствующий о том, что обработка приводит к значительному улучшению памяти (фиг. 3Б, неспаренный односторонний 1-критерий; р=0,03, однонаправленный дисперсионный анализ; генотип, Р=0,12, вакцина, Р=0,002. Взаимодействие (контакт) Р=0,54). Следует отметить, что такие же результаты получены для 2№группы.

Тест на условно-рефлекторную реакцию страха состоял из сеанса по обучению, сеанса с подсказкой и контекстуального сеанса. В процессе сеанса по обучению или сеанса с подсказкой во всех группах был выявлен одинаковый уровень замирания (фиг. 3В). В процессе контекстуального сеанса у мышей линии Τκ65Όη, обработанных незагруженной вакциной (только липосома без антигена), обнаружен более низкий процент замирания, чем у контрольных мышей линии 2Ν. В противоположность этому, у мышей линии Τκ65Όη после иммунизации обнаружена повышенная способность к замиранию, достигающая уровня, сопоставимого с уровнем, обнаруженным у мышей линии 2Ν (неспаренный односторонний 1-критерий; Р=0,04) (однонаправленный дисперсионный анализ, генотип, Р=0,01, вакцина, Р=0,16. Взаимодействие Р=0,33). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация была эффективной и повышала способность к запоминанию у мышей линии Τκ65Όη.

В целом эти результаты свидетельствуют о том, что обработка с помощью АС1-Э8-01 может восстанавливать дефицит памяти у мышей линии Τκ65Όη.

Пример 4. Механизм действия вакцины АС.Ч-Э8-01 в отношении снижения когнитивного дефицита.

Для решения вопроса о воздействии индуцированных АС1-Э8-01 антител на уровень Αβ, осуществляли ЕЫ8А с использованием белковых экстрактов из гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка. Ни в одной из указанных областей не обнаружено существенного различия между уровнями Αβ после обработки с помощью АС1-Э8-01; ни касательно Αβ40, ни касательно Αβ42 (фиг. 4А). Важно отметить, что соотношение Αβ-40/42 в коре и мозжечке статистически значимо коррелировало с более высоким коэффициентом узнавания (К1) (фиг. 4Б и 4В. Кора головного мозга; коэффициент корреляции Пирсона г=-0,3248, Р=0, 0,03. Мозжечок; коэффициент корреляции Пирсона г=-0,4127, Р=0,009). Эти результаты позволяют предположить, что соотношение Αβ-40/42 может быть ответственно за когнитивный дефицит. Дополнительный анализ продемонстрировал, что содержание Αβ42 в плазме находилось на необнаруживаемом уровне. В противоположность этому, повышенный уровень Αβ40 в плазме, по-видимому, должен ассоциироваться с более высокими титрами анти-Αβ 1дС, измеренными в группе мышей линии Τκ65Όη, обработанных ЛС1-Э8-01 (фиг. 4Г; коэффициент корреляции Пирсона г=0,51, Р =0,09). Кроме того, величина К1 коррелировала с титрами анти-Αβ 1дС (фиг. 4Д; коэффициент корреляции Пирсона г=0,3154, Р=0,007).

Эти результаты позволяют предположить, что индуцированные ΑΟ-08-01 антитела могут приводить к клиренсу Αβ из головного мозга в плазму, что, в свою очередь, может приводить к улучшению памяти.

Пример 5. Морфология нейронов в мышиных моделях синдрома Дауна.

Анализировали размер, количество и оптическую плотность холинергических нейронов в основании переднего мозга (ВБСЛ). Два среза, сделанные на уровне ΒΡΟΝ. окрашивали антителом к ΟΙιΑΤ (фирма Мййроге, каталожный № ΑВ144Р, лот № 2010060). Площадь медиальной перегородки (М8) сканировали с помощью конфокального микроскопа для количественной оценки. Рассчитывали следующие параметры: 1) плотность ΟΙιΑΤ'-клеток в М8; 2) площадь индивидуальных ΟιΑΤ'-нейронов и 3) среднюю оптическую плотность Ο1ΑΤ в индивидуальных нейронах. Визуализировали холинергические нейроны в медиальной перегородке и применяли программу 1шаде1 для подсчета количества нейронов, оценки оптической плотности окрашивания и очерчивания площади тела клетки.

Результаты. Количество ΟιΑΤ'-клеток в медиальной перегородке и оптическая плотность оказались сходными у мышей линий 2Ν и Τκ65Όη, обработанных незагруженной вакциной (фиг. 9А и 9Б).

Количество ΟιΑΤ'-клеток в медиальной перегородке оказалось сходным у обработанных ΑΟ-0801 мышей линий 2Ν и Τκ65Όη (фиг. 9Α) (2№незагруженная=27,5±7,2 на срез размером 100 мкм; Τκ65^η-незагρуженная=23,9±7,0; 2N-ΑСI-^8-01=36,6±4,6; Τκ65^η-ΑСI-^8-01=20,9±6,6). Оптическая плотность, характеризующая окрашивание индивидуальных ΟιΑΤ'-клеток в медиальной перегородке, также оказалась сходной у обработанных ΑΟ-08-01 мышей линий 2Ν и Τκ65Όη (фиг. 9Б) (2Νнезагруженная=79,9±3,5 условных единиц; Τκ65^η-незагρуженная=74,7±2,6; 2Ν-ΑΟ-0801=71,9±2,6; ^65011^0-08-01=75,8+4,5). Площадь тела СйΑΤ⁺-клеток в медиальной перегородке оказалась ниже у мышей линии Τκ65Όη по сравнению с мышами линии 2Ν (фиг. 9В). Площадь тела ΟιΑΤ'клеток в медиальной перегородке обработанных ΑΟ-08-01 мышей линии Τκ65Όη оказалась существенно выше по сравнению с обработанными незагруженной вакциной мышами (Τ5650π-\ό1ι) (Τδ65Όη

