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ES2663512T3 - Secuencias de aminoácidos dirigidas contra RANK-L y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos - Google Patents

Secuencias de aminoácidos dirigidas contra RANK-L y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos Download PDF

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ES2663512T3
ES2663512T3 ES08759983.3T ES08759983T ES2663512T3 ES 2663512 T3 ES2663512 T3 ES 2663512T3 ES 08759983 T ES08759983 T ES 08759983T ES 2663512 T3 ES2663512 T3 ES 2663512T3
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ES
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amino acid
polypeptide
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nanobody
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ES08759983.3T
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English (en)
Inventor
Els Beirnaert
Sigrid Cornelis
Hendricus Renerus Jacobus Matteus Hoogenboom
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Ablynx NV
Original Assignee
Ablynx NV
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Abstract

Polipéptido o constructo multivalente que comprende o que consiste esencialmente en al menos dos secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra y pueden unirse específicamente a RANK-L elegidas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 572 y SEQ ID NO: 750-756.

Description

Secuencias de aminoácidos dirigidas contra RANK-L y polipéptidos que comprenden las mismas para el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos
La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (tal como se define en el presente documento) ligando del receptor activador del factor nuclear kappa B (RANK-L, también denominado citocina inducida por activación, relacionada con el factor de necrosis tumoral (TRANCE), factor de diferenciación de osteoclastos (ODF), ligando de osteoprotegerina (OPG-L) o miembro 11 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF11)), así como a compuestos o constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden o consisten esencialmente en una o más de tales secuencias de aminoácidos (también denominadas en el presente documento “secuencias de aminoácidos de la invención”, “compuestos de la invención” y “polipéptidos de la invención”, respectivamente).
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos (también denominados en el presente documento “ácidos nucleicos de la invención” o “secuencias de nucleótidos de la invención”); a métodos para preparar tales polipéptidos; a células huésped que expresan o que son capaces de expresar tales polipéptidos; a composiciones y en particular a composiciones farmacéuticas, que comprenden tales polipéptidos, ácidos nucleicos y/o células huésped; y a usos de tales polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped y/o composiciones, en particular con propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, tales como los propósitos profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico mencionados en el presente documento.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La remodelación (recambio) del hueso es el proceso mediante el cual el esqueleto adulto está continuamente reabsorbiéndose (retirándose) y formándose (reponiéndose). La remodelación ósea implica la síntesis de matriz ósea por los osteoblastos y su resorción por las células osteoclásticas. Los osteoclastos, derivados de células hematopoyéticas, son formas únicas de macrófagos tisulares que tienen la capacidad de reabsorber tejido óseo. Los osteoblastos son fibroblastos especializados que tienen la capacidad de secretar colágeno óseo. Existe una coordinación exquisita entre las actividades de estas células óseas que vinculan los procesos de formación de hueso y resorción de hueso.
La remodelación ósea está controlada por un equilibrio entre RANK-L/RANK y el receptor señuelo de RANK-L, OPG. RANK-L y su receptor RANK son esenciales para el desarrollo y la activación de osteoclastos. OPG, una proteína secretada, es un inhibidor eficaz de la maduración de osteoclastos y la activación de osteoclastos. En la homeostasis ósea normal, RANK-L y OPG participan en un eje de citocinas que controla estrechamente la generación de osteoclastos a partir de precursores de monocitos. RANK-L, expresado por los osteoblastos y células del estroma de la médula ósea, se une a su receptor funcional, RANK, para estimular la diferenciación de osteoclastos a partir de células precursoras y la proliferación y actividad de osteoclastos maduros. OPG, que se expresa por osteoblastos, células del estroma, células dendríticas y megacariocitos, limita este proceso al actuar como receptor señuelo soluble para RANK-L.
La molécula de la familia de TNF, RANK-L, está codificada por un único gen (rankl) en el cromosoma humano 13q14. El ARNm de RANK-L se expresa en los mayores niveles en hueso y médula ósea, así como en tejidos linfoides (ganglio linfático, timo, bazo, hígado fetal y placas de Peyer) (Anderson et al. 1997, Nature 390: 175-179; Wong et al. 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194; Lacey et al. 1998, Cell 93: 165-176; Yasuda et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3597-3602). El corte y empalme alternativo de ARNm de RANK-L permite la expresión como glicoproteína transmembrana de tipo II de o bien 316 o bien 270 aminoácidos o como ligando soluble de 243 aminoácidos (Kong et al. 1999, Nature 397: 315-323; Nagai et al. 2000, Biochem Biophys. Res. Commun. 269: 532536). Además, RANK-L puede liberarse de su estado unido a membrana por metaloproteinasas, incluyendo TNF-alfa convertasa (Lum et al. 1999, J. Biol. Chem. 274: 13613-13618). Las cuatro isoformas de RANK-L se asocian en moléculas triméricas capaces de desencadenar osteoclastogénesis.
RANK (receptor activador de NF-kappaB también conocido como TRANCE-R, ODAR o TNFRSF11A), expresado en células preosteoclásticas, es el único receptor en estas células para RANK-L (Li et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1566-1571). La activación de RANK por RANK-L va seguida por su interacción con miembros de la familia de factores asociados a receptores de TNF (TRAF), la activación del factor nuclear (NF)-kappaB y c-Fos, JNK, c-src y la serina/treonina cinasa Akt/PKB (Anderson et al. 1997, Nature 390: 175-179; Hsu et al. 1999, Proc. Acad. Sci. USA 96: 3540-3545).
OPG (osteoprotegerina; “protector del hueso”; también conocido como factor inhibidor de la osteoclastogénesis (OCIF)) es una glicoproteína homodiméricas, unida con puentes disulfuro de 110-kDa, soluble producida y liberada por células osteoblásticas activadas (Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319) con homología con la familia de receptores de TNF, que funciona como receptor señuelo para RANK-L y compite con RANK por la unión a RANK-L. Por consiguiente, OPG es un inhibidor eficaz de la maduración de osteoclastos y la activación de osteoclastos
(Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319; Lacey et al. 1998, Cell 93: 165-176; Kong et al. 1999, Nature 397: 315-323), reduciendo de ese modo la resorción de hueso.
Se presenta una visión general más detallada del sistema OPG/RANK-L/RANK como mediador de la formación y destrucción de hueso en Khosla, (2001 Endocrinology 142: 5050-5055), Holstead Jones et al. (2002, Ann. Rheum. Dis. 61 (Supl. II): ii32-ii39), Bezerra et al. (2005, Brazilian J. Med. Biol. Res. 38: 161-170) y McClung (2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33).
Se producen varios trastornos óseos cuando existe un desequilibrio entre los componentes de resorción y formación de la actividad de remodelación ósea (desacoplamiento de la homeostasis ósea). Los desequilibrios entre las actividades de osteoclastos y osteoblastos pueden surgir de una amplia variedad de cambios hormonales o perturbaciones de factores inflamatorios y de crecimiento, tales como por ejemplo un equilibrio alterado entre OPG y RANK-L. Cuando la resorción de hueso es mayor que la formación de hueso, hay una pérdida neta de hueso a lo largo del tiempo. Esto puede dar como resultado eventualmente una baja masa ósea (osteopenia) u osteoporosis. Cuando la formación de hueso supera a la resorción, hay un aumento neto de la masa ósea (osteopetrosis).
Se ha implicado una pérdida o destrucción de hueso excesiva debida a mayor nivel de RANK-L, menor de OPG o ambos en muchos estados patológicos, incluyendo osteoporosis posmenopáusica (Eghbali-Fatourechi et al. 2003, Journal of Clinical Investigation 111: 1221-1230; Tsangari et al. 2004, Bone 35: 334-342; Abdallah et al. 2005, Calcified Tissue International 76: 90-97), hiperparatiroidismo primario (Stilgren et al. 2004, Bone 35: 256-265; Johnell et al. 2005, Journal of Bone and Mineral Research 20: 1185-1194), enfermedad de Paget de los huesos (Reddy 2004, Journal of Cellular Biochemistry 93: 688-696), enfermedad ósea metastásica (Brown 2004, Cancer Treatment and Research 118: 149-172), mieloma (Okada et al. 2003, Clinical and Experimental Metastasis 20: 639-646), artritis reumatoide (Crotti et al. 2002, Annals of the Rheumatic Diseases 61: 1047-1054) y varios otros trastornos inflamatorios de los huesos y las articulaciones (Locklin et al. 2001, Bone 28 (Supl.): S80; Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050).
Se dispone de agentes farmacológicos para disminuir el riesgo de fractura desde hace más de diez años. Los fármacos anticatabólicos (estrógenos, bisfosfonatos, calcitonina y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos) disminuyen la resorción de hueso, mientras que los agentes anabólicos, tales como la hormona paratiroidea (PTH) humana recombinante, aumentan la formación de hueso y el tamaño del hueso. La clase de biofosfonatos de fármacos es la usada con mayor frecuencia para el tratamiento de osteoporosis. Aunque esta clase de fármacos es generalmente muy segura, la dosificación oral es compleja y se ha asociado con acontecimientos adversos gastrointestinales en un pequeño porcentaje de pacientes de la práctica clínica. Se están evaluando en ensayos clínicos intervalos crecientes de dosificación intravenosa de bifosfonatos.
El reciente descubrimiento del sistema OPG/RANK-L/RANK como factores reguladores fundamentales en la patogenia de enfermedades y trastornos óseos como osteoporosis proporciona dianas únicas para los agentes terapéuticos. En animales de laboratorio y en humanos, la administración de formas de OPG inhibió notablemente la actividad osteoclástica y mejoró la resistencia del hueso (Bekker et al. 2001, J. Bone Miner. Res. 16: 348-360; Campagnuolo et al. 2002, Arthritis Rheum. 46: 1926-1936; Bezerra et al. 2005, Brazilian J. Med. Biol. Res. 38: 161170; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33). En estudios iniciales en humanos, un anticuerpo totalmente humano contra RANK-L (denosumab) redujo el recambio de hueso y mejoró la densidad ósea (Body et al. 2003, Cancer 97: 887-892; Bekker et al. 2004, J. Bone Miner. Res. 19: 1059-1066; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050; McClung et al. 2006, N. Engl.
J. Med. 354: 821-831). También se han descrito anticuerpos que se unen a RANK-L en los documentos WO 02/15846 y US 2004/0213788. Sin embargo, tales anticuerpos completos se enfrentan a los inconvenientes de los anticuerpos de tamaño completo tales como altos costes de producción, baja estabilidad y su gran tamaño, que por ejemplo impide su acceso a determinados epítopos escondidos.
Los Nanobodies son más potentes y más estables que los anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, lo que conduce a (1) formas de dosificación menores, dosificación menos frecuente que conduce a menos efectos secundarios y (2) estabilidad mejorada que conduce a una elección más amplia de vías de administración, que comprenden las vías oral o subcutánea y formulaciones de liberación retardada además de la vía intravenosa.
Se indica que el término “Nanobody” se refiere a una denominación de marca (Nanobody®) y debe interpretarse como tal siempre que se mencione en esta memoria descriptiva.
Debido a su pequeño tamaño, los Nanobodies tienen la capacidad para atravesar membranas y penetrar en compartimentos fisiológicos, tejidos y órganos no accesibles para otros polipéptidos y proteínas más grandes. Por ejemplo, los Nanobodies podrían penetrar fácilmente en la matriz ósea haciendo que sean adecuados para el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos.
El pequeño tamaño del Nanobody también hace que sean adecuados, de manera ideal, para su modificación por ingeniería para dar polipéptidos multivalentes o multiespecífico. En contraposición a los anticuerpos completos que pueden unirse únicamente a una subunidad de RANK-L, polipéptidos triméricos, bivalentes o trivalentes (basados en
respectivamente dos o tres Nanobodies contra RANK-L), podrán unirse a respectivamente 2 o 3 subunidades de la molécula trimérica de RANK-L y podrían ser ventajosos debido a su mayor potencia.
La presente invención proporciona un polipéptido o constructo multivalente que comprende o que consiste esencialmente en al menos dos secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra o que pueden unirse específicamente a RANK-L elegidas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 572 y SEQ ID NO: 750-756. En un aspecto preferido, el polipéptido o constructo es un polipéptido o constructo bivalente o un polipéptido o constructo trivalente.
Los polipéptidos y las composiciones de la presente invención pueden usarse generalmente para modular, y en particular inhibir y/o impedir, la unión de RANK-L a RANK, y por tanto para modular, y en particular inhibir y/o impedir, la señalización que está mediada por RANK-L, RANK y/o OPG, para modular las rutas biológicas en las que están implicados RANK-L y/o RANK, y/o para modular los mecanismos, las respuestas y los efectos biológicos asociados con tal señalización o estas rutas. La unión de RANK-L a RANK y/o la señalización que está mediada por RANK-L, RANK y/o OPG puede inhibirse y/o impedirse en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con la unión de RANK-L a RANK y/o la señalización que está mediada por RANK-L, RANK y/o OPG en las mismas condiciones pero sin la presencia de polipéptido de la invención.
En otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos y las composiciones de la invención pueden usarse para modular (inhibir y/o impedir o reforzar) la diferenciación y/o proliferación de osteoclastos. La diferenciación y/o proliferación de osteoclastos puede aumentar o disminuir, respectivamente, en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con la diferenciación y/o proliferación de osteoclastos en las mismas condiciones pero sin la presencia del polipéptido de la invención.
En otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos y las composiciones de la invención pueden usarse para modular la remodelación ósea. La remodelación ósea puede modularse en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con la remodelación ósea en las mismas condiciones pero sin la presencia del polipéptido de la invención.
Como tal, los polipéptidos y las composiciones de la presente invención pueden usarse para la prevención y el tratamiento (tal como se define en el presente documento) de enfermedades y trastornos óseos. Generalmente, “enfermedades y trastornos óseos” puede definirse como enfermedades y trastornos que pueden prevenirse y/o tratarse, respectivamente, administrando de manera adecuada a un sujeto que lo necesita (es decir, que tiene la enfermedad o el trastorno o al menos un síntoma del mismo y/o que corre el riesgo de contraer o desarrollar la enfermedad o el trastorno) de o bien un polipéptido o bien una composición de la invención (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo) y/o de un principio activo conocido activo contra RANK-L o una ruta o un mecanismo biológico en el que está implicado RANK-L (y en particular, de una cantidad farmacéuticamente activa del mismo).
Las enfermedades y los trastornos óseos engloban enfermedades y trastornos asociados con la regulación de la formación y resorción de hueso. Las enfermedades y los trastornos óseos caracterizados por una pérdida neta de hueso (la resorción de hueso supera la formación de hueso) también se denominan trastornos osteopénicos, incluyendo osteopenia, osteoporosis y osteólisis y se caracterizan por señalización excesiva y/o no deseada mediada por RANK-L. Los polipéptidos y las composiciones de la presente invención que modulan, y en particular inhiben y/o impiden, la unión de RANK-L a RANK actúan como antagonista y se usarán generalmente para la prevención y el tratamiento (tal como se define en el presente documento) de enfermedades y trastornos óseos caracterizados por pérdida neta de hueso. También los polipéptidos y las composiciones de la presente invención que modulan, y en particular inhiben y/o impiden, la unión de RANK-L a OPG pueden actuar como antagonistas y se usarán generalmente para la prevención y el tratamiento (tal como se define en el presente documento) de enfermedades y trastornos óseos caracterizados por pérdida neta de hueso.
Ejemplos de tales enfermedades y trastornos óseos estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento, y por ejemplo incluyen las siguientes enfermedades y trastornos: osteoporosis (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), incluyendo, pero sin limitarse a, osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (incluyendo, pero sin limitarse a, hipertiroidismo, hiperparatiroidismo (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232), síndrome de Cushing y acromegalia), formas hereditarias y congénitas de osteoporosis (incluyendo, pero sin limitarse a, osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, síndrome de Riley-Day), osteoporosis debida a la inmovilización de extremidades, osteoporosis inducida por glucocorticoides (Locklin et al. 2001, Bone 28 (Supl.): S80; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232) y osteoporosis posmenopáusica (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports
4: 28-33); enfermedad de Paget (juvenil o familiar) (Cundy et al. 2002, Hum. Mol. Genet. 11: 2119-2127; Whyte et al. 2002, J. Bone Miner. Res. 17: 26-29; Whyte et al. 2002, N. Engl. J. Med. 347: 175-184; Johnson-Pais et al. 2003, J.
Bone Miner Res. 18: 376-380; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); osteomielitis, es decir, una lesión infecciosa en hueso, que conduce a pérdida de hueso; hipercalcemia (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232), incluyendo, pero sin limitarse a, hipercalcemia que resulta de tumores sólidos (incluyendo, pero sin limitarse a, de mama, pulmón y riñón) y tumores malignos hematológicos (incluyendo, pero sin limitarse a, mieloma múltiple (Sordillo y Pearse 2003, Cancer 97 (3 Supl.): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289), linfoma y leucemia), hipercalcemia idiopática e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y trastornos de la función renal; pérdida de hueso, incluyendo pero sin limitarse a, osteopenia tras cirugía, osteopenia inducida por la administración de esteroides, osteopenia asociada con trastornos del intestino delgado y grueso y osteopenia asociada con enfermedades hepáticas y renales crónicas; osteonecrosis, es decir, muerte de células óseas, incluyendo, pero sin limitarse a, osteonecrosis asociada con lesión traumática, osteonecrosis asociada con enfermedad de Gaucher, osteonecrosis asociada con anemia falciforme, osteonecrosis asociada con lupus eritematoso sistémico, osteonecrosis asociada con artritis reumatoide, osteonecrosis asociada con enfermedad periodontal, osteonecrosis asociada con metástasis osteolítica y osteonecrosis asociada con otros estados; pérdida de hueso asociada con trastornos artríticos tales como artritis psoriásica, artritis reumatoide, pérdida de cartílago y erosión articular asociadas con artritis reumatoide (Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); artritis (Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170), incluyendo artritis inflamatoria (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), artritis inducida por colágeno (Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170); osteólisis periprotésica (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); enfermedad ósea relacionada con cáncer (McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33); pérdida de hueso asociada con tratamiento con inhibidores de aromatasa (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); pérdida de hueso asociada con tratamiento de privación androgénica (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); pérdida de hueso asociada con metástasis ósea; pérdida de hueso asociada con enfermedades que tienen afectación del sistema inmunitario, tales como leucemias de adultos e infantiles, metástasis de cáncer, autoinmunidad y diversas infecciones virales (Holstead Jones et al. 2002, Ann. Rheum. Dis. 61 (Supl. II): ii32-ii39) trastornos osteopénicos tales como leucemias de adultos e infantiles (Oliveri et al. 1999, Henry Ford Hosp. Med. 39: 45-48), infecciones crónicas tales como hepatitis C o por VIH (Stellon et al. 1985, Gastroenterology 89: 1078-1083), trastornos autoinmunitarios tales como diabetes mellitus (Piepkorn et al. 1997, Horm. Metab. Res. 29: 584-91) y lupus eritematoso (Seitz et al. 1985, Ann. Rheum Dis. 44: 438-445), enfermedades alérgicas tales como asma (Ebeling et al. 1998, J. Bone Min. Res. 13: 1283-1289), metástasis óseas líticas en múltiples cánceres tales como cáncer de mama (Coleman 1998, Curr. Opin. Oncol. 10 (Supl. 1): 7-13); cáncer de próstata; enfermedad ósea debida a mieloma (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); infecciones periodontales (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); hiperfosfatasia expansible esquelética (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); metástasis en hueso (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232).
También se engloba dentro del alcance de la presente invención la prevención y/o el tratamiento con los compuestos y/o los polipéptidos de la invención de otras enfermedades y trastornos asociados con un desequilibrio en la ruta de RANK-L/RANK/OPG. Tales enfermedades y trastornos incluyen pero no se limitan a osteoporosis, estados inflamatorios, estados autoinmunitarios, asma, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, mieloma múltiple (Sordillo y Pearse 2003, Cancer 97 (3 Supl.): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289); enfermedades vasculares (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232) y enfermedad cardiovascular (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050).
En particular, los polipéptidos y las composiciones de la presente invención pueden usarse para la prevención y el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos que están mediados por la(s) ruta(s) en la(s) que participa RANK-L. Ejemplos de tales enfermedades y trastornos óseos estarán claros de nuevo para el experto basándose en la divulgación en el presente documento.
Por tanto, sin limitarse a ello, los polipéptidos de la invención pueden usarse, por ejemplo, para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y trastornos que se previenen o se tratan actualmente con principios activos que pueden modular la señalización mediada por RANK-L, tales como los mencionados en la técnica anterior citada previamente. También se prevé que los polipéptidos de la invención pueden usarse para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y trastornos para los que está desarrollándose actualmente, se ha propuesto o se propondrá o desarrollará en el futuro el tratamiento con tales principios activos. Además, se prevé que, debido a sus propiedades favorables tal como se describe adicionalmente en el presente documento, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para la prevención y el tratamiento de otras enfermedades y trastornos que aquellos para los que están usándose o se propondrán o desarrollarán estos principios activos conocidos; y/o que los polipéptidos de la presente invención pueden proporcionar nuevos métodos y regímenes para tratar las enfermedades y los trastornos descritos en el presente documento.
Por tanto, sin limitarse a ello, los polipéptidos de la invención pueden usarse, por ejemplo, para prevenir y/o para tratar todas las enfermedades y trastornos que se previenen o se tratan actualmente con denosumab.
Otras aplicaciones y usos de los polipéptidos de la invención resultarán evidentes para el experto a partir de la
divulgación adicional en el presente documento.
Generalmente, es un objeto de la invención proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas que pueden usarse en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos.
En particular, es un objeto de la invención proporcionar tales agentes farmacológicamente activos, composiciones y/o métodos que tienen determinadas ventajas en comparación con los agentes, las composiciones y/o los métodos que actualmente se usan y/o conocen en la técnica. Estas ventajas resultarán evidentes a partir de la descripción adicional a continuación.
Más en particular, es un objeto de la invención proporcionar proteínas terapéuticas tal como se define en las reivindicaciones adjuntas que pueden usarse como agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que comprenden los mismos, para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos.
Por consiguiente, la presente solicitud describe secuencias de aminoácidos según las reivindicaciones adjuntas que están dirigidas contra (tal como se define en el presente documento) RANK-L, en particular contra RANK-L de un animal de sangre caliente, más en particular contra RANK-L de un mamífero, y especialmente contra RANK-L humano; y polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en al menos una secuencia de aminoácidos de este tipo.
En particular, es un objeto específico de la presente invención proporcionar polipéptidos según las reivindicaciones adjuntas que son adecuados para uso profiláctico, terapéutico y/o de diagnóstico en un animal de sangre caliente, y en particular en un mamífero y más en particular en un ser humano.
Más en particular, es un objeto específico de la presente invención proporcionar polipéptidos según las reivindicaciones adjuntas que pueden usarse para la prevención, el tratamiento, el alivio y/o diagnóstico de una o más enfermedades, trastornos o estados asociados con RANK-L y/o mediada por RANK-L (tales como las enfermedades, los trastornos y estados mencionados en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero y más en particular en un ser humano.
También es un objeto específico de la invención proporcionar polipéptidos según las reivindicaciones adjuntas que pueden usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas o veterinarias para la prevención y/o el tratamiento de una o más enfermedades, trastornos o estados asociados con y/o mediados por RANK-L (tales como las enfermedades, los trastornos y estados mencionados en el presente documento) en un animal de sangre caliente, en particular en un mamífero y más en particular en un ser humano.
En la invención, generalmente, se logran estos objetos mediante el uso de las secuencias de aminoácidos, proteínas, polipéptidos y las composiciones que se describen en el presente documento.
En general, la solicitud describe secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (tal como se define en el presente documento) y/o pueden unirse específicamente a (tal como se define en el presente documento) a RANK-L; así como compuestos y constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de este tipo.
Más en particular, la solicitud describe secuencias de aminoácidos que pueden unirse a RANK-L con una afinidad (medida adecuadamente y/o expresada como valor de KD (real o aparente), un valor de KA (real o aparente), una velocidad kon y/o una velocidad koff, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento; así como compuestos y constructos, y en particular proteínas y polipéptidos, que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de este tipo.
En particular, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados son preferiblemente tales que:
-
se unen a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litros/mol o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o más y más preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad kon de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre 103 M-1s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s-1;
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad koff de entre 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s) y 10-6 s-1 (proporcionando un complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días), preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos monovalente (o un polipéptido que contiene únicamente una secuencia de aminoácidos) es preferiblemente tal que se unirá a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
Algunos valores preferidos de CE50 y CI50 para la unión de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos para RANK-L divulgados resultarán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en el presente documento.
Para la unión a RANK-L, una secuencia de aminoácidos contendrá habitualmente dentro de su secuencia de aminoácidos uno o más residuos de aminoácido o uno o más tramos de residuos de aminoácido (es decir, comprendiendo cada “tramo” dos o residuos de aminoácido que son adyacentes entre sí o están en las proximidades uno de otro, es decir en la estructura primaria o terciaria de la secuencia de aminoácidos) mediante lo cual la secuencia de aminoácidos puede unirse a RANK-L, residuos de aminoácido o tramos de residuos de aminoácido que forman por tanto el “sitio” para la unión a RANK-L (también denominado en el presente documento el “sitio de unión a antígeno”).
Las secuencias de aminoácidos divulgadas están preferiblemente en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento), o forman parte de una proteína o un polipéptido de la invención (tal como se define en el presente documento), que pueden comprender o consistir esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos y que opcionalmente pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas unidas opcionalmente mediante uno o más ligadores adecuados). Por ejemplo y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos divulgadas pueden usarse como unidad de unión en una proteína o un polipéptido de este tipo, que pueden contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (es decir, contra una o más de otras dianas distintas de RANK-L), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico, respectivamente, todo tal como se describe en el presente documento. Una proteína o un polipéptido de este tipo también pueden estar en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento).
Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados como tal preferiblemente consisten esencialmente en una única cadena de aminoácidos que no se une mediante puentes disulfuro a ninguna otra cadena o secuencia de aminoácidos (pero que puede contener o no uno o más puentes disulfuro intramoleculares. Por ejemplo, se sabe que los Nanobodies, tal como se describe en el presente documento, pueden contener a veces un puente disulfuro entre CDR3 y CDR1 o FR2).
Generalmente, cuando una secuencia de aminoácidos (o un compuesto, constructo o polipéptido que comprende la misma) está destinado para su administración a un sujeto (por ejemplo, con propósitos terapéuticos y/o de diagnóstico tal como se describe en el presente documento), es preferiblemente o bien una secuencia de aminoácidos que no se produce de manera natural en dicho sujeto; o bien, cuando sí que se produce de manera natural en dicho sujeto, está en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento).
También estará claro para el experto que, para uso farmacéutico, las secuencias de aminoácidos (así como compuestos, constructos y polipéptidos que comprenden las mismas) están dirigidas preferiblemente contra RANK-L humano.
Además, una secuencia de aminoácidos puede contener opcionalmente, y además del al menos un sitio de unión para la unión contra RANK-L, contienen uno o más sitios de unión adicionales para la unión contra otros antígenos, proteínas o dianas.
La eficacia de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados y de composiciones que comprenden los mismos, puede someterse a prueba usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal adecuado conocido en sí mismo, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o el trastorno específico implicado. Los ensayos in vitro adecuados estarán claros para el experto, y por ejemplo incluyen ELISA; ensayo de unión mediante FACS; Biacore; ensayo de unión de competencia (AlphaScreen®, Perkin Elmer, Massachusetts, EE.UU.; FMAT); ensayo TRAP (ensayo de diferenciación de osteoclastos; Rissanen et al. 2005, J. Bone Miner. Res. 20, Supl. 1: S256); ensayo con gen indicador de NF-kappaB (Mizukami et al. 2002, Mol. Cell. Biol. 22: 992-1000). Los valores de CE50 para la unión de los Nanobodies divulgados (y de polipéptidos que comprenden los mismos) a RANK-L en, por ejemplo ELISA o FACS son preferiblemente de 1 M a 1 pM, más preferiblemente de 1 nM a 1 pM y más preferiblemente de 100 pM a 1 pM. Los valores de CI50 para la unión de los Nanobodies divulgados (y de polipéptidos que comprenden los mismos) a RANK-L en, por ejemplo, AlphaScreen®, ensayo de NF-kappaB o ensayo TRAP son preferiblemente de 1 M a 1 pM, más preferiblemente de 1 nM a 1 pM y más preferiblemente de 100 pM a 1 pM.
Los modelos animales adecuados estarán claros para el experto, y por ejemplo incluyen el modelo de ratón (SCID)/ARH-77 (Sordillo y Pearse 2003, Cancer 97 (3 Supl.): 802-812); el modelo de ratón SCID-hu de MM humano (Sordillo y Pearse 2003, Cancer 97 (3 Supl.): 802-812; Tassone et al. 2005, Blood 106: 713-716); ratones transgénicos que sobreexpresan OPG bajo el control del promotor del gen de apoE y potenciador asociado (Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319); modelo de ratón de destrucción de hueso inducida por sarcoma (Honore et al. 2000, Nat. Med. 6: 521-528); modelos de animales sometidos a ovariectomía tales como, por ejemplo, monas sometidas a ovariectomía (Jerome et al. 1995, Bone 17: 403S-408S), ratonas sometidas a ovariectomía (Roggia et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20: 13960-13965) o ratas y macacos cangrejeros hembra sometidos a ovariectomía (Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319; Høegh-Andersen et al. 2004, Arthritis Res. Ther. 6: R169-R180); modelos de rata (animal) para artritis (Bendele et al. 1999, Toxicologic Pathology 27: 134-142; Romas et al. 2002, Am. J. Pathol.
161: 1419-1427; Mori et al. 2002, Histochemistry and Cell Biology 117: 283-292) tales como modelos para artritis inducida por colágeno o modelos para artritis inducida por adyuvante; modelos animales de hipercalcemia inducida por PTHrP derivada de tumor (Morony et al. 1999, J. Bone Miner. Res. 14: 1478-1485; Capparelli et al. 2000, Cancer Res. 60: 783-778); modelo murino de mieloma múltiple (Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289); modelo de enfermedad inflamatoria del intestino en ratones (Byrne et al. 2005, Gut 54: 78-86); ratones transgénicos que sobreexpresan MIF (Onodera et al. 2006, J. Bone Miner. Res. 21: 876-885); ratones transgénicos que sobreexpresan factor de diferenciación de osteoclastos soluble (sODF) (Mizuno et al. 2002, 20: 337-44); ratones transgénicos que expresan CSF-1 bajo el control del promotor/controlador de primer intrón de CSF-1R [ratones con transgén TgN(Csflr-Csfl)Ers (TgRC)] (Wei et al. 2006, J. Leukoc. Biol. 80: 1445-1453); ratones transgénicos que sobreexpresan factor de unión al núcleo alfa1 (Cbfa1) (Geoffroy et al. Mol. Cell Biol. 22: 6222-6233); ratones transgénicos que sobreexpresan el receptor señuelo 3 (DcR3) (Tang et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 2346-2354), así como los ensayos y modelos animales usados en la parte experimental a continuación y en la técnica anterior citada en el presente documento.
Además, secuencias de aminoácidos y polipéptidos que están dirigidos contra RANK-L de una primera especie de animal de sangre caliente pueden mostrar o no reactividad cruzada con RANK-L de una o más de otras especies de animal de sangre caliente. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano pueden mostrar o no reactividad cruzada con RANK-L de una o más de otras especies de primates (tales como, sin limitación, monos del género Macaca (tal como, y en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) y/o con RANK-L de una o más especies de animales que se usan a menudo en modelos animales para enfermedades (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con RANK-L (tales como las especies y los modelos animales mencionados en el presente documento). A este respecto, estará claro para el experto que tal reactividad cruzada, cuando está presente, puede tener ventajas desde un punto de vista de desarrollo de fármacos, puesto que permite que se sometan a prueba las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos contra RANK-L humano en tales modelos de enfermedad.
Más generalmente, secuencias de aminoácidos y polipéptidos que presentan reactividad cruzada con RANK-L de múltiples especies de mamífero serán ventajosos habitualmente para su uso en aplicaciones veterinarias, puesto que se permitirá que se use la misma secuencia de aminoácidos o el mismo polipéptido a través de múltiples especies. Por tanto, pueden usarse secuencias de aminoácidos y polipéptidos dirigidos contra RANK-L de una especie de animal (tales como secuencias de aminoácidos y polipéptidos contra RANK-L humano) en el tratamiento de otra especie de animal, siempre que el uso de las secuencias de aminoácidos y/o los polipéptidos proporcionen los efectos deseados en la especie que va a tratarse.
En una realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano presentan reacción cruzada con RANK-L de macaco cangrejero.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano presentan reacción cruzada con RANK-L de ratones o ratas.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano presentan reacción cruzada con RANK-L de macaco cangrejero y con RANK-L de ratones o ratas.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano no presentan reacción cruzada con RANK-L de ratones o ratas.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano presentan reacción cruzada con RANK-L de macaco cangrejero mientras que no presentan reacción cruzada con RANK-L de ratones o ratas.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano no presentan reacción cruzada con RANK-L de macaco cangrejero.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos dirigidos contra RANK-L humano no presentan reacción cruzada con RANK-L de macaco cangrejero ni con RANK-L de ratones o ratas.
Se supone y se prefiere generalmente que las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados de la invención estén dirigidos preferiblemente contra un sitio de interacción (tal como se define en el presente documento), y en particular contra el sitio de unión en RANK-L para RANK.
Por tanto, secuencias de aminoácidos y polipéptidos preferidos de la invención están dirigidos contra el sitio de unión al receptor de RANK en RANK-L, y son tal como se definen adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas. La unión de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención al sitio de unión al receptor de RANK en RANK-L puede inhibir y/o impedir la unión de RANK-L a RANK y por tanto inhibir y/o impedir la señalización que está mediada por esta unión RANK-L/RANK. Por tanto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención pueden actuar como antagonistas de la señalización mediada por RANK-L/RANK.
En otro aspecto de la presente invención, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados de la invención, definidos en las reivindicaciones, están dirigidos preferiblemente contra un epítopo en RANK-L que se solapa con el epítopo de denosumab. La unión de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos a un epítopo en RANK-L que se solapa con el epítopo de denosumab puede inhibir y/o impedir la unión de denosumab a RANK-L. Por tanto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos pueden actuar como inhibidor competitivo o no competitivo de la unión de denosumab a RANK-L (por ejemplo, en ELISA, en el ensayo AlphaScreen®, en el ensayo TRAP y/o en el ensayo de NF-kappaB).
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, un polipéptido de la invención puede contener dos
o más secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra RANK-L, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Generalmente, tales polipéptidos se unirán a RANK-L con avidez aumentada en comparación con una única secuencia de aminoácidos. Un polipéptido de este tipo comprende dos secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra el mismo determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (cuando sea aplicable) de RANK-L (que puede ser o no un sitio de interacción); la solicitud también describe polipéptidos que comprenden al menos una “primera” secuencia de aminoácidos que está dirigida contra un mismo y primer determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (cuando sea aplicable) de RANK-L (que puede ser o no un sitio de interacción); y al menos una “segunda” secuencia de aminoácidos que está dirigida contra un segundo determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación (cuando sea aplicable) diferente del primero (y que de nuevo puede ser o no un sitio de interacción). Preferiblemente, en tales polipéptidos “biparatópicos”, al menos una secuencia de aminoácidos está dirigida contra un sitio de interacción (tal como se define en el presente documento).
Por tanto, en un aspecto particular, un polipéptido de la invención puede comprender dos o más secuencias de aminoácidos de la invención que están dirigidas contra el sitio de unión para RANK en RANK-L; la solicitud también describe polipéptidos que comprenden al menos una “primera” secuencia de aminoácidos de la invención que está dirigida contra el sitio de unión para RANK en RANK-L; y al menos una “segunda” secuencia de aminoácidos de la invención que está dirigida contra un segundo determinante antigénico, epítopo, parte, dominio, subunidad o confirmación diferente de la primera y que no es un sitio de unión para RANK en RANK-L.
Además, cuando la diana forma parte de un par de unión (por ejemplo, un par de unión receptor-ligando), las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos pueden ser tales que compiten con la pareja de unión relacionada (por ejemplo, el ligando, receptor u otra pareja de unión, según sea aplicable) para la unión a la diana, y/o tales que neutralizan (total o parcialmente) la unión de la pareja de unión a la diana.
También se encuentra dentro del alcance de la divulgación que, cuando sea aplicable, una secuencia de aminoácidos de la invención puede unirse a dos o más determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios, subunidades o confirmaciones de RANK-L. En tal caso, los determinantes antigénicos, epítopos, partes, dominios o subunidades de RANK-L a los que se unen las secuencias de aminoácidos y/o los polipéptidos de la invención pueden ser esencialmente los mismos (por ejemplo, si RANK-L contiene motivos estructurales repetidos o se produce en forma multimérica). En un aspecto preferido, pero no limitativo, los polipéptidos de la invención se unen a dos o tres subunidades del trímero de RANK-L. Además, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que está unido a un ligando pertinente, pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que no está unido a un ligando pertinente, o pueden unirse a ambas de tales conformaciones (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes). Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que está unido a RANK, pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que no está unido a RANK, o pueden unirse a ambas de tales conformaciones (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes). Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que está unido a OPG, pueden unirse a una conformación de RANK-L en la que no está unido a OPG, o pueden unirse a ambas de tales conformaciones (de nuevo con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales o diferentes).
RANK-L existe en una forma unida a membrana y soluble. Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a cualquiera de estas formas, o preferiblemente las secuencias de aminoácidos y los
polipéptidos divulgados pueden unirse a ambas de estas formas. RANK-L existe en cuatro isoformas diferentes (véase anteriormente). Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a una cualquiera de las cuatro isoformas de RANK-L, o pueden unirse a más de una tal como dos, tres o las cuatro isoformas de RANK-L.
También se espera que las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados se unan generalmente a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos que se producen de manera natural o sintéticos de RANK-L; o al menos a aquellos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de RANK-L que contienen uno o más determinantes antigénicos o epítopos que son esencialmente iguales al/a los determinante(s) antigénico(s) o epítopo(s) a los que se unen las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados en RANK-L (por ejemplo, en RANK-L de tipo natural). De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos pueden unirse a tales análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que son iguales a, o que son diferentes de (es decir, mayores que o menores que), la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoácidos se unen a RANK-L (de tipo natural). Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a algunos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de RANK-L, pero no a otros.
Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a otros miembros de la familia de TNF relacionados (por ejemplo, TRAIL, TNF-alfa y/o ligando de CD40). En un aspecto preferido, sin embargo, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados no tendrán una afinidad detectable por miembros de la familia de TNF relacionados (es decir, una afinidad que es mayor de 10 veces, preferiblemente mayor de 100 veces, más preferiblemente mayor de 1000 veces menor que su afinidad por RANK-L). En un aspecto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados no tendrán una afinidad detectable por TRAIL. En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados no tendrán una afinidad detectable por TNF-alfa. En otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados no tendrán una afinidad detectable por el ligando de CD40. En aún otro aspecto, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados no tendrán una afinidad detectable por TRAIL, TNF-alfa y/o ligando de CD40.
De manera similar a todos los miembros de la familia de citocinas de TNF conocidos, RANK-L se autoagrega para dar trímeros asociados de manera no covalente. Cuando RANK-L existe en forma monomérica y en una o más formas multiméricas, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse únicamente a RANK-L en forma monomérica, unirse únicamente a RANK-L en forma multimérica, o unirse tanto a la forma monomérica como a la multimérica. De nuevo, en tal caso, las secuencias de aminoácidos divulgadas pueden unirse a la forma monomérica con una afinidad y/o especificidad que son iguales a, o que son diferentes de (es decir, mayores que o menores que), la afinidad y especificidad con que las secuencias de aminoácidos se unen a la forma multimérica.
Se acepta que RANK-L se une a una molécula receptora (RANK) a lo largo de cada una de las tres fisuras (o hendiduras) formadas por monómeros vecinos del homotrímero. De esta manera, el trímero de RANK-L presenta tres hendiduras de unión al receptor entre subunidades espacialmente distintas, pero equivalentes en las que se unen tres moléculas receptoras. Por tanto, para inhibir la interacción entre RANK-L y sus receptores, moléculas terapéuticas deben seleccionar como diana preferiblemente estas hendiduras de unión al receptor entre subunidades de RANK-L. Los Nanobodies (tal como se define adicionalmente en el presente documento) pueden mostrar las denominadas propiedades de unión a cavidad (entre otras cosas debido a su bucle de CDR3 extendido, en comparación con los dominios VH convencionales) y por tanto, son adecuados de manera ideal para la inhibición de la interacción de RANK-L con su receptor de RANK. Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a las hendiduras de unión al receptor entre subunidades de RANK-L
Además, cuando RANK-L puede asociarse con otras proteínas o polipéptidos para formar complejos proteicos (por ejemplo, con múltiples subunidades), las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados pueden unirse a RANK-L en su estado no asociado, se unen a RANK-L en su estado asociado, o se unen a ambos. En todos estos casos, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos pueden unirse a tales multímeros o complejos proteicos asociados con una afinidad y/o especificidad que pueden ser iguales a o diferentes de (es decir, mayores que o menores que) la afinidad y/o especificidad con que las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos se unen a RANK-L en su estado monomérico y no asociado.
Generalmente, las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos se unirán al menos a aquellas formas de RANK-L (incluyendo formas monoméricas, multiméricas y asociadas) que son las más relevantes desde un punto de vista biológico y/o terapéutico, tal como estará claro para el experto.
Además, generalmente, los polipéptidos de la invención que contienen dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies dirigidos contra RANK-L pueden unirse con mayor avidez que las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies monoméricos correspondientes.
Por ejemplo, y sin limitación, una proteína o un polipéptido multivalente (tal como se define en el presente documento) que contiene dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos contra
diferentes epítopos de RANK-L pueden unirse a RANK-L con mayor avidez que los monómeros correspondientes.
De manera más importante, una proteína o un polipéptido multivalente (tal como se define en el presente documento) que contiene dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos contra RANK-L pueden unirse (y habitualmente lo harán) con mayor avidez a un multímero de RANK-L que a un monómero de RANK-L y habitualmente también se unirán con mayor avidez que las secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies monoméricos correspondientes. En una proteína o un polipéptido multivalente de este tipo, las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies pueden estar dirigidos, por ejemplo, contra los mismos epítopos, epítopos sustancialmente equivalentes o diferentes epítopos. En una realización de una proteína o un polipéptido multivalente de este tipo, las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies pueden ser iguales (y por tanto estar dirigidos contra el mismo epítopo). Esto último es de particular importancia, ya que se sabe que el modo primario de transducción de señales por RANK-L implica la unión de receptores de RANK a un trímero de moléculas de RANK-L, que contiene tres sitios de unión al receptor (véase, por ejemplo, Lam et al. 2001, J. Clin. Invest. 108: 971-979).
En la presente invención, se ha encontrado que secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies son capaces de unirse a RANK-L de tal modo que se reduce la actividad de RANK-L, tanto en modelos in vitro como en modelos celulares (véase la sección experimental a continuación). Aunque la invención no se limita a ningún mecanismo, explicación o hipótesis específicos, se supone que debido a su pequeño tamaño y alta afinidad por RANK-L, dos o tres secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies monovalentes de la invención son capaces de ocupar simultáneamente dos o tres sitios de unión al receptor diferentes en el trímero de RANK-L, impidiendo por tanto que el trímero inicie la unión al receptor e inicie de ese modo la transducción de señales (sin embargo, no se excluyen otros mecanismos de acción: por ejemplo, dependiendo del epítopo contra el que esté dirigido, una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody de la invención también puede inhibir la asociación de RANK-L en el estado trimérico).
También debe indicarse que, además o como alternativa a la unión a dos o más sitios de unión al receptor en un único trímero de RANK-L, las proteínas o los polipéptidos de la presente invención que comprenden o consisten esencialmente en dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos contra epítopos de RANK-L pueden unirse a (por ejemplo, intermolecularmente) epítopos en dos moléculas de RANK-L independientes (por ejemplo, dos trímeros independientes).
La invención se refiere a un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos cada uno contra epítopos en RANK-L (y en particular en el trímero de RANK-L) que se encuentran en y/o forman parte del/de los sitio(s) de unión al receptor del trímero de RANK-L, de tal manera que dicho polipéptido, tras la unión a un trímero de RANK-L, es capaz de inhibir o reducir la unión al receptor de RANK que está mediada por dicho trímero de RANK-L y/o la transducción de señales que está mediada por tal unión al receptor.
En particular, la invención se refiere a un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos cada uno contra epítopos en RANK-L (y en particular en el trímero de RANK-L) que se encuentran en y/o forman parte del/de los sitio(s) de unión al receptor del trímero de RANK-L, en el que dichas secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies se unen entre sí de tal modo que la proteína o el polipéptido es capaz de unirse simultáneamente a dos o más sitios de unión al receptor en un único trímero de RANK-L (dicho de otro modo, es capaz unirse de manera intramolecular a al menos dos sitios de unión al receptor de RANK-L en un trímero de RANK-L). Las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies son Nanobodies (de modo que la proteína o el polipéptido es un constructo de Nanobody multivalente, tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies son los mismos y están dirigidos contra el mismo epítopo.
El polipéptido o constructo multivalente de la presente invención comprende o consiste esencialmente en al menos dos secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra y/o que pueden unirse específicamente a RANK-L elegidas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 572 y SEQ ID NO: 750-756.
Algunos constructos preferidos, pero no limitativos de la invención son SEQ ID NO: 643, 679, 761, 766 y 772.
En esta realización de la invención, las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies se unirán habitualmente mediante uno o más ligadores adecuados, ligadores que son tales que cada secuencia de aminoácidos y/o Nanobodies puede unirse a un sitio de unión al receptor diferente en el mismo trímero de RANK-L. Los ligadores adecuados dependerán, entre otras cosas, de (la distancia entre) los epítopos en el trímero de RANK-L al que se las secuencias de aminoácidos y/o los Nanobodies, y estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento, opcionalmente después de cierto grado limitado de experimentación de rutina. Pueden elegirse ligadores adecuados de los ligadores descritos en el presente documento, pero con una longitud de ligador que es tal que los dos o más Nanobodies se unen cada uno a un sitio de unión al receptor diferente en el mismo trímero de RANK-L.
Además, los dos o más Nanobodies que se unen a los sitios de unión al receptor de RANK-L también pueden unirse
entre sí mediante un tercer anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody (en el que los dos o más Nanobodies pueden unirse directamente al tercer anticuerpo de (un solo) dominio/Nanobody o mediante ligadores adecuados). Tal tercer anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody que proporciona una semivida aumentada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Por ejemplo, este último anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody puede ser un anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody que es capaz de unirse a una proteína sérica (humana) tal como albúmina sérica (humana), tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Algunos ejemplos no limitativos de tales constructos son los constructos de SEQ ID NO: 715 y 759. Tal tercer anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody que está dirigido contra y/o puede unirse a otro epítopo en RANK-L, proporcionando un anticuerpo biparatópico de (un solo) dominio o Nanobodies, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Alternativamente, las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que se unen al/a los sitio(s) de unión al receptor de RANK-L pueden unirse en serie (o bien directamente o bien mediante un ligador adecuado) y el tercer anticuerpo de (un solo) dominio o Nanobody (que puede proporcionar una semivida aumentada o que puede unirse a otro epítopo en RANK-L, tal como se describió anteriormente) puede conectarse directamente o mediante un ligador a una de estas dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies mencionados anteriormente.
Más generalmente, la distancia entre las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies debe ser tal que permita que la proteína o el polipéptido experimente unión intramolecular al trímero de RANK-L (es decir, en vez de de unión intermolecular). La distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L puede determinarse mediante cualquier medio adecuado, tal como mediante cristalografía o modelado molecular (tal como se describe, por ejemplo, por Lam et al. 2001, J. Clin. Invest.
108: 971-979). Estas técnicas también hacen que sea posible generalmente determinar si una proteína o un polipéptido multivalente o multiespecífico específico es capaz de proporcionar modelado intramolecular. Alternativamente, podría usarse cromatografía de exclusión molecular (tal como se describe por Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129) para determinar si una proteína o un polipéptido dado de la invención proporcionará (predominantemente) unión intramolecular a un trímero de RANK-L o (predominantemente) unión intermolecular entre dos o más trímeros de RANK-L. Por tanto, en una realización particular de la invención, una proteína o un polipéptido de la invención es preferiblemente tal que, en este experimento, conduce de manera predominante o esencialmente exclusiva a unión intramolecular. Sin embargo, tal como se hizo hincapié anteriormente, debe indicarse que proteínas o polipéptidos de la invención que actúan mediante unión intermolecular de moléculas de RANK-L independientes (por ejemplo, trímeros) también se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Por tanto, en otro aspecto preferido, la invención proporciona una proteína o un polipéptido multivalente o multiespecífico que comprende al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies contra RANK-L (y en particular del trímero de RANK-L), tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, en los que dichas al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies se unen de tal modo que la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L es tal que la proteína o el polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L.
En una proteína o un polipéptido preferido de este tipo, las dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies puede unirse de cualquier modo adecuado, siempre que pueda lograrse la distancia preferida entre el extremo Nterminal y el extremo C-terminal de las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L, y/o siempre que la proteína o el polipéptido sea capaz de experimentar unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L.
Por ejemplo, en su forma más sencilla, las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies se unen directamente mediante un ligador o espaciador adecuado que proporciona la distancia preferida entre el extremo Nterminal y el extremo C-terminal de las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L y que puede permitir que la proteína o el polipéptido experimente unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L. Se describen ligadores adecuados en el presente documento y pueden comprender, por ejemplo y sin limitación, una secuencia de aminoácidos, secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente una longitud de desde 1 hasta 50 aminoácidos o más, más preferiblemente desde 5 hasta 30 aminoácidos, tal como de aproximadamente 9 a 20 aminoácidos. Preferiblemente, tal secuencia de aminoácidos también debe ser tal que permita que la proteína o el polipéptido experimenten unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L.
Por tanto, en otro aspecto preferido, la invención proporciona una proteína o un polipéptido multivalente o multiespecífico que comprende al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies contra RANK-L (y en particular el trímero de RANK-L), tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, en los que dichas secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies preferiblemente se unen directamente entre sí usando un ligador o espaciador adecuado de tal manera que la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L es tal que la proteína o el polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L.
Más preferiblemente, en este aspecto preferido, el ligador o espaciador es una secuencia de aminoácidos que tiene preferiblemente una longitud de desde 1 hasta 50 aminoácidos o más, más preferiblemente desde 5 hasta 30 aminoácidos, tal como de aproximadamente 9 a 20 aminoácidos. En una realización preferida, pero no limitativa, el ligador consiste esencialmente en residuos de glicina y serina (tal como se describe adicionalmente a continuación). Por ejemplo, un ligador adecuado es el ligador GS9 descrito en el presente documento, que comprende 9 residuos de aminoácido, el ligador GS15 descrito en el presente documento, que comprende 15 residuos de aminoácido, el ligador GS20 descrito en el presente documento, que comprende 20 residuos de aminoácido y el ligador GS30 descrito en el presente documento, que comprende 30 residuos de aminoácido.
En otra realización, las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies contra RANK-L se unen entre sí mediante otro resto (opcionalmente mediante uno o dos ligadores), tal como otra proteína o polipéptido. En esta realización, puede desearse tener la distancia preferida (es decir, tal como se mencionó anteriormente) entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies anti-RANK-L, por ejemplo de tal manera que la proteína o el polipéptido pueda experimentar todavía unión intramolecular (tal como se describe en el presente documento) con un trímero de RANK-L. En esta realización, las al menos dos secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies puede unirse directamente al otro resto, o usar un ligador o espaciador adecuado, de nuevo siempre que todavía pueda lograrse la distancia preferida y/o unión intramolecular deseada. El resto puede ser cualquier resto adecuado que no reduzca (demasiado) la unión de la proteína o el polipéptido a RANK-L y/o las propiedades biológicas o farmacológicas deseadas adicionales de la proteína o el polipéptido. Como tal, el resto puede ser esencialmente inactivo o puede ser biológicamente activo, y como tal puede mejorar o no las propiedades deseadas de la proteína o el polipéptido y/o puede conferir una o más propiedades deseadas adicionales a la proteína o el polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede mejorar la semivida de la proteína o el polipéptido, y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada. En una realización preferida, el resto puede ser otra secuencia de aminoácidos y/o Nanobody (incluyendo pero sin limitarse a una tercera secuencia de aminoácidos y/o Nanobody contra RANK-L, aunque esto no es necesario y habitualmente menos preferido), y en particular otra secuencia de aminoácidos y/o Nanobody que mejora la semivida de la proteína o el polipéptido, tal como una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody que está dirigido contra una proteína sérica, por ejemplo contra albúmina sérica humana. Se describen ejemplos de tales proteínas y polipéptidos en el presente documento.
Por tanto, en una realización, la invención se refiere a un constructo multiespecífico multivalente que comprende dos
o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies que están dirigidos cada uno contra epítopos en RANK-L (por ejemplo, en el trímero de RANK-L) que se encuentran en y/o forman parte del sitio de unión al receptor, y que se unen entre sí mediante al menos una secuencia de aminoácidos y/o Nanobody que proporciona una semivida aumentada (y opcionalmente mediante uno o más ligadores adecuados), de tal manera que dicho polipéptido, tras la unión a un trímero de RANK-L, es capaz de inhibir o reducir la unión al receptor de RANK y/o la transducción de señales que está mediada por dicho trímero de RANK-L. Un polipéptido de este tipo puede ser tal que dichas primeras dos o más secuencias de aminoácidos y/o Nanobodies mencionados pueden unirse cada uno a un sitio de unión al receptor diferente en un trímero de RANK-L.
En particular, en esta realización, el polipéptido puede comprender un Nanobody biespecífico trivalente, que comprende dos Nanobodies que están dirigidos cada uno contra epítopos en RANK-L (y en particular del trímero de RANK-L) que se encuentran en y/o forman parte del sitio de unión al receptor, en el que dichos Nanobodies se unen entre sí mediante un tercer Nanobody que proporciona una semivida aumentada (por ejemplo, un Nanobody que está dirigido a una proteína sérica tal como albúmina sérica humana), en el que cada uno de los dos primeros Nanobodies mencionados puede unirse directamente a dicho tercer Nanobody o mediante uno o más ligadores adecuados, de tal manera que dicho polipéptido, tras la unión a un trímero de RANK-L, es capaz de inhibir o reducir la unión al receptor de RANK y/o la transducción de señales que está mediada por dicho trímero de RANK-L. Un Nanobody para su uso en la invención es SEQ ID NO: 572, así como variantes humanizadas del mismo (SEQ ID NO: 750 a 756); y los Nanobodies dirigidos contra albúmina sérica humana descritos en el presente documento. Algunos constructos preferidos, pero no limitativos de esta realización de la invención son SEQ ID NO: 715 y 759.
También se encuentra dentro del alcance de esta divulgación usar derivados de las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos de la invención, y/o usar proteínas o polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en uno o más de tales derivados, siempre que estos sean adecuados para los usos previstos en el presente documento. Tales derivados contendrán habitualmente un sitio de unión a antígeno funcional para la unión contra RANK-L; y más preferiblemente serán capaces de unirse de manera específica a RANK-L, e incluso más preferiblemente capaces de unirse RANK-L con una afinidad (medida adecuadamente y/o expresada como valor de KD (real o aparente), un valor de KA (real o aparente), una velocidad kon y/o una velocidad koff, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento. Algunos ejemplos no limitativos de tales derivados, proteínas y/o polipéptidos resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento. En un aspecto específico, pero no limitativo de la invención, que se describirá adicionalmente en el presente documento, tales derivados tienen una semivida aumentada en suero (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que derivan. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos divulgada puede unirse
(químicamente o de otro modo) a uno o más grupos o restos que prolongan la semivida (tales como PEG), para proporcionar un derivado de una secuencia de aminoácidos con semivida aumentada.
La secuencia de aminoácidos divulgada es una secuencia de aminoácidos que comprende un plegamiento de inmunoglobulina o una secuencia de aminoácidos que, en condiciones adecuadas (tal como condiciones fisiológicas) es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina (es decir, mediante plegamiento). Se hace referencia, entre otros, a la revisión de Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71. Preferiblemente, cuando se pliega apropiadamente para formar un plegamiento de inmunoglobulina, tal secuencia de aminoácidos es capaz de unirse de manera específica (tal como se define en el presente documento) a RANK-L; y más preferiblemente capaz de unirse a RANK-L con una afinidad (medida adecuadamente y/o expresada como valor de KD (real o aparente), un valor de KA (real o aparente), una velocidad kon y/o una velocidad koff, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento. Además, derivados de tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente tales que comprenden un plegamiento de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un plegamiento de inmunoglobulina.
Las secuencias de aminoácidos divulgadas pueden ser secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente).
La secuencia de aminoácidos divulgada puede ser, en particular, una secuencia de inmunoglobulina, y más en particular una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina o una denominada secuencia de VHH (tal como se define en el presente documento) que deriva de un denominado “anticuerpo de cadena pesada” (tal como se define en el presente documento).
Sin embargo, debe indicarse que la divulgación no está limitada en cuanto al origen de la secuencia de aminoácidos descrita (o de la secuencia de nucleótidos usada para expresarla), ni en cuanto al modo en que se generó o obtuvo (o se ha generado u obtenido) la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos. Por tanto, las secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que se producen de manera natural (de cualquier especie adecuada) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semisintéticas. En un aspecto específico, pero no limitativo, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de inmunoglobulina que se produce de manera natural o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semisintética, incluyendo pero sin limitarse a secuencias de inmunoglobulina “humanizadas” (tal como se define en el presente documento) (tales como secuencias de VHH o Nanobodies parcial
o totalmente humanizados). Por ejemplo, se hace referencia a los manuales convencionales, así como a la descripción adicional y técnica anterior mencionadas en el presente documento.
De manera similar, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser secuencias de nucleótidos que se producen de manera natural o secuencias sintéticas o semisintéticas, y pueden ser, por ejemplo, secuencias que se aíslan mediante PCR de un molde que se produce de manera natural adecuado (por ejemplo, ADN o ARN aislado de una célula), secuencias de nucleótidos que se han aislado de una biblioteca (y en particular, una biblioteca de expresión), secuencias de nucleótidos que se han preparado introduciendo mutaciones en una secuencia de nucleótidos que se produce de manera natural (usando cualquier técnica adecuada conocida en sí misma, tal como PCR de apareamiento erróneo), secuencias de nucleótidos que se han preparado mediante PCR usando cebadores solapantes, o secuencias de nucleótidos que se han preparado usando técnicas para la síntesis de ADN conocidas en sí mismas.
La secuencia de aminoácidos divulgada es un Nanobody (tal como se define en el presente documento, e incluyendo pero sin limitarse a una secuencia de VHH);. Para una descripción general de anticuerpos de (un solo) dominio, también se hace referencia a la técnica anterior citada previamente, así como al documento EP 0 368 684. Para el término “dAb”, se hace referencia, por ejemplo, a Ward et al. (Nature 12 de octubre de 1989; 341 (6242): 544-6), a Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; así como, por ejemplo, a los documentos WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. También debe indicarse que, aunque menos preferido en el contexto de la presente invención porque no proceden de mamíferos, anticuerpos de un solo dominio o dominios variables individuales pueden derivar de determinadas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados “dominios IgNAR”, véase, por ejemplo, el documento WO 05/18629).
En particular, la secuencia de aminoácidos de la invención puede ser un Nanobody® (tal como se define en el presente documento) o un fragmento adecuado del mismo. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® y Nanoclone® son marcas registradas de Ablynx N.V.] Tales Nanobodies dirigidos contra RANK-L también se denominarán en el presente documento “Nanobodies de la invención”.
Para una descripción general de los Nanobodies, se hace referencia a la descripción adicional a continuación, así como a la técnica anterior citada en el presente documento. A este respecto, sin embargo debe indicarse que esta descripción y la técnica anterior describieron principalmente Nanobodies de los denominados “clase de VH3” (es decir, Nanobodies con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de línea germinal humana de la clase de VH3 tales como DP-47, DP-51 o DP-29). Sin embargo, debe indicarse que la solicitud en su sentido más amplio cubre generalmente cualquier tipo de Nanobody dirigido contra RANK-L, y por ejemplo también cubre los
Nanobodies pertenecientes a la denominada “clase de VH4” (es decir, Nanobodies con un alto grado de homología de secuencia con secuencias de línea germinal humana de la clase de VH4 tales como de tipo P-78), tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 07/118670.
Generalmente, los Nanobodies (en particular secuencias de VHH y Nanobodies parcialmente humanizados) pueden estar caracterizados, en particular, por la presencia de uno o más “residuos distintivos” (tal como se describe en el presente documento) en uno o más de las secuencias de región de entramado (de nuevo tal como se describe adicionalmente en el presente documento).
Por tanto, generalmente, un Nanobody puede definirse como una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 -CDR1 -FR2-CDR2 -FR3-CDR3 -FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que uno o más de los residuos distintivos son tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
En particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 -CDR1 -FR2-CDR2 -FR3-CDR3 -FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que las secuencias de región de entramado son tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
Más en particular, un Nanobody puede ser una secuencia de aminoácidos con la estructura (general)
FR1 -CDR1 -FR2-CDR2 -FR3-CDR3 -FR4
en la que FR1 a FR4 se refieren a las regiones de entramado 1 a 4, respectivamente, y en la que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en la que:
i) preferiblemente uno o más de los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108 según la numeración de Kabat se eligen de los residuos distintivos mencionados en la tabla A-3 a continuación;
y en la que:
ii) dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de aminoácidos de al menos el 80 % con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 22, en las que con el propósito de determinar el grado de identidad de aminoácidos, no se consideran los residuos de aminoácido que forman las secuencias de CDR (indicadas con X en las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 22).
En estos Nanobodies, las secuencias de CDR son generalmente tal como se definen adicionalmente en el presente documento.
Por tanto, la solicitud describe tales Nanobodies que pueden unirse a (tal como se define en el presente documento) y/o están dirigidos contra RANK-L, fragmentos adecuados del mismo, así como polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de tales Nanobodies y/o fragmentos adecuados.
SEQ ID NO: 560-621 proporcionan las secuencias de aminoácidos de varias secuencias de VHH que se han producido contra RANK-L.
En particular, la invención proporciona:
-
secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra (tal como se define en el presente documento) RANK-L y que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 572. Estas secuencias de aminoácidos son tales que neutralizan la unión de RANK a RANK-L; y/o compiten con RANK por la unión a RANK-L; y/o están dirigidas contra un sitio de interacción (tal como se define en el presente documento) en RANK-L (tal como el sitio de unión a RANK); secuencias de aminoácidos que pueden ser tal como se describe adicionalmente en el presente documento (y pueden ser, por ejemplo, Nanobodies); así como polipéptidos de la invención que comprenden uno o más de tales secuencias de aminoácidos (que pueden ser tal como se describe adicionalmente en el presente documento, y pueden ser, por ejemplo, polipéptidos biespecíficos y/o biparatópicos tal como se describe en el presente documento), y secuencias de ácido nucleico que codifican tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos. Tales secuencias de aminoácidos y polipéptidos no incluyen cualquier ligando que se produzca de manera natural.
De nuevo, tales Nanobodies pueden derivar de cualquier manera adecuada y de cualquier fuente adecuada, y pueden ser, por ejemplo, secuencias de VHH que se producen de manera natural (es decir, de una especie adecuada de camélido) o secuencias de aminoácidos sintéticas o semisintéticas, incluyendo pero sin limitarse a Nanobodies “humanizados” (tal como se define en el presente documento). Además, cuando un Nanobody comprende una secuencia de VHH, dicho Nanobody puede humanizarse de manera adecuada, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, para proporcionar uno o más Nanobodies humanizados (parcial o totalmente) adicionales de la invención. De manera similar, cuando un Nanobody comprende una secuencia sintética o semisintética (tal como una secuencia parcialmente humanizada), dicho Nanobody opcionalmente puede humanizarse de manera adecuada adicionalmente, de nuevo tal como se describe en el presente documento, de nuevo para proporcionar uno o más Nanobodies humanizados (parcial o totalmente) adicionales de la invención.
En particular, los Nanobodies humanizados pueden ser secuencias de aminoácidos que son tal como se definen generalmente para Nanobodies en los párrafos anteriores, pero en el que al menos un residuo de aminoácido está presente (y en particular, en al menos uno de los residuos de región de entramado) que es y/o que corresponde a una sustitución de humanización (tal como se define en el presente documento). Algunas sustituciones de humanización preferidas, pero no limitativas (y combinaciones adecuadas de las mismas) resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento. Además, o alternativamente, otras sustituciones de humanización potencialmente útiles pueden determinarse comparando la secuencia de las regiones de entramado de una secuencia de VHH que se produce de manera natural con la secuencia de región de entramado correspondiente de una o más secuencias de VH humanas estrechamente relacionadas, después de lo cual pueden introducirse una o más de las sustituciones de humanización potencialmente útiles (o combinaciones de las mismas) así determinadas en dicha secuencia de VHH (de cualquier manera conocida en sí misma, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) y las secuencias de VHH humanizadas resultantes pueden someterse a prueba para determinar la afinidad por la diana, para determinar la estabilidad, para determinar la facilidad y el nivel de expresión y/o determinar otras propiedades deseadas. De esta manera, por medio de un grado limitado de ensayo y error, el experto puede determinar otras sustituciones de humanización adecuadas (o combinaciones adecuadas de las mismas) basándose en la divulgación en el presente documento. Además, basándose en lo anterior, puede(n) humanizarse parcialmente o humanizarse totalmente (las regiones de entramado de) un Nanobody.
Los Nanobodies humanizados de la invención son variantes humanizadas del Nanobody de SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 750-756.
La secuencia de aminoácidos divulgada puede ser tal que CDR1 es SEQ ID NO: 200; y CDR2 SEQ ID NO: 324; y CDR3 es SEQ ID NO: 448.
Además, tales secuencias de aminoácidos son preferiblemente tales que pueden unirse específicamente (tal como se define en el presente documento) a RANK-L; y más en particular se unen a RANK-L con una afinidad (medida adecuadamente y/o expresada como valor de KD (real o aparente), un valor de KA (real o aparente), una velocidad kon y/o una velocidad koff, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento.
En tal secuencia de aminoácidos, las secuencias de región de entramado pueden ser cualquier secuencia de región de entramado adecuada, y los ejemplos de secuencias de región de entramado adecuadas estarán claros para el experto, por ejemplo basándose en los manuales convencionales y la divulgación adicional y técnica anterior mencionadas en el presente documento.
Las secuencias de región de entramado son preferiblemente (una combinación adecuada de) secuencias de región de entramado de inmunoglobulina o secuencias de región de entramado que han derivado de secuencias de región de entramado de inmunoglobulina (por ejemplo, mediante humanización). La secuencia de región de entramado deriva de una secuencia de VHH (en la que dichas secuencias de región de entramado opcionalmente pueden haberse humanizado parcial o totalmente).
Las secuencias de región de entramado son tales que la secuencia de aminoácidos de la invención es un Nanobody™ (incluyendo pero sin limitarse una secuencia de VHH). En otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto o constructo, y en particular una proteína o un polipéptido (también denominados en el presente documento un “compuesto de la invención” o “polipéptido de la invención”, respectivamente) que comprende o consiste esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos de la invención (o fragmentos adecuados de las mismas), y comprende opcionalmente además uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión. Tal como resultará evidente para el experto a partir de la divulgación adicional en el presente documento, tales grupos, residuos, restos, unidades de unión o secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar o no funcionalidad adicional a la secuencia de aminoácidos de la invención (y/o al compuesto o constructo en el que está presente) y pueden modificar o no las propiedades de la secuencia de aminoácidos de la invención.
Por ejemplo, tales grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales pueden ser una o más secuencias de aminoácidos adicionales, de tal manera que el compuesto o constructo es una proteína (de fusión) o un polipéptido
(de fusión). En un aspecto preferido pero no limitativo, dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de inmunoglobulina. Incluso más preferiblemente, dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies.
Alternativamente, tales grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden ser, por ejemplo, grupos químicos, residuos, restos, que pueden ser o no por sí mismos biológica y/o farmacológicamente activos. Por ejemplo, y sin limitación, tales grupos pueden unirse a la una o más secuencias de aminoácidos de la invención para proporcionar un “derivado” de una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
También se encuentran dentro del alcance de la presente invención compuestos o constructos tal como se define en las reivindicaciones adjuntas que comprenden o consisten esencialmente en uno o más derivados tal como se describe en el presente documento, y comprenden opcionalmente además uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión, opcionalmente unidos mediante uno o más ligadores. Preferiblemente, dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de aminoácidos.
En los compuestos o constructos descritos anteriormente, la una o más secuencias de aminoácidos de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, y el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión pueden unirse directamente entre sí y/o mediante uno o más ligadores o espaciadores adecuados. Por ejemplo, cuando el uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de aminoácidos, los ligadores también pueden ser secuencias de aminoácidos, de modo que el compuesto o constructo resultante es una fusión (de proteína) o fusión (de polipéptido).
Los compuestos o polipéptidos de la invención pueden prepararse generalmente mediante un método que comprende al menos una etapa de unir de manera adecuada la una o más secuencias de aminoácidos de la invención al uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, opcionalmente mediante el uno o más ligadores adecuados, para proporcionar el compuesto o polipéptido de la invención. También pueden prepararse polipéptidos de la invención mediante un método que comprende generalmente al menos las etapas de proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, expresar dicho ácido nucleico de manera adecuada, y recuperar el polipéptido expresado de la invención. Tales métodos pueden realizarse de una manera conocida en sí misma, que estarán claros para el experto, por ejemplo basándose en los métodos y las técnicas descritos adicionalmente en el presente documento.
El procedimiento de diseñar/seleccionar y/o preparar un compuesto o polipéptido de la invención, partiendo de una secuencia de aminoácidos de la invención, también se denomina en el presente documento “cambio de formato” de dicha secuencia de aminoácidos de la invención; y un aminoácido de la invención que se hace que forme parte de un compuesto o polipéptido de la invención se dice que se ha “cambiado de formato” o que está “en el formato de” dicho compuesto o polipéptido de la invención. Los ejemplos de modos en los que puede cambiarse de formato una secuencia de aminoácidos de la invención y ejemplos de tales formatos estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento; y tales secuencias de aminoácidos cambiadas de formato forman un aspecto adicional de la invención.
En un aspecto específico de la invención, un compuesto de la invención o un polipéptido de la invención pueden tener una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales compuestos y polipéptidos resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento y por ejemplo comprenden secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para aumentar la semivida de las mismas (por ejemplo, por medio de pegilación); secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden al menos un sitio de unión adicional para la unión a una proteína sérica (tal como albúmina sérica); o polipéptidos de la invención que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de la invención que se une a al menos un resto (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la semivida de la secuencia de aminoácidos de la invención. Los ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden tales restos o secuencias de aminoácidos que prolongan la semivida resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento; y por ejemplo incluyen, sin limitación, polipéptidos en los que la una o más secuencias de aminoácidos de la invención se unen de manera adecuada a una o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tales como albúmina sérica (humana) o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, por ejemplo, anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a proteínas séricas tales como albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana), inmunoglobulinas séricas tales como IgG, o transferrina; se hace referencia a la descripción adicional y las referencias mencionadas en el presente documento); polipéptidos en los que una secuencia de aminoácidos de la invención se une a una parte Fc (tal como un Fc
humano) o una parte o un fragmento adecuado de la misma; o polipéptidos en los que la una o más secuencias de aminoácidos de la invención se unen de manera adecuada a una o más proteínas o péptidos pequeños que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, sin limitación, las proteínas y los péptidos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y WO 2008/068280.
Generalmente, los compuestos o polipéptidos de la invención con semivida aumentada tienen preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí misma. Por ejemplo, los compuestos o polipéptidos de la invención con semivida aumentada pueden tener una semivida que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí misma.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, tales compuestos o polipéptidos de la invención tienen una semivida en suero que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí misma.
En otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, tales compuestos o polipéptidos de la invención presentan una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, compuestos o polipéptidos de la invención puede tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención (o un fragmento adecuado del mismo). Tal ácido nucleico también se denominará en el presente documento un “ácido nucleico de la invención” y pueden estar, por ejemplo, en forma de un constructo genético, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped o un huésped no humano que expresa (o que en circunstancias adecuadas es capaz de expresar) un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales huéspedes o células huésped resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La invención se refiere además a un producto o una composición que contiene o que comprende al menos un polipéptido de la invención y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones conocidos en sí mismos, es decir dependiendo del uso pretendido de la composición. Tal producto o composición puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica (tal como se describe en el presente documento), una composición veterinaria o un producto o una composición para uso diagnóstico (tal como se describe también en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales productos o composiciones resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención, o de una composición que comprende el mismo, en (métodos o composiciones para) modular RANK-L, o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en un organismo unicelular o pluricelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de o padece una enfermedad o un trastorno óseo).
La invención también se refiere a métodos para modular RANK-L, o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en un organismo unicelular o pluricelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de o padece una enfermedad o un trastorno óseo), método que comprende al menos la etapa de poner en contacto RANK-L con al menos un polipéptido de la invención, o con una composición que comprende el mismo, de una manera y en una cantidad adecuada para modular RANK-L, con al menos una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición (tal como, sin limitación, una composición o preparación farmacéutica tal como se describe adicionalmente en el presente documento) para modular RANK-L, o bien in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro o celular) o bien in vivo (por ejemplo, en un organismo unicelular o pluricelular, y en particular en un mamífero, y más en particular en un ser humano, tal como en un ser humano que corre el riesgo de o padece una enfermedad o un trastorno óseo).
En el contexto de la presente invención, “modular” o “para modular” significa generalmente o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de, RANK-L, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento). En particular, “modular” o “para modular” puede significar o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de RANK-L, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (tales como los mencionados en el presente documento), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con actividad de RANK-L en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del polipéptido de la invención.
Tal como estará claro para el experto, “modular” también puede implicar realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminución) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de RANK-L para una o más de sus dianas, ligandos o sustratos; y/o realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminución) en la sensibilidad de RANK-L para una o más condiciones en el medio o los alrededores en el que RANK-L está presente (tal como pH, fuerza iónica, la presencia de cofactores, etc.), en comparación con las mismas condiciones pero sin la presencia del polipéptido de la invención. Tal como estará claro para el experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido en sí mismo, tales como los ensayos descritos en el presente documento o en la técnica anterior citada en el presente documento.
“Modular” también puede significar realizar un cambio (es decir, una actividad como agonista o como antagonista, respectivamente) con respecto a uno o más mecanismos, efectos, respuestas, funciones, rutas o actividades biológicos o fisiológicos en los que está implicado RANK-L (o en los que están implicados sus sustrato(s) o ruta(s), tales como su ruta de señalización o ruta metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados). De nuevo, tal como estará claro para el experto, tal acción como agonista o antagonista puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (ensayo in vitro y habitualmente celular o in vivo) conocido en sí mismo, tales como los ensayos descritos en el presente documento o en la técnica anterior citada en el presente documento. En particular, una acción como agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biológica o fisiológica pretendida está aumentada o disminuida, respectivamente, en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del polipéptido de la invención.
Modular puede implicar, por ejemplo, reducir o inhibir la unión de RANK-L a uno de sus sustratos o ligandos y/o competir con un ligando natural, sustrato para la unión a RANK-L. Modular también puede implicar activar RANK-L o el mecanismo o la ruta en el que participa. Modular puede ser reversible o irreversible, pero con propósitos farmacéuticos y farmacológicos habitualmente será de manera reversible.
La invención se refiere además a aplicaciones y usos de los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento, así como a métodos para la prevención y/o el tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con RANK-L. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitativos resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La invención también se refiere a los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en tratamiento.
En particular, la invención también se refiere a los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno que puede prevenirse o tratarse administrando, a un sujeto que lo necesita, (una cantidad farmacéuticamente eficaz de) una secuencia de aminoácidos, compuesto, constructo o polipéptido tal como se describe en el presente documento.
Más en particular, la invención se refiere a los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención también resultarán claras a partir de la descripción adicional en el presente documento, en la que se describirá y comentará la invención con más detalle con referencia a los Nanobodies de la invención y polipéptidos de la invención que comprenden los mismos, que forman algunos de los aspectos preferidos de la invención.
Tal como resultará evidente a partir de la descripción adicional en el presente documento, los Nanobodies ofrecen generalmente determinadas ventajas (expuestas en el presente documento) en comparación con “dAb” o anticuerpos similares de (un solo) dominio o secuencias de inmunoglobulina, ventajas que también se proporcionan por los Nanobodies de la invención. Sin embargo, estará claro para el experto que los aspectos más generales de
las enseñanzas a continuación también pueden aplicarse (o bien directamente o bien de manera análoga) a otras secuencias de aminoácidos de la invención.
Descripción detallada de la invención
En la presente descripción, los ejemplos y las reivindicaciones:
a) A menos que se indique o defina de otro modo, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que estarán claros para el experto. Por ejemplo, se hace referencia a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2.ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., (1985); Old et al., “Principios of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2.ª edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6.ª ed.), Mosby/ Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10.ª ed. Blackwell Publishing, R.U. (2001); y Janeway et al., “Immunobiology” (6.ª ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), así como a los antecedentes generales de la técnica citados en el presente documento;
b) A menos que se indique de otro modo, el término “secuencia de inmunoglobulina”, ya se use en el presente documento para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de 4 cadenas convencional, se usa como término general para incluir tanto el anticuerpo de longitud completa, las cadenas individuales del mismo, así como todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluyendo pero sin limitarse a fragmentos o dominios de unión a antígeno tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Además, el término “secuencia” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo, en términos como “secuencia de inmunoglobulina”, “secuencia de anticuerpo”, “secuencia de dominio variable”, “secuencia de VHH” o “secuencia de proteína”), debe entenderse generalmente que incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante así como secuencias de ácido nucleico o secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, a menos el contexto requiera una interpretación más limitada;
c) A menos que se indique de otro modo, todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle pueden realizarse y se han realizado de una manera conocida en sí misma, tal como estará claro para el experto. Por ejemplo, se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales y los antecedentes generales de la técnica mencionados en el presente documento y a las referencias adicionales citadas en esos documentos; así como, por ejemplo, a las siguientes revisiones: Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (56): 640-56; Levin y Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Supl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, que describen técnicas para la ingeniería de proteínas, tal como maduración por afinidad y otras técnicas para mejorar la especificidad y otras propiedades deseadas de proteínas tales como inmunoglobulinas.
d) Se indicarán los residuos de aminoácido según el código para aminoácidos de tres letras o de una letra convencional, tal como se menciona en la tabla A-2;

