JP2006512067A - 植物細胞においてｄｎａ配列を発現させるための人工プロモーター - Google Patents

Abstract

本発明は、組換えＤＮＡのキメラ分子を含むことを特徴とする人工プロモーターに関し、そのプロモーターは任意のクラスの植物細胞にいったん導入された場合、その３’末端に融合した任意のＤＮＡ分子の高い発現レベルを促進する。本発明のプロモーター分子の基本的な遺伝子エレメントは、コンセンサスＴＡＴＡボックスを有するプロモーター核、それに続くエキソン／イントロン／エキソン領域及び翻訳活性強化エレメントであり、それらのすべてが人工的に産生される。器官又は組織に特異的時間応答能を有した発現をもたらすために、転写発現調節エレメントをプロモーターの上流に挿入できる。設計された人工遺伝子エレメントを植物細胞における任意の活性プロモーター及び任意のＤＮＡ配列の間に、後者の転写／翻訳レベルを増加させるために機能的に挿入できる。

Description

本発明はバイオテクノロジーに関し、さらに詳細には植物遺伝子工学に関する。詳細には、キメラＤＮＡ構築物を提供し、それらの構築物は双子葉及び単子葉植物の細胞においてそれらの構築物に融合した任意のヌクレオチド配列の高い転写／翻訳プロモーター活性を示し、さらに高発現レベルの目的の遺伝子及びＤＮＡ配列を有するトランスジェニック植物を得ることを可能にする。

植物遺伝子工学は、新しいバイオテクノロジー産物の基礎研究及び商業生産に非常に生産力の高いことが実証された技術である。（Ｈａｍｍｏｎｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９、２４０：１〜１９頁；Ｓｉｍｏｅｎｓ Ｃ．及びＶａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ．、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｐｄａｔｅ １９９５、１：５２３〜５４２頁）。

分子生物学的手法により遺伝子操作された植物に導入された遺伝子又はＤＮＡ配列の強度及び時間的又は空間的特異性に関して十分な発現を保証するプロモーターシグナルの選択は、植物遺伝子工学が成功するために非常に重要である。このような理由から、必要な導入遺伝子のそれぞれの発現を確実にできるプロモーター及びシグナルの探索に多数の努力が過去２０年間に捧げられてきた。このように、種々の起源（植物、ウイルス、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ又はＲｉ、或いはキメラ）のプロモーターが評価され、トランスジェニック植物の産生に採用されてきた。

植物遺伝子操作にさらに広く使用された構成性プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ ＡＲＮプロモーター（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ；Ｎａｇｙ Ｆ；Ｃｈｕａ Ｎ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ １９８５、３１３：８１０〜８１２頁）、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔｉプラスミド由来ノパリンシンテターゼ遺伝子（ｎｏｓ）プロモーター（Ａｎ Ｇ；Ｃｏｓｔａ Ｍ．Ａ；Ｍｉｔｒａ Ａ；Ｈａ Ｓ；Ｍａｒｔｏｎ Ｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｉｓｉｏｌ．１９８６、８８：５４７〜５５２頁）、イネアクチン−１遺伝子プロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ Ｄ；Ｚｈａｎｇ Ｗ；Ｃａｏ Ｊ；Ｗｕ Ｒ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９０、２：１６３〜１７１頁）及びトウモロコシユビキチン−１遺伝子プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ａ．Ｈ；Ｓｈａｒｒｏｃｋ Ｒ．Ａ；Ｑｕａｉｌ Ｐ．Ｈ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２、１８：６７５〜６８９頁）であった。しかし、どの植物クラスにおいても発現レベルが十分に高くないことが主な原因となって、これらの天然発現系にはそれぞれ限界がある。例えばプロモーターの発現が双子葉植物の細胞において低く、単子葉類ではほとんど検出できない一方で、最も広く使用されているプロモーターであるＣａＭＶ ３５Ｓの発現は単子葉植物よりもタバコ細胞においてずっと強い（Ｔｏｐｆｅｒ Ｒ；Ｍａａｓ Ｃ；Ｈｏｒｉｃｋｅ−Ｇｒａｎｄｐｉｅｒｒｅ Ｃ；Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ；Ｓｔｅｉｎｂｉｓｓ Ｈ．Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３、２１７：６７〜７８頁；Ｍｉｔｓｕｈａｒａ Ｉ；Ｕｇａｋｉ Ｍ；Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ Ｈ；Ｏｈｓｈｉｍａ Ｍ；Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｔ；Ｇｏｔｏｈ Ｙら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６、３７：４９〜５９頁）。同様にイネアクチン−１及びトウモロコシユビキチン−１プロモーターは単子葉植物の細胞において下流の遺伝子の転写の促進に極めて効率的であるが、タバコ細胞におけるそのプロモーター活性は低い（Ｓｃｈｌｅｄｚｅｗｓｋｉ Ｋ；Ｍｅｎｄｅｌ Ｒ．Ｒ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４、３：２４９〜２２５頁）。

トランスジェニック植物における異種タンパク質の発現レベルを増加させるために、天然プロモーターを転写又は翻訳エンハンサーと組み合わせた多様なキメラプロモーターが設計された。これらのエンハンサーエレメントの中で、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ翻訳エンハンサー（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ；Ｓｌｅａｔ Ｄ．Ｅ；Ｗａｔｔｓ Ｊ．Ｗ；Ｔｕｒｎｅｒ Ｐ．Ｃ；Ｗｉｌｓｏｎ Ｔ．Ｍ．Ａ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７、１５：３２５７〜３２７３頁）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳エンハンサー（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｊ．Ｃ；Ｆｒｅｅｄ Ｄ．Ｄ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９０、６４：１５９０〜１５９７頁）、オクトピンシンターゼ由来プロモーター転写エンハンサー（Ｆｒｏｍｍ Ｈ；Ｋａｔａｇｉｒｉ Ｆ；Ｃｈｕａ Ｎ．Ｈ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９８９、１：９７７〜９８４頁）、マンノピンシンターゼ由来（Ｃｏｍａｉ Ｌ；Ｍｏｒａｎ Ｐ；Ｍａｓｌｙａｒ Ｄ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０、１５：３７３〜３８１頁）及びＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター由来（Ｋａｙ Ｒ；Ｃｈａｎ Ａ；Ｄａｌｙ Ｍ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７、２３６：１２９９〜１３０２頁）、並びに天然エキソン及びイントロン、例えばトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン１（Ｃａｌｌｉｓ Ｊ；Ｆｒｏｍｍ Ｍ；Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ １９８７、１：１１８３〜１２００頁；Ｌａｓｔ Ｄ．Ｉ；Ｂｒｅｔｔｅｌｌ Ｒ．Ｉ．Ｓ；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎｅ Ｄ．Ａ；Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ Ａ．Ｍ；Ｌａｒｋｉｎ Ｐ．Ｊら、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１９９１、８１：５８１〜５８８頁）、トウモロコシスクロースシンターゼ由来第一エキソン／イントロン（Ｍａａｓ Ｃ；Ｌａｕｆｓ Ｊ；Ｇｒａｎｔ Ｓ；Ｋｏｒｆｈａｇｅ Ｃ；Ｗｅｒｒ Ｗ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１、１６：１９９〜２０７頁）、イネアクチン−１遺伝子由来第一エキソン／イントロン（ＭｃＥｌｒｏｙ Ｄ；Ｂｌｏｗｅｒｓ Ａ．Ｄ；Ｊｅｎｅｓ Ｂ；Ｗｕ Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９１、２３１：１５０〜１６０頁）などを挙げることができる。それにより、２Ｘ３５Ｓ、Ｍａｃ、Ｅｍｕなどのプロモーターが生じ（ＥＰ０４５９６４３、ＥＰ０６５１８１２）、それらは双子葉又は単子葉類の主に特定のクラスの植物細胞において強力である（Ｓｃｈｌｅｄｚｅｗｓｋｉ Ｋ；Ｍｅｎｄｅｌ Ｒ．Ｒ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９４、３：２４９〜２５５頁）。

双子葉及び単子葉植物両方の細胞において遺伝子を発現させるために採用できる強力なプロモーターの開発は、これまでも現在も多くの研究室に関係する問題である。それは、多様なクラスの植物を形質転換するための独特な遺伝子構築物を手に入れるという科学的挑戦やそれが意味する節約のためだけではなく、バイオテクノロジー産物の生産及び商品化をさらに容易にする特有の発現系を手に入れるためでもある。特許出願Ｗ０９９４３８３８において請求された合成プロモーターは、５’末端を３５Ｓプロモーター、トウモロコシユビキチン−１プロモーター及びオクトピンシンターゼプロモーターからの転写エンハンサー配列に融合した、高いＧＣ含量（６４％以上）を有するＴＡＴＡボックスから転写開始部位までの配列を請求した。他方、双子葉及び単子葉植物における発現を探索するだけではなく、配列相同性に依存した遺伝子サイレンシングを避けるために（Ｐａｒｋ Ｙ．Ｄ；Ｐａｐｐ Ｉ；Ｍｏｓｃｏｎｅ Ｅ；Ｉｇｌｅｓｉａｓ Ｖ；Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ Ｈ；Ｍａｔｚｋｅ Ａ；Ｍａｔｚｋｅ Ｍ．Ａ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９６、９：１８３〜１９４頁）、特許出願ＷＯ００５８４８５は２つのウイルスゲノム、すなわちツユクサ黄色斑紋ウイルス（ＣｏＹＭＶ）及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）からの配列並びに３５Ｓプロモーターからのエンハンサー配列の組合せに由来する人工プロモーターを請求している。