- 18 032494 незагруженная=179±6 мкм²; Т8650п-ЛС1-Э8-01=201±8. р=0,031). У обработанных ЛС1-Э8-01 мышей линий 2Ν и Тз65Ип обнаружена сходная площадь тела клеток (2Ν-ΑΟ-Ό8-01= 208±8 мкм²; Т865Эп-ЛС1И8-01=201±8, р=0,55) (фиг. 9В). Эти результаты свидетельствуют о восстановлении площади тела клетки у СНЛТ'-клеток в медиальной перегородке после обработки АС1-И8-01. Аналогично этому, результаты свидетельствуют о безопасности вакцины АС1-И8-01, поскольку количество СНЛТ'-клеток не изменялось после иммунизации вакциной. Эти морфологические исследования свидетельствуют о меньшей атрофии нейронов после иммунизации с помощью АС1- Ό8-01, демонстрируя, что вакцину можно применять для предупреждения нейродегенерации.

Пример 6. Безопасность липосомной вакцины АС1-И8-01.

Для решения вопроса о том, может ли иммунизация с использованием ЛСЧ-Э8-01 индуцировать опасность, осуществляли определение веса тела, общие наблюдения и определяли маркеры воспаления. Перед обработкой мыши линии Тз65Ип имели существенно более низкий вес по сравнению с мышами линии 2Ν (дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; р=0,001). Иммунизация не приводила к значимому изменению веса тела (фиг. 5А). Масса головного мозга оказалась сходной во всех четырех группах мышей (фиг. 5А). Результаты иммуногистохимического анализа продемонстрировали отсутствие различия в количестве позитивных по глиальному фибриллярному кислому белку (СР АР) клеток астроглии или СИ45-позитивных клеток микроглии. Полученные результаты оказались сходными для коры головного мозга и гиппокампа (фиг. 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что вакцинация с использованием АС1-И8-01 не индуцировала воспалительный ответ.

Для подтверждения специфичности индуцированных АС1-И8-01 антител осуществляли изучение перекрестной реактивности. Срезы головного мозга мышей линий 2Ν и Тз65Ип окрашивали антисывороткой обработанных АС1-И8-01 мышей линии 2Ν.

В целом указанные результаты свидетельствуют о безопасности вакцины АС1-И8-01.

Пример 7. Общая методология экспериментов с вакцинами АС1-И8-02 и АС1-И8-03.

7.1. Иммунизация вакциной АС1-И8-02 и АС1-И8-03.

Самцов мышей линии Тз65Ип (фирма 1ах 1аЬога1огу В6Е1С38п.ВЫА-Т8(1716)65Ип/Ип1), возраст которых в начале исследования составлял 4±0,3 месяца, иммунизировали путем подкожных (з.с.) инъекций 200 мкл АС1-И8-02 (18,6 мкг на дозу дипальмитоилированного пептида Αβ22-39) (п=6 Тз65Ип-мыши) или ЗФР (п=4 Тз65Ип-мыши). Всего осуществляли четыре инъекции в дни 1, 14, 28 и 42. Через 1 неделю после каждой иммунизации отбирали образцы крови из хвоста; т.е. в дни 7, 21, 35 и 49.

Такую же процедуру осуществляли при иммунизации вакциной АС1-И8-03 (38,6 мкг на дозу Ра1 1429, тетрапальмитоилированный пептид Αβ14-29) (п=7 Тз65Ип-мыши) или ЗФР (п=4 Тз65Ип-мыши).

Мышам из применяемого в качестве контроля приплода (п=7, 2 Ν-мыши), делали такие же инъекции, но с ЗФР.

7.2. Количественная оценка специфических в отношении мышиного Αβ антител.

Определяли ответы в виде специфических в отношении Αβ1-42 1дС с помощью ЕЬ18А. В целом метод состоял в следующем: планшеты сенсибилизировали, используя по 10 мкг/мл человеческого Αβ1-42 (фирма ВасНет Н1368, лот: 1000255), в течение ночи при 4°С. После отмывки с помощью ЗФР-0,05% Твин 20 и блокирования 1% БСА в планшеты добавляли серийные разведения плазмы и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. В качестве положительного контроля применяли антитело к Αβ 6Е10 (антитело 6Е10 фирмы Соуапсе 81С-39320, лот: 09СС01254 пузырек а, 1 мг/мл, разведение 1000/). После отмывки планшеты инкубировали с конъюгированным со щелочной фосфатазой (АР) антимышиным антителом в виде 1дС (фирма .Таскзоп 1ттнпоге8еагсН Вест-Гроув, шт. Пенсильвания, каталожный № 115-055-164, лот 87821, разведение в пузырьке 1/4000) в течение 2 ч при 37°С. После конечной отмывки планшеты инкубировали в течение 2,5 ч с субстратом АР (ρΝΡΡ) и считывали при 405 нм с помощью планшет-ридера для ЕЬ18А. Результаты выражали в виде оптической плотности (ОП).

7.3. Поведенческие опыты.

Всех мышей подвергали одинаковым сериям поведенческих тестов, начиная с возраста около 6±0,3 месяца. Все поведенческие опыты проводили в течение светового дня в период между 7:00 А.М. и 7:00 Р.М. и при комнатной температуре (22°С).

7.3.1. Задача на узнавание пространственного объекта.

