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CN101796072B - 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽 - Google Patents

用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽 Download PDF

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CN101796072B CN200880100072.6A CN200880100072A CN101796072B CN 101796072 B CN101796072 B CN 101796072B CN 200880100072 A CN200880100072 A CN 200880100072A CN 101796072 B CN101796072 B CN 101796072B
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Abstract

本发明涉及针对RANK-L的氨基酸序列，以及包括一个或多个所述氨基酸序列或基本上由其组成的化合物或构建体、且特别是蛋白和多肽。本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸，用于制备所述氨基酸序列和多肽的方法；表达或能够表达所述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包括所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物、且特别是药物组合物；和所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是预防、治疗或诊断目的的应用。

Description

用于治疗骨疾病和病症的针对RANK-L的氨基酸序列以及包括其的多肽
本发明涉及针对(如本文所定义)核因子κB配体的受体激活剂(RANK-L，还称为肿瘤坏死因子相关的、激活-诱导的细胞因子(TRANCE)，破骨细胞分化因子(ODF)，护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPG-L)或肿瘤坏死因子超家族成员11(TNFSF11))的氨基酸序列，以及包括一个或多个所述氨基酸序列或基本上由其组成的化合物或构建体、且特别是蛋白和多肽(在本发明还分别称为“本发明的氨基酸序列”，“本发明的化合物”，和“本发明的多肽”)。
本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本发明还称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及制备所述氨基酸序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达所述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；涉及包括所述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物特别是药物组合物，并且涉及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用，特别是用于预防、治疗或诊断目的如本发明所提及的预防、治疗或诊断目的的应用。
本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述中变得清楚。
骨的重塑(更新)是这样的过程，即通过该过程不断地吸收(去除)和形成(替换)成人骨骼。骨的重塑包括通过成骨细胞合成骨基质和其通过破骨细胞的再吸收。破骨细胞，来源于造血细胞，是巨噬细胞组织的独特形式，其具有再吸收骨组织的能力。成骨细胞是具有分泌骨胶原蛋白能力的专门的成纤维细胞。在连接骨形成和骨再吸收过程的这些骨细胞活动之间存在精巧的协调作用。
骨重塑由RANK-L/RANK和RANK-L假受体OPG之间的平衡控制。RANK-L及其受体RANK是破骨细胞发育和活化所必需的。OPG，一种分泌的蛋白，是破骨细胞成熟和破骨细胞活化的有效抑制剂。在正常的骨体内平衡中，RANK-L和OPG参与紧密控制破骨细胞由单核细胞前体生成的细胞因子轴。RANK-L，其由成骨细胞和骨髓基质细胞表达，结合其功能受体RANK，以刺激由前体细胞分化破骨细胞和成熟的破骨细胞的增殖和活性。OPG，其由成骨细胞、基质细胞、树突细胞和巨核细胞表达，通过作用为RANK-L的可溶假受体而限制该过程。
TNF家族分子RANK-L由在人染色体13q14上的单一基因(rankl)编码。RANK-L mRNA在骨和骨髓中、以及在淋巴组织(淋巴结，胸腺(thumus)，脾，胎儿肝脏，和派伊尔小结(Peyer’s patches))中以最高水平表达(Anderson等，1997，Nature(自然)390：175-179；Wong等，1997，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：25190-25194；Lacey等，1998，Cell(细胞)93：165-176；Yasuda等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95：3597-3602)。RANK-L mRNA的可变剪接允许表达为316或270个氨基酸的II型跨膜糖蛋白或243个氨基酸的可溶配体(Kong等，1999，Nature(自然)397：315-323；Nagai等，2000，Biochem Biophys.Res.Commun.(生物化学和生物物理学研究通讯)269：532-536)。另外，RANK-L可以通过金属蛋白酶、包括TNF-α转化酶由其膜结合状态释放(Lum等，1999，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)274：13613-13618)。RANK-L的所有4种同种型缔合成能够促进破骨细胞生成的三聚体分子。
RANK(NFκB的受体激活剂，还称为TRANCE-R，ODAR，或TNFRSF11A)，其在前破骨细胞(preosteoclastic cell)上表达，是这些细胞上关于RANK-L的唯一受体(Li等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97：1566-1571)。RANK-L激活RANK之后是其与TNF受体-相关(TRAF)家族成员相互作用，激活核因子(NF)-κB和c-Fos，JNK，c-src，和丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB(Anderson等，1997，Nature(自然)390：175-179；Hsu等，1999，Proc.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)96：3540-3545)。
OPG(护骨蛋白；“骨保护剂”；还称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF))是一种由激活的成骨细胞产生并释放的可溶的、110-kDa、二硫键连接的、同源二聚体糖蛋白(Simonet等，1997，Cell(细胞)89：309-319)，具有与TNF受体家族的同源性，其作用为RANK-L的假受体，且与RANK竞争RANK-L的结合。因此，OPG是破骨细胞成熟和破骨细胞活化的有效抑制剂(Simonet等，1997，Cell(细胞)89：309-319；Lacey等，1998，Cell(细胞)93：165-176；Kong等，1999，Nature(自然)397：315-323)，由此减少骨的再吸收。
在Khosla，(2001 Endocrinology(内分泌学)142：5050-5055)，HolsteadJones等，(2002，Ann.Rheum.Dis.(年度风湿病)61(增刊II)：ii32-ii39)，Bezerra等，(2005，Brazilian J.Med.Biol.Res.(巴西医学生物学研究杂志)38：161-170)和McClung(2006，Current Osteoporosis Reports(当代骨质疏松症报告)4：28-33)中记述了OPG/RANK-L/RANK系统作为骨形成和破坏的调节剂的更详细的概述。
当在骨的重塑活动的再吸收和形成成分之间存在不平衡时(骨体内稳态的解离)，发生一些骨的病症。破骨细胞和成骨细胞活性之间的不平衡可以由广泛种类的激素改变或炎性和生长因子的混乱引起，诸如例如改变的OPG和RANK-L之间的平衡。当骨的再吸收大于骨的形成时，随着时间在骨中存在净损失。这可以最终导致低骨量(骨量减少)或骨质疏松。当骨形成超过再吸收时，在骨质中存在净增加(骨硬化症)。
由于较高的RANK-L、较低的OPG或二者引起的过量骨损失或破坏已经参与许多疾病状态，包括绝经后骨质疏松症(Eghbali-Fatourechi等，2003，Journal of Clinical Investigation(临床研究杂志)111：1221-1230；Tsangari等，2004，Bone(骨)35：334-342；Abdallah等，2005，CalcifiedTissue International(国际钙化组织)76：90-97)，原发性甲状旁腺功能亢进(Stilgren等，2004，Bone(骨)35：256-265；Johnell等，2005，Journal of Boneand Mineral Research(骨和矿物研究杂志)20：1185-1194)，骨的佩吉特病(Reddy 2004，Journal of Cellular Biochemistry(细胞生物化学杂志)93：688-696)，转移骨病(metastatic bone disease)(Brown 2004，CancerTreatment and Research(癌症治疗和研究)118：149-172)，骨髓瘤(Okada等，2003，Clinical and Experimental Metastasis(临床和实验性转移)20：639-646)，类风湿性关节炎(Crotti等，2002，Annals of the RheumaticDiseases(风湿病年报)61：1047-1054)和一些其他的代谢或炎性骨和关节病症(Locklin等，2001，Bone(骨)28(增刊)：S80；Lewiecki 2006，ExpertOpin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050)。
在十多年以来已经可以获得降低骨折危险的药学试剂。抗分解代谢药(anticatablolic drugs)(雌激素，双磷酸脂，降钙素和选择性雌激素受体调节剂)降低骨的再吸收，而同化激素类药，诸如重组的人甲状旁腺激素(PTH)，增加骨的形成和骨的尺寸。双磷酸脂种类的药物是最常用于治疗骨质疏松症的一种。尽管该药物种类通常是非常安全的，但是口服给药是复杂的，且已经在少量的临床实践患者中与胃肠不利事件相关。临床试验正评估增加静脉内双磷酸脂给药的时间间隔。
最近的发现，即OPG/RANK-L/RANK系统作为骨的疾病和病症如骨质疏松症发病机理中的关键调控因子，为治疗剂提供了特有的靶标。在实验室动物和在人类中，OPG的施用形式显著抑制破骨细胞活性，且提高骨强度(Bekker等，2001，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)16：348-360；Campagnuolo等，2002，Arthritis Rheum.(类风湿性关节炎)46：1926-1936；Bezerra等，2005，Brazilian J.Med.Biol.Res.(巴西医学生物学研究杂志)38：161-170；McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33)。在早期的人类研究中，针对RANK-L的完整人抗体(denosumab)减少骨的更新，且提高骨密度(Body等，2003，Cancer(癌症)97：887-892；Bekker等，2004，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)19：1059-1066；McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33；Lewiecki 2006，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050；McClung等，2006，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)354：821-831)。然而，这样的完整抗体面临完整大小抗体的缺点，如高的生产成本，低的稳定性，和它们的大尺寸，其例如干扰它们接近某些隐藏的表位。
纳米抗体比常规四链抗体更有效且更稳定，其导致：(1)更低的剂型，更低频率的给药导致更少的副作用；和(2)提高的稳定性，导致对施用途径的更宽泛的选择，除了静脉内途径之外，包括口服或皮下途径和缓慢释放制剂。
因为它们的小尺寸，纳米抗体具有穿过膜和穿透彼此不接近的生理区室、组织和器官、更大的多肽和蛋白质的能力。纳米抗体可以，例如，容易地穿透到骨基质中，使得它们适合用于治疗骨疾病和病症。
纳米抗体的小尺寸还使得它们理想的适合将它们加工成多价或多特异性的多肽。与可以仅结合RANK-L三聚体的一个亚基的完整抗体相反，二价或三价的多肽(分别基于两个或三个针对RANK-L的纳米抗体)，能够分别结合三聚体RANK-L分子的2或3个亚基，且可以因为它们更高的功效而是有利的。
本发明的氨基酸序列、多肽和组合物通常可以用来调节，且特别是抑制和/或防止RANK-L与RANK结合，且因此以调节，且特别是抑制或防止由RANK-L，RANK和/或OPG介导的信号传导，从而调节其中包括RANK-L和/或RANK的生物学途径，和/或从而调节与所述信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。与在相同条件下，但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下的RANK-L与RANK的结合和/或由RANK-L、RANK和/或OPG介导的信号传导相比较，RANK-L与RANK的结合和/或由RANK-L、RANK和/或OPG介导的信号传导可以被抑制和/或防止至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
在本发明的另一方面中，本发明的氨基酸序列、多肽和组合物可以用来调节，且特别是抑制和/或防止RANK-L与OPG结合，且因此以调节(抑制和/或防止或加强)由RANK-L，RANK和/或OPG介导的信号传导，从而调节其中包括RANK-L，RANK和/或OPG的生物学途径，和/或从而调节与所述信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。本发明的氨基酸序列、多肽和组合物可以是RANK-L和/或所述信号传导的激动剂或拮抗剂。它们可以以与OPG相同的方式抑制RANK/RANK-L介导的信号传导，或者它们可以完全或部分地防止OPG抑制RANK/RANK-L介导的信号传导。与在相同条件下，但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下，RANK-L与OPG的结合和/或由RANK-L、RANK和/或OPG介导的信号传导相比较，RANK-L与OPG的结合和/或由RANK-L、RANK和/或OPG介导的信号传导可以被抑制和/或防止至少1％，优选地至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
在本发明的另一个方面中，本发明的氨基酸序列、多肽和组合物可以用来调节(抑制和/或防止或加强)破骨细胞的分化和/或增殖。与在相同条件下，但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下的破骨细胞的分化和/或增殖相比较，破骨细胞的分化和/或增殖可以分别增加或减少至少1％，优选地至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
在本发明的另一个方面中，本发明的氨基酸序列、多肽和组合物可以用来调节骨重塑。与在相同条件下，但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下的骨重塑相比较，骨重塑可以被调节至少1％，优选地至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
因此，本发明的多肽和组合物可以用于预防和治疗(如本文定义那样)骨疾病和病症。通常，“骨疾病和病症”可以定义为这样的疾病和病症，即其可以分别通过向需要其的受试者(即，患有所述疾病或病症或其至少一种症状和/或处于易患或发展所述疾病或病症的危险中)适当施用本发明的多肽或组合物(且特别地，其药物活性量的)和/或已知针对RANK-L或其中包括RANK-L的生物学途径或机制有活性的活性成分(principle)(且特别地，其药物活性量的)而得到预防和/或治疗。
骨疾病和病症包括与骨形成和再吸收的调节相关的疾病和病症。特征为净骨损失(骨再吸收超过骨形成)的骨疾病和病症也称为骨质减少病症，其包括骨质减少症、骨质疏松症和骨质溶解，且其特征在于过量的和/或不需要的由RANK-L介导的信号传导。调节且特别是抑制和/或防止RANK-L与RANK结合的本发明的多肽和组合物作用为拮抗剂，且通常用于预防和治疗(如本文定义那样)特征为净骨损失的骨疾病和病症。此外，调节且特别是抑制和/或防止RANK-L与OPG结合的本发明的多肽和组合物可以作用为拮抗剂，且通常用于预防和治疗(如本文定义那样)特征为净骨损失的骨疾病和病症。
特征为净骨量增加的骨疾病和病症称为骨硬化症，且特征在于极少的由RANK-L介导的信号传导。调节且特别是抑制和/或防止RANK-L与OPG结合的本发明的多肽和组合物可以作用为激动剂，且通常用于预防和治疗(如本文定义那样)特征为净骨量增加的骨疾病和病症。
基于本文的公开内容，所述骨疾病和病症的实例对于熟练的技术人员将是清楚的，且例如，包括下述疾病和病症：骨质疏松症(McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33)，其包括但不限于，原发性骨质疏松症，内分泌性骨质疏松症(包括但不限于，甲状腺机能亢进，甲状旁腺功能亢进(Anandarajah和Schwarz 2006，J.CellBiochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)，Cushing′s综合征，和肢端肥大症)，遗传和先天形式的骨质疏松症(包括但不限于，成骨不全，高胱氨酸尿症，Menkes′综合征，Riley-Day综合征)，由于肢体固定导致的骨质疏松症，糖皮质激素-诱导的骨质疏松症(Locklin等，2001，Bone(骨)28(增刊)：S80；McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)和绝经后骨质疏松症(McClung 2006，Current OsteoporosisReports(现代骨质疏松症报告)4：28-33)；(青少年或家族性的)佩吉特氏病(Cundy等，2002，Hum.Mol.Genet.(人类分子遗传学)11：2119-2127；Whyte等，2002，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)17：26-29；Whyte等，2002，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)347：175-184；Johnson-Pais等，2003，J.Bone Miner Res.(骨骼矿物质研究杂志)18：376-380；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；骨髓炎，即，一种骨感染性损伤，其导致骨损失；高钙血症(Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)，其包括但不限于，由实体瘤(包括但不限于，乳腺、肺和肾)和恶性血液病(包括但不限于，多发性骨髓瘤(Sordillo和Pearse 2003，Cancer(癌症)97(3增刊)：802-812；Vanderkerken等，2003，Cancer Res.(癌症研究)63：287-289)，淋巴瘤和白血病)导致的高钙血症，特发性高钙血症，和与甲状腺机能亢进和肾功能病症相关的高钙血症；骨损失，包括但不限于，手术后的骨质减少症，由于类固醇施用诱导的骨质减少症，与小肠和大肠病症相关的骨质减少症，和与慢性肝和肾病相关的骨质减少症；骨坏死，即，骨细胞死亡，其包括但不限于，与外伤性损伤相关的骨坏死，与Gaucher′s病相关的骨坏死，与镰刀细胞贫血症相关的骨坏死，与系统狼疮红斑相关的骨坏死，与类风湿性关节炎相关的骨坏死，与牙周疾病相关的骨坏死，与溶骨性转移瘤相关的骨坏死，和与其它病况相关的骨坏死；与关节炎病症如银屑病关节炎，类风湿关节炎相关的骨损失，与类风湿性关节炎相关的软骨损失和关节磨损(Bezerra等，2005，Brazilian Journal of Medical and Biological Research(巴西医学和生物学研究杂志)38：161-170；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；关节炎(Bezerra等，2005，Brazilian Journal ofMedical and Biological Research(巴西医学和生物学研究杂志)38：161-170)，其包括炎性关节炎(McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33)，胶原蛋白-诱导的关节炎(Bezerra等，2005，Brazilian Journal of Medical and Biological Research(巴西医学和生物学研究杂志)38：161-170)；人工关节假体周围骨溶解(Periprosthetic osteolysis)(McClung 2006，Current Osteoporosis Reports(现代骨质疏松症报告)4：28-33；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；癌症相关的骨疾病(McClung 2006，Current OsteoporosisReports(现代骨质疏松症报告)4：28-33)；与芳香酶抑制剂治疗相关的骨损失(Lewiecki 2006，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050)；与雄激素耗尽治疗相关的骨损失(Lewiecki 2006，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050)；与骨转移病相关的骨损失；与免疫系统参与的疾病相关的骨损失，所述疾病如成年人和儿童白血病、癌症转移、自体免疫、和各种病毒感染(Holstead Jones等，2002，Ann.Rheum.Dis.(年度风湿病)61(增刊II)：ii32-ii39)骨质减少病症，如成年人和儿童白血病(Oliveri等，1999，Henry Ford Hosp.Med.39：45-48)，慢性感染如丙型肝炎或HIV(Stellon等，1985，Gastroenterology(肠胃病学)89：1078-1083)，自体免疫病症如糖尿病(Piepkorn等，1997，Horm.Metab.Res.(激素代谢研究)29：584-91)，和红斑狼疮(Seitz等，1985，Ann.Rheum Dis.(年度风湿病)44：438-445)，过敏性疾病如哮喘(Ebeling等，1998，J.BoneMin.Res.(骨骼矿物质研究杂志)13：1283-1289)，多发性癌症如乳腺癌中的溶骨转移病(Coleman 1998，Curr.Opin.Oncol.(现代肿瘤学观点)10(增刊1)：7-13)；前列腺癌；骨髓瘤骨病(Anandarajah和Schwarz 2006，J.CellBiochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；牙周感染(Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；扩张性骨磷酸酯酶过多症(Expansile skeletal hyperphosphatasia)(Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)；骨转移(Lewiecki 2006，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050；Anandarajah和Schwarz 2006，J.Cell Biochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)。
本发明范围内还包括使用本发明的氨基酸序列、组合物和/或多肽预防和/或治疗与RANK-L/RANK/OPG途径的失衡相关的其它疾病和病症。所述疾病和病症包括但不限于骨质疏松症，炎性病况，自体免疫病况，哮喘，类风湿性关节炎，多发性硬化病，多发性骨髓瘤(Sordillo和Pearse 2003，Cancer(癌症)97(3增刊)：802-812；Vanderkerken等，2003，Cancer Res.(癌症研究)63：287-289)；血管疾病(Anandarajah和Schwarz 2006，J.CellBiochem.(细胞生物化学杂志)97：226-232)和心血管疾病(Lewiecki 2006，Expert Opin.Biol.Ther.(生物学治疗的专家观点)6：1041-1050)。
本发明范围内还包括使用本发明的氨基酸序列、化合物和/或多肽预防和/或治疗与骨硬化症如迟发性骨硬化症、先天性骨硬化症和大理石状骨病相关的疾病和病症。
特别地，本发明的多肽和组合物可以用来预防和治疗由包括RANK-L的途径介导的骨疾病和病症。基于本文公开的内容，所述骨疾病和病症的实例同样对于熟练的技术人员是清楚的。
因此，不限于此，本发明的氨基酸序列和多肽可以，例如，用来预防和/或治疗目前使用可以调节RANK-L-介导的信号传导的活性成分来预防或治疗的所有疾病和病症，诸如在上文引用的现有技术中提到的那些。还考虑了本发明的多肽可以用来预防和/或治疗这样的所有的疾病和病症，对于使用所述活性成分来治疗所述疾病和病症，目前正在研发中、已经提议了、或将在将来提议或研发。另外，因为它们如本文进一步所述的有利特性，考虑了本发明的多肽可以用来预防和治疗除使用或将提议或研发的这些已知的活性成分的那些之外的其他疾病和病症；和/或本发明的多肽可以提供用于治疗本文所述的疾病和病症的新方法和方案。
因此，不限于此，本发明的氨基酸序列和多肽可以，例如，用于预防和/或治疗目前正用denosumab预防或治疗的所有疾病和病症。
对于熟练的技术人员，通过本文进一步的公开内容，本发明的氨基酸序列和多肽的其他应用和用途将变得清楚。
通常，本发明的一个目的是提供药物活性试剂，以及包括其的组合物，其可以用于骨疾病和病症以及本文提及的其他疾病和病症的诊断、预防和/或治疗；且提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述试剂和组合物。
特别地，本发明的一个目的是提供与本领域中目前所用的和/或所知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点的这样的药物活性试剂、组合物和/或方法。这些优点将通过下文的进一步描述变得清楚。
更特别地，本发明的目的是提供可以用作药物活性试剂的治疗性蛋白，以及包括其的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗骨疾病和病症以及本文提及的其他的疾病和病症；和提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述治疗性蛋白和组合物。
因此，本发明的具体目的是提供针对(如本发明所定义)RANK-L、特别是针对来自温血动物的RANK-L、更特别是针对来自哺乳动物的RANK-L、并且尤其是针对人RANK-L的氨基酸序列；并且提供包括至少一种所述氨基酸序列或基本上由其组成的蛋白和多肽。
特别地，本发明的具体目的是提供适合在温血动物、并且特别是在哺乳动物、且更特别是在人类中用于预防、治疗和/或诊断应用的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
更特别地，本发明的具体目的是提供可以在温血动物、特别是在哺乳动物、且更特别是在人中用于预防、治疗、减轻和/或诊断一种或多种与RANK-L相关和/或由RANK-L介导的疾病、病症或病况(如本文所提及的疾病、病症和病况)的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
本发明还有一个具体目的是提供可以用于制备用于预防和/或治疗温血动物、特别是哺乳动物、且更特别是人类中的一种或多种与RANK-L相关的和/或由RANK-L介导的疾病、病症或病况(如本文所提及的疾病、病症和病况)的药物或兽医组合物的所述氨基酸序列和所述蛋白和/或多肽。
在本发明中，通常，这些目的通过利用本发明所述的氨基酸序列、蛋白、多肽和组合物实现。
一般地，本发明提供针对(如本发明所定义)和/或可以特异性结合(如本发明所定义)RANK-L的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基酸序列的化合物和构建体、且特别是蛋白和多肽。
更特别地，本发明提供可以以如本发明所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述)与RANK-L结合的氨基酸序列；以及包括至少一个所述氨基酸序列的化合物和构建体、且特别是蛋白和多肽。
特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选这样，以致它们：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与RANK-L结合。
优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽)优选是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与RANK-L结合。
对于本发明的氨基酸序列或多肽与RANK-L结合的一些优选的EC50和IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
对于与RANK-L结合，本发明的氨基酸序列通常将在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基、或氨基酸残基的一个或多个序列(即，每个“序列”包括彼此相邻或彼此紧邻的两个(或多个)氨基酸残基，即，在该氨基酸序列的一级或三级结构上)，通过其本发明的氨基酸序列可以与RANK-L结合，因此所述氨基酸残基或氨基酸残基序列形成结合RANK-L的“位点”(本发明还称为“抗原结合位点”)。
本发明提供的氨基酸序列优选地基本上采用分离形式(如本发明所定义)、或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义)，其可以包括一个或多个本发明的氨基酸序列或基本上由其组成，并且其可以任选地还包括一个或多个其它氨基酸序列(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，本发明的一个或多个氨基酸序列可以用作在这样的蛋白或多肽内的结合单位，所述蛋白或多肽可以任选地包含可以作为结合单位的一个或多个其它氨基酸序列(即，针对除RANK-L外的一个或多个其它靶标)，以便分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。这样的蛋白或多肽还可以采用基本上分离的形式(如本发明所定义)。
因此，本发明的氨基酸序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键与任一另一氨基酸序列或链连接(但是其可以或可以不包含一个或多个分子内二硫键。例如，已知纳米抗体----如本文所述----有时可以在CDR3和CDR1或FR2之间包含二硫键)的单一氨基酸链组成。然而，应该注意，一个或多个本发明的氨基酸序列可以彼此连接和/或与其他氨基酸序列连接(例如，通过二硫键)，以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如，Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”和其他多特异性构建体。例如，参考Holliger和Hudson，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36的综述)。
一般地，当本发明的氨基酸序列(或包括其的化合物、构建体或多肽)意欲施用给受试者时(例如，为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优选在所述受试者内不天然存在的氨基酸序列；或当它在所述受试者内不天然存在时，采用基本上分离的形式(如本文所定义)。
熟练的技术人员还应该清楚，对于药物应用，本发明的氨基酸序列(以及包括其的化合物、构建体和多肽)优选地针对人RANK-L；而对于兽医用目的，本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对来自待治疗的物种的RANK-L，或至少与来自待治疗的物种的RANK-L交叉反应。
此外，本发明的氨基酸序列可以任选地，并且除了所述至少一个针对RANK-L结合的结合位点之外，包含针对其它抗原、蛋白或靶标结合的一个或多个其它结合位点。
本发明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包括其的组合物的功效可以使用任何适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本质上已知的动物模型、或它们的任何组合进行检测，这取决于所涉及的具体的疾病或病症。适当的体外测定对于熟练的技术人员将是清楚的，并且例如，包括ELISA；FACS结合测定；Biacore；竞争性结合测定(PerkinElmer，Massachusetts，美国；FMAT)；TRAP测定(破骨细胞分化测定；Rissanen等，2005，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)20，增刊1：S256)；NF-κB报道基因测定(Mizukami等，2002，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)22：992-1000)。关于在例如ELISA或FACS中本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)与RANK-L结合的EC50值优选为1μM-1pM，更优选1nM-1pM，且更优选地100pM-1pM。关于在例如NF-κB测定或TRAP测定中本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)与RANK-L结合的IC50值优选为1μM-1pM，更优选1nM-1pM，且更优选100pM-1pM。