種々の遺伝子エレメントがヌクレオチド配列の転写又は翻訳を増強することを可能にするメカニズムはまだ明らかではない。例えば、多くのＲＮＡウイルスからのリーダー配列が、５’末端に融合したキャップ（ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ）の存在と無関係に種々のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を増強できることが報告された（Ｓｌｅａｔ Ｄ．Ｅ；Ｗｉｌｓｏｎ Ｔ．Ｍ．Ａ．１９９２．「Ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｓ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ」、Ｔ．Ｍ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｊ．Ｗ．Ｄａｖｉｅｓ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、５５〜１１３頁；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ；Ｓｌｅａｔ Ｄ．Ｅ；Ｗａｔｔｓ Ｊ．Ｗ；Ｔｕｒｎｅｒ Ｐ．Ｃ；Ｗｉｌｓｏｎ Ｔ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７、１５：８６９３〜８７１１頁）。しかし、これらすべてのウイルスリーダーのＲＮＡ二次構造が複雑でないことを除いて、翻訳エンハンサーの性質を表すために応答するヌクレオチド配列で別の共通エレメントは決定されていない。

具体的には、ＴＭＶオメガ断片の翻訳増強は、繰り返し配列である少なくとも１つのコピーのオクタマーＡＣＡＴＴＴＡＣ及び重大なモチーフと考えられる２５塩基の（ＣＡＡ）ｎ領域の存在によることが報告された（２つのコピーの（ＣＡＡ）ｎ領域は高いエンハンサーレベルを付与するために十分である）（Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ；Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２、２０：４６３１〜４６３８）。しかし、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）リーダーからの富ＣＡ領域である２８塩基は「それ自体では」翻訳エンハンサー活性を示さなかった（Ｐｏｏｇｇｉｎ Ｍ．Ｍ；Ｓｋｒｙａｂｉｎ Ｋ．Ｇ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９２、２３４：３２９〜３３１頁）が、ＰＶＸリーダーのＣＡ領域に存在するＣＣＡＣＣペンタヌクレオチドは、１８Ｓ ｒＲＮＡの３’末端と対形成相互作用を有する可能性があることが報告されている（Ｔｏｍａｓｈｅｖｓｋａｙａ Ｏ．Ｌ；Ｓｏｌｏｖｙｅｖ Ａ．Ｇ；Ｋａｒｐｏｖａ Ｏ．Ｖ；Ｆｅｄｏｒｋｉｎ Ｏ．Ｎ；Ｒｏｄｉｏｎｏｖａ Ｎ．Ｐ；Ｍｏｒｏｚｏｖ Ｓ．Ｙ；Ａｔａｂｅｋｏｖ Ｊ．Ｇ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、７４：２７１７〜２７２４頁）。一部のウイルスリーダーは翻訳エンハンサー活性に関与する配列エレメントを有することが測定され、その配列エレメントには、ジャガイモウイルスＳ（ＰＶＳ）様のカルラウイルスリーダーに保存されているＣＣＴＴＴＡＧＧＴＴ配列（Ｔｕｒｎｅｒ Ｒ；Ｂａｔｅ Ｎ；Ｔｅｗｅｌｌ Ｄ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｇ．Ｄ．、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４、１３４：３２１〜３３３頁）及びアルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）のＲＮＡ３リーダーにおける２７塩基繰り返し領域にみられ、最適な翻訳レベルに達するために２つを必要とするいわゆる内部制御領域２型（ＩＣＲ２）モチーフ（ＧＧＴＴＣＧＡＮＴＣＣ）などがある（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ Ｅ．Ａ．Ｇ；Ｎｅｅｌｅｍａｎ Ｌ；Ｂｏｌ Ｊ．Ｆ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３、２１：１３６１〜１３６７頁）。

ＴＥＶリーダーの場合、それぞれヌクレオチド２８〜６５及び６６〜１１８のＣＩＲＥ−１及びＣＩＲＥ−２と称する２つの領域は、この１４８ｂｐのウイルスリーダーの翻訳増強性を担っていることが明らかにされた（Ｎｉｅｐｅｌ Ｍ；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９、７３：９０８０〜９０８８頁）。しかし、ＣＩＲＥ領域内部でこれらのウイルスリーダーのエンハンサー活性に重大とみなされる特異的エレメントは規定されていない。

上に述べたように、天然起源のイントロン及びその隣接配列は、特にそのイントロンが遺伝子の５’末端近くである場合に、種々の遺伝子発現系を増強するためにも広く採用されてきた。しかし、イントロンの起源、エキソンフランキング領域及び細胞の種類のような要因に依存した遺伝子発現のイントロン介在性増強（ＩＭＥ）が報告されている。発現の強いＩＭＥは主に単子葉植物の細胞で観察されたが、双子葉類ではＩＭＥは通常２〜５倍を超えない。ＩＭＥの分子メカニズムは完全には開示されていない（Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｇ．Ｇ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６、３２：１〜４１頁；Ｓｃｈｕｌｅｒ Ｍ．Ａ．１９９８．「Ｐｌａｎｔ ｐｒｅ−ＭＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ」、Ｊ．Ｂａｉｌｅｙ−Ｓｅｒｒｅｓ ＆ Ｄ．Ｒ．Ｇａｌｌｉｅ編、Ａ ｌｏｏｋ ｂｅｙｏｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ＭＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、１〜１９頁；Ｌｏｒｋｏｖｉｃ Ｚ．Ｊ；Ｋｉｒｋ Ｄ．Ａ．Ｗ；Ｌａｍｂｅｒｍｏｎ Ｍ．Ｈ．Ｌ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００、５：１６０〜１６７頁）。

単子葉及び双子葉植物の細胞の間で観察された発現のＩＭＥの変動は、異なるクラスの植物細胞における十分なプレｍＲＮＡプロセシングに要する要求性の公知の差が原因であり得る。実際に双子葉植物の細胞ではなく単子葉植物の細胞では、イントロン配列における富ＡＵセグメントの存在はプロセシングに欠かせないわけではなく、単子葉植物の細胞は高ＧＣ含量（５０％を超える）及び複雑な二次構造（ヘアピンループ）を有してイントロンをプロセシングでき、このことは双子葉植物の細胞が複雑な二次構造を有するイントロンをプロセシングできないことを示している（Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９１、１０：２６３５〜２６４４頁；Ｌｏｒｋｏｖｉｃ Ｚ．Ｊ；Ｋｉｒｋ Ｄ．Ａ．Ｗ；Ｌａｍｂｅｒｍｏｎ Ｍ．Ｈ．Ｌ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００、５：１６０〜１６７頁）。これらの理由はヌクレオチド配列の発現を人工的に増強するためにＩＭＥを採用している現行の系がどうしてクラス特異的であるかを少なくとも部分的に説明している。

本特許出願において提起された発現プロモーターの配列は、以下の特有の特徴を提供する。１）双子葉及び単子葉植物の細胞において活性であるので、普遍的に機能的であり、高発現レベルの目的遺伝子及び目的ＤＮＡ配列を有する任意のクラスのトランスジェニック植物を得ることを可能にする、２）人工的に集合させた遺伝子エレメントの組合せに基づき、ＩＭＥによるだけでなく翻訳も促進してｍＲＮＡレベルを増加させる、３）本プロモーターが天然又はウイルス遺伝子と同一の配列を有する長鎖ＤＮＡ断片を欠くことは、ＲＮＡが介在する相同遺伝子サイレンシングのリスク及びｉｎ ｐｌａｎｔａの相同組換えの結果としての新しいウイルス品種又はウイルス株が出現する可能性を最小限にする、４）ＴＡＴＡボックスから転写開始部位までの配列のＧＣ含量は必ずしも高くなくともよい、５）我々のプロモーター配列の汎用性は５’末端に転写調節エレメントを挿入することを可能にし、このことは発現に時間、器官又は組織特異性を付与する、６）それを有する人工遺伝子エレメントを、植物細胞において活性な任意のプロモーター及び任意のＤＮＡ配列の間にも機能的に挿入でき、その転写／翻訳を増加できる。

任意のクラスの植物細胞においてｍＲＮＡの蓄積を大きく増強する活性を有するキメラエキソン／イントロン／エキソン領域の設計、及びそれの人工翻訳エンハンサーへの機能的組み込みは、本特許出願の２つの本質的要素を構成している。それは、これらのエレメントにより植物細胞に任意の目的ＤＮＡ配列を効率的に発現することが可能になるからである。

我々が領域、分子又はＤＮＡ配列が人工又はキメラであると称する場合、我々はそれがｉｎ ｖｉｔｒｏで設計及び合成されたため、その配列の小断片は天然起源を有し得るが、その配列は同一の一次ＤＮＡ構造を有する遺伝子エレメントではまったくないことを言及していると明らかにしておくことは重要である。

発現のＩＭＥを促進できる、対応する隣接エキソン配列を有するイントロンを設計するために、我々はどの配列モチーフ及び遺伝子構成要素が報告された転写エンハンサー活性を有する植物イントロンに共通であるかを研究した。同時に、ＧＣ含量には依存せずに双子葉及び単子葉植物においてこのイントロンの十分で効率的なプロセシングを達成するという挑戦を決意しなければならなかった。

転写エンハンサーとして広く使用されているプロモーターであるイネアクチン−１、トウモロコシユビキチン−１及びスクロースシンターゼ−１のイントロン配列を比較した場合、それらのすべてに共通の繰り返し配列モチーフを検出できる（図１）。これらのイントロンが付与する遺伝子発現のＩＭＥにこれらのモチーフが果たす責務はまったく実証されないが、これらの領域、及び多様な植物プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスの５’領域においてＣＴＣＣモチーフ（又はその相同配列であるＣＴＣ、ＴＣＣ及びＴＣ）の保存レベルが高いことは、それがＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を促進できる転写因子の結合に有利であり得るという可能性を示している。同時に、第一エキソン（翻訳されないｍＲＮＡ非翻訳リーダーとして残る領域）及び報告された翻訳エンハンサー活性を有するウイルスリーダーにおける富Ｃ及びＡ配列の存在度並びに保存は、そのような配列が生じるＭＲＮＡの安定性及びそれが翻訳される能力を促進できることを示している。

上に説明した理論のうちどれも完全な科学的実証をもたない。このように、特定の繰り返し配列モチーフを含む隣接するエキソン配列を有する人工イントロンの構築は、ｍＲＮＡの高い転写レベル及び蓄積を促進する領域を生じることは明白ではないが、我々の研究の結果はこれを示していることを強調するのは評価される。