Перед тестированием мышей помещали в камеру из серого полипропилена (диаметр 40 см, высота 32,4 см), выдерживали в течение 10 мин без какого-либо объекта в условиях с регулируемым естественным освещением. На следующий день и в процессе сессии по обучению два идентичных объекта (кубики из конструктора Лего или стеклянный черный сосуд) помещали (на 10 мин) на одну сторону лабиринта. Тест на сохранение в памяти осуществляли через 3 ч после обучения, один из идентичных объектов передвигали на противоположную сторону лабиринта и оставляли на 10 мин. Все сеансы регистрировали на видео, используя программу для слежения Е1Ьоу18юп ХТ 8.0. Измеряемые параметры представляли собой среднее суммарное время исследования образца-объекта, как нового, так и известного, и коэффициент дискриминации (контакт с новым объектом/суммарный контакт с обоими объектами).

7.3.2. Задача на запоминание в водном лабиринте.

Для анализа долговременной памяти проводили опыты в водном лабиринте. При проведении теста

- 19 032494 по адаптации мышей помещали в первый день в водный лабиринт (диаметр: 165 см, высота: 64 см) с видимой являющейся внешним стимулом платформой (диаметр 11 см, высота: 37 см). Этот тест состоял из 5 попыток по 120 с каждая с 30-минутным интервалом между попытками. Последнюю 6-ю попытку осуществляли в отсутствии видимой являющейся внешним стимулом платформы. Начиная со следующего дня, мышей подвергали 4-дневным тренировкам со скрытой (погруженной) платформой. Каждый день мышам давали осуществлять 6 попыток по 120 с каждая с 30-минутными интервалами между попытками. В начале опыта мышь погружали в воду, повернув мордой к грани резервуара в одной из стартовых точек (северо-восток, юго-восток, юго-запад и северо-запад). Стартовые точки изменяли от попытки к попытке, в то время как предназначенная для спасения платформа находилась в фиксированном положении (западный квадрант) в течение всего эксперимента. Если мышь находила платформу в течение 120 с, ей давали оставаться на платформе в течение 15 с. Если ей не удавалось найти платформу в течение 120 с, то попытку прекращали и мышь осторожно продвигали к платформе и давали находиться на ней в течение 15 с. Измеряемые параметры включали: продолжительность требуемого для спасения латентного периода (с) в различных частях лабиринта, количество посещений каждого квадранта лабиринта, расстояние (см), на которое животное перемещалось в каждом квадранте, расстояние (см) до целевой зоны, время нахождения (%) в каждом квадранте, время нахождения (%) внутри более широкой окружности вокруг целевой платформы, во время пробной попытки, количество пересечений более широкой окружности вокруг целевой платформы, во время пробной попытки, и скорость (см/с).

7.3.3. Контекстуальный тест на условно-рефлекторную реакцию страха.

Контекстуальный тест и оценку условно-рефлекторной реакции страха осуществляли для изучения зависящего от страха научения и воспроизведения. Тест осуществляли с использованием камер фирмы Ме6 ΑδδοοίαΙοδ 1п81гитеп18. В первый день животных помещали в камеру (контекст А) на 2 мин для оценки исходного уровня, затем на них воздействовали четырьмя звуковыми сигналами, спаренными с шоковым воздействием (условно-рефлекторные стимулы, С8). Вызывающий шок звуковой стимул продолжительностью 30 с (5000 Гц, 80 дБ) заканчивался одновременно с 2-секундным шоковым воздействием электрического импульса на лапу (0,7 мА) в каждой паре условно-рефлекторный/безусловнорефлекторный стимул. На второй день мышей на 5 мин помещали в контекст А без воздействия какоголибо условно-рефлекторного/безусловно-рефлекторного стимула. В последний день эксперимента для теста с подсказкой применяли новую камеру (контекст Б; новое помещение, новое ольфакторное окружение, новая текстура пола, синие пластиковые вставки для стен, дополнительный источник синего цвета и визуальные стимулы). После 2-минутного периода, предшествующего подаче звукового сигнала, на животных воздействовали тремя звуковыми сигналами без вызывающего шок электрического импульса в течение 8-минутного периода тестирования. Состояние замирания определяли как полное отсутствие движения в течение как минимум 0,75 с. Получали данные о проценте замирания в каждый период времени.

7.4. Иммуноокрашивание амилоидных бляшек в образцах головного мозга людей с Ό8 с помощью индуцированных вакцинами ЛС1-О8-02 и ЛС1-Э8-03 антител к Αβ.

Срезы головного мозга людей с Ό8 окрашивали индуцированными вакцинами антителами к Αβ, присутствующими в сыворотке мышей, иммунизированных вакциной ΑΟ-ϋ8-02. Для процедуры иммуноокрашивания применяли пул сыворотки из пяти мышей линии С57ВБ/6, иммунизированных вакциной ΑΟ-Ό8-02, в разведении 1/100. В целом метод состоял в следующем: криосрезы толщиной 10 мкм, полученные из головного мозга человека возрастом 59 лет с Ό8, инкубировали в 4% параформальдегида (фирма 818111:-1^1613011, 252549) в течение 20 мин. После инкубации в 70% муравьиной кислоты (фирма Мегск, 1.00264.1000) и 10% Тритон Х-100 (фирма 81дта, 234729) каждый раз по 15 мин срезы блокировали в течение 2 ч в 10% сыворотки здоровой козы (N08, фирма 1пуйгодеп, 6210072) в ЗФРТ (ЗФР плюс 0,5% Тритон Х-100). Инкубацию с первичным антителом (сыворотка иммунизированных мышей) в ЗФРТ с 10% N08 осуществляли в течение ночи. На следующий день и после промывки в ЗФРА срезы инкубировали с конъюгированным с ΑΓχη Р1иог 488 козьим антимышиным 1дС ЛΓΓ^η^Ρи^е (фирма 1аск8оп 1ттипоК,е8еагск, 115-545-146). Срезы монтировали в РгоЬопд Оо16 (фирма 1пу6годеп, Р36931). В качестве положительного контроля применяли первичное антитело к Αβ 6Е10 (фирма Соуапсе, 8Ю-39320, антитело к Αβ (к Ν-концевой области Αβ, используя разведение 1:10000). Сыворотку мышей линии С57ВЬ/6, иммунизированных ЗФР, применяли в качестве отрицательного контроля. Сыворотку мышей линии С57ВЬ/6, иммунизированных ΑΟ-24, применяли в качестве контроля. Вакцина ΑΟΤ24 соответствует вакцине ΑΟΤΌ8-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ΑΟΙ-24, представляет собой последовательность человеческого Αβ1-15, а вакцина ΑΟ-Ό8-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Αβ1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1).