Tabla A-2: código para aminoácidos de tres letras y de una letra
Apolar, no cargado (a pH 6,07,0)(3)
Alanina Ala A
Valina
Val V
Leucina
Leu L
Isoleucina
Ile I
Fenilalanina
Phe F
Metionina(1)
Met M
Triptófano
Trp W
Prolina
Pro P
Polar, no cargado (a pH 6,07,0)
Glicina(2) Gly G
Serina
Ser S
Treonina
Thr T
Cisteína
Cys C
Asparagina
Asn N
Glutamina
Gln Q
Tirosina
Tyr Y
Polar, cargado (a pH 6,07,0)
Lisina Lys K
Arginina
Arg R
Histidina(4)
His H
Aspartato
Asp D
Glutamato
Glu E
Notas:
(1)
A veces también se considera que es un aminoácido polar no cargado.
(2)
A veces también se considera que es un aminoácido apolar no cargado.
(3)
Tal como estará claro para el experto, el hecho de que se haga referencia a un residuo de aminoácido en esta tabla como que o bien está cargado o bien no está cargado a un pH de 6,0 a 7,0 no se refleja en modo alguno en la carga que dicho residuo de aminoácido puede tener a un pH menor de 6,0 y/o a un pH mayor de 7,0; los residuos de aminoácido mencionados en la tabla pueden o bien estar cargados y/o bien no estar cargados a tales pH mayores o menores, tal como estará claro para el experto.
(4)
Tal como se conoce en la técnica, la carga de un residuo de His depende enormemente incluso de pequeños cambios de pH, pero un residuo de His generalmente puede considerarse esencialmente no cargado a un pH de aproximadamente 6,5.
e) Con el propósito de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de “identidad de secuencia” entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos puede calcularse dividiendo [el número de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de nucleótidos] entre [el número total de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos] y multiplicando por [100 %], en el que cada deleción, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos, en comparación con la primera secuencia de nucleótidos, se considera una diferencia en un único nucleótido (posición).
Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos puede calcularse usando un algoritmo informático conocido para la alineación de secuencias tal como NCBI Blast v2.0, usando configuraciones convencionales. Se describen algunas otras técnicas, algoritmos informáticos y configuraciones para determinar el grado de identidad de secuencia, por ejemplo, en los documentos WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 y GB 2 357 768-A. Habitualmente, con el propósito de determinar el porcentaje de “identidad de secuencia” entre dos secuencias de nucleótidos según el método de cálculo expuesto anteriormente en el presente documento, la secuencia de nucleótidos con el mayor número de nucleótidos se tomará como la “primera” secuencia de nucleótidos, y la otra secuencia de nucleótidos se tomará como la “segunda” secuencia de nucleótidos;
f) Con el propósito de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de “identidad de secuencia” entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos (también denominado en el presente documento “identidad de aminoácidos”) puede calcularse dividiendo [el número de residuos de aminoácido en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes en la segunda secuencia de aminoácidos] entre [el número total de residuos de aminoácido en la primera secuencia de aminoácidos] y multiplicando por [100 %], en el que cada deleción, inserción, sustitución o adición de un residuo de aminoácido en la segunda secuencia de aminoácidos, en comparación con la primera secuencia de aminoácidos, se considera una diferencia en un único residuo de aminoácido (posición), es decir una “diferencia de aminoácido” tal como se define en el presente documento.
Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede calcularse usando un algoritmo informático conocido, tales como los mencionados anteriormente para determinar el grado de identidad de secuencia para secuencias de nucleótidos, de nuevo usando configuraciones convencionales.
Habitualmente, con el propósito de determinar el porcentaje de “identidad de secuencia” entre dos secuencias de aminoácidos según el método de cálculo expuesto anteriormente en el presente documento, la secuencia de aminoácidos con el mayor número de residuos de aminoácido se tomará como la “primera” secuencia de aminoácidos, y la otra secuencia de aminoácidos se tomará como la “segunda” secuencia de aminoácidos.
Además, al determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, el experto puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos “conservadoras”, que pueden describirse generalmente como sustituciones de aminoácidos en las que un residuo de aminoácido se reemplaza por otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que tiene escasa o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones de aminoácidos conservadoras se conocen bien en la técnica, por ejemplo a partir de los documentos WO 04/037999, GB-A-3 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 y WO 01/09300; y pueden seleccionarse tipos (preferidos) y/o combinaciones de tales sustituciones basándose en las enseñanzas pertinentes del documento WO 04/037999 así como del documento WO 98/49185 y de las referencias adicionales citadas en esos documentos.
Tales sustituciones conservadoras son preferiblemente sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a) -(e) se sustituye por otro residuo de aminoácido dentro del mismo grupo: (a) residuos pequeños alifáticos, apolares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (no cargadas): Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (d) residuos grandes alifáticos, apolares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
Sustituciones conservadoras particularmente preferidas son las siguientes: Ala a Gly o a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln o
a His; Asp aGlu; Cys a Ser; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Ala o a Pro; His a Asn o aGln; Ile a Leu o a Val; Leu a Ile o aVal; Lys aArg, aGln oaGlu; Met aLeu, aTyr oaIle; Phe aMet, aLeu oaTyr; Ser aThr; Thr aSer; Trp aTyr; Tyr a Trp; y/o Phe a Val, a Ile o a Leu.
Cualquier sustitución de aminoácidos aplicada a los polipéptidos descritos en el presente documento también puede basarse en el análisis de las frecuencias de variaciones de aminoácidos entre proteínas homólogas de diferentes especies desarrollado por Schulz et al., Principios of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, en los análisis de potenciales de formación de estructura desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, y en el análisis de patrones de hidrofobicidad en proteínas desarrollado por Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporados al presente documento en su totalidad como referencia. Se facilita información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de los Nanobodies en la descripción en el presente documento y en los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente. Además, con este propósito, se facilita la estructura cristalina de un dominio VHH de una llama, por ejemplo, por Desmyter et al., Nature Structural Biology, vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, vol. 7, 4, 361 (1999). Puede hallarse información adicional sobre algunos de los residuos de aminoácido que en los dominios VH convencionales forman la superficie de contacto VH/VL y posibles sustituciones de camelización en estas posiciones, en la técnica anterior citada previamente.
g) Se dice que las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico son “exactamente iguales” si tienen una identidad de secuencia del 100 % (tal como se define en el presente documento) por toda su longitud;
h) Cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término “diferencia de aminoácido” se refiere a una inserción, deleción o sustitución de un único residuo de aminoácido en una posición de la primera secuencia, en comparación con la segunda secuencia; entendiéndose que dos secuencias de aminoácidos pueden contener una, dos o más de tales diferencias de aminoácido;
i) Cuando se dice que una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos “comprende” otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, o “consiste esencialmente en” otra secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, esto puede significar que esta última secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos se ha incorporado en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos mencionada en primer lugar, respectivamente, pero más habitualmente esto significa generalmente que la secuencia de nucleótidos
o secuencia de aminoácidos mencionada en primer lugar comprende dentro de su secuencia un tramo de nucleótidos o residuos de aminoácido, respectivamente, que tienen la misma secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, que esta última secuencia, independientemente de cómo se haya generado u obtenido la secuencia mencionada en primer lugar (que puede ser, por ejemplo, mediante cualquier método adecuado descrito en el presente documento). A modo de ejemplo no limitativo, cuando se dice que un Nanobody de la invención comprende una secuencia de CDR, esto puede significar que dicha secuencia de CDR se ha incorporado en el Nanobody de la invención, pero más habitualmente esto significa generalmente que el Nanobody de la invención contiene dentro de su secuencia un tramo de residuos de aminoácido con la misma secuencia de aminoácidos que dicha secuencia de CDR, independientemente de cómo se haya generado u obtenido dicho Nanobody de la invención. También debe indicarse que cuando esta última secuencia de aminoácidos tiene una función biológica o estructural específica, preferiblemente tiene esencialmente las misma función biológica o estructural, una similar o equivalente en la secuencia mencionada en primer lugar de aminoácidos (dicho de otro modo, la secuencia mencionada en primer lugar de aminoácidos es preferiblemente tal que esta última secuencia es capaz de realizar esencialmente la misma función biológica o estructural, una similar o equivalente). Por ejemplo, cuando se dice que un Nanobody de la invención comprende una secuencia de CDR o secuencia de región de entramado, respectivamente, las secuencia de CDR y de entramado preferiblemente son capaces, en dicho Nanobody, de funcionar como secuencia de CDR o secuencia de región de entramado, respectivamente. Además, cuando se dice que una secuencia de nucleótidos comprende otra secuencia de nucleótidos, la secuencia mencionada en primer lugar de nucleótidos es preferiblemente tal que, cuando se expresa en un producto de expresión (por ejemplo, un polipéptido), la secuencia de aminoácidos codificada por esta última secuencia de nucleótidos forma parte de dicho producto de expresión (dicho de otro modo, que esta última secuencia de nucleótidos está en el mismo marco de lectura que la secuencia de nucleótidos más grande, mencionada en primer lugar).
j) Se considera que una secuencia de secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos está “(en forma) esencialmente aislada”, por ejemplo, en comparación con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo a partir del que se ha obtenido, cuando se ha separado de al menos otro componente con el que está asociado habitualmente en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente minoritario. En particular, se considera que una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos está “esencialmente aislada” cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Una secuencia de secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que está “en forma esencialmente aislada” preferiblemente es esencialmente homogénea, tal como se determina usando una técnica adecuada, tal como una técnica cromatográfica adecuada, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida;
k) El término “dominio” tal como se usa en el presente documento se refiere generalmente a una región globular de una secuencia de aminoácidos (tal como una cadena de anticuerpo, y en particular a una región globular de un anticuerpo de cadena pesada), o a un polipéptido que consiste esencialmente en tal región globular. Habitualmente, tal dominio comprenderá bucles peptídicos (por ejemplo, 3 o 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, como una lámina o mediante enlaces disulfuro. El término “dominio de unión” se refiere a un dominio de este tipo que está dirigido contra un determinante antigénico (tal como se define en el presente documento);
l) El término “determinante antigénico” se refiere al epítopo en el antígeno reconocido por la molécula de unión a antígeno (tal como un Nanobody o un polipéptido de la invención) y más en particular por el sitio de unión a antígeno de dicha molécula. Los términos “determinante antigénico” y “epítopo” también pueden usarse indistintamente en el presente documento.
m) Una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanobody, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o generalmente una proteína o un polipéptido de unión a antígeno o un fragmento de los mismos) que puede unirse (específicamente) a, que tiene afinidad por y/o que tiene especificidad por un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína específicos (o al menos por una parte, un fragmento o epítopo de los mismos) se dice que está “contra” o “dirigida contra” dicho determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.
n) El término “especificidad” se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que puede unirse a una molécula de unión a antígeno o molécula de proteína de unión a antígeno particular (tal como un Nanobody o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse basándose en su afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida para la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor es el valor de la KD, más intensa es la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Tal como estará claro para el experto (por ejemplo, basándose en la divulgación adicional en el presente documento), puede determinarse la afinidad de una manera conocida en sí misma, dependiendo del antígeno de interés específico. La avidez es la medida de la fuerza de la unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como un Nanobody o polipéptido de la invención) y el antígeno pertinente. La avidez se refiere tanto a la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno como al número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno. Normalmente, las proteínas de unión a antígeno (tales como las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y/o polipéptidos de la invención) se unirán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litros/mol o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o más y más preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol). Generalmente, se considera que cualquier valor de KD mayor de 104 mol/litro (o cualquier valor de KA menor de 104 M-1) litros/mol indica unión inespecífica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida en sí misma, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competencia de tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas en sí mismas en la técnica; así como las otras técnicas mencionadas en el presente documento.
La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, tal como estará claro para el experto. Estarán claros para el experto métodos para determinar la constante de disociación, y por ejemplo incluyen las técnicas mencionadas en el presente documento. A este respecto, también estará claro que puede no ser posible medir constantes de disociación mayores de 10-4 moles/litro o 10-3 moles/litro (por ejemplo, de 10-2 moles/litro). Opcionalmente, tal como también estará claro para el experto, la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse basándose en la constante de asociación (real o aparente) (KA), por medio de la relación [KD = 1/KA].
La afinidad indica la fuerza o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se facilita habitualmente mediante la KD, o constante de disociación, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad también puede expresarse como una constante de asociación, KA, que es igual a 1/KD y tiene unidades de (mol/litro)-1 (o M-1). En la presente memoria descriptiva, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tal como una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención y su diana pretendida) se expresará principalmente en cuanto al valor de KD de su interacción; quedando claro para el experto que en vista de la relación KA = 1/KD, que especifica la fuerza de la interacción molecular mediante su valor de KD también puede usarse para calcular el valor de KA correspondiente. El valor de KD caracteriza la fuerza de una interacción molecular también en un sentido termodinámico ya que está relacionada con la energía libre (DG) de la unión mediante la relación bien conocida DG = RT.ln(KD) (de manera equivalente DG = -RT.ln(KA)), donde R es igual a la constante de los gases, T es igual a la temperatura absoluta y ln indica el logaritmo neperiano.
La KD para interacciones biológicas que se consideran importantes (por ejemplo, específicas) están normalmente en el intervalo de 10-10 M (0,1 nM) a 10-5 M (10 000 nM). Cuanto más fuerte es la interacción, menor es su KD.
La KD también puede expresarse como la razón de la constante de velocidad de disociación de un complejo, indicada como koff, con respecto a la velocidad de su asociación, indicada como kon (de modo que KD = koff/kon y KA = kon/koff). La koff de velocidad de disociación tiene unidades de s-1 (donde s es la notación de la unidad del SI de segundo). La kon de velocidad de asociación tiene unidades de M-1s-1. La velocidad de asociación puede variar entre
M-1-1
102 sy aproximadamente 107 M-1s-1, aproximándose a la constante de velocidad de asociación limitada por difusión para interacciones bimoleculares. La velocidad de disociación se refiere a la semivida de una interacción molecular dada por la relación t1/2 = ln(2)/koff. La velocidad de disociación puede variar entre 10-6 s-1 (complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días) y 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).
La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse mediante diferentes técnicas conocidas en sí mismas, tales como la técnica bien conocida de biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR) (véase, por ejemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) en la que se inmoviliza una molécula en el chip de biosensor y se hace pasar la otra molécula sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo que producen mediciones de kon, koff y así valores de KD (o KA). Esto puede realizarse, por ejemplo, usando los instrumentos BIACORE bien conocidos.
También estará claro para el experto que la KD medida puede corresponder a la KD aparente si el proceso de medición influye de algún modo en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo mediante artefactos relacionados con el recubrimiento en el biosensor de una molécula. Además, puede medirse una KD aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En tal situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción mediante las dos moléculas.
Otro enfoque que puede usarse para evaluar la afinidad es el procedimiento de ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) de 2 etapas de Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición en equilibrio de la unión en fase de disolución y evita posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas sobre un soporte tal como plástico.
Sin embargo, la medición exacta de KD puede requerir bastante mano de obra y en consecuencia, a menudo se determinan valores de KD aparente para evaluar la fuerza de unión de dos moléculas. Debe indicarse que siempre que se realicen todas las mediciones de manera coherente (por ejemplo, manteniendo inalteradas las condiciones de ensayo) pueden usarse mediciones de KD aparente como aproximación de la verdadera KD y así en el presente documento KD y KD aparente deben tratarse con igual importancia o relevancia.
Finalmente, debe indicarse que en muchas situaciones el científico experto puede considerar conveniente determinar la afinidad de unión con relación a alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la fuerza de unión entre las moléculas A y B, puede usarse por ejemplo una molécula de referencia C que se sabe que se une a B y que se marca de manera adecuada con un grupo fluoróforo o cromóforo u otro resto químico, tal como biotina para su fácil detección en un ELISA o FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) u otro formato (el fluoróforo para detección por fluorescencia, el cromóforo para detección por absorción de luz, la biotina para detección por ELISA mediada por estreptavidina). Normalmente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y se varía la concentración de A para una concentración o cantidad dada de B. Como resultado, se obtiene un valor de CI50 correspondiente a la concentración de A a la que la señal medida para C en ausencia de A es la mitad. Dado que se conoce KD ref, la KD de la molécula de referencia, así como la concentración total cref de la molécula de referencia, puede obtenerse la KD aparente para la interacción A-B a partir de la siguiente fórmula: KD = CI50/(1+cref/KD ref). Obsérvese que si cref << KD ref, KD ≈ CI50. Siempre que la medición de CI50 se realiza de manera coherente (por ejemplo, manteniendo fija cref) para los agentes de unión que se comparan, la fuerza o estabilidad de una interacción molecular puede evaluarse mediante la CI50 y esta medición se considera equivalente a KD o a la KD aparente en la totalidad de este texto.
o) La semivida de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención puede definirse generalmente como el tiempo que lleva que la concentración sérica de la secuencia de aminoácidos, el compuesto o polipéptido se reduzca en un 50 %, in vivo, por ejemplo debido a degradación de la secuencia o el compuesto y/o el aclaramiento o secuestro de la secuencia o el compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención puede determinarse de cualquier manera conocida en sí misma, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas estarán claras para el experto en la técnica, y pueden implicar por ejemplo generalmente las etapas de administrar de manera adecuada a un animal de sangre caliente (es decir, a un humano o a otro mamífero adecuado, tal como un ratón, conejo, rata, cerdo, perro o un primate, por ejemplo monos del género Macaca (tal como, y en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos, el compuesto o polipéptido de la invención; extraer muestras de sangre u otras muestras de dicho animal; determinar el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos, el compuesto o polipéptido de la invención en dicha muestra de sangre; y calcular, a partir de (una representación gráfica de) los datos así obtenidos, el tiempo hasta que el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos, el compuesto o
polipéptido de la invención se ha reducido en el 50 % en comparación con el nivel inicial tras la dosificación. Por ejemplo, se hace referencia a la parte experimental a continuación, así como a los manuales convencionales, tales como Kennet, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y Peters et al, Pharmacokinetics analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2.ª rev. edición (1982).
Tal como también estará claro para el experto (véanse, por ejemplo, las páginas 6 y 7 del documento WO 04/003019 y en las referencias adicionales citadas en ese documento), la semivida puede expresarse usando parámetros tales como t1/2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (AUC). En la presente memoria descriptiva, un “aumento de la semivida” se refiere a un aumento de uno cualquiera de estos parámetros, tales como dos cualesquiera de estos parámetros, o esencialmente los tres de estos parámetros. Tal como se usa en el presente documento “aumento de la semivida” o “semivida aumentada” en particular se refiere a un aumento de t1/2-beta, o bien con o bien sin un aumento de t1/2-alfa y/o el AUC o ambos.
p) En el contexto de la presente invención, “modular” o “para modular” significa generalmente o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar la actividad de, una diana o un antígeno, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado. En particular, “modular” o “para modular” puede significar o bien reducir o bien inhibir la actividad de, o alternativamente aumentar una actividad biológica (relevante o pretendida) de, una diana o un antígeno, tal como se mide usando un ensayo in vitro, celular o in vivo adecuado (que dependerá habitualmente de la diana o el antígeno implicados), en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con actividad de la diana o el antígeno en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invención.
Tal como estará claro para el experto, “modular” también puede implicar realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminución) en la afinidad, avidez, especificidad y/o selectividad de una diana o un antígeno por uno o más de sus ligandos, parejas de unión, parejas para su asociación en una forma homomultimérica o heteromultimérica, o sustratos; y/o realizar un cambio (que puede ser o bien un aumento o bien una disminución) en la sensibilidad de la diana o el antígeno para una o más condiciones en el medio o los alrededores en el que la diana
o el antígeno está presente (tal como pH, fuerza iónica, la presencia de cofactores, etc.), en comparación con las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invención. Tal como estará claro para el experto, esto puede determinarse de nuevo de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado conocido en sí mismo, dependiendo de la diana o el antígeno implicados.
“Modular” también puede significar realizar un cambio (es decir, una actividad como agonista, como antagonista o como agonista inverso, respectivamente, dependiendo de la diana o el antígeno y el efecto biológico o fisiológico deseado) con respecto a uno o más mecanismos, efectos, respuestas, funciones, rutas o actividades biológicos o fisiológicos en los que está implicado la diana o el antígeno (o en los que están implicados sus sustrato(s) o ruta(s), tales como su ruta de señalización o ruta metabólica y sus efectos biológicos o fisiológicos asociados). De nuevo, tal como estará claro para el experto, tal acción como agonista o antagonista puede determinarse de cualquier manera adecuada y/o usando cualquier ensayo adecuado (ensayo in vitro y habitualmente celular o in vivo) conocido en sí mismo, dependiendo de la diana o el antígeno implicados. En particular, una acción como agonista o antagonista puede ser tal que una actividad biológica o fisiológica pretendida está aumentada o disminuida, respectivamente, en al menos el 1 %, preferiblemente al menos el 5 %, tal como al menos el 10 % o al menos el 25 %, por ejemplo en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, o el 90 % o más, en comparación con la actividad biológica o fisiológica en el mismo ensayo en las mismas condiciones pero sin la presencia del constructo de la invención.
Modular también puede implicar, por ejemplo, la modulación alostérica de la diana o el antígeno; y/o reducir o inhibir la unión de la diana o el antígeno a uno de sus sustratos o ligandos y/o competir con un ligando natural, sustrato para la unión a la diana o el antígeno. Modular también puede implicar activar la diana o el antígeno o el mecanismo
o la ruta en el que está implicado. Modular también puede implicar, por ejemplo, realizar un cambio con respecto al plegamiento o confirmación de la diana o el antígeno, o con respecto a la capacidad de la diana o el antígeno para plegarse, para cambiar su confirmación (por ejemplo, tras la unión de un ligando), para asociarse con otra(s) (sub)unidades, o para disociarse. Modular también puede implicar, por ejemplo, realizar un cambio en la capacidad de la diana o el antígeno para transportar otros compuestos o para servir como canal para otros compuestos (tales como iones).
Modular puede ser reversible o irreversible, pero con propósitos farmacéuticos y farmacológicos habitualmente será de manera reversible.
q) Con respecto a una diana o un antígeno, el término “sitio de interacción” en la diana o el antígeno significa un sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos de aminoácido en la diana o el antígeno que es un sitio para la unión a un ligando, receptor u otra pareja de unión, un sitio catalítico, un sitio de escisión, un sitio para interacción alostérica, un sitio implicado en multimerización (tal como homodimerización o heterodimerización) de la diana o el antígeno; o cualquier otro sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio
o tramo de residuos de aminoácido en la diana o el antígeno que está implicado en una acción o un mecanismo biológico de la diana o el antígeno. Más generalmente, un “sitio de interacción” puede ser cualquier sitio, epítopo, determinante antigénico, parte, dominio o tramo de residuos de aminoácido en la diana o el antígeno al que puede unirse una secuencia de aminoácidos o polipéptido de la invención de tal manera que se modula la diana o el antígeno (y/o cualquier ruta, interacción, señalización, mecanismo biológico o efecto biológico en el que la diana o el antígeno está implicado) (tal como se define en el presente documento).
r) Se dice que una secuencia de aminoácidos o polipéptido es “específico para” una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno cuando se une al primer antígeno con una afinidad (tal como se describió anteriormente, y expresado de manera adecuada como valor de KD, valor de KA, velocidad Koff y/o velocidad Kon) que es al menos 10 veces, tal como al menos 100 veces, y preferiblemente al menos 1000 veces, y hasta 10 000 veces o más, mejor que la afinidad con la que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Por ejemplo, el primer antígeno puede unirse a la diana o el antígeno con un valor de KD que es al menos 10 veces menor, tales como al menos 100 veces menor, y preferiblemente al menos 1000 veces menor, tal como 10 000 veces menor o incluso menos que eso, que la KD con la que dicha secuencia de aminoácidos o polipéptido se une a la segunda diana o polipéptido. Preferiblemente, cuando una secuencia de aminoácidos o polipéptido es “específico para” una primera diana o antígeno en comparación con una segunda diana o antígeno, está dirigido contra (tal como se define en el presente documento) dicha primera diana o antígeno, pero no está dirigido contra dicha segunda diana o antígeno.
s) Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, el número total de residuos de aminoácido en un Nanobody puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente 112-115, y es lo más preferiblemente 113. Sin embargo, debe indicarse que las partes, los fragmentos, análogos o derivados (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) de un Nanobody no están particularmente limitados en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que tales partes, fragmentos, análogos o derivados satisfagan los requisitos adicionales expuestos en el presente documento y sean también preferiblemente adecuados con los propósitos descritos en el presente documento;
t) Los residuos de aminoácido de un Nanobody se numeran según la numeración general para dominios VH facilitada por Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación n.º 91), aplicada a dominios VHH de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 23 de junio de 2000; 240 (1-2): 185-195 (véase, por ejemplo, la figura 2 de esta publicación); o que se hace referencia en el presente documento. Según esta numeración, FR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanobody comprende los residuos de aminoácido en las posiciones 103-113. [A este respecto, debe indicarse que, tal como se conoce bien en la técnica para dominios VH y para dominios VHH, el número total de residuos de aminoácido en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácido indicados mediante la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más residuos de aminoácido que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración según Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los residuos de aminoácido en la secuencia real. Generalmente, sin embargo, puede decirse que, según la numeración de Kabat e independientemente del número de residuos de aminoácido en las CDR, la posición 1 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR1 y viceversa, la posición 36 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceversa, la posición 66 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR3 y viceversa, y la posición 103 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR4 y viceversa.].
Métodos alternativos para la numeración de los residuos de aminoácido de dominios VH, métodos que también pueden aplicarse de manera análoga a dominios VHH de camélidos y a Nanobodies, son el método descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), la denominada “definición de AcM” y la denominada “definición de contacto”. Sin embargo, en la presente descripción, las reivindicaciones y figuras, debe seguirse la numeración según Kabat aplicada a dominios VHH por Riechmann y Muyldermans, a menos que se indique de otro modo; y
u) Las figuras, la lista de secuencias y la parte experimental/ejemplos se facilitan únicamente para ilustrar adicionalmente la invención y no deben interpretarse o considerarse que limitan el alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas en modo alguno, a menos que se indique explícitamente en otra parte en el presente documento.
Para una descripción general de anticuerpos de cadena pesada y los dominios variables de los mismos, se hace referencia, entre otros, a la técnica anterior citada en el presente documento, al artículo de revisión de Muyldermans en Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302; así como a las siguientes solicitudes de patente, que se mencionan como antecedentes generales de la técnica: los documentos WO 94/04678, WO 95/04079 y WO 96/34103 de la Vrije Universiteiit Brussel; los documentos WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968,
WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 y WO 02/48193 de Unilever; los documentos WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 de el Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); el documento WO 03/050531 de Algonomics N.V. y Ablynx N.V.; el documento WO 01/90190 de el National Research Council de Canadá; el documento WO 03/025020 (= EP 1 433 793) del Institute of Antibodies; así como los documentos WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825, de Ablynx N.V. y las solicitudes de patente adicionales publicadas por Ablynx N.V. También se hace referencia a la técnica anterior adicional mencionada en estas solicitudes, y en particular a la lista de las referencias mencionadas en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153.
Según la terminología usada en la técnica (véanse las referencias anteriores), los dominios variables presentes en anticuerpos de cadena pesada que se producen de manera natural también se denominarán “dominios VHH”, para distinguirlos de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominarán a continuación en el presente documento “dominios VH”) y de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominarán a continuación en el presente documento “dominios VL”).
Tal como se menciona en la técnica anterior a la que se hizo referencia anteriormente, los dominios VHH tienen varias características estructurales y propiedades funcionales únicas que hacen que los dominios VHH aislados (así como Nanobodies basados en los mismos, que comparten estas características estructurales y propiedades funcionales con los dominios VHH que se producen de manera natural) y proteínas que contienen los mismos sean altamente ventajosos para su uso como proteínas o dominios de unión a antígeno funcionales. En particular, y sin limitarse a ello, los dominios VHH (que se han “diseñado” en la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin ninguna interacción con, un dominio variable de cadena ligera) y Nanobodies pueden funcionar como una única unidad estructural, dominio o proteína de unión a antígeno funcional, relativamente pequeño. Esto distingue los dominios VHH de los dominios VH y VL de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, que por sí mismos no son adecuados generalmente para aplicación práctica como proteínas o dominios de unión a antígeno individuales, sino que es necesario combinarlos en alguna forma u otra para proporcionar una unidad de unión a antígeno funcional (como por ejemplo en fragmentos de anticuerpo convencionales tales como fragmentos Fab; en fragmentos ScFv, que consisten en un dominio VH unido covalentemente a un dominio VL).
Debido a estas propiedades únicas, el uso de dominios VHH y Nanobodies como proteínas de unión a antígeno o como dominios de unión a antígeno individuales (es decir, como parte de una proteína o un polipéptido más grande) ofrece varias ventajas importantes con respecto al uso de dominios VH y VL convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpo convencionales (tales como fragmentos Fab o F(ab’)2):
-
únicamente se requiere que se una un solo dominio a un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de modo que no haya necesidad de tener dos dominios independientes presentes, no asegurarse de que estos dos dominios están presentes en la conformación y configuración espaciales correctas (es decir, a través del uso de ligadores especialmente diseñados, como con scFv);
-
pueden expresarse dominios VHH y Nanobodies a partir de un único gen y no requieren modificaciones ni plegamiento postraduccionales;
-
pueden modificarse por ingeniería fácilmente dominios VHH y Nanobodies para dar formatos multivalentes y multiespecíficos (tal como se comenta adicionalmente en el presente documento);
-
los dominios VHH y Nanobodies son altamente solubles y no tienen una tendencia a agregarse (como con los “dAb” derivados de ratón descritos por Ward et al., Nature, vol. 341, 1989, p. 544);
-
los dominios VHH y Nanobodies son altamente estables frente al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones de desnaturalización (véase, por ejemplo, Ewert et al, citado anteriormente);
-
los dominios VHH y Nanobodies son fáciles y relativamente económicos de preparar, incluso a la escala requerida para producción. Por ejemplo, los dominios VHH, Nanobodies y proteínas/polipéptidos que contienen los mismos pueden producirse usando fermentación microbiana (por ejemplo, tal como se describe adicionalmente a continuación) y no requieren el uso de sistemas de expresión de mamífero, como por ejemplo con fragmentos de anticuerpo convencionales;
-
los dominios VHH y Nanobodies son relativamente pequeños (de aproximadamente 15 kDa, o 10 veces más pequeños que una IgG convencional) en comparación con anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y por tanto muestra una alta/mayor penetración en tejidos (incluyendo pero sin limitarse a tumores sólidos y otros tejidos densos) que tales anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos;
-
los dominios VHH y Nanobodies pueden mostrar las denominadas propiedades de unión a cavidad (entre otras
cosas debidas a su bucle de CDR3 extendido, en comparación con los dominios VH convencionales) y por tanto también pueden acceder a dianas y epítopos no accesibles para anticuerpos de 4 cadenas convencionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, se ha mostrado que los dominios VHH y Nanobodies pueden inhibir enzimas (véanse, por ejemplo, el documento WO 97/49805; Transue et al., Proteins 1 de septiembre de 1998; 32(4): 515-22; Lauwereys et al., EMBO J. 1 de julio de 1998; 17(13): 3512-20).
La solicitud describe Nanobodies contra RANK-L, y en particular Nanobodies contra RANK-L de un animal de sangre caliente, y más en particular Nanobodies contra RANK-L de un mamífero, y especialmente Nanobodies contra RANK-L humano; así como proteínas y/o polipéptidos que comprenden al menos uno de tales Nanobodies.
En particular, la solicitud describe Nanobodies contra RANK-L, y proteínas y/o polipéptidos que comprenden los mismos, que tienen propiedades terapéuticas y/o farmacológicas mejoradas y/u otras propiedades ventajosas (tales como, por ejemplo, facilidad mejorada de preparación y/o costes reducidos de bienes), en comparación con anticuerpos convencionales contra RANK-L o fragmentos de los mismos, en comparación con constructos que podrían basarse en tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales (tales como fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, constructos ScFv, “Diabodies” y otros constructos multiespecíficos (véase, por ejemplo, la revisión de Holliger y Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36)), y también en comparación con los denominados “dAb” o anticuerpos de (un solo) dominio similares que pueden derivar de dominios variables de anticuerpos convencionales. Estas propiedades mejoradas y ventajosas resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento, y por ejemplo incluyen, sin limitación, uno o más de:
-
afinidad y/o avidez aumentada por RANK-L, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o bien en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento);
-
mejor idoneidad para cambiar el formato a un formato multivalente (por ejemplo, a un formato bivalente);
-
mejor idoneidad para cambiar el formato a un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento);
-
idoneidad o susceptibilidad mejorada para sustituciones “de humanización” (tal como se define en el presente documento);
-
menos inmunogenicidad, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o bien en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento);
-
estabilidad aumentada, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o bien en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento);
-
especificidad aumentada hacia RANK-L, o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o bien en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento);
-
reactividad cruzada disminuida o cuando se desee aumentada con RANK-L de diferentes especies;
y/o
-
uno o más de otras propiedades mejoradas deseadas para uso farmacéutico (incluyendo uso profiláctico y/o uso terapéutico) y/o para uso diagnóstico (incluyendo pero sin limitarse a uso con propósitos de obtención de imágenes),
o bien en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo, en un formato bivalente) y/o bien en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descritos a continuación en el presente documento).
Tal como se describe generalmente en el presente documento para las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies divulgados están preferiblemente en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento), o forman parte de una proteína o un polipéptido (tal como se define en el presente documento), que pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más Nanobodies y que opcionalmente pueden comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas unidas opcionalmente mediante uno o más ligadores adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos pueden usarse como unidad de unión en una proteína o un polipéptido de este tipo, que pueden contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (es decir, contra una o más de otras dianas distintas de RANK-L), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico, respectivamente, todo tal como se describe en el presente documento. En particular, una proteína o un polipéptido de este tipo pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más Nanobodies y opcionalmente uno o más
(de otros) Nanobodies (es decir, dirigidos contra otras dianas distintas de RANK-L), todas unidas opcionalmente mediante uno o más ligadores adecuados, para proporcionar un constructo de Nanobody monovalente, multivalente
o multiespecífico, respectivamente, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Tales proteínas
o polipéptidos también puede estar en forma esencialmente aislada (tal como se define en el presente documento).
En un Nanobody divulgado en el presente documento, el sitio de unión para la unión contra RANK-L está formado preferiblemente por las secuencias de CDR. Opcionalmente, un Nanobody puede contener adicionalmente, y además del al menos un sitio de unión para la unión contra RANK-L, uno o más sitios de unión adicionales para la unión contra otros antígenos, proteínas o dianas. Para métodos y posiciones para introducir tales segundos sitios de unión, se hace referencia, por ejemplo, a Keck y Huston, Biophysical Journal, 71, octubre de 1996, 2002-2011; documentos EP 0 640 130 y WO 06/07260.
Los Nanobodies divulgados (y polipéptidos que comprenden los mismos) están dirigidos contra el sitio de unión para RANK en RANK-L. Las secuencias de aminoácidos y los polipéptidos divulgados están dirigidos preferiblemente contra un epítopo en RANK-L que se solapa con el epítopo de denosumab.
Tal como se ha descrito ya en el presente documento, la secuencia de aminoácidos y estructura de un Nanobody puede considerarse, sin limitarse a ello no obstante, que se compone de cuatro regiones de entramado o “FR” (o a veces también denominadas “FW”), a las que se hace referencia en la técnica y en el presente documento como “región de entramado 1” o “FR1”; como “región de entramado 2” o “FR2”; como “región de entramado 3” o “FR3”; y como “región de entramado 4” o “FR4”, respectivamente; regiones de entramado que están interrumpidas por tres regiones determinantes de complementariedad o “CDR”, a las que se hace referencia en la técnica como “región determinante de complementariedad 1” o “CDR1”; como “región determinante de complementariedad 2” o “CDR2”; y como “región determinante de complementariedad 3” o “CDR3”, respectivamente. Algunas secuencias preferidas de región de entramado y CDR (y combinaciones de las mismas) que están presentes en los Nanobodies divulgados son tal como se describen en el presente documento.
(Las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies divulgados son tales que:
-
los Nanobodies pueden unirse a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litros/mol o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o más y más preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o tales que:
-
los Nanobodies pueden unirse a RANK-L con una velocidad kon de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1 , preferiblemente entre 103 M-1s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105
M-1-1
s-1 y 107 M-1s;
y/o tales que:
-1 -1
-
los Nanobodies pueden unirse a RANK-L con una velocidad koff de entre 1 s(t1/2 = 0,69 s) y 10-6 s(proporcionando un complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días), preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1 , más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
Preferiblemente, (las secuencias de CDR presentes en) los Nanobodies divulgados son tales que: un Nanobody monovalente (o un polipéptido que contiene únicamente un Nanobody) es preferiblemente tal que se unirá a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
La afinidad del Nanobody contra RANK-L puede determinarse de una manera conocida en sí misma, por ejemplo usando las técnicas generales para medir KD. KA, koff o kon mencionados en el presente documento, así como algunos de los ensayos específicos descritos en el presente documento.
Algunos valores preferidos de CI50 para la unión de los Nanobodies divulgados de la invención (y de polipéptidos que comprenden los mismos) a RANK-L resultarán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en el presente documento.
La solicitud describe un Nanobody (tal como se define en el presente documento) contra RANK-L, que consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que:
-
CDR1 se elige del grupo que consiste en:
a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249;
b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249; c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249;
y/o -CDR2 se elige del grupo que consiste en: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758;
f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758; y/o -CDR3 se elige del grupo que consiste en: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497; i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497;
o cualquier fragmento adecuado de tal secuencia de aminoácidos. En particular, la solicitud describe un Nanobody (tal como se define en el presente documento) contra RANK-L, que
consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que: -CDR1 se elige del grupo que consiste en: a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249; b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249;
c) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 188-249; y -CDR2 se elige del grupo que consiste en: d) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758; e) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758;
f) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 312-373 y 758; y -CDR3 se elige del grupo que consiste en: g) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497; h) secuencias de aminoácidos que tienen al menos una identidad de aminoácidos del 80 % con al menos una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497;
i) secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o 1 diferencia(s) de aminoácido con al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497;
o cualquier fragmento adecuado de una secuencia de aminoácidos de este tipo. Como generalmente, cuando un Nanobody contiene una o más secuencias de CDR1 según b) y/o c): i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR según b) y/o c) es preferiblemente, y en comparación con la CDR
correspondiente según a), una sustitución de aminoácidos conservadora (tal como se define en el presente documento);
y/o ii) la CDR según b) y/o c) preferiblemente contiene únicamente sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según a);
y/o
iii) la CDR según b) y/o c) puede ser una CDR que deriva de una CDR según a) por medio de maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas en sí mismas. De manera similar, cuando un Nanobody contiene una o más secuencias de CDR2 según e) y/o f): i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR según e) y/o f) es preferiblemente, y en comparación con la CDR
correspondiente según d), una sustitución de aminoácidos conservadora (tal como se define en el presente documento);
y/o ii) la CDR según e) y/o f) preferiblemente contiene únicamente sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según d);
y/o
iii) la CDR según e) y/o f) puede ser una CDR que deriva de una CDR según d) por medio de maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas en sí mismas. Además, de manera similar, cuando un Nanobody contiene una o más secuencias de CDR3 según h) y/o i): i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR según h) y/o i) es preferiblemente, y en comparación con la CDR
correspondiente según g), una sustitución de aminoácidos conservadora (tal como se define en el presente documento);
y/o ii) la CDR según h) y/o i) preferiblemente contiene únicamente sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la CDR correspondiente según g);
y/o
iii) la CDR según h) y/o i) puede ser una CDR que deriva de una CDR según g) por medio de maduración por afinidad usando una o más técnicas de maduración por afinidad conocidas en sí mismas. Debe entenderse que los tres últimos párrafos se aplican generalmente a cualquier Nanobody que comprende una o
más secuencias de CDR1, secuencias de CDR2 y/o secuencias de CDR3 según b), c), e), f), h) o i),
respectivamente. De los Nanobodies divulgados, se prefieren particularmente Nanobodies que comprenden una o más de las CDR explícitamente enumeradas anteriormente; se prefieren más particularmente Nanobodies que comprenden dos o más de las CDR explícitamente enumeradas anteriormente; y son los más particularmente preferidos Nanobodies que comprenden tres de las CDR explícitamente enumeradas anteriormente.
Algunas combinaciones de secuencias de CDR, así como combinaciones preferidas de secuencias de CDR y secuencias de región de entramado, se mencionan en la tabla A-1 a continuación, que enumera las secuencias de
CDR y secuencias de región de entramado que están presentes en varios Nanobodies que se unen a RANK-L. Tal como estará claro para el experto, habitualmente se preferirá una combinación de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que se producen en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que se mencionan en la misma línea en la tabla A-1). Además, habitualmente se preferirá una combinación de secuencias de CDR y
5 secuencias de región de entramado que se producen en el mismo clon (es decir, secuencias de CDR y secuencias de región de entramado que se mencionan en la misma línea en la tabla A-1).
Además, en los Nanobodies que comprenden las combinaciones de CDR mencionadas en la tabla A-1, cada CDR puede sustituirse por una CDR elegida del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen una
10 identidad de secuencia de al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 %, incluso más preferiblemente al menos el 99 % (tal como se define en el presente documento) con las CDR mencionadas; en los que:
i) cualquier sustitución de aminoácidos en tal CDR es preferiblemente, y en comparación con la secuencia de CDR
15 correspondiente mencionada en la tabla A-1, una sustitución de aminoácidos conservadora (tal como se define en el presente documento);
y/o
20 ii) cualquiera de tales secuencias de CDR preferiblemente contiene únicamente sustituciones de aminoácidos, y no deleciones o inserciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la tabla A-1;
y/o
25 iii) cualquiera de tales secuencias de CDR es una CDR que deriva por medio de una técnica para maduración por afinidad conocida en sí misma, y en particular partiendo de la secuencia de CDR correspondiente mencionada en la tabla A-1.
30 Sin embargo, tal como estará claro para el experto, se preferirán generalmente las (combinaciones de) secuencias de CDR, así como (las combinaciones de) secuencias de CDR y secuencias de región de entramado mencionadas en la tabla A-1.
Generalmente, los Nanobodies con las secuencias de CDR anteriores pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento, y tienen preferiblemente secuencias de región de entramado que son también tal como se describen adicionalmente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo y tal como se menciona en el presente documento, tales Nanobodies pueden ser Nanobodies que se producen de manera natural (de cualquier especie adecuada), secuencias de VHH que se producen de manera natural (es decir, de una especie adecuada de camélido) o secuencias de aminoácidos o Nanobodies sintéticos o semisintéticos, incluyendo pero sin limitarse a Nanobodies o secuencias de VHH parcialmente humanizados, Nanobodies o secuencias de VHH
totalmente humanizados, secuencias de dominio variable de cadena pesada camelizadas, así como Nanobodies que se han obtenido mediante las técnicas mencionadas en el presente documento.
La solicitud describe un Nanobody humanizado, que consiste en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en el que CDR1 a CDR3 son tal como se definen en el presente documento y en el que dicho Nanobody humanizado comprende al menos una sustitución de humanización (tal como se define en el presente documento), y en particular al menos una sustitución de humanización en al menos una de sus secuencias de región de entramado (tal como se define en el presente documento).
La invención se refiere a un Nanobody con una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 572.
Otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invención se refiere a variantes humanizadas del Nanobody de SEQ ID NO: 572, que comprenden, en comparación con la secuencia de VHH nativa correspondiente, al menos una sustitución de humanización (tal como se define en el presente documento), y en particular al menos una sustitución de humanización en al menos una de sus secuencias de región de entramado (tal como se define en el presente documento). Variantes humanizadas son los Nanobodies humanizados de SEQ ID NO: 750-756. Por tanto, la invención también se refiere a un Nanobody humanizado con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 750-756.
Los polipéptidos de la invención comprenden o consisten esencialmente en al menos un Nanobody de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de polipéptidos de la invención se facilitan en SEQ ID NO: 643, 679, 715, 759, 761, 766 y 772.
Generalmente, las proteínas o los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en un único Nanobody (tal como un único Nanobody de la invención) se denominarán en el presente documento proteínas o polipéptidos “monovalentes” o “constructos monovalentes”. Las proteínas o los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en dos o más Nanobodies (tal como al menos dos Nanobodies de la invención o al menos un Nanobody de la invención y al menos otro Nanobody) se denominarán en el presente documento proteínas o polipéptidos “multivalentes” o “constructos multivalentes”, y estos pueden proporcionar determinadas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la invención. Algunos ejemplos no limitativos de tales constructos multivalentes resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
Un polipéptido de la invención comprende o consiste esencialmente en al menos dos Nanobodies de la invención, tal como dos o tres Nanobodies de la invención. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, tales constructos multivalentes pueden proporcionar determinadas ventajas en comparación con una proteína o un polipéptido que comprende o que consiste esencialmente en un único Nanobody de la invención, tal como una avidez muy mejorada por RANK-L. Tales constructos multivalentes estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales constructos de Nanobody multivalentes son los constructos de SEQ ID NO: 643, 679, 761, 766, y 772 (bivalentes) y SEQ ID NO: 715 y 759 (trivalentes).
La solicitud describe un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody de la invención y al menos otra unidad de unión (es decir, dirigida contra otro epítopo, antígeno, diana, proteína o polipéptido), que es preferiblemente también un Nanobody. Tales proteínas o polipéptidos también se denominan en el presente documento proteínas o polipéptidos “multiespecíficos” o “constructos multiespecíficos”, y estos pueden proporcionar determinadas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la invención (tal como resultará evidente a partir del comentario adicional en el presente documento de algunos constructos multiespecíficos preferidos, pero no limitativos). Tales constructos multiespecíficos estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento; algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales constructos de Nanobody multiespecíficos son los constructos de SEQ ID NO: 715 y 759.
La solicitud describe un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody de la invención, opcionalmente uno o más Nanobodies adicionales, y al menos otra secuencia de aminoácidos (tal como una proteína o un polipéptido) que confiere al menos una propiedad deseada al Nanobody de la invención y/o a la proteína de fusión resultante. De nuevo, tales proteínas de fusión pueden proporcionar determinadas ventajas en comparación con los Nanobodies monovalentes correspondientes de la invención. Algunos ejemplos no limitativos de tales secuencias de aminoácidos y de tales constructos de fusión resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
También es posible combinar dos o más de los aspectos anteriores, por ejemplo para proporcionar un constructo biespecífico trivalente que comprende dos Nanobodies de la invención y otro Nanobody, y opcionalmente una o más de otras secuencias de aminoácidos. Ejemplos no limitativos adicionales de tales constructos, así como algunos constructos que se prefieren particularmente dentro del contexto de la presente invención, resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
En los constructos anteriores, el uno o más Nanobodies y/u otras secuencias de aminoácidos pueden unirse directamente entre sí y/o unirse de manera adecuada entre sí mediante una o más secuencias ligadoras. Algunos ejemplos adecuados pero no limitativos de tales ligadores resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
En un aspecto específico de la invención, un Nanobody de la invención o un compuesto, constructo o polipéptido de la invención que comprende al menos un Nanobody de la invención puede tener una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales Nanobodies, compuestos y polipéptidos resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento, y por ejemplo comprenden secuencias de Nanobodies o polipéptidos de la invención que se han modificado químicamente para aumentar la semivida de los mismos (por ejemplo, por medio de pegilación); secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden al menos un sitio de unión adicional para la unión a una proteína sérica (tal como albúmina sérica); o polipéptidos de la invención que comprenden al menos un Nanobody de la invención que se unen al menos a un resto (y en particular al menos una secuencia de aminoácidos) que aumenta la semivida del Nanobody de la invención. Ejemplos de polipéptidos de la invención que comprenden tales restos o secuencias de aminoácidos que prolongan la semivida resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación adicional en el presente documento; y por ejemplo incluyen, sin limitación, polipéptidos en los que el uno o más Nanobodies de la invención se unen de manera adecuada a una
o más proteínas séricas o fragmentos de las mismas (tal como albúmina sérica o fragmentos adecuados de la misma) o a una o más unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas (tal como, por ejemplo, Nanobodies
o anticuerpos de (un solo) dominio que pueden unirse a proteínas séricas tales como albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas tales como IgG, o transferrina); polipéptidos en los que un Nanobody de la invención se une a una parte Fc (tal como un Fc humano) o una parte o un fragmento adecuado de la misma (la invención, por ejemplos prevé polipéptidos en los que los Nanobodies se unen de manera adecuada a una parte Fc mediante ligadores de diferentes tamaños para permitir la unión intramolecular y/o intermolecular de RANK-L); o polipéptidos en los que el uno o más Nanobodies de la invención se unen de manera adecuada a una o más proteínas o péptidos pequeños que pueden unirse a proteínas séricas (tales como, sin limitación, las proteínas y los péptidos descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489 y WO 2008/068280.
De nuevo, tal como estará claro para el experto, tales Nanobodies, compuestos, constructos o polipéptidos pueden contener uno o más grupos, residuos, restos o unidades de unión adicionales, tales como una o más secuencias de aminoácidos adicionales y en particular uno o más Nanobodies adicionales (es decir, no dirigidos contra RANK-L), para proporcionar un constructo de Nanobody tri o multiespecífico.
Generalmente, los Nanobodies de la invención (o compuestos, constructos o polipéptidos que comprenden los mismos) con semivida aumentada tienen preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí misma. Por ejemplo, los Nanobodies, compuestos, constructos o polipéptidos de la invención con semivida aumentada pueden tener una semivida que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la invención en sí misma.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, tales Nanobodies, compuestos, constructos o polipéptidos de la invención presentan una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, compuestos o polipéptidos de la invención pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días),
o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
En otro un aspecto de la invención, un polipéptido de la invención comprende uno o más Nanobodies (tal como dos
o preferiblemente un) Nanobody de la invención unidos (opcionalmente mediante una o más secuencias ligadoras adecuadas) a una o más secuencias de aminoácidos (tal como dos y preferiblemente una secuencia) que permiten que el polipéptido de la invención resultante atraviese la barrera hematoencefálica. En particular, dicha una o más secuencias de aminoácidos que permiten que los polipéptidos de la invención resultantes atraviesen la barrera hematoencefálica pueden ser uno o más Nanobodies (tal como dos y preferiblemente un Nanobody), tales como los Nanobodies descritos en el documento WO 02/057445, de los que son ejemplos preferidos FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento WO 06/040153) y FC5 (SEQ ID NO: 190 del documento WO 06/040154).
En particular, los polipéptidos que comprenden uno o más Nanobodies de la invención son preferiblemente tales que:
-
se unen a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de
10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litros/mol o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o más y más preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad kon de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre
103 M-1-1
s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s;
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad koff de entre 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s) y 10-6 s-1 (proporcionando un complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días), preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
Preferiblemente, un polipéptido que contiene únicamente una secuencia de aminoácidos de la invención es preferiblemente tal que se unirá a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. A este respecto, estará claro para el experto que un polipéptido que contiene dos o más Nanobodies de la invención puede unirse a RANK-L con una avidez aumentada, en comparación con un polipéptido que contiene únicamente una secuencia de aminoácidos de la invención.
Algunos valores preferidos de CI50 para la unión de las secuencias de aminoácidos o polipéptidos de la invención a RANK-L resultarán evidentes a partir de la descripción adicional y los ejemplos en el presente documento.
Otro aspecto de esta invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención que comprende el mismo. De nuevo, tal como se describe generalmente en el presente documento para los ácidos nucleicos de la invención, tal ácido nucleico puede estar en forma de un constructo genético, tal como se define en el presente documento.
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula huésped o un huésped no humano que expresa o que es capaz de expresar un polipéptido de la invención que comprende el mismo; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales huéspedes o células huésped resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un producto o una composición que contiene o que comprende al menos un polipéptido de la invención y/o al menos un ácido nucleico de la invención, y opcionalmente uno o más componentes adicionales de tales composiciones conocidos en sí mismos, es decir dependiendo del uso pretendido de la composición. Tal producto o composición pueden ser, por ejemplo, una composición farmacéutica (tal como se describe en el presente documento), una composición veterinaria o un producto o una composición para uso diagnóstico (tal como se describe también en el presente documento). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales productos o composiciones resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La invención se refiere además a métodos para preparar o generar las secuencias de aminoácidos, los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales métodos resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
La invención se refiere además a aplicaciones y usos de los compuestos, constructos, polipéptidos, ácidos nucleicos, las células huésped, los productos y las composiciones descritos en el presente documento, así como a métodos para la prevención y/o el tratamiento para enfermedades y trastornos asociados con RANK-L. Algunas aplicaciones y usos preferidos pero no limitativos resultarán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención también resultarán claros a partir de la descripción adicional a continuación en el presente documento.
Los Nanobodies de la invención comprenden Nanobodies con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH que se produce de manera natural, pero que se ha “humanizado”, es decir reemplazando uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de VHH que se produce de manera natural (y en particular en las secuencias de región de entramado) por uno o más de los residuos de aminoácido que aparecen en la(s) posición/posiciones correspondiente(s) en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicadas anteriormente). Esto puede realizarse de una manera conocida en sí misma, que estará clara para el experto, por ejemplo basándose en la descripción adicional en el presente documento y la técnica anterior sobre humanización a la que se hace referencia
en el presente documento. De nuevo, debe indicarse que tales Nanobodies humanizados de la invención pueden obtenerse de cualquier manera adecuada conocida en sí misma y, por tanto, no se limitan estrictamente a polipéptidos que se han obtenido usando un polipéptido que comprende un dominio VHH que se produce de manera natural como material de partida.
Otra clase particularmente preferida de Nanobodies de la invención comprende Nanobodies con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se produce de manera natural, pero que se ha “camelizado”, es decir reemplazando uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH que se produce de manera natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o más de los residuos de aminoácido que aparecen en la(s) posición/posiciones correspondiente(s) en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto puede realizarse de una manera conocida en sí misma, que estará clara para el experto, por ejemplo basándose en la descripción adicional en el presente documento. Tales sustituciones de “camelización” se insertan preferiblemente en posiciones de aminoácido que forman y/o están presentes en la superficie de contacto VH-VL, y/o en los denominados residuos distintos de Camelidae, tal como se define en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento WO 94/04678 y Davies y Riechmann (1994 y 1996), citado anteriormente). Preferiblemente, la secuencia de VH que se usa como material de partida o punto de partida para generar o diseñar el Nanobody camelizado es preferiblemente una secuencia de VH de un mamífero, más preferiblemente la secuencia de VH de un ser humano, tal como una secuencia de VH3. Sin embargo, debe indicarse que tales Nanobodies camelizados de la invención pueden obtenerse de cualquier manera adecuada conocida en sí misma y, por tanto, no se limitan estrictamente a polipéptidos que se han obtenido usando un polipéptido que comprende un dominio VH que se produce de manera natural como material de partida.
Por ejemplo, de nuevo tal como se describe adicionalmente en el presente documento, tanto la “humanización” como la “camelización” pueden realizarse proporcionando una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VHH
o dominio VH que se produce de manera natural, respectivamente, y luego cambiando, de una manera conocida en sí misma, uno o más codones en dicha secuencia de nucleótidos de tal modo que la nueva secuencia de nucleótidos codifica un Nanobody “humanizado” o “camelizado” de la invención, respectivamente. Este ácido nucleico puede expresarse entonces de una manera conocida en sí misma, para proporcionar el Nanobody de la invención deseado. Alternativamente, basándose en la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH o dominio VH que se produce de manera natural, respectivamente, puede diseñarse la secuencia de aminoácidos del Nanobody humanizado o camelizado de la invención deseado, respectivamente, y luego sintetizarse de novo usando técnicas para la síntesis de péptidos conocidas en sí mismas. Además, basándose en la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un dominio VHH o dominio VH que se produce de manera natural, respectivamente, puede diseñarse una secuencia de nucleótidos que codifica el Nanobody humanizado o camelizado de la invención deseado, respectivamente, y luego sintetizarse de novo usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos conocidas en sí mismas, después de lo cual puede expresarse el ácido nucleico así obtenido de una manera conocida en sí misma, para proporcionar el Nanobody de la invención deseado.
Estarán claros para el experto otros métodos y técnicas adecuados para obtener los Nanobodies de la invención y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, partiendo de secuencias de VH o preferiblemente secuencias de VHH que se producen de manera natural, y pueden comprender por ejemplo combinar una o más partes de una o más secuencias de VH que se producen de manera natural (tales como una o más secuencias de FR y/o secuencias de CDR), una o más partes de una o más secuencias de VHH que se producen de manera natural (tales como una o más secuencias de FR o secuencias de CDR), y/o una o más secuencias sintéticas o semisintéticas, de manera adecuada, para proporcionar un Nanobody de la invención o una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico que codifica el mismo (que puede expresarse entonces de manera adecuada). Estarán claras para el experto secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de región de entramado de secuencias de VHH o Nanobodies basándose en la divulgación en el presente documento y/o la técnica anterior adicional citada en el presente documento (y/o pueden obtenerse alternativamente mediante PCR partiendo de las secuencias de nucleótidos obtenidas usando los métodos descritos en el presente documento) y pueden combinarse de manera adecuada con secuencias de nucleótidos que codifican las CDR preferidas (por ejemplo, mediante ensamblaje por PCR usando cebadores solapantes), para proporcionar un ácido nucleico que codifica un Nanobody de la invención.
Tal como se menciona en el presente documento, los Nanobodies pueden caracterizarse, en particular, por la presencia de uno o más “residuos distintivos” (tal como se describe en el presente documento) en una o más de las secuencias de región de entramado.
Colectivamente, los residuos de aminoácido en las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108, que en los Nanobodies son tal como se mencionaron anteriormente, también se denominarán en el presente documento “residuos distintivos”. Los residuos distintivos y los residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes de los dominios humanos más estrechamente relacionados VH, VH3, se resumen en la tabla A-3.
Algunas combinaciones especialmente preferidas pero no limitativas de estos residuos distintivos tal como aparecen en dominios VHH que se producen de manera natural se mencionan en la tabla A-4. Para su comparación, los residuos de aminoácido correspondientes del VH3 humano denominados DP-47 se han indicado en cursiva.