（対応するエキソンを有する）異なるイントロンの間のすでに言及した比較研究から、我々が遺伝子発現のＩＭＥに関連性があると考えたモチーフに富むイネアクチン−１及びトウモロコシユビキチン−１のイントロン／エキソン配列断片を組み合わせた人工エキソン／イントロン／エキソン領域を設計することを決意した。この目標を達成するために、双子葉植物の細胞にも遺伝子発現の増加を起こすことができるためには、生じる人工イントロンがこれらのクラスの植物で効率的にプロセシングされなければならないことを考慮に入れなければならなかった。それにもかかわらず、最初の物質として我々が使用したイントロン配列は高いＧＣ含量及び豊富なヘアピンループを有する複雑な二次構造を有し、そのＡＧアクセプターの３’スプライシング部位の配列は分岐点のコンセンサス配列とは幾分異なることから、これらのイントロンは双子葉植物の細胞でプロセシングが困難なおそれがあることを我々は発見した。

我々が設計したエキソン／イントロン／エキソンの二次構造を簡単にしていかなるクラスの植物細胞においてもプロセシングできるようにするために、我々はその配列にいくつかの規則的な変化を作り、配列のプロセシングを活性化するＵＵＵＵＵＡＵ様配列を挿入することを決意した（Ｇｎｉａｄｋｏｗｓｋｉ Ｍ；Ｈｅｍｍｉｎｇｓ−Ｍｉｅｓｚｃｚａｋ Ｍ；Ｋｌａｈｒｅ Ｕ；Ｌｉｕ Ｈ．Ｘ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６、２４：６１９〜６２７頁）。さらに、我々のキメラ配列を第二エキソンに融合させ、双子葉類（例えばタバコ）における効率的なプロセシングを利用してトウモロコシアクチン−１遺伝子の第二イントロン（ＩＶＳ２）に挿入した（Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ；Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ Ｗ．、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９１、１０：２６３５〜２６４４頁）。それぞれの人工エキソン／イントロン／エキソン変異体の推定二次構造をＰＣＦＯＬＤ４．０プログラムを用いたコンピュータ法で検討した（Ｚｕｋｅｒ Ｍ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８９、１８０：２６２〜２８８頁）。我々が創作した人工エキソン／イントロン／エキソン配列を本時点からＡＲＴと称する。

すでに言及したように、本特許出願の第二の関連構成要素は、遺伝子発現レベルを増加させるためにキメラエキソン／イントロンの下流に融合させた人工翻訳エンハンサーである。

いくつかのウイルスのリーダーで形成した配列及び二次構造の分析から人工翻訳エンハンサーを設計した。この分析から我々は翻訳エンハンサーには３つの本質的な構成要素があると結論する：１）複雑性の低い二次構造、２）富Ｃ及びＡ配列セグメント、３）コンセンサスＨＣＡＹＹＹ配列（Ｈ＝Ｃ又はＵ又はＡ；Ｙ＝Ｃ又はＵ、表１参照）と８３％までの相同性を有し、露出し、繰り返しが頻繁で、かつ／又は低融解温度の尾部を有するヘアピン構造をとるモチーフ。

表１．いくつかのＲＮＡウイルスのリーダー断片において構造が保存された配列（Ｈ＝Ｃ／Ｕ／Ａ、Ｙ＝Ｃ／Ｕ）

上に指摘した前提から、我々はそれぞれヘアピンループ構造をとるＨＣＡＹＹＹ様配列を４５塩基の富Ｃ及びＡ配列に挿入した人工翻訳エンハンサーを設計した。この人工翻訳エンハンサーは、その調製に採用された理論的前提を提供したＲＮＡウイルスのリーダーと５５％を超えない相同性を有し、６個を超えるヌクレオチドと１００％の相同性を有する配列セグメントはまったく存在しない。この理由から、我々の翻訳エンハンサーは以前に報告又は保護された（ＥＰ０２７０６１１）いかなる翻訳エンハンサーの誘導体でもなく、それらから直接誘導された配列も有さないことを我々は断言できる。

操作及び目的遺伝子の融合をさらに容易にするために、我々の翻訳エンハンサーに制限部位を付加した。最終的に、我々が創作した人工エキソン／イントロンに新しい翻訳エンハンサーを融合する前に、キメラ遺伝子の発現を増強する能力がＴＭＶオメガ断片と比べて同じであることを示し、そのキメラ遺伝子の機能性はｉｎ ｖｉｖｏであった。我々が創作した人工翻訳エンハンサーはＥｕｒｅｋａと称する（図２）。

本特許において請求されたプロモーター配列を構築するために、コンセンサスＴＡＴＡボックスにより形成されるコアプロモーター（Ｊｏｓｈｉ Ｃ．Ｐ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７、１５：６６４３〜６６５３頁）を最初に設計し、それをＣａＭＶ ３５Ｓの（転写開始部位から）−２４〜−４領域に融合させ、次に転写開始部位並びに富Ｃ及びＡ領域をもたらすアクチン−１の−５〜＋２７プロモーター領域に融合させた。転写開始部位からの＋２６〜＋７２であるトウモロコシユビキチン−１領域を下流に融合させ、富ＡＣ領域及び富ＴＣ領域をもたらし、第一人工エキソンを得、それをトウモロコシアクチン−１のＩＶＳ２イントロンの５’スプライス部位前の１２塩基であるトウモロコシアクチン−１第二エキソン及びＩＶＳ２イントロン自体と連結した。ＲＮＡの成熟に影響し得る推定二次構造を避けるために、コンピュータ法の予測にしたがってこの結合の周辺に塩基の変化、付加又は欠失を作製した。我々が設計した人工イントロンは、ＩＶＳ２イントロンの最初の５４塩基が、転写開始部位からの塩基＋８９〜＋１２６に対応するトウモロコシユビキチン−１の第一イントロンの５’領域からの３７塩基に融合し、次にイネアクチン−１の第一イントロンからの３７５塩基（この転写開始部位から位置＋１０３〜＋４７７）が続き、トウモロコシユビキチン−１のイントロンの３’末端からの３３塩基（転写開始部位から位置＋１０５１〜１０８３）に融合し、アクチン−１のＩＶＳ２イントロンの後半（３’プロセシング開始部位から位置−５２〜＋５）並びに制限部位及び翻訳開始コンセンサス配列を含む２９塩基のキメラ配列と連結したものから構成される（Ｌｕｔｃｋｅ Ｈ．Ａ；Ｃｈｏｗ Ｋ．Ｃ；Ｍｉｃｋｅｌ Ｆ．Ｓ；Ｍｏｓｓ Ｋ．Ａ；Ｋｅｒｎ Ｈ．Ｆ；Ｓｃｈｅｅｌｅ Ｇ．Ａ．、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．１９８７、６：４３〜４８頁）。我々が創作した人工エキソン／イントロン／エキソンであるＡＲＴの配列を図３に示す。構築された人工エキソン／イントロン／エキソンの効率的なプロセシングを、タバコ細胞及びイネ細胞の両方における一過性発現によりいったん試験してから、その３’末端に翻訳エンハンサーＥｕｒｅｋａを融合した。図４に本発明のプロモーター配列物（ＰＡＲＴＥプロモーター）の最終構造がみられる。

我々が設計したエンハンサーエレメントであるＡＲＴは、通常使用されているイネアクチン−１遺伝子の第一エキソン／イントロン／エキソンよりも遺伝子発現エンハンサーとして高い効率を示したことを強調しなければならない。Ｅｕｒｅｋａ断片はＡＲＴの活性の追加のエンハンサーである。

本研究において任意のクラスのトランスジェニック植物細胞において任意のＤＮＡ配列の発現を増強する、２つの非常に効率の高い人工遺伝子エレメントを初めて成し遂げることができ、このことは我々が基づいている理論的指針の妥当性を実証している。ＡＴ含量が５２％を下回る人工プロモーターが双子葉植物の細胞において十分にプロセシングされ、発現の高いＩＭＥを促進することも最初である。ＡＲＮウイルスのリーダーとの相同性が低い、完全に人工の、高効率翻訳エンハンサーの構築も新規である。

種々の転写エンハンサー配列を本発明のプロモーター配列物の５’に融合した。このように、図５に示すようにイネアクチン−１領域の（転写開始部位から）−４３〜−３１０がプロモーターＰＡＲＴＥの５’末端に融合され、プロモーター領域ＡＰＡＲＴＥが形成し、これにａｓ−１様転写エンハンサーエレメント（Ｂｅｎｆｅｙ Ｐ．Ｎ；Ｃｈｕａ Ｎ．Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２５０：９５９〜９６６頁）及びトウモロコシユビキチン−１プロモーターの５’領域からの５５６塩基断片（転写開始部位から−２９９〜−８５５）も有する、Ｕ３ＡＲＴＥプロモーターを最終的に得、その構造を図６に示す。

記載された遺伝子エレメントから多くのプロモーター配列変異体を構築し（図７参照）、採用されたすべてのエンハンサー領域及びアクチベーター領域の遺伝子発現にわたり相乗効果をもたらすことから、それらのすべてにおいてｉｎ ｖｉｖｏアッセイによりその機能性が実証された。

転写エンハンサーとして我々の構築物に採用されたａｓ−１エレメント（図６参照）は、オクトピンシンターゼのパリンドロームエンハンサーと５０％未満の相同性を有することから革新的な設計を有し（Ｅｌｌｉｓ Ｊ．Ｇ；Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ Ｄ．Ｊ；Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．Ｃ；Ｄｅｎｎｉｓ Ｅ．Ｓ；Ｐｅａｃｏｃｋ Ｗ．Ｊ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１９８７、６：３２０３〜３２０８頁；ＥＰ０２７８６５９）、Ｅｌｌｉｓら（Ｂｏｕｃｈｅｚ Ｄ；Ｔｏｋｕｈｉｓａ Ｊ．Ｇ；Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ Ｄ．Ｊ；Ｄｅｎｎｉｓ Ｅ．Ｓ；Ｅｌｌｉｓ Ｊ．Ｇ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１９８９、８：４１９７〜４２０４頁；米国特許第５８３７８４９号）によりなされた研究において請求されたこの種の配列変異体のいずれとも同一でなく（同一性８５％未満）、それにみられるＴＧＡＣＧモチーフは独特なフランク配列に関連して見出される。