7.5. Статистический анализ.

Данные представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (СКО) или среднеквадратичная ошибка среднего арифметического (стандартная ошибка) (8ЕМ). Статистический анализ осуществляли с использованием неспаренного двустороннего ΐ-критерия. Вероятность р<0,05 рассматривали как значимую.

Пример 8. Иммунизация с использованием ΑΟ-Ό8-02 приводит к образованию антител к человече

- 20 032494 скому Αβ.

Четыре дозы ΑΟΙ-Ό8-02 вводили подкожно и через 2 недели самцам мышей линии Τδ65Όη, возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2Ν. Анализ плазмы, полученной через 7 дней после введения каждой дозы, позволил определить титры антител в виде 1дС к человеческому Αβ42 в иммунизированных мышах как из Τδ65Όη-, так и из 2№группы (данные не представлены). Титры 1дС у мышей линии Τδ65Όη, иммунизированных ΑΟΙ-Ό8-02, существенно отличались от титров у мышей, иммунизированных ЗФР, в день 21 и 35 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р=0,01 и 0,05 соответственно). Таким образом, вакцина ΑΟΙ-Ό8-02 обладает способностью разрушает самотолерантность к Αβ на мышиной модели Ό8.

Титры 1дМ анализировали в плазме мышей, иммунизированных вакциной ΑΟΙ-Ό8-02. Результаты, полученные с помощью ЕЫ8Л. которые осуществляли с применением Αβ42, продемонстрировали, что в иммунизированной Т§65Оп-группе титры 1дМ оказались выше, чем в группе, иммунизированной ЗФР, в день 7, день 35 и день 49 (однонаправленный дисперсионный анализ, анализ апостериорных сравнений Тьюки; Р<0,01, Р<0,05 и Р<0,01 соответственно, данные не представлены).

Пример 9. Индуцированные ΑΟΙ-Ό8-02 антитела к человеческому Αβ распознают амилоидные бляшки при Ό8.

Эксперимент с использованием иммуноокрашивания продемонстрировал, что индуцированные ΑΟΙ-Ό8-02 антитела связываются с амилоидными бляшками в образцах головного мозга людей с Ό8 (фиг. 6). Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6Е10, поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с окрашиванием антителом, индуцированным ΑΟΙ-24. Вакцина ΑΟΙ-24 соответствует вакцине ΑΟΙ-Ό8-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в ΑΟΙ-24, представляет собой последовательность человеческого Αβ1-15, вакцина ΑΟΙ-Ό8-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Αβ1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1). Никакого окрашивания не обнаружено, когда срез инкубировали с сывороткой мышей, иммунизированных ЗФР. Этот результат свидетельствует о том, что иммунизация с использованием вакцины ΑΟΙ-Ό8-02 индуцирует образование антител, которые распознают амилоидные бляшки в головном мозге людей с Ό8.

Пример 10. ΑΟΙ-Ό8-02 повышает способность к ассоциативному научению в тесте на условнорефлекторную реакцию страха.

При оценке условно-рефлекторной реакции у мышей линии Τδ65Όη, иммунизированных вакциной ΑΟΙ-Ό8-02, выявлена тенденция к повышению уровней замирания после получения каждого условнорефлекторного стимула (фиг. 7А). Повышенный уровень замирания значимо отличался от уровня у иммунизированных ЗФР мышей линии Τδ65Όη только после третьего условно-рефлекторного стимула (С83) (двусторонний дисперсионный анализ, оценка по продолжительности реакции, Р<0,0001, тенденция для вакцины (Р=0,09), апостериорный критерий Бонферрони, Р=0,05 при С83).

Известно, что процесс научения может опосредоваться механизмом, зависящим от синаптической пластичности (1о1ап8еп, 2011). Однако, известно, что ранее приобретенная память о страхе (контекстуальный сеанс, сеанс с подсказкой и сеанс по оценке торможения условного рефлекса) могут опосредоваться различными нейронными механизмами. Полученный результат позволяет предположить, что иммунизация с использованием ΑΟΙ-Ό8-02 улучшает фазу обучения/выработки условно-рефлекторной реакции страха, во время которой происходит научение.

Пример 11. Иммунизация с использованием ΑΟΙ-Ό8-03 индуцирует производство антител к человеческому Αβ.