适当的动物模型对于熟练的技术人员将是清楚的，例如包括(SCID)/ARH-77小鼠模型(Sordillo和Pearse 2003，Cancer(癌症)97(3增刊)：802-812)；人MM的SCID-hu小鼠模型(Sordillo和Pearse 2003，Cancer(癌症)97(3增刊)：802-812；Tassone等，2005，Blood(血液)106：713-716)；在apoE基因启动子和相关的增强子的控制下过量表达OPG的转基因小鼠(Simonet等，1997，Cell(细胞)89：309-319)；肉瘤-诱导的骨破坏的小鼠模型(Honore等，2000，Nat.Med.(自然医学)6：521-528)；切除卵巢的动物模型，诸如例如，切除卵巢的猴(Jerome等，1995，Bone(骨骼)17：403S-408S)，切除卵巢的小鼠(Roggia等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)20：13960-13965)或切除卵巢的大鼠和食蟹猴(cynomolgus monkeys)(Simonet等，1997，Cell(细胞)89：309-319；-Andersen等，2004，Arthritis Res.Ther.(关节炎研究治疗)6：R169-R180)；关节炎的大鼠(动物)模型(Bendele等，1999，ToxicologicPathology(毒物学病理性)27：134-142；Romas等，2002，Am.J.Pathol.(美国病理性杂志)161：1419-1427；Mori等，2002，Histochemistry and CellBiology(组织化学和细胞生物学)117：283-292)，如胶原蛋白-诱导的关节炎模型或佐剂-诱导的关节炎模型；肿瘤-来源的PTHrP-诱导的高钙血症动物模型(Morony等，1999，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)14：1478-1485；Capparelli等，2000，Cancer Res.(癌症研究)60：783-778)；多发性骨髓瘤的鼠源模型(Vanderkerken等，2003，Cancer Res.(癌症研究)63：287-289)；小鼠中的炎性肠病模型(Byrne等，2005，Gut 54：78-86)；过量表达MIF的转基因小鼠(Onodera等，2006，J.Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)21：876-885)；过量表达可溶性破骨细胞分化因子(sODF)的转基因小鼠(Mizuno等，2002，20：337-44)；在CSF-1R启动子/第一内含子驱动的控制下表达CSF-1的转基因小鼠[转基因TgN(Csf1r-Csf1)Ers(TgRC)小鼠](Wei等，2006，J.Leukoc.Biol.(白细胞生物学杂志)80：1445-1453)；过量表达核心-结合因子α1(Cbfa1)的转基因小鼠(Geoffroy等，Mol.CellBiol.(分子细胞生物学)22：6222-6233)；过量表达假受体3(DcR3)的转基因小鼠(Tang等，2007，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)282：2346-2354)，以及在下述实验部分和在本文引用的现有技术中所用的测定法和动物模型。
此外，按照本发明，针对来自第一温血动物物种的RANK-L的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它温血动物物种的RANK-L的交叉反应性。例如，针对人RANK-L的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它灵长类物种(诸如，不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))的RANK-L的交叉反应性，和/或与来自通常用于疾病动物模型中的(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)、且特别是用于与RANK-L相关的疾病和病症的动物模型中(诸如本发明提及的物种和动物模型)的一种或多种动物物种的RANK-L的交叉反应性。在这一方面，对于熟练的技术人员应该清楚，从药物开发观点来看，所述交叉反应性，当存在时，可以具有优点，因为它允许在所述疾病模型中检测所述针对人RANK-L的氨基酸序列和多肽。
更一般地，与来自多个哺乳动物物种的RANK-L交叉反应的本发明的氨基酸序列和多肽将通常有利于用于兽医应用，原因在于它将允许在多种物种之间使用相同的氨基酸序列或多肽。因此，在本发明的范围内还包括针对来自一个动物物种的RANK-L的氨基酸序列和多肽(诸如针对人RANK-L的氨基酸序列和多肽)可以用于治疗另一个动物物种，只要所述氨基酸序列和/或多肽的应用在待治疗的物种中提供所需要的作用。
在一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽与来自食蟹猴的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽与来自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽与来自食蟹猴的RANK-L且与来自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽不与来自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽与来自食蟹猴的RANK-L交叉反应，而不与来自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽不与来自食蟹猴的RANK-L交叉反应。
在另一个实施方案中，针对人RANK-L的本发明的氨基酸序列和多肽不与来自食蟹猴的RANK-L交叉反应，且不与来自小鼠或大鼠的RANK-L交叉反应。
本发明在其最广泛意义上还不特别限于或限定在本发明的氨基酸序列和多肽所针对的RANK-L的特异性抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(confirmation)(在适用时)。例如，所述氨基酸序列和多肽可以或可以不针对“相互作用位点”(如本文定义)。然而，通常假定并且优选本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对相互作用位点(如本文定义)，且特别地针对RANK-L上关于RANK的结合位点或针对RANK-L上关于OPG的结合位点。
因此，在一个优选而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽针对RANK-L上的RANK受体结合位点，且如本文进一步所定义那样。本发明的氨基酸序列和多肽与RANK-L上的RANK受体结合位点的结合可以抑制和/或防止RANK-L与RANK结合，且因此抑制或防止由该RANK-L/RANK结合所介导的信号传导。本发明的氨基酸序列和多肽因此可以作用为RANK-L/RANK介导的信号传导的拮抗剂。
在一个具体而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽针对RANK-L上的RANK受体结合位点，而不干扰(减少/抑制)RANK-L/OPG相互作用。在该具体方面中，除了OPG介导的对破骨细胞成熟和活化的抑制之外，本发明的氨基酸序列和多肽将作用为RANK-L/RANK介导的信号传导的拮抗剂(并且抑制破骨细胞成熟和活化)。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽针对RANK-L上的OPG结合位点，且如本发明进一步所述。本发明的氨基酸序列和多肽与RANK-L上OPG结合位点的结合可以抑制和/或防止RANK-L与OPG的结合。因此，本发明的氨基酸序列和多肽可以作用为RANK-L与OPG结合的竞争性或非竞争性抑制剂(例如，在ELISA中，在测定中，在TRAP测定中和/或在NFκB测定中)。本发明的氨基酸序列和多肽与在RANK-L上的OPG结合位点的结合又可以抑制和/或防止RANK-L与RANK的结合，且因此抑制和/或防止由这种RANK-L/RANK结合介导的信号传导。因此，本发明的氨基酸序列和多肽可以作用为RANK-L和RANK-L/RANK介导的信号传导的拮抗剂(即，它们抑制RANK/RANK-L相互作用)。
然而，在一些情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以针对RANK-L上的OPG结合位点，且干扰RANK-L与OPG的结合，而基本上不减少RANK-L与RANK的结合。在该情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以加强由该RANK-L/RANK相互作用介导的信号传导，且作用为RANK-L和RANK-L/RANK介导的信号传导的激动剂(即，它们作用为OPG作用的拮抗剂)。
在本发明的另一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对RANK-L上与denosumab的表位重叠的表位。本发明的氨基酸序列和多肽与RANK-L上同denosumab的表位重叠的表位的结合可以抑制和/或防止denosumab与RANK-L的结合。因此，本发明的氨基酸序列和多肽可以作用为denosumab与RANK-L结合的竞争性或非竞争性抑制剂(例如，在ELISA中，在测定中，在TRAP测定中和/或在NFκB测定中)。
如本文进一步所述，本发明的多肽可以包含两个或多个本发明针对RANK-L的氨基酸序列。通常，所述多肽以与本发明的单一氨基酸序列相比增加的抗体亲抗源性(avidity)与RANK-L结合。所述多肽可以，例如，包括两个本发明的氨基酸序列，所述氨基酸序列针对RANK-L相同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用情形中)(其可以或可以不是相互作用位点)；或包括至少一个本发明的“第一”氨基酸序列，其针对RANK-L的第一个相同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用情形中)(其可以或可以不是相互作用位点)；和至少一个本发明的“第二”氨基酸序列，其针对与所述第一个不同的第二个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用情形中)(且其同样可以或可以不是相互作用位点)。优选地，在所述本发明的“二互补位(biparatopic)”多肽中，至少一个本发明的氨基酸序列针对相互作用位点(如本文定义)，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此。
因此，在一个特别的方面中，本发明的多肽可以包括两个或多个针对RANK-L上RANK结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个针对RANK-L上RANK结合位点的“第一”本发明的氨基酸序列；和至少一个“第二”本发明的氨基酸序列，其针对与所述第一不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，且其不是在RANK-L的RANK结合位点。
因此，在另一个特定方面中，本发明的多肽可以包括两个或多个针对RANK-L上OPG的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个针对RANK-L上OPG结合位点的“第一”本发明的氨基酸序列；和至少一个“第二”本发明的氨基酸序列，其针对与所述第一不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，且其不是在RANK-L的OPG结合位点。
此外，当靶标是结合对(例如，受体-配体结合对)的一部分时，所述氨基酸序列和多肽可以是这样的，以致它们与同源结合配偶体(例如，配体、受体或其他结合配偶体，在适用时)竞争与所述靶标结合，和/或是这样的，以致它们(完全或部分地)中和所述结合配偶体与所述靶标的结合。
以下也在本发明的范围内，即，在适用时，本发明的氨基酸序列可以结合两个或多个RANK-L的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。在这样的情形中，与本发明的氨基酸序列和/或多肽结合的RANK-L的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚基可以是基本上相同的(例如，如果RANK-L包含重复的结构基序或存在于多聚体形式中)或可以是不同的(且在后一种情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以可能是相同或不同的亲和力和/或特异性结合所述不同的RANK-L抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基)。在一个优选但非限制性方面中，本发明的氨基酸序列和多肽结合RANK-L三聚体的两个或三个亚基。此外，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合其中与相关配体结合的RANK-L构象，可以结合其中不与相关配体结合的RANK-L构象，或可以结合所述两种构象(同样以可能是相同或不同的亲和力和/或特异性)。例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合其中结合RANK的RANK-L构象，可以结合其中不结合RANK的RANK-L构象，或可以结合所述两种构象(同样以可能是相同或不同的亲和力和/或特异性)。例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合其中结合OPG的RANK-L构象，可以结合其中不结合OPG的RANK-L构象，或可以结合所述两种构象(同样以可能是相同或不同的亲和力和/或特异性)。
RANK-L以膜结合和可溶形式存在。本发明的氨基酸序列和多肽可以结合任一种形式，或者优选地，本发明的氨基酸序列和多肽可以结合这两种形式。RANK-L以4种不同的同种型存在(参见如前所述)。本发明的氨基酸序列和多肽可以结合RANK-L四种同种型中的任一种，或者可以结合多于一种，诸如两种、三种或全部四种RANK-L同种型。
还预测本发明的氨基酸序列和多肽通常将结合RANK-L的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合包含一个或多个抗原决定簇或表位的那些RANK-L的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，所述抗原决定簇或表位与本发明的氨基酸序列和多肽在RANK-L中(例如，在野生型RANK-L中)结合的抗原决定簇或表位基本相同。同样地，在这样的情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列结合(野生型)RANK-L的亲和力和特异性相同、或不同(例如，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。在本发明的范围内还包括本发明的氨基酸序列和多肽结合RANK-L的一些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，但不结合另一些。
本发明的氨基酸序列和多肽可以结合其它的、相关TNF家族成员(例如，TRAIL，TNF-α和/或CD40配体)。然而，在一个优选的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽对于相关的TNF家族成员不具有可检测的亲和力(即，比其针对RANK-L的亲和力低多于10倍、优选多于100倍、更优选多于1000倍的亲和力)。在一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽不具有针对TRAIL的可检测的亲和力。在另一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽不具有针对TNF-α的可检测的亲和力。在另一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽不具有针对CD40配体的可检测的亲和力。在另一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽不具有针对TRAIL、TNF-α和/或CD40配体的可检测的亲和力。
与所有已知的TNF细胞因子家族成员相似，RANK-L自我组装成非共价缔合的三聚体。当RANK-L以单体形式存在和以一个或多个多聚体形式存在时，以下在本发明的范围内，即，本发明的氨基酸序列和多肽仅结合单体形式的RANK-L，仅结合多聚体形式的RANK-L，或结合所述单体和多聚体两种形式。同样地，在所述情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列与多聚体形式结合的亲和力和特异性相同、或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合单体形式。
在本发明的一个非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽结合RANK-L，以致防止和/或抑制RANK-L三聚体的形成。
公认RANK-L结合沿着由同型三聚体的相邻单体形成的三个裂口(或沟)的每一个结合一个受体分子(RANK)。以这种方式，RANK-L三聚体表现出三种空间不同的、但是等价的、亚基之间的受体-结合沟，三种受体分子结合在所述沟内。因此，为了抑制RANK-L及其受体之间的相互作用，治疗分子应该优选靶向RANK-L的这些亚基之间的受体结合沟。纳米抗体(如本文进一步定义)可以表现出所谓的腔-结合特性(与常规VH结构域比较，特别是由于它们延长的CDR3环)，且因此理想地适于抑制RANK-L与其RANK受体的相互作用。因此，在一个优选的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽结合RANK-L的亚基之间的受体-结合沟。
此外，当RANK-L可以与其他蛋白或多肽缔合形成蛋白质复合物时(例如，具有多个亚基)时，以下在本发明的范围内，即，本发明的氨基酸序列和多肽结合非缔合状态的RANK-L，结合缔合状态的RANK-L，或结合两者。在所有这些情形中，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和多肽结合单体和非缔合状态的RANK-L的亲和力和/或特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合所述多聚体或缔合的蛋白质复合物。
通常，本发明的氨基酸序列和多肽至少结合这些形式的RANK-L(包括单体、多聚体和缔合形式)，其与生物学和/或治疗观点最相关，这对于熟练的技术人员是清楚的。
此外，通常，包含两个或多个针对RANK-L的氨基酸序列和/或纳米抗体的本发明的多肽可以以比相对应的单体氨基酸序列和/或纳米抗体更高的抗体亲抗源性进行结合。
例如，且不限于，包含针对不同RANK-L表位的两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体的多价(如本文定义)蛋白质或多肽可以以比相对应的单体更高的抗体亲抗源性与RANK-L结合。
更重要的是，包含针对RANK-L的两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体的多价(如本文定义)蛋白质或多肽可以(且通常将)以比与RANK-L单体更高的抗体亲抗源性结合RANK-L多聚体，且通常还将以比相对应的单体氨基酸序列和/或纳米抗体更高的抗体亲抗源性结合。在这样的多价蛋白质或多肽中，所述两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体可以，例如，针对相同的表位、实质上等价的表位、或不同的表位。在所述多价蛋白质或多肽的一个实施方案中，所述两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体可以是相同的(且因此针对相同的表位)。
后者是特别重要的，因为已知通过RANK-L的信号转导的主要模式包括RANK受体与RANK-L分子三聚体的结合，所述RANK-L分子三聚体包含三个受体结合位点(参见，例如，Lam等.2001，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)108：971-979)。
在本发明中，已经发现在体外模型和在细胞模型中氨基酸序列和/或纳米抗体能够以这样的方式与RANK-L结合以致减少RANK-L活性(参见下文实验部分)。尽管本发明不限于任何具体的机制、解释或假说，但是假定由于它们的小尺寸和针对RANK-L的高亲和力，本发明的两种或三种单价氨基酸序列和/或纳米抗体能够同时占据RANK-L三聚体上的两个或三个不同的受体结合位点，由此防止该三聚体起始受体结合且由此起始信号转导(然而，不排除其他作用机制：例如，依赖于其所针对的表位，本发明的氨基酸序列和/或纳米抗体也可以抑制RANK-L缔合成三聚体状态)。
还应该注意到，除了或者作为与单一RANK-L三聚体上的两个或多个受体结合位点结合的备选方案，本发明的蛋白或多肽，其包括两个或多个针对RANK-L表位的氨基酸序列和/或纳米抗体或由其组成，可以结合(例如，分子间地)在两个单独的RANK-L分子(例如，两个单独的三聚体)上的表位。
然而，按照一个特别优选的实施方案，本发明涉及这样的蛋白或多肽，其包括两个或多个分别针对RANK-L上(且特别是在RANK-L三聚体上)的表位的氨基酸序列和/或纳米抗体或基本上由其组成，所述RANK-L上的表位位于和/或形成RANK-L三聚体受体结合位点的一部分，以致所述多肽，在与RANK-L三聚体结合时，能够抑制或减少由所述RANK-L三聚体介导的RANK受体结合和/或由所述受体结合介导的信号转导。
特别地，按照该优选实施方案，本发明涉及这样的蛋白或多肽，其包括两个或多个分别针对RANK-L上(且特别是在RANK-L三聚体上)的表位的氨基酸序列和/或纳米抗体或基本上由其组成，所述RANK-L上的表位位于和/或形成RANK-L三聚体受体结合位点的一部分，其中所述氨基酸序列和/或纳米抗体以这样的方式彼此连接，以致所述蛋白或多肽能够同时与单一RANK-L三聚体上的两个或多个受体结合位点结合(换言之，能够分子内结合在RANK-L三聚体上的至少两个RANK-L受体结合位点)。在该实施方案中，所述两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体优选如上文定义，且最优选是纳米抗体(以致所述蛋白或多肽是多价纳米抗体构建体，如本文进一步所述)。此外，在该实施方案中，所述两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体可以是相同的或不同的；且可以针对RANK受体结合位点之内的不同表位，但是优选是针对相同的表位。本发明该实施方案的一些优选的但非限制性的构建体为SEQ ID NO’s：622-693，761-762和766-773。
在本发明的该实施方案中，所述两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体将通常通过一个或多个适当的接头连接，所述接头是这样的，以致每个氨基酸序列和/或纳米抗体可以结合在同一RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。适当的接头将特别依赖于与所述氨基酸序列和/或纳米抗体结合的在RANK-L三聚体上的表位(之间的距离)，且基于本文的公开内容，任选地在进行一些有限程度的常规实验之后，对于熟练的技术人员将是清楚的。例如，当两个或多个氨基酸序列是(单)结构域抗体或纳米抗体时，适当的接头可以选自本文所述的接头，但是具有这样的接头长度，其是这样的，以致所述两个或多个(单)结构域抗体或纳米抗体可以分别结合在同一RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。
此外，当结合RANK-L受体结合位点的所述两种或多种氨基酸序列是(单)结构域抗体或纳米抗体时，它们还可以通过第三(单)结构域抗体或纳米抗体彼此连接(其中所述两种或多种(单)结构域抗体或纳米抗体可以直接与第三(单)结构域抗体/纳米抗体连接或通过适当的接头连接)。所述第三(单)结构域抗体或纳米抗体可以例如是提供增加半衰期的(单)结构域抗体或纳米抗体，如本文进一步所述。例如，后一(单)结构域抗体或纳米抗体可以是能够与(人)血清蛋白如(人)血清白蛋白结合的(单)结构域抗体或纳米抗体，如本文进一步所述。所述构建体的一些非限制性的实例是SEQ ID NO’s：694-729和759-760的构建体。所述第三(单)结构域抗体或纳米抗体可以例如是针对和/或可以结合RANK-L上的另一个表位的(单)结构域抗体或纳米抗体，提供二互补位(单)结构域抗体或纳米抗体，如本文进一步所述。
备选地，与RANK-L上的受体结合位点结合的两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体可以连续连接(直接地或通过适当的接头)，且所述第三(单)结构域抗体或纳米抗体(可以提供其来增加半衰期或其可以结合在RANK-L上的另一个表位，如上文所述)可以直接或通过接头与这两种或多种前述氨基酸序列和/或纳米抗体中的一种连接。
更一般地，在所述两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体之间的距离应该是这样的，以致其允许所述蛋白或多肽进行与RANK-L三聚体的分子内结合(即，不是分子间结合)。两种抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间的距离可以通过任何适当的方式确定，诸如通过晶体学或分子建模(例如，如由Lam等.2001，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)108：971-979所述)。这些技术通常也使得确定具体的多价或多特异性蛋白或多肽是否能够提供分子内建模成为可能。备选地，尺寸排阻色谱法(如由Santora等，Anal.Biochem.，(生物化学年刊)299：119-129所述)可以用来确定本发明给定的蛋白或多肽是否将(主要)提供与RANK-L三聚体的分子内结合或(主要)在两个或多个RANK-L三聚体之间的分子间结合。因此，在本发明的一个特定实施方案中，本发明的蛋白或多肽优选是这样的，以致，在该实验中，它主要或基本上专一地导致分子内结合。然而，如上文强调，应该注意到，通过单独的RANK-L分子(例如，三聚体)的分子内结合运作的本发明的蛋白或多肽也在本发明的范围内。
因此，在另一个优选的方面中，本发明提供包括针对RANK-L(且特别是RANK-L三聚体)的至少两个氨基酸序列和/或纳米抗体的多价或多特异性蛋白或多肽，其中所述至少两种氨基酸序列和/或纳米抗体以这样的方式连接，以致在所述至少两个抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间的距离是这样的，以致所述蛋白或多肽能够进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。
在这样优选的蛋白或多肽中，所述两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体可以以任何适当的方式连接，只要可以获得在所述至少两种抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间的优选距离，和/或只要所述蛋白或多肽能够进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。
例如，在其最简单的形式中，所述至少两种氨基酸序列和/或纳米抗体直接通过适当的接头或间隔体连接，所述接头或间隔体提供所述至少两种抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间的优选距离，且其可以允许所述蛋白或多肽进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。适当的接头如本文所述，且可以----例如且不限于----包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列优选具有1-50或更多个氨基酸的长度，更优选5-30个氨基酸，如约9-20个氨基酸的长度。优选地，所述氨基酸序列还应该是这样的，以致其允许所述蛋白或多肽进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。
因此，在另一个优选的方面中，本发明提供包括针对RANK-L(且特别是RANK-L三聚体)的至少两种氨基酸序列和/或纳米抗体的多价或多特异性的蛋白或多肽，其中所述氨基酸序列和/或纳米抗体优选使用适当的接头或间隔体直接彼此连接，以致在所述至少两种抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间的距离是这样的，以致所述蛋白或多肽能够进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。
更优选地，在该优选的方面中，所述接头或间隔体是一种氨基酸序列，其优选具有1-50个或更多个氨基酸的长度，更优选5-30个氨基酸，诸如约9-20个氨基酸的长度。在一个优选的、但非限制性的实施方案中，所述接头基本由甘氨酸和丝氨酸残基组成(如下文进一步所述)。例如，一种适当的接头是本文所述的GS9接头，其包括9个氨基酸残基，本文所述的GS15接头，其包括15个氨基酸残基，本文所述的GS20接头，其包括20个氨基酸残基，和本文所述的GS30接头，其包括30个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，针对RANK-L的所述至少两种氨基酸序列和/或纳米抗体通过另一部分诸如另一种蛋白或多肽(任选地通过一个或多个接头)彼此连接。在该实施方案中，在所述至少两种抗-RANK-L氨基酸序列和/或纳米抗体的N-端和C-端之间具有优选距离(即，如上文提及)可能是理想的，例如以致所述蛋白或多肽仍然可以进行与RANK-L三聚体的分子内结合(如本文所述)。在该实施方案中，所述至少两种氨基酸序列和/或纳米抗体可以直接与所述另一部分连接，或使用适当的接头或间隔体连接，同样只要仍然可以获得优选的距离和/或需要的分子内结合。所述部分可以是任何适当的部分，其不降低(太多)所述蛋白或多肽与RANK-L的结合和/或所述蛋白或多肽进一步所述需要的生物学或药学特性。因此，所述部分可以是基本上无活性的，或可以是生物学活性的，且因此可以或可以不提高所述蛋白或多肽的理想特性和/或可以赋予所述蛋白或多肽一种或多种额外需要的特性。例如，且不限于，所述部分可以提高所述蛋白或多肽的半衰期，和/或可以减少其免疫原性或提高任何其他需要的特性。在一个优选的实施方案中，所述部分可以是另一种氨基酸序列和/或纳米抗体(包括但不限于针对RANK-L的第三氨基酸序列和/或纳米抗体，尽管这不是必需的且通常较不优选)，且特别是提高所述蛋白或多肽的半衰期的另一种氨基酸序列和/或纳米抗体，诸如针对血清蛋白、例如针对人血清白蛋白的氨基酸序列和/或纳米抗体。本文描述了所述蛋白和多肽的实例。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的多价多特异性的构建体，其包括分别针对RANK-L上(例如，RANK-L三聚体上)的表位的两个或多个氨基酸序列和/或纳米抗体，所述表位位于和/或形成受体结合位点的一部分，且其通过提供增加的半衰期的至少一个氨基酸序列和/或纳米抗体(且任选地，通过一个或多个适当的接头)彼此连接，以致所述多肽，在与RANK-L三聚体结合时，能够抑制或减少RANK受体结合和/或由所述RANK三聚体介导的信号转导。所述多肽可以是这样的，以致所述前文提及的两种或多种氨基酸序列和/或纳米抗体可以分别结合在RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。
特别地，在该实施方案中，所述多肽可以包括三价双特异性的纳米抗体，其包括两个分别针对RANK-L上(且特别是RANK-L三聚体上)的表位的纳米抗体，所述表位位于和/或形成受体结合位点的一部分，其中所述纳米抗体通过提供增加的半衰期的第三纳米抗体(例如，针对血清蛋白如人血清白蛋白的纳米抗体)彼此连接，其中每一个前文提及的两种纳米抗体可以直接与所述第三纳米抗体或通过一个或多个适当的接头连接，以致所述多肽，在与RANK-L三聚体结合时，能够抑制或减少RANK受体结合和/或由所述RANK-L三聚体介导的信号转导。所述多肽可以是这样的，以致所述前文提及的两种纳米抗体可以分别结合在RANK-L三聚体上的不同受体结合位点。同样地，用于本发明该实施方案中的一些特别优选的纳米抗体描述在SEQ ID NO’s：560-621中，以及其人源化的和其他变体(诸如例如SEQ ID NO’s：730-757和765)；和本文所述的针对人血清白蛋白的纳米抗体。本发明该实施方案的一个优选的、但非限制性的构建体是SEQ ID NO’s：694-729和759-760。
以下也在本发明的范围内：使用本发明氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一种或多种所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白或多肽，只要这些适于本文所述的应用。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常包含(至少部分)用于结合RANK-L的功能性抗原-结合位点；且更优选地能够与RANK-L特异性结合，且甚至更优选地能够以本文所述的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)与RANK-L结合。所述部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性实例将通过本发明的进一步描述变得清楚。还可以通过适当组合(即，通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本发明所述的部分或片段而提供本发明的其他片段或多肽。
在本发明的一个具体而非限制性方面中，其将在本发明中进一步描述，与它们衍生而来的氨基酸序列相比，所述类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物在血清中具有增加的半衰期(如本文进一步所述)。例如，可以将本发明的氨基酸序列连接到(化学或其他方式)一个或多个延长半衰期的基团或部分(诸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
在一个具体而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括免疫球蛋白折叠的氨基酸序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的氨基酸序列。其中特别参考Halaby等，J.(1999)蛋白质工程(Protein Eng.)12，563-71的综述。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的氨基酸序列能够特异性结合(如本发明所定义)RANK-L；并且更优选地能够以如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本发明进一步所述)结合RANK-L。此外，所述氨基酸序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样的，以致它们包括免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。
特别地，但不限于，本发明的氨基酸序列可以是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何适当的片段(那么其通常将包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进一步所述)。
本发明的氨基酸序列可以特别是免疫球蛋白序列或其适当的片段，并且更特别地是免疫球蛋白可变结构域序列或其适当的片段，诸如轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列)或其适当的片段。当本发明的氨基酸序列是重链可变结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列(诸如，不限于，来源于人抗体的VH序列)，或是来源于所谓的“重链抗体”(如本文所定义)的所谓的VHH-序列(如本文所定义)。
然而，应该注意到，本发明不限制本发明的氨基酸序列的来源(或用于表达其的本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经产生或获得)本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体而非限制性方面，所述氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(诸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特别是部分或完全人源化的VHH序列或纳米抗体)，“骆驼源化的(camelized)”(如本文所定义)免疫球蛋白序列，以及已经通过下列技术获得的免疫球蛋白序列：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，镶盖术(veneering)，组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及熟练的技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合。例如，参考标准手册，以及进一步描述和本文提及的现有技术。