イネアクチン−１遺伝子はすでに記載され、種々の遺伝子の発現に使用されたが（ＭｃＥｌｒｏｙ Ｄ；Ｚｈａｎｇ Ｗ；Ｃａｏ Ｊ；Ｗｕ Ｒ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９０、２：１６３〜１７１頁；Ｗ０９１０９９４８）、我々の研究はその５’領域の転写エンハンサー活性及び異種発現エンハンサーとしてのその使用を明らかにしていることを強調しておくことが重要である。同様に、トウモロコシユビキチン−１の５’転写エンハンサー領域の使用が請求された（ＥＰ０３４２９２６）が、我々が採用した５５６塩基の断片はこのエンハンサーの機能性に必須であると規定された「熱ショック」エレメント（このプロモーター配列の位置−１８８〜−２１４の間にみられる）を含まないことから、この断片は独特であり我々が使用したユビキチン配列の転写エンハンサー活性は不要とならない。

ＰＡＲＴＥプロモーターはイネｇｌｕＢ−１遺伝子の転写開始部位から−３１〜−２４５領域に対応する小さな２１４塩基断片にも融合され（Ｔａｋａｉｗａ Ｆ；Ｏｏｎｏ Ｋ；Ｋａｔｏ Ａ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１、１６：４９〜５８頁）、新しいプロモーター領域であるＧＡＲＴＥ（図８）が形成した。一過性発現アッセイは、この新しい人工プロモーターＧＡＲＴＥが種子内乳に高効率でＤＮＡ配列を発現することを実証している。

このように、これらのキメラ５’転写エンハンサーの機能的組合せが新規性を有し、植物が属するクラスとは無関係にその植物の細胞におけるＤＮＡ配列の高い発現レベルの達成を可能にして、遺伝子エレメントの産生に極めて有用であると結論する。

種々のプロモーターからの他の５’調節因子領域を、高い発現レベルを達成するために、かつ／或いは発現に時間特異性、器官特異性又は組織特異性を付与するために本発明の物体に明らかにｃｙｓ融合できる。

遺伝子工学技術の経験者にとっては、本明細書に記載した事柄により、植物細胞においてＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａエンハンサーを任意の転写プロモーターエレメントと組み合わせて使用して、単子葉又は双子葉植物の細胞において任意のＤＮＡ配列の転写／翻訳を増強することが可能となる。同様に分子生物学技術の経験者は、我々の観察から得られたＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａの設計に我々を導いた理論的指針を採用し、植物細胞において新しいＤＮＡ発現エンハンサー配列を構築することができる。

過去２０年間における植物遺伝子工学の高まる開発を考慮すると、任意の遺伝子及び転写終結配列と連結した本発明のプロモーター物を植物細胞遺伝子形質転換ベクターに挿入でき、確立した効率的な方法の使用により目的遺伝子を発現できるトランスジェニック植物を得ることができることは明白である。

本特許出願において、遺伝子形質転換ベクターはそれに予め挿入された任意のＤＮＡ断片を植物細胞に導入するための運搬媒体として役立つ（精製されたか、或いは細菌細胞又はウイルス内部に含まれる）ＤＮＡ分子を称する。

微生物の寄託
プラスミドｐＣ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＧＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−Ｕ３ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔを微生物保護のためのブダペスト条約に基づいてベルギー共同微生物プラスミド保存機関（ｔｈｅ Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ， Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ）、ゲント大学、「Ｆｉｅｒｓ−Ｓｃｈｅｌｌ−Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ」ビル、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ９２７、Ｂ−９０５２ Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、ベルギーに寄託した。プラスミドｐＣ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＧＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔの寄託番号はそれぞれＬＭＢＰ４７２７、ＬＭＢＰ４７２５、ＬＭＢＰ４７２８、寄託日は２００３年５月１９日であり、ｐＣ−Ｕ３ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔの寄託番号は４７９１で寄託日は２００３年１１月２５日である。

実施例１：植物細胞にＤＮＡ配列を発現させるための新しいキメラ系の構成エレメントの構築
正確なクローニングを容易にするために種々のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの制限部位に対する接着末端を有するようにすべての合成ＤＮＡ断片を創作した。

ａ）Ｅｕｒｅｋａ翻訳エンハンサーのクローニング
翻訳エンハンサーＥＵＲＥＫＡ（配列番号１）に対応する８６塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片を、合成ＤＮＡ断片の設計に含めた制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｃＩに対する接着末端を利用して予め両酵素で分解したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）にクローニングした。生じたプラスミドをｐＢＳ−Ｅｕｒｅｋａと名付けた。

ｂ）人工エキソン／イントロン／エキソン領域ＡＲＴの集合
人工エキソン／イントロン／エキソン領域であるＡＲＴを、設計したＤＮＡ断片のクローニング及び前後の集合により構築した。まず、コアプロモーター、第一エキソン及び人工イントロンの一部を含むＰ３５ＡｃＵと名付けたＤＮＡ合成断片（配列番号２）を、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で分解したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクターにクローニングし、プラスミドｐＢＳ−ＡｃＵを得た。その後に、そのプラスミドをＳｐｅＩ及びＳａｃＩで分解し、人工イントロンの一部をコードするＤＮＡ合成断片Ｉ−Ｕ／Ａｃ（配列番号３）をそれに挿入した。このようにしてｐＢＳ−ＡｃＵＡｃプラスミドを得た。

次に、人工イントロンの末端を保有するＤＮＡ合成断片Ｉ−Ａｃ／Ｕ（配列番号４）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで分解したｐＢＳ−ＡｃＵＡｃプラスミドに挿入し、プラスミドｐＢＳ−ＡｃＵＡｃＵを産生させた。

断片ＩｎｉＴ（配列番号５）を、ＳｐｅＩ／ＳａｃＩで分解したｐＢＳ−ＡｃＵＡｃＵに挿入したときに、プラスミドｐＢＳ−ＡＲＴを一致させる人工エキソン／イントロン／エキソンであるＡＲＴが完成した（配列番号６）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターの制限部位ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩの間の一次構造を配列番号７の配列に示す。

ｃ）ＰＡＲＴＥプロモーターの構築
本発明のプロモーター配列物（ＰＡＲＴＥプロモーター）を構築するために、コアプロモーター及び（３’領域を有さない）エキソン／イントロン／エキソン領域ＡＲＴを含むＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ分解によりｐＢＳ−ＡＲＴプラスミドから得、それを同酵素で分解したｐＢＳ−Ｅｕｒｅｋａプラスミドに挿入した。このように、我々はプラスミドｐＰＡＲＴＥ（図４、図７Ｄ）を実現し、そのＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位の間の配列を配列番号９の配列に示す。

実施例２：植物細胞におけるＥｕｒｅｋａ及びＡＲＴエンハンサーエレメントの機能性の実証
ａ）タバコ細胞における翻訳エンハンサーＥｕｒｅｋａの機能性
タバコ及びイネ細胞におけるＥｕｒｅｋａのエンハンサー力を証明するために、一連の補助遺伝子構築物を作製した。

ＳｎａＢＩ部位に挿入されたジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子のＩＶ２イントロンを有するレポーター遺伝子ｕｉｄＡ（ＧＵＳｉｎｔ）を、プラスミドｐＵＣ−ＧＵＳｉｎｔのＮｃｏＩ／ＳａｃＩ分解により得（図９）、プラスミドｐＢＳ−Ｅｕｒｅｋａの同部位にクローニングし、ベクターＰｂｓ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔを生成させた。これをさらに制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで分解し、Ｓ−１ヌクレアーゼで処理してプラスミドｐＢＳ−ΔＥＵＲＧＵＳｉｎｔを得た。それをＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで分解してＧＵＳｉｎｔ遺伝子に融合したＥｕｒｅｋａエンハンサーを含むＤＮＡ断片を得て、それをｐＢＰＦΩ（オメガ）７ベクター（図１０）に挿入した。このように、我々はｐＢＰＦ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔベクター（図７Ａ）を得た。そのベクターはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（１．３ｋｂ版）、Ｅｕｒｅｋａエンハンサー及びアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｎｏｓ遺伝子転写終結シグナル（ｔＮＯＳ）の制御下でＧＵＳｉｎｔ遺伝子を発現する。

構築物ｐＢＰＦ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔの発現を評価するための対照として、ＳａｌＩ／クレノウ及びＫｐｎＩ分解によりプラスミドｐＵＣ−ＧＵＳｉｎｔから得られたＧＵＳｉｎｔ遺伝子を、ｐＢＰＦΩ（オメガ）７ベクターのＳｍａＩ及びＫｐｎＩ部位の間にクローニングすることでプラスミドｐＢＰＦΩ（オメガ）−ＧＵＳｉｎｔを構築した。このプラスミドは、Ｅｕｒｅｋａの代わりにＧＵＳｉｎｔを制御している翻訳エンハンサーΩ（オメガ）が存在することを除き、ｐＢＰＦ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔに類似している。別の対照プラスミドを、ＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ分解によりプラスミドｐＢＰＦΩ（オメガ）−ＧＵＳｉｎｔのエンハンサーオメガを除き、クレノウにより処理し、プラスミドの自己連結を行うことにより構築し、ｐＢＰＦ−ＧＵＳｉｎｔベクターを得た。