Tabla A-3: Residuos distintivos en Nanobodies
Posición
VH3 humano Residuos distintivos
11
L, V; predominantemente L L, M, S, V,W; preferiblemente L
37
V, I, F; habitualmente V F(1), Y, H, I, L o V, preferiblemente F(1) o Y
44(8)
G G(2), E(3), A, D, Q, R, S, L; preferiblemente G(2), E(3) o Q; lo más preferiblemente G(2) o E(3).
45(8)
L L(2), R(3), C, I, L, P, Q, V; preferiblemente L(2) o R(3)
47(8)
W, Y W(2), L(1) o F(1), A, G, I, M, R, S, V o Y; preferiblemente W(2) , L(1), F(1) o R
83
R o K; habitualmente R R, K(5), N, E(5), G, I, M, Q o T; preferiblemente K o R; lo más preferiblemente K
84
A, T, D; predominantemente A P(5), A, L, R, S, T, D, V; preferiblemente P
103
W W(4), P(6), R(6), S; preferiblemente W
104
G G o D; preferiblemente G
108
L, M o T; predominantemente L Q, L(7) o R; preferiblemente Q o L(7)
Notas: (1) En particular, pero no exclusivamente, en combinación con KERE o KQRE en las posiciones 4346. (2) Habitualmente como GLEW en las posiciones 44-47. (3) Habitualmente como KERE o KQRE en las posiciones 43-46, por ejemplo como KEREL, KEREF, KQREL, KQREF o KEREG en las posiciones 43-47. Alternativamente, también son posibles secuencias tales como TERE (por ejemplo, TEREL), KECE (por ejemplo, KECEL o KECER), RERE (por ejemplo, REREG), QERE (por ejemplo, QEREG), KGRE (por ejemplo, KGREG), KDRE (por ejemplo, KDREV). Algunas otras secuencias posibles, pero menos preferidas incluyen por ejemplo DECKL y NVCEL.(4) Tanto con GLEW en las posiciones 44-47 como KERE o KQRE en las posiciones 43-46. (5) A menudo como KP o EP en las posiciones 83-84 de dominios VHH que se producen de manera natural. (6) En particular, pero no exclusivamente, en combinación con GLEW en las posiciones 44-47. (7) Con la condición de que cuando las posiciones 44-47 son GLEW, la posición 108 es siempre Q en secuencias (no humanizadas) de VHH que también contienen W en 103. (8) El grupo GLEW también contiene secuencias similares a GLEW en las posiciones 44-47, tales como por ejemplo GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER y ELEW.
Tabla A-4: Algunas combinaciones preferidas pero no limitativas de residuos distintivos en Nanobodies que se producen de manera natural. Para la humanización de estas combinaciones, se hace referencia a la memoria descriptiva.
11
37 44 45 47 83 84 103 104 108
DP-47 (humano)
M V G L W R A W G L
Grupo “KERE”
L F E R L K P W G Q
L
F E R F E P W G Q
L
F E R F K P W G Q
L
Y Q R L K P W G Q
L
F L R V K P Q G Q
L
F Q R L K P W G Q
L
F E R F K P W G Q
Grupo “GLEW”
L V G L W K S W G Q
M
V G L W K P R G Q
10 La invención se refiere a un Nanobody con una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 572. Las secuencias de CDR y FR secuencias en los Nanobodies de la invención son tales que los Nanobodies de la invención (y polipéptidos de la invención que comprenden los mismos): 15 -se unen a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de 42
asociación (KA) de 105 a 1012 litros/mol o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros/mol o más y más preferiblemente de 108 a 1012 litros/mol);
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad kon de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre
103 M-1-1
s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s;
y/o tales que:
-
se unen a RANK-L con una velocidad koff de entre 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s) y 10-6 s-1 (proporcionando un complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días), preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
Preferiblemente, secuencias de CDR y secuencias de FR presentes en los Nanobodies de la invención son tales que los Nanobodies de la invención se unirán a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
Un Nanobody puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos “una diferencia de aminoácido” (tal como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones de entramado en comparación con la región de entramado correspondiente de un dominio VH humano que se produce de manera natural, y en particular en comparación con la región de entramado correspondiente de DP-47. Más específicamente, un Nanobody puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos “una diferencia de aminoácido” (tal como se define en el presente documento) en al menos uno de los residuos distintivos (incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45) en comparación con la región de entramado correspondiente de un dominio VH humano que se produce de manera natural, y en particular en comparación con la región de entramado correspondiente de DP-47. Habitualmente, un Nanobody tendrá al menos una diferencia de aminoácido de este tipo con un dominio VH que se produce de manera natural en al menos una de FR2 y/o FR4, y en particular en al menos uno de los residuos distintivos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
Además, un Nanobody humanizado puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos “una diferencia de aminoácido” (tal como se define en el presente documento) en al menos una de las regiones de entramado en comparación con la región de entramado correspondiente de un dominio VHH que se produce de manera natural. Más específicamente, un Nanobody humanizado puede ser tal como se define en el presente documento, pero con la condición de que tenga al menos “una diferencia de aminoácido” (tal como se define en el presente documento) en al menos uno de los residuos distintivos (incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45) en comparación con la región de entramado correspondiente de un dominio VHH que se produce de manera natural. Habitualmente, un Nanobody humanizado tendrá al menos una diferencia de aminoácido de este tipo con un dominio VHH que se produce de manera natural en al menos una de FR2 y/o FR4, y en particular en al menos uno de los residuos distintivos en FR2 y/o FR4 (de nuevo, incluyendo aquellos en las posiciones 108, 103 y/o 45).
La invención en su sentido más amplio también comprende derivados de los Nanobodies de la invención. Tales derivados pueden obtenerse generalmente mediante modificación, y en particular mediante modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática), de los Nanobodies de la invención y/o de uno o más de los residuos de aminoácido que forman los Nanobodies de la invención.
Ejemplos de tales modificaciones, así como ejemplos de residuos de aminoácido dentro de la secuencia del Nanobody que pueden modificarse de tal manera (es decir, o bien en la estructura principal de la proteína pero preferiblemente en una cadena lateral), métodos y técnicas que pueden usarse para introducir tales modificaciones y los posibles usos y ventajas de tales modificaciones estarán claros para los expertos.
Por ejemplo, tal modificación puede implicar la introducción (por ejemplo, mediante unión covalente o de otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, residuos o restos en o sobre el Nanobody de la invención, y en particular de uno o más grupos funcionales, residuos o restos que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody de la invención. Estarán claros para el experto ejemplos de tales grupos funcionales.
Por ejemplo, tal modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, mediante la unión covalente o de cualquier otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales que aumentan la semivida, la solubilidad y/o la absorción del Nanobody de la invención, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad del Nanobody de la invención, que eliminan o atenúan cualquier efecto secundario no deseado del Nanobody de la invención, y/o que confieren otras propiedades ventajosas a y/o reducen las propiedades no deseadas de los Nanobodies y/o polipéptidos de la invención; o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. Estarán claros para el experto ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos, y pueden comprender generalmente todos los
grupos funcionales y las técnicas mencionadas en los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente en el presente documento así como los grupos funcionales y las técnicas conocidos en sí mismos para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv y anticuerpos de un solo dominio), para los que por ejemplo, se hace referencia a Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16.ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tales grupos funcionales pueden unirse, por ejemplo, directamente (por ejemplo, covalentemente) a un Nanobody de la invención, u opcionalmente mediante un ligador o espaciador adecuado, como estarán claros de nuevo para el experto.
Una de las técnicas más ampliamente usadas para aumentar la semivida y/o reducir la inmunogenicidad de proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tal como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, puede usarse cualquier forma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de (un solo) dominio y ScFv); se hace referencia por ejemplo a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); de Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), de Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en el documento WO 04/060965. Diversos reactivos para pegilación de proteínas también están disponibles comercialmente, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EE. UU.
Preferiblemente, se usa pegilación dirigida al sitio, en particular mediante un residuo de cisteína (véase, por ejemplo, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, con este propósito, PEG puede unirse a un residuo de cisteína que se produce de manera natural en un Nanobody de la invención, puede modificarse un Nanobody de la invención para introducir de manera adecuada uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG puede fusionarse al extremo N-terminal y/o C-terminal de un Nanobody de la invención, todo ello usando técnicas de ingeniería de proteínas conocidas en sí mismas para el experto.
Preferiblemente, para los Nanobodies y proteínas de la invención, se usa un PEG con un peso molecular mayor de 5000, tal como mayor de 10 000 y menor de 200 000, tal como menor de 100 000; por ejemplo en el intervalo de 20 000-80 000.
Otra modificación habitualmente menos preferida comprende glicosilación unida a N o unida a O, habitualmente como parte de modificación cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la célula huésped usada para expresar el Nanobody o polipéptido de la invención.
Aún otra modificación puede comprender la introducción de uno o más marcadores detectables u otros grupos o restos de generación de señales, dependiendo del uso pretendido del Nanobody marcado. Estarán claros para el experto marcadores y técnicas adecuados para unirlos, usarlos y detectarlos, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes (tal como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina y metales fluorescentes tales como 152Eu u otros metales de la serie de los lantánidos), marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminiscentes o marcadores bioluminiscentes (tales como luminal, isoluminol, éster de acridinio termocrómico, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, dioxetano o GFP y su análogos), radioisótopos (tales como 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe y 75Se), metales, quelatos de metal o cationes metálicos (por ejemplo, cationes metálicos tales como 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu,67Ga y 68Ga u otros metales o cationes metálicos que son particularmente adecuados para su uso en el diagnóstico y la obtención de imágenes in vivo, in vitro o in situ, tales como (157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr y 56Fe), así como cromóforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotina-avidina peroxidasa, peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa). Otros marcadores adecuados estarán claros para el experto, y por ejemplo incluyen restos que pueden detectarse usando espectroscopía de RMN o ESR.
Tales Nanobodies y polipéptidos marcados de la invención pueden usarse, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo
o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos en sí mismos tal como ELISA, RIA, EIA y otros “ensayos de tipo sándwich”, etc.) así como para propósitos de diagnóstico y obtención de imágenes in vivo, dependiendo de la elección del marcador específico.
Tal como estará claro para el experto, otra modificación puede implicar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metálicos a los que se hizo referencia anteriormente. Los grupos quelantes adecuados por ejemplo incluyen, sin limitación, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o etilendiaminotetraacético ácido (EDTA).
Aún otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que forma parte de un par de unión específica, tal como el par de unión biotina-(estrept)avidina. Tal grupo funcional puede usarse para unir el Nanobody de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que está unido a la otra mitad del par de unión, es decir a través de la formación del par de unión. Por ejemplo, un Nanobody de la invención puede conjugarse con
biotina, y unirse a otra proteína, polipéptido, compuesto o portador conjugado con avidina o estreptavidina. Por ejemplo, tal Nanobody conjugado puede usarse como indicador, por ejemplo en un sistema de diagnóstico en el que un agente de producción de señal detectable se conjuga con avidina o estreptavidina. Tales pares de unión también pueden usarse por ejemplo para unir al Nanobody de la invención a un portador, incluyendo portadores adecuados con propósitos farmacéuticos. Un ejemplo no limitativo son las formulaciones liposomales descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Tales pares de unión también pueden usarse para unir un agente terapéuticamente activo al Nanobody de la invención.
Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las que se pretende destruir una célula que expresa la diana contra las que están dirigidos los Nanobodies de la invención (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer), o para reducir o ralentizar el crecimiento y/o la proliferación de tal célula, los Nanobodies de la invención también pueden unirse a una toxina o a un residuo o resto tóxico. Ejemplos de restos, compuestos o residuos tóxicos que pueden unirse a un Nanobody de la invención para proporcionar, por ejemplo, un compuesto citotóxico estarán claros para el experto y pueden hallarse por ejemplo en la técnica anterior citada previamente y/o en la descripción adicional en el presente documento. Un ejemplo es la denominada tecnología ADEPT™ descrita en el documento WO 03/055527.
Otras posibles modificaciones químicas y enzimáticas estarán claras para el experto. Tales modificaciones también pueden introducirse con propósitos de investigación (por ejemplo, para estudiar relaciones función-actividad). Por ejemplo, se hace referencia a Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).
Preferiblemente, los derivados son tales que se unen a RANK-L con una afinidad (medida adecuadamente y/o expresada como valor de KD (real o aparente), un valor de KA (real o aparente), una velocidad kon y/o una velocidad koff, o alternativamente como valor de CI50, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) que es tal como se define en el presente documento para los Nanobodies de la invención.
Tal como se mencionó anteriormente, la invención también se refiere a proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente en o comprenden al menos un Nanobody de la invención. Por “consisten esencialmente en” quiere decirse que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención o bien es exactamente igual a la secuencia de aminoácidos de un Nanobody de la invención o bien corresponde a la secuencia de aminoácidos de un Nanobody de la invención que tiene un número limitado de residuos de aminoácido, tales como 1-20 residuos de aminoácido, por ejemplo 1-10 residuos de aminoácido y preferiblemente 1-6 residuos de aminoácido, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoácido, añadidos en el extremo amino terminal, en el extremo carboxilo terminal, o tanto en el extremo amino terminal como en el extremo carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos del Nanobody.
Dichos residuos de aminoácido pueden o no cambiar, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biológicas) del Nanobody y pueden añadir o no funcionalidad adicional al Nanobody. Por ejemplo, tales residuos de aminoácido:
-
pueden comprender un residuo de Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula huésped o un organismo huésped heterólogo.
-
pueden formar una secuencia señal o secuencia líder que dirige la secreción del Nanobody desde una célula huésped tras la síntesis. Péptidos líder secretores adecuados estarán claros para el experto, y pueden ser tal como se describen adicionalmente en el presente documento. Habitualmente, tal secuencia líder se unirá al extremo Nterminal del Nanobody, aunque la invención en su sentido más amplio no se limita a ello;
-
pueden formar una secuencia o señal que permite que el Nanobody se dirija hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, células, o partes o compartimentos específicos de células, y/o que permite que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa celular tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos estarán claros para el experto. Algunos ejemplos no limitativos son los pequeños vectores peptídicos (“vectores Pep-trans”) descritos en el documento WO 03/026700 y en Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani y Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (2004) y Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), y la secuencia de translocador de membrana descrita por Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). Por ejemplo, se describen secuencias de aminoácidos C-terminales y N-terminales para direccionamiento intracelular de fragmentos de anticuerpo por Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Otras técnicas adecuadas para direccionamiento intracelular implican la expresión y/o el uso de los denominados “Intrabodies” que comprenden un Nanobody de la invención, tal como se menciona a continuación;
-
pueden formar una “etiqueta”, por ejemplo una secuencia de aminoácidos o residuo que permite o facilita la purificación del Nanobody, por ejemplo usando técnicas de afinidad dirigidas contra dicha secuencia o residuo. Después de eso, dicha secuencia o residuo puede retirarse (por ejemplo, mediante escisión química o enzimática) para proporcionar la secuencia del Nanobody (con este propósito, la etiqueta puede unirse opcionalmente a la secuencia del Nanobody mediante una secuencia de ligador escindible o contener un motivo escindible). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales residuos son múltiples residuos de histidina, residuos de glutatión y
una etiqueta myc (véase, por ejemplo, SEQ ID NO:31 del documento WO 06/12282).
-
pueden ser uno o más residuos de aminoácido que se han funcionalizado y/o que pueden servir como sitio para la unión de grupos funcionales. Residuos de aminoácido y grupos funcionales adecuados estarán claros para el experto e incluyen, pero no se limitan a, los residuos de aminoácido y grupos funcionales mencionados en el presente documento para los derivados de los Nanobodies de la invención.
Según otro aspecto, un polipéptido de la invención comprende un Nanobody de la invención, que se fusiona en su extremo amino terminal, en su extremo carboxilo terminal, o tanto en su extremo amino terminal como en su extremo carboxilo terminal a al menos una secuencia de aminoácidos adicional, es decir para proporcionar una proteína de fusión que comprende dicho Nanobody de la invención y la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal fusión también se denominará en el presente documento una “fusión de Nanobody”.
La una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos adecuada y/o deseada. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterar o influir de otro modo en las propiedades (biológicas) del Nanobody, y pueden añadir o no funcionalidad adicional al Nanobody o el polipéptido de la invención. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confiere una o más propiedades o funcionalidades deseadas al Nanobody o el polipéptido de la invención.
Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos adicional también puede proporcionar un segundo sitio de unión, sitio de unión que puede estar dirigido contra cualquier proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo deseado (incluyendo pero sin limitarse a la misma proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo contra el que está dirigido el Nanobody de la invención, o una proteína, un polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epítopo diferente).
Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos estarán claros para el experto, y pueden comprender generalmente todas las secuencias de aminoácidos que se usan en fusiones peptídicas basadas en anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos (incluyendo pero sin limitarse a ScFv y anticuerpos de un solo dominio). Por ejemplo, se hace referencia a la revisión de Holliger y Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005).
Por ejemplo, tal secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que aumenta la semivida, la solubilidad o la absorción, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad, elimina o atenúa los efectos secundarios no deseados, y/o confiere otras propiedades ventajosas a y/o reduce las propiedades no deseadas de los polipéptidos de la invención, en comparación con el Nanobody de la invención en sí mismo. Algunos ejemplos no limitativos de tales secuencias de aminoácidos son proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana (véase, por ejemplo, el documento WO 00/27435) o moléculas hapténicas (por ejemplo, haptenos que se reconocen por anticuerpos circulantes, véase, por ejemplo, el documento WO 98/22141).
En particular, se ha descrito en la técnica que puede usarse la unión de fragmentos de inmunoglobulinas (tales como dominios VH) a albúmina sérica o a fragmentos de la misma para aumentar la semivida. Se hace referencia a los documentos WO 00/27435 y WO 01/077137). Según la invención, el Nanobody de la invención preferiblemente se une o bien directamente a albúmina sérica (o a un fragmento adecuado de la misma) o bien mediante un ligador adecuado, y en particular mediante un péptido adecuado de modo que el polipéptido de la invención puede expresarse como fusión genética (proteína). Según un aspecto específico, el Nanobody de la invención puede unirse a un fragmento de albúmina sérica que comprende al menos el dominio III de albúmina sérica o parte del mismo. Por ejemplo, se hace referencia al documento WO 07/112940 de Ablynx N.V.
Alternativamente, la secuencia de aminoácidos adicional puede proporcionar un segundo sitio de unión o unidad de unión que está dirigido contra una proteína sérica (tal como, por ejemplo, albúmina sérica humana u otra proteína sérica tal como IgG), para proporcionar una semivida aumentada en suero. Tales secuencias de aminoácidos por ejemplo incluyen los Nanobodies descritos a continuación, así como los pequeños péptidos y las proteínas de unión descritos en los documentos WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 02/076489 y los dAb descritos en los documentos WO 03/002609 y WO 04/003019. También se hace referencia a Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005, así como a los documentos EP 0 368 684, y WO 2008/028977, WO 2008/043821, WO 2008/043822 y al documento WO2008/068280.
Tales secuencias de aminoácidos pueden estar dirigidas, en particular, contra albúmina sérica (y más en particular albúmina sérica humana) y/o contra IgG (y más en particular IgG humana). Por ejemplo, tales secuencias de aminoácidos pueden ser secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra albúmina sérica (humana) y secuencias de aminoácidos que pueden unirse a residuos de aminoácido en albúmina sérica (humana) que no participan en la unión de albúmina sérica a FcRn (véase, por ejemplo, el documento WO 06/0122787) y/o secuencias de aminoácidos que son capaces de unirse a residuos de aminoácido en albúmina sérica que no forman parte del dominio III de albúmina sérica (véase de nuevo por ejemplo el documento WO 06/0122787); secuencias de aminoácidos que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (véase, por ejemplo, el documento WO 08/028977 de Ablynx N.V.); secuencias de aminoácidos contra albúmina sérica humana que presentan reacción cruzada con albúmina sérica de al menos una especie de mamífero, y en particular con al menos una especie de
primate (tal como, sin limitación, monos del género Macaca (tales como, y en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus), se hace referencia de nuevo al documento WO 2008/028977; secuencias de aminoácidos que pueden unirse a albúmina sérica de manera independiente del pH y/o secuencias de aminoácidos que son agentes de unión condicional (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/043822).
Según otro aspecto, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpos de 4 cadenas convencionales (y en particular anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, aunque habitualmente se prefiere menos, un Nanobody de la invención puede unirse a un dominio VH o VL convencional (preferiblemente humano) o a un análogo natural o sintético de un dominio VH o VL, de nuevo opcionalmente mediante una secuencia de ligador (incluyendo pero sin limitarse a otros anticuerpos de (un solo) dominio, tales como los dAb descritos por Ward et al.).
El al menos un Nanobody también puede unirse a uno o más dominios CH1, CH2 y/o CH3 (preferiblemente humanos), opcionalmente mediante una secuencia de ligador. Por ejemplo, un Nanobody unido a un dominio CH1 adecuado podría usarse, por ejemplo junto con cadenas ligeras adecuadas, para generar estructuras/fragmentos de anticuerpo análogos a fragmentos Fab o fragmentos F(ab’)2 convencionales, pero en los que uno o (en caso de un fragmento F(ab’)2) uno o ambos de los dominios VH convencionales se han reemplazado por un Nanobody de la invención. Además, dos Nanobodies podrían unirse a un dominio CH3 (opcionalmente mediante un ligador) para proporcionar un constructo con semivida aumentada in vivo.
Según un aspecto específico de un polipéptido de la invención, uno o más Nanobodies de la invención pueden unirse (opcionalmente mediante un ligador o región bisagra adecuado) a uno o más dominios constantes (por ejemplo, 2 o 3 dominios constantes que pueden usarse como parte de/para formar una parte Fc), a una parte Fc y/o a una o más partes, fragmentos o dominios de anticuerpo que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad para unirse a uno o más receptores de Fc. Por ejemplo, con este propósito, y sin limitarse a ello, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más dominios CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (tal como se describe en el presente documento) y más preferiblemente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o pueden formar (parte de) una region Fc, por ejemplo de IgG (por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), de IgE o de otra Ig humana tal como IgA, IgD o IgM. Por ejemplo, el documento WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH de camélido o un derivado humanizado del mismo (es decir, un Nanobody), en el que el dominio CH2 y/o CH3 de Camelidae se han reemplazado por dominios CH2 y CH3 humanos, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas que comprenden cada una un Nanobody y dominios CH2 y/o CH3 humanos (pero no el dominio CH1), inmunoglobulina que tiene la función efectora proporcionada por los dominios CH2 y/o CH3 e inmunoglobulina que puede funcionar sin la presencia de ninguna cadena ligera. Otras secuencias de aminoácidos que pueden unirse de manera adecuada a los Nanobodies de la invención para proporcionar una función efectora estarán claros para el experto, y pueden elegirse basándose en la(s) función/funciones efectora(s) deseada(s). Por ejemplo, se hace referencia a los documentos WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 y WO 05/017148, así como la revisión de Holliger y Hudson, citados anteriormente. El acoplamiento de un Nanobody de la invención a una parte Fc también puede conducir a una semivida aumentada, en comparación con el Nanobody de la invención correspondiente. Para algunas aplicaciones, el uso de una parte Fc y/o de dominios constantes (es decir, dominios CH2 y/o CH3) que confieren una semivida aumentada sin ninguna función efectora biológicamente significativa también puede ser adecuados o incluso preferido. Otros constructos adecuados que comprenden uno o más Nanobodies y uno o más dominios constantes con semivida aumentada in vivo estarán claros para el experto, y pueden comprender por ejemplo dos Nanobodise unidos a un dominio CH3, opcionalmente mediante una secuencia de ligador. Generalmente, cualquier proteína de fusión o derivado con semivida aumentada tendrá preferiblemente un peso molecular mayor de 50 kD, el valor de punto de corte para la absorción renal.
En otro aspecto específico, pero no limitativo, para formar un polipéptido de la invención, una o más secuencias de aminoácidos de la invención puede unirse (opcionalmente mediante una región bisagra o un ligador adecuado) a dominios constantes que se producen de manera natural, sintéticos o semisintéticos (o análogos, variantes, mutantes, partes o fragmentos de los mismos) que tienen una tendencia reducida (o esencialmente su ausencia) a autoasociarse para dar dímeros (es decir, en comparación con dominios constantes que se producen de manera natural en anticuerpos de 4 cadenas convencionales). Tales variantes de cadena Fc monoméricas (es decir, sin autoasociación), o fragmentos de las mismas, estarán claras para el experto. Por ejemplo, Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494, describen variantes de cadena Fc monoméricas que pueden usarse en las cadenas de polipéptido de la invención.
Además, tales variantes de cadena Fc monoméricas son preferiblemente tales que todavía son capaces de unirse al complemento o el/los receptor(es) de Fc relevante(s) (dependiendo de la parte Fc de la que derivan), y/o tales que todavía tienen alguna o todas las funciones efectoras de la parte Fc de la que derivan (o a un nivel reducido todavía adecuado para el uso pretendido). Alternativamente, en una cadena de polipéptido de este tipo de la invención, la cadena de Fc monomérica puede usarse para conferir una semivida aumentada a la cadena de polipéptido, en cuyo caso la cadena de Fc monomérica también puede tener o no funciones esencialmente efectoras.
Polipéptidos bivalentes/multivalentes, biespecíficos/multiespecíficos o biparatópicos/multiparatópicos de la invención también pueden unirse a partes Fc.
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia señal o secuencia líder que dirige la secreción del Nanobody o el polipéptido de la invención desde una célula huésped tras la síntesis (por ejemplo, para proporcionar una forma pre, pro o prepro del polipéptido de la invención, dependiendo de la célula huésped usada para expresar el polipéptido de la invención).
La secuencia de aminoácidos adicional también puede formar una secuencia o señal que permite que el Nanobody o polipéptido de la invención se dirija hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, células, o partes o compartimentos de células específicos, y/o que permite que el Nanobody o polipéptido de la invención penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa de células tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Estarán claros para el experto ejemplos adecuados de tales secuencias de aminoácidos, y por ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los vectores “Peptrans” mencionados anteriormente, las secuencias descritas por Cardinale et al. y las secuencias de aminoácidos y los fragmentos de anticuerpo conocidos en sí mismos que pueden usarse para expresar o producir los Nanobodies y polipéptidos de la invención como los denominados “Intrabodies”, por ejemplo tal como se describe en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; y en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, y las referencias adicionales descritas en esos documentos.
Para algunas aplicaciones, en particular para aquellas aplicaciones en las que se pretende destruir una célula que expresa la diana contra la que se dirigen los Nanobodies de la invención (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer),
o para reducir o ralentizar el crecimiento y/o la proliferación de tal célula, los Nanobodies de la invención también pueden unirse a una proteína o un polipéptido (cito)tóxicos. Ejemplos de tales proteínas y polipéptidos tóxicos que pueden unirse a un Nanobody de la invención para proporcionar, por ejemplo, un polipéptido citotóxico de la invención estarán claros para el experto y pueden hallarse, por ejemplo, en la técnica anterior citada previamente y/o en la descripción adicional en el presente documento. Un ejemplo es la denominada tecnología ADEPT™ descrita en el documento WO 03/055527.
Según un aspecto preferido, pero no limitativo, dicha una o más secuencias de aminoácidos adicionales comprenden al menos un Nanobody adicional, para proporcionar un polipéptido de la invención que comprende al menos dos Nanobodies, tal como tres, cuatro, cinco o más, en el que dichos Nanobodies pueden unirse opcionalmente mediante una o más secuencias ligadoras (tal como se define en el presente documento). Los polipéptidos que comprenden dos o más Nanobodies, de los que al menos uno es un Nanobody de la invención, también se denominarán en el presente documento polipéptidos “multivalentes” de la invención, y los Nanobodies presentes en tales polipéptidos también se denominarán en el presente documento que están en un “formato multivalente”. Por ejemplo un polipéptido “bivalente” de la invención comprende dos Nanobodies, opcionalmente unidos mediante una secuencia ligadora, mientras que un polipéptido “trivalente” de la invención comprende tres Nanobodies, opcionalmente unidos mediante dos secuencias ligadoras; etc.; en el que al menos uno de los Nanobodies presentes en el polipéptido, y hasta la totalidad de los Nanobodies presentes en el polipéptido, es/son un Nanobody de la invención.
En un polipéptido multivalente, los dos o más Nanobodies pueden ser iguales o diferentes, y pueden estar dirigidos contra el mismo antígeno o determinante antigénico (por ejemplo, contra la(s) misma(s) parte(s) o epítopo(s) o contra diferentes partes o epítopos) o pueden estar dirigidos alternativamente contra diferentes antígenos o determinantes antigénicos; o cualquier combinación adecuada de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido bivalente puede comprender (a) dos Nanobodies idénticos; (b) un primer Nanobody dirigido contra un primer determinante antigénico de una proteína o un antígeno y un segundo Nanobody dirigido contra el mismo determinante antigénico de dicha proteína o antígeno que es diferente del primer Nanobody; (c) un primer Nanobody dirigido contra un primer determinante antigénico de una proteína o un antígeno y un segundo Nanobody dirigido contra otro determinante antigénico de dicha proteína o antígeno; o (d) un primer Nanobody dirigido contra una primera proteína o un primer antígeno y un segundo Nanobody dirigido contra una segunda proteína o un segundo antígeno (es decir, diferente de dicho primer antígeno). De manera similar, un polipéptido trivalente puede comprender, por ejemplo y sin limitarse a ello (a) tres Nanobodies idénticos; (b) dos Nanobodies idénticos contra un primer determinante antigénico de un antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un determinante antigénico diferente del mismo antígeno; (c) dos Nanobodies idénticos contra un primer determinante antigénico de un antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno; (d) un primer Nanobody dirigido contra un primer determinante antigénico de un primer antígeno, un segundo Nanobody dirigido contra un segundo determinante antigénico de dicho primer antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno; o (e) un primer Nanobody dirigido contra un primer antígeno, un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno, y un tercer Nanobody dirigido contra un tercer antígeno diferente de dichos antígenos primero y segundo.
Los polipéptidos que contienen al menos dos Nanobodies, en los que al menos un Nanobody está dirigido contra un primer antígeno (es decir, contra RANK-L) y al menos un Nanobody está dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de RANK-L), también se denominarán polipéptidos “multiespecíficos” de la invención, y los Nanobodies presentes en tales polipéptidos también se denominarán en el presente documento que están en un “formato multiespecífico”. Por tanto, por ejemplo, un polipéptido “biespecífico” es un polipéptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antígeno (es decir, RANK-L) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de RANK-L), mientras que un polipéptido “triespecífico” es un polipéptido que comprende al menos un Nanobody dirigido contra un primer antígeno (es decir, RANK-L), al menos un Nanobody adicional dirigido contra un segundo antígeno (es decir, diferente de RANK-L) y al menos un Nanobody adicional dirigido contra un tercer antígeno (es decir, diferente tanto de RANK-L como del segundo antígeno); etc.
Por consiguiente, en su forma más sencilla, un polipéptido biespecífico es un polipéptido bivalente de la invención (tal como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra RANK-L, y un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno, en el que dichos Nanobodies primero y segundo pueden unirse opcionalmente mediante una secuencia ligadora (tal como se define en el presente documento); mientras que un polipéptido triespecífico en su forma más sencilla es un polipéptido trivalente de la invención (tal como se define en el presente documento), que comprende un primer Nanobody dirigido contra RANK-L, un segundo Nanobody dirigido contra un segundo antígeno y un tercer Nanobody dirigido contra un tercer antígeno, en el que dichos Nanobodies primero, segundo y tercero pueden unirse opcionalmente mediante una o más secuencias ligadoras, y en particular una y más, en particular dos.
Sin embargo, tal como estará claro a partir de la descripción anterior en el presente documento, un polipéptido multiespecífico puede comprender al menos un Nanobody contra RANK-L, y cualquier número de Nanobodies dirigidos contra uno o más antígenos diferentes de RANK-L.
Además, aunque está englobado dentro del alcance de la invención que el orden o la disposición específicos de los diversos Nanobodies en los polipéptidos de la invención pueden tener cierta influencia sobre las propiedades del polipéptido final de la invención (incluyendo pero sin limitarse a la afinidad, especificidad o avidez por RANK-L, o contra el uno o más de otros antígenos), dicho orden o disposición habitualmente no son críticos y pueden elegirse de manera adecuada por el experto, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados basados en la divulgación en el presente documento. Por tanto, cuando se hace referencia a un polipéptido específico multivalente o multiespecífico de la invención, debe indicarse que esto engloba cualquier orden o disposición de los Nanobodies relevantes, a menos que se indique explícitamente de otro modo.
Finalmente, también se encuentra dentro del alcance de la invención que los polipéptidos de la invención contienen dos o más Nanobodies y una o más secuencias de aminoácidos adicionales (tal como se menciona en el presente documento).
Para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios VHH y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; así como, por ejemplo, a los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221. Pueden hallarse algunos otros ejemplos de algunos polipéptidos multiespecíficos y/o multivalentes específicos de la invención en las solicitudes de Ablynx N.V. a las que se hizo referencia en el presente documento.
Un ejemplo preferido, pero no limitativo de un polipéptido multiespecífico comprende al menos un Nanobody de la invención y al menos un Nanobody que proporciona una semivida aumentada. Tales Nanobodies pueden ser, por ejemplo, Nanobodies que están dirigidos contra una proteína sérica, y en particular una proteína sérica humana, tal como albúmina sérica humana, proteína de unión a tiroxina, transferrina (humana), fibrinógeno, una inmunoglobulina tal como IgG, IgE o IgM, o contra una de las proteínas séricas enumeradas en el documento WO 04/003019. De estos, Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica (y en particular albúmina sérica humana) o a IgG (y en particular IgG humana, véase, por ejemplo, VH-1 de Nanobody descrito en la revisión de Muyldermans, citado anteriormente) se prefieren particularmente (aunque por ejemplo, para experimentos en ratones o primates, pueden usarse Nanobodies contra o que presentan reacción cruzada con albúmina sérica de ratón (MSA) o albúmina sérica de dicho primate, respectivamente. Sin embargo, para uso farmacéutico, se preferirán habitualmente Nanobodies contra albúmina sérica humana o IgG humana). Los Nanobodies que proporcionan para semivida aumentada y que pueden usarse en los polipéptidos de la invención incluyen los Nanobodies dirigidos contra albúmina sérica que se describen en el documento WO 04/041865, en el documento WO 06/122787 y en las solicitudes de patente adicionales de Ablynx N.V., tales como las mencionadas anteriormente.
Por ejemplo, algunos Nanobodies preferidos que proporcionan una semivida aumentada para su uso en la presente invención incluyen Nanobodies que pueden unirse a residuos de aminoácido en albúmina sérica (humana) que no participan en la unión de albúmina sérica a FcRn (véase, por ejemplo, el documento WO 06/0122787); Nanobodies que son capaces de unirse a residuos de aminoácido en albúmina sérica que no forman parte del dominio III de albúmina sérica (véase, por ejemplo, el documento WO 06/0122787); Nanobodies que tienen o pueden proporcionar una semivida aumentada (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/028977); Nanobodies contra albúmina sérica
humana que presentan reacción cruzada con albúmina sérica de al menos una especie de mamífero, y en particular con al menos una especie de primate (tal como, sin limitación, monos del género Macaca (tal como, y en particular, macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y/o macacos de la India (Macaca mulatta)) y babuinos (Papio ursinus)) (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/028977); Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica de manera independiente del pH (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/043821) y/o Nanobodies que son agentes de unión condicionales (véase, por ejemplo, el documento WO 2008/043822).
Algunos Nanobodies particularmente preferidos que proporcionan una semivida aumentada y que pueden usarse en los polipéptidos de la invención incluyen los Nanobodies ALB-1 a ALB-10 divulgados en el documento WO 06/122787 (véanse las tablas II y III) de los que se prefiere particularmente ALB-8 (SEQ ID NO: 62 en el documento WO 06/122787).
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de polipéptidos de la invención que comprenden al menos un Nanobody de la invención y al menos un Nanobody que proporciona una semivida aumentada se facilitan en SEQ ID NO 715 y 759.
Según un aspecto específico, pero no limitativo de la invención, los polipéptidos de la invención contienen, además del uno o más Nanobodies de la invención, al menos un Nanobody contra albúmina sérica humana.
Generalmente, cualquier polipéptido de la invención con semivida aumentada que contiene uno o más Nanobodies de la invención, y cualquier derivado de Nanobodies de la invención o de tales polipéptidos que tienen una semivida aumentada, tiene preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tal como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida del Nanobody correspondiente de la invención en sí mismo. Por ejemplo, tal derivado o polipéptido con semivida aumentada puede tener una semivida que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con el Nanobody correspondiente de la invención en sí mismo.
En un aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, tales derivados o polipéptidos pueden presentar una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más. Por ejemplo, tales derivados o polipéptidos pueden tener una semivida de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
Según un aspecto de la invención, los polipéptidos son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden aumentar la semivida del polipéptido in vivo.
Los polipéptidos de la invención se estabilizan in vivo y aumentarse su semivida mediante la unión a moléculas que resisten la degradación y/o el aclaramiento o secuestro. Normalmente, tales moléculas son proteínas que se producen de manera natural que tienen a su vez una larga semivida in vivo.
Otro ejemplo preferido, pero no limitativo de un polipéptido multiespecífico de la invención comprende al menos un Nanobody de la invención y al menos un Nanobody que dirige el polipéptido de la invención hacia, y/o que permite que el polipéptido de la invención penetre o entre en órganos, tejidos, células, o partes o compartimentos específicos de células, y/o que permite que el Nanobody penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa de células tal como una capa de células epiteliales, un tumor incluyendo tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de tales Nanobodies incluyen Nanobodies que se dirigen hacia proteínas, marcadores o epítopos de superficie celular específicos del órgano, tejido o célula deseados (por ejemplo, marcadores de superficie celular asociados con células tumorales), y los fragmentos de anticuerpo de un solo dominio de direccionamiento al cerebro descritos en los documentos WO 02/057445 y WO 06/040153, de los que son ejemplos preferidos FC44 (SEQ ID NO: 189 del documento WO 06/040153) y FC5 (SEQ ID NO: 190 del documento WO 06/040154).
En los polipéptidos de la invención, el uno o más Nanobodies y el uno o más polipéptidos pueden unirse directamente entre sí (tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/23221) y/o pueden unirse entre sí mediante uno o más espaciadores o ligadores adecuados, o cualquier combinación de los mismos.
Estarán claros para el experto espaciadores o ligadores adecuados para su uso en polipéptidos multivalentes y multiespecíficos, y pueden ser generalmente cualquier ligador o espaciador usado en la técnica para unir secuencias de aminoácidos. Preferiblemente, dicho ligador o espaciador es adecuado para su uso en la construcción de proteínas o polipéptidos que están destinados para uso farmacéutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y ligadores que se usan en la técnica
para unir fragmentos de anticuerpo o dominios de anticuerpo. Estos incluyen los ligadores mencionados en los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente, así como por ejemplo ligadores que se usan en la técnica para construir Diabodies o fragmentos de ScFv (a este respecto, sin embargo, debe indicarse que, mientras que en Diabodies y en fragmentos de ScFv la secuencia ligadora usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permiten que los dominios VH y VL pertinentes se junten para formar el sitio de unión a antígeno completo, no hay limitación particular en la longitud o la flexibilidad del ligador usado en el polipéptido de la invención, puesto que cada Nanobody por sí mismo forma un sitio de unión a antígeno completo).
Por ejemplo, un ligador puede ser una secuencia de aminoácidos adecuada, y en particular secuencias de aminoácidos de entre 1 y 50 residuos de aminoácido, preferiblemente entre 1 y 30, tal como entre 1 y 10. Algunos ejemplos preferidos de tales secuencias de aminoácidos incluyen ligadores Gly-Ser, por ejemplo del tipo (GlyxSery)z, tal como (por ejemplo, (Gly4Ser)3 o (Gly3Ser2)3, tal como se describe en el documento WO 99/42077 y los ligadores GS30, GS15, GS9 y GS7 descritos en las solicitudes de Ablynx mencionados en el presente documento (véase, por ejemplo, los documentos WO 06/040153 y WO 06/122825), así como regiones de tipo bisagra, tales como las regiones bisagra de anticuerpos de cadena pesada que se producen de manera natural o secuencias similares (tal como se describen en el documento WO 94/04678).
Algunos otros ligadores particularmente preferidos son poli-alanina (tal como AAA), así como los ligadores GS30 (SEQ ID NO: 85 en el documento WO 06/122825) y GS9 (SEQ ID NO: 84 en el documento WO 06/122825).
Otros ligadores adecuados comprenden generalmente compuestos o polímeros orgánicos, en particular aquellos adecuados para su uso en proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, se han usado restos poli(etilenglicol) para unir dominios de anticuerpo, véase, por ejemplo, el documento WO 04/081026.
Está englobado dentro del alcance de la invención que la longitud, el grado de flexibilidad y/u otras propiedades del/de los ligador(es) usado(s) (aunque no es crítico, tal como lo es habitualmente para ligadores usados en fragmentos ScFv) pueden tener cierta influencia sobre las propiedades del polipéptido final de la invención, incluyendo pero sin limitarse a la afinidad, especificidad o avidez por RANK-L, o por uno o más de los otros antígenos. Basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar el/los ligador(es) óptimo(s) para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Por ejemplo, en polipéptidos multivalentes de la invención que comprenden Nanobodies dirigidos contra un antígeno multimérico (tal como un receptor multimérico u otra proteína), la longitud y flexibilidad del ligador son preferiblemente tales que permiten que cada Nanobody de la invención presente en el polipéptido se una al determinante antigénico en cada una de las subunidades del multímero. De manera similar, en un polipéptido multiespecífico de la invención que comprende Nanobodies dirigidos contra dos o más determinantes antigénicos diferentes en el mismo antígeno (por ejemplo, contra diferentes epítopos de un antígeno y/o contra diferentes subunidades de un receptor, canal o proteína multiméricos), la longitud y flexibilidad del ligador son preferiblemente tales que permiten que cada Nanobody se una a su determinante antigénico pretendido. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar el/los ligador(es) óptimo(s) para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
También se encuentra dentro del alcance de la invención que el/los ligador(es) usado(s) confiera(n) una o más de otras propiedades o funcionalidad favorables para los polipéptidos de la invención, y/o proporcione(n) uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de grupos funcionales (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento para los derivados de los Nanobodies de la invención). Por ejemplo, los ligadores que contienen uno o más residuos de aminoácido cargados (véase la tabla A-2 anteriormente) pueden proporcionar propiedades hidrófilas mejoradas, mientras que pueden usarse ligadores que forman o contienen pequeños epítopos
o etiquetas con el propósito de detección, identificación y/o purificación. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar los ligadores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Finalmente, cuando dos o más ligadores se usan en los polipéptidos de la invención, estos ligadores pueden ser iguales o diferentes. De nuevo, basándose en la divulgación en el presente documento, el experto será capaz de determinar los ligadores óptimos para su uso en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Habitualmente, para facilidad de expresión y producción, un polipéptido de la invención será un polipéptido lineal. Sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limita a ello. Por ejemplo, cuando un polipéptido de la invención comprende tres o más Nanobodies, es posible unirlos mediante el uso de un ligador con tres o más “ramas”, uniéndose cada “rama” a un Nanobody, para proporcionar un constructo “en forma de estrella”. También es posible, aunque habitualmente menos preferido, usar constructos circulares.
La invención también comprende derivados de los polipéptidos de la invención, que pueden ser esencialmente análogos a los derivados de los Nanobodies de la invención, es decir, tal como se describen en el presente
documento.
La invención también comprende proteínas o polipéptidos que “consisten esencialmente” en un polipéptido de la invención (en el que la expresión “consisten esencialmente en” tiene esencialmente el mismo significado que el indicado en el presente documento).
Según un aspecto de la invención, el polipéptido de la invención está en forma esencialmente aislada, tal como se define en el presente documento.
Las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de una manera conocida en sí misma, tal como estará claro para el experto a partir de la descripción adicional en el presente documento. Por ejemplo, los Nanobodies y polipéptidos de la invención pueden prepararse de cualquier manera conocida en sí misma para la preparación de anticuerpos y en particular para la preparación de fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos ScFv). Algunos métodos preferidos, pero no limitativos para preparar las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies, polipéptidos y ácidos nucleicos incluyen los métodos y las técnicas descritos en el presente documento.
Tal como estará claro para el experto, un método particularmente útil para preparar una secuencia de aminoácidos, un Nanobody y/o un polipéptido de la invención comprende generalmente las etapas de:
i) expresar, en una célula huésped o un organismo huésped no humano adecuado (también denominado en el presente documento un “huésped de la invención”) o en otro sistema de expresión adecuado, un ácido nucleico que codifica dicha secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención (también denominado en el presente documento un “ácido nucleico de la invención”), opcionalmente seguido por:
ii) aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención así obtenido.
En particular, un método de este tipo puede comprender las etapas de:
i) cultivar y/o mantener un huésped no humano de la invención en condiciones que son tales que dicho huésped de la invención expresa y/o produce al menos una secuencia de aminoácidos, un Nanobody y/o polipéptido de la invención; opcionalmente seguido por:
ii) aislar y/o purificar una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención así obtenido.
Un ácido nucleico de la invención puede estar en forma de ADN o ARN mono o bicatenario, y está preferiblemente en forma de ADN bicatenario. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con una utilización de codones que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula huésped o el organismo huésped pretendido).
Según un aspecto de la invención, el ácido nucleico de la invención está en forma esencialmente aislada, tal como se define en el presente documento.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC, que de nuevo puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse u obtenerse de una manera conocida en sí misma, basándose en la información en las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención facilitadas en el presente documento, y/o pueden aislarse de una fuente natural adecuada. Para proporcionar análogos, pueden someterse secuencias de nucleótidos que codifican dominios VHH que se producen de manera natural por ejemplo a mutagénesis dirigida al sitio, de modo que se proporcione un ácido nucleico de la invención que codifica dicho análogo. Además, tal como estará claro para el experto, para preparar un ácido nucleico de la invención, también puede unirse entre sí de manera adecuada varias secuencias de nucleótidos, tales como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un Nanobody y por ejemplo ácidos nucleicos que codifican uno o más ligadores.
Técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención estarán claras para el experto y pueden incluir por ejemplo, pero no se limitan a, síntesis automatizada de ADN; mutagénesis dirigida al sitio; combinación de dos o más secuencias que se producen de manera natural y/o sintéticas (o dos o más partes de las mismas), introducción de mutaciones que conducen a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que pueden dirigirse y/o ligarse fácilmente usando enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción PCR usando uno o más cebadores “de apareamiento erróneo”. Estas y otras técnicas estarán claras para el experto, y se hace referencia de nuevo a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados anteriormente, así como los ejemplos a continuación.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente en y/o formar parte de un
constructo genético, como estará claro para el experto en la técnica. Tales constructos genéticos comprenden generalmente al menos un ácido nucleico de la invención que se une opcionalmente a uno o más elementos de constructos genéticos conocidos en sí mismos, tales como por ejemplo uno o más elementos reguladores adecuados (tales como un(os) promotor(es), potenciador(es), terminador(es) adecuado(s), etc.) y los elementos adicionales de constructos genéticos a los que se hizo referencia en el presente documento. Tales constructos genéticos que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención también se denominarán en el presente documento “constructos genéticos de la invención”.
Los constructos genéticos de la invención pueden ser ADN o ARN, y son preferiblemente ADN bicatenario. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula huésped o el organismo huésped pretendido, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula huésped pretendida o en una forma adecuada para la replicación, el mantenimiento y/o la herencia independientes en el organismo huésped pretendido. Por ejemplo, los constructos genéticos de la invención pueden estar en forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir un vector que puede proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo, en una célula huésped, un organismo huésped y/o sistema de expresión adecuados).
En un aspecto preferido pero no limitativo, un constructo genético de la invención comprende
i) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado operativamente a
ii) uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado;
y opcionalmente también
iii) uno o más elementos adicionales de constructos genéticos conocidos en sí mismos;
en el que los términos “elemento regulador”, “promotor”, “terminador” y “conectado operativamente” tienen su significado habitual en la técnica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento); y en el que dicho “elementos adicionales” presentes en los constructos genéticos pueden ser, por ejemplo, secuencias 3’ o 5’-UTR, secuencias líder, marcadores de selección, genes indicadores/marcadores de expresión y/o elementos que pueden facilitar o aumentar la (eficacia de) transformación o integración. Estos y otros elementos adecuados para tales constructos genéticos estarán claros para el experto, y pueden depender por ejemplo del tipo de constructo usado, la célula huésped o el organismo huésped pretendido; la manera en que van a expresarse las secuencias de nucleótidos de la invención de interés (por ejemplo, mediante expresión constitutiva, transitoria o inducible); y/o la técnica de transformación que va a usarse. Por ejemplo, pueden usarse secuencias reguladoras, promotores y terminadores conocidos en sí mismos para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos ScFv) de manera esencialmente análoga.
Preferiblemente, en los constructos genéticos de la invención, dicho al menos un ácido nucleico de la invención y dichos elementos reguladores, y opcionalmente dicho uno o más elementos adicionales, se “unen operativamente” entre sí, mediante lo que se pretende generalmente que estén en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, se considera que un promotor está “operativamente unido” a una secuencia codificante si dicho promotor es capaz de iniciar o de controlar/regular de otro modo la transcripción y/o la expresión de una secuencia codificante (en la que dicha secuencia codificante debe entenderse como que está “bajo el control de” dicho promotor). Generalmente, cuando dos secuencias de nucleótidos están operativamente unidas, estarán en la misma orientación y habitualmente también en el mismo marco de lectura. Habitualmente también serán esencialmente contiguas, aunque esto puede no requerirse también.
Preferiblemente, los elementos reguladores y adicionales de los constructos genéticos de la invención son tales que son capaces de proporcionar su función biológica pretendida en la célula huésped o el organismo huésped pretendido.
Por ejemplo, un promotor, potenciador o terminador debe ser “operable” en la célula huésped o el organismo huésped pretendido, mediante lo que quiere decirse que (por ejemplo) dicho promotor debe ser capaz de iniciar o de controlar/regular de otro modo la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo una secuencia codificante, a la que está operativamente unido (tal como se define en el presente documento).
Algunos promotores particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a, promotores conocidos en sí mismos para la expresión en las células huésped mencionadas en el presente documento; y en particular promotores para la expresión en las células bacterianas, tales como aquellas mencionadas en el presente documento y/o aquellas usadas en los ejemplos.
Un marcador de selección debe ser tal que permita que, es decir en condiciones de selección apropiadas, células huésped y/u organismos huésped que se han transformado (satisfactoriamente) con la secuencia de nucleótidos de
la invención para distinguirse de células/organismos huésped que no se han transformado (satisfactoriamente). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de tales marcadores son genes que proporcionan resistencia contra antibióticos (tales como kanamicina o ampicilina), genes que proporcionan resistencia a la temperatura, o genes que permiten que la célula huésped o el organismo huésped se mantenga en ausencia de determinados factores, compuestos y/o componentes (alimenticios) en el medio que son esenciales para la supervivencia de las células o los organismos no transformados.
Una secuencia líder debe ser tal que, en la célula huésped o el organismo huésped pretendido, permite las modificaciones postraduccionales deseadas y/o tal que dirige el ARNm transcrito a una parte o un orgánulo deseado de una célula. Una secuencia líder también puede permitir la secreción del producto de expresión de dicha célula. Como tal, la secuencia líder puede ser cualquier secuencia pro, pre o prepro operable en la célula huésped o el organismo huésped. Pueden no requerirse secuencias líder para la expresión en una célula bacteriana. Por ejemplo, pueden usarse secuencias líder conocidas en sí mismas para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de un solo dominio y fragmentos ScFv) de manera esencialmente análoga.
Un gen indicador o marcador de expresión debe ser tal que, en la célula huésped o el organismo huésped, permite la detección de la expresión de (un gen o una secuencia de nucleótidos presente en) el constructo genético. Un marcador de expresión también puede permitir opcionalmente la localización del producto expresado, por ejemplo en una parte un orgánulo específico de una célula y/o en (una/un) célula(s), tejido(s), órgano(s) o parte(s) específicos de un organismo pluricelular. Tales genes indicadores también pueden expresarse como fusión proteica con la secuencia de aminoácidos de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de promotores, terminadores y elementos adicionales adecuados incluyen aquellos que pueden usarse para la expresión en las células huésped mencionadas en el presente documento; y en particular aquellas que son adecuadas para la expresión en células bacterianas, tales como aquellas mencionadas en el presente documento y/o aquellas usadas en los ejemplos a continuación. Para algunos ejemplos (adicionales) no limitativos de los promotores, marcadores de selección, secuencias líder, marcadores de expresión y elementos adicionales que pueden estar presentes/usarse en los constructos genéticos de la invención, tales como terminadores, potenciadores transcripcionales y/o traduccionales y/o factores de integración, se hace referencia a los manuales generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al. mencionados anteriormente, así como a los ejemplos que se facilitan en los documentos WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-7,207,410, US-A-5,693,492 y EP 1 085 089. Otros ejemplos estarán claros para el experto. También se hace referencia a los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente y las referencias adicionales citadas en el presente documento.
Los constructos genéticos de la invención pueden proporcionarse generalmente uniendo de manera adecuada la(s) secuencia(s) de nucleótidos de la invención al uno o más elementos adicionales descritos anteriormente, por ejemplo usando las técnicas descritas en los manuales generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados anteriormente.
A menudo, los constructos genéticos de la invención se obtendrán insertando una secuencia de nucleótidos de la invención en un vector (de expresión) adecuado conocido en sí mismo. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos de vectores de expresión adecuados son aquellos usados en los ejemplos a continuación, así como aquellos mencionados en el presente documento.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o los constructos genéticos de la invención pueden usarse para transformar una célula huésped o un organismo huésped no humano, es decir para la expresión y/o producción de una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención. Estarán claros para el experto las células huésped o los huéspedes no humanos adecuados, y pueden ser, por ejemplo, cualquier célula o línea celular fúngica, procariota o eucariota adecuada o cualquier organismo fúngico, procariota o eucariota adecuado, por ejemplo:
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una cepa bacteriana, incluyendo pero sin limitarse a cepas gramnegativas tales como cepas de Escherichia coli; de Proteus, por ejemplo de Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por ejemplo de Pseudomonas fluorescens; y cepas grampositivas tales como cepas de Bacillus, por ejemplo de Bacillus subtilis o de Bacillus brevis; de Streptomyces, por ejemplo de Streptomyces lividans; de Staphylococcus, por ejemplo de Staphylococcus carnosus; y de Lactococcus, por ejemplo de Lactococcus lactis;
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una célula fúngica, incluyendo pero sin limitarse a células de especies de Trichoderma, por ejemplo de Trichoderma reesei; de Neurospora, por ejemplo de Neurospora crassa; de Sordaria, por ejemplo de Sordaria macrospora; de Aspergillus, por ejemplo de Aspergillus niger o de Aspergillus sojae; o de otros hongos filamentosos;
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una célula de levadura, incluyendo pero sin limitarse a células de especies de Saccharomyces, por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae; de Schizosaccharomyces, por ejemplo de Schizosaccharomyces pombe; de Pichia, por
ejemplo de Pichia pastoris o de Pichia methanolica; de Hansenula, por ejemplo de Hansenula polymorpha; de Kluyveromyces, por ejemplo de Kluyveromyces lactis; de Arxula, por ejemplo de Arxula adeninivorans; de Yarrowia, por ejemplo de Yarrowia lipolitica;
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una célula o línea celular de anfibio, tal como ovocitos de Xenopus;
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una célula o línea celular derivada de insectos, tal como células/líneas celulares derivadas de Lepidoptera, incluyendo pero sin limitarse a Spodoptera SF9 y Sf21 células o células/líneas celulares derivadas de Drosophila, tales como células de Schneider y Kc;
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una planta o célula vegetal, por ejemplo en plantas de tabaco; y/o
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una célula o línea celular de mamífero, por ejemplo una célula o línea celular derivada de un humano, una célula o una línea celular de mamíferos incluyendo pero sin limitarse a células CHO, células BHK (por ejemplo, células BHK21) y células o líneas celulares humanas tales como células HeLa, COS (por ejemplo, COS-7) y PER.C6;
así como todas las demás células huésped o huéspedes no humanos conocidos en sí mismos para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de (un solo) dominio y fragmentos ScFv), que estarán claros para el experto. También se hace referencia a los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente en el presente documento, así como, por ejemplo, a los documentos WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), citado anteriormente; Riechmann y Muyldermans, (1999), citado anteriormente; van der Linden, (2000), citado anteriormente; Thomassen et al., (2002), citado anteriormente; Joosten et al., (2003), citado anteriormente; Joosten et al., (2005), citado anteriormente; y las referencias adicionales citada en el presente documento.
Las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y polipéptidos de la invención también pueden introducirse y expresarse en una o más células, tejidos u órganos de un organismo pluricelular, por ejemplo con propósitos profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como terapia génica). Con este propósito, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden introducirse en las células o los tejidos de cualquier modo adecuado, por ejemplo como tales (por ejemplo, usando liposomas) o después de haberse introducido en un vector para terapia génica adecuado (por ejemplo, derivado de retrovirus tales como adenovirus, o parvovirus tales como virus adenoasociados). Tal como también estará claro para el experto, tal terapia génica puede realizarse in vivo y/o in situ en el cuerpo de un paciente administrando un ácido nucleico de la invención o un vector para terapia génica adecuado que codifica el mismo al paciente o a células específicas o un tejido o órgano específico del paciente; o pueden tratarse células adecuadas (a menudo extraídas del cuerpo del paciente que va a tratarse, tales como linfocitos explantados, aspirados de médula ósea o biopsias de tejido) in vitro con una secuencia de nucleótidos de la invención y luego (re)introducirse de manera adecuada en el cuerpo del paciente. Todo esto puede realizarse usando vectores para terapia génica, técnicas y sistemas de administración que se conocen bien por el experto, y por ejemplo descritos en Culver, K. W., “Gene Therapy”, 1994, pág. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, Nueva York, N.Y); Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),808813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; documentos WO 94/29469; WO 97/00957, US 5.580.859; US 5.5895466; o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635
640. Por ejemplo, se ha descrito en la técnica la expresión in situ de fragmentos ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) y de Diabodies (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)).
Para la expresión de los Nanobodies en una célula, también pueden expresarse como los denominados “Intrabodies”, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940; el documento WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
Las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y polipéptidos de la invención también pueden producirse por ejemplo en la leche de mamíferos transgénicos, por ejemplo en la leche de conejas, vacas, cabras u ovejas (véanse, por ejemplo, los documentos US-A-6.741.957, US-A-6.304.489 y US-A-6.849.992 para técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos), en plantas o partes de plantas incluyendo pero sin limitarse a sus hojas, flores, semillas, raíces o tubérculos (por ejemplo, en tabaco, maíz, soja o alfalfa) o por ejemplo en pupas del gusano de seda Bombix mori.
Además, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y polipéptidos de la invención también pueden expresarse y/o producirse en sistemas de expresión libres de células, y ejemplos adecuados de tales sistemas estarán claros para el experto. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos incluyen la expresión en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema Zubay de E. coli.
Tal como se mencionó anteriormente, una de las ventajas del uso de Nanobodies es que los polipéptidos basados en los mismos pueden prepararse a través de la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y sistemas de
expresión bacterianos, vectores, células huésped, elementos reguladores adecuados, etc., estarán claros para el experto, por ejemplo a partir de las referencias citadas previamente. Sin embargo, debe indicarse que la invención en su sentido más amplio no se limita a la expresión en sistemas bacterianos.
Preferiblemente, en la invención, se usa un sistema de expresión (in vivo o in vitro), tal como un sistema de expresión bacteriano, que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es adecuada para uso farmacéutico, y tales sistemas de expresión estarán claros de nuevo para el experto. Tal como también estará claro para el experto, pueden prepararse polipéptidos de la invención adecuados para uso farmacéutico usando técnicas para la síntesis de péptidos.
Para la producción a escala industrial, los huéspedes heterólogos preferidos para la producción (industrial) de Nanobodies o proteínas terapéuticas que contienen Nanobody incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica (es decir, de calidad para BPF) a gran escala. Los ejemplos adecuados de tales cepas estarán claros para el experto. Tales cepas y sistemas de producción/expresión también se ponen a disposición por empresas tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia).
Alternativamente, pueden usarse líneas celulares de mamífero, en particular células de ovario de hámster chino (CHO), para la expresión/producción/fermentación a gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación farmacéutica a gran escala. De nuevo, tales sistemas de expresión/producción se ponen a disposición por algunas de las empresas mencionadas anteriormente.
La elección del sistema de expresión específico dependerá en parte del requisito de determinadas modificaciones postraduccionales, más específicamente glicosilación. La producción de una proteína recombinante que contiene Nanobody para la que se desea o requiere glicosilación necesitará el uso de huéspedes de expresión de mamífero que tienen la capacidad para glicosilar la proteína expresada. A este respecto, estará claro para el experto que el patrón de glicosilación obtenido (es decir, la clase, el número y la posición de residuos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se usa para la expresión. Preferiblemente, o bien se usa una célula o línea celular humana (es decir, que conduce a una proteína que esencialmente tiene un patrón de glicosilación humano) o bien se usa otra línea celular de mamífero que puede proporcionar un patrón de glicosilación que es esencial y/o funcionalmente igual a la glicosilación humana o al menos imita la glicosilación humana. Generalmente, los huéspedes procariotas tales como E. coli no tienen la capacidad para glicosilar proteínas, y el uso de eucariotas inferiores tales como levaduras conduce habitualmente a un patrón de glicosilación que difiere de la glicosilación humana. No obstante, debe entenderse que todas las células huésped y sistemas de expresión anteriores pueden usarse en la invención, dependiendo de la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o polipéptido deseado que va a obtenerse.
Por tanto, según un aspecto no limitativo de la invención, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención está glicosilado. Según otro aspecto no limitativo de la invención, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención no está glicosilado.
Según un aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, se produce una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las cepas mencionados anteriormente.
Según otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invención se produce, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como células de las especies mencionadas anteriormente.
Según aún otro aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, se produce una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de a humano línea celular, y más en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es adecuada para la producción farmacéutica a gran escala, tal como las líneas celulares mencionadas anteriormente en el presente documento.
Cuando se usa la expresión en una célula huésped para producir las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y los polipéptidos de la invención, las secuencias de aminoácidos, los Nanobodies y polipéptidos de la invención pueden producirse o bien de manera intracelular (por ejemplo, en el citosol, en el periplasma o en los cuerpos de inclusión) y luego aislarse de las células huésped y opcionalmente purificarse adicionalmente; o bien pueden producirse de manera extracelular (por ejemplo, en el medio en el que se cultivan las células huésped) y luego aislarse del medio de cultivo y opcionalmente purificarse adicionalmente. Cuando se usan células huésped eucariotas, habitualmente se prefiere la producción extracelular puesto que esto facilita considerablemente el aislamiento adicional y el procesamiento posterior de los Nanobodies y proteínas obtenidos. Las células bacterianas tales como las cepas de E. coli mencionadas anteriormente no secretan normalmente proteínas de manera extracelular, excepto por unas cuantas de proteínas tales como toxinas y hemolisina, y la producción secretora en E. coli se refiere a la translocación de proteínas a través de la membrana interior al espacio periplásmico. La producción periplásmica proporciona varias ventajas con respecto a la producción citosólica. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos N-terminal del producto secretado puede ser idéntica a la del producto génico natural después de la escisión de la secuencia señal de secreción por una señal de peptidasa específica. Además, parece haber una actividad proteasa mucho menor en el periplasma que en el citoplasma. Además, la purificación de proteínas es más sencilla debido a que hay menos proteínas contaminantes en el periplasma. Otra ventaja es que pueden formarse enlaces disulfuro correctos porque el periplasma proporciona un entorno más oxidativo que el citoplasma. A menudo se encuentran proteínas sobreexpresadas en E. coli en agregados insolubles, denominados cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión pueden estar ubicados en el citosol o en el periplasma; la recuperación de proteínas biológicamente activas de estos cuerpos de inclusión requiere un procedimiento de desnaturalización/replegamiento. Muchas proteínas recombinantes, incluyendo proteínas terapéuticas, se recuperan de cuerpos de inclusión. Alternativamente, tal como estará claro para el experto, pueden usarse cepas de bacterias recombinantes que se han modificado genéticamente de modo que secreten una proteína deseada, y en particular una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o un polipéptido de la invención.
Por tanto, según un aspecto no limitativo de la invención, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido que se ha producido de manera intracelular y que se ha aislado de la célula huésped, y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. Según otro aspecto no limitativo de la invención, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención es una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido que se ha producid de manera extracelular, y que se ha aislado del medio en el que se cultiva la célula huésped.
Algunos promotores preferidos, pero no limitativos para su uso con estas células huésped incluyen,
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para la expresión en E. coli: promotor lac (y derivados del mismo tales como el promotor lacUV5); promotor de arabinosa; promotor de fago lambda izquierdo (PL) y derecho (PR); promotor del operón trp; promotores híbridos lac/trp (tac y trc); promotor de T7 (más específicamente el del gen 10 del fago T7) y otros promotores de fagos T; promotor del gen de resistencia a tetraciclina Tn10; variantes modificadas por ingeniería de los promotores anteriores que incluyen una o más copias de una secuencia de operador regulador foráneo;
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para la expresión en S. cerevisiae: constitutivos: ADH1 (alcohol deshidrogenasa 1), ENO (enolasa), CYC1 (citocromo c iso-1), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), PGK1 (fosfoglicerato cinasa), PYK1 (piruvato cinasa); regulados: GAL1.10.7 (enzimas metabólicas de galactosa), ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2), PHO5 (ácido fosfatasa), CUP1 (metalotioneína de cobre); heterólogos: VMCo (promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor);
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para la expresión en Pichia pastoris: el promotor AOX1 (alcohol oxidasa I);
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para la expresión en células de mamífero: potenciador/promotor de expresión precoz de citomegalovirus humano (hCMV); variantes de promotor de expresión precoz de citomegalovirus humano (hCMV) que contiene dos secuencias de operador de tetraciclina de tal manera que el promotor puede regularse mediante el represor Tet; promotor de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple; potenciador/promotor de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous (LTR de VSR); promotor de factor de elongación 1 (hEF-1) de humano, chimpancé, ratón o rata; el promotor de expresión temprana de SV40; promotor de repetición terminal larga de VIH-1; promotor de -actina;
Algunos vectores preferidos, pero no limitativos para su uso con estas células huésped incluyen:
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vectores para la expresión en células de mamífero: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y 1ZD35 (ATCC 37565), así como sistemas de expresión basados en virus, tales como aquellos basados en adenovirus;
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vectores para la expresión en células bacterianas: vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen);
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vectores para la expresión en levaduras u otras células fúngicas: pYES2 (Invitrogen) y vectores de expresión de Pichia (Invitrogen);
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vectores para la expresión en células de insecto: pBlueBacII (Invitrogen) y otros vectores de baculovirus
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vectores para la expresión en plantas o células vegetales: por ejemplo vectores basados en virus del mosaico de la coliflor o virus del mosaico del tabaco, cepas adecuadas de Agrobacterium, o vectores basados en plásmido Ti.
Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitativas para su uso con estas células huésped incluyen:
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para su uso en células bacterianas tales como E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, y similares; péptido señal TAT, señal de secreción C-terminal de hemolisina;
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para su uso en levaduras: secuencia prepro de factor de -apareamiento, fosfatasa (pho1), invertasa (Suc), etc.;
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para su uso en células de mamífero: señal indígena en caso de que la proteína diana sea de origen eucariota; péptido señal C de cadena VJ2 de Ig -murina; etc.
Las técnicas adecuadas para transformar una célula huésped o un huésped de la invención estarán claras para el experto y pueden depender de la célula huésped/el organismo huésped pretendido y el constructo genético que va a usarse. Se hace referencia de nuevo a los manuales y las solicitudes de patente mencionados anteriormente.
Después de la transformación, puede realizarse una etapa para detectar y seleccionar aquellas células huésped u organismos huésped que se han transformado satisfactoriamente con la secuencia de nucleótidos/constructo genético de la invención. Esto puede ser, por ejemplo, una etapa de selección basada en un marcador seleccionable presente en el constructo genético de la invención o una etapa que implica la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo, usando anticuerpos específicos.
La célula huésped transformada (que puede estar forma de una línea celular estable) o los organismos huésped transformados (que pueden estar en forma de una línea o cepa mutante estable) forman aspectos adicionales de la presente invención.
Preferiblemente, estas células huésped o organismos huésped son tales que expresan, o son (al menos) capaces de expresar (por ejemplo, en condiciones adecuadas), una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención (y en caso de un organismo huésped: en al menos una célula, parte, tejido u órgano del mismo). La invención también incluye generaciones, progenie y/o descendencia posteriores de la célula huésped o el organismo huésped de la invención, que pueden obtenerse, por ejemplo, mediante división celular o mediante reproducción sexual o asexual.
Para producir/obtener la expresión de las secuencias de aminoácidos de la invención, la célula huésped transformada o el organismo huésped transformado pueden sostenerse, mantenerse y/o cultivarse generalmente en condiciones tales que se expresa/produce la secuencia de aminoácidos, el Nanobody o polipéptido (deseado) de la invención. Las condiciones adecuadas estarán claras para el experto y dependerán habitualmente de la célula huésped/el organismo huésped usado, así como de los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención. De nuevo, se hace referencia a los manuales y las solicitudes de patente mencionados anteriormente en los párrafos sobre los constructos genéticos de la invención.
Generalmente, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimentos y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un compuesto o factor de inducción adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible); todos los cuales los puede seleccionar el experto. De nuevo, en tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden expresarse de manera constitutiva, de manera transitoria, o únicamente cuando se induce de manera adecuada.
También estará claro para el experto que una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención puede generarse (en primer lugar) en una forma inmadura (tal como se mencionó anteriormente), que luego puede someterse a modificación postraduccional, dependiendo de la célula huésped/el organismo huésped usado. Además, una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención puede glicosilarse, de nuevo dependiendo de la célula huésped/el organismo huésped usado.
La secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención puede aislarse entonces de la célula huésped/el organismo huésped y/o del medio en el que se cultivó dicha célula huésped u organismo huésped, usando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas conocidas en sí mismas, tales como técnicas de electroforesis y/o cromatografía (preparativa), técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, usando una secuencia de aminoácidos escindible específica, fusionada con una secuencia de aminoácidos, un Nanobody o polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, usando anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos que va a aislarse).
Generalmente, para uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención pueden formularse como preparación farmacéutica o composiciones que comprenden al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más compuestos y/o polipéptidos farmacéuticamente activos adicionales. Por medio de ejemplos no limitativos, tal formulación puede estar en una forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como mediante inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración mediante inhalación, mediante un parche cutáneo, mediante un implante, mediante un supositorio, etc. Tales formas de administración adecuadas, que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas, dependiendo del modo de administración, así como métodos y portadores para su uso en la preparación de las mismas, estarán claras para el experto, y se describen adicionalmente en el presente documento.
Por tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico), y opcionalmente uno o más sustancias activas adicionales.
Generalmente, los polipéptidos de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera adecuada conocida en sí misma, a los que se hace referencia por ejemplo, en los antecedentes generales de la técnica citados anteriormente (y en particular en los documentos WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 y WO 08/020079) así como en los manuales convencionales, tales como Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18.ª ed., Mack Publishing Company, EE. UU. (1990) o Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21.ª edición, Lippincott Williams y Wilkins (2005); o the Handbook of Therapeutical Antibodies (S. Dubel, ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (véanse, por ejemplo, las páginas 252-255).
Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden formularse y administrarse de cualquier manera conocida en sí misma para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo convencionales (incluyendo ScFv y Diabodies) y otras proteínas farmacéuticamente activo. Tales formulaciones y métodos para preparar los mismos estarán claros para el experto, y por ejemplo incluyen preparaciones adecuadas para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intraarterial o intratecal) o para administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica).
Preparaciones para administración parenteral pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que son adecuadas para infusión o inyección. Los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones por ejemplo incluyen, sin limitación, agua estéril y disoluciones y tampones acuosos tales como solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, disolución de dextrosa y solución de Hank; aceites acuosos; glicerol; etanol; glicoles tales como propilenglicol o así como aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja, así como mezclas adecuadas de los mismos. Habitualmente, se preferirán disoluciones o suspensiones acuosas.
Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse usando métodos de administración de terapia génica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.399.346, que se incorpora como referencia en su totalidad. Usando un método de administración de terapia génica, células primarias transfectadas con el gen que codifica para un polipéptido de la invención pueden transfectarse adicionalmente con promotores específicos de tejido para seleccionar como diana células, órganos, tejidos, injertos o tumores específicos y pueden transfectarse adicionalmente con secuencias señal y de estabilización para expresión localizada a nivel subcelular.
Por tanto, los polipéptidos de la invención pueden administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, pueden someterse a compresión para dar comprimidos, o pueden incorporarse directamente en los alimentos de la dieta del paciente. Para administración terapéutica oral, los polipéptidos de la invención pueden combinarse con uno o más excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, tabletas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos el 0,1 % del polipéptido de la invención. Su porcentaje en las composiciones y preparaciones puede variarse por supuesto y puede ser convenientemente de entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 % del peso de una forma de dosificación unitaria dada. La cantidad del polipéptido de la invención en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosificación eficaz.
Los comprimidos, tabletas, pastillas, cápsulas, y similares también pueden contener los siguientes: aglutinantes tales como goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y puede añadirse un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo o un agente aromatizante tal como menta piperita, aceite de gaulteria o aromatizante de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros diversos materiales pueden estar presentes como recubrimientos
o modificar de otro modo la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, las pastillas o cápsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener los polipéptidos de la invención, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aroma a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los polipéptidos de la invención pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
También pueden proporcionarse preparaciones y formulaciones para administración oral con un recubrimiento entérico que permitirá que los constructos de la invención resistan el entorno gástrico y pasen al intestino. Más generalmente, pueden formularse de manera adecuada preparaciones y formulaciones para administración oral para la administración a cualquier parte deseada del tracto gastrointestinal, pueden usarse supositorios adecuados para la administración al tracto gastrointestinal.
Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse por vía intravenosa o por vía intraperitoneal mediante infusión o inyección. Pueden prepararse disoluciones de los polipéptidos de la invención o sus sales en agua, opcionalmente mezclada con un tensioactivo no tóxico. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina, y mezclas de los mismos y en aceites. En las condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosificación farmacéuticas adecuados para inyección o infusión pueden incluir disoluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el principio activo que están adaptadas para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables o infundibles estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosificación final debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un disolvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o mediante el uso de tensioactivos. Puede provocarse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible que incluya agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se preparan disoluciones inyectables estériles incorporando los polipéptidos de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los demás componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado por congelación y secado a vacío, que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional presente en las disoluciones esterilizadas por filtración previamente.
Para administración tópica, los polipéptidos de la invención pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, generalmente será deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser un sólido o un líquido.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen agua, hidroxialquilos o glicoles o combinaciones de agua-alcohol/glicol, en las que los polipéptidos de la invención pueden disolverse o dispersarse a niveles eficaces, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Pueden añadirse adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse desde almohadillas absorbentes, usadas para impregnar vendajes y otros apósitos, o pulverizarse sobre la zona afectada usando pulverizadores de tipo bomba o de aerosol.
También pueden emplearse espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con portadores líquidos para formar pastas extensibles, geles, pomadas, jabones, y similares, para la aplicación directamente a la piel del usuario.
Se conocen en la técnica ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden usarse para administrar los polipéptidos de la invención a la piel; por ejemplo, véanse Jacquet et al. (patente estadounidense n.º 4.608.392), Geria (patente estadounidense n.º 4.992.478), Smith et al. (patente estadounidense n.º 4.559.157) y Wortzman (patente estadounidense n.º 4.820.508).
Pueden determinarse dosificaciones útiles de los polipéptidos de la invención comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en modelos animales. Se conocen en la técnica métodos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones, y otros animales, a humanos; por ejemplo, véase la patente estadounidense n.º 4.938.949.
Generalmente, la concentración de los polipéptidos de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente el 0,1-25 % en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,5-10 % en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente el 0,15 % en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,5-2,5 % en peso.
La cantidad de los polipéptidos de la invención requerida para su uso en tratamiento variará no solo con el polipéptido particular seleccionado sino también con la vía de administración, la naturaleza del estado que esté tratándose y la edad y condición del paciente y será en última instancia a discreción del médico clínico o doctor responsable. También la dosificación de los polipéptidos de la invención varía dependiendo de la célula, el tumor, tejido, injerto u órgano diana.
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una única dosis o como doses divididas administradas a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día. La propia subdosis puede dividirse adicionalmente, por ejemplo, en varias administraciones diferenciadas libremente separadas; tales como múltiples inhalaciones desde un insuflador o mediante la aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un régimen de administración podría incluir el tratamiento diario a largo plazo. Por “a largo plazo” quiere decirse al menos dos semanas y preferiblemente, varias semanas, meses o años de duración. Un experto habitual en la técnica puede determinar las modificaciones necesarias en este intervalo de dosificación usando únicamente experimentación de rutina dadas las enseñanzas en el presente documento. Véase Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., 4.ª ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosificación también puede ajustarse por el médico clínico individual en caso de cualquier complicación.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno óseo, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En el contexto de la presente invención, el término “prevención y/o tratamiento” no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino que también comprende generalmente prevenir la aparición de la enfermedad, ralentizar o revertir el progreso de la enfermedad, prevenir o ralentizar la aparición de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la intensidad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma y/o prevenir un aumento adicional de la intensidad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma, prevenir, reducir o revertir cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y generalmente cualquier acción farmacológica que es beneficiosa para el paciente que esté tratándose.
El sujeto que va a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Tal como estará claro para el experto, el sujeto que va a tratarse será en particular una persona que padece, o corre el riesgo de desarrollar, las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento.
La invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno que está asociado con RANK-L, con su actividad biológica o farmacológica, y/o con la señalización o las rutas biológicas en las que participa RANK-L, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. En particular, la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno que puede tratarse modulando RANK-L, su actividad biológica o farmacológica, y/o la señalización o las rutas biológicas en las que participa RANK-L, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. En particular, dicha cantidad farmacéuticamente eficaz puede ser una cantidad que es suficiente para modular RANK-L, su actividad biológica o farmacológica, y/o la señalización o las rutas biológicas en las que participa RANK-L; y/o una cantidad que proporciona a nivel del polipéptido de la invención en la circulación que es suficiente para modular RANK-L, su actividad biológica o farmacológica, y/o la señalización o las rutas biológicas en las que participa RANK-L.
La invención además se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno que pueden prevenirse y/o tratarse administrando un polipéptido de la invención a un paciente, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
Más en particular, la invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno elegidas del grupo que consiste en las enfermedades y los trastornos enumerados en el presente documento, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, método que comprende administrar, a un sujeto que padece o que corre el riesgo de desarrollar las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento, una cantidad farmacéuticamente activa de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.
En los métodos anteriores, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse de cualquier manera adecuada, dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que va a usarse. Por tanto, los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos pueden administrarse por ejemplo por vía oral, por vía intraperitoneal (por ejemplo, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, o por cualquier otra vía de administración que sortee el tracto gastrointestinal), por vía intranasal, por vía transdérmica, de manera tópica, por medio de un supositorio, mediante inhalación, de nuevo dependiendo de la formulación o composición farmacéutica específica que vaya a usarse. El médico clínico será capaz de seleccionar una vía de administración adecuada y una formulación o composición farmacéutica adecuada que va a usarse en tal administración, dependiendo de la enfermedad o el trastorno que vaya a prevenirse o tratarse y otros factores que conoce bien el médico clínico.
Los polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprenden los mismos se administran según un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o el trastorno que va a prevenirse o tratarse. El médico clínico será capaz generalmente de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o el trastorno que va a prevenirse o tratarse, la intensidad de la enfermedad que va a tratarse y/o la intensidad de los síntomas de la misma, el polipéptido de la invención específico que va a usarse, la vía de administración específica y formulación o composición farmacéutica que va a usarse, la edad, el sexo, peso, la dieta, condición general del paciente, y factores similares que conoce bien el médico clínico.
Generalmente, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de uno o más polipéptidos de la invención,
o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en uno o más dosis o cantidades farmacéuticamente eficaces. El médico clínico puede determinar la(s) dosis o cantidad(es) específica(s) que deben administrarse, de nuevo basándose en los factores citados previamente.
Generalmente, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento y dependiendo de la enfermedad o el trastorno específico que va a tratarse, la potencia del polipéptido de la invención específico que va a usarse, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica específica usada, los polipéptidos de la invención se administrarán generalmente en una cantidad de entre 1 gramo y 0,01 microgramos por kg de peso corporal al día, preferiblemente entre 0,1 gramo y 0,1 microgramos por kg de peso corporal al día, tal como de aproximadamente 1, 10, 100 o 1000 microgramos por kg de peso corporal al día, o bien de manera continua (por ejemplo, mediante infusión), como una única dosis diaria
o como múltiples dosis divididas durante el día. El médico clínico será capaz generalmente de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en el presente documento. También estará claro que en casos específicos, el médico clínico puede elegir apartarse de estas cantidades, por ejemplo basándose en los factores citados previamente y su criterio experto. Generalmente, puede obtenerse cierta orientación sobre las cantidades que deben administrarse a partir de las cantidades administradas habitualmente para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales comparables contra la misma diana administrados esencialmente por la misma vía, teniendo en cuenta sin embargo diferencias en la afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, semivida y factores similares que conoce bien el experto.
Habitualmente, en el método anterior, se usará un único polipéptido de la invención. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención usar dos o más polipéptidos de la invención en combinación.
Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir como régimen de tratamiento combinado, que pueden conducir o no a un efecto sinérgico. De nuevo, el médico clínico será capaz de elegir tales compuestos o principios adicionales, así como un régimen de tratamiento combinado adecuado, basándose en los factores citados previamente y su criterio experto.
En particular, los polipéptidos de la invención pueden usarse en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que se usan o pueden usarse para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos citados en el presente documento, como resultado de que puede obtenerse o no un efecto sinérgico. También estarán claros para el médico clínico ejemplos de tales compuestos y principios, así como vías, métodos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos.
En particular, la composición farmacéutica de la invención puede comprender uno o más polipéptidos de la invención y al menos un agente terapéutico adicional seleccionado de un factor morfogenético óseo, factor de crecimiento transformante- (TGF-), un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), IL-1ra, Kineret™, un inhibidor de TNF, un receptor de TNF soluble, Enbrel™, un anticuerpo anti-TNF, Remicade™, un anticuerpo D2E7, una hormona paratiroidea, un análogo de una hormona paratiroidea, una proteína relacionada con la hormona paratiroidea, un análogo de una proteína relacionada con la hormona paratiroidea, una prostaglandina, un bisfosfonato, un alendronato, fluoruro, calcio, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2, Celebrex™, Vioxx™, un inmunosupresor, metotrexato, leflunomida, un inhibidor de serina proteasa, un inhibidor de proteasa secretado por leucocitos (SLPI), un inhibidor de IL-6, un anticuerpo o Nanobody contra IL-6, un inhibidor de IL-8, un anticuerpo o Nanobody contra IL-8, un inhibidor de IL-18, una proteína de unión a IL-18, un anticuerpo o Nanobody contra IL-18, un modulador de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un modulador de FGF, un antagonista de PAF, un factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), una molécula relacionada con KGF, un modulador de KGF, un modulador de metaloproteinasa de la matriz (MMP), un modulador de óxido nítrico sintasa (NOS), un modulador del receptor de glucocorticoides, un modulador del receptor de glutamato, un modulador de los niveles de lipopolisacárido (LPS), una noradrenalina, un mimético de noradrenalina y un modulador de noradrenalina tal como se describe, por ejemplo, en el documento US 2004/00335353
Cuando van a usarse dos o más sustancias o principios como parte de un régimen de tratamiento combinado, pueden administrarse por la misma vía de administración o por vías de administración diferentes, esencialmente en el mismo momento o en momentos diferentes (por ejemplo, de manera esencialmente simultánea, consecutiva, o según un régimen alterno). Cuando van a administrarse las sustancias o principios simultáneamente por la misma vía de administración, pueden administrarse como diferentes formulaciones o composiciones farmacéuticas o parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, tal como estará claro para el experto.
Además, cuando van a usarse dos o más sustancias o principios activos como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios puede administrarse en la misma cantidad y según el mismo régimen usado cuando se usa por sí mismo el compuesto o principio, y tal uso combinado puede conducir o no a un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de las dos o más sustancias o principios activos conduce a un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o la totalidad de las sustancias o principios que va a administrarse, mientras que todavía se logra la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil, por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario no deseado que esté asociado con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando se usan en sus cantidades habituales, mientras que todavía se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
La eficacia del régimen de tratamiento usado según la invención puede determinarse y/o someterse a seguimiento de cualquier manera conocida en sí misma para la enfermedad o el trastorno implicado, tal como estará claro para el médico clínico. El médico clínico también será capaz, cuando sea apropiado y caso por caso, para cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, de modo que se logre el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados, y/o lograr un equilibrio apropiado entre lograr el efecto terapéutico deseado por un lado y evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados por otro lado.