类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成的或半合成的序列，并且例如，可以是通过PCR从适当的天然存在的模板(例如，从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列，已经从文库(并且特别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然存在的核苷酸序列中引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配PCR)而制备的核苷酸序列，已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已经利用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。
本发明的氨基酸序列可以特别是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文所定义，并且包括但不限于VHH序列)；其它单可变结构域，或它们中任一种的任何适当的片段。对于(单)结构域抗体的概括描述，参考上文引用的现有技术，以及参考EP 0 368 684。对于术语“dAb’s”，例如，参考Ward等(自然(Nature)1989年10月12日；341(6242)：544-6)，参考Holt等，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)，2003，21(11)：484-490；以及例如参考WO 06/030220，WO06/003388与Domantis(Domantis Ltd.)有限公司的其它公布的专利申请。还应该注意到，尽管由于它们不是哺乳动物来源的，在本发明的情形中较不优选，但是单结构域抗体或单可变结构域可以来源于某些鲨鱼(shark)物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。特别地，本发明的氨基酸序列可以是(如本文所定义)或其适当的片段。[注意： 为埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标]。所述针对RANK-L的纳米抗体在本文也称为“本发明的纳米抗体”。
对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所引用的现有技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术主要描述所谓“VH3种类”的纳米抗体(即，与VH3种类的人种系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的纳米抗体)，所述纳米抗体形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通常涵盖任何类型的针对RANK-L的纳米抗体，并且例如，还涵盖属于所谓的“VH4种类”的纳米抗体(即，与VH4种类的人种系序列如DP-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如，如在WO 07/118670中描述。
一般地，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一个或多个“标志残基(hallmark residues)”(如本文所述)。
因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义。
特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。
更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基；
并且其中：
ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：1-22中的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQ ID NO’s：1-22中表示为X)。
在这些纳米抗体中，所述CDR序列通常如本文进一步所定义。
因此，本发明还涉及这样的纳米抗体，其可以结合(如本文定义)和/或针对RANK-L，涉及其适当的片段，以及涉及包括一种或多种所述纳米抗体和/或适当的片段或基本上由其组成的多肽。
SEQ ID NO’s：560-621给出已经针对RANK-L获得的多种VHH序列的氨基酸序列。
特别地，本发明在一些具体的方面中提供：
-针对(如本文定义)RANK-L和与SEQ ID NO’s：560-621的至少一种氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、如90％或95％或更多的序列同一性的的氨基酸序列。这些氨基酸序列可以进一步是这样的，以致它们中和RANK或OPG与RANK-L的结合；和/或与RANK或OPG竞争与RANK-L结合；和/或针对RANK-L上的相互作用位点(如本文定义)(诸如RANK或OPG结合位点)；
-交叉阻断(如本文定义)SEQ ID NO’s：560-621的至少一种氨基酸序列与RANK-L的结合和/或与SEQ ID NO’s：560-621的至少一种氨基酸序列竞争与RANK-L结合的氨基酸序列。同样地，这些氨基酸序列可以进一步是这样的，以致它们中和同源配体与RANK-L的结合；和/或与所述同源配体竞争与RANK-L的结合；和/或针对RANK-L上的相互作用位点(如本文定义)(诸如RANK或OPG结合位点)；所述氨基酸序列可以如本文进一步所述(且可以例如是纳米抗体)；以及包括一种或多种所述氨基酸序列的本发明的多肽(其可以如本文进一步所述，且可以例如是双特异性和/或二互补位多肽，如本文所述)，和编码所述氨基酸序列和多肽的核酸序列。所述氨基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配体。
因此，本发明的一些特别优选的纳米抗体是可以结合(如本文进一步所定义)和/或针对RANK-L的纳米抗体，且其：
i)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。在这一方面，还参考表A-1，其列出了SEQ ID NO’s：560-621的纳米抗体的构架1序列(SEQ ID NO’s：126-187)，构架2序列(SEQ ID NO’s：250-311)，构架3序列(SEQ ID NO’s：374-435)和构架4序列(SEQ ID NO’s：498-559)(关于在所述构架1序列的位置1-4和27-30的氨基酸残基，还参考下文的评述。因此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略这些残基；
并且其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基。
在这些纳米抗体中，所述CDR序列通常如本文进一步所定义。
同样地，所述纳米抗体可以以任何适当的方式获得，并且来源于任何适当的来源，并且例如，可以是天然存在的VHH序列(即，来自于适当的骆驼(Camelid)物种)或合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)纳米抗体，“骆驼源化的”(如本文所定义)免疫球蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列)，以及已经通过下列技术获得的纳米抗体：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR移植，镶盖术，组合来源于不同的免疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及熟练的技术人员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组合，这如本文进一步描述。此外，当纳米抗体包括VHH序列时，所述纳米抗体可以适当地被人源化，如本文进一步所述，以便提供一个或多个本发明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。类似地，当纳米抗体包括合成的或半合成的序列(诸如部分人源化的序列)时，所述纳米抗体可以任选地进一步适当地被人源化，同样如本文所述，同样以便提供一个或多个其他本发明的(部分或完全)人源化的纳米抗体。
特别地，人源化的纳米抗体可以是如前述段落中关于纳米抗体概括定义的氨基酸序列，但是其中存在至少一个这样的氨基酸残基(并且特别地，在至少一个构架残基中)，所述氨基酸残基是和/或对应人源化的取代(如本文所定义)。基于本文公开的内容，对于熟练的技术人员，一些优选的、而非限制性的人源化取代(及其适当的组合)将变得清楚。另外，或者备选地，通过比较天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列，可以确定其它潜在有用的人源化取代，此后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以检测所得到的人源化的VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其它需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试验和误差程度，熟练的技术人员基于本文公开的内容可以确定其它适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，纳米抗体(的构架区)可以是部分人源化的或完全人源化的。
本发明一些特别优选的人源化的纳米抗体是SEQ ID NO’s：560-621的纳米抗体的人源化变体，其中SEQ ID NO’s：730-757和765的氨基酸序列是一些特别优选的实例。
因此，本发明一些其它优选的纳米抗体是这样的纳米抗体，其可以结合(如本文进一步所述)RANK-L，并且其：
i)是SEQ ID NO’s：560-621的氨基酸序列之一的人源化变体；和/或
ii)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列和/或SEQ ID NO’s：730-757和765的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
i)优选地，在依据Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自下表A-3中提及的标志残基。
按照本发明的另一个具体方面，本发明提供许多特别适合结合RANK-L的氨基酸残基的序列(streches)(即，小肽)。这些氨基酸残基的序列可以存在于，和/或可以结合在本发明的氨基酸序列中，特别以它们形成本发明的氨基酸序列的(部分)抗原结合位点这样的方式存在和/或结合。由于这些氨基酸残基序列最初作为针对RANK-L产生的重链抗体或VHH序列的CDR序列产生(或可以基于和/或来源于所述CDR序列，如本文进一步所述)，在本发明中它们还将通常被称为“CDR序列”(即，分别称为CDR1序列，CDR2序列和CDR3序列)。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上不限于这些氨基酸残基序列可能在本发明的氨基酸序列中具有的特有的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基序列允许本发明的氨基酸序列与RANK-L结合。因此，一般地，本发明在其最广泛意义上包括任何这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列能够与RANK-L结合，并且包括一个或多个本文所述的CDR序列，并且特别地两个或更多个所述CDR序列的适当组合，其通过一个或多个其它氨基酸序列彼此适当连接，以致整个氨基酸序列形成能够结合RANK-L的结合结构域和/或结合单位。然而，还应该注意到，在本发明的氨基酸序列中仅存在一个所述CDR序列可以本身已经足以提供能够结合RANK-L的本发明的氨基酸序列；例如，同样参考WO 03/050531中描述的所谓的“派遣片段(Expedite fragments)”。
因此，在另一个具体而非限制性的方面，本发明的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括选自由本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或它们的任何适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列。特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或它们的任何适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列。
一般地，在本发明的这一方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个氨基酸残基序列的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基序列具有与本文所述的至少一个CDR序列的序列相对应的氨基酸序列。这样的氨基酸序列可以或可以不包括免疫球蛋白折叠。例如，并且不限于，这样的氨基酸序列可以是适当的免疫球蛋白序列片段，所述片段包括至少一个所述CDR序列，但是其不够大，不足以形成(完整)的免疫球蛋白折叠(例如，同样参考WO 03/050531中所述的“派遣片段”)。备选地，这样的氨基酸序列可以是适当的“蛋白支架”，所述蛋白支架包括与这样的CDR序列相对应(即，作为其抗原结合位点的一部分)的至少一个氨基酸残基序列。用于呈递氨基酸序列的适当的支架对于熟练的技术人员将是清楚的，并且例如，包括，但不限于，基于或来源于免疫球蛋白的结合支架(即，除了本文已经描述的免疫球蛋白序列之外)，来源于蛋白质A结构域的蛋白支架(诸如AffibodiesTM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等，Nat.Biotech(自然生物技术)2005，卷23：1257)，和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等，组合化学高通量筛选(Comb Chem High Throughput Screen)20069(8)：619-32)。
同样地，包括一个或多个这些CDR序列的任何本发明的氨基酸序列优选是这样的，以致其可以特异性结合(如本文所定义)RANK-L，并且更特别地是这样的，以致其可以以如本文所限定的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本文进一步所述)与RANK-L结合。
更特别地，本发明该方面所述的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的任何氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1序列、本文所述的CDR2序列和本文所述的CDR3序列组成的组的至少两个氨基酸序列，以致(i)当第一氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列时，第二氨基酸序列选自本文所述的CDR2序列或本文所述的CDR3序列；(ii)当第一氨基酸序列选自本文所述的CDR2序列时，第二氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列；或(iii)当第一氨基酸序列选自本文所述的CDR3序列时，第二氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列。
甚至更特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1序列、本文所述的CDR2序列和本文所述的CDR3序列组成的组的至少三个氨基酸序列，以致第一氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列，第二氨基酸序列选自本文所述的CDR2序列，并且第三氨基酸序列选自本文所述的CDR3序列。CDR1、CDR2和CDR3序列的优选组合将通过本文的进一步描述变得清楚。对于熟练的技术人员将是清楚的，这样的氨基酸序列优选是免疫球蛋白序列(如本文进一步所述)，但是例如，它也可以是包括呈递所述CDR序列的适当的支架的任何其它的氨基酸序列。
因此，在一个具体而非限制性方面中，本发明涉及针对RANK-L的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或它们的任何适当的组合。
当本发明的氨基酸序列包含b)和/或c)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，在b)和/或c)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，b)和/或c)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，b)和/或c)所述的氨基酸序列可以是来源于a)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
类似地，当本发明的氨基酸序列包含e)和/或f)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，在e)和/或f)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，e)和/或f)所述的氨基酸序列可以是来源于d)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
此外，类似地，当本发明的氨基酸序列包含h)和/或i)所述的一个或多个氨基酸序列时：
i)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，在h)和/或i)所述的氨基酸序列中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，h)和/或i)所述的氨基酸序列可以是来源于g)所述的氨基酸序列的氨基酸序列。
应该理解，最后的前述段落通常也适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或i)所述的一个或多个氨基酸序列的本发明的任何氨基酸序列。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
i)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；和
iii)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
或它们的任何适当组合。
此外，优选地，在这样的氨基酸序列中，至少一个所述氨基酸残基序列形成结合RANK-L的抗原结合位点的一部分。
在一个更具体而同样非限制性的方面中，本发明涉及针对RANK-L的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的两个或更多个氨基酸残基序列：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以致(i)当第一氨基酸残基序列对应于a)，b)或c)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；
(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一。
在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的组的两个以上的氨基酸残基序列：
i)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；和
iii)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
以致，(i)当第一氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：312-373和758或SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：188-249或SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：188-249或SEQID NO’s：312-373和758的氨基酸序列之一。
此外，在这样的氨基酸序列中，所述至少两个氨基酸残基序列同样优选地形成结合RANK-L的抗原结合位点的一部分。
在甚至更具体而非限制性的方面中，本发明涉及针对RANK-L的氨基酸序列，其包括三个或更多个氨基酸残基序列，其中第一氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
优选地，在该具体方面中，第一氨基酸残基序列选自由SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列组成的组；第二氨基酸残基序列选自由SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列组成的组；并且第三氨基酸残基序列选自由SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选地，在这样的氨基酸序列中，所述至少三个氨基酸残基序列形成结合RANK-L的抗原结合位点的一部分。
所述氨基酸序列的序列的优选组合将通过本文进一步的公开内容变得清楚。
优选地，在所述氨基酸序列中，所述CDR序列与SEQ ID NO’s 560-621的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一性。这种氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s 560-621中的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度(以本文所述的方式)而确定，其中忽视形成构架区的氨基酸残基。此外，本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本文所定义)RANK-L；并且更特别地以如本文所定义的亲和力结合RANK-L(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本文进一步所述)。
当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样的，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列组成的组；和/或CDR2选自由SEQID NO’s：312-373和758的氨基酸序列组成的组；和/或CDR3选自由SEQID NO’s：436-497的氨基酸序列组成的组。
特别地，当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选地是这样，以致：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列的任何适当的片段。
特别地，这样的本发明的氨基酸序列可以是这样的，以致CDR1选自由SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列组成的组；并且CDR2选自由SEQID NO’s：312-373和758的氨基酸序列组成的组；并且CDR3选自由SEQID NO’s：436-497的氨基酸序列组成的组。
同样地，优选的CDR序列的组合将通过本文的进一步描述而变得清楚。
此外，所述氨基酸序列优选是这样的，以致它们可以特异性结合(如本文所定义)RANK-L；并且更特别地以如本文所定义的亲和力结合RANK-L(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地作为IC50值，如本文进一步所述)。
在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。例如，这种氨基酸同一性的程度可以通过确定在所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：560-621的一个或多个序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)而确定，其中忽略形成所述构架区的氨基酸残基。本发明的所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。
在这样的本发明的氨基酸序列中，所述构架序列可以是任何适当的构架序列，并且例如，基于标准手册和进一步公开的内容以及本文引用的现有技术，适当的构架序列的实例对于熟练的技术人员将是清楚的。
所述构架序列优选是免疫球蛋白构架序列或已经来源于免疫球蛋白构架序列(例如，通过人源化或骆驼源化)的构架序列(的适当组合)。例如，所述构架序列可以是来源于轻链可变结构域(例如，VL-序列)和/或来源于重链可变结构域(例如，VH-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面中，所述构架序列是已经来源于VHH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以任选地已经被部分或完全人源化)或是已经骆驼源化(如本文所定义)的常规VH序列。
所述构架序列优选地是这样的，以致本发明的氨基酸序列是结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)；是″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)；或是纳米抗体TM(包括但不限于VHH序列)。同样地，例如，基于标准手册和进一步的公开内容以及本文所提及的现有技术，适当的构架序列对于熟练的技术人员将是清楚的。
特别地，在本发明的氨基酸序列中存在的所述构架序列可以包含一个或多个标志残基(如本文所定义)，以致本发明的氨基酸序列是一种纳米抗体。所述构架序列(的适当的组合)的一些优选的、而非限制性的实例将通过本文进一步的公开内容变得清楚。
同样地，如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，还可以使用前述任一种的适当的片段(或片段组合)，诸如包含适当与一个或多个构架序列侧连和/或通过一个或多个构架序列连接的一个或多个CDR序列的片段(例如，以如这些CDR相同的顺序，并且构架序列可以以所述片段所来源的完全大小的免疫球蛋白序列存在)。所述片段还可以也是这样的，以致它们包括或可以形成免疫球蛋白折叠，或者备选地是这样的，以致它们不包括或不能形成免疫球蛋白折叠。
在一个具体的方面中，这样的片段包括如本文所述的单CDR序列(并且特别是CDR3序列)，其在每一边侧连构架序列(的一部分)(并且特别地，在所述片段所来源的免疫球蛋白序列中与所述CDR序列相邻的构架序列的一部分。例如，CDR3序列可以在FR3序列(的一部分)之后并且在FR4序列(的一部分)之前)。这样的片段还可以包含二硫键，并且特别是连接分别在所述CDR序列之前和之后的两个构架区的二硫键(为了形成这样的二硫键的目的，可以使用在所述构架区中天然存在的半胱氨酸残基，或备选地，半胱氨酸残基可以合成添加或引入到所述构架区)。对于这些“派遣片段”的进一步描述，同样参考WO 03/050531，以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年12月5日提交的题目为“Peptides capable of binding toserum proteins(能够结合血清蛋白的肽)”的埃博灵克斯股份有限公司美国临时申请(发明人：Revets，Hilde AdiPierrette；Kolkman，Joost Alexander；和Hoogenboom，Hendricus RenerusJacobus Mattheus)(还参见PCT/EP2007/063348)。
在另一个方面中，本发明涉及这样的化合物和构建体，且特别是蛋白或多肽(本文也分别称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”)，其包括一个或多个本发明的氨基酸序列(或其适当的片段)或基本上由其组成，且任选地还包括一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位。熟练的技术人员通过本文进一步的公开内容将清楚，所述其他基团、残基、部分、结合单位或氨基酸序列可以或可以不为本发明的氨基酸序列(和/或为其所存在于其中的化合物或构建体)提供进一步的官能性，且可以或可以不修饰本发明的氨基酸序列的特性。
例如，所述其它基团、残基、部分或结合单位可以是一个或多个额外的氨基酸序列，以致所述化合物或构建体是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
备选地，例如，所述基团、残基、部分或结合单位可以是化学基团、残基、部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以连接到一个或多个本发明的氨基酸序列上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步所述。
也在本发明范围内的是这样的化合物或构建体，其包括一个或多个本文所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
在上述化合物或构建体中，所述一个或多个本发明的氨基酸序列以及所述一个或多个基团、残基、部分或结合单位可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔体连接。例如，当所述一个或多个基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列时，所述接头可以也是氨基酸序列，以致所得到的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括将所述一个或多个本发明的氨基酸序列任选地通过一个或多个适当的接头适当地连接到所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位上的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以优选地通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。这样的方法可以以本身已知的方式进行，例如，基于本发明进一步所述的方法和技术，其对于熟练的技术人员将是清楚的。
由本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本发明中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列；并且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被认为是“格式化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本发明的公开内容，熟练的技术人员将清楚本发明的氨基酸序列可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的氨基酸序列形成本发明的另一个方面。
在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性实例对于熟练的技术人员将变得清楚，并且例如包括下列各项：已经被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过聚乙二醇化方式)的本发明的氨基酸序列或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包括所述半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例对于熟练的技术人员将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如(人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”’，适合用作dAb的氨基酸序列，或可以结合血清蛋白如血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)的纳米抗体、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白；参考进一步的描述和本发明提及的参考文献)；这样的多肽，其中本发明的氨基酸序列连接Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列适当连接一个或多个可以结合血清蛋白的小蛋白或肽(诸如，但不限于，记述在WO 91/01743，WO 01/45746，WO02/076489和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年12月5日提交的题目为“Peptides capable of binding to serum proteins(能够结合血清蛋白的肽)”的埃博灵克斯股份有限公司的美国临时申请(也参见PCT/EP2007/063348)中的蛋白和肽)。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，所述本发明的化合物或多肽具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选而非限制性方面中，所述本发明的化合物或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
在另一个方面中，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽(或其适当的片段)的核酸。这样的核酸在本发明中还称为“本发明的核酸”，并且例如，可以采用遗传构建体的形式，如本发明进一步所述。
在另一个方面中，本发明涉及表达(或在适当的环境下能够表达)本发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞，和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及一种产品或组合物，所述产品或组合物包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列、至少一种本发明的多肽(或其适当的片段)和/或至少一种本发明的核酸、以及任选地一种或多种所述组合物本身已知的其它成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，这样的产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或用于诊断用途的产品或组合物(同样如本文所述)。通过本发明进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽、或包括其的组合物在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单个细胞中或在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处于骨疾病或病症的危险中或患有其的人中)调节RANK-L(的方法或组合物)中的应用。
本发明还涉及使用至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽用于体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单个细胞中或在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处于骨疾病或病症的危险中或患有其的人中)调节RANK-L的方法，所述方法至少包括使RANK-L与至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽、或包括其的组合物以适于调节RANK-L的方式和量相接触的步骤。
本发明还涉及一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单个细胞中或在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处于骨疾病或病症的危险中或患有其的人中)调节RANK-L的组合物(诸如，但不限于如本文进一步所述药物组合物或制剂)中的应用。