プラスミドｐＢＰＦΩ（オメガ）−ＧＵＳｉｎｔ、ｐＢＰＦ−ＧＵＳｉｎｔ、及びｐＢＰＦ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔをＨｉｎｄＩＩＩで分解して、植物においてＧＵＳｉｎｔを発現させるためのカセットを得た。これらをＨｉｎｄＩＩＩで分解したバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００にクローニングし、それぞれバイナリーベクターｐＣ−Ω（オメガ）７ＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−ＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔを生成させた。

得られたバイナリープラスミドをＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入し、我々は、Ａｎら（Ａｎ Ｇ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８５、７９：５６８〜５７０頁）が記載したプロトコルを幾分修正したものにしたがってＮＴ１タバコ細胞において一過性発現実験によりエンハンサーＥｕｒｅｋａの機能性のアッセイを始めた。タバコ細胞を、各バイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムと４日間共培養した後で、細胞を回収し、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．１９８８．「Ｐｌａｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ：ｔｈｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２４７〜２６３頁）が記載したように処理し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を測定した。各実験を３回繰り返し、各回に各構築物につき５回の繰り返しを行った。結果を以下の表に示す。

表２．タバコ細胞における翻訳エンハンサーＥｕｒｅｋａの機能性の実証

表２に示す結果にみられるように、Ｅｕｒｅｋａのエンハンサー活性はＴＭＶオメガリーダー配列のエンハンサー活性と有意差をもたない。このことは完全に人工の効率的な翻訳エンハンサーを最初に実現したことを実証している。このことは、Ｃ及びＡに富む配列の領域をモチーフＨＣＡＹＹＹ（Ｈ＝Ｃ／Ｔ／Ａ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）と相同の配列と組み合わせることにより３’方向下流に融合したＤＮＡ配列の翻訳を増強させる重大な性質を有する遺伝子エレメントを構築することが可能であることを示し、我々の理論的指針も確認している。

ｂ）タバコ細胞における人工エキソン／イントロン／エキソンＡＲＴの機能性
タバコ細胞におけるＡＲＴエレメントの機能性を試験するために、プラスミドｐＵＣ−ＧＵＳｉｎｔからまずＧＵＳｉｎｔ断片を得、それをＮｃｏＩ−ＳａｃＩで分解し、同酵素で分解したｐＢＳ−ＡＲＴにクローニングしてプラスミドｐＢＳ−ＡＲＴＧＵＳｉｎｔを得た。次に、このプラスミドをＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩで分解しＳ１ヌクレアーゼで処理してｐＢＳ−ΔＡＲＴＧＵＳｉｎｔを得、それをＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで分解してＡＲＴＧＵＳｉｎｔ断片を得、同酵素で分解したベクターｐＢＰＦΩ（オメガ）７−ＧＵＳｉｎｔにクローニングし、プラスミドｐＢＰＦＡＲＴＧＵＳｉｎｔ（図７Ｂ）を得た。ここで、ＧＵＳｉｎｔ発現はＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（１．３ｋｂ版）、人工エキソン／イントロン／エキソン領域であるＡＲＴ、及びＡ．ツメファシエンスｎｏｓ遺伝子転写終結シグナル（ｔＮＯＳ）の制御下にある。

プラスミドｐＢＳ−ΔＡＲＴＧＵＳｉｎｔからＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ分解によりエレメントＡＲＴを含むバンドを得、それを同酵素で分解したｐＢＳ−ＥＵＲＧＵＳｉｎｔベクターに融合させプラスミドｐＢＳ−ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔを得た。これからＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ分解によりＧＵＳｉｎｔ遺伝子を遺伝子エレメントＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａのシグナル下に置くためのＤＮＡ断片を得、同様に分解したｐＢＰＦΩ（オメガ）７ベクターに導入しｐＢＰＦＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔプラスミドを産生させた（図７Ｃ）。

プラスミドｐＢＰＦＡＲＴＧＵＳｉｎｔ及びｐＢＰＦＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔをＨｉｎｄＩＩＩで分解し、植物にＧＵＳｉｎｔを発現させるためのカセットを得た。これらをバイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００にクローニングし、バイナリープラスミドｐＣ−ＡＲＴＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔをそれぞれ生じさせた。

得られたバイナリープラスミドをアグロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した後に、我々は本実施例の（ａ）項に述べたようにＮＴ１タバコ細胞を用いた一過性発現アッセイにおいて翻訳エンハンサーＥｕｒｅｋａの機能性のアッセイを始めた。得られた結果を表３に示す。

表３．タバコ細胞における遺伝子エレメントＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａの機能性の実証

タバコ細胞におけるＡＲＴの機能性評価の結果は、人工イントロンが双子葉植物の細胞において正確にプロセシングされ、発現エンハンサー活性を保持することを明らかにした。我々の実験結果は構築物ｐＢＰＦＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔにおけるＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａエレメントの間の相互作用から得られた発現レベルに及ぼす正の相乗作用も示し、ここで公知の天然プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓの発現能が５倍に増加する。

設計された人工遺伝子エレメント（ＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａ）を、植物細胞において活性な任意のプロモーター（この場合ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）及び他の任意のＤＮＡ配列（我々の場合ＧＵＳｉｎｔ）の間に機能的に挿入でき、その転写／翻訳を増加できることも証明される。

ｃ）イネ細胞におけるエンハンサーエレメントＥｕｒｅｋａ及びＡＲＴの機能性
単子葉植物の細胞における我々の人工エンハンサーの機能性を証明するために新しい構築物のセットを作製した。まず、５’末端を人工エキソン／イントロンＡＲＴに融合したｕｉｄＡ（ｇｕｓ）遺伝子を保有するプラスミドｐＢＰＦＡＲＴＧＵＳｉｎｔからのＸｈｏＩ〜ＫｐｎＩ断片を、同制限酵素で分解したｐＢＰＦＡ１９−リンカーベクター（図１１）に挿入して、プラスミドｐＢＰＦＡ１９ＡＲＴＧＵＳｉｎｔを形成させた。このプラスミドにおいて、ｐＢＰＦＡ１９−リンカーに存在するイネアクチン−１のエキソン／イントロン／エキソン領域は、人工エレメントＡＲＴに置き換わり、他の調節エレメントとして（４重のオクトピンシンターゼａｓ−１様エンハンサーはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（４００ｂｐ版）に融合している）キメラプロモーターＡ１９及びｔＮＯＳ転写終結シグナルを残す。

同様に、プラスミドｐＢＳ−ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔからのＸｈｏＩ〜ＫｐｎＩのバンドをｐＢＰＦＡ１９−リンカーベクターにクローニングして構築物ｐＢＰＦＡ１９ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔを得た。対照として使用した構築物ｐＢＰＦＡ１９ＧＵＳｉｎｔを、プラスミドｐＵＣ−ＧＵＳｉｎｔからＧＵＳｉｎｔ断片をＮｃｏＩ／ＳａｃＩで分解したｐＢＰＦＡ１９−リンカーベクターにクローニングすることにより作製した。使用した別の対照プラスミドはｐＢＰＦΩ（オメガ）−ＧＵＳｉｎｔであった。

イネ細胞においてＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａが遺伝子発現を増強する能力の定性評価を、インディカＰｅｒｌａ品種のイネのカルスにおける一過性発現をアッセイすることにより実施した。次亜塩素酸ナトリウム及びアルコールで予め滅菌した成熟した種子からカルスを得、遮光してＮ６−２培地すなわちＮ６塩類及びビタミン類（Ｃｈｕ Ｃ．Ｃら、Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃ １９７５、１８：６５９頁）、０．１ｇ／Ｌミオイノシトール、１ｇ／Ｌカゼイン加水分解物、２ｍｇ／Ｌ ２，４Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、３ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．７）中で２１日間培養した。マイクロプロジェクタイルを用いたボンバードメント法により形質転換を実施した。ボンバードメントの前に、浸透圧前処理用に０．４Ｍマンニトールを補充したＮ６−２培地にカルスを継代した。出版されたプロトコルにしたがってボンバードメントには１μｍの球状金粒子（ＢｉｏＲａｄ）をマイクロプロジェクタイルとして使用した（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｒ．、Ｗａｌｌａｃｅ Ｋ．Ｍ．、Ｂａｔｈｅ Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１９９３、１２：１６５〜１６９頁）。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステム（ＢｉｏＲａｄ）を採用して形質転換を実施した。ボンバードメントには３０個のカルスを平板中央に置き、条件は圧力１１００ｐｓｉ、距離６ｃｍ、平板１枚あたり１回発射した。ボンバードメント後にカルスを遮光下で同じ浸透圧培地中で１６時間維持してから、マンニトールを有さないＮ６−２培地で２日間継代培養した。組織化学法によりＸ−Ｇｌｕｃを用いてＧＵＳ活性を明らかにする（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．１９８８．「Ｐｌａｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ：ｔｈｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２４７〜２６３頁）。立体顕微鏡で各カルスにおける青い点及び帯域を計数することにより評価を実施した（図１２）。表４は繰り返しをそれぞれ３回行った４回の実験から得られた結果を示す。

表４．イネ細胞におけるＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａの機能性の比較実証

見て取れるように、これらの実験結果は単子葉植物の細胞における遺伝子発現エンハンサーエレメントとしてのＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａの機能性も確認している。我々のアッセイにおいて人工エキソン／イントロン／エキソンＡＲＴ（ｐＡ１９ＡＲＴＧＵＳｉｎｔ）により発生するＩＭＥ活性は、容認された遺伝子発現エンハンサー能を有する遺伝子エレメントであるイネアクチン−１遺伝子の第一エキソン／イントロン／エキソン（ｐＢＰＦＡ１９ＧＵＳｉｎｔ）で観察された活性よりも高かったことを強調しておくのは重要である。さらに、我々の実験において構築物ｐＡ１９ＡＲＴＧＵＳｉｎｔ及びｐＡ１９ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔに対して得られた結果の間の有意差を評価することはできないが、ｐＡ１９ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔのボンバードメントを行ったカルスのＸ−Ｇｌｕｃ組織化学染色後の青く着色した帯域の大きさ及び強度から（図１２）、最終構築物中にＥｕｒｅｋａ断片が存在すると発現が大きく増加することは図１２において注目に値する。