Generalmente, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que se logre el efecto terapéutico deseado y/o durante el tiempo que se mantenga el efecto terapéutico deseado. De nuevo, esto puede determinarlo el médico clínico.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno óseo; y/o para su uso en uno o más de los métodos de tratamiento mencionados en el presente documento.
El sujeto que va a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Tal como estará claro para el experto, el sujeto que va a tratarse será en particular una persona que padece, o que corre el riesgo de desarrollar, las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento.
La invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno que pueden prevenirse y/o tratarse administrando un polipéptido de la invención a un paciente.
Más en particular, la invención se refiere al uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos óseos, y en particular para la prevención y el tratamiento de uno o más de las enfermedades y los trastornos enumerados en el presente documento.
De nuevo, en una composición farmacéutica de este tipo, el uno o más polipéptidos de la invención también pueden combinarse de manera adecuada con uno o más de otros principios activos, tales como aquellos mencionados en el presente documento.
Usos adicionales de los polipéptidos, ácidos nucleicos, constructos genéticos y huéspedes y células huésped de la invención estarán claros para el experto basándose en la divulgación en el presente documento. Por ejemplo, y sin limitación, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden unirse a un portador o soporte sólido adecuado para proporcionar un medio que puede usarse de una manera conocida en sí misma para purificar RANK-L de composiciones y preparaciones que comprenden el mismo. También pueden usarse derivados de las secuencias de aminoácidos de la invención que comprenden un marcador detectable adecuado, como marcadores para determinar (cualitativa o cuantitativamente) la presencia de RANK-L en una composición o preparación o como marcador para detectar selectivamente la presencia de RANK-L en la superficie de una célula o un tejido (por ejemplo, en combinación con técnicas de clasificación celular adecuadas).
También se describen los siguientes aspectos:
1.
Secuencia de aminoácidos que está dirigida contra y/o que puede unirse específicamente a RANK-L.
2.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 1, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente al sitio de unión al receptor de RANK en RANK-L.
3.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 o 2, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente a las hendiduras de unión al receptor entre subunidades en el trímero de RANK-L.
4.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 3, que modula la unión de RANK-L-L a RANK.
5.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 4, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK.
6.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 5, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK, mientras que no reduce y/o inhibe la interacción RANK-L/OPG.
7.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 6, que es un antagonista de RANK-L.
8.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 1, que previene y/o inhibe la diferenciación y/o proliferación de osteoclastos.
9.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 1, que modula la remodelación ósea.
10.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 9, que no se une a TRAIL.
11.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 10, que no se une a TNF-alfa.
12.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 11, que no se une al ligando de CD40.
13.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 12, que no se une a miembros de la familia de TNF relacionados.
14.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 13, que está en forma esencialmente aislada.
15.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 14, para la administración a un sujeto, en la que dicha secuencia de aminoácidos no se produce de manera natural en dicho sujeto.
16.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 1012 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
17.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que puede unirse específicamente a
M-1-1 M-1-1
RANK-L con una velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 sy aproximadamente 107 s, preferiblemente entre 103 M-1s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M
1s-1 y 107 M-1s-1 .
18.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que puede unirse específicamente a RANK-L con una velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 s-1, preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
19.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que puede unirse específicamente a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
20.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que es una secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de aminoácidos sintética o semisintética.
21.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que comprende un plegamiento de inmunoglobulina o que en condiciones adecuadas es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina.
22.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente).
23.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que es una secuencia de inmunoglobulina.
24.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que es una secuencia de inmunoglobulina que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semisintética.
25.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada.
26.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable de cadena pesada que deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
27.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente en un Nanobody (incluyendo pero sin limitarse a una secuencia de VHH).
28.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente en un Nanobody.
29.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que consiste esencialmente en un Nanobody humanizado.
30.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que además del al menos un sitio de unión para la unión contra RANK-L, contiene uno o más sitios de unión adicionales para la unión contra otros antígenos, proteínas o dianas.
31.
Secuencia de aminoácidos dirigidas contra RANK-L, que comprende tres o más tramos de residuos de aminoácido, en la que el primer tramo de residuos de aminoácido es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; el segundo tramo de residuos de aminoácido es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 324; y el tercer tramo de residuos de aminoácido es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 448.
32.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 31, en la que los al menos tres tramos de residuos de aminoácido forman parte del sitio de unión a antígeno para la unión contra RANK-L.
33.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 32, que está en forma esencialmente aislada.
34.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 33, para la administración a un sujeto, en la que dicha secuencia de aminoácidos no se produce de manera natural en dicho sujeto.
35.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 34, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 1012 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
36.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 35, que puede unirse específicamente a
M-1-1 M-1-1
RANK-L con una velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 sy aproximadamente 107 s, preferiblemente entre 103 M-1s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M
1s-1 y 107 M-1s-1 .
37.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 36, que puede unirse específicamente a RANK-L con una velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 s-1 preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
38.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 37, que puede unirse específicamente a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
39.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 38, que es una secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de aminoácidos sintética o semisintética.
40.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 39, que comprende un plegamiento de inmunoglobulina o que en condiciones adecuadas es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina.
41.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 40, que es una secuencia de inmunoglobulina.
42.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 41 que es una secuencia de inmunoglobulina que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semisintética.
43.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 42, que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada.
44.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 43, que consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable de cadena pesada que deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
45.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 44, que consiste esencialmente en un Nanobody (incluyendo pero sin limitarse a una secuencia de VHH).
46.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 45, que consiste esencialmente en un Nanobody.
47.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 31 a 46, que consiste esencialmente en un Nanobody humanizado.
48.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que además del al menos un sitio de unión para la unión formado por las secuencias de CDR, contiene uno o más sitios de unión adicionales para la unión contra otros antígenos, proteínas o dianas.
49.
Secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en 4 regiones de entramado (FR1 a FR4, respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3, respectivamente), en la que: -CDR1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; y -CDR2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 324;
y -CDR3 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 436-497.
50.
Secuencia de aminoácidos según el aspecto 49, que está en forma esencialmente aislada.
51.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 50, para la administración a un sujeto, en la que dicha secuencia de aminoácidos no se produce de manera natural en dicho sujeto.
52.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 51, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 1012 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
53.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 52, que puede unirse específicamente a
M-1-1 M-1-1
RANK-L con una velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 sy aproximadamente 107 s, preferiblemente entre 103 M-1s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M
1s-1 y 107 M-1s-1 .
54.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 53, que puede unirse específicamente a RANK-L con una velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 s-1 preferiblemente entre 10-2 s-1 y 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
55.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 54, que puede unirse específicamente a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
56.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 55, que es una secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de aminoácidos sintética o semisintética.
57.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 56, que comprende un plegamiento de inmunoglobulina o que en condiciones adecuadas es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina.
58.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 57, que es una secuencia de inmunoglobulina.
59.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 58, que es una secuencia de inmunoglobulina que se produce de manera natural (de cualquier especie adecuada) o una secuencia de inmunoglobulina sintética o semisintética.
60.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 59, que es una secuencia de inmunoglobulina humanizada.
61.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 60, que consiste esencialmente en una secuencia de dominio variable de cadena pesada que deriva de un anticuerpo de cadena pesada.
62.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 61, que consiste esencialmente en un Nanobody (incluyendo pero sin limitarse a una secuencia de VHH).
63.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 62, que consiste esencialmente en un Nanobody.
64.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 49 a 63, que consiste esencialmente en un Nanobody humanizado.
65.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos anteriores, que además del al menos un sitio de unión para la unión formado por las secuencias de CDR, contiene uno o más sitios de unión adicionales para la unión contra otros antígenos, proteínas o dianas.
66.
Nanobody que está dirigido contra y/o que puede unirse específicamente a RANK-L.
67.
Nanobody según el aspecto 66, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente al sitio de unión al receptor de RANK en RANK-L.
68.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 o 67, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente a las hendiduras de unión al receptor entre subunidades en el trímero de RANK-L.
69.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 68, que modula la unión de RANK-L-L a RANK.
70.
Nanobody según el aspecto 69, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK.
71.
Nanobody según el aspecto 70, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK, mientras que no reduce y/o inhibe la interacción RANK-L/OPG.
72.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 71, que es un antagonista de RANK-L.
73.
Nanobody según el aspecto 66, que previene y/o inhibe la diferenciación y/o proliferación de osteoclastos.
74.
Nanobody según el aspecto 66, que modula la remodelación ósea.
75.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 74, que no se une a TRAIL.
76.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 75, que no se une a TNF-alfa.
77.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 76, que no se une a ligando de CD40.
78.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 77, que no se une a miembros de la familia de TNF relacionados.
79.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 78, que está en forma esencialmente aislada.
80.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 79, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
81.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 80, que puede unirse específicamente a RANK-L con una velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre 103
M-1-1
s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s.
82. Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 81, que puede unirse específicamente a RANK-L con una
-1 -1
velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 spreferiblemente entre 10-2 sy 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
83.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 82, que puede unirse específicamente a RANK-L con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM.
84.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 83, que es un Nanobody que se produce de manera natural
(de cualquier especie adecuada) o un Nanobody sintético o semisintético.
85.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 84 que es una secuencia de VHH, una secuencia parcialmente humanizada de VHH, una secuencia completamente humanizada de VHH.
86.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 85, en el que: -CDR1 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; y -CDR2 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 324; y -CDR3 la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 448.
87.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 86, que es un Nanobody parcialmente humanizado.
88.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 87, que es un Nanobody completamente humanizado.
89.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 88, que es SEQ ID NO: 572.
90.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 88, que es un Nanobody humanizado que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NO: 750-756.
91.
Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 90, que se elige de SEQ ID NO: 572 o del grupo que consiste en SEQ ID NO: 750-756.
92.
Polipéptido que comprende o consiste esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65 y/o uno o más Nanobodies según cualquiera de los aspectos 66 a 91, y comprende opcionalmente además uno o más de otras unidades de unión de aminoácidos, opcionalmente unidas mediante uno o más ligadores peptídicos.
93.
Polipéptido según el aspecto 92, en el que dicho uno o más unidades de unión son secuencias de inmunoglobulina.
94.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 o 93, en el que dicha una o más de otras unidades de unión se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb o Nanobodies.
95.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 94, en el que dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son secuencias de inmunoglobulina.
96.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 95, en el que dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son Nanobodies.
97.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 96, que comprende o consiste esencialmente en uno o más Nanobodies según cualquiera de los aspectos 66 a 91 y en el que dicha una o más de otras unidades de unión son Nanobodies.
98.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 97, que es un constructo multivalente.
99.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 98, que es un constructo multiparatópico.
100.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 99, que es un constructo multiespecífico.
101.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 100, que tiene una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
102.
Polipéptido según el aspecto 101, en el que dicha una o más de otras unidades de unión proporcionan al polipéptido una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo,
respectivamente.
103.
Polipéptido según el aspecto 102, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporcionan al polipéptido una semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en proteínas séricas o fragmentos de las mismas, unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas, una parte Fc y pequeñas proteínas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas.
104.
Polipéptido según el aspecto 102, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporcionan al polipéptido una semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en albúmina sérica humana o fragmentos de la misma.
105.
Polipéptido según el aspecto 102, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporciona el polipéptido con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en unidades de unión que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
106.
Polipéptido según el aspecto 102, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporciona el polipéptido con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
107.
Polipéptido según el aspecto 102, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporciona el polipéptido con semivida aumentada es un Nanobody que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
108.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 101 a 107, que tiene una semivida en suero que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
109.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 101 a 108, que tiene una semivida en suero que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas,
o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
110.
Polipéptido según cualquiera de los aspectos 101 a 109, que tiene una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, de al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
111.
Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente en una o más secuencias de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65 y/o uno o más Nanobodies según cualquiera de los aspectos 66 a 91, y comprende opcionalmente además uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión, opcionalmente unidos mediante uno o más ligadores.
112.
Compuesto o constructo según el aspecto 111, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de aminoácidos.
113.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 112, en el que dicho uno o más ligadores, si están presentes, son una o más secuencias de aminoácidos.
114.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 113, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de inmunoglobulina.
115.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 114, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb o Nanobodies.
116.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 115, en el que dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son secuencias de inmunoglobulina.
117.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 116, en el que dicha una o más secuencias de aminoácidos de la invención son Nanobodies.
118.
Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente en uno o más Nanobodies según cualquiera de los aspectos 66 a 91 y en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son Nanobodies.
119.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 118, que es un constructo multivalente.
120.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 119, que es un constructo multiparatópico.
121.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 120, que es un constructo multiespecífico.
122.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 121, que tiene una semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
123.
Compuesto o constructo según el aspecto 122, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión proporcionan el compuesto o constructo con semivida aumentada, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
124.
Compuesto o constructo según el aspecto 123, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporcionan el compuesto o constructo con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en proteínas séricas o fragmentos de las mismas, unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas, una parte Fc y pequeñas proteínas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas.
125.
Compuesto o constructo según el aspecto 123, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporcionan el compuesto o constructo con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en albúmina sérica humana o fragmentos de la misma.
126.
Compuesto o constructo según el aspecto 123, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporciona el compuesto o constructo con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en unidades de unión que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
127.
Compuesto o constructo según el aspecto 123, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporciona el compuesto o constructo con semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de dominio, anticuerpos de un solo dominio, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como anticuerpo de un solo dominio, “dAb”, secuencias de aminoácidos que son adecuadas para su uso como dAb, o Nanobodies que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
128.
Compuesto o constructo según el aspecto 123, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión que proporciona el compuesto o constructo con semivida aumentada es un Nanobody que pueden unirse a albúmina sérica (tal como albúmina sérica humana) o a una inmunoglobulina sérica (tal como IgG).
129.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 122 a 128, que tiene una semivida en suero que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
130.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 122 a 129, que tiene una semivida en suero que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, respectivamente.
131.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 122 a 130, que tiene una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, de al menos 5 días (tal como de
aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
132.
Constructo monovalente, que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65 y/o un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91.
133.
Constructo monovalente según el aspecto 132, en el que dicha secuencia de aminoácidos de la invención se elige de Nanobodies.
134.
Constructo monovalente, que comprende o que consiste esencialmente en un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91.
135.
Secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos, que codifica una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, un polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, un compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134.
136.
Secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según el aspecto 135, que está en forma de un constructo genético.
137.
Célula huésped o huésped no humano que expresa, o que en circunstancias adecuadas es capaz de expresar, una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, un polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, un compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134; y/o que comprende una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según el aspecto 135, o un constructo genético según el aspecto 136.
138.
Composición, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, o secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según el aspectos 135 a 136.
139.
Composición según el aspecto 138, que es una composición farmacéutica.
140.
Composición según el aspecto 139, que es una composición farmacéutica, que comprende además al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y que comprende opcionalmente uno o más compuestos y/o polipéptidos farmacéuticamente activos adicionales.
141.
Método para producir una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, un polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, un compuesto
o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, una composición farmacéutica según cualquiera de los aspectos 139 o 140, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:
-
expresar, en una célula huésped o un organismo huésped no humano adecuado o en otro sistema de expresión adecuado, una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según el aspecto 135, o un constructo genético según el aspecto 136, opcionalmente seguido por:
-
aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, el Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, el polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, el compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, o el constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, así obtenido.
142. Método para producir una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, un polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, un compuesto
o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, una composición farmacéutica según cualquiera de los aspectos 139 o 140, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:
-
cultivar y/o mantener una célula huésped o un huésped no humano según el aspecto 137 en condiciones que son tales que dicha célula huésped o dicho huésped expresa y/o produce al menos una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, opcionalmente seguido por:
-
aislar y/o purificar la secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, el Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, el polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, el compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, o el constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134 así obtenido.
143.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, o composición según el aspecto 139 o 140 para su uso en un método para inmunoterapia.
144.
Uso de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131 o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134, en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad
o un trastorno óseo.
145.
Secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131, o un constructo monovalente según cualquiera de los aspectos 132 a 134 para su uso en prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno óseo.
146.
Derivado de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de los aspectos 1 a 65, o de un Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91.
147.
Derivado según el aspecto 146, que puede unirse específicamente a RANK-L.
148.
Derivado según el aspecto 147, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente al sitio de unión al receptor de RANK en RANK-L.
149.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 o 148, que está dirigida contra y/o puede unirse específicamente a las hendiduras de unión al receptor entre subunidades en el trímero de RANK-L.
150.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 149, que modula la unión de RANK-L-L a RANK.
151.
Derivado según el aspecto 150, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK.
152.
Derivado según el aspecto 151, que inhibe y/o previene la unión de RANK-L-L a RANK, mientras que no reduce y/o inhibe la interacción RANK-L/OPG.
153.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 152, que es un antagonista de RANK-L
154.
Derivado según el aspecto 147, que previene y/o inhibe la diferenciación y/o proliferación de osteoclastos.
155.
Derivado según el aspecto 147, que modula la remodelación ósea.
156.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 155, que no se une a TRAIL.
157.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 156, que no se une a TNF-alfa.
158.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 157, que no se une al ligando de CD40.
159.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 158, que no se une a miembros de la familia de TNF relacionados.
160.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 159, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
161.
Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 160, que puede unirse específicamente a RANK-L con una
velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre 103
M-1-1
s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s.
162. Derivado según cualquiera de los aspectos 147 a 161, que puede unirse específicamente a RANK-L con una
-1 -1
velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 spreferiblemente entre 10-2 sy 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
163.
Derivado de un compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131.
164.
Derivado según el aspecto 163, que puede unirse específicamente a RANK-L.
165.
Derivado según cualquiera de los aspectos 163 a 164, que puede unirse específicamente a RANK-L con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro.
166.
Derivado según cualquiera de los aspectos 163 a 165, que puede unirse específicamente a RANK-L con una velocidad de asociación (velocidad kon) de entre 102 M-1s-1 y aproximadamente 107 M-1s-1, preferiblemente entre 103
M-1-1
s-1 y 107 M-1s-1, más preferiblemente entre 104 M-1s-1 y 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 y 107 M-1s.
167. Derivado según cualquiera de los aspectos 163 a 166, que puede unirse específicamente a RANK-L con una
-1 -1
velocidad de disociación (velocidad koff) de entre 1 s-1 y 10-6 spreferiblemente entre 10-2 sy 10-6 s-1, más preferiblemente entre 10-3 s-1 y 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 y 10-6 s-1 .
168.
Derivado según cualquiera de los aspectos 146 a 167, que tiene una semivida en suero que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo, Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, o compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131 en sí mismo.
169.
Derivado según cualquiera de los aspectos 146 a 168, que tiene una semivida en suero que está aumentada en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, tal como más de 12 horas, o incluso más de 24, 48 o 72 horas, en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente según cualquiera de los aspectos 1 a 65 en sí mismo o Nanobody según cualquiera de los aspectos 66 a 91 en sí mismo, polipéptido según cualquiera de los aspectos 92 a 110, o compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 111 a 131 en sí mismo.
170.
Derivado según cualquiera de los aspectos 146 a 169, que tiene una semivida en suero en humano de al menos aproximadamente 12 horas, preferiblemente al menos 24 horas, más preferiblemente al menos 48 horas, incluso más preferiblemente al menos 72 horas o más; por ejemplo, al menos 5 días (tal como de aproximadamente 5 a 10 días), preferiblemente al menos 9 días (tal como de aproximadamente 9 a 14 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 10 días (tal como de aproximadamente 10 a 15 días), o al menos aproximadamente 11 días (tal como de aproximadamente 11 a 16 días), más preferiblemente al menos aproximadamente 12 días (tal como de aproximadamente 12 a 18 días o más), o mayor de 14 días (tal como de aproximadamente 14 a 19 días).
171.
Derivado según cualquiera de los aspectos 146 a 170, que es un derivado pegilado.
172.
Compuesto o constructo, que comprende o consiste esencialmente en uno o más derivados según cualquiera de los aspectos 146 a 171, y comprende opcionalmente además uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión, opcionalmente unidos mediante uno o más ligadores.
173.
Compuesto o constructo según el aspecto 172, en el que dicho uno o más de otros grupos, residuos, restos o unidades de unión son secuencias de aminoácidos.
174.
Compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 172 o 173, en el que dicho uno o más ligadores, si están presentes, son una o más secuencias de aminoácidos.
175.
Ácido nucleico que codifica un derivado para cualquiera de los aspectos 146 a 171 o un compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 172 a 174.
176.
Composición, que comprende al menos un derivado para cualquiera de los aspectos 146 a 171, compuesto o constructo según cualquiera de los aspectos 172 a 174, o secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según el aspectos 175.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Resultados de ELISA de competencia con TNF, TRAIL, CD40L y RANK-L tal como se describe en el ejemplo 3.2. A: la unión del Nanobody RANK-L6; B: la unión del Nanobody RANK-L9; C: la unión del Nanobody RANK-L13; D: la unión del Nanobody RANK-L15; E: la unión del Nanobody RANK-L18.
Figura 2: Resultados del ensayo de unión de competencia basado en células con anticuerpos anti-Nanobodies RANK-L monovalentes y trivalentes tal como se describe en el ejemplo 4.3. A: inhibición con Nanobodies RANK-L13 y RANK-L130; B: inhibición con Nanobodies RANK-L15 y RANK-L150; C: inhibición con Nanobodies RANK-L18 y RANK-L180. Línea continua: Nanobody monovalente; Línea discontinua larga: Nanobody biespecífico trivalente; Línea discontinua corta: Nanobody irrelevante.
Figura 3: Los efectos de los Nanobodies en la diferenciación de osteoclastos humanos. Se muestran los resultados como valores de TRACP 5b. Los grupos son: BL = Nivel inicial (sin compuestos añadidos); C = control (OPG 100 ng/ml); A1 = 0,05 nM; A2 = 0,3 nM; A3 = 1 nM; A4 = 3 nM; A5 = 10 nM; A6 = 50 nM; A7 = 250 nM. Se compararon los resultados de todos los grupos por separado con los resultados del grupo de nivel inicial usando ANOVA de un factor. Los asteriscos indican efectos inhibidores estadísticamente significativos en comparación con el nivel inicial. Todos los Nanobodies inhiben la diferenciación de osteoclastos de manera dependiente de la dosis (***p <0,001). 3-
A: RANK-L60; 3-B: RANK-L130; 3-C: RANK-L180.
Figura 4: (A) Niveles de NTx en suero expresados como % de cambio del nivel inicial tras la administración de Nanobodies (no se incluyen los niveles por debajo del límite de detección). (B) Niveles de NTx promedio en suero expresados como % de cambio del nivel inicial tras la administración de ibandronato de molécula pequeña (IBN) o de Nanobody de control negativo ALB-1.
Figura 5: Niveles de BAP en suero expresados como % de cambio del nivel inicial tras la administración de Nanobodies.
Figura 6: Alineación de RANK-L13hum5 humanizado (SEQ ID NO: 755) con la molécula de tipo natural RANK-L13 (SEQ ID NO: 572) y con los primeros 97 residuos de aminoácido de VH3-23 de línea germinal humana (SEQ ID NO: 763). Los residuos de aa humanizados se indican en rojo, mientras que CDR1, 2 y 3 se destacan en verde.
Figura 7: Análisis de la potencia de RANK-L13, RANK-L13hum5 y RANK-L13hum5_D62E en el ensayo AlphaScreen.
Figura 8: La unión de RANK-L130NT y RANK-L 008a a RANK-L inmovilizado. La unión de RANK-L 130NT (azul claro) y Rank-L 008a (rosa) en presencia de albúmina a Rank-L inmovilizado.
Figura 9: Sensogramas superimpuestos de la unión de RANK-L18hum6. RANK-L18hum6: la unión de RANK-L18hum6 500 nM durante 120 segundos. Mezcla: la unión de RANK-L18hum6 500 nM durante 120 segundos seguido por la inyección de una mezcla que contenía 500 nM de RANK-L18hum6 y RANK-L13hum5.
Figura 10: Sensogramas superimpuestos de la unión de RANK-L13hum5. RANK-L13hum5: la unión de 500 nM RANK-L13hum5 durante 120 segundos. Mezcla: la unión de 500 nM RANK-L13hum5 durante 120 segundos seguido por la inyección de una mezcla que contenía 500 nM de RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6.
Figura 11: La inhibición de RANK-L indujo la diferenciación de células RAW264.7. Se incubaron células RAW264.7 (2000 células/pocillo) con una serie de dilución de RANK-L008a (), RANK-L003p (■), o un Nanobody irrelevante (▲) y se indujo diferenciación con RANK-L 7,5 ng/ml. Después de 4 días, se midió la actividad ácido fosfatasa resistente en tartrato en el sobrenadante. Se muestra la media  e.e. de mediciones por duplicado. Se indican los controles positivos (es decir, sin Nanobody) usando ; se indican los controles negativos (es decir, sin RANK-L) usando ().
Figura 12: Inhibición de la interacción de RANK-L con RANK. Se incubó una serie de dilución de RANK-L008a (), RANK-L003p (▲) u osteoprotegerina () con RANK-L 7,5 ng/ml y RANK-Fc 200 ng/ml. Se transfirieron las mezclas a una placa de 96 pocillos recubierta con el Nanobody anti-Fc PMP02. Se detectó RANK-L unido residual.
Figura 13: Unión de RANK-L008a a albúmina sérica humana. Se recubrieron placas de 96 pocillos con HSA. Después de bloqueo, se aplicó una serie de dilución de RANK-L008a. Se detectó RANK-L008a unido con un Nanobody bivalente marcado con peroxidasa del rábano.
Figura 14 Unión bifuncional de RANK-L008a a HSA y RANK-L. A) Se recubrieron placas de microtitulación con Neutravidin después de que se uniera RANK-L biotinilado. Se incubaron los pocillos con una serie de dilución de RANK-L008a. Se detectó RANK-L008a unido con albúmina marcada con peroxidasa del rábano. Media  e.e. de mediciones por duplicado; B) Se recubrieron placas de microtitulación con HSA después de que se aplicara una serie de dilución de RANK-L008a. Se detectó RANK-L008a unido con RANK-L biotinilado seguido por estreptavidina marcada con peroxidasa del rábano.
Figura 15: Niveles de NTx en suero tras administración intravenosa o subcutánea (3 mg/kg) de Nanobodies RANK-L008a (8-A), RANK-L001p (8-B) o RANK-L003p (8-C) (no se incluyen los niveles por debajo del límite de detección).
Figura 16 Niveles de NTx en suero tras la administración (0,3 mg/kg; 0,03 mg/kg) de Nanobodies RANK-L008a (9-A), RANK-L001p (9-B) o RANK-L003p (9-C) (no se incluyen los niveles por debajo del límite de detección).
Figura 17: Reactividad cruzada de los Nanobodies con otros miembros de la familia de TNF, TNF y TRAIL y con RANK-L de ratón.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de Nanobodies de bloqueo de RANK-L
1.1 Inmunizaciones
Se inmunizaron dos llamas (n.º 115 y n.º 116), según protocolos convencionales, con 9 inyecciones intramusculares (100 o 50 mg/dosis a intervalos semanales) de RANK-L humano (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE. UU.) y RANK-L de ratón (R&D Systems, Mineápolis, MN, EE. UU.) alternos en la llama n.º 116 y en la llama n.º 115 para las 5 primeras inyecciones. Las últimas cuatro inyecciones en la llama 115 eran únicamente de RANK-L humano. Se formularon ambos antígenos en Stimune (Cedi-Diagnostics B.V., Lelystad, Países Bajos). En la semana 3, se recogieron los sueros para definir títulos de anticuerpos contra RANK-L humano y de ratón mediante ELISA. En resumen, se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) con RANK-L humano o de ratón. Después de bloqueo y adición de muestras de sueros diluidas, se demostró la presencia de Nanobodies anti-RANK-L usando anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de llama conjugado con HRP (peroxidasa del rábano) (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, Texas, EE.UU.) y una reacción enzimática posterior en presencia del sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetramentilbencidina) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). La DO450nm superó el valor de 1 para RANK-L humano y de ratón en ambos animales.
1.2 Construcción de bibliotecas
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica a partir de las muestras de suero usando Ficoll-Hypaque según las instrucciones del fabricante. A continuación, se extrajo el ARN total de estas células y se usó como material de partida para RTP-CR para amplificar fragmentos génicos que codifican Nanobody. Se clonaron estos fragmentos en un vector de fagémido preparado de manera interna. Se preparó el fago según métodos convencionales (véase, por ejemplo, la técnica anterior y las solicitudes presentadas por el solicitante citadas en el presente documento) y se almacenó después de esterilización por filtración a 4 °C para uso posterior.
1.3 Selecciones
Se usaron las bibliotecas de fagos obtenidas de las llamas n.º 115 y n.º 116 para diferentes estrategias de selección.
En una primera selección, se capturó hRANK-L biotinilado (expresado en la línea celular de mieloma de ratón NS0) (R&D Systems, Mineápolis, EE. UU.) a 1, 0,1, 0,01 g/ml en una fase sólida recubierta con Neutravidin. Tras incubación con las bibliotecas de fagos y lavado extenso, se eluyó de manera no específica el fago unido con tripsina (1 mg/ml).
En una segunda selección, soluble hRANK-L biotinilado (R&D Systems, Mineápolis, EE. UU.) (1 nM, 100 pM, 10 pM) se incubó con las bibliotecas de fagos. Después de lavado extenso, se capturó el hRANK-L biotinilado en una fase sólida recubierta con Neutravidin. Se eluyó de manera específica el fago unido con tripsina (1 mg/ml)
En una tercera selección, se recubrió hRANK-L (expresado en E. coli) (Peprotech, Londres, R.U.) sobre placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) a 1, 0,1, 0,01 mg/ml. Tras incubación con las bibliotecas de fagos y lavado extenso, se eluyó de manera no específica el fago unido con tripsina (1 mg/ml).
En todas las selecciones, se observó enriquecimiento. Volvió a clonarse el resultado de las selecciones como combinación en un vector de expresión producido de manera interna. Se recogieron las colonias y se hicieron crecer en placas de 96 pocillos profundos (volumen de 1 ml) y se indujeron añadiendo IPTG para la expresión del Nanobody. Se prepararon extractos periplásmicos (volumen: ∼80 l) según métodos convencionales (véase, por ejemplo, la técnica anterior y las solicitudes presentadas por el solicitante citadas en el presente documento).
1.4 Examen para detectar Nanobodies de bloqueo de RANK-L en el ensayo AlphaScreen
Se examinaron los extractos periplásmicos en un ensayo AlphaScreen para RANK para evaluar la capacidad de bloqueo de los Nanobodies expresados. Este ensayo se basa en el uso de perlas donadoras y aceptoras que pueden conjugarse con moléculas biológicas. Cuando una interacción biológica entre moléculas acerca las perlas, las moléculas de oxígeno singlete excitadas que se producen tras excitación con láser a 680 nm mediante un fotosensibilizador en la perla donadora, difunden por los alrededores para reaccionar con un agente quimiolumiscente en la perla aceptora que activa adicionalmente fluoróforos que posteriormente emiten luz a 520620 nm. Si el Nanobody inhibe la unión de RANK-L a RANK, disminuirá la emisión de fluorescencia, y la cantidad de Nanobody presentes estará inversamente relacionada con la cantidad de fluorescencia.
Se biotiniló RANK-L humano usando biotina (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) y sal de sodio del éster de 3-sulfo-Nhidroxisuccinimida del ácido biotinamidohexanoico (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.). Se acopló la quimera RANKhuFc (Alexis, Biochemical, Lausen, Suiza) a perlas aceptoras según las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.). Para evaluar la capacidad de neutralización de los Nanobodies anti-hRANK-L, se preincubaron series de dilución de los extractos periplásmicos con RANK-L humano biotinilado. A esta mezcla, se le añadieron las perlas aceptoras y las perlas donadoras de estreptavidina y se incubó adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se midió la fluorescencia mediante la lectura de placas en el lector de placas de marcador múltiple EnVision (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Una disminución de la señal de fluorescencia indica que la unión de RANK-L biotinilado al receptor de RANK se bloquea por el Nanobody expresado en el extracto periplásmico.
A partir de este examen, se seleccionaron y secuenciaron Nanobodies de inhibición. El análisis de secuenciación reveló 12 Nanobodies individuales y 10 familias de Nanobodies. Se representan las secuencias correspondientes en la tabla C-1 y la tabla B-1. Se muestra la secuencia de Nanobodies no inhibidores en la tabla B-2.
Ejemplo 2: Caracterización de 21 Nanobodies de bloqueo de RANK-L en el ensayo AlphaScreen y ELISA
2.1 Expresión y purificación de Nanobodies
Se purificaron y caracterizaron adicionalmente 20 Nanobodies inhibidores seleccionados del examen descrito en el ejemplo 1. Se expresaron los Nanobodies seleccionados en E.coli como proteínas etiquetadas con His6, c-myc en un volumen de cultivo de 50 ml. Se indujo la expresión mediante adición de IPTG 1 mM y se permitió que continuase durante 4 h a 37 °C. Después de centrifugar los cultivos celulares, se prepararon extractos periplásmicos mediante congelación-descongelación de los sedimentos. Se usaron estos extractos como material de partida para cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Se eluyeron los Nanobodies de la columna con imidazol 150 mM y posteriormente dializaron frente a PBS.
2.2 Los Nanobodies se unen a hRANK-L soluble recubierto en placas Maxisorp de 96 pocillos
En primer lugar, se capturó hRANK-L biotinilado (200 ng/ml) en placas de 96 pocillos recubiertas con Neutravidin. Por tanto, se recubrió con Neutravidin 2 g/ml durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas 5 veces con 300 l de PBS y luego se bloquearon con 300 l de caseína al 1 %/PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de bloqueo, se añadió RANK-L biotinilado (200 ng/ml) a los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado extenso con PBS, se añadieron cantidades variables de Nanobodies partiendo de 500 nM hasta 160 pM diluidos en caseína al 1 %/PBS a los pocillos y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectaron los Nanobodies unidos mediante incubaciones posteriores de un anticuerpo anti-myc de ratón primario y un conjugado de anticuerpo secundario de ratón-HRP (DAKO, Glostrup, Dinamarca) y usando cóctel de sustrato de TMB-H2O2 (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Se detuvo la reacción con H2SO4 y se leyó la DO a 450 nm. Todos los Nanobodies se unieron a hRANK-L recubierto en placas de manera dependiente de la dosis. Se muestran los valores de DE50 calculados en la tabla C-2.
También se analizó el mismo panel de Nanobodies para determinar la unión a RANK-L murino en una configuración similar tal como se describe para RANK-L humano (véase anteriormente). Únicamente el Nanobody RANK-L3 pudo unirse a RANK-L murino de manera dependiente de la dosis con una DE50 de aproximadamente 600 pM.
2.3 Los Nanobodies bloquean la unión de RANK-L a su RANK receptor relacionado en Alpha Screen
Se biotiniló RANK-L humano usando biotina (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) y sal de sodio del éster de 3-sulfo-Nhidroxisuccinimida del ácido biotinamidohexanoico (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.). Se acopló la quimera RANKhuFc (1 nM) (Alexis, Biochemical, Lausen, Suiza) a perlas aceptoras según las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.).
Se preincubó una serie de dilución de Nanobodies anti-RANK-L partiendo de 50 nM hasta 1 pM con RANK-L biotinilado 100 pM durante 30 minutos a TA. A esta mezcla, se le añadieron las perlas aceptoras de RANK y las perlas donadoras de estreptavidina y se incubó adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se midió la fluorescencia mediante la lectura de placas en el lector de placas de marcador múltiple EnVision (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 680 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
La preincubación de todos los Nanobodies con RANK-L biotinilado redujo la intensidad de fluorescencia a 520 nm, demostrando que los Nanobodies pueden inhibir eficazmente la unión de RANK-L a RANK de manera dependiente de la dosis. Se muestran los valores de CI50 calculados en la tabla C-3, y varían entre 137 pM para RANK-L9 y 3530 pM para RANK-L23.
Ejemplo 3: Especificidad de unión de RANK-L 6, 9, 13, 15, 18
3.1 RANK-L 6, 9, 13, 15, 18 se unen a específicamente a RANK-L humano y de macaco cangrejero expresados en membrana celular
Se expresó RANK-L de humano y macaco cangrejero en células de riñón embrionario humano (HEK293T; Wullaert et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 81-90) como la proteína unida a membrana, de longitud completa. Se evaluó la unión de los Nanobodies a RANK-L expresado en la superficie celular mediante análisis por FACS de células tal como se describe a continuación.
Se hicieron crecer células de riñón embrionario humano (HEK293T) en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS), L-glutamina 2 nM, piruvato de sodio 0,4 mM. Se transfectaron células HEK293T de manera transitoria con el plásmido que expresa RANK-L de macaco de longitud completa o humano de longitud completa usando Fugene6® y Optimem (Roche Molecular Biochemical, Indianápolis, IN, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se sometieron las células transfectadas a análisis por FACS. Se sembraron los transfectantes en placas de 96 pocillos a una concentración final de 5E+06/ml en tampón para FACS (PBS + FBS al 10 %) y se incubaron con cantidades variables de Nanobody (2 nM, 400 pM, 80 pM, 16 pM, 3,2 pM para transfectantes de hRANK-L; 2 nM, 400 pM para transfectantes de RANK-L de macaco) durante 1 hora a 4ºC. Luego se lavaron las células tres veces con tampón para FACS. Se detectaron los Nanobodies unidos mediante incubaciones posteriores de un anticuerpo anti-Myc de ratón primario (30 min a 4 °C (2 g/ml)) y una segunda incubación con anticuerpo de cabra anti-ficoeritrina (PE) de ratón (Jackson Laboratories) durante otros 30 min a 4°C. Finalmente, después de lavado, se suspendieron las células en PBS + FBS al 10 % + TO-PRO®-3 (5 nM) (Molecular Probes®, Invitrogen, Merelbeke, Bélgica) y se midió la fluorescencia de la superficie celular expresada como la fluorescencia de PE media, usando citometría de flujo. Todos los Nanobodies mostraron una unión dependiente de la dosis tanto a RANK-L humano como a RANK-L de macaco expresados en células HEK293T en todas las concentraciones sometidas a prueba (tabla C-4). La unión fue específica puesto que la adición de RANK-L humano soluble 40 nM a la mezcla de incubación de Nanobody 400 pM con los transfectantes de HEK293T suprimió la unión del Nanobody respectivo a las células (datos no mostrados).
3.2 RANK-L 6, 9, 13, 15, 18 no se unen a los miembros de la familia de TNF, TNF, ligando de CD40 (CD40L) o TRAIL
Se ha notificado que OPG humana presenta una unión débil al ligando de inducción de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL). La secuencia de aminoácidos de RANK-L muestra una similitud del 34 % con la de TRAIL.
En un ELISA de competencia, se mostró que los Nanobodies anti-RANK-L no se unen a los miembros de la familia de TNF, TNF, TRAIL y CD40L. Se recubrió RANK-L en placas de 96 pocillos tal como se describe en el ejemplo 2. Se preincubaron los Nanobodies RANK-L 6, 9, 13, 15 y 18 (1 nM) con cantidades variables de RANK-L, TNF, CD40L o TRAIL (aproximadamente de 100 nM a 40 pM) antes de añadirse a las placas. La unión de los Nanobodies a las placas recubiertas con RANK-L solo se inhibió por RANK-L añadido de manera exógena y no se vio afectada por la adición de los demás ligandos (figura 1).
Ejemplo 4: Actividad de neutralización de Nanobodies anti-RANK-L biespecíficos trivalentes frente a sus homólogos monovalentes
4.1 Construcción y expresión de Nanobodies anti-RANK-L biespecíficos trivalentes
También se expresaron RANK-L3, RANK-L6, RANK-L9, RANK-L13, RANK-L15 y RANK-L18 como Nanobodies anti-RANK-L biespecíficos trivalentes. Las moléculas trivalentes (por ejemplo, RANK-L6-ALB1-RANK-L6) comprenden dos elementos estructurales correspondientes a Nanobodies anti-RANK-L con un tercer elemento estructural en la parte central correspondiente a un elemento estructural de Nanobody anti-albúmina sérica humana (HSA) (ALB-1; SEQ ID NO: 790). Se fusionaron los elementos estructurales individuales mediante un ligador de Gly/Ser (GGGGSGGGS; SEQ ID NO: 792). Se muestran las secuencias de estos Nanobodies anti-RANK-L biespecíficos trivalentes en la tabla B-3. Se expresaron estos constructos en E.coli como proteínas etiquetadas con His6, c-myc y posteriormente se purificaron del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y cromatografía de exclusión molecular (SEC).
4.2 Inhibición por Nanobodies trivalentes de la unión de RANK-L a RANK en Alpha-Screen
Se compararon 5 Nanobodies trivalentes (RANK-L30: RANK-L3-ALB1-RANK-L3; RANK-L60: RANK-L6-ALB1-RANK-L6, RANK-L90: RANK-L9-ALB1-RANK-L9, RANK-L130: RANK-L13-ALB1-RANK-L13, RANK-L150: RANK-L15ALB1-RANK-L15, RANK-L180: RANK-L18-ALB1-RANK-L18) con sus homólogos monovalentes en el ensayo Alpha-Screen para evaluar si también pueden block la unión de RANK-L a su receptor relacionado.
Se realizó AlphaScreen tal como se describe en el ejemplo 2. Tal como se muestra en la tabla C-5, todos los Nanobodies trivalentes bloquearon la unión de RANK-L al receptor de RANK de manera dependiente de la dosis con potencia aumentada en comparación con las moléculas monovalentes correspondientes.
4.3 Inhibición por Nanobodies anti-RANK-L de la unión de RANK-L a RANK expresado en Membrana de células HEK293T
Se transfectaron células HEK293T de manera transitoria con el plásmido que expresa RANK de longitud completa usando Fugene6 tal como se describe en el ejemplo 3. Después de 24 horas, se aplicaron alícuotas de 60 l (7,5 × 103 células) en placas de 484 pocillos del sistema FMAT (PE Biosystems, CA, EE. UU.) y se permitió la adhesión durante 24 h. Después de adhesión durante la noche, se retiró el sobrenadante de cultivo golpeando suavemente la placa. Para iniciar el examen competitivo, se añadieron 20 l de RANK-L humano marcado con ALEXA617 (concentración final de 200 pM) diluido en PBS + BSA al 10 % (tampón de FMAT) y 20 l de una serie de dilución (de 200 nM a 0,075 pM) de los diferentes Nanobodies monovalentes y trivalentes a las placas de 484 pocillos que contenían células del sistema FMAT (PE Biosystems, CA). Se barrieron las placas después de 10 horas de incubación. Se midió la fluorescencia de la superficie celular mediante el sistema de detección celular 8200 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) que es un analizador macroconfocal de fluorescencia de eventos de unión biológica que permite ensayos de mezclado y lectura con células vivas.
La tabla C-6 y la figura 2 muestran que los Nanobodies bloquearon la unión de RANK-L a su receptor de manera dependiente de la dosis y que los formatos trivalentes muestran una potencia aumentada con respecto a las moléculas monovalentes.
4.4 Inhibición por Nanobodies anti-RANK-L de La activación de NF-κB inducida por RANK-L en células HEK293T
La osteoclastogénesis estimulada por RANK-L está asociada con la activación de NF-κB. De la manera más probable, RANK-L activa el dímero más común, p50/p65 (Wei et al. 2001, Endocrinology 142(3): 1290-1295). Xing et al. (2002, J Bone Miner. Res. 17(7): 1200-1210) han mostrado el importante papel de las moléculas de p50 y p52 de NF-kB en la osteoclastogénesis al notificar que p50 y p52 de NF-κB son esenciales para que precursores de osteoclastos que expresan RANK se diferencien en osteoclastos TRAP+ en respuesta a RANK-L. Además, supuestamente los ratones doblemente deficientes en p50 y p52 desarrollan una intensa osteopetrosis debido a la incapacidad para generar osteoclastos maduros (Franzoso et al. 1998, Genes & Development 11: 3482-3496). En conjunto, la activación de NF-κB inducida por RANK-L es importante para la formación de osteoclastos maduros.
Para evaluar el efecto de los Nanobodies sobre la activación de NF-κB inducida por RANK-L, se transfectaron células HEK293T de manera transitoria tal como se describe en el ejemplo 3 con un plásmido de gen indicador de NF-κB y un plásmido que codifica -galactosidasa, usándose este último para corregir la eficacia de transfección. Después de 24 h, se sembraron las células en placas de 96 pocillos. Otras 24 h después, se dejaron las células sin tratar o se incubaron en presencia de una cantidad constante de RANK-L humano (300 ng/ml) y cantidades variables de los Nanobodies anti-RANK-L indicados (de 200 nM a aproximadamente 10 pM). Después de 6 horas se lisaron las células; se sometieron a ensayo las actividades luciferasa (Luc) y -galactosidasa usando el kit Dual-light (Tropix/Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Se normalizaron los valores de Luc para los valores de -galactosidasa para corregir diferencias en la eficacia de transfección. Tal como se muestra en la tabla C-7, todos los Nanobodies anti-RANK-L inhiben la activación de NF-κB inducida por RANK-L de manera dependiente de la dosis. Los valores de CI50 calcularon indican que los Nanobodies trivalentes son más potentes que las moléculas monovalentes correspondientes.
Ejemplo 5: Inhibición de formación de osteoclastos por Nanobodies
Se investigaron los efectos de los tres Nanobodies RANK-L60, RANK-L130 y RANK-L180 sobre la diferenciación de osteoclastos humanos in vitro.
El método de osteoclastos cultivo en secciones de hueso lo describieron originariamente Boyde y colaboradores (1984; Br. Dent J. 156: 216-220) y Chambers y Horton (1984; J. Pathol. 144: 295-6). Originariamente, se determinaba el número de osteoclastos calculando el número de células multinucleadas positivas para fosfatasa ácidas resistente a tartrato (TRACP) bajo un microscopio. Después se demostró que la actividad TRACP 5b secretada refleja el número de osteoclastos en cultivos de osteoclastos de ratón (Alatalo et al., 2000; Clin. Chem. 46: 1751-4). Aunque la actividad TRACP 5b secretada se correlacionó estrechamente con el número de osteoclastos, no se secretó TRACP 5b por células precursoras de osteoclastos mononucleadas positivas para TRACP antes de haberse diferenciado en osteoclastos multinucleados maduros. Por tanto, TRACP 5b secretada es un marcador fiable del número de osteoclastos multinucleados maduros.
Se configuró un ensayo de diferenciación de osteoclastos humanos en el que se cultivaron células precursoras de osteoclastos CD34+ derivadas de médula ósea humana durante para 7 días en presencia de factores de crecimiento apropiados, incluyendo M-CSF y ligando de RANK, permitiéndoles diferenciarse en osteoclastos de resorción de hueso (Rissanen et al., 2005; Circulation 112: 3937-46).
Se suspendieron células madre CD34+ derivadas de médula ósea humana en medio de cultivo y se permitió que se unieran a secciones de hueso bovino en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. El medio de cultivo contenía cantidades apropiadas de importantes factores de crecimiento que favorecen la diferenciación de osteoclastos, incluyendo M-CSF y ligando de RANK. Se incubaron las células en un incubador de CO2 en una atmósfera humidificada del 95 % de aire y el 5 % de dióxido de carbono a 37 °C. En el día 7, cuando se completó la diferenciación de osteoclastos, se midió la actividad de la isoforma 5b fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRACP 5b) del medio de cultivo como índice del número de osteoclastos formados, usando el ensayo BoneTRAP® (IDS Ltd, Boldon, R.U.) y el contador de marcador múltiple VICTOR2™ (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.).
Se sometieron a prueba siete concentraciones diferentes de cada Nanobody en este estudio, que oscilaron entre 0,05 nM y 250 nM. Se incluyeron un grupo de nivel inicial sin Nanobodies y un grupo de control con una molécula de referencia en cada cultivo celular. Se usó osteoprotegerina, un inhibidor de la osteoclastogénesis, como molécula de referencia para demostrar que el sistema de prueba puede detectar la inhibición de la diferenciación de osteoclastos.
Los valores de nivel inicial de TRACP 5b fueron altos y el inhibidor de referencia OPG inhibió significativamente la diferenciación de osteoclastos, lo que indica que el ensayo se realizó satisfactoriamente y los resultados obtenidos eran fiables (figura 3). Los tres Nanobodies inhibieron de manera dependiente de la dosis la diferenciación de osteoclastos humanos. Todos los compuestos mostraron una inhibición estadísticamente significativa con concentraciones de 3,0 nM y mayores. Los perfiles de inhibición fueron similares para los tres Nanobodies.
Ejemplo 6: Identificación de residuos en RANK-L implicados en la interacción con los Nanobodies.
6.1 Construcción de híbridos de humano/ratón
Para identificar los sitios de unión de los Nanobodies en la molécula de RANK-L, se aprovechó la unión específica a RANK-L humano de los Nanobodies. Excepto para el Nanobody RANK-L3, los Nanobodies obtenidos no interaccionaron con RANK-L de ratón. Para identificar residuos implicados en la interacción específica de especie en RANK-L humano, se diseñaron tres híbridos de humano/ratón que contenían sustituciones humano/ratón en AA’ y bucles CD tal como sigue:
Bucle AA’: híbrido 1 de humano/ratón: se sustituyeron T174D175 por A y S, respectivamente
Bucle CD: híbrido 2 de humano/ratón: se sustituyeron D231L232 por S y V, respectivamente híbrido 3 de humano/ratón: se sustituyeron A233TE235 por P y TD, respectivamente
Se generaron los híbridos de humano/ratón mediante PCR de solapamiento usando los cebadores mostrados en la tabla C-8. Posteriormente se clonaron los amplicones como fragmentos de restricción Xho1/Xba1 en un vector de expresión, pCIneo (Promega, Madison, WI).
6.2 Unión de Nanobodies a híbridos de humano/ratón de RANK-L
Se transfectaron células HEK293T de manera transitoria con vectores de expresión que codifican hRANK-L o los híbridos de humano/ratón. Se evaluó la unión de los Nanobodies (cantidades variables: 250 nM, 50 nM, 10 nM, 2 nM, 0,4 nM, 0,08 nM, 16 pM) a RANK-L expresado en la superficie celular mediante análisis por FACS de células tal como se describió anteriormente. Se presenta una visión general de los resultados de unión en la tabla C-9.
La unión del Nanobody RANK-L3 con reacción cruzada de humano/ratón sirvió como control para la expresión y el plegamiento correcto de las diferentes moléculas híbridas. Tal como se muestra en la tabla C-9, RANK-L3 se une a las tres moléculas híbridas diferentes.
Pueden resumirse los resultados de unión con Nanobodies específicos de humano tal como sigue:
-
El bucle AA’ no está implicado en la interacción específica de especie con los Nanobodies.
-
El bucle CD es crucial para la interacción con los Nanobodies.
-
Los Nanobodies pueden subdividirse en diferentes clases basándose en las diferencias observadas en su interacción con el bucle CD.
o RANK-L13, RANK-L15: la mutación de la parte N-terminal y la parte C-terminal del bucle CD suprime la interacción.
o RANK-L9 y RANK-L18: la mutación de la parte C-terminal del bucle CD suprime la interacción. La parte N-terminal del bucle CD no participa en la interacción.
o RANK-L6: la mutación de la parte N-terminal del bucle CD suprime la interacción. La parte Cterminal del bucle CD no participa en la interacción.
Ejemplo 7: Farmacocinética y farmacodinamia en macacos cangrejeros
Se asignaron cinco macacos cangrejeros macho y cinco hembra a 5 grupos, consistiendo cada grupo en un macho y una hembra. Los individuos macho tenían una edad comprendida entre 39 y 42 meses, mientras que las hembras tenían una edad de 33 a 44 meses. El peso corporal inicial del animal varió entre 2,5 y 2,7 kg para los individuos macho, y 2,2 y 2,6 kg para los individuos hembra.
Se sometieron a prueba Nanobodies RANK-L130 (SEQ ID NO: 715) y RANK-L180 (SEQ ID NO: 729) además del Nanobody RANK-L131 (SEQ ID NO: 643). RANK-L131 corresponde a un Nanobody bivalente que se compone únicamente de dos elementos estructurales de RANK-L13 interconectados por ligador. Se incluyó RANK-L131 para evaluar por completo el impacto del formato de unión a albúmina tanto en PK como en PD. Se incluyó ALB-1 (SEQ ID NO: 790) como control negativo e ibandronato de molécula pequeña (LKT Laboratories, Inc, St. Paul, MN) sirvió como control positivo. Se dosificó a los animales tal como se describe en la tabla C-10.
Se extrajeron muestras de suero para la determinación de los niveles de Nanobodies, análisis de anticuerpos y análisis de los marcadores de recambio de hueso N-telopéptido en suero (N-Tx en suero) y BAP (fosfatasa alcalina específica de hueso). También se recogió orina para el análisis de N-telopéptido (N-Tx en orina) y creatinina.
7.1 Farmacocinética
Se determinaron las concentraciones de los Nanobodies RANK-L130, RANK-L180 y RANK-L131 en plasma tal como sigue: se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C con 100 l de Neutravidin (2 g/ml, Pierce, Rockford, IL). Se aspiraron los pocillos y se bloquearon durante 30 min a TA con 300 l de SuperBlock®T20 PBS (Pierce, Rockford, IL). Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se capturó RANK-L biotinilado (0,5 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %) incubando 100 l durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de esta etapa de incubación, se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,05 %. Se prepararon los patrones, QC y prediluciones de las muestras de prueba en una placa no recubierta (de polipropileno) en plasma de macaco cangrejero al 100 % y se incubaron durante 30 min a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se transfirió una dilución 1/10 de las muestras y los patrones en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 % (la concentración final de plasma de macaco cangrejero es del 10 %) a la placa recubierta y se incubó durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de tres etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron las placas con un anticuerpo policlonal de conejo anti-Nanobody purificado interno (1 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron 100 l de anticuerpo de cabra policlonal anti-conejo marcado con peroxidasa del rábano (HRP) (1/5000 en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se realizó la visualización a cubierto de la luz durante 10 min con 100 l de 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina soluble potenciada (esTMB, SDT, Bruselas, Bélgica), diluido 1/3 en tampón de sustrato. Este tampón de sustrato era una composición del 60 % de Na2HPO2 (100 mM) y el 40 % de ácido cítrico (100 mM). Después de 10 min, se detuvo la reacción de formación de color con 100 l de HCl 1 N. Se determinó la absorbancia a 450 nm después de una agitación durante 10 s en el lector para ELISA Tecan, y se corrigió la absorbancia de fondo a 620 nm. Se determinó la concentración en cada muestra basándose en una curva patrón sigmoidea.
Los perfiles para las concentraciones plasmáticas de RANK-L130 y RANK-L180 parecieron disminuir de manera trifásica. En los primeros 2,5 días tras la administración, hubo una fase de disposición corta inicial (t1/2 de fase alfa aparente ≈ 0,5 días), seguido por una fase secundaria más lenta dominante (fase beta aparente) y una fase final corta (fase gamma aparente) caracterizadas por un cambio en la pendiente terminal.
Se sometieron los perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales de todos los individuos a los que se les inyectó RANK-L130 y RANK-L180 a un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) usando el modelo 201 preprogramado dentro del software profesional Win-Nonlin versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain Vista California, EE. UU.). Se analizaron los perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales de todos los animales a los que se les inyectó RANK-L131 usando el modelo 202 preprogramado. Se calcularon el área bajo la curva de concentración plasmática (AUC) y parámetros PK derivados por medio de la regla trapezoidal lineal hacia arriba/logarítmica hacia abajo. Se presenta una visión general de los parámetros farmacocinéticos calculados en la tabla C-11 y la tabla C-12.
Se detectan títulos de anticuerpos significativos para los Nanobodies en cuatro de los seis animales de las cohortes de RANK-L130, RANK-L131 y RANK-L180. La incidencia no dependía del Nanobody puesto que los cuatro animales que desarrollaron anticuerpos se originaron a partir de tres cohortes diferentes (cynolm, cyno3m, cyno4f, cyno6f).
7.2 Farmacodinamia
El descubrimiento de N-telopéptidos reticulados de colágeno tipo I (NTx) ha proporcionado un marcador bioquímico específico de la resorción de hueso humano. La generación de la molécula de NTx está mediada por osteoclastos en hueso y se halla en orina y suero como producto final de degradación estable.
Se evaluaron los cambios en la resorción de hueso inducidos por los Nanobodies sometiendo a ensayo NTx en suero y NTx en orina usando inmunoensayos según las instrucciones del fabricante (Osteomark®NTx serum, Osteomark®NTx urine, Wampole Laboratories).
RANK-L130 y RANK-L180 provocaron una rápida disminución de los niveles de NTx en suero (figura 4). La inhibición máxima en estos dos grupos de prueba duró hasta al menos 40 días. Los niveles de NTx en suero comenzaron a volver al nivel inicial aproximadamente en el día 40 para cyno 1m y cyno 6f. En cyno 2f y 5m, la vuelta al nivel inicial se inició en el día 45 y el día 52, respectivamente. Los perfiles menos favorables observados para cyno 1m y cyno 6f pueden explicarse mediante la inmunogenicidad observada en estos animales.
La supresión de los perfiles de NTx en suero inducidos por RANK-L131 en cyno 3m y cyno 4f fue transitoria, ya que los niveles vuelven al nivel inicial en el día 8.
El fármaco de molécula pequeña ibandronato, que se administró una vez al mes, indujo una inhibición global de aproximadamente el 50 % en comparación con los niveles iniciales.
Se midieron los niveles de NTx en orina hasta el día 16 para las cohortes de RANK-L130, RANK-L131 y RANK-L180. NTx en orina mostró tendencias similares a las de NTx en suero.
Se evaluaron los cambios en la formación de hueso sometiendo a ensayo la actividad fosfatasa alcalina específica de hueso (BAP) en suero como medida cuantitativa e indicador de actividad osteoblática usando el inmunoensayo Metra®BAP. Se realizó el ensayo según las instrucciones del fabricante. RANK-L130 y RANK-L180 indujeron supresión de la actividad BAP (figura 5).
Ejemplo 8: Humanización de Nanobodies
Se ensamblaron versiones humanizadas de Nanobodies de tipo natural a partir de oligonucleótidos usando un método de PCR de extensión por solapamiento. Se muestran las secuencias de diferentes variantes posibles de RANK-L6, 9, 13, 15 y 18 que se evaluaron para determinar su capacidad de unión y actividad de neutralización en AlphaScreen y en los ensayos bioquímicos y celulares tal como se describen en los ejemplos 2, 3 y 4 en la tabla B-5.
RANK-L13
Se hizo una búsqueda de tipo BLAST de la secuencia de aminoácidos del Nanobody anti-RANK-L, RANK-L13 (SEQ ID NO: 572) en la base de datos de secuencia de VH de línea germinal humana usando una herramienta de alineación/consulta de secuencia interna (figura 6). VH3-23 de línea germinal humana (DP-47; SEQ ID NO: 763-764) mostró la secuencia más estrechamente relacionada. El Nanobody RANK-L13 muestra 80 sustituciones de aminoácidos conservadoras idénticas y 7 extra a lo largo de los primeros 97 residuos de aminoácido de VH3-23 de línea germinal humana. Se sustituyeron 8 residuos de aminoácido (indicados en rojo) con propósitos de humanización para producir RANK-L13hum5 (SEQ ID NO: 755).
En el proceso de humanización de RANK-L13, se construyeron cinco versiones de RANK-L13 (RANK-L13basic, RANK-L13hum1, RANK-L13hum2, RANL13hum3 y RANK-L13hum4). RANK-L13basic contiene 4 sustituciones: A14P, E44G, V78L y Q108L. Además de estos cambios, se han introducido sustituciones adicionales en las versiones hum1-4: RANK-L13hum1: R27F; RANK-L13hum2: R30S; RANK-L13hum3: A49S; RANK-L13hum4: S91Y. Se sometieron a prueba todas las versiones en el ensayo AlphaScreen y se analizó la unión a RANK-L mediante resonancia de plasmón superficial.
Se sometieron a prueba todas las versiones en el ensayo AlphaScreen. Los valores de CI50 calculados en AlphaScreen indican que las mutaciones introducidas no afectaron a las potencias de las versiones de RANK-L13 humanizadas cuando se compararon con RANK-L13 de tipo natural (tabla C-13).
También se analizó la cinética de unión de las versiones humanizadas del Nanobody RANK-L13 mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore 3000). Se unió covalentemente RANK-L soluble humano a la superficie de chips de sensor CM5 mediante acoplamiento de amina usando EDC/NHS para la activación y HCl para la desactivación. Se evaluó la unión a Nanobody a una concentración (100 nM). Se inyectó cada Nanobody durante 4 minutos a una velocidad de flujo de 45 ml/min para permitir la unión a antígeno unido a chip. A continuación, se envió el tampón de unión sin Nanobody sobre el chip a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación espontánea del Nanobody unido. A partir de los sensogramas obtenidos para los diferentes Nanobodies, se calcularon los valores de koff (kd) y se indican en la tabla C-13. Las constantes de velocidad de asociación (kon o ka), y así también valores de KD, eran únicamente indicativos ya que solo se usó 1 concentración de Nanobody para ajustar el modelo de unión. Tal como se muestra en la tabla C-13, todos los Nanobodies humanizados mostraron constantes de velocidad de disociación/velocidades de disociación comparables en comparación con el Nanobody de tipo natural RANK-L13.
En conjunto, los datos de AlphaScreen y el análisis por Biacore no indicaron efectos significativos sobre la unión o potencia de las mutaciones introducidas en las versiones humanizadas respectivas. En una versión humanizada final, RANK-L13hum5, se combinaron todas las mutaciones de humanización. Tal como se muestra en la tabla C-13, RANK-L13hum5 muestra potencia y afinidad de unión similares a RANK-L13 de tipo natural.
RANK-L18
En el proceso de humanización de RANK-L18, se construyeron seis versiones de RANK-L18 (RANK-L18basic, RANK-L18hum1, RANK-L18hum2, RANL18hum3, RANK-L18hum4 y RANK-L18hum5). RANK-L18basic contiene 4 sustituciones: A14P, E44G, V78L y Q108L. Además de estos cambios, se introdujeron sustituciones adicionales en las versiones hum1-5: RANK-L18huml: R27F; RANK-L18hum2: G49S; RANK-L18hum3: G60A; RANK-L18hum4: P77T y V78L; RANK-L18hum5: G94A. Se sometieron a prueba todas las versiones en AlphaScreen y Biacore (tabla C-13).
Los valores de CI50 calculados en AlphaScreen indicaron que las mutaciones introducidas en RANK-L18basic, RANK-L18hum3 y RANK-L18hum5 no afectaron a las potencias de estas versiones en comparación con RANK-L18 de tipo natural (tabla C-13). Las mutaciones de humanización en RANK-L18hum1 y RANK-L18hum2 influyeron moderadamente en la potencia mientras que la doble mutación en RANK-L18hum4 suprimió por completo la potencia del Nanobody. Basándose en estos resultados, se construyeron y analizaron dos mutantes adicionales, RANK-L18hum6 y RANK-L18hum7. RANK-L18hum6 combina las mutaciones de humanización en RANK-L18basic, RANK-L18hum3 y RANK-L18hum5. RANK-L18hum7 incluye todas las mutaciones de RANK-L18hum6 junto con la sustitución V78L. La tabla C-13 muestra que RANK-L18hum6 presenta una potencia y afinidad de unión similares a RANK-L18 de tipo natural. RANK-L18hum7 es ligeramente menos potente y muestra una afinidad de unión a RANK-L ligeramente reducida.
Ejemplo 9: Análisis de RANK-L13hum5 D62E mutante
El análisis de la secuencia primaria de RANK-L13hum5 identificó D62 como sitio potencial para isomerización y así como fuente potencial de inestabilidad química de la molécula. Para someter a prueba esta posibilidad, se realizó un ensayo de estabilidad con la molécula de RANK-L13hum5 y un mutante en el que el sitio potencial para isomerización sitio se reemplaza por un residuo de ácido glutámico (E), RANK-L13hum5_D62E (SEQ ID NO: 756).
Se introdujo la mutación D62E en RANK-L13hum5 mediante de PCR de solapamiento usando cebadores que incluyen la mutación: RevRANK-L13hum5D62 (CCTCCCTTTGACGGATTCCGCGTAATACGT; SEQ ID NO: 797) y FwRANK-L13hum5D62E (ACGTATTACGCGGATTCCGTCAAAGGGAGG; SEQ ID NO: 798). Se clonaron ambos ADNc que codifican RANK-L13hum5 o RANK-L13hum5_D62E como fragmentos SfiI /BstEII en un vector de expresión derivado de pUC119 que contenía el promotor LacZ, un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina, un sitio de clonación múltiple y la secuencia líder gen3. En marco con la secuencia codificante del Nanobody, el vector codificaba dos codones de terminación en el extremo 3’ del Nanobody.
Para la producción, se inocularon los constructos RANK-L13hum5 y RANK-L13hum5_D62E en 50 ml de TB/glucosa al 0,1 %/kanamicina y se incubó la suspensión durante la noche a 37 °C. Se inoculó 5 × 400 ml de medio con 1/100 del precultivo durante la noche obtenido. Se incubaron los cultivos adicionalmente a 37 °C, 250 rpm hasta DO600 >5. Se indujeron los cultivos con IPTG 1 mM y se mantuvieron incubando adicionalmente durante 4 horas a 37 °C, 250 rpm. Se centrifugaron los cultivos durante 20 minutos a 4500 rpm y después de eso se desechó el sobrenadante. Se almacenaron los sedimentos a -20 °C.
Para la purificación, se descongelaron los sedimentos y se resuspendieron en 20 ml de d-PBS y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Luego, se centrifugaron las suspensiones a 8500 rpm durante 20 minutos para aclarar el residuo célula del extracto periplásmico. Se purificaron los Nanobodies mediante columna de intercambio catiónico (Source 30S, tampón de lavado: ácido cítrico 10 mM pH 4,0; tampón de elución ácido cítrico 10 mM/NaCl 1 M pH 4,0) seguido por cromatografía de exclusión molecular (columna Superdex 75 Hiload 16/60; en d-PBS). Se midió la DO 280 nm y se calculó la concentración. Se almacenaron muestras a -20 °C.
Se analizaron RANK-L13hum5 y RANK-L13hum5_D62E para determinar su capacidad de unión y actividad de neutralización en AlphaScreen tal como se describe en el ejemplo 2. La humanización de RANK13 y la mutación D62E en RANK-L13hum5 no interfirieron en la potencia del Nanobody. RANK-L13, RANK-L13hum5 y RANKL13hum5_D62E presentaron potencias similares tal como se miden en el ensayo AlphaScreen (figura 7).
Ejemplo 10: Determinación de la magnitud de las longitudes de ligador en moléculas bivalentes para potencias óptimas
RANK-L13
Se construyó una serie de moléculas bivalentes que contenían diferentes longitudes de ligador. RANK-L131 (RANK-L13-9GSRANK-L13; SEQ ID NO: 643) y RANK-L133 (RANK-L13-30GS-RANK-L13; SEQ ID NO: 766) contienen un ligador 9GS o a 30GS, respectivamente. Se sometieron a prueba ambas moléculas en el ensayo AlphaScreen y el ensayo FMAT y se compararon con RANK-L13 monovalente y RANK-L130 biespecífico trivalente. Se muestran los valores de CI50 calculados en la tabla C-14. Ambos ensayos indican que un ligador 9GS es suficiente para obtener una potencia similar a la determinada para RANK-L130.
RANK-L18
Se construyó una serie de moléculas bivalentes que contenían diferentes longitudes de ligador:
RANK-L181biv: RANK-L18-9GS-RANK-L18 (SEQ ID NO: 657) RANK-L182biv: RANK-L18-20GS-RANK-L18 (SEQ ID NO: 693) RANK-L183biv: RANK-L18-30GS-RANK-L18 (SEQ ID NO: 767) RANK-L18hum6 Bi_25: RANK-L18Hum6-25GS-RANK-L18Hum6 (SEQ ID NO: 768) RANK-L 18hum6 Bi_30: RANK-L18Hum6-30GS-RANK-L18Hum6 (SEQ ID NO: 769)
Todas las moléculas se sometieron a prueba en el ensayo AlphaScreen y el ensayo FMAT y se compararon con RANK-L18 monovalente y RANK-L180 biespecífico trivalente. Se muestran los valores de CI50 calculados en la tabla C-14. Ambos ensayos indican que se requiere un ligador 30GS para obtener una potencia similar a la determinada para RANK-L180.
RANK-L9
Se construyó una serie de moléculas bivalentes que contenían diferentes longitudes de ligador:
RANK-L91biv: RANK-L9-9GS-RANK-L9 (SEQ ID NO: 636) RANK-L92biv: RANK-L9-20GS-RANK-L9 (SEQ ID NO: 672) RANK-L93biv: RANK-L9-30GS-RANK-L9 (SEQ ID NO: 770) RANK-L94biv: RANK-L9-15GS-RANK-L9 (SEQ ID NO: 771)
Todas las moléculas se sometieron a prueba en el ensayo AlphaScreen y el ensayo FMAT y se compararon con RANK-L9 monovalente y RANK-L90 biespecífico trivalente (SEQ ID NO: 708) (tabla C-14). Ambos ensayos indican que un ligador 15GS es suficiente para inducir un cambio en la potencia comparable a RANK-L90.
Ejemplo 11: Construcción y producción de diferente formatos de los Nanobodies humanizados
Se construyeron Nanobodies anti-RANK-L bivalentes y trivalentes biespecíficos a partir de RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6. Se representa una visión general de los diferentes Nanobodies humanizados con cambio de formato con ID de Nanobody correspondientes en la tabla C-15.
11.1 Nanobodies biespecíficos trivalentes
Las moléculas biespecíficas trivalentes (RANK-L008a y RANK-L010a) tienen dos elementos estructurales correspondientes a Nanobodies anti-RANK-L humanizados con un tercer elemento estructural de Nanobody humanizado en la parte central correspondiente a un elemento estructural de Nanobody con albúmina sérica humana (ALB-12; SEQ ID NO: 791). Se fusionan los elementos estructurales individuales mediante un ligador de Gly/Ser (GGGGSGGGS; SEQ ID NO: 792).
Se expresó RANK-L008a en E.coli y se purificó del medio y extractos periplásmicos. Se capturó el Nanobody en MabSelect Xtra (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se produjo la elución con tampón-B (glicina 100 mM pH 2,5). Se neutralizaron fracciones con Tris 1,5 M pH 7,5 y se dializaron frente a PBS 1/10. Posteriormente se sometieron muestras a intercambio catiónico usando una columna Source 15 S (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).
Se clonó RANK-L010a en pPICZalphaA (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformó en Pichia pastoris. Se diluyeron las colonias en 250 ml de medio BCGM y se hicieron crecer a 30 °C. A DO600 de 20-25, se centrifugaron los cultivos y se resuspendió el sedimento en 80 ml de medio BMCM. Se indujo la expresión mediante adición de metanol al 100 %. Se capturó el Nanobody del medio mediante captura en MabSelect Xtra (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se neutralizaron las fracciones elución en tampón glicina 100 mM pH 2,5 con Tris 1,5 M pH 7,5 y se dializaron frente a PBS 1/10. Se purificaron adicionalmente muestras mediante intercambio catiónico (columna Source 30 S).
Finalmente, se produjo una etapa de dimensionamiento en la columna Superdex 75 26/60.
11.2 Nanobodies pegilados
5 Se construyeron RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6 bivalentes. Se expresaron los constructos en E.coli. Se llevaron a cabo la purificación y pegilación tal como sigue:
Se purificó el Nanobody bivalente mediante cromatografía de afinidad con proteína A (MabSelect Xtra™). Después de la elución, usando glicina 100 mM pH 2,5, se neutralizó inmediatamente la muestra recogida usando Tris 1,5 M 10 pH 7,5. Después de una etapa de intercambio catiónico (columna Source 15S), se concentró la fracción que contenía el Nanobody® mediante Vivaspin (5 kD), se añadió DTT a una concentración final de 10 mM y se incubó durante la noche. Después de retirarse el DTT libre mediante SEC, se añadió PEG (3-maleimidoproprionamida, 1,3bis(metoxi-poli(etilenglicol) modificado con 2-glicerol), MW promedio de 40 000; Nektar Therapeutics, San Carlos, CA) en un exceso molar de 5 y se incubó durante la noche. Se separó el Nanobody pegilado de Nanobody sin
15 pegilar/libre de PEG mediante intercambio catiónico en MacroCap SP (tampón: acetato de Na 25 mM pH 5 + Pluronic al 0,5 %). Se eluyeron las proteínas unidas con un gradiente lineal para el tampón (1x PBS + Pluronic al 0,5 %).
11.3 Fusiones de HSA
20 Las proteínas de fusión de HSA, RANK-L004h y RANK-L006h, corresponden a RANK-L13hum5-9GSRANK-L13hum5 y RANK-L18hum6-30GS-RANK-L18hum6 bivalentes, respectivamente, que se fusionan en el extremo Cterminal a HSA.
25 Para la generación de RANK-L004h, se amplificó RANK-L13hum5 mediante PCR usando los siguientes cebadores:
Secuencia
SEQ ID NO
807
808
809
810
Se digirieron amplicones posteriores usando enzimas de restricción apropiadas (fragmento N-terminal: Bbsl/Xhol y fragmento C-terminal: BbsI/Avr II) y se clonaron en un vector pPICZalphaA-HSA abierto con XhoI/AvrII. Este vector 30 contiene la secuencia codificante para albúmina sérica humana de longitud completa.
Para la generación de RANK-L006h, se amplificó RANK-L18hum6 mediante PCR usando los siguientes cebadores:
Secuencia
SEQ ID NO
811
812
813
814
35 Se digirieron los amplicones usando enzimas de restricción apropiadas (fragmento N-terminal: BamHI/XhoI y fragmento C-terminal: BamHI/Avr II) y se clonaron en un vector pPICZalphaA-HSA abierto con XhoI/AvrII. Ese vector contiene albúmina sérica humana de longitud completa.
Se transformaron los plásmidos en Pichia pastoris. Se diluyeron las colonias en 250 ml de medio BCGM y se
40 hicieron crecer a 30 °C. Se indujo la expresión mediante adición de metanol al 100 %. Se purificaron los Nanobodies del medio mediante captura de los Nanobodies en MabSelect Xtra (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y etapas de pulido adicionales usando Poros50HQ y Superdex200 XK26/60.
Ejemplo 12: Caracterización de los Nanobodies humanizados con cambio de formato en AlphaScreen y el ensayo FMAT.
12.1 Potencia de los formatos basados en RANK-L13hum5 en AlphaScreen y el ensayo FMAT
Se sometieron a prueba el Nanobody biespecífico trivalente RANK-L008a, el Nanobody pegilado RANK-L001p y proteína de fusión de HSA RANK-L004h en el ensayo AlphaScreen y el ensayo FMAT y se compararon con RANK-L13hum5 monovalente y RANK-L130 biespecífico trivalente de tipo natural. Se muestran los valores de CI50 calculados en la tabla C-16. En ambos ensayos RANK-L008a, RANK-L001p y RANK-L004h presentaron una potencia similar que es comparable a la de RANK-L130.
12.2 Potencia de los formatos basados en RANK-L18hum6 en AlphaScreen y el ensayo FMAT
Se sometieron a prueba el Nanobody biespecífico trivalente RANK-L010a y el Nanobody pegilado RANK-L003p en el ensayo AlphaScreen y el ensayo FMAT y se compararon con RANK-L18hum6 monovalente y RANK-L180 biespecífico trivalente de tipo natural. Se muestran los valores de CI50 calculados en la tabla C-16. En ambos ensayos RANK-L010a y RANK-L003p presentaron potencias que son comparables a la que de RANK-L180.
12.3 Efecto de albúmina sobre la cinética de unión de RANK-L13 con elemento estructural de Nanobody con albúmina sérica humana
Se realizó un experimento con RANK-L130NT de tipo natural (RANK-L13-ALB-1-RANK-L13) y RANK-L008a humanizado (RANK-L13hum5-ALB-12-RANK-L13hum5). En este experimento, se hizo pasar una disolución 100 nM sobre un chip con RANK-L inmovilizado. Tal como se muestra en la figura 8, los sensogramas en ausencia de albúmina son comparables para ambas moléculas (de tipo natural y humanizada) lo que sugiere que ambas moléculas interaccionan de modo similar con RANK-L inmovilizado. Posteriormente, se preparó una mezcla (100 nM del Nanobody con HSA 500 nM) y se hizo pasar sobre el chip. Como la señal era significativamente mayor para el complejo, se concluyó que ambas variantes de tipo natural y humanizada con elemento estructural de Nanobody con albúmina sérica humana son capaces de unirse a RANK-L y albúmina simultáneamente.
12.4 Mapeo de epítopos de RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6.
En el pasado, se generaron datos experimentales que respaldaban la declaración de que RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6 se unen a epítopos solapantes. Esta observación se confirmó en un experimento de Biacore. En estos experimentos de mapeo de epítopos, en primer lugar se saturó el chip de sensor de RANK-L con el primer Nanobody (concentración de 500 nM). Después de 120 segundos, se permitió la disociación o se inyectó una mezcla que contenía la misma concentración del primer Nanobody junto con 500 nM del Nanobody que iba a someterse a prueba, durante 120 segundos. En la figura 9, se muestran los sensogramas para RANK-L18hum6 y en la figura 10 los sensogramas para RANK-L13hum5. Únicamente se observó un ligero aumento de la señal tras la inyección de la mezcla después de saturación de la superficie en primer lugar con o bien RANK-L13hum5 o bien RANK-L18hum, indicando que RANK-L13hum5 y RANK-L18hum6 se unen a epítopos solapantes.
12.5 La inhibición de RANK-L indujo la diferenciación de células RAW264.7 por Nanobodies humanizados con cambio de formato
Se mantuvieron células RAW264.7 (ATCC) en DMEM que contenía FBS al 10 %. Se suspendieron las células en alfa-MEM sin rojo de fenol que contenía FBS al 10 %, piruvato de sodio al 0,1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % y se sembraron a 2000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió a los pocillos una serie de dilución de los Nanobodies humanizados con cambio de formato. Se indujo la diferenciación a células similares a osteoclastos añadiendo RANK-L 7,5 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Se midió la actividad fosfatasa resistente a tartrato total en el sobrenadante después de 4 días usando fosfato de para-nitrofenilo como sustrato (figura 11).
12.6 Inhibición de la interacción de RANK-L con RANK por Nanobodies humanizados con cambio de formato
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con Nanobody anti-Fc PMP02 y se bloquearon con tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS). Se preincubaron diferentes concentraciones de Nanobodies humanizados con cambio de formato con RANK-Fc 200 ng/ml y RANK-L 5 ng/ml después de que se transfirieron las mezclas a los pocillos recubiertos. Se detectó RANK-L unido durante 1 h a temperatura ambiente (TA) con una dilución 1/100 de anticuerpo policlonal purificado por afinidad biotinilado humano TRANCE/RANKL/TNFSF11 (R&D Systems, Mineápolis, MN) en PBS que contenía tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS) al 10 % seguido por una incubación durante 30 min con estreptavidina marcada con peroxidasa del rábano (1/5000 en PBS que contenía tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS) al 10 %). Se realizó la visualización con 3,3’,5,5’tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno después de que se detuviera la reacción de formación de color con HCl 1 N. Se determinó la absorbancia a 450 nm. Se muestra la inhibición de la interacción de RANK-L con RANK por los Nanobodies humanizados con cambio de formato en la figura 12.
12.7 Unión de RANK-L008a a albúmina sérica humana
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con albúmina sérica humana (HSA, 20 g/ml en PBS). Se aspiraron los pocillos y se bloquearon con tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS). Se incubaron los pocillos durante 1 h a TA con una serie de dilución de RANK-L008a. Posteriormente, se detectó RANK-L008a unido con un Nanobody bivalente acoplado a peroxidasa del rábano. Se realizó la visualización tal como se describió anteriormente (figura 13).
12.8 Unión bifuncional de RANK-L008a a HSA y RANK-L
Se aplicaron dos formatos de ELISA diferentes para medir una unión simultánea de RANK-L008a a HSA y RANK-L.
En un primer formato, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con Neutravidin (2 g/ml, PBS) y se bloquearon con tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS). Se incubaron los pocillos con RANK-L biotinilado (0,5 g/ml en PBS) después de que se aplicara una serie de dilución de RANK-L008a. Se detectó RANK-L008a unido con albúmina marcada con peroxidasa del rábano (Genetex, San Antonio, TX; 1/6000). Se realizó la visualización tal como se describió anteriormente (figura 14-A).
En un segundo formato, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con HSA (10 g/ml, PBS) y se bloquearon con tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS). Posteriormente, se aplicó una serie de dilución de RANK-L008a. Después de 1 h de incubación a TA, se detectó RANK-L008a unido con RANK-L biotinilado (5 ng/ml), seguido por una incubación con estreptavidina marcada con peroxidasa del rábano (1/2000). Se realizó la visualización tal como se describió anteriormente (figura 14-B).
Ejemplo 13: Farmacocinética de Nanobodies humanizados con cambio de formato en ratones Balb/c después de una única administración intravenosa o subcutánea
Se administró una dosis en bolo de 100 g de cada Nanobody a ratones Balb/c macho (de 8 a 12 semanas) (n = 3),
o bien por vía intravenosa en la cola o bien por vía subcutánea. En una serie de puntos de tiempo, se extrajeron muestras de sangre.
Se realizó la detección de los diferente Nanobodies tal como sigue:
Se recubrieron placas de microtitulación Maxisorb (Nunc, Wiesbaden, Alemania) durante 1 h a temperatura ambiente (TA) con 100 l de una disolución 5 g/ml de Neutravidin (Pierce, Rockford, IL) en tampón PBS. Después de recubrimiento, se aspiraron las placas durante 4 segundos y se bloquearon (300 l/pocillo) durante 30 min a TA con Superblock T20 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products, Rockford, IL). Se lavaron las placas tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Después de bloqueo, se capturó RANK-L humano biotinilado (0,25 g/ml, 100 l/pocillo) durante 1 h a TA (600 rpm). Se añadieron cantidades conocidas de las series de dilución de los patrones de Nanobody (preparados en PBS/caseína al 0,1 %) al suero de ratón de blanco combinado al 100 % (Harlan, Oxon, Reino Unido) y luego se diluyeron adicionalmente 1/10 con PBS que contenía caseína al 0,1 % (en placa Nunc no recubierta independiente), dando como resultado una matriz de muestras final que consistía en suero de ratón combinado al 10 %. Se trataron muestras de suero de mismo modo. Se incubaron todas las prediluciones durante 30 minutos a TA (600 rpm) en la placa no recubierta. Después de la etapa de captura, se lavaron las placas recubiertas tres veces (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %), y se transfirió una alícuota de cada dilución de muestra (100 l) a la placa recubierta y se permitió que se uniese durante 1 h a TA (600 rpm). Después de la incubación de muestra, se lavaron las placas tres veces (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) y se incubó durante 1 h a TA con 100 l de un anticuerpo policlonal de conejo interno anti-Nanobody (1 g/ml, en PBS/caseína al 0,1 %). Entonces se lavaron las placas tres veces (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) y se incubaron con 100 l de una dilución 1/2000 (en PBS con caseína al 0,1 %) de anticuerpo de cabra anti-conejo-HRP (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Después de incubación durante 30 minutos a TA (600 rpm), se lavaron las placas tres veces (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) y se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad con 100 l de es(HS)TMB (dilución 1/3 en tampón de HRP; SDT, Bruselas, Bélgica). Después de 10 minutos, se detuvo la reacción con 100 l de HCl (1 N). Después de 5 minutos, se midió la absorbancia de cada pocillo a 450 nm (espectrofotómetro Sunrise de Tecan; Männedorf, Suiza), y se corrigió la absorbancia de fondo a 620 nm. Se determinó la concentración en cada muestra de suero basándose en una curva patrón sigmoidea con pendiente variable.
Después de administración i.v., se sometió el perfil de concentración sérica-tiempo de cada ratón a un análisis farmacocinético bicompartimental usando el modelo número 7 preprogramado dentro del software profesional WinNonlin versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain Vista California, EE. UU.). Se muestran los parámetros calculados para los Nanobodies individuales en la tabla C-17.
Después de administración s.c., se sometió el perfil de concentración sérica-tiempo de cada ratón a un análisis farmacocinético unicompartimental (con absorción de primer orden) usando el modelo número 3 (sin tiempo de retado) o 4 (con tiempo de retardo) preprogramados dentro del software profesional WinNonlin versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain Vista California, EE. UU.). Se muestran los parámetros calculados para los Nanobodies individuales en la tabla C-18.
Ejemplo 14: Farmacocinética y farmacodinamia de Nanobodies humanizados con cambio de formato en macacos cangrejeros
Se asignaron macacos cangrejeros hembra a 17 grupos, consistiendo cada grupo en tres individuos con una edad de aproximadamente 24 meses.
Se dosificó a los animales tal como se describe en la tabla C-19. Se administraron los Nanobodies RANK-L008a, RANK-L001p y RANK-L003p a diferente dosis (3 mg/kg; 0,3 mg/kg; 0,03 mg/kg). El Nanobody ALB-8 sirvió como control negativo. Se incluyó ibandronato de molécula pequeña como control positivo. Se extrajeron muestras de suero para la determinación de los niveles de Nanobodies, análisis de anticuerpos y análisis del marcador de recambio de hueso N-telopéptido en suero (N-Tx en suero).
14.1 Farmacocinética
Se determinaron las concentraciones de RANK-L008a en plasma tal como sigue:
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C con 100 l de Neutravidin (2 g/ml, Pierce, Rockford, IL). Se aspiraron los pocillos y se bloquearon durante 30min a TA con 300 l de Super Block®T20 PBS (Pierce, Rockford, IL). Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se capturó RANK-L biotinilado (0,5 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, interno) incubando 100 l durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de esta etapa de incubación, se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,05 %. Se prepararon los patrones, QC y prediluciones de las muestras de prueba en una placa no recubierta (de polipropileno) en plasma de macaco cangrejero al 100 % y se incubaron durante 30 min a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se transfirió una dilución 1/10 de las muestras en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 % (la concentración final de plasma de macaco cangrejero es del 10 %) a la placa recubierta y se incubó durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de tres etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron las placas con el anticuerpo policlonal de conejo interno purificado anti-Nanobody (1 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, interno, n.º de lote 15/05/06) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron 100 l de anticuerpo de cabra policlonal anti-conejo marcado con peroxidasa del rábano (HRP) (1/5000 en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca; n.º de artículo P0448) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se realizó la visualización a cubierto de la luz durante 10 min con 100 l de 3,3’,5,5’tetrametilbencidina (esTMB, SDT, Bruselas, Bélgica). Este sustrato se diluyó 1/3 en tampón de sustrato. El tampón de sustrato es una composición del 60 % de Na2HPO2 (100 mM) y el 40 % de ácido cítrico (100 mM). Después de 10 min, se detuvo la reacción de formación de color con 100 l de HCl 1 N. Se determinó la absorbancia a 450 nm después de una agitación durante 10 s en el lector para ELISA Tecan, y se corrigió la absorbancia de fondo a 620 nm. Se determinó la concentración en cada muestra basándose en una curva patrón sigmoidea.
Se determinaron las concentraciones de RANK-L001p y RANK-L003p tal como sigue:
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc, Wiesbaden, Alemania; n.º de artículo 430341) durante la noche a 4 °C con 100 l de Neutravidin (2 g/ml, Pierce, Rockford, IL). Se aspiraron los pocillos y se bloquearon durante 30 min a TA con 300 l de SuperBlock®T20 PBS (Pierce, Rockford, IL). Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se capturó RANK-L biotinilado (0,5 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, interno) incubando 10 l durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de esta etapa de incubación, se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,05 %. Se prepararon los patrones, QC y prediluciones de las muestras de prueba en una placa no recubierta (de polipropileno) en plasma de macaco cangrejero al 100 % y se incubaron durante 30 min a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se transfirió una dilución 1/10 de las muestras en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 % + plasma de macaco cangrejero al 10 % (la concentración final de plasma de macaco cangrejero era del 10 %) a la placa recubierta y se incubó durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de tres etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron las placas con el anticuerpo policlonal de conejo interno purificado anti-Nanobody (1 g/ml en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, interno) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Después de 3 etapas de lavado con PBS-Tween 20 al 0,05 %, se incubaron 100 l de anticuerpo de cabra policlonal anti-conejo marcado con peroxidasa del rábano (HRP) (1/2000 en PBS-caseína al 0,1 %-Tween 20 al 0,05 %, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) durante 1 h a TA mientras se agitaba a 600 rpm. Se realizó la visualización a cubierto de la luz durante 10 min con 100 l de 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (esTMB sin diluir, SDT, Bruselas, Bélgica). Después de 10 min, se detuvo la reacción de formación de color con 100 l de HCl 1 N. Se determinó la absorbancia a 450 nm después de una agitación durante 10 s en el lector para ELISA Tecan, y se corrigió la absorbancia de fondo a 620 nm. Se determinó la concentración en cada muestra basándose en una curva patrón sigmoidea.
Se sometieron los perfiles de concentración plasmática-tiempo individuales de todos los monos a un análisis farmacocinético no compartimental (NCA) usando el software profesional WinNonlin versión 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain Vista California, EE. UU.). Se usó el modelo 200 o 201 preprogramados después de dosificación subcutánea y intravenosa, respectivamente. Se calcularon el AUC y parámetros PK derivados por medio de la regla trapezoidal lineal hacia arriba/logarítmica hacia abajo. Se presenta una visión general de los parámetros farmacocinéticos calculados en las tablas C-20 a C-23.
14.2 Farmacodinamia
Se evaluaron los cambios en la resorción de hueso inducida por los Nanobodies sometiendo a ensayo NTx en suero usando inmunoensayos según las instrucciones del fabricante (Osteomark®NTx serum, Wampole Laboratories).
Las figuras 15 y 16 representan las representaciones gráficas de concentración de NTx en suero-tiempo para los diferentes Nanobodies dosificados a diferentes cantidades o bien por vía intravenosa o bien por vía subcutánea.
Todos los perfiles de concentración plasmática-tiempo de cada Nanobody se ajustaron simultáneamente a la función farmacocinética que era necesaria mínimamente para proporcionar una caracterización razonable de los datos de concentración-tiempo. Únicamente se incluyeron en el análisis los perfiles de concentración plasmática-tiempo de los monos carentes de una inmunogenicidad significativa. Se halló que un modelo farmacocinético bicompartimental con aclaramiento tanto lineal como no lineal desde el compartimento central caracterizaba la farmacocinética dependiente del tiempo y la dosis. A su vez, se usaron estas funciones farmacocinéticas específicas de Nanobody como función de entrada para el modelo farmacodinámico para estimar la potencia in vivo (CI50) y la actividad intrínseca (Imáx) en recambio de NTx en suero.
Se describieron la actividad intrínseca (Imáx) y la potencia (CI50) de cada Nanobody en el recambio de NTx en suero usando un modelo de respuesta indirecta. Se parametrizó el modelo de respuesta indirecta con la semivida de NTx en suero (t1/2 = 0,693/kout) y una inhibición mediada por Nanobody (función de Hill) en la velocidad de producción de orden cero de NTx (Kin). Se supuso que los Nanobodies inhibían Kin por medio de una ecuación de Hill parametrizada con Imáx, CI50 y un factor de forma n. Para cada Nanobody, se estimó un único conjunto de parámetros PD, excepto para RANK-L003p en el que se permitió que variasen los parámetros de recambio (Kin, Kout) para cada dosis nivel.
Los parámetros farmacodinámicos obtenidos de todos los Nanobodies se presentan en la tabla C-24. Aunque los tres Nanobodies tenían una actividad intrínseca similar y mediaban en una inhibición casi completa de NTx en suero (Imáx ≈ 90), su potencia era significativamente diferente. Se halló que RANK-L008a era el inhibidor más potente de la síntesis de NTx en suero, seguido por RANK-L001p y RANK-L003p. RANK-L003p tenía una potencia diez veces menor que RANK-L008a. La semivida de NTx en suero promedio era de aproximadamente 1,6 h.
Ejemplo 15: Reactividad cruzada de RANK-L 130, RANK-L180, RANK-L008a, RANK-L001p y RANK-L003p con los miembros de la familia de TNF, TNF, ligando de CD40 (CD40L) y TRAIL
Se sometió a prueba la reactividad cruzada de los Nanobodies anti-RANK-L con los miembros de la familia de TNF, TNF, TRAIL o para RANK-L de ratón en un ELISA de competencia. Se recubrió RANK-L humano en placas de 96 pocillos tal como se describe en el ejemplo 2. Se preincubaron Nanobodies (100 pM) con cantidades variables de RANK-L humano, RANK-L de ratón, TNF o TRAIL (de 10 nM a 13,7 pM) antes de añadirse a las placas. La unión de los Nanobodies a las placas recubiertas con RANK-L solo se inhibió por RANK-L añadido de manera exógena y no se vio afectada por la adición de los demás ligandos (figura 17).
Ejemplo 15. La administración de Nanobodies anti-RANK-L previene la pérdida de hueso y mantiene la resistencia y calidad en macacos cangrejeros sometidos a ovariectomía
La osteoporosis se caracteriza por una baja masa ósea y el deterioro microarquitectónico del tejido óseo, con un consiguiente aumento de la fragilidad y susceptibilidad a fracturas. La reducción de estrógenos contribuye a la baja masa ósea característica de la osteoporosis posmenopáusica. Por tanto, se ha usado la reducción de estrógenos como modelo animal de pérdida de hueso para estudiar tratamientos contra la osteoporosis.
Un mes después de OVX o cirugía simulada, se tratan macacos cangrejeros (cynos) sometidos a ovariectomía (OVX) (de 9 a 16 años de edad) con vehículo o Nanobody anti-RANK-L durante 16 meses. Los controles simulados se tratan con vehículo. Se analizan los efectos sobre la resorción de hueso y sobre la densidad mineral ósea (DMO) tras la administración del Nanobody anti-RANK-L.
Después del sacrificio, se toman barridos DXA y pQCT ex vivo del fémur derecho intacto, cuerpos vertebrales L3-L4, y núcleos de hueso esponjoso de 5 mm vertebrales L5-L6. Se realizan pruebas destructivas mediante flexión en 3 puntos de la diáfisis del fémur y haces corticales humerales, cizallamiento del cuello del fémur y compresión de muestras vertebrales lumbares.
Se analizan los efectos del Nanobody anti-RANK-L sobre el recambio de hueso a nivel histológico, y sus relaciones con la resistencia del hueso tal como sigue: se inyectan marcadores de fluorocromos dobles antes de biopsias de cresta ilíaca y costilla (en el mes 6 y 12), y antes del sacrificio. Se realiza histomorfometría en estas biopsias, la
5 diáfisis tibial y hueso esponjoso en la vértebra L2 y el fémur proximal.
Ejemplo 16. Construcción y análisis de fusiones VHH-Fc
Se clonan Nanobodies dirigidos contra RANK-L en un vector adecuado para generar fusiones genéticas a la parte
10 FC con CH1 delecionada de IgG1 humana o de IgG2 humana. Las regiones bisagra que unen el Nanobody a Fc derivan o bien de IgG1 o bien de IgG2.
Se transfectan de constructos de plásmido en líneas celulares eucariotas y se secreta la fusión de Fc en el sobrenadante de cultivo. Se purifican los productos y se analizan en un gel con tinción de Coomassie. Se
15 representan secuencias representativas en la tabla B-6 (SEQ ID NO: 774-789). Se someten a prueba fusiones de Nanobody en el ensayo de unión de competencia FMAT, el ensayo de indicador de NF-KB y el ensayo de diferenciación de osteoclastos TRACP 5b.
Tablas
20 Tabla B-1: Nanobodies contra RANK-L preferidos (inhibidores de la interacción RANK/RANK-L)
Tabla B-2: Nanobodies contra RANK-L preferidos (no inhibidores de la interacción RANK/RANK-L)
Tabla B-3: Nanobodies bivalentes contra RANK-L
Tabla B-4: Nanobodies biespecíficos trivalentes contra RANK-L
Ligador
Secuencia SEQ ID NO
Ligador 9GS
GGGGSGGGS 792
Ligador 15GS
ggggsggggsggggs 793
Ligador 20GS
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 794
Ligador 25GS
ggggsggggsggggsggggsggggs 795
Ligador 30GS
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 796