在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”通常意指减少或抑制RANK-L的活性，或备选地增加RANK-L的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法(诸如本文提及的那些)测量的。特别地，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”可以意指减少或抑制RANK-L的活性，或备选地增加RANK-L的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法(诸如本文提及的那些)测量的，与在相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的条件下，在相同测定中的RANK-L活性相比较，至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
熟练的技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽相比较，对RANK-L对其靶标、配体或底物中的一种或多种的亲和力、抗体亲抗源性、特异性和/或选择性施加改变(其可以是增加或减少)；和/或对RANK-L对于在所述RANK-L存在于其中的介质或环境中的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性施加改变(其可以是增加或减少)。熟练的技术人员应该清楚，这同样可以以任何适当的方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法来确定，诸如本文或在本文引用的现有技术中所述的测定法。
“调节”还可以意指对包括RANK-L(或其中包括其底物、配体、或途径，如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性施加改变(即，分别作为激动剂或作为拮抗剂的活性)。同样，熟练的技术人员应该清楚，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任何适当的(体外且通常是细胞或测定法)测定法确定，诸如本文或在本文引用的现有技术中所述的测定法。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的相同测定法中，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
例如，调节还可以包括减少或抑制RANK-L与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与RANK-L的结合。调节还可以包括激活RANK-L或其中包括RANK-L的机制或途径。调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于制药学和药学目的，通常应该是以可逆的方式。
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。所述方法的一些优选但非限制性的实例将通过本文进一步的描述变得清楚。
一般地，这些方法可以包括下列步骤：
a)提供氨基酸序列的组、集合或文库；和
b)从所述氨基酸序列的组、集合或文库中筛选可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的氨基酸序列；
和
c)分离所述可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的氨基酸序列。
在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是任何适当的氨基酸序列的组、集合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的组、集合或文库(如本文所述)，诸如免疫球蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库；免疫球蛋白序列的合成的或半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。
此外，在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是重链可变结构域(诸如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或可以是能够作为结构域抗体或单结构域抗体行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。
在本方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如，来自已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物的免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，以诸如促进筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域熟练的技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。同样参考Hoogenboom在Nature Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，用于产生氨基酸序列的方法包括至少下列步骤：
a)提供表达氨基酸序列的细胞的集合或样品；
b)从所述细胞的集合或样品中筛选表达可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的氨基酸序列的细胞；
和
c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
例如，当所需要的氨基酸序列是免疫球蛋白序列时，所述细胞的集合或样品可以是，例如，B细胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于熟练的技术人员将是清楚的。例如，参考EP 0 542 810，WO 05/19824，WO 04/051268和WO04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。对于此，例如，参考Lieby等，Blood(血液)，卷97，No.12，3820(2001)。
在另一个方面中用于产生针对RANK-L的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的氨基酸序列的核酸序列；
和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
在这样的方法中，所述编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码免疫球蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码免疫球蛋白序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
此外，在这样的方法中，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重链可变结构域(诸如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或能够作为结构域抗体或单结构域抗体行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是核酸序列的免疫的组、集合或文库，例如，所述核酸序列来源于已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重链可变结构域或轻链可变结构域的免疫的组、集合或文库。在一个具体的方面中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以编码VHH序列的组、集合或文库。
在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，以诸如促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域熟练的技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。同样参考Hoogenboom在NatureBiotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，所述用于产生针对RANK-L的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码这样的氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性且被交叉阻断或交叉阻断本发明的纳米抗体如SEQ ID NO’s：560-621，或本发明的人源化纳米抗体如SEQ ID NO’s：730-757和765，或本发明的多肽或构建体如SEQ ID NO’s：622-729，759-762和766-789；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
本发明还涉及通过上述方法或备选地通过包括上述方法之一以及至少下列步骤的方法而获得的氨基酸序列，所述步骤为：确定所述免疫球蛋白序列的核苷酸序列或氨基酸序列；并且以本身已知的方式表达或合成所述氨基酸序列，诸如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达，或通过化学合成。
此外，在上述步骤后，一个或多个本发明的氨基酸序列可以适当地被人源化(或备选地，被骆驼源化)；和/或可以将这样获得的氨基酸序列彼此连接，或连接一个或多个其它适当的氨基酸序列(任选地，通过一个或多个适当的接头)，以提供本发明的多肽。此外，编码本发明的氨基酸序列的核酸序列可以被适当地人源化(或备选地，被骆驼源化)并且适当地表达；和/或编码本发明的氨基酸序列的一个或多个核酸序列可以彼此连接，或连接编码其它适当的氨基酸序列的一个或多个核酸序列(任选地通过编码一个或多个适当的接头的核苷酸序列)，然后，这样获得的核苷酸序列可以进行适当地表达，以提供本发明的多肽。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗与RANK-L相关的疾病和病症的方法。通过本发明进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于治疗。
特别地，本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于这样的疾病和病症的治疗，所述疾病和病症可以通过给需要其的受试者施用(药物有效量的)如本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体或多肽而预防或治疗。
更特别地，本发明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于骨疾病和病症的治疗。
通过本文进一步的描述，本发明的其它方面、实施方案、优点和应用也将变得清楚，其中本发明将更详细地描述和讨论本发明的纳米抗体以及包括其的本发明的多肽，其形成本发明的一些优选方面。
如通过本发明进一步的描述将变得清楚，与“dAb”或相似的(单)结构域抗体或免疫球蛋白序列相比，纳米抗体通常提供某些优点(本发明所述的)，本发明的纳米抗体也提供所述优点。然而，熟练的技术人员应该清楚，下述教导的更通用的方面也可以适用于(直接或类似地)本发明的其它氨基酸序列。
本发明的详述
在本描述、实施例和权利要求中：
a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等，″分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)″(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(1989)；F.Ausubel等，编，″现代分子生物学方法(Currentprotocols in molecular biology)″，Green Publishing和Wiley Interscience，纽约(1987)；Lewin，“Genes II”，John Wiley & Sons，New York，纽约，(1985)；Old等，“基因操作原理：基因工程导言(Principles of Gene Manipulation：AnIntroduction to Genetic Engineering)”，第2版，加利福尼亚大学出版社(University of California Press)，伯克利，CA(1981)；Roitt等，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)；Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’s Essential Immunology)，第10版.Blackwell Publishing，英国(2001)；和Janeway等，“免疫生物学(Immunobiology)”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及本发明所引用的公知背景技术；
b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4-链抗体——用作一般术语，包括完整大小的抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，术语“序列”用于本文时(例如在类似“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关的氨基酸序列、以及编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释；
c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及参考例如下述综述Presta，Adv.DrugDeliv.Rev.(高级药物递送综述)2006，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，Mol.Biosyst.2006，2(1)：49-57；Irving等，J.Immunol.Methods，(免疫学方法杂志)2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等，Placenta，2000，21增刊.A，S106-12，Gonzales等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)，2005，26(1)，31-43，其描述了用于蛋白质加工的技术，诸如亲和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的特性的其他技术；
d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如在表A-2提及的；
表A-2：一字母和三字母氨基酸密码
e)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以【第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一删除、插入、取代或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBIBlast v2.0。
例如，在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列；
f)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文还称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一删除、插入、取代或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本文所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，熟练的技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO04/037999，GB-A-2357768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。
所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下：Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978研究的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和高级酶学(Adv.Enzymol.)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，美国国家科学院学报(Proc.Nad.Acad Sci.USA)81：140-144，1984；Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.).157：105-132，1981，以及Goldman等，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.).15：321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自然结构生物学(NatureStructural Biology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(Natural Structural Biology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其它信息可以在上文引用的现有技术中找到。
g)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本文所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”。
h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、删除或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异。
i)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的序列，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的纳米抗体包括CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基序列，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时，它优选地具有在最先提及的氨基酸序列中基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使作用。此外，当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
j)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸序列或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术确定时，诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均相的；
k)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列(诸如抗体链，并且特别是指重链抗体的球状区域)的球状区域，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)。术语“结合结构域”是指针对抗原决定簇这样的结构域(如本文所定义)；
l)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；
m)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“针对(against)”或者“针对(directed against)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
n)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的许多不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗源性(avidity)而确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的测量：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如，基于本文进一步的公开内容)，亲和力可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗源性是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的测量。抗体亲抗源性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升(M)或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升(M)或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本文提及的其它技术。
解离常数可以是实际的或表观解离常数，熟练的技术人员应该清楚。确定解离常数的方法对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本文提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，熟练的技术人员应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD＝1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示；熟练的技术人员应该清楚，考虑到KA＝1/KD的关系，通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等价于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关，KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(以致KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1-约107M-1s-1之间变化，对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon，koff测量以及因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
熟练的技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和力，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的KD可以与表观KD相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗源性的影响。
可以用来评估亲和力的另一个方法是Friguet等(免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。
然而，KD的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观KD测量可以用作真实KD的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团或生色团或其它化学部分标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果，对应于A的浓度获得IC50值，在其中将在不存在A的条件下关于C所测量的信号二等分。假定已知参照分子的KD，即KDref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KD：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref＜＜KDref，则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于KD或等价于表观KD。
o)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；从所述动物收集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(Chemical Stability ofPharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists)和Peters等，药物动力学分子：实践方法(Pharmacokinete analysis：A Practical Approach)(1996)。还参考″药物动力学(Pharmacokinetics)″，M Gibaldi和D Perron，MarcelDekker出版，第2综述版(2nd Rev.edition)(1982)。
熟练的技术人员还应该清楚(例如，参见WO 04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数。当用于本文时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
p)在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”通常意指减少或抑制靶或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法测量的。特别地，“调节(modulating)”或“调节(to modulate)”可以意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加靶标或抗原的(相关或目的)生物学活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定法(其通常将取决于包括的靶标或抗原)测量的，与在相同条件但不存在本发明的构建体的条件下，在相同测定中的所述靶标或抗原的活性相比较，至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
熟练的技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本发明的构建体相比较，对靶标或抗原对其配体、结合配偶体、缔合成同源多聚体或异源多聚体形式的配偶体、或底物中的一种或多种的亲和力、抗体亲抗源性、特异性和/或选择性施加改变(其可以是增加或减少)；和/或对所述靶标或抗原对于在所述靶标或抗原存在于其中的介质或环境的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性施加改变(其可以是增加或减少)。熟练的技术人员应该清楚，这同样可以以适当的方式和/或使用本身已知的任何适当的测定法来确定，这取决于所包括的靶标或抗原。
“调节”还可以意指对包括所述靶标或抗原(或其中包括其底物、配体、或途径，如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)的一种或多种生物学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性施加改变(即，分别作为激动剂、作为拮抗剂或作为反激动剂的活性，这取决于所述靶标或抗原和需要的生物学或生理学作用)。同样，熟练的技术人员应该清楚，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任何适当的(体外且通常是细胞或体内测定法)测定法确定，这取决于所包括的靶标或抗原。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的构建体的相同测定法中的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。
例如，调节还可以包括所述靶标或抗原的别构调节；和/或减少或抑制所述靶标或抗原与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与所述靶标或抗原的结合。调节还可以包括激活所述靶标或抗原或其中包括所述靶标或抗原的机制或途径。例如，调节还可以包括对所述靶标或抗原的折叠或构象(confirmation)、或对所述靶标或抗原折叠的能力施加改变，以改变其构象(例如，在与配体结合时)，以与其他(亚)基缔合，或以解聚。例如，调节还可以包括对所述靶标或抗原转运其他化合物或作为其他化合物(诸如离子)的通道的能力施加改变。
调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于制药学和药学目的，通常应该是以可逆的方式。
q)关于靶标或抗原，术语在所述靶标或抗原上的“相互作用位点”意指在所述靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，其是所述靶标或抗原的用于结合配体、受体或其他结合配偶体的位点、催化位点、分解位点、别构相互作用的位点、参与多聚体化(如同源多聚体化或异源多聚体化)的位点；或是在所述靶标或抗原上的参与所述靶标或抗原的生物学作用或机制的任何其他位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列。更一般地，“相互作用位点”可以是在所述靶标或抗原上的本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，以致调节(如本文定义)所述靶标或抗原(和/或其中包括所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用)。
r)认为这样的氨基酸序列或多肽是对第一靶标或抗原“特异性的”，即，与第二靶标或抗原相比较，当与第一抗原以是所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合的亲和力的至少10倍、如至少100倍、且优选至少1000倍、且多至10000倍或更多的亲和力(如上述，且适当表示为KD值、KA值、koff-速率和/或kon-速率)结合时。例如，所述第一抗原可以以比所述氨基酸序列或多肽与所述第二靶标或多肽结合的KD小至少10倍、如小至少100倍、且优选小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的KD值结合所述靶标或抗原。优选地，当氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原相比较对第一靶标或抗原是“特异性的”时，它针对(如本文定义)所述第一靶标或抗原，但是不针对所述第二靶标或抗原。
s)术语“交叉阻断(cross-block)”，“交叉阻断的(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”在本文可以互换使用，用来意指氨基酸序列或其他结合试剂(如本发明的多肽)干扰本发明的其他氨基酸序列或结合试剂与给定靶标的结合的能力。本发明的氨基酸序列或其他结合试剂能够干扰另一种对RANK-L的结合的程度，且因此其能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确定。一种特别适当的定量交叉阻断测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量氨基酸序列或其他结合试剂之间对于它们与所述靶标的结合的竞争。
以下概括描述用于确定氨基酸序列或其他结合试剂是否交叉阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的Biacore测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列或其他结合试剂一起使用。按照供应商的建议使用Biacore机器(例如，Biacore 3000)。因此，在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将目标蛋白偶联到CM5Biacore芯片上，以产生由所述靶标包被的表面。典型地，200-800个共振单位的靶标将被偶联到芯片上(易于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。将两种待检测它们彼此交叉阻断的能力的测试氨基酸序列(称为A*和B*)以结合位点1∶1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。当基于结合位点计算浓度时，假设氨基酸序列的分子量是氨基酸序列的总分子量除以所述氨基酸序列上的靶标结合位点的数目。测试混合物中每种氨基酸序列的浓度应该足够高，足以易于饱和所述氨基酸序列关于捕获在Biacore芯片上的靶标分子的结合位点。在所述混合物中的氨基酸序列处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述浓度典型地为1.00-1.5微摩尔(基于结合)。还制备仅包含A*和仅包含B*的分开的溶液。在这些溶液中的A*和B*应该处在与在所述测试混合物中相同的缓冲液中和相同的浓度。将测试混合物通过靶标-包被的Biacore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除结合的氨基酸序列。典型地，这通过用30mM HCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有A*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。同样处理芯片，以在不损坏芯片-结合的靶标的条件下去除所有结合的氨基酸序列。然后，将仅有B*的溶液通过靶标-包被的表面，并记录结合的量。接着计算A*和B*混合物的最大理论结合，且为每种氨基酸序列在单独通过靶标表面时的结合的总和。如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则该两种氨基酸序列彼此是交叉阻断的。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的氨基酸序列或其他结合试剂是一种将在上述Biacore交叉阻断测定法中与靶标结合的，以致在该测定法中且在存在本发明的第二氨基酸序列或其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种氨基酸序列或结合试剂的最大理论结合(如上文定义)的80％-0.1％(例如，80％-4％)，特别地是最大理论结合的75％-0.1％(例如，75％-4％)，且更特别地是最大理论结合的70％-0.1％(例如，70％-4％)。上述Biacore测定法是用来确定氨基酸序列或其他结合试剂彼此是否是按照本发明交叉阻断的主要测定法。在很少的情形中，特定的氨基酸序列或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联到CM5Biacore芯片上的靶标结合(这通常在靶标上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在这样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的靶标，例如N端His-标记的形式确定。以这种特定的形式，抗-His氨基酸序列将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的靶标通过芯片表面，并被所述抗-His氨基酸序列捕获。交叉阻断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后，新的His-标记的靶标将被重新负载到抗-His氨基酸序列包被的表面上。除了使用N端His-标记的靶标给出的实例之外，可以备选地使用C端His-标记的靶标。此外，本领域已知的各种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，具有抗-HA抗体的HA标记；具有抗-FLAG抗体的FLAG标记；具有链霉抗生物素蛋白的生物素标记)。