Четыре дозы ΑΟΙ-Ό8-03 вводили подкожно и через 2 недели самцам мышей линии Τδ65Όη, возраст которых соответствовал возрасту применяемой в качестве контроля линии 2Ν. Анализ плазмы, полученной через 7 дней после введения каждой дозы, позволил определить титры антител в виде ΙβΟ к человеческому Αβ42 у иммунизированных мышей как из Τδ65Όη-, так и из 2№группы (данные не представлены). Титры Ι§0 у мышей линии Τδ65Όη, иммунизированных ΑΟΙ-Ό8-02, существенно отличались от титров у мышей, иммунизированных ЗФР, в день 21 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р=0,05). Таким образом, вакцина ΑΟΙ-Ό8-03 обладает способностью разрушает самотолерантность к Αβ на мышиной модели Ό8.

Титры Ι§Μ анализировали в плазме мышей, иммунизированных вакциной ΑΟΙ-Ό8-03. Результаты, полученные с помощью ΕΕΙ8Α, которые осуществляли с применением Αβ42, продемонстрировали, что в иммунизированной ^65011-^^^ титры Ι§Μ оказались выше, чем в группе, иммунизированной ЗФР, в день 7 и 49 (однонаправленный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Тьюки; Р<0,01, Р<0,05 и Р<0,01 соответственно, данные не представлены).

Пример 12. Индуцированные ΑΟΙ-Ό8-03 антитела к человеческому Αβ распознают амилоидные бляшки при Ό8.

Эксперимент с использованием иммуноокрашивания продемонстрировал, что индуцированные ΑΟΙ-Ό8-03 антитела связываются с амилоидными бляшками в образцах головного мозга людей с Ό8 (фиг. 8). Окрашивание оказалось сходным с окрашиванием, полученным с использованием 6Е10, поступающего в продажу антитела к амилоиду бета, и с окрашиванием антителом, индуцированным ΑΟΙ-24.

- 21 032494

Вакцина АС1-24 соответствует вакцине АС1-Э8-01 с тем отличием, что антиген, применяемый в АС1-24, представляет собой последовательность человеческого Αβ1-15, вакцина АС1-О8-01 содержит в качестве антигена последовательность мышиного Αβ1-15 (три аминокислотных различия в двух указанных антигенах см. на фиг. 1). Никакого окрашивания не было обнаружено, когда срез инкубировали с сывороткой мышей, иммунизированных ЗФР. Этот результат свидетельствует о том, что иммунизация с использованием вакцины АС1-1)8-03 индуцирует образование антител, которые распознают амилоидные бляшки в головном мозге людей с Ό8.

Пример 13. Инфракрасная спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения.

Проводили анализ образцов липосом в виде гидратированной И₂О тонкой пленки, полученной из 15 мкл, высушенной на /п8е-кристалле. Спектры получали с помощью спектрофотометра ВКиКЕК ΤΕΝ8ОК 27, предназначенного для ИК-спектрометрии с преобразованием Фурье (РТ1К), снабженного охлаждаемым жидким азотом детектором из теллурида ртути-кадмия и связанного с устройством ВюАТК-11. Для каждого спектра получали 2000 сканированных изображений с разрешением 2 см^-1 с использованием чистого АТК-кристалла для получения фонового уровня, усредняли и подвергали РТ-преобразованию. Верхний и нижний пределы частоты свертки составляли 4000 см^-1 и 900 см^-1. Камеру для образца постоянно продували высушенным воздухом и все измерения осуществляли при 25°С. Затем зарегистрированные спектры вырезали в области амидной полосы I, корректировали на фоновый уровень и метили. Для выявления перекрывающихся компонентов в широкой амидной полосе I, применяли методы сужения [с использованием второй производной и Фурье-самодеконволюции (Ρ8Ό)]. На основе анализа главных выявленных полос с использованием следующих частотных диапазонов в 1)₂О: β-складка 1613-1637 см^-1, случайная спираль - 1637-1646 см^-1, α-спираль/петли - 1646-1662 см^-1, β-повороты - 16621682 см^-1, антипараллельная β-складка - 1682-1698 см^-1 были сделаны качественные заключения об основной вторичной конформации. Количественный анализ осуществляли путем подгонки кривой с помощью соответствующей прикладной программы, входящей в пакет программ ОРИ8, с использованием полос, идентифицированных в спектрах 2-й производной и Ρ8Ό, в качестве исходных величин для индивидуальных компонентов. Предполагалось, что пики компонентов имели смешанную форму ГауссЛоренцовского типа. Итерационный процесс осуществляли следующим образом: фиксировали частоты и давали возможность варьироваться ширинам, интенсивностям и формам пиков, а затем при осуществлении второго итерационного процесса давали возможность варьироваться также и частотам. Оценки вторичной структуры осуществляли путем расчета % площади, соответствующей всей области амида I для каждой полосы вторичной структуры, исходя из предположения одинаковой абсорбционной способности различных компонентов.

Перечень ссылок

1. Ап1опагак18 8.Е., Ьу1е К., ОеппйгаИз Е.Т., Кеутопб А., ОеиЕсЬ 8.,

Скготозоте 21 ап! άοινη зупдготе: (гот депопйсз (о ра11юр11у81о1оду. Иа!. Κεν.

Степе!. 5, 2004, сс. 725-738.

2. Ва11аг1 С, Оаи(Ыег 8., СогЬеП А., Вгаупе С., Аагз1ап0 Ό., 1опез Е.,

ΑΙζΙιείηιεί'δ с118еа8е. Еапсе!. 377, 2011, сс. 1019-1031.