Tabla C-1: Secuencias de Nanobody anti-RANK-L obtenidas tal como se describe en el ejemplo 1. Las secuencias de Nanobody se agrupan por familia. Se indican las secuencias únicas.
Tabla C-3: valores de CI50 obtenidos con los Nanobodies anti-RANK-L en el ensayo AlphaScreen
10 Tabla C-4: Unión dependiente de la dosis de Nanobodies a RANK-L unido a membrana humano y cyno (fluorescencia media de PE)
Nanobody (pM)
RANK-L humano RANK-L de macaco cangrejero
RANK-L6
RANK-L9 RANK-L13 RANK-L15 RANK-L18 irrelevante RANK-L13 RANK-L15 RANK-L18 irrelevante
2000
12752 4865 13918 7724 7633 87 12442 10956 12032 149
400
4579 3365 5225 2641 2327 90 4107 3410 3488 140
80
1697 2279 1534 715 649 82
16
434 1350 499 250 218 77
3,2
347 381 220 124 105 84

Tabla C-5: Comparación de Nanobodies anti-RANK-L monovalentes y biespecíficos trivalentes en AlphaScreen
Grupo
ID de animal Dosis y vía de administración Única / repetida
RANK-L130 RANK-L131 RANK-L180 ALB1
1m 2h 3m 4h 5m 6h 7m 8h 10 mg/kg (bolo i.v.) 10 mg/kg (bolo i.v.) 15 mg/kg (infusión 8 h) 15 mg/kg (infusión 8 h) 10 mg/kg (bolo i.v.) 10 mg/kg (bolo i.v.) 10 mg/kg (bolo i.v.) 10 mg/kg (bolo i.v.) Única Única Única Única Única Única Única Única
Ibandronato
9m 0,15 mg/kg (bolo i.v.) Repetida (mensual)
10h
0,15 mg/kg (bolo i.v.) Repetida (mensual)