下述概括描述用于确定针对靶标的氨基酸序列或其他结合试剂是否交叉阻断或如本文所定义那样能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法可以与本文所述的任何氨基酸序列(或其他结合试剂，如本发明的多肽)一起使用。本测定法的一般原理是使得针对所述靶标的氨基酸序列或结合试剂包被到ELISA平板的孔上。将过量的量的第二、潜在的交叉阻断、抗-靶标氨基酸序列添加到溶液中(即，不与ELISA平板结合)。然后将有限量的靶标添加到孔中。所述包被的氨基酸序列和溶液中的氨基酸序列竞争与有限量的靶标分子的结合。洗涤平板，以去除未与包被的氨基酸序列结合的过量的靶标，且还去除第二、溶液相氨基酸序列以及在所述第二、溶液相氨基酸序列和靶标之间形成的任何复合物。然后，使用适于检测所述靶标的试剂测量结合的靶标的量。相对于在不存在第二、溶液相的氨基酸序列的条件下所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的氨基酸序列的氨基酸序列将能够引起所述包被的氨基酸序列可以结合的靶标分子的数量的减少。在其中选择第一氨基酸序列如Ab-X作为固定的氨基酸序列的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，将过量的量的第二氨基酸序列如Ab-Y添加到该ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板的过程中，每孔Ab-Y靶标结合位点的摩尔比每孔所用的Ab-X靶标结合位点的摩尔高至少10倍。然后，加入靶标，以致每孔加入的靶标的摩尔比用于包被每孔的Ab-X靶标结合位点的摩尔低至少25倍。在适当的温育时间之后，洗涤ELISA平板，且加入用于检测所述靶标的试剂，以测量由所述包被的抗-靶标氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)特异结合的靶标的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、第二溶液相氨基酸序列(在该情形中为Ab-Y)、仅有靶标缓冲剂(即，不添加靶标)和靶标检测试剂的孔中获得的信号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列(在该情形中为Ab-X)、仅有第二溶液相氨基酸序列缓冲剂(即，不添加第二溶液相氨基酸序列)、靶标和靶标检测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种氨基酸序列用作包被氨基酸序列和哪种用作第二(竞争剂)氨基酸序列导致的任何假象(例如，Ab-X和Ab-Y之间对于靶标的显著不同的亲和力)，该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1是其中Ab-X是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-Y是在溶液中的竞争氨基酸序列，和2)形式2是其中Ab-Y是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-X是在溶液中的竞争氨基酸序列。如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-靶标氨基酸序列的条件下(即，阳性对照孔)获得的靶标检测信号相比较，所述溶液相抗-靶标氨基酸序列能够引起靶标检测信号(即，由所述包被的氨基酸序列结合的靶标的量)减少60％-100％，特别地70％-100％，且更特别地80％-100％，则Ab-X和Ab-Y被定义为是交叉阻断的。
t)如果它对于这两种不同的抗原或抗原决定簇是特异性的(如本文定义)，则认为氨基酸序列对于两种不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应的”。
u)“基本上不依赖pH”的结合在本文通常意指在动物或人体细胞内存在的pH值(如本文进一步所述)氨基酸序列对血清蛋白(如血清白蛋白)的缔合常数(KA)是在所述细胞外存在的pH值所述氨基酸序列对相同血清蛋白的缔合常数(KA)的至少5％，如至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，如甚至更优选至少70％，如至少80％或90％或更多(或甚至大于100％，如大于110％，大于120％或甚至130％或更多，或甚至大于150％，或甚至大于200％)。备选地，“基本上不依赖pH”的结合在本文通常意指在动物或人体细胞内存在的pH值(如本文进一步所述，例如5.5左右的pH，例如5.3-5.7)氨基酸序列对血清蛋白(如血清白蛋白)的koff速率(通过Biacore测量)是在所述细胞外存在的pH值如pH 7.2-7.4所述氨基酸序列对相同血清蛋白的koff速率的至少5％，如至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，如甚至更优选至少70％，如至少80％或90％或更多(或甚至大于100％，如大于110％，大于120％或甚至130％或更多，或甚至大于150％，或甚至大于200％)。所谓“在动物或人体细胞内存在的pH值”意指可能在细胞内，且特别是在参与血清蛋白再循环的细胞内存在的pH值。特别地，“在动物或人体细胞内存在的pH值”意指可能存在于参与血清蛋白的再循环(例如，作为胞饮作用、内吞作用、胞转作用、胞外分泌和吞噬作用或类似的摄入或在所述细胞内内在化的机制)的(亚)细胞区室或小泡内如内涵体、溶酶体或胞饮泡内的pH值。
v)如本文进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别局限于它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层要求，并且还优选地适于本文所述的目的；
w)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列(Sequence of proteins of immunological interest)”，美国公众健康服务中心(US Public Health Services)，NIH Bethesda，MD，Publication No.91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日；240(1-2)：185-195的文章中用于来自骆驼科动物的VHH结构域(例如，参见本公布的图2)，或参考本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。]。
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(自然(Nature)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、权利要求和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明；并且
x)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
关于重链抗体及其可变结构域的概括描述，其中特别参考本文引用的现有技术，参考Muyldermans在分子生物技术综述(Reviews in MolecularBiotechnology)74(2001)，277-302中的综述论文；以及参考下述专利申请，其作为公知背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO03/050531；加拿大国家研究委员会的(the National Research Council ofCanada)WO 01/90190；抗体研究所(the Institute of Antibodies)的WO03/025020(＝EP 1 433 793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司(AblynxN.V.)的其它公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的其它现有技术，并且特别参考在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用结合于此。
按照本领域中所用的术语学(参见上述参考文献)，在天然存在的重链抗体中存在的可变结构域还叫作“VHH结构域”，以将它们与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“VH结构域”)区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“VL结构域”)区分。
如在上文提到的现有技术中提及，VHH结构域具有许多独特的结构特征和功能特性，这使得分离的VHH结构域(以及基于此的纳米抗体，其与天然存在的VHH结构域一起具有这些结构特征和功能特性)以及包含其的蛋白高度有利地用作功能性抗原-结合结构域或蛋白。特别地，并且不限于此，VHH结构域(其天然地就“设计”为功能性结合抗原，而无需存在轻链可变结构域，并且无需与轻链可变结构域的任何相互作用)和纳米抗体可以作用为单一的、相对小的、功能性抗原-结合结构单位、结构域或蛋白。这将VHH结构域与常规4-链抗体的VH和VL结构域区分开，其本身通常不适合作为单一抗原-结合蛋白或结构域用于实际应用，但是需要以某种形式或另一蛋白或结构域结合以提供功能性抗原-结合单位(例如，在常规抗体片段诸如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由共价连接到VL结构域上的VH结构域组成)。
由于这些独特的特性，VHH结构域和纳米抗体用作单一抗原-结合蛋白或用作抗原-结合结构域(即，作为更大的蛋白或多肽的部分)提供许多优于常规VH和VL结构域、scFv’s或常规抗体片段(诸如Fab-或F(ab’)2-片段)应用的显著优点：
-只需要单结构域来以高亲和力和高选择性结合抗原，以致不需要存在两个分开的结构域，或者不需要保证这两个结构域以正确的空间构象和构型(即，通过使用专门设计的接头，如同scFv’s)存在；
-VHH结构域和纳米抗体可以从单一基因表达，并且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域和纳米抗体可以容易地加工成多价和多特异性形式(如本文进一步所讨论)；
-VHH结构域和纳米抗体高度可溶，并且没有聚集倾向(如同Ward等，自然(Nature)，341卷，1989，第544页所述的来源于小鼠的“dAb’s”)；
-VHH结构域和纳米抗体对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳定(参见，例如，Ewert等，同前所述)；
-VHH结构域和纳米抗体制备容易并且相对廉价，即使以生产需要的规模制备。例如，VHH结构域、纳米抗体和包含其的蛋白/多肽可以使用微生物发酵生产(例如，下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动物表达系统，如同例如常规抗体片段；
-与常规4-链抗体及其抗原-结合片段相比，VHH结构域和纳米抗体相对较小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并且因此表现出比所述常规4-链抗体及其抗原-结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤和其它致密组织)穿透性；
-VHH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的腔-结合(cavity-binding)特性(与常规VH结构域相比，尤其由于它们延长的CDR3环)，并且因此还可以接近常规4-链抗体及其抗原-结合片段不能接近的靶标和表位。例如，已经表明VHH结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见，例如，WO 97/49805；Transue等，Proteins(蛋白质)1998，同前所述9月1日；32(4)：515-22；Lauwereys等，EMBO J.1998，同前所述7月1日；17(13)：3512-20)。
在一个具体且优选的方面中，本发明提供针对RANK-L的纳米抗体，且特别是针对来自温血动物的RANK-L的纳米抗体，且更特别地是针对来自哺乳动物的RANK-L的纳米抗体，且尤其是针对人RANK-L的纳米抗体；以及包括至少一种所述纳米抗体的蛋白和/或多肽。
特别地，本发明提供针对RANK-L的纳米抗体，和包括其的蛋白和/或多肽，与常规针对RANK-L的抗体或其片段相比，与可基于所述常规抗体或抗体片段的构建体(如Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“二抗体”和其他多特异性构建体(参见例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36)的综述)相比，且还与所谓的“dAb’s”或来源于常规抗体的可变结构域相似的(单)结构域抗体相比，其具有提高的治疗和/或药学特性和/或其他有利特性(诸如，例如，改进的制备容易型和/或减少的商品成本)。这些提高的和有利的特性将通过本文的进一步描述变得清楚，且例如包括但不限于，下述各项的一种或多种：
-提高的针对RANK-L的亲和性和/或抗体亲抗源性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-对于以多价形式(例如，以二价形式)格式化的更好的适合性；
-对于以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)格式化的更好的适合性；
-提高的对“人源化”取代(如本文定义)的适合性或易感性；
-更小的免疫原性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-增加的稳定性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-增加的针对RANK-L的特异性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；
-减少或在需要时提高与来自不同物种的RANK-L的交叉反应性；和/或
-一种或多种药学应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应用(包括但不限于成像目的)需要的其他改善的特性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)。
如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米抗体优选以基本上分离的形式(如本文定义)存在，或形成本发明的蛋白或多肽(如本文定义)的一部分，其可以包括一个或多个本发明的纳米抗体或基本上由其组成，且其可以任选地还包括一个或多个其他氨基酸序列(所有任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，且不限于，所述本发明的一个或多个氨基酸序列可以在所述蛋白或多肽中用作结合单位，其可以任选地包含一个或多个可以作为结合单位的其他氨基酸序列(即，针对除RANK-L外的一个或多个其他的靶标)，以分别提供单价的、多价的或多特异性的本发明的多肽，所有均如本文所述。特别地，这样的蛋白或多肽可以包括一个或多个本发明的纳米抗体和任选地一个或多个(其他)纳米抗体或基本上由其组成(即，针对除RANK-L外的其他的靶标)，所有均任选地通过一个或多个适当的接头连接，以分别提供单价的、多价的或多特异性的纳米抗体构建体，如本文进一步所述。这样的蛋白或多肽也可以以基本上分离的形式(如本文定义)存在。
在本发明的纳米抗体中，用于针对RANK-L结合的结合位点优选地由CDR序列形成。任选地，本发明的纳米抗体还可以，且除了用于针对RANK-L结合的至少一个结合位点之外，包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的其他结合位点。对于引入所述第二结合位点的方法和位置，例如，参考Keck和Huston，Biophysical Journal，(生物物理学杂志)71，1996年10月，2002-2011；EP 0 640 130和WO 06/07260。
如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，当意欲将本发明的纳米抗体(或包括其的本发明的多肽)施用给受试者时(例如，用于治疗和/或诊断目的，如本文所述)，它优选地针对人RANK-L；而对于兽医用目的，它优选地针对来自被治疗的物种的RANK-L。此外，如使用本发明的氨基酸序列，本发明的纳米抗体可以或可以不是交叉反应的(即，针对来自两种或多种哺乳动物物种的RANK-L，如针对人RANK-L和来自本文提及的哺乳动物物种中的至少一种的RANK-L)。
此外，同样如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米抗体可以通常针对RANK-L的任何抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(在适用的情形中)。然而，通常假定和优选本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)针对RANK-L上的RANK结合位点或RANK-L上的OPG结合位点。在本发明的另一个方面中，本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对RANK-L上与denosumab的表位重合的表位。
如本文已经所述，可以认为纳米抗体的氨基酸序列和结构----然而，不限于此----包括4个构架区或“FR’s”(或有时还称为“FW’s”)，其在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区由3个互补性决定区或“CDR’s”中断，其在本领域分别称为“互补性决定区1”或“CDR1”；“互补性决定区2”或“CDR2”；和“互补性决定区3”或“CDR3”。在本发明的纳米抗体中存在的一些优选的构架序列和CDR’s(及其组合)如本文所述。其他适当的CDR序列可以通过本文所述的方法获得。
按照本发明的非限制性但是优选的方面，本发明的纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的，以致：
-所述纳米抗体可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与RANK-L结合；
和/或这样，以致：
-所述纳米抗体可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与RANK-L结合；
和/或这样，以致：
-所述纳米抗体可以以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与RANK-L结合。
优选地，本发明的纳米抗体(中存在的CDR序列)是这样的，以致：本发明的单价纳米抗体(或包含仅一个本发明的纳米抗体的多肽)优选是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与RANK-L结合。
本发明的纳米抗体针对RANK-L的亲和力可以以本身已知的方式确定，例如，使用本文提及的用于测量KD.KA，koff或kon的通用技术，以及本文所述的一些具体的测定法确定。
对于本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)与RANK-L结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及针对RANK-L的纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或所述氨基酸序列的任何适当的片段。
特别地，按照该优选而非限制性的方面，本发明涉及针对RANK-L的纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或所述氨基酸序列的任何适当的片段。
通常如本文关于本发明的氨基酸序列所提及的，当本发明的纳米抗体包含一个或多个b)和/或c)所述的一个或多个CDR1序列时：
i)与a)所述的相对应CDR相比，在b)和/或c)所述的CDR中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与a)所述的相对应CDR相比，b)和/或c)所述的CDR优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，b)和/或c)所述的CDR可以是来源于a)所述的CDR的CDR。
类似地，当本发明的纳米抗体包含e)和/或f)所述的一个或多个CDR2序列时：
i)与d)所述的相对应CDR相比，在e)和/或f)所述的CDR中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与d)所述的相对应CDR相比，e)和/或f)所述的CDR优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，e)和/或f)所述的CDR可以是来源于d)所述的CDR的CDR。
此外，类似地，当本发明的纳米抗体包含h)和/或i)所述的一个或多个CDR3时：
i)与g)所述的相对应CDR相比，在h)和/或i)所述的CDR中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与g)所述的相对应CDR相比，h)和/或i)所述的CDR优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)利用一种或多种本身已知的的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式，h)和/或i)所述的CDR可以是来源于g)所述的CDR的CDR。
应该理解，最后三段落通常也适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或i)所述的一个或多个CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列的本发明的任何纳米抗体。
在本发明的纳米抗体中，包括一个或多个上文清楚列出的CDR’s的纳米抗体是特别优选的；包括两个或多个上文清楚列出的CDR’s的纳米抗体是更特别优选的；且包括三个上文清楚列出的CDR’s的纳米抗体是最特别优选的。
CDR序列的一些特别优选的而非限制性的组合，以及CDR序列和构架序列的优选的组合，在下表A-1中提及，其列出了在许多优选的(但非限制性的)本发明的纳米抗体中存在的CDR序列和构架序列。如熟练的技术人员应该清楚的，在同一克隆中存在的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR1、CDR2和CDR3序列)通常是优选的(尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，且还包括表A-1中提及的CDR序列的其他适当的组合)。此外，在同一克隆中存在的CDR序列和构架序列的组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR序列和构架序列)通常是优选的(尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，且还包括表A-1中提及的CDR序列和构架序列的其他适当的组合，以及所述CDR序列和其他适当的构架序列的组合，例如，如本文进一步所述)。
此外，在包括表A-1中提及的CDR’s组合的本发明纳米抗体中，每个CDR可以被选自由与所提及的CDR’s具有至少80％、优选至少90％、优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性(如本文定义)的氨基酸序列组成的组的CDR替换；其中：
i)与表A-1中提及的相对应的CDR序列相比较，在这样的CDR中的任何氨基酸取代优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或
ii)与表A-1中提及的相对应的CDR序列相比较，任何所述CDR序列优选地仅包含氨基酸取代，并且没有氨基酸删除或插入；
和/或
iii)任何所述CDR序列是通过通过本身已知的用于亲和力成熟的技术得到的CDR，并且其特别起始自如表A-1中提及的相应的CDR序列。
然而，如熟练的技术人员应该清楚的，表A-1中提及的CDR序列(的组合)、以及CDR序列和构架序列(的组合)通常是优选的。
因此，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少之一适当地分别选自由表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；或分别选自与分别在表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的“序列同一性”(如本文定义)的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个具有3、2或仅有1个“氨基酸差异”(如本文定义)的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
在该情形中，“适当选择”意指，在适用时，分别地，CDR1序列选自适当的CDR1序列(即，如本文定义)，CDR2序列选自适当的CDR2序列(即，如本文定义)，和CDR3序列选自适当的CDR3序列(即，如本文定义)。更特别地，CDR序列优选这样选择，以致本发明的纳米抗体以本文定义的亲和力(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为IC50值，如本发明进一步所述)结合RANK-L。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表A-1中列出的CDR3序列组成的组，或选自由与表A-1中列出的至少一种CDR3序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR3序列组成的组；和/或选自由与表A-1中列出的至少一种CDR3序列具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR3序列组成的组。
优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少两种适当地分别选自由表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组，或分别选自与分别在表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的“序列同一性”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一种具有3、2或仅有1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自由表A-1中列出的CDR3序列组成的组，或选自由与表A-1中列出的CDR3序列的至少一种具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR3序列组成的组；和存在的CDR1和CDR2序列中的至少之一适当地分别选自分别由表A-1中列出的CDR1和CDR2序列组成的组，或分别选自由分别与表A-1中列出的CDR1和CDR2序列的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR1和CDR2序列组成的组；和/或分别选自由分别与表A-1中列出的CDR1和CDR2序列的至少之一具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
最优选地，在本发明的纳米抗体中，所有三种存在的CDR1，CDR2和CDR3序列适当地分别选自由分别在表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；或分别选自与分别在表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的“序列同一性”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组；和/或分别选自由分别与表A-1中列出的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少之一具有3、2或仅有1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少之一适当地分别选自由表A-1列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在该方面中，存在的另外两种CDR序列中的至少一种或优选地两种适当地分别选自与表A-1列出的相对应的CDR序列中的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR序列，和/或分别选自由与表A-1列出的相对应的序列中的至少之一具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列选自由表A-1列出的CDR3序列组成的组。优选地，在该方面中，存在的CDR1和CDR2序列中的至少一种和优选地两种适当地分别选自由分别与表A-1列出的CDR1和CDR2序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR1和CDR2序列组成的组，和/或分别选自由分别与表A-1列出的CDR1和CDR2序列中的至少之一具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列中的至少两种适当地分别选自由表A-1列出CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。优选地，在该方面中，其余存在的CDR序列适当地选自由与表A-1列出的相对应的CDR序列中的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR序列组成的组；和/或选自由与表A-1列出的相对应的序列中的至少之一具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
特别地，在本发明的纳米抗体中，至少CDR3序列适当地选自由表A-1列出的CDR3序列组成的组，和CDR1序列或CDR2序列适当地分别选自由表A-1列出的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在该方面中，其余存在的CDR序列适当选自由与表A-1中列出的相对应的CDR序列中的至少之一具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR序列组成的组；和/或选自由与表A-1列出的相对应的CDR序列具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三种CDR1，CDR2和CDR3序列适当地分别选自由表A-1列出的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。
此外，一般地，优选表A-1中列出的CDR’s组合(即，在表A-1中同一行提及的那些)。因此，通常优选，当本发明纳米抗体中的CDR是表A-1中提及的CDR序列或适当地选自由与表A-1中列出的CDR序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR序列组成的组；和/或选自由与表A-1列出的CDR序列具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组，其它CDR中的至少一种和优选的两种适当地选自属于表A-1中同一组合(即，在表A-1中同一行中提及的)的CDR序列，或适当地选自与属于同一组合的CDR序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的序列同一性的CDR序列组成的组，和/或选自由与属于同一组合的CDR序列具有3、2或仅有1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。前述段落中所述的其他优先选择也适用于表A-1中提及的CDR组合。
因此，通过非限制性实施例，本发明的纳米抗体可以，例如，包括与表A-1中提及的CDR1序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR1序列，与表A-1中提及的CDR2序列之一(但是属于不同的组合)具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
一些优选的本发明的纳米抗体可以，例如，包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR1序列；与表A-1中提及的CDR2序列之一(但是属于不同的组合)具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中提及的CDR3序列之一(但是属于不同的组合)具有大于80％的序列同一性的CDR3序列；或(2)与表A-1中列出的CDR1序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR1序列；CDR2序列，和表A-1中列出的CDR3序列之一；或(3)CDR1序列；与表A-1中列出的CDR2序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR2序列；和与表A-1中提及的属于与所述CDR2序列同一组合的CDR3序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR3序列。
一些特别优选的本发明的纳米抗体可以，例如，包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR1序列；与表A-1中提及的属于同一组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中提及的属于同一组合的CDR3序列具有大于80％的序列同一性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表A-1中列出的CDR2和表A-1中列出的CDR3序列(其中所述CDR2序列和所述CDR3序列可以属于不同的组合)。
一些甚至更优选的本发明的纳米抗体可以，例如，包括：(1)与表A-1中提及的CDR1序列之一具有大于80％的序列同一性的CDR1序列；表A-1中列出的属于同一组合的CDR2序列；和表A-1中列出的属于不同组合的CDR3序列；或(2)表A-1中提及的CDR1序列；与表A-1中提及的属于同一组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表A-1中提及的属于同一或不同组合的CDR3序列具有大于80％的序列同一性的CDR3序列。
特别优选的本发明的纳米抗体可以，例如，包括表A-1中提及的CDR1序列，与表A-1中提及的属于同一组合的CDR2序列具有超过80％序列统一性的CDR2序列；和表A-1中提及的属于同一组合的CDR3序列。
在最优选的本发明的纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表A-1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合之一。
按照本发明另一个优选的而非限制性的方面，(a)CDR1具有1-12个氨基酸残基的长度，且通常为2-9个氨基酸残基，如5，6或7个氨基酸残基；和/或(b)CDR2具有13-24个氨基酸残基的长度，且通常为15-21个氨基酸残基，如16-17个氨基酸残基；和/或(c)CDR3具有2-35个氨基酸残基的长度，且通常为3-30个氨基酸残基，如6-23个氨基酸残基。