結論として、本実施例は任意の種類の植物細胞における遺伝子発現エンハンサーとしての人工遺伝子エレメントＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａの機能性を示している。そのうえ、これらのエンハンサーエレメントは効率が高く、それらが融合したプロモーターに依存せずに発現レベルを増加させることが実証された。最後に、ＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａは下流の遺伝子の発現をなお相乗的に増強させるために組み合わせることができることも実証された。

ＡＲＴ及びＥｕｒｅｋａを植物に活性な任意のプロモーター（例えばＡ１９）及び任意のＤＮＡ配列（ＧＵＳｉｎｔ遺伝子）の間に機能的に挿入してその転写／翻訳を増加できることを新たに示す。

実施例３：種々の５’転写エンハンサー領域を採用したＰＡＲＴＥ発現系変異体
ａ）ＰＡＲＴＥプロモーターへのイネアクチン−１の５’転写アクチベーター領域の付加
イネアクチン−１遺伝子からＰＡＲＴＥプロモーターに５’転写エンハンサー領域をｃｙｓ−融合するために、ｐＰＡＲＴＥプラスミドを酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで分解し、これらの酵素で連結する両極端を有する合成ＤＮＡ断片Ｅｎ−Ａｃ１（イネアクチン−１遺伝子の転写開始部位から−４３〜−２２１、配列番号１０）をそれに挿入した。得られたプラスミドｐＡ１ＰＡＲＴＥをＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩで分解して、合成ＤＮＡ断片Ｅｎ−Ａｃ２（イネアクチン−１の転写開始部位から−２２６〜−３１０、配列番号１１）を挿入し、アクチン−１遺伝子プロモーターの５’アクチベーター領域を完成させプラスミドｐＡＰＡＲＴＥ（図５、図７Ｅ）を産生させた。このプラスミドの制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩの間のヌクレオチド配列を配列番号１２に示す。

ｂ）ＡＰＡＲＴＥプロモーターへのａｓ−１様転写エンハンサー配列の付加
プラスミドｐＡ１ＰＡＲＴＥをＮｒｕＩ及びＳａｌＩで分解し、ＡＳＰ（配列番号１３）と称するＤＮＡ合成断片をそれに挿入し、構築物ｐＡＳＰΔＡ１ＰＡＲＴＥを産生させる。ＡＳＰは上記の制限酵素に対する接着末端を保有しａｓ−１−様転写エンハンサー配列のために成分化する。このプラスミドをＳａｌＩで分解し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理してからＰｓｔＩで分解し約９００ｂｐのＤＮＡ断片を得、それをその後ＮｒｕＩ及びＰｓｔＩで分解したベクターｐＡ１ＰＡＲＴＥにクローニングし、最終的にプラスミドｐＡＳＰＡ１ＰＡＲＴＥを得た。そのプラスミドはイネアクチン−１の５’転写活性化領域のＮｒｕＩ部位に挿入されたＡＳＰエンハンサーを有する。それをＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩで分解することによって、第二のＡＳＰエンハンサーをプラスミドｐＡＳＰＡ１ＰＡＲＴＥに挿入し、ベクターｐ２Ａ１ＰＡＲＴＥ（配列番号１４、制限部位ＫｐｎＩ及びＳａｃＩの間のヌクレオチド配列を示す）を生成させたが、図７Ｆにその構造を示す。

ｐＡ１ＰＡＲＴＥについて上に解説したように、Ｅｎ−Ａｃ２断片もｐＡＳＰＡ１ＰＡＲＴＥに挿入し構築物ｐＡＳＰＡＰＡＲＴＥを得た。ここでそれをＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩで分解することにより第二ＡＳＰエンハンサーを挿入し、最終的にベクターｐ２ＡＰＡＲＴＥ（図７Ｇ）を得た。ＳａｌＩ及びＳａｃＩ部位の間のヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。

ｃ）Ｕ３ＡＲＴＥプロモーターの構築
まず、プライマーＯｌｉ−Ｕ１（配列番号１６）及びＯｌｉ−Ｕ２（配列番号１７）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってトウモロコシｕｂｉ−１遺伝子の転写開始部位から−２９９〜−６８０の領域に対応する約３９５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させた。増幅した断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（両部位はプライマー内に含まれていた）で分解し、同様にプロセシングしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫベクターにクローニングし、構築物ｐＢＳ−Ｕｂｉ１を得た。その後、トウモロコシｕｂｉ−１遺伝子の−６８０〜−８５５（配列番号１８）のために成文化している（ｃｏｄｉｆｙ）合成ＤＮＡ断片（Ｅｎ−Ｕ２）をＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで分解したｐＢＳ−Ｕｂｉ１ベクターにクローニングし、構築物ｐＢＳ−Ｕｂｉ２を生成させた。その構築物はトウモロコシユビキチン−１遺伝子５’アクチベーター領域（−２９９〜−８５５、配列番号１９）を含む。

トウモロコシユビキチン−１遺伝子からクローニングされた「熱ショック」ボックスを含まない５’転写アクチベーター領域をＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ分解によりプラスミドｐＢＳ−Ｕｂｉ２から得、ベクターのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ分解によりプロモーター２ＡＰＡＲＴＥの５’にｃｉｓ−挿入し、いわゆる構築物ｐＵ３ＡＲＴＥを得た（図６、図７Ｈ）。部位ＫｐｎＩ及びＳａｃＩの間のベクターｐＵ３ＡＲＴＥの配列を配列番号２０に示す。

ｄ）ＧＡＲＴＥプロモーターの構築
本発明物の適応性を実証するために、我々は器官、組織又は発生特異性を有するプロモーターからの５’調節領域を融合させることを決意し、これによりすでに言及した特徴を有する高い発現レベルが付与された。このように、グルテリンの器官特異的発現を制御するイネｇｌｕＢ−１遺伝子５’調節領域をＰＡＲＴＥプロモーターのｃｙｓ及び５’に融合した。この目標を達成するために、ｇｌｕＢ−１転写開始部位から−３１〜−２４５領域（配列番号２１）に対応する２１４塩基対の断片（ＧＬＵ）及び都合のよいクローニング部位を合成し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで分解したｐＰＡＲＴＥプラスミドにそれを挿入して、ｐＧＡＲＴＥベクターを産生させ（図８）、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩ部位の間のその一次構造を配列番号２２に示す。

実施例４：タバコ及びイネ細胞におけるＰＡＲＴＥ発現系の種々の変異体の機能性
単子葉及び双子葉植物の細胞において本発明の各プロモーター変異体物の発現レベルを評価するために、バイナリーベクターｐＣ−ＡＲＴＥ−ＧＵＳｉｎｔにおいてＧＵＳｉｎｔの発現を制御しているＣａＭＶ ３５ＳプロモーターをＳｍａＩ−ＳｐｅＩ分解により欠失させ、その場所に構築物ｐＡＰＡＲＴＥ、ｐ２Ａ１ＰＡＲＴＥ、ｐ２ＡＰＡＲＴＥ及びｐＵ３ＡＲＴＥからのＫｐｎＩ／Ｓ１ヌクレアーゼ−ＳｐｅＩ断片を挿入し、新しいバイナリーベクターｐＣ−ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２Ａ１ＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−Ｕ３ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔを産生させた。

ａ）タバコでのアッセイ
バイナリーベクターｐＣ−ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２Ａ１ＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−Ｕ３ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔをＡ．ツメファシエンス細胞に導入し、実施例２の（ａ）項に記載したようにＮＴ１タバコ細胞における一過性発現アッセイ実験を実施した。使用した対照プラスミドｐＣ−ＧＵＳｉｎｔは、ＧＵＳの発現がＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（１．３ｋｂ版）及びｔＮＯＳターミネーターに制御されている。実験を２回実施し（各処理について５回の繰り返し）、結果を以下の表に示す。

表５．タバコ細胞におけるＰＡＲＴＥ発現系の種々の変異体の機能性

我々の結果が本発明物における種々のプロモーター変異体の機能性の確証となり、ＰＡＲＴＥに融合した５’転写調節領域に応じてその活性を調整することが可能であることも示していることは明らかである。双子葉植物の細胞において、我々の遺伝子構築物を用いて我々は天然プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓにより制御されている場合に達成されたものを上回る発現レベルに達したことを強調しなければならない。

ｂ）イネを用いたアッセイ
ＰＡＲＴＥプロモーターの種々の変異体の活性の一過性評価を実施するために、実施例２（ｃ）項に記載したようにバイナリーベクターｐＣ−ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２Ａ１ＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ、ｐＣ−２ＡＰＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔ及びｐＣ−Ｕ３ＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔを用いてイネカルスにボンバードメントを行った。対照プラスミドｐＡｃｔｌ−Ｆ（ＭｃＥｌｒｏｙ Ｄ；Ｚｈａｎｇ Ｗ；Ｃａｏ Ｊ；Ｗｕ Ｒ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９０、２：１６３〜１７１頁）は、イネアクチン−１遺伝子プロモーター及びｔＮＯＳターミネーターの制御下でｇｕｓ遺伝子を発現する。発現カセットをＫｐｎＩ−ＸｂａＩ分解によりこれらのプラスミドから抽出し、同制限酵素で分解したバイナリープラスミドｐＣＡＭＢＩＡ２３００に挿入し、ベクターｐＣ−Ａｃｔ１Ｆを産生させた。

評価する各構築物について３回の繰り返しでボンバードメント実験を３回実施した。得られた結果を以下の表に示す。

表６．イネ細胞におけるＰＡＲＴＥプロモーター発現系の種々の変異体の機能性

本表に示した結果は、単子葉植物の細胞におけるＰＡＲＴＥプロモーターの種々の変異体がイネアクチン−１遺伝子の天然プロモーターを上回る発現レベルに達することから、それらの変異体の機能性を証明している。したがって、本発明物は、その制御下でｃｙｓに配置されたＤＮＡ配列の高い発現レベルを達成するための効率の高い遺伝子ツールとしての有用性が確認される。