Tabla C-11: Valores obtenidos para los parámetros farmacocinéticos en el estudio con macacos cangrejeros tal como se describe en el ejemplo 7.
Parámetro1
cyno 1m cyno 2f cyno 5m cyno 6f
Vss_pred (ml/kg)
67,7 71,1 67,1 55,4
CL_pred (ml/día/kg)
7,71 7,91 5,86 5,08
MRTinf_pred (día)
8,79 8,98 11,5 10,9
t1/2 z1 (día)2
6,75 6,81 8,74 9,28
z1_inferior-z1_superior (día)
1-39 2-51 4-51 1-32
R2 t1/2 z1
0,992 0,998 0,993 0,982
t1/2 z2 (día)3
3,10 3,29 2,53 2,21
z2_inferior-z2_superior (día)
39-58 51-72 58-72 36-51
R2 t1/2 z2
0,994 0,985 0,991 0,984
AUC0-39días
1287 - 1693 -
AUC0-51días
- 1260 - 1909
AUCúltimo (g·día/ml)
1297 1264 1707 1970
% de AUCextrap_pred
0,0117 0,0033 0,0046 0,0112
AUCinf_pred (g·día/ml)
1297 1264 1708 1970
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,130 0,126 0,171 0,197
1Todos los parámetros se calcularon con modelado no compartimental. 2Semivida calculada en fase beta aparente. 3Semivida calculada en fase gamma aparente.
10 Tabla C-12: Valores obtenidos para los parámetros farmacocinéticos en el estudio con macacos cangrejeros tal como se describe en el ejemplo 7.
Parámetro1
cyno 3m cyno 4f
Vss_pred (ml/kg)
488 775
CL_pred (ml/día/kg)
2433 3355
MRTinf_pred (día)
0,200 0,231
t1/2 z (día)
0,787 0,843
z1_inferior-z1_superior (día)
1,0-4,0 1,0-4,0
R2 t1/2 z
0,970 0,918
AUCúltimo (g·día/ml)
6,14 4,45
% de AUCextrap_pred
0,380 0,493
AUCinf_pred (g·día/ml)
6,16 4,47
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,0004 0,0003
1Todos los parámetros se calcularon con modelado no compartimental. 15 Tabla C-13: Actividad de los Nanobodies RANK-L humanizados en AlphaScreen y Biacore 3000.
Tabla C-16: Actividad de los diferentes constructos de los Nanobodies humanizados en AlphaScreen y FMAT.
Parámetro
RANK-L008a RANK-L010a RANK-L001p RANK-L003p
Media
DE CV(%) Media DE CV(%) Media DE CV(%) Media DE CV(%)
C(0) (g/ml)
87,2 8,2 9 80,8 25,5 32 - - - 122 61 50
Vss (ml)
2,03 0,05 2 2,73 0,72 26 - - - 1,32 0,61 46
Vc (ml)
1,16 0,11 9 1,35 0,52 39 - - - 1,08 0,77 71
Vt (ml)
0,870 0,158 18 1,38 0,21 15 - - - 0,250 0,159 64
CL (ml/día)
1,15 0,08 7 1,36 0,40 29 - - - 0,629 0,263 42
CLd (ml/día)
2,06 0,18 9 5,12 0,95 19 - - - 1,09 0,41 38
t½ alfa (h)
3,55 0,35 10 2,06 0,48 23 - - - 2,99 2,41 81
t½ beta (día)
1,37 0,01 1 1,50 0,09 6 - - - 1,53 0,07 4
MRT (día)
1,77 0,08 4 2,02 0,10 5 - - - 2,08 0,09 4
AUCinf(g”día/ml)
87,4 6,2 7 77,1 19,1 25 - - - 176 60 34
AUCinf/D(día/ml)
0,874 0,062 7 0,771 0,191 25 - - - 1,76 0,60 34
10 Tabla C-18: Parámetros farmacocinéticos básicos de Nanobodies después de una única administración subcutánea (100 g/animal) en el ratón Balb/c macho.
Parámetro
RANK-L008a RANK-L010a RANK-L001p RANK-L003p
Media
DE CV(%) Media DE CV(%) Media DE CV(%) Media DE CV(%)
V/F(ml)
2,59 0,34 13 2,39 0,10 4 4,53 4,68 103 1,01 0,29 29
CL/F(ml/h)
1,41 0,19 13 1,12 0,01 1 1,93 2,03 105 0,447 0,109 24
tretardo(min)
- - - - 81,9 68,5 83 - -
t½absorción(h)
20,4 6,8 33 13,6 0,4 3 7,8 1,5 19 12,2 2,8 23
t½eliminación(día)
1,27 0,04 3 1,49 0,06 4 1,65 0,04 2 1,55 0,08 5
tmáx(día)
1,47 0,24 16 1,27 0,04 3 1,00 0,09 9 1,21 0,14 12
Cmáx(mg/ml)
17,5 1,5 9 23,1 0,7 3 27,1 18,0 66 60,6 14,3 24
AUCinf(g•h/ml)
72,0 9,4 13 89,7 0,9 1 95,8 62,8 66 233 59 25
AUCinf/D(h/ml)
0,720 0,094 13 0,897 0,009 1 0,958 0,628 66 2,33 0,59 25
F(%)
82,4 102 - 110133