在另一个优选的而非限制性的方面中，本发明涉及这样的纳米抗体，其中CDR序列(如本文定义)与氨基酸序列SEQ ID NO’s：560-621中的至少之一的CDR序列具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％、如99％或更多的序列同一性(如本文定义)。
一般地，具有上述CDR序列的纳米抗体可以如本文进一步所述，且优选地具有也如本文进一步所述的构架序列。因此，例如，且如本文所提及，这样的纳米抗体可以是(来自任何适当的物种的)天然存在的纳米抗体，天然存在的VHH序列(即，来自适当的骆驼科物种)或合成的或半合成的氨基酸序列或纳米抗体，包括但不限于部分人源化的纳米抗体或VHH序列、完全人源化的纳米抗体或VHH序列、骆驼源化的重链可变结构域序列、以及已经通过本文提及的技术获得的纳米抗体。
因此，在一个具体而非限制性的方面中，本发明涉及人源化的纳米抗体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中CDR1-CDR3如本文所述，且其中所述人源化的纳米抗体包括至少一个人源化的取代(如本文定义)，且特别地是在其至少一个构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化的取代。
在另一个优选而非限制性的方面中，本发明涉及这样的纳米抗体，其中所述CDR序列与氨基酸序列SEQ ID NO’s：560-621中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性、优选至少80％的氨基酸同一性、更优选至少90％的氨基酸同一性、如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上为100％的氨基酸同一性。这种氨基酸同一性程度可以，例如，通过确定在所述纳米抗体和SEQ ID NO’s：560-621序列中的一种或多种之间的氨基酸同一性的程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以进一步如本文所述。
在另一个优选而非限制性的方面中，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：560-621组成的组或选自由与氨基酸序列SEQ ID NO’s：560-621中的至少一种具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％、如99％或更多的序列同一性(如本文定义)的氨基酸序列组成的组。
本发明另一个优选的而非限制性的方面涉及SEQ ID NO’s：560-621纳米抗体的人源化变体，与常规的天然VHH序列相比较，其包括至少一个人源化的取代(如本文定义)，且特别是在至少其构架序列(如本文定义)之一中的至少一个人源化的取代。这样的人源化变体的一些优选的而非限制性的实例是SEQ ID NO’s：730-757和765的人源化的纳米抗体。因此，本发明还涉及具有这样的氨基酸序列的人源化的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：730-757和765组成的组，或选自由与SEQ ID NO’s：730-757和765氨基酸序列中的至少之一具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％、如99％或更多序列同一性(如本文定义)的氨基酸序列组成的组，(其中与相对应的SEQ ID NO’s：730-757和765序列相比较，选自后一组氨基酸序列的氨基酸序列可以包含较多数量或较少数量的人源化取代，只要它们保留存在于相对应的SEQ ID NO’s：730-757和765序列中的至少一个人源化的取代)。
本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体，或基本上由其组成。本发明的多肽的一些优选的但非限制性的实例在SEQ ID NO’s：622-729，759-762和766-789给出。
熟练的技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”(或“更优选的”、“甚至更优选的”、等等)纳米抗体也是优选的(或更优选的，或甚至更优选的，等等)用于本文所述的多肽中。因此，包括一个或多个“优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是优选的，且包括一个或多个“更优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是更优选的，等等。
一般地，包括单一纳米抗体(如本发明的单一纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白或多肽在本文称为“单价的”蛋白或多肽或称为“单价的”构建体。包括两个或多个纳米抗体(如至少两个本发明的纳米抗体或至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白和多肽在本文称为“多价的”蛋白或多肽或称为“多价的”构建体，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点。通过本文的进一步描述，所述多价构建体的一些非限制性的实例将变得清楚。
按照一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少两个本发明的纳米抗体、如两个或三个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。如本文进一步所述，与包括单一的本发明的纳米抗体或基本上由其组成的蛋白或多肽相比较，所述多价构建体可以提供某些优点，如提高很多的对于RANK-L的抗体亲抗源性。基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该清楚所述多价构建体；一些优选的但非限制性的所述多价纳米抗体构建体是SEQ ID NO’s：622-693，761-762和766-773(二价)和SEQ ID NO’s：694-729和759-760(三价)的构建体。
按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其他结合单位(即，针对另一个表位、抗原、靶标、蛋白或多肽)或基本上由其组成，所述其他结合单位优选地也是纳米抗体。所述蛋白或多肽在本文还称为“多特异性的”蛋白或多肽，或称为“多特异性的构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点(一些优选的、但非限制性的多特异性构建体将通过本文的进一步讨论变得清楚)。基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该清楚所述多特异性的构建体；所述多特异性纳米抗体构建体的一些优选的、但非限制性的实例是SEQ ID NO’s：694-729和759-790的构建体。
按照另一个具体的但非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发明的纳米抗体、任选地一个或多个其他纳米抗体、和至少一个赋予本发明的纳米抗体和/或赋予所得到的融合蛋白至少一种需要的特性的其他氨基酸序列(如蛋白或多肽)，或基本上由其组成。同样地，与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，所述融合蛋白可以提供某些的优点。所述氨基酸序列和所述融合构建体的一些非限制性的实例将通过本文的进一步描述变得清楚。
还可以组合两个或多个上述方面，例如，以提供三价双特异性构建体，其包括两个本发明的纳米抗体，和一个其他的纳米抗体，和任选地一个或多个其他的氨基酸序列。所述构建体的其他非限制性的实例，以及在本发明的情形中特别优选的一些构建体，将通过本文的进一步描述变得清楚。
在上述构建体中，所述一个或多个纳米抗体和/或其他氨基酸序列可以直接彼此连接和/或适当地通过一个或多个接头序列彼此连接。所述接头的一些适合的但非限制性的实例将通过本文的进一步所述变得清楚。
在本发明的一个具体的方面中，与本发明相对应的氨基酸序列相比较，本发明的纳米抗体或包括至少一个本发明的纳米抗体的本发明的化合物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步公开的内容，熟练的技术人员应该清楚所述纳米抗体、化合物和多肽的一些优选的但非限制性的实例，且例如，包括已经进行化学修饰(例如，通过聚乙二醇化)提高其半衰期的本发明的纳米抗体序列或多肽；包括至少一个用于结合血清蛋白(如血清白蛋白)的额外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个与至少一个增加本发明的纳米抗体的半衰期的部分(且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的纳米抗体的本发明的多肽。基于本文进一步的公开内容，熟练的技术人员应该清楚包括所述半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例；且例如包括，不限于，这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与下列各项连接：一个或多个血清蛋白或其片段(如血清白蛋白或其适当的片段)，或一个或多个可以结合血清蛋白的结合单位(如例如，可以结合血清蛋白如血清白蛋白、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体或(单)结构域抗体)；这样的多肽，其中本发明的纳米抗体与Fc部分(如人Fc)或其适当的部分或片段连接的多肽(例如，本发明包括其中通过不同尺寸的接头与Fc部分适当地连接的纳米抗体的多肽，以允许RANK-L的分子内和/或分子间结合)；或这样的多肽，其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与可以结合血清蛋白的一个或多个小蛋白或肽(诸如，不限于，记述在WO91/01743，WO 01/45746，WO 02/076489和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年12月5日提交的题目为“Peptides capable ofbinding to serum proteins(能够结合血清蛋白的肽)”的埃博灵克斯股份有限公司的美国临时申请(也参见PCT/EP2007/063348)中的蛋白和肽)连接。
同样地，如熟练的技术人员应该清楚的，所述纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以包含一个或多个另外的基团、残基、部分或结合单位，如一个或多个其他氨基酸序列，且特别是一个或多个另外的纳米抗体(即，不针对RANK-L)，以提供多特异性纳米抗体构建体中的三特异性纳米抗体构建体。
一般地，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或包括其的化合物、构建体或多肽)优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选而非限制性方面中，所述本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。
在本发明的另一个方面中，本发明的多肽包括与允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的一个或多个(诸如两个并且优选一个)氨基酸序列连接(任选地通过一个或多个适当的接头序列连接)的一个或多个(诸如两个或优选一个)本发明的纳米抗体。特别地，允许所得到的本发明的多肽穿过血脑屏障的所述一个或多个氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两个并且优选一个)纳米抗体，诸如在WO 02/057445中所述的纳米抗体，其中FC44(WO 06/040153的SEQ ID NO：189)和FC5(WO 06/040154的SEQ ID NO：190)是优选的实施例。
特别地，包括一个或多个本发明的纳米抗体的多肽优选是这样的，以致它们：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与RANK-L结合。
优选地，包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽优选是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与RANK-L结合。在这一方面中，熟练的技术人员应该清楚，与包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽相比较，包含两个或多个本发明的纳米抗体的多肽可以以增加的抗体亲抗源性结合RANK-L。
对于本发明的氨基酸序列或多肽与RANK-L结合的一些优选的IC50值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。
按照本发明该优选方面的其他多肽可以，例如，选自由与氨基酸序列SEQ ID NO’s：622-729，759-762和766-773中的一种或多种具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％、如99％或更多“序列同一性”(如本文定义)的氨基酸序列组成的组，其中在所述氨基酸序列内包括的所述纳米抗体优选地如本文进一步所定义。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的氨基酸序列(如本发明的纳米抗体)或包括其的本发明的多肽的核酸。同样地，如本文关于本发明的核酸概括所述，这样的核酸可以以遗传构建体的形式存在，如本文定义。
在另一个方面中，本发明涉及表达或能够表达本发明的氨基酸序列(如纳米抗体)和/或包括其的本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明的另一个方面涉及包含或包括至少一个本发明的氨基酸序列、至少一个本发明的多肽和/或至少一个本发明的核酸的产品或组合物，和任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其他成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)，兽医用组合物或用于诊断应用(也如本文所述)的产品或组合物。通过本文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及用于制备或产生本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些优选的但非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与RANK-L相关的疾病和病症的方法。通过本文进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用和用途的实例将变得清楚。
通过下文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用也变得清楚。
一般地，应该注意，术语纳米抗体在用于本文时在其最广泛意义上不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如在下文更详细讨论的，本发明的纳米抗体通常可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”(如本文所述)或者通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种且特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的VH结构域“骆驼源化(camelization)”(如本文所述)，或者通过表达编码这样的骆驼源化的VH结构域的核酸；(5)通过如Ward等(同前所述)所述将“结构域抗体”或“Dab”“骆驼源化”，或者通过表达编码这样的骆驼源化VH结构域的核酸；(6)应用合成或半合成技术制备本身已知的蛋白、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过应用本身已知的核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(8)通过前述一种或多种的任何结合。基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该清楚实行前述的适当的方法和技术，并且例如包括本发明更详细描述的方法和技术。
一个优选的纳米抗体种类对应于针对RANK-L的天然存在的重链抗体的VHH结构域。如本文进一步所述，这样的VHH序列通常可以这样产生或获得：通过用RANK-L适当免疫骆驼科动物物种(即，以产生针对RANK-L的免疫反应和/或重链抗体)，通过获得来自所述骆驼科动物的适当的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B-细胞样品)，并且通过利用本身已知的任何适当技术从所述样品开始产生针对RANK-L的VHH序列。所述技术对于熟练的技术人员应该是清楚的，和/或在本文中进一步所述。
备选地，所述针对RANK-L天然存在的VHH结构域可以从首次用于实验的骆驼科动物VHH序列文库获得，例如，通过使用本身已知的一种或多种筛选技术用RANK-L、或其至少一部分、片段、抗原决定簇或表位筛选这样的文库。例如，这样的文库和技术记述在WO 99/37681，WO 01/90190，WO 03/025020和WO 03/035694中。备选地，可以使用来源自首次用于实验的VHH文库的改进的合成的或半合成的文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR重排的技术从首次用于实验的VHH文库获得的VHH文库，如例如记述在WO 00/43507中获得。
因此，在另一个方面中，本发明涉及用于产生针对RANK-L的纳米抗体的方法。在一个方面中，所述方法至少包括下列步骤：
a)提供纳米抗体序列的组、集合或文库；和
b)从所述纳米抗体序列的组、集合或文库中筛选可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和力的纳米抗体序列；
和
c)分离所述可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的氨基酸序列。
在这样的方法中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的首次用于实验的组、集合或文库；纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库。
在本方法的优选方面中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的免疫组、集合或文库，特别是，来自已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科物种的VHH序列的免疫组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，所述纳米抗体或VHH序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选纳米抗体序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域熟练的技术人员将是清楚的，例如，基于本发明进一步的公开内容。还参考WO 03/054016和Hoogenboom在Nature Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面中，所述用于产生纳米抗体序列的方法包括至少下列步骤：
a)提供来源于骆驼科物种的表达免疫球蛋白序列的细胞的集合或样品；和
b)从所述细胞集合或样品中筛选：(i)表达可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和力的免疫球蛋白序列的细胞；和(ii)表达重链抗体的细胞，其中亚步骤(i)和(ii)可以基本上按照一个筛选步骤或作为两个独立的筛选步骤以任何适当的顺序进行，以提供至少一种表达可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和力的重链抗体的细胞；
和
c)(i)从所述细胞分离存在于所述重链抗体中的VHH序列；或(ii)从所述细胞分离编码存在于所述重链抗体中的VHH序列的核酸序列，然后表达所述VHH结构域
在该方面所述的方法中，所述细胞的集合或样品可以是，例如，B细胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位
上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于熟练的技术人员将是清楚的。例如，参考EP 0542810，WO 05/19824，WO 04/051268和WO04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。对于此，例如，参考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No.12，3820。特别参考在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请WO 06/079372中记述的所谓的“纳米抗体TM”技术。
在另一个方面中，所述用于产生针对RANK-L的氨基酸序列的方法可以包括至少下列步骤：
a)提供编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性的重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列；
和
c)分离所述核酸序列，然后分别表达存在于所述重链抗体中的VHH序列、或表达所述纳米抗体序列。
在这样的方法中，所述编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库可以是，例如，编码重链抗体或VHH序列的首次用于实验的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码纳米抗体序列的合成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是编码重链抗体或VHH序列的核酸序列的免疫的组、集合或文库，所述核酸序列来源于已经用RANK-L适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域熟练的技术人员将是清楚的，例如，基于本文进一步的公开内容。还参考WO 03/054016和Hoogenboom在自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
熟练的技术人员应该清楚，本文所述的方法的筛选步骤也可以作为选择步骤进行。因此，术语“筛选”在用于本说明书时，可以包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任何适当的组合。此外，当使用序列的组、集合或文库时，它可以包含任何适当数量的序列，如1，2，3或约5，10，50，100，500，1000，5000，104，105，106，107，108或更多序列。
此外，上述氨基酸序列的组、集合或文库中的一个或多个或全部序列可以通过理性的、或半经验的方法如计算机建模技术或生物统计学或数据收集(datamining)技术获得或定义。
此外，这样的组、集合或文库可以包括作为来自另一种的变体(例如，具有设计的点突变或具有随机的位置)的一个、两个或多个序列，包括(compromise)来源于不同的天然多样性序列的组(例如，免疫文库)的多个序列，或不同序列的任何其他来源(例如，如在Hoogenboom等，NatBiotechnol(自然生物技术)23：1105，2005和Binz等，Nat Biotechnol(自然生物技术)2005，23：1247中所述)。所述序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面上，且在这些载体内与编码所述氨基酸序列的核苷酸序列连接。这使得所述组、集合或文库易于进行选择步骤，从而分离需要的本发明的氨基酸序列。更一般地，当将序列展示在适当的宿主或宿主细胞上时，还可以(且习惯上)首先从所述宿主或宿主细胞分离编码所需要的序列的核苷酸序列，然后通过在适当的宿主生物体内适当表达所述核苷酸序列而获得所需要的序列。同样地，这可以以本身已知的任何适当的方式进行，其是熟练的技术人员应该清楚的。
用于获得针对RANK-L的VHH序列或纳米抗体序列的另一种技术包括适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对RANK-L的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得包含(编码)所述VHH序列或纳米抗体序列(的核酸序列)的适当的生物样品(如血液样品、血清样品或B-细胞样品)，然后使用本身已知的任何适当的技术(如例如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)由所述样品起始产生针对RANK-L的VHH序列。例如，为了该目的，可以使用记述在WO 02/085945，WO 04/049794和WO 06/008548和Janssens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美国国家科学院学报)200610月10日；103(41)：15130-5中的表达重链抗体的小鼠和其他方法和技术。例如，所述表达重链抗体的小鼠可以表达具有任何适当的(单)可变结构域、如来源于天然来源的(单)可变结构域(例如，人(单)可变结构域、骆驼科(单)可变结构域或鲨鱼(单)可变结构域)、以及例如合成的或半合成的(单)可变结构域的重链抗体。
本发明还涉及通过上述方法、或备选地通过包括上述方法之一和另外至少下列步骤的方法获得的VHH序列或纳米抗体序列，所述步骤为：确定所述VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本身已知的方式，如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达或通过化学合成，表达或合成所述VHH序列或纳米抗体序列。
如本文提及，本发明纳米抗体的一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列相对应的但是已被“人源化”的氨基酸序列的纳米抗体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(并且，特别是在构架序列中的)的一个或多个氨基酸残基(例如上文所示)。这可以以本身已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述以及本文引用的关于人源化的现有技术。此外，应该注意，本发明这样的人源化纳米抗体可以以本身已知的任何适当方法获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VHH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
本发明纳米抗体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的VH结构域的氨基酸序列相对应但已被“骆驼源化”的氨基酸序列的纳米抗体，“骆驼源化”即，用在重链抗体的VHH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式进行，这对于熟练的技术人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述。这样的“骆驼源化”取代优选插入在形成和/或存在于VH-VL界面的氨基酸位置，和/或在所谓的骆驼科动物(Camelidae)标志残基，如本文所定义(参见例如WO94/04678和Davies与Riechmann(1994和1996)，同前所述)。优选地，用作产生或设计所述骆驼源化纳米抗体的起始原料或起点的VH序列优选地是来自哺乳动物的VH序列，更优选地是人类的VH序列，诸如VH3序列。然而，应该注意，这种骆驼源化的本发明纳米抗体可以以本身已知的任何适当方式获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然存在的VH结构域的多肽作为起始原料而获得的多肽。
例如，又如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼源化”可以这样进行：通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，并且然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，以致新核苷酸序列分别编码“人源化的”或“骆驼源化的”本发明的纳米抗体。然后以本身已知的方式表达这种核酸，以提供理想的本发明的纳米抗体。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的氨基酸序列，然后应用本身已知的肽合成技术从头开始合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所述理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的核苷酸序列，然后应用本身已知的核酸合成技术从头开始合成，之后可以以本身上已知的方式表达这样获得的核酸，以提供合乎需要的本发明的纳米抗体。
熟练的技术人员应该清楚从天然存在的VH序列或优选的VHH序列起始而获得本发明的纳米抗体和/或编码其的核酸的其它适宜方法和技术，并且例如，可以包括以适当方式组合一个或多个天然存在的VH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)，一个或多个天然存在的VHH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)，和/或一个或多个合成的或半合成的序列，以提供本发明的纳米抗体或编码其的核苷酸序列或核酸(然后其可以被适当地表达)。基于本文的公开内容和/或本文引用的其他现有技术(和/或备选地可以通过由使用本文所述的方法获得的核苷酸序列起始的PCR获得)，编码VHH序列或纳米抗体的构架序列的核苷酸序列为熟练的技术人员所清楚，且可以适当地与编码需要的CDR’s的核苷酸序列(例如，通过利用重叠引物的PCR装配)组合，以提供编码本发明的纳米抗体的核酸。
如本文提及，纳米抗体可以特别特征在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmark residues)”(如本文所述)。
因此，按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，所述多肽包括：
a)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中在按照Kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是Q；
和/或：
b)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本发明所定义)或半胱氨酸残基，并且在位置44的氨基酸残基优选是E；
和/或：
c)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸或半胱氨酸，并且按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基优选是E；和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，纳米抗体在其最广泛意义上可以通常定义为这样的多肽，所述多肽包括：
a)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或：
b)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或：
c)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，并且特别是选自由R和S组成的组。
因此，在一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，按照本发明针对RANK-L的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中
a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
和/或其中：
b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
和/或其中：
c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
特别地，按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体通常可以定义为包括包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列的多肽，其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；和
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地是W或R，并且最优选地为W；
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
或者其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q；
或者其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；和
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；和
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；和
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
因此，在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；
并且其中：
a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；
并且其中：
a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地选自由W或R组成的组，并且最优选地为W；
并且其中：
a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；
并且其中：
b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；
并且其中：
b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W；
并且其中：
b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；
并且其中：
c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；
并且其中：
c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；
并且其中：
c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q；
并且其中：
d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
本发明纳米抗体的两个特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述(a-1)到(a-4)；按照上述b)；按照上述(b-1)到(b-4)；按照上述(c)；和/或按照上述(c-1)到(c-4)的那些，其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本文所述的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
或其中：