3. ВеНскепко Ν.Ρ., ВеНскепко Р.У., Ккзсксушкоу А.М., 8а1еЫ Α., Κεενεδ

К.Н., МоЫеуХУ.С., Тке «Όοινη зупдготс сп!1са1 Γε§ΐοη» Ϊ8 зиГйысп! ίη ТЬс тоизс πιοάεΐ 1о сопГег Ьс11ау1ога1, псигор11у81о1о§1са1, апб зупарПс ркспо1урс8 с(1агас1сп811с οίΌολνη зупдготс. 1 ΝειίΓΟδώ. 29, 2009, сс. 5938- 5948.

4. ВеНскепко Р.У., КкзсРсуткоу А.М., 8а1еЫ Α, Ερδΐείη С.1., МоЫсу XV.С.,

8упарПс апс! содпИАе аЬпогтаНПсз ίη тоизс ιηοάεΐδ οίΌολνη зупдготс: ехр1оппд дспо1урс-р11спо1урс гсШюпзЫрз. 1 Сотр. ΝειιΐΌΐ. 504, 2007, сс. 329-345.

5. Βενΐηδ К.А., Всзкссг 1., Окцес! гесодтПоп ίη га18 ап! пнсе: а опе-1па1 поп- та1сЫпд-1о-8атр1с научение 1азк 1о 81и1у 'гесодпайоп тетогу'. Иа!. Рго1ос. 1,

2006, сс. 1306-1311.

6. Оау188оп М.Т., 8с11Ш111 С, Κεενεδ К.Н., 1гутд Ν.Ο., Акевоп Е.С, Наше

В.8., Βκοπδοη К.Т., 8едтеп1а11п8оту а8 а тоиве ιηοάεΐ 1ог Όοινη 8уп1готе. Ргод.

С1т. Βΐοΐ. Κεδ. 384, 1993, сс. 117-133.

- 22 032494

7. Иеасоп К.М., КалуНпз ЕХ., Т-таге аИегпаНоп ίη тИе τοάεηΐ. Хак Ргсйос. 1, 2006, сс.7-12.

8. СШшап.З., Ко11ег М., В1аск К.8., 1епк1пз Б., Опйккз О., Бох Х.С., Е1зпег Б., К1гЬу Б., Воада К.М., БогеБе Г., Огдодого ЕМ., СНшса1 е££ес!з о£ А{Ье1а} 1ттитга1кп (АХ1792) ίη райегйз ν/ίΐΐι Αϋ ίη ап ίηΐεπτιρΐεά 1па1. Хеиго1оду, 2005.

9. Нип1ег С.Б., Βίιηοηΐε-Χείδοη Н.А., Хекоп М., Ескшап С.В., Огап1ю1т А.С., Ве11ау1ога1 апд пеигоЬккдка1 шагкегз о£ АЫ1е1шег'8 сНзеазе ίη Τδ65ϋη Ш1се: е££ес!з о£езкодеп. ХеигоЫок Адшд. 25, 2004, сс. 873-884.

10. 1о11ап8еп I. Р., Саш С.К., Оз1го££Е.Е и ЕеОоих ЕЕ., Мо1еси1аг Мескатзтз о£Беаг Ееагпшд апд Мешогу. Се11 147, 2011.

И. Бее М., Вагд Б., ЫтзопАУоод К., Бее С., Ни К., ОпБГнЬз О., В1аскК.8., Зскепк Ό., 8еиЬег1 Р., АЬе1а42 1ттитга1кп ίη А1гЬе1тег'з сНзеазе депега1ез АЬе1а Х-1егшша1 апБЬодкз. Апп. Хеигок 58, 2005, сс. 430-435.

12. Еешеге С.А., В1изг1а)п 1.К., УатадисЫ Η., ΧνίδηίελνδΗ Т., 8а1до Т.С, 8е1кое ϋ.Ε, Зедиепсе о£ άεροδίΐίοη о£ 11е1егодепеои8 атук1д Ье1а- рерйдез апд АРО Е ίη ϋο\νη зупдготе: 1шрНса11оп8 £ог шШа1 ενεηΐδ ίη атук1д ркцие Гогшайоп. ХеигоЬ1о1 ϋίδ. 3, 1996, сс. 16-32.

13. Еш Б., Огипдке-1дЬа1 I., 1цЬа1 К., Ода У., Топйгалуа К., Оопд С.Х., Тгипсайоп апд асБуайоп о£ сакшеипп а Ьу са1раш I ίη ΑΙζΙιβίπιβΓ сНзеазе Ьгаш. 1. Βΐοΐ. Скет. 280, 2005, сс. 37755-37762.

14. Еш Б., Ыапд Ζ., \Уед1е1 1., Н\уапдУ.\¥., 1_ЧЬа1 К., Огипдке-1дЬа1 I., Катакпзкпа X., Оопд С.Х., Оуегехргеззкп о£Оугк1А соп1пЬи1ез ΐο пеигоПЬпПагу скдепегайоп ϊη ϋοχνη зупдготе. БА8ЕВ 1. 22, 2008, сс. 3224-3233.

15. Мопсаз1ег 1.А., Ртеда К., Μοίτ Κ.Ό., Ей 8., ВиИоп М.А., Οΐιοδίι 1.О., Епсззоп М., 8озс1а 8.Е, Мосо£апезси А., Бо1кег111 Κ.Ό., КоЬЬ К.М., Кизгак Σ.Κ., С1агк ЕЕ, Тапг1 К.Е., Нип1ег Ό.Ο., Οοΐάδΐβϊη Е.Е., ΑΙζΙιείηιετ'δ сНзеазе атук1д-Ье!а Нпкз кпз апд Ьгаш ракокду ίη ϋοννη зупдготе. ΡΕοδ Опе 5, 2010, е10659.