Tabla C-19: Dosis, vía y frecuencia de administración usadas en el modelo animal tal como se describe en el 15 ejemplo 14.
Grupo
Articulo de prueba Nivel de dosis Vía/ frecuencia de admin. Número de animales
1
RANK-L008a 3,0 i.v./una vez 1-3
2
RANK-L008a 0,3 i.v./una vez 4-6
3
RANK-L008a 0,03 i.v./una vez 7-9
4
RANK-L008a 3,0 s.c./una vez 10-12
5
RANK-L001p 3,0 i.v./una vez 13-15
6
RANK-L001p 0,3 i.v./una vez 16-18
7
RANK-L001p 0,03 i.v./una vez 19-21
8
RANK-L001p 3,0 s.c./una vez 22-24
9
RANK-L003p 3,0 i.v./una vez 25-27
10
RANK-L003p 0,3 i.v./una vez 28-30
11
RANK-L003p 0,03 i.v./una vez 31-33
12
RANK-L003p 3,0 s.c./una vez 34-36
13
RANK-L130 10 i.v./una vez 37-39
14
RANK-L130 3,0 i.v./una vez 40-42
15
Ibandronato 0,15 i.v./cada mes 43-45
16
ALB8 16 i.v./una vez 46-48
17
PBS 3,0 i.v./una vez 49-51