ii)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或如本文所述的KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如本发明定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选是Q；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在所述其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基最优选是F。在所述其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，L，V或F组成的组，并且最优选是V。
因此，但不以任何方式局限于此，基于在上述位置存在的氨基酸残基，本发明的纳米抗体可以通常基于下述三组分类：
i)“GLEW-组”：按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有V，并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表A-3中提及的那些。更一般地，且不限于，属于GLEW-组的纳米抗体可以定义为在位置44具有G和/或在位置47具有W的纳米抗体，其中位置46通常为E，且其中优选地位置45不是带电荷的氨基酸残基且不是半胱氨酸；
ii)“KERE-组”：按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE(或另一个KERE-样序列)并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。更一般地，且不限于，属于KERE-组的纳米抗体可以定义为在位置44具有K，Q或R(通常为K)的纳米抗体，其中位置45是带电荷的氨基酸残基或半胱氨酸，且位置47如本文进一步所定义；
iii)“103 P，R，S-组”：在位置103具有P，R或S的纳米抗体。这些纳米抗体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F结合(如关于KERE-组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具有Q或L，并且优选地具有Q。
此外，在适当的情形中，纳米抗体可以属于这些种类的两种或更多种(即，具有其特征)。例如，一个特别优选的纳米抗体组在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)；并且在位置108具有Q(其可以是对L人源化的)。
更一般地，应该注意，上述定义描述和应用于以天然(即，非人源化的)VHH序列的形式存在的纳米抗体，且这些纳米抗体的人源化的变体可以包含除了上述显示的那些(即，如本文定义的一个或多个人源化的取代)之外的其他氨基酸残基。例如，且不限于，在GLEW-组或103P，R，S-组的一些人源化的纳米抗体中，在位置108的Q可以被人源化为108L。如本文已经提及的，基于本文的公开内容，其他人源化的取代(及其适当的组合)将为熟练的技术人员所清楚。另外，或备选地，其他潜在有用的人源化取代可以通过将天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列进行比较而确定，之后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，且由此人源化的VHH序列可以检测针对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他需要的特性。以这种方式，通过有效程度的试验和误差，其他适当的人源化取代(或其适当的组合)可以由熟练的技术人员基于本文的公开内容确定。此外，基于前述，纳米抗体(的构架区)可以被部分人源化或完全人源化。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于KERE-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于103P，R，S-组(如本发明所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103P，R，S残基之外，本发明的纳米抗体可以在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的VH序列同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如表A-2中提及)。这样的取代包括，但不限于下表A-3中提及的GLEW-样序列；以及国际申请WO 00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的取代，例如以获得在位置108具有Q和在位置44-47具有KLEW组合的纳米抗体。基于本发明的公开内容，在这些位置的其它可能的取代对于熟练的技术人员应该是清楚的。
在本发明的纳米抗体的一个方面中，在位置83的氨基酸残基选自由L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。
此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置83的氨基酸残基选自由R，K，N，E，G，I，T和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。在一个方面中，位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，DT，和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。
此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置104的氨基酸残基选自由G和D组成的组；并且最优选地是G。
总而言之，在所述纳米抗体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述标志残基以及在最接近的相关的人VH结构域，即VH3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表A-3中。
在天然存在的VHH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选但非限制性的组合在表A-4中提及。为了比较，将叫作DP-47的人VH3的相对应氨基酸残基以斜体显示。
表A-3：纳米抗体中的标志残基
在所述纳米抗体中，在除所述标志残基外的任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的VHH结构域的相应位置(按照Kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。
熟练的技术人员对于这样的氨基酸残基应该是清楚的。表A-5-A-8提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的任一位置(按照Kabat编号方式)。对于任一位置，在天然存在的VHH结构域的任一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米抗体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的VHH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持Chothia(同前所述)的构成编号方式的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成CDR1的部分。)
在表A-5-A-8中，还已经提及可以在人VH3结构域的任一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人VH3结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。
仅是为了参考，表A-5-A-8还包含对于代表性样品1118VHH序列关于在每个氨基酸位置的VHH熵(“VHHEnt.”)和VHH可变性(“VHH Var.”)的数据(数据由乌得勒支大学(Utrecht University)的David Lutje Hulsing和TheoVerrips教授馈赠)。关于VHH熵和VHH可变性的数值提供对于被分析的1118VHH序列之间的氨基酸残基的可变性和保守度的测量：低数值(即＜1，诸如＜0.5)表示在所述VHH序列之间氨基酸残基是高度保守的(即，几乎没有可变性)。例如，在位置8的G和在位置9的G分别具有0.1和0的VHH熵数值，这表示这些残基是高度保守的，并且具有很小的可变性(并且假设在所分析的所有1118序列中位置9是G)，而对于形成CDR部分的残基通常发现1.5或更大的数值(数据未显示)。注意：(1)在表A-5-A-8第二栏列出的氨基酸残基是基于比最后两栏引用的为确定VHH熵和VHH可变性而分析的1118VHH序列大的样品；并且(2)下述数据支持这样的假说：在位置27-30的氨基酸残基以及还可能甚至在位置93和94的氨基酸残基已经形成CDR的一部分(尽管本发明不限于任何具体的假说或解释，并且如上文所提及，本发明使用按照Kabat的编号方式)。对于序列熵的一般解释，序列可变性以及用于确定其的方法，参见Oliveira等，蛋白质：结构，功能和遗传(PROTEINS：Structure，Function and Genetics)，52：544-552(2003)。
表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-6：FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-8：FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基；
并且其中：
ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如本发明的一个更优选的方面而定义。
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
特别地，本发明的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中：
i)(优选地)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基(应该理解，VHH序列应该包含一个或多个标志残基；并且部分人源化的纳米抗体应该通常，且优选地，[仍然]包含一个或多个标志残基[尽管依据本发明在适当的情形中提供部分人源化的纳米抗体也在本发明的范围内，在所述部分人源化的纳米抗体中，所有的标志残基，而不是一个或多个其余氨基酸残基，已经被人源化]；并且在完全人源化的纳米抗体中，依据本发明在适当的情形中，所有在标志残基位置上的氨基酸残基应该是在人VH3序列中存在的氨基酸残基。基于本发明公开的内容，熟练的技术人员应该清楚，所述VHH序列、所述具有至少一个标志残基的部分人源化的纳米抗体、所述不具有标志残基的部分人源化的纳米抗体、和所述完全人源化的纳米抗体均形成本发明的方面)；
并且其中：
ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：1-22中的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQ ID NO’s：1-22中用X表示)；
iii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
特别地，本发明KERE-组的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：
i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；
且其中：
ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-10：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列。
  KERE FW1序列号1   SEQ ID NO：23   QVQRVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSS
  KERE FW1序列号2   SEQ RD NO：24   QVQLVESGGGLVQTGDSLSLSCSASGRTFS
  KERE FW1序列号3   SEQ ID NO：25   QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAATGRAFG
  KERE FW1序列号4   SEQ ID NO：26   AVQLVESGGGLVQPGESLGLSCVASGRDFV
  KERE FW1序列号5   SEQIDNO：27   EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEVLGRTAG
  KERE FW1序列号6   SEQ ID NO：28   QVQLVESGGGWVQPGGSLRLSCAASETILS
  KERE FW1序列号7   SEQ ID NO：29   QVQLVESGGGTVQPGGSLNLSCVASGNTFN
  KERE FW1序列号8   SEQID NO：30   EVQLVESGGGLAQPGGSLQLSCSAPGFTLD
  KERE FW1序列号9   SEQ ID NO：31   AQELEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN
且其中：
iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-11：KERE-组纳米抗体的代表性FW2序列。
  KERE FW2序列号1   SEQ ID NO：41   WFRQAPGKEREFVA
  KERE FW2序列号2   SEQID NO：42   WFRQTPGREREFVA
  KERE FW2序列号3   SEQ ID NO：43   WYRQAPGKQREMVA
  KERE FW2序列号4   SEQ ID NO：44   WYRQGPGKQRELVA
  KERE FW2序列号5   SEQ ID NO：45   WIRQAPGKEREGVS
  KERE FW2序列号6   SEQ ID NO：46   WFREAPGKEREGIS
  KERE FW2序列号7   SEQ ID NO：47   WYRQAPGKERDLVA
  KERE FW2序列号8   SEQ ID NO：48   WFRQAPGKQREEVS
  KERE FW2序列号9   SEQ ID NO：49   WFRQPPGKVREFVG
且其中：
iv)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-12：KERE-组纳米抗体的代表性FW3序列。
  KERE FW3序列号1   SEQ ID NO：50   RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYRCYF
  KERE FW3序列号2   SEQ ID NO：51   RFAISRDNNKNTGYLQMNSLEPEDTAVYYCAA
  KERE FW3序列号3   SEQ ID NO：52   RFTVARNNAKNTVNLEMNSLKPEDTAVYYCAA
  KERE PW3序列号4   SEQ ID NO：53   RFTISRDIAKNTVDLLMNNLEPEDTAVYYCAA
  KERE FW3序列号5   SEQ ID NO：54   RLTISRDNAVDTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
  KERE FW3序列号6   SEQ ID NO：55   RFTISRDNAKNTVYLQMDNVKPEDTAIYYCAA
  KERE FW3序列号7   SEQ ID NO：56   RFTISKDSGKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCAT
  KERE FW3序列号8   SEQ ID NO：57   RFTISRDSAKNMMYLQMNNLKPQDTAVYYCAA
  KERE FW3序列号9   SEQ ID NO：58   RFTISRENDKSTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAA
  KERE FW3序列号10   SEQ ID NO：59   RFTISRDYAGNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCAT
且其中：
v)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-13：KERE-组纳米抗体的代表性FW4序列。
  KERE FW4序列号1   SEQ ID NO：60   WGQGTQVTVSS
  KERE FW4序列号2   SEQID NO：61   WGKGTLVTVSS
  KERE FW4序列号3   SEQID NO：62   RGQGTRVTVSS
  KERE FW4序列号4   SEQ ID NO：63   WGLGTQVTISS
且其中：
vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，一个或多个其他标志残基优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
此外，上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
关于构架1，熟练的技术人员应该清楚，当上述氨基酸序列通过表达核苷酸序列而产生时，前4个氨基酸序列(即，按照Kabat编号方式的氨基酸残基1-4)可以通常通过已经用来生成所述核酸的引物来确定。因此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选忽略前4个氨基酸残基。
此外，关于构架1，且尽管按照Kabat编号方式的氨基酸位置27-30被认为是构架区的一部分(且不是CDR’s)，通过分析多于1000个VHH序列的数据库已经发现，位置27-30具有比在位置1-26的可变性高得多的可变性(以VHH熵和VHH可变性表示----参见表A-5-A-8)。因为此，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地也忽略在位置27-30的氨基酸残基。
考虑到此，KERE种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列，其中：
i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；
且其中：
ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-14：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
KERE FW1序列号10     SEQ ID NO：32  VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
KERE FW1序列号11     SEQ ID NO：33  VDSGGGLVQAGDSLKLSCALTG
  KERE FW1序列号12   SEQ ID NO：34   VDSGGGLVQAGDSLRLSCAASG
  KERE FW1序列号13   SEQ ID NO：35   VDSGGGLVEAGGSLRLSCQVSE
  KERE FW1序列号14   SEQ ID No：36   QDSGGGSVQAGGSLKLSCAASG
  KERE FW1序列号15   SEQ ID NO：37   VQSGGRLVQAGDSLRLSCAASE
  KERE FW1序列号16   SEQ ID NO：38   VESGGTLVQSGDSLKLSCASST
  KERE FW1序列号17   SEQ ID NO：39   MESGGDSVQSGGSLTLSCVASG
  KERE FW1序列号18   SEQ ID NO：40   QASGGGLVQAGGSLRLSCSASV
且其中：
iii)FR2，FR3和FR4如本文关于KERE-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中
i)优选地，当所述GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基是Q；
ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-15：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW1序列
  GLEW FW1序列号1   SEQ ID NO：64   QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS
  GLEW FW1序列号2   SEQ ID NO：65   EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK
  GLEW FW1序列号3   SEQ ID NO：66   QVKLEESGGGLAQPGGS LRLSCVASG FTFS
  GLEW FW1序列号4   SEQ ID NO：67   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT
  GLEW FW1序列号5   SEQ ID NO：68   EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS
且其中：
iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-16：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW2序列。
  GLEW FW2序列号1   SEQ ID NO：72   WVRQAPGKVLEWVS
  GLEW FW2序列号2   SEQ ID NO：73   WVRRPPGKGLEWVS
  GLEW FW2序列号3   SEQ ID NO：74   WVRQAPGMGLEWVS
  GLEW FW2序列号4   SEQ ID NO：75   WVRQAPGKEPEWVS
  GLEW FW2序列号5   SEQ ID NO：76   WVRQAPGKDQEWVS
  GLEW FW2序列号6   SEQ ID NO：77   WVRQAPGKAEEWVS
  GLEW FW2序列号7   SEQ ID NO：78   WVRQAPGKGLEWVA
  GLEW FW2序列号8   SEQ ID NO：79   WVRQAPGRATEWVS
且其中：
iV)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-17：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW3序列。
  GLEW FW3序列号1   SEQ ID NO：80   RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCVK
  GLEW FW3序列号2   SEQ ID NO：81   RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR
  GLEW FW3序列号3   SEQ ID NO：82   RFTSSRDNAKSTLYLQMNDLKPEDTALYYCAR
  GLEW FW3序列号4   SEQ ID NO：83   RFIISRDNAKNTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR
  GLEW FW3序列号5   SEQ ID NO：84   RFTASRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTARYYCAR
  GLEW FW3序列号6 SEQ ID NO：85 RFTISRDNAKNTLYLQMDDLQSEDTAMYYCGR
且其中：
V)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-18：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW4序列。
  GLEW FW4序列号1   SEQ ID NO：86   GSQGTQVTVSS
  GLEW FW4序列号2   SEQ ID NO：87   LRGGTQVTVSS
  GLEW FW4序列号3   SEQ ID NO：88   RGQGTLVTVSS
  GLEW FW4序列号4   SEQ ID NO：89   RSRGIQVTVSS
  GLEW FW4序列号5   SEQ ID NO：90   WGKGTQVTVSS
  GLEW FW4序列号6   SEQ ID NO：91   WGQGTQVTVSS
且其中：
vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
关于构架1，同样熟练的技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。
考虑到此，GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)优选地，当GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位置108的氨基酸残基为Q；
且其中：
ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-19：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
  GLEW FW1序列号6   SEQ ID NO：69   VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
  GLEW FW1序列号7   SEQ ID NO：70   EESGGGLAQPGGSLRLSCVASG
  GLEW FW1序列号8   SEQ ID NO：71   VESGGGLALPGGSLTLSCVFSG
且其中：
iii)FR2，FR3和FR4如本文关于GLEW-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是VHH序列或部分人源化的纳米抗体时)。
P，R，S 103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；
且其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或S，且更优选是R；
且其中：
iii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-20：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW1序列。
  P，R，S 103 FW1序列号1   SEQ ID NO：92   AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS
  P，R，S 103 FW1序列号2   SEQ ID NO：93   QVQLQESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFDFG
  P，R，S 103 FW1序列号3   SEQ ID NO：94   EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK
  P，R，S 103 FW1序列号4   SEQ ID NO：95   QVQLAESGGGLVQPGGSLKLSCAASRTIVS
  P，R，S 103 FW1序列号5   SEQ ID NO：96   QEHLVESGGGLVDIGGSLRLSCAASERIFS
  P，R，S 103 FW1序列号6   SEQ ID NO：97   QVKLEESGGGLAQPGGSLRLSCVASGFTFS
  P，R，S 103 FW1序列号7   SEQ ID NO：98   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT
  P，R，S 103 FW1序列号8   SEQ ID NO：99   EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS
且其中：
iV)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-21：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW2序列。
  P，R，S 103 FW2序列号1   SEQ ID NO：102   WFRQAPGKEREFVA
  P，R，S 103 FW2序列号2   SEQ ID NO：103   WVRQAPGKVLEWVS
  P，R，S 103 FW2序列号3   SEQ ID NO：104   WVRRPPGKGLEWVS
  P，R，S 103 FW2序列号4   SEQ ID NO：105   WIRQAPGKEREGVS
  P，R，S 103 FW2序列号5   SEQ ID NO：106   VVVRQYPGKEPEWVS
  P，R，S 103 FW2序列号6   SEQ ID NO：107   WFRQPPGKEHEFVA
  P，R，S 103 FW2序列号7   SEQ ID NO：108   WYRQAPGKRTELVA
  P，R，S 103 FW2序列号8   SEQ ID NO：109   WLRQAPGQGLEWVS
  P，R，S 103 FW2序列号9   SEQ ID NO：110   WLRQTPGKGLEWVG
  P，R，S 103 FW2序列号10   SEQ ID NO：111   WVRQAPGKAEEFVS
且其中：
V)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-22：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW3序列。
  P，R，S 103 FW3序列号1   SEQ ID NO：112   RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA
  P，R，S 103 FW3序列号2   SEQ ID NO：113   RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR
  P，R，S 103 FW3序列号3   SEQ ID NO：114   RFTISRDNAKNEMYLQMNNLKTEDTGVYWCGA
  P，R，S 103 FW3序列号4   SEQ ID NO：115   RFTISSDSNRNMIYLQMNNLKPEDTAVYYCAA
  P，R，S 103 FW3序列号5   SEQ ID NO：116   RFTISRDNAKNMLYLHLNNLKSEDTAVYYCRR
  P，R，S 103 FW3序列号6   SEQ ID NO：117   RFTISRDNAKKTVYLRLNSLNPEDTAVYSCNL
  P，R，S 103 FW3序列号7   SEQ ID NO：118   RFKISRDNAKKTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR
  P，R，S 103 FW3序列号8   SEQ ID NO：119   RFTVSRDNGKNTAYLRMNSLKPEDTADYYCAV
且其中：
Vi)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列：
表A-23：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW4序列。
  P，R，S 103 FW4序列号1   SEQ ID NO：120   RGQGTQVTVSS
  P，R，S 103 FW4序列号2   SEQ ID NO：121   LRGGTQVTVSS
  P，R，S 103 FW4序列号3   SEQ ID NO：122   GN KGTLVTVSS
  P，R，S 103 FW4序列号4   SEQ ID NO：123   SSPGTQVTVSS
  P，R，S 103 FW4序列号5   SEQ ID NO：124   SSQGTLVTVSS
  P，R，S 103 FW4序列号6   SEQ ID NO：125   RSRGIQVTVSS
且其中：
Vii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们为VHH序列或部分人源化的纳米抗体时。)
关于构架1，同样熟练的技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。
考虑到此，P，R，S 103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：
i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；
且其中：
ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或S，且更优选是R；
且其中：
iii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：
表A-24：P，R，S 103--组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。
 P，R，S 103 FW1序列号9   SEQ ID NO：100   VESGGGLVQAGGSLRLSCAASG
 P，R，S 103 FW1序列号10   SEQ ID NO：101   AESGGGLVQPGGSLKLSCAASR
且其中：
iv)FR2，FR3和FR4如本文关于P，R，S 103-种类的纳米抗体的FR2，FR3和FR4所提及的；
且其中：
v)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本发明的一个优选方面而定义，并且更优选地如按照本发明的一个更优选的方面而定义。
上述纳米抗体可以，例如，是VHH序列或可以是人源化的纳米抗体。当上述纳米抗体序列为VHH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。
在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是VHH序列或部分人源化的纳米抗体时)。
在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明涉及如上文所述的纳米抗体，其中CDR序列与氨基酸序列SEQ ID NO’s：560-621中的至少一种的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选地至少80％的氨基酸同一性，更优选地至少90％的氨基酸同一性，如95％的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％的氨基酸同一性。这种氨基酸同一性程度可以，例如，通过确定在所述纳米抗体和SEQ ID NO’s：560-621的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度(以本文所述的方式)而确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。
如本文已经提及的，本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：560-621组成的组，或选自由与氨基酸序列SEQ ID NO’s：560-621中的至少一种具有大于80％、优选大于90％、更优选大于95％、如99％或更多的序列同一性(如本文定义)的氨基酸序列组成的组。
此外，在上述纳米抗体中：