ｃ）イネ種子のアッセイ
イネ細胞内乳におけるＧＡＲＴＥプロモーターの組織特異性を評価するために、ＧＵＳｉｎｔ遺伝子に融合しｎｏｓターミネーター（ｔＮＯＳ）を有するＥｕｒｅｋａ断片を含む、ｐＢＰＦＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔベクターからの約２．５ＫｂのＳａｌＩ／クレノウ−ＰｓｔＩ断片を、ＸｂａＩ／クレノウ−ＰｓｔＩで分解したｐＧＡＲＴＥベクターにクローニングした結果、構築物ｐＧＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔが生じた。

ｐＧＡＲＴＥＧＵＳｉｎｔにおけるＧＡＲＴＥプロモーターをＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ分解することにより、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＧｌｕＢ−１プラスミドのＳａｌＩ−ＮｃｏＩ分解から得られた種子内乳特異的で高効率のイネグルテリンＢ−１プロモーターに置き換えた対照プラスミドも構築した。このように、我々はｐＧｌｕＧＵＳｉｎｔを得た。

ＧＡＲＴＥプロモーターの評価及びＧｌｕＢ１のプロモーターとの比較を、Ｙ−Ｓ．Ｈｗａｎｇ（Ｈｗａｎｇ Ｙ−Ｓ；ＭｃＣｕｌｌａｒ Ｃａｓｓ；Ｈｕａｎｇ Ｎ．、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１、１６１：１１０７〜１１１６頁）にしたがって、温室栽培されたイネ品種インディカＰｅｒｌａの穂の穎果（ｅａｒ ｃａｒｉｏｐｓｉｓ）から単離した未熟な内乳（受粉後８〜９日）にボンバードメントを行うことによって実施した。内乳におけるＧＵＳ活性を測定するための蛍光アッセイを、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．１９８８．「Ｐｌａｎｔ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ：ｔｈｅ ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２４７〜２６３頁）にしたがって実施し、プラスミドＤＮＡで覆った金微粒子を用いたボンバードメントを行った２４時間後に評価した。それぞれ５回の繰り返しを行った独立した２回の実験で得られたＧＵＳ活性の結果を表７に示す。

表７．イネ種子内乳におけるＧＡＲＴＥプロモーターの機能性

これらの結果は、我々が設計した人工エレメントに基づくキメラプロモーターＧＡＲＴＥが種子内乳において遺伝子を発現する効率が高いことを確認している。ＧＡＲＴＥプロモーターに挿入されたＧＬＵ配列は発現に特異性を付与できるが、それは「それ自体は」高レベルを保証せず、プロモーターを一致させる他のエレメントにも依存する（Ｔａｋａｉｗａ Ｆ；Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ Ｕ；Ｙｏｓｈｉｈａｒａ Ｔ；Ｗａｓｈｉｄａ Ｈ；Ｔａｎａｂｅ Ｆ；Ｋａｔｏ Ａ；Ｙａｍａｄａ Ｋ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９６、３０：１２０７〜１２２１頁）。

示された結果は、本発明のエレメント物上流に調節領域を挿入すると、発生、器官又は組織特異性を有する任意のＤＮＡ配列の発現を効率的に導くためにそのエレメント物を使用できることを再び支持している。分子生物学の経験者には、ＧＡＲＴＥプロモーターに挿入されたＧｌｕＢ−１プロモーター調節配列を、生物によるストレス（例えば病原体の攻撃）、非生物因子（例えば創傷、極端な高温又は低温、塩分、乾燥、一部の化学物質の存在）、酸化ストレス、種々の器官及び組織発生段階などに応答する調節配列とうまく置き換えられることは明白である。

本発明の調節領域物下でクローニングされたＤＮＡ配列を植物細胞に導入でき、公知の生物学的又は物理化学的形質転換法により安定挿入できること、並びにこれらの遺伝修飾された細胞から、ＤＮＡ配列が融合したプロモーター変異体にしたがってその配列が都合よく発現する受精能のある植物を再生させることが可能であることも明らかである。このように、本発明は害虫、疾病、多様なストレスに対する抵抗レベルがさらに大きく、農業の収穫量がさらに大きいか、又は使用の中でとりわけ医学又は工業応用を有する化合物を高効率で産生するトランスジェニック植物の製造に貢献する潜在性を示している。

転写開始部位からのイネアクチン−１（Ａｃｔ）、トウモロコシユビキチン−１（Ｕｂｉ）及びトウモロコシスクロースシンターゼ（Ｓｈｒｕｎ）遺伝子配列を示す図である。大文字は第一エキソンを、小文字は第一イントロンの５’領域を示し、繰り返し共通配列モチーフの部分に下線を付す。 Ｅｕｒｅｋａ人工翻訳エンハンサー配列を示す図であり、関連のあるエレメント及び制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。 ＡＲＴエキソン／イントロン／エキソン人工配列を示す図であり、その構成要素の断片のそれぞれの起点を示す（小文字：人工イントロン、ＵＵＵＵＵＡＵ様配列を作り出すために挿入した塩基に下線２本を付す、制限エンドヌクレアーゼのいくつかの関連性のある認識部位に下線１本で印を付ける）。 本発明物（ＰＡＲＴＥプロモーター）の一次構造を示す図であり、ＡＲＴエキソン／イントロン／エキソン領域（イントロン塩基は小文字、エキソンは大文字）及び人工翻訳エンハンサーＥＵＲＥＫＡに融合したコアプロモーター（斜体小文字）を示す。制限エンドヌクレアーゼのいくつかの関連性のある認識部位に下線を付し、ＴＡＴＡボックスに下線２本を付し、翻訳開始コドンを太字で示す。 ＡＰＡＲＴＥプロモーターの一次構造を示す図であり、ＰＡＲＴＥプロモーター（プロモーターは斜体小文字、イントロンは小文字、エキソンは大文字）に融合したイネアクチン−１の５’調節領域（斜体大文字で転写開始部位から−４３〜−３１０領域）を示す。制限エンドヌクレアーゼのいくつかの関連性のある認識部位に下線１本で印を付す。ＴＡＴＡボックスに下線２本を付し、翻訳開始コドンを太字で示す。 Ｕ３ＡＲＴＥプロモーターの一次構造を示す図であり、その構成エレメントであるトウモロコシｕｂｉ−１遺伝子の転写開始部位から−２９９〜−８５５領域を大文字で、ａｓ−１様転写エンハンサーを太字大文字で、イネａｃｔ−１遺伝子の転写開始部位から−４３〜−３１０領域を斜体大文字で、ＰＡＲＴＥプロモーターを小文字で示す（ＴＡＴＡボックスに下線２本を付し、ＡＲＴイントロンを斜体で示し、翻訳開始部位に下線１本を付す）。 本発明のエンハンサーエレメント物を有するプロモーター変異体を示す図である。Ａ：３５ＳＥｕｒｅｋａ； Ｂ：３５ＳＡＲＴ； Ｃ：３５ＳＡＲＴＥ； Ｄ：ＰＡＲＴＥ； Ｅ：ＡＰＡＲＴＥ； Ｆ：２Ａ１ＰＡＲＴＥ； Ｇ：２ＡＰＡＲＴＥ； Ｈ：Ｕ３ＡＲＴＥ． れんが模様部分：３５Ｓ プロモーター（１．３Ｋｂ）； チェック柄部分：翻訳エンハンサー Ｅｕｒｅｋａ； 縦縞模様部分：ＡＲＴ エキソン／イントロン／エキソン； 格子柄部分：人工プロモーターコア； 白抜き部分：イネアクチン−１ 遺伝子５’活性化領域（−４３〜−２２１）； 点（疎）模様部分：イネアクチン−１ 遺伝子５’活性化領域（−２２６〜−３１０）； 斜め縞模様部分：ＡＳＰ（ａｓ−１−様エンハンサー）； 点（密）模様部分：トウモロコシユビキチン−１ プロモーター５’活性化領域（−２９９〜−８５５）。 ＧＡＲＴＥプロモーターの一次構造を示す図であり、その構成エレメントである、転写開始部位から−３１〜−２４５のイネｇｌｕＢ−１遺伝子領域を斜体大文字で示す、ＰＡＲＴＥプロモーター（プロモーターを斜体小文字で、イントロンを小文字で、エキソンを大文字で示し、いくつかの関連性のある制限部位に下線を付し、ＴＡＴＡボックスに下線２本を付し、翻訳開始コドンは太字）を示す。 ｐＵＣ−ＧＵＳｉｎｔの地図を示す図である。 ｐＢＰＦΩ（オメガ）７の地図を示す図である。 ｐＢＰＦＡ１９−リンカーの地図を示す図である。 促進したマイクロプロジェクタイルを用いたボンバードメントにより誘導されたＧＵＳｉｎｔ遺伝子を保有する種々の遺伝子構築物の一過性発現によりイネ細胞におけるＡＲＴ及びＥＵＲＥＫＡエレメントの機能性のＸ−Ｇｌｕｃ組織化学染色による比較実証を示す図である。

Claims (71)