Tabla C-20: Parámetros farmacocinéticos básicos de RANK-L008a después de una única administración en bolo intravenosa en el macaco cangrejero hembra tal como se describe en el ejemplo 14.
3 mg/kg
0,3 mg/kg 0,03 mg/kg
parámetro
Media DE Media DE Media DE
Vss_pred (ml/kg)
65,8 4,3 74,2 12,8 85,3 7,9
CL_pred (ml/día/kg)
8,33 1,71 14,0 0,6 50,8 11,0
MRTinf_pred (día)
8,07 1,37 5,29 0,68 1,72 0,31
t1/2 z1 (día)1
7,28 0,07 5,83 0,27 - -
z1_inferior (día)
- - - - - -
z1_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z1
- - - - - -
t1/2 z2 (día)2
1,65 1,42 1,28 0,58 1,18 0,20
z2_inferior (día)
- - - - - -
z2_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z2
- - - - - -
AUCúltimo (g·día/ml)
370 74 19,5 3,0 0,546 0,186
% de AUCextrap_pred
0,0510 0,0584 2,10 3,26 11,7 14,2
AUCinf_pred (g·día/ml)
370 74 20,0 3,4 0,609 0,140
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,124 0,025 0,0716 0,0034 0,0203

Tabla C-21: Parámetros farmacocinéticos básicos de RANK-L0081p después de una única administración en bolo intravenosa en el macaco cangrejero hembra tal como se describe en el ejemplo 14
5 1Semivida calculada en fase beta aparente. 2Semivida calculada en fase gamma aparente.
3 mg/kg
0,3 mg/kg 0,03 mg/kg
parámetro
Media DE Media DE Media DE
Vss_pred (ml/kg)
60,4 4,6 73,3 4,3 67,5 0,9
CL_pred (ml/día/kg)
8,69 0,82 15,0 1,5 41,3 4,5
MRTinf_pred (día)
6,95 0,13 4,90 0,51 1,64 0,18
t1/2 z1 (día)1
5,14 0,15 4,11 0,44 - -
z1_inferior (día)
- - - - - -
z1_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z1
- - - - - -
t1/2 z2 (día)2
1,28 0,63 1,95 0,39 1,11 0,09
z2_inferior (día)
- - - - - -
z2_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z2
- - - - - -
AUCúltimo (g·día/ml)
346 31 19,7 2,0 0,670 0,095
% de AUCextrap_pred
0,0191 0,0072 1,65 1,18 3,95 1,97
AUCinf_pred (g·día/ml)
346 31 20,0 1,9 0,697 0,092
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,115 0,010 0,0669 0,0065 0,0244 0,0026

Tabla C-22: Parámetros farmacocinéticos básicos de RANK-L003p después de una única administración en bolo 15 intravenosa en el macaco cangrejero hembra tal como se describe en el ejemplo 14.
1Semivida calculada en fase beta aparente. 2Semivida calculada en fase gamma aparente.
3 mg/kg
0,3 mg/kg 0,03 mg/kg
parámetro
Media DE Media DE Media DE
Vss_pred (ml/kg)
33,1 1,8 31,1 3,9 32,5 5,9
CL_pred (ml/día/kg)
4,49 0,04 5,93 0,60 14,9 2,9
MRTinf_pred (día)
7,38 0,34 5,25 0,50 2,21 0,37
t1/2 z1 (día)1
5,75 1,10 4,57 0,24 - -
z1_inferior (día)
- - - - - -
z1_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z1
- - - - - -
t1/2 z2 (día)2
1,39 0,12 2,06 0,37 1,52 0,24
z2_inferior (día)
- - - - - -
z2_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z2
- - - - - -
AUCúltimo (g·día/ml)
647 32 50,2 4,9 1,88 0,42
% de AUCextrap_pred
3,21 5,50 1,37 0,19 9,19 2,03
AUCinf_pred (g·día/ml)
669 5 50,9 4,9 2,06 0,42
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,223 0,002 0,170 0,016 0,0688 0,0140
1Semivida calculada en fase beta aparente. 2Semivida calculada en fase gamma aparente.
Tabla C-23: Parámetros farmacocinéticos básicos de Nanobodies después de administración subcutánea en los macacos cangrejeros hembra tal como se describe en el ejemplo 14.
3 mg/kg
0,3 mg/kg 0,03 mg/kg
parámetro
Media DE Media DE Media DE
Vss/F (ml/kg)1
33,1 1,8 31,1 3,9 32,5 5,9
CL/F (ml/día/kg)
4,49 0,04 5,93 0,60 14,9 2,9
MRTinf_pred (día)1
7,38 0,34 5,25 0,50 2,21 0,37
t1/2 z1 (día)2
5,75 1,10 4,57 0,24 - -
z1_inferior (día)
- - - - - -
z1_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z1
- - - - - -
t1/2 z2 (día)3
1,39 0,12 2,06 0,37 1,52 0,24
z2_inferior (día)
- - - - - -
z2_superior (día)
- - - - - -
R2 t1/2 z2
- - - - - -
AUCúltimo (mg·día/ml)
647 32 50,2 4,9 1,88 0,42
% de AUCextrap_pred
3,21 5,50 1,37 0,19 9,19 2,03
AUCinf_pred (mg·día/ml)
669 5 50,9 4,9 2,06 0,42
tmáx (día)
Cmáx (g/ml)
AUCinf_pred/D (kg·día/ml)
0,223 0,002 0,170 0,016 0,0688 0,0140
F (%)

Tabla 24: Parámetros farmacodinámicos ( DE) de RANK008a, RANK-L001p y RANK-L003p en el macaco cangrejero hembra tal como se describe en el ejemplo 14.
1MRT calculado como AUMC/AUC y, por tanto, no corregido para MAT. Vss/F=MRT•CL 2Semivida calculada en fase b aparente. 3Semivida calculada en fase g aparente. 4 Estimación de F en el nivel de dosis 3 mg/kg dosis ignorando la inmunogenidad y no linealidad en CL
Parámetro
RANK-L008a RANK-L001p RANK-L003p
Kin (nM/día)
938  194 1201  235 2835  27581
Kout (1/día)
8,99  1,79 11,7  2,1 25,9  19,81
Imáx
0,878  0,024 0,882  0,017 0,892  0,038
CI50 (g/ml)
0,049  0,008 0,114  0,025 0,518  125
n
1,38  0,29 1,23  0,21 0,817  0,182
1 No pudieron estimarse los valores con suficiente precisión

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polipéptido o constructo multivalente que comprende o que consiste esencialmente en al menos dos secuencias de aminoácidos que están dirigidas contra y pueden unirse específicamente a RANK-L elegidas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 572 y SEQ ID NO: 750-756.
  2. 2.
    Polipéptido o constructo según la reivindicación 1, que es un polipéptido o constructo bivalente o un polipéptido o constructo trivalente.
  3. 3.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NO: 643, 679, 761, 766 y 772.
  4. 4.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una semivida aumentada, en comparación con el polipéptido o constructo multivalente correspondiente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en sí mismo, en el que el polipéptido se ha modificado químicamente por medio de pegilación.
  5. 5.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una semivida aumentada, en comparación con el polipéptido o constructo multivalente correspondiente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en sí mismo, y en el que uno o más de otros restos o unidades de unión proporcionan al polipéptido una semivida aumentada elegido del grupo que consiste en proteínas séricas, unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas, una parte Fc y pequeñas proteínas o péptidos que pueden unirse a proteínas séricas.
  6. 6.
    Polipéptido o constructo según la reivindicación 5, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporcionan al polipéptido o constructo una semivida aumentada se eligen del grupo que consiste en unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas.
  7. 7.
    Polipéptido o constructo según la reivindicación 5, en el que dicha una o más de otras unidades de unión que proporcionan al polipéptido o constructo una semivida aumentada son unidades de unión que pueden unirse a proteínas séricas elegidas del grupo que consiste en anticuerpos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, VHH o VHH humanizados que pueden unirse a albúmina sérica o a una inmunoglobulina sérica.
  8. 8.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NO: 715 y 759.
  9. 9.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 759.
  10. 10.
    Secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos, que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  11. 11.
    Secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según la reivindicación 10, que está en forma de un constructo genético.
  12. 12.
    Célula huésped o huésped no humano que expresa, o que en circunstancias adecuadas es capaz de expresar, un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y/o que comprende una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según la reivindicación 10, o un constructo genético según la reivindicación 11.
  13. 13.
    Composición que comprende al menos un polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según las reivindicaciones 10 a 11.
  14. 14.
    Composición según la reivindicación 13, que es una composición farmacéutica.
  15. 15.
    Composición según la reivindicación 14, que es una composición farmacéutica, que comprende además al menos un portador, diluyente o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y que comprende opcionalmente uno o más compuestos y/o polipéptidos farmacéuticamente activos adicionales.
  16. 16.
    Método para producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es tal que puede obtenerse mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos que codifica el mismo, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:
    -
    expresar, en una célula huésped o un organismo huésped no humano adecuado o en otro sistema de expresión adecuado, una secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos según la reivindicación 10, o un constructo genético según la reivindicación 11; o
    -
    cultivar y/o mantener una célula huésped o un huésped según la reivindicación 12 en condiciones que son tales que dicha célula huésped o dicho huésped expresa y/o produce al menos un polipéptido según 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
    opcionalmente seguido por:
    -
    aislar y/o purificar el polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 así obtenido. 10
  17. 17.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en tratamiento.
  18. 18.
    Polipéptido o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la prevención y/o el
    tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno óseo. 15
    130 131 132
    141 142 143
    145 146 147
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