16. Мопзопедо А., Магоп К., го!а V., 8е1кое ϋ.Ε, АУетегН.Е., 1ттипе 11уроге8роп81уепе88 ΐο атукк Ье1а-рерйде ϊη атук1д ргесигзог ρτοΐεϊη Еапздетс тке: 1трНсаЕопз £ог 1Ье ракодепе818 апд 1геа1теп1 о£ ΑΙζΙιείπιετ'δ сНзеазе., изд-во Ргос. Ха11. Асад. 8с1. и. 8. А 98, 2001, сс. 10273-10278.

17. ΧεΐζειΑΥ.Ε, Ροχνείΐ С., Хопд Υ., В1ипде11 1., АУопд Б., Ои££К., Б1а]ок1М., Огеепдагд Р., Еолуеппд Ье1а-атук1д Ιβνβίδ гезсиез научение апд тетогу ίη а ϋολνη зупдготе тоизе тодек ΡΕοδ Опе 5, 2010, е10943.

18. Хко1аи С, ОгеГегак К., Ва1аЬап Т.8., ЕагаПе ЕЕ., Норктз ЮТ., А Нрозоте-Ьазед кегареийс уассше адатз! Ье1а -атук1д ркдиез оп Фе рапсгеаз о£ 1гапздетс ХОКВА тке, изд-во Ргос. Ха11. Асад. 8ск и. 8. А 99, 2002, сс. 23322337.

19. ΟΌοΗετΐγ А., Ки£ 8., МиШдап С, НИдгеФУ., Егппд1оп М.Б., Сооке 8., 8езау А., Модшо 8., Уапез Б., Негпапдег Ό., Бтекап ЕМ., Зкагре Р.Т., Вгапдпег 8., Β1Ϊ88 ТУ., Непдегзоп Ό.Ε, Χίζεΐίο ϋ., ТуЬиклукг У.Е, Б1з11ег Е.М., Ап апеирк1д тоизе зкат саггутд китап скготозоте 21 λνίΐΐι ϋολνη зупдготе р11епо1уре8, изд-во 8скпсе. 309, 2005, сс. 2033-2037.

20. РгазйегУ.Р,. ϋολνη'δ зупдготе, кпдеуйу, апд А1гЬе1тег'з д1зеазе. Вг. 1 РзусЫайу. 162, 1993, с. 711 .

- 23 032494

21. Ргавкег У.Р., Κβνϊβχν оЕ доперегй, пуавЕдпЕпе, §а1ап1апЕпе апд тетапЕпе £ог гИе (геа(теп! оЕ детепЕа ΐη ΑΙζΕεϊιηβΓδ сНзеазе ϊη ади1(8 χνίΐΗ ϋοχνη вупдготе: 1трНсаЕоп8 (ог гИе 1п1е11ес(иа1 сНзаЬШ(у рорикЕоп. ίηΐ. I Оепа(г.

РзусЫа(гу. 19, 2004, сс. 509-515.

22. КаГЕ М.8., Тке ри1зе оЕ дгид деуекртеп! (ог А1г11е1тег'8 Шзеазе. Кеу. КесепЕ С1т. Тпак, 5, 2010, сс. 57-62.

23. 8ахе Μ.ϋ., ВаЕадНа Г., ХУапд Г XV., Ма11еге( О., Оау1д ϋΤ., Мопск1оп ГЕ., Оагс1а Α.Ό., δοίτοηΐβν М.У., Капде1 Е.К., 8ап1агеШ Б., Ней К., Отелу М.К,. АЫаЕоп оЕ Ырросатра1 пеигодепез181тра1гз соп!ех(иа1 Ееаг οοηάΐίΐοηΐηβ апд вупарЕс р1а8(1С1(у ϊη 1ке с1еп!а(е душе, изд-во Ргос. ХаЕ. Асад. δοϊ. и.8.А. 103, 2006, сс. 17501 -17506.

24. 8(ап1оп Б.К, Сое(гее К.ЕЕ, ϋοχνη'δ вупдготе апд детепЕа. В: Адуапсев ΐη РзусЫа(пс Тгеа(тепЕ КеЕ Туре: Оепепс, 10, 2004, сс. 50-58.

25. 8(о1(гпег 8.Е., ОгепЕеП Т.Г, Мой С, ХУ18те\У8к1 К.Е., ХУ18П1е\¥8к1 Т.М., 8е1кое ϋ.Γ, Бетеге С.А., Тетрога1 ассгиа1 оЕ сотр1етеп! ρΓοίβϊηβ ϊη атук1д р1ациев ϊη ϋοχνη'δ вупдготе χνϊΐΐι ΑΙζΕεϊιηεΓδ д1веа8е. Ат. Г Ра(ко1. 156, 2000, сс. 489-499.

26. Тар1о1а Т., δοϊηϊηεη ЕЕ, РйЕИаТ., С8Е 1аи апд АЬе(а42 Ιενβίδ ϊη ра(кп(§ ννϊίΕ ϋοννη'δ вупдготе. Хеигокду. 56, 2001, сс. 979-980.

27. ХУетег Н.Б, Егепке1 Ό., 1ттипо1оду апд 1ттипо(кегару оЕ ΑΙζΕβϊηιεΓδ д18еаве. ХаЕ Кеу. (ттипоЕ 6, 2006, сс. 404-416.

28. Гегпапдег Г., МопвкЕа XV., 2итда Е., Хдиуеп Г, В1апк М., Ма1епка К.С.

и Оагпег С.С., 2007.