1. 組換えＤＮＡ分子であることを特徴とする人工プロモーターであって、前記プロモーターが植物細胞においてその３’末端に融合した任意のＤＮＡ配列の発現を促進し、
   ａ）５’転写調節エレメント、
   ｂ）それに続くＴＡＴＡボックス、ＧＣ含量６４％未満を有するヌクレオチド配列、及び転写開始部位を含む人工コアプロモーター、並びに
   ｃ）第一キメラエキソン、人工イントロン、及び第二キメラエキソンにより一致される、下流に挿入された任意の遺伝子の翻訳増強性を有する転写可能であるが翻訳可能ではない合成ヌクレオチド配列、
   を含み、前記転写開始部位の３’末端が前記合成ヌクレオチド配列に融合し、前記合成イントロンが植物細胞においてそれに融合した遺伝子の発現を増強できるプロモーター。
2. 前記５’転写調節エレメントが人工である、組換えＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１記載の人工プロモーター。
3. 前記５’転写調節エレメントが植物細胞において遺伝子発現を自然に増強及び／又は調節するＤＮＡ配列と相同である、組換えＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１記載の人工プロモーター。
4. ５’転写調節エレメントがイネアクチン−１遺伝子に由来する請求項３記載の人工プロモーター。
5. 前記５’転写調節エレメントがイネアクチン−１遺伝子の転写開始部位から−４３から−３１０の領域を含む請求項４記載の人工プロモーター。
6. 前記５’転写調節エレメントのヌクレオチド配列が配列番号１０における配列又はその断片に対応する請求項５記載の人工プロモーター。
7. 前記５’転写調節エレメントのヌクレオチド配列が配列番号１１における配列又はその断片に対応する請求項５記載の人工プロモーター。
8. 前記５’転写調節エレメントがトウモロコシユビキチン−１遺伝子に由来する請求項３記載の人工プロモーター。
9. ヌクレオチド配列がトウモロコシユビキチン−１遺伝子の転写開始部位から−２９９から−８５５の領域を含む請求項８記載の人工プロモーター。
10. 前記５’転写調節エレメントが配列番号１９における配列又はその断片に対応する請求項９記載の人工プロモーター。
11. 前記５’転写調節エレメントがａｓ−１様転写エンハンサーである請求項２又は３に記載の人工プロモーター。
12. ａｓ−１様転写エンハンサーのヌクレオチド配列が配列番号１３におけるヌクレオチド７から２６、又はその相補的配列に対応する配列断片と本質的に同一である、請求項１１記載の人工プロモーター
13. 前記５’転写調節エレメントがウイルスプロモーターに由来する請求項３記載の人工プロモーター。
14. 前記５’転写調節エレメントがＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターに由来する請求項１３記載の人工プロモーター。
15. 前記５’転写調節エレメントが発生特異性、器官特異性又は組織特異性を有して植物細胞における遺伝子発現を制御する請求項２又は３に記載の人工プロモーター。
16. 前記５’転写調節エレメントが種子における発現を制御する請求項１５記載の人工プロモーター。
17. 前記５’転写調節エレメントがイネグルテリンＢ−１遺伝子に由来する請求項１６記載の人工プロモーター。
18. 前記５’転写調節エレメントがイネグルテリンＢ−１遺伝子の転写開始部位から−３１から−２４５の領域の断片を含む請求項１７記載の人工プロモーター。
19. 前記５’転写調節エレメントが配列番号２１における配列又はその断片に対応する請求項１８記載の人工プロモーター。
20. 前記５’転写調節エレメントが生物又は非生物ストレス下にある植物細胞における遺伝子発現を制御する請求項１５記載の人工プロモーター。
21. 前記５’転写調節エレメントが傷を有する植物組織における遺伝子発現を制御する請求項１５記載の人工プロモーター。
22. ５’転写調節領域が異なる起源からの機能できる形で融合した２つ以上の調節エレメントを含み、前記調節エレメントが請求項２から２１までに記載の性質のいずれかに対して個別に応答する請求項１記載の人工プロモーター。
23. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からの第一エキソンがＣ及びＡリッチな（ｒｉｃｈ）配列モチーフを含む請求項１記載の人工プロモーター。
24. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からの第一エキソンが、モチーフＣＴＣＣ並びに／又はその相同配列ＣＴＣ、ＴＣＣ及びＴＣの頻繁に繰り返す配列を含む請求項１記載の人工プロモーター。
25. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からのイントロンが、ＣＴＣＣモチーフ並びに／又はその相同配列ＣＴＣ、ＴＣＣ及びＴＣの頻繁に繰り返す配列を含む請求項１記載の人工プロモーター。
26. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からのヌクレオチド配列が、配列番号６又はその断片に対応する請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の人工プロモーター。
27. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からの第二エキソンが高いＣ及びＡ含量を有する配列モチーフを含む請求項１記載の人工プロモーター。
28. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からの第二エキソンがモチーフＨＣＡＹＹＹ（Ｈ＝Ｃ又はＴ又はＡ、Ｙ＝Ｃ又はＴ）と少なくとも８３％相同の配列を含む請求項１記載の人工プロモーター。
29. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域からの第二エキソンのヌクレオチド配列が配列番号１の配列に対応する請求項２７又は２８に記載の人工プロモーター。
30. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域のヌクレオチド配列が配列番号８又はその断片に対応する請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の人工プロモーター。
31. 前記人工エキソン／イントロン／エキソン領域のヌクレオチド配列が少なくとも部分的に配列番号２０の配列に対応する請求項１〜３０のいずれか一項に記載の人工プロモーター。
32. 植物において機能的な任意のプロモーターに融合した場合に前記プロモーターにより制御されるＤＮＡ配列の発現を増強するように貢献する請求項１〜３１のいずれか一項に記載の人工プロモーターからのＤＮＡ断片。
33. 人工プロモーターの断片であって、前記断片に融合した遺伝子の翻訳を増強できる、請求項３２記載の断片。
34. モチーフＨＣＡＹＹＹ（Ｈ＝Ｃ又はＴ又はＡ、Ｙ＝Ｃ又はＴ）と少なくとも８３％相同の配列を含む請求項３３記載の人工プロモーターの断片。
35. Ｃ及びＡリッチな（ｒｉｃｈ）配列モチーフを有する請求項３３記載の人工プロモーターの断片。
36. ヌクレオチド配列が配列番号１における配列に対応する請求項３３記載の人工プロモーターの断片。
37. 植物細胞においてＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターから産生されるｍＲＮＡの翻訳の増強に貢献する請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の人工プロモーターの断片。
38. エキソン／イントロン／エキソン領域に対応する請求項３２記載の人工プロモーターの断片。
39. 第一エキソンがＣ及びＡリッチな（ｒｉｃｈ）配列モチーフを含む請求項３８記載の人工プロモーターの断片。
40. 前記第一エキソンがモチーフＣＴＣＣ並びに／又はその相同配列ＣＴＣ、ＴＣＣ及びＴＣの頻繁に繰り返す配列を含む請求項３８記載の人工プロモーターの断片。
41. 前記イントロンがモチーフＣＴＣＣ並びに／又はその相同配列ＣＴＣ、ＴＣＣ及びＴＣの頻繁に繰り返す配列を含む請求項３８記載の人工プロモーターの断片。
42. ヌクレオチド配列が配列番号６における配列に対応する請求項３８記載の人工プロモーターの断片。
43. ヌクレオチド配列が配列番号８における配列に対応する請求項３８記載の人工プロモーターの断片。
44. 植物細胞においてＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下で任意の遺伝子の発現の増強に貢献する請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の人工プロモーターの断片。
45. ａｓ−１様転写エンハンサーに対応する請求項３２記載の人工プロモーターの断片。
46. ヌクレオチド配列が配列番号１３におけるヌクレオチド７から２６又はその相補的配列に対応する断片の配列と本質的に同一である人工プロモーターの断片。
47. ５’転写調節エレメントに対応する請求項３２記載の人工プロモーターの断片。
48. 前記５’転写調節エレメントがイネアクチン−１遺伝子に由来する請求項４７記載の人工プロモーターの断片。
49. ヌクレオチド配列がイネアクチン−１遺伝子の転写開始部位から−４３から−３１０の断片を含む請求項４８記載の人工プロモーターの断片。
50. ヌクレオチド配列が配列番号１０における配列又はその断片に対応する請求項４９記載の人工プロモーターの断片。
51. ヌクレオチド配列が配列番号１１における配列又はその断片に対応する請求項４９記載の人工プロモーターの断片。
52. 前記５’転写調節エレメントがトウモロコシユビキチン−１遺伝子に由来する請求項４７記載の人工プロモーターの断片。
53. ヌクレオチド配列がトウモロコシユビキチン−１遺伝子の転写開始部位から−２９９から−８５５の領域を含む請求項５２記載の人工プロモーターの断片。
54. 前記５’転写調節エレメントが配列番号１９における配列又はその断片に対応する請求項５３記載の人工プロモーターの断片。
55. 請求項１から３１までのいずれかに対応する人工プロモーターを含む、植物細胞におけるＤＮＡ配列の発現のためのカセット。
56. 請求項３２から５４までのいずれかに対応するＤＮＡ断片に機能的に融合した転写エンハンサーエレメントを含む、植物細胞におけるＤＮＡ配列の発現のためのカセット。
57. 請求項５５又は５６に記載の発現カセットの１つを含む、植物細胞の形質転換のためのＤＮＡベクター。
58. 請求項５７記載のベクターを保有する細菌細胞及びその子孫。
59. 請求項５７記載のベクターで形質転換された植物細胞及びその子孫。
60. 請求項５７記載のベクターにより導入された前記発現カセットにおいて人工プロモーターの制御下でＤＮＡ断片を発現する請求項５９記載の植物細胞。
61. 請求項５５又は５６に記載の発現カセットがゲノムに完全に組み込まれた請求項５９記載の植物細胞。
62. 請求項６１記載の植物細胞から再生したトランスジェニック植物。
63. 請求項５７に記載したベクターにより導入された発現カセットに含まれる人工プロモーターの制御下でＤＮＡ断片を発現する請求項６２記載のトランスジェニック植物。
64. 請求項６３記載のトランスジェニック植物の子孫。
65. 双子葉類である請求項６４記載の植物。
66. ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）である請求項６５記載の植物。
67. タバコ、トマト又はジャガイモのうち１つの種に属する請求項６６記載の植物。
68. 単子葉類である請求項６４記載の植物。
69. イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）である請求項６８記載の植物。
70. イネ、サトウキビ、トウモロコシ、コムギ又はオオムギのうちの１つの種に属する請求項６９記載の植物。
71. 請求項５７記載のベクターにより導入された発現カセットに含まれる人工プロモーターの制御下に位置するＤＮＡ断片の発現の結果としての、請求項６０又は６３に記載の細胞又は植物により産生される組換えタンパク質の精製又は使用。

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