29. Наппеу М., Ргавкег V., ХУПНатв X., 1опев Е.Б., Аагв1апд ϋ., СогкеЕ А., Бахугепсе ϋ., Уи Б.М., Тугег 8., Егапс18 Р.Т., ΙοΕηβοη Т., Ви11оск К. и ВаПагд С., МетапЕпе Еог ОетепЕа ϊη Адикв О1дег Ткап 40 Уеагб \ΜϊΐΗ ϋοχνη'δ Зупдготе (ΜΕΑϋΟΧνδ): аКапдот1вед, ОоиЫе-ВНпд, Р1асеко-Соп1го11ед ТпаЕ Бапсе( 379, 2012, сс. 528-536.

30. 8акЫ Α., ϋβΙοΓοϊχ Ι-ϋ., ВеНскепко Р.У., 2кап К., ХУи С., Уа11еЕа Г С.,

Так1то(о-К1тига К., Кквскеуткоу А. М., Заткатигк К., Скипд Р.Р., Х1а ХУ.,У111аг А., СатрЬеП А.XV., Ки1папе Б.8., Νϊχοη К.А., Батк В.Т., Ερβίβϊη С.Г, 8(ок1п О.В., θοΐάδίεϊη Б.8.В., Мокку XV.С., 1псгеабед Арр ΕχρΓβδδϊοη ϊη а Моибе Моде1 οΕϋολνη'δ 8упдготе Όίδίτιρΐδ ХОЕ Тгапврог! апд Саи8е8 СкоЕпег§1с Хеигоп ОедепегаЕоп, Хеигоп, 51, 2006, сс. 29-42.

31. 8а1ек1 Α., Έάϊζϊ М., Со1а8 Ό., Уа11е11а Г, Бадипа Г, Так1то1о-К1тига К., Кквскеуткоу А., ХУадпег 8. Б., Αϊβεη Р., 8каш1оо М., Мокку XV. С., Кев1огаЕоп Хогер1перкппе-Моди1а1ед Соп1ех1иа1 Мешогу ϊη а Мойве Моде1 οΕϋοχνη 8упдготе, 8οϊ Тгапв1 Мед 1, 2009, 7га17.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение Ν-концевого Αβ1-15 антигенного пептида, происходящего из бета-амилоидного белка, для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, где антигенный пептид модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты и встроен в липосому, а у указанного индивидуума с синдромом Дауна еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
2. Применение по п.1, где указанные нарушения памяти и/или когнитивные нарушения представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнако

- 24 032494 мой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
3. Применение по п.1, где указанные нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии у индивидуума с синдромом Дауна представляют собой нарушения или аномалии памяти и/или когнитивные нарушения или аномалии АО-типа.
4. Применение по п.1, где указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой:

(а) индивидуума от молодого до среднего возраста, (б) индивидуума среднего возраста, (в) индивидуума молодого возраста, (г) индивидуума детского возраста.
5. Применение по п.4, где указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
6. Применение по п.1, где антигенный пептид Αβ модифицирован с помощью пальмитиновой кислоты, связанной с Ν- и/или С-концом пептида.
7. Применение по п.6, где антигенный пептид Αβ модифицирован с помощью:

а) 4 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с Ν- и/или С-концом пептида, или

б) 2 молекул пальмитиновой кислоты, связанных с Ν- и/или С-концом пептида.
8. Применение по п.1 для лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, не вызывающее воспалительной реакции.
9. Применение по любому из пп.1-7, где антигенный пептид представлен в виде композиции, содержащей антигенный пептид в терапевтически эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.
10. Применение по п.9, где композиция содержит адъювант.
11. Способ лечения и/или облегчения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.
12. Способ по п.11, в котором указанное нарушение или указанная аномалия представляют собой нарушения опознавательной памяти, и/или нарушения контекстуальной ассоциативной памяти, и/или нарушения ассоциативного научения, и/или нарушения декларативной памяти на факты и события, и/или нарушения эпизодической памяти, и/или нарушения зрительно-пространственного восприятия, такие как неспособность положить предметы в нужное место и сложность ориентации в незнакомой и знакомой местности, и/или апраксию, и/или нарушения усвоения задач на выполнение движения.
13. Способ по п.11, предназначенный для улучшения сохранения или полного восстановления когнитивной способности у индивидуума с синдромом Дауна, предусматривающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10.
14. Способ по любому из пп.11-13, в котором указанный индивидуум с синдромом Дауна представляет собой:

а) индивидуума от молодого до среднего возраста;

б) индивидуума среднего возраста;

в) индивидуума молодого возраста или

г) индивидуума детского возраста.
15. Способ по п.14, в котором указанный индивидуум имеет возраст менее 60, в частности менее 55, в частности менее 50, в частности менее 45, в частности менее 40, в частности менее 35, в частности менее 30, в частности менее 25, в частности менее 20, в частности менее 15, в частности менее 10, в частности менее 5, в частности менее 3 лет.
16. Способ предотвращения нарушений или аномалий памяти и/или когнитивных нарушений или аномалий у индивидуума с синдромом Дауна, включающий введение указанному индивидууму антигенного пептида, как он определен в любом из пп.1, 6, 7, или композиции, как она определена в п.9 или 10, где у указанного индивидуума еще не развились ассоциированные с амилоидным белком бляшки в головном мозге.

- 25 032494 человеческий Αβ:Αβρ-А1а-61и- РНе-Аге-Жз-Азр- 5ег-61у-Туг- б1и-\/а1-Н|5-Н|’5-61п мышиный Αβ: Азр-А1а- С1и-РЬе- 6ΐν- Ηΐβ-Азр- 5ег-61у- РНе- 61 и- Уа1- Аге- Жз- 61 п пальмитоилированный Αβ 1 -15