i)与SEQ ID NO’s：560-621的相对应氨基酸序列相比，任何氨基酸取代(当其不是如本文定义的人源化取代时)优选是保守氨基酸取代，(如本文所定义)；
和/或：
ii)与SEQ ID NO’s：560-621的相对应氨基酸序列相比，其氨基酸序列优选地包含仅一个氨基酸取代，或另外优选地不多于5个、优选地不多于3个、且更优选地仅1或2个氨基酸删除或插入；
和/或
iii)CDR’s可以是利用亲和力成熟，例如，由SEQ ID NO’s：560-621的相对应氨基酸序列的CDR’s起始来源的CDR’s。
优选地，在本发明的纳米抗体中的CDR序列和FR序列是这样的，以致本发明的纳米抗体(和包括其的本发明的多肽)：
-以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的kon-速率与RANK-L结合；
和/或这样，以致它们：
-以1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的koff速率与RANK-L结合。
优选地，在本发明的纳米抗体中存在的CDR序列和FR序列是这样的，以致本发明的纳米抗体将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力与RANK-L结合。
按照本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人VH结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，按照本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限制条件：与天然存在的人VH结构域的相对应的构架区相比，并且特别是与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108，103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，纳米抗体应该在FR2和/或FR4中的至少一种中，并且特别是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基(同样，(包括在位置108，103和/或45的那些))与天然存在的VH结构域具有至少一个这样的氨基酸差异。
此外，人源化的本发明的纳米抗体可以如本发明所定义，但是具有这样的限制条件：与天然存在的VHH结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区具有“至少一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，按照本发明的一个非限制性方面，人源化的纳米抗体可以如本文所定义，但是具有下述限制条件：与天然存在的VHH结构域的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置108，103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，人源化的纳米抗体应该在FR2和/或FR4中的至少一个、并且特别是在FR2和/或FR4中的至少一个标志残基(同样，包括在位置108，103和/或45的那些)关于天然存在的VHH结构域具有至少一个所述氨基酸差异。
从本发明的公开内容应该清楚，使用如本发明所定义的本发明的纳米抗体的天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直向同源物(本发明笼统称为“类似物”)，并且特别是SEQ ID NO’s：560-621的纳米抗体的类似物也在本发明的范围之内。因此，按照本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛意义上还涵盖所述类似物。
通常，在所述类似物中，与如本发明所定义的本发明纳米抗体相比，一个或多个氨基酸残基可以被取代、删除和/或添加。这样的取代、插入或删除可以在一个或多个构架区和/或在一个或多个CDR内进行。当所述取代、插入或删除在一个或多个构架区内进行时，它们可以在一个或多个标志残基处和/或在构架残基中的一个或多个其它位置进行，尽管通常较不优选在标志残基处的取代、插入或删除(除非这些是如本文所述的适当的人源化取代)。
通过非限制性实例的方式，例如，取代可以是保守取代(如本文所述)和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个VHH结构域中相同位置处的另一个氨基酸残基取代(关于这样的取代的一些非限制性实例参见表A-5-A-8)，尽管本发明通常不限于此。因此，在本发明的范围内包括任何一个或多个取代、删除或插入，或它们的任何组合，所述取代、删除或插入或其组合改善本发明的纳米抗体的特性，或至少没有将本发明的纳米抗体的理想特性或理想特性的平衡或组合减损太多(即，到所述纳米抗体不再适合其目的应用的程度)。基于本发明的公开内容，以及任选地在有限程度的常规实验之后，例如，常规实验可以包括引入有限数目的可能的取代并且确定它们对这样获得的纳米抗体特性的影响，熟练的技术人员通常应该能够确定并且选择适当的取代、删除或插入、或它们的适当的组合。
例如，并且取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主生物体，所述删除和/或取代可以以这样的方式设计，所述方式去除一个或多个翻译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这应该在本领域技术人员的能力范围内。备选地，可以设计取代或插入，以引入一个或多个附着官能团(如本文所述)的位点，例如，以允许位点-特异性的聚乙二醇化(pegylation)(同样如本文所述)。
从在上述表A-5-A-8中提供的关于VHH熵和VHH可变性的数据可以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何取代、删除或插入。此外，通常，氨基酸取代优于氨基酸删除或插入。
所述类似物优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量的和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地表示为IC50值，如本发明进一步所述)结合RANK-L。
所述类似物优选还是这样的，以致它们保留所述纳米抗体的有利特性，如本文所述。
此外，按照一个优选的方面，所述类似物与SEQ ID NOs：560-621的一个纳米抗体具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、如至少95％或99％或更多的序列同一性程度；和/或优选地具有至多20个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个、如4，3，2或仅有1个氨基酸差异(如本文定义)。
此外，所述类似物的构架序列和CDR’s优选是这样的，以致它们与本文定义的优选方面一致。更一般地，如本文所述，所述类似物具有：(a)在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带电荷氨基酸或半胱氨酸残基，和优选地在位置44为E，更优选地在位置44为E和在位置45为R；和/或(c)在位置103的P，R或S。
本发明纳米抗体的类似物的一个优选的种类包括已经被人源化的纳米抗体(即，与天然存在的本发明的纳米抗体的序列相比较)。如在本发明引用的背景技术中提及的，这样的人源化通常包括用在人VH结构域如人VH3结构域中相同位置存在的氨基酸残基取代在天然存在的VHH序列中的一个或多个氨基酸残基。熟练的技术人员应该清楚可能的人源化取代的实例或人源化取代的组合，例如，从本发明的表格，从在本发明引用的背景技术中提及的可能的人源化取代，和/或从纳米抗体序列和天然存在的人VH结构域序列之间的比较获知。
所述人源化取代应该这样选择，以致所得到的人源化的纳米抗体仍然保留如本发明所定义的纳米抗体的有利特性，并且更优选这样选择，以致它们如在前段中关于类似物的描述。基于本文的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验包括，例如，引入有限数量的可能的人源化取代，并且确定它们对这样获得的纳米抗体的特性的影响，熟练的技术人员通常能够确定并选择适当的人源化取代或适当的人源化取代的组合。
一般地，作为人源化的结果，本发明的纳米抗体可以变得更加“人-样”，同时仍然保留如本发明所述的本发明的纳米抗体的有利特性。结果，与相对应的天然存在的VHH结构域相比，这样人源化的纳米抗体可以具有一些优点，诸如减小的免疫原性。同样，基于本发明的公开内容，并且任选在有限程度的常规实验之后，熟练的技术人员应该能够选择人源化取代或适当的人源化取代组合，其最优化或获得一方面在通过人源化取代提供的有利特性和另一方面在天然存在的VHH结构域的有利特性之间的理想的或适当的平衡。
本发明的纳米抗体可以在任何构架残基处被适当人源化，诸如在一个或多个标志残基处(如本文所定义)或在一个或多个其它构架残基处(即，非标志残基)或它们的任何适当的组合。关于“P，R，S-103组”或“KERE组”的纳米抗体的一个优选的人源化取代是将Q108取代成L108。“GLEW种类”的纳米抗体也可以通过将Q108取代成L108被人源化，条件是其它标志残基中的至少一个含有骆驼科动物(骆驼源化)取代(如本文所定义)。例如，如上文所提及，人源化的纳米抗体的一个特别优选的种类在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)，并且在位置108具有L。
人源化的和其它类似物，以及编码其的核酸序列，可以以本身已知的任何方式提供。例如，所述类似物可以这样获得：通过提供编码天然存在的VHH结构域的核酸，将要被取代的一个或多个氨基酸残基的密码子改变成相对应的合乎需要的氨基酸残基的密码子(例如，通过位点定向诱变或通过使用适当错配的引物进行的PCR)，在适当的宿主或表达系统中表达这样获得的核酸/核苷酸序列；并且任选地分离和/或纯化这样获得的类似物，以提供基本上分离形式(如本文进一步所述)的所述类似物。这通常可以应用本身已知的方法和技术而进行，所述方法和技术应该是熟练的技术人员所清楚的，例如从手册和本文所引用的参考文献、本文引用的背景技术和/或从本文的进一步描述中可知。备选地，编码所述需要的类似物的核酸可以以本身已知的方法合成(例如使用用于合成具有预先确定氨基酸序列的核酸序列的自动装置)，并且然后可以如本文所述进行表达。另一种技术可以包括组合一个或多个分别编码所述理想的类似物的一部分的天然存在的和/或合成的核酸序列，并且然后如本发明所述表达所组合的核酸序列。此外，所述类似物可以使用相关氨基酸序列的化学合成而提供，其应用本身已知的肽合成技术，诸如本发明所提及的那些技术。
在这一方面，熟练的技术人员还应该清楚，本发明的纳米抗体(包括它们的类似物)还可以从人VH序列(即，氨基酸序列或相对应的核苷酸序列)起始设计和/或制备，所述人VH序列诸如例如人VH3序列，诸如DP-47、DP-51、或DP-29，即，通过引入一个或多个骆驼源化的取代(即，将在所述人VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基改变成在VHH结构域相对应位置存在的氨基酸残基)，以提供本发明的纳米抗体序列，和/或将纳米抗体的有利特性赋予这样获得的序列。同样地，这通常可以应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人VH结构域的氨基酸序列和/或核苷酸序列作为起点。
一些优选的而非限制性的骆驼源化取代可以来自表A-5-A-8。同样应该清楚，在一个或多个标志残基的骆驼源化取代通常将比在一个或多个其它氨基酸位置的取代对所需要的特性有更大的影响，尽管这两种取代以及它们的任何适当的组合均包括在本发明范围之内。例如，可以引入一个或多个已经赋予至少一些所需要的特性的骆驼源化取代，并且然后引入进一步的骆驼源化取代，其进一步改善所述特性和/或赋予额外的有利特性。同样地，基于本发明的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后，所述常规实验可以包括，例如，引入有限数量的可能的骆驼源化取代，并且确定是否获得或改善纳米抗体的有利特性(即，与原始VH结构域相比)，熟练的技术人员将通常能够确定并选择适当的骆驼源化取代或适当的骆驼源化取代的组合。然而，一般地，所述骆驼源化取代优选是这样的以致得到的氨基酸序列至少包含(a)在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带电荷的氨基酸或半胱氨酸残基以及优选地也在位置44的E，以及更优选地在位置44的E和在位置45的R；和/或(c)在位置103的P，R或S；和任选地一种或多种其它的骆驼源化取代。更优选地，所述骆驼源化取代是这样的以致它们导致本发明的纳米抗体和/或其类似物(如本文定义)，如得到人源化的类似物和/或优选地如在前述段落中定义的类似物。
可以提供其他类似物和编码其的核酸序列，例如，来提高所述纳米抗体的稳定性。在保存过程中，由于下列各项，纳米抗体和其他类型的免疫球蛋白可以产生某些变体：
i)氧化事件，其典型地仅发生在“易受影响的”甲硫氨酸上，其中在保存过程中氧化与温育温度和时间平行增加；
ii)第一谷氨酸残基，如果存在，的环化作用，导致形成焦谷氨酸盐；和
iii)在DG，DS，NG或NS基序中的仅“易受影响的”天冬氨酸或天冬酰胺的异构化作用，其中在保存过程中异构化作用与温育温度和时间平行增加。
可以生成具有提高的稳定性特性的本发明的纳米抗体的变体的类似物。例如，但不限于，这可以通过下列各项进行：避免Asp(D)和Asn(N)的异构化，例如，异构化的避免通过用另一种氨基酸如例如Glu(E)或Gln(Q替换CDRs中的Asp-Gly(DG)，Asp-Ser(DS)，Asn-Gly(NG)和Asn-Ser(NS)；避免Met的氧化作用，例如，通过用另一种氨基酸如例如Ala或Thr替换易受被动氧化影响的Met；和/或用备选的N端如Asp替换N端Glu。同样地，基于本文的公开内容，且任选地在有限程度的常规实验之后，其可以例如包括引入有限数量的可能的稳定性取代，并且确定所述纳米抗体是否仍然结合RANK-L，和是否获得或提高纳米抗体的有利特性(即，与原始VH或VHH结构域相比较)，熟练的技术人员通常能够确定和选择适当的稳定性取代或适当的稳定性取代的组合。优选的稳定的纳米抗体表示在SEQID NO：756中，其中CDR2中的DS基序用ES替换，导致下述CDR2：SITGSGGSTYYAESVKG(SEQ ID NO：758)。
通过本文的公开内容还应该清楚的是，使用如本文定义的本发明的纳米抗体的部分或片段、或两个或多个部分或片段的组合，且特别是SEQ IDNO’s：560-621的纳米抗体的部分或片段也在本发明的范围内。因此，按照本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛意义上也涵盖所述部分或片段。
一般地，本发明的纳米抗体(包括其类似物)的所述部分或片段具有这样的氨基酸序列，其中，与相对应的本发明的全长纳米抗体(或其类似物)的氨基酸序列相比较，已经删除和/或去除在N末端的一个或多个氨基酸残基，在C末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个连续的内部氨基酸残基，或它们的任何组合。
所述部分或片段优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述))结合RANK-L。
任何部分或片段优选地是这样，以致其包括相对应的本发明的全长纳米抗体的氨基酸序列的至少10个连续的氨基酸残基，优选地至少20个连续的氨基酸残基，更优选地至少30个连续的氨基酸残基，诸如至少40个连续的氨基酸残基。
此外，任何部分或片段优选是这样的，以致其包括CDR1、CDR2和/或CDR3中的至少一个或至少其部分(并且特别是至少CDR3或至少其部分)。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(并且优选至少CDR3或其部分)，和至少一个其它CDR(即，CDR1或CDR2)或至少其部分，优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(且优选至少CDR3或其部分)，和至少两个剩余CDR的部分，同样优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。
按照另一个特别优选的但非限制性的方面，这样的部分或片段包括至少CDR3，诸如相对应的本发明全长纳米抗体的FR3、CDR3和FR4，即，例如，如在国际申请WO 03/050531(Lasters等)中所述。
如上文已经提及，还可以组合两个或更多个这样的部分或片段(即，来自相同的或不同的本发明的纳米抗体)，即，以提供本发明纳米抗体的类似物(如本文所定义)和/或以提供其它部分或片段(如本文所定义)。例如，还可以将本发明纳米抗体的一个或多个部分或片段与人VH结构域的一个或多个部分或片段组合。
按照一个优选方面，所述部分或片段与纳米抗体SEQ ID NOs：560-621中的一个有至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、95％或99％或更多的序列同一性程度。
所述部分和片段，以及编码其的核酸序列可以以本身已知的任何方式提供并且任选地组合。例如，所述部分或片段可以通过在编码本发明的全长纳米抗体的核酸中插入终止密码子，并且然后以本身已知的方式(例如，如本文所述)表达这样获得的核酸而获得。备选地，编码所述部分或片段的核酸可以这样获得，即，通过适当限制性酶切(restrict)编码本发明的全长纳米抗体的核酸或通过以本身已知的方式合成这样的核酸。部分或片段还可以使用本身已知的肽合成技术提供。
本发明在其最广泛意义上还包括本发明的纳米抗体的衍生物。这样的衍生物通常可以通过本发明的纳米抗体和/或形成本发明的纳米抗体的一个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例如，酶促)修饰获得。
熟练的技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及纳米抗体序列中可以以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白骨架上但是优选地在侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途和优点。
例如，这样的修饰可以包括向本发明的纳米抗体内或向本发明的纳米抗体上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能团、残基或部分，并且特别是赋予本发明的纳米抗体一种或多种理想的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或部分。熟练的技术人员应该清楚所述官能团的实例。
例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的纳米抗体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的纳米抗体的任何不理想的副作用，和/或赋予本发明的纳米抗体和/或多肽其它的有利特性和/或减少本发明的纳米抗体和/或多肽的不理想特性；或者两种或多种上述的任何组合。所述官能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为熟练的技术人员清楚，并且通常可以包括上文引用的综合背景技术中提及的所有官能团和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参考雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack出版公司，Easton，PA(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共价地)到本发明的纳米抗体上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂(spacer)连接，这也为熟练的技术人员所清楚。
关于增加半衰期和/或减少药物蛋白的免疫原性最广泛应用的一种技术包括适当的药用聚合物诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)的附着。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考Chapman，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，54，531-545(2002)；Veronese和Harris，高级药物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)54，453-456(2003)，Harris和Chess，自然药物发现综述(Nat.Rev.Drug.Discov.)，2，(2003)以及在WO 04/060965中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治疗公司(Nektar Therapeutics)购得。
优选地，应用定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参见例如Yang等，蛋白质工程(Protein Engineering)，16，10，761-770(2003))。例如，为了这一目的，PEG可以附着到在本发明的纳米抗体中天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的纳米抗体可以这样进行修饰，以适当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的纳米抗体的N-和/或C-端，本身为熟练的技术人员所了解的所有应用的蛋白质加工技术。
优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白，使用具有大于5000的分子量的PEG，诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在20,000-80,000范围内。
另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为了表达本发明的纳米抗体或多肽所用的宿主细胞。
另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生基团或部分，其取决于所标记纳米抗体的目的用途。适宜的标记以及附着、使用和检测它们的技术是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括但不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺和荧光素金属诸如152Eu或其它来自镧系的金属)，磷光性标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromatic acridinium ester、咪唑、acridinium盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性-同位素(诸如3H，125I，32P，35S，14C，51Cr，36Cl，57Co，58Co，59Fe和75Se)，金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga和68Ga，或其它特别适合用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(157Gd，55Mn，162Dy，52Cr和56Fe))，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-V-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物素-抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它适宜的标记为熟练的技术人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的部分。
例如，这样标记的本发明的纳米抗体和多肽可以用于体外、体内或原位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如ELISA，RIA，EIA和其它“夹心式检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。
熟练的技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的纳米抗体与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例如，本发明的纳米抗体可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如，这样缀合的纳米抗体可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如，这种结合对还可以用来将本发明的纳米抗体与载体结合，所述载体包括适用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh，药物靶向杂志(Journal of Drug Targetting)，8，4，257(2000)所述的脂质体制剂。这种结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的纳米抗体结合。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与毒素或者毒性残基或部分连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是记述在WO 03/055527中的所谓的ADEPTTM技术。
熟练的技术人员应该清楚其它潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考Lundblad和Bradshaw，生物技术和应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)，26，143-151(1997)。
优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本文关于本发明的纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为KD-值(实际的或表观的)，KA-值(实际的或表观的)，kon-速率和/或koff-速率，或备选地为IC50值，如本发明进一步所述)与RANK-L结合。
如上文提及，本发明还涉及基本上由至少一个本发明的纳米抗体组成或包括至少一个本发明的纳米抗体的蛋白或多肽。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的氨基酸序列与本发明纳米抗体的氨基酸序列完全相同，或者与本发明纳米抗体的氨基酸序列相对应，其将有限数目的氨基酸残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基添加到所述纳米抗体的氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。
所述氨基酸残基可以或者可以不变化、改变或者另外影响所述纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或者可以不为所述纳米抗体添加其它的官能性。例如，所述氨基酸残基：
-可以包括N-端Met残基，例如，作为在异源宿主细胞或宿主生物体内表达的结果；
-可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导所述纳米抗体从宿主细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是熟练的技术人员所清楚的，并且可以是本文进一步所述的。通常，这样的前导序列与所述纳米抗体的N端连接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；
-可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述纳米抗体导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的实例对于熟练的技术人员是清楚的。一些非限制性的实例是在WO03/026700和Temsamani等，生物学治疗的专家观点(Expert Opin.Biol.Ther.)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，今日药物发现(Drug Discov.Today)，9，1012(004)以及Rousselle，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans载体”)，和由Zhao等，程序性细胞死亡(Apoptosis)，8，631-637(2003)所述的膜易位体序列。例如，用于抗体片段细胞内靶向的C端和N端氨基酸序列由Cardinale等，方法(Methods)，34，171(2004)所述。关于细胞内靶向的其它适宜的技术包括所谓的“细胞内抗体(intrabody)”的表达和/或应用，所述“细胞内抗体”包括本发明的纳米抗体，如下文所提及；
-可以形成“标记”，例如允许或促进所述纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供纳米抗体序列(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所述纳米抗体序列连接或包含可裂解的基序)。这种残基的一些优选的但非限制性的实例是多组氨酸残基、谷胱甘肽(glutatione)残基以及myc-标记(例如参见WO 06/12282的SEQ ID NO：31)；
-可以是已经被官能化和/或可以作为官能团附着的位点的一个或多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是熟练的技术人员所清楚的，并且包括但不限于，本文为本发明的纳米抗体的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。
按照另一个方面，本发明的多肽包括本发明的纳米抗体，所述多肽在其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至少一个其它氨基酸序列，即，以提供包括所述本发明的纳米抗体和一个或多个其它氨基酸序列的融合蛋白。这种融合体在本文还叫作“纳米抗体融合体”。
所述一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适宜的和/或理想的氨基酸序列。所述其它氨基酸序列可以或可以不变化、改变或另外影响所述纳米抗体的(生物学)特性，并且可以或可以不为本发明的纳米抗体或多肽加入其它的官能性。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致它赋予本发明的纳米抗体或多肽一种或多种理想的特性或官能性。
例如，所述其他氨基酸序列也可以提供第二结合位点，所述结合位点可以针对任何需要的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于与本发明的纳米抗体所针对的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。
这样的氨基酸序列的实例是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以包括基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的用于肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson，自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，与本发明的纳米抗体本身相比，这样的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减少本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽其它有利的特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如人血清白蛋白(参见，例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。
特别地，在本领域中已经描述，免疫球蛋白(如VH结构域)与血清白蛋白或与其片段的连接片段可以用来增加半衰期。参考WO 00/27435和WO01/077137。按照本发明，本发明的纳米抗体优选地与血清白蛋白(或与其适当的片段)直接连接，或通过适当的接头连接，且特别地通过适当的肽连接，以致本发明的多肽可以作为遗传融合体(蛋白)表达。按照一个具体的方面，本发明的纳米抗体可以与血清白蛋白片段连接，所述血清白蛋白片段至少包括血清白蛋白的结构域III或其部分。例如，参考埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 07/112940。
备选地，所述其它的氨基酸序列还可以提供第二结合位点或结合单位，所述结合位点或结合单位针对血清蛋白(诸如例如，人血清白蛋白或另一种血清蛋白，诸如IgG)，以在血清中提供增加的半衰期。例如，所述氨基酸序列包括下述纳米抗体，以及在WO 91/01743，WO 01/45746和WO02/076489中所述的小肽和结合蛋白，和在WO 03/002609和WO 04/003019所述的dAb’s。还参考Harmsen等，疫苗(Vaccine)，23(41)；4926-42，2005，以及EP 0 368 684，以及下述本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx.N.V.)的美国临时申请60/843,349(也参见PCT/EP2007/059475)，60/850,774(也参见PCT/EP2007/060849)，60/850,775(也参见PCT/EP2007/060850)和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx.N.V.)于2006年12月5日提交的题目为“Peptides capable of binding to serum proteins(能够结合血清蛋白的肽)”的美国临时申请(也参见PCT/EP2007/063348)。
所述氨基酸序列可以特别针对血清白蛋白(并且更特别是人血清白蛋白)和/或针对IgG(并且更特别是人IgG)。例如，所述氨基酸序列可以是下列氨基酸序列：针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列，和可以结合在(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残基的氨基酸序列(例如，参见WO 06/0122787)，和/或能够结合在血清白蛋白上不形成血清白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基的氨基酸序列(例如，同样参见WO06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的氨基酸序列(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 08/028977)；与来自至少一个哺乳动物物种的、并且特别是与至少一个灵长类物种(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，同样参考美国临时申请60/843,349和PCT/EP2007/059475)的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列；可以以不依赖pH方式结合血清白蛋白的氨基酸序列(参见，例如，埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年10月11日提交的题目为“以基本上不依赖pH的方式结合血清白蛋白的氨基酸序列，包含其的化合物及其应用(Aminoacid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentiallyindependent of the pH，compounds comprising the same，and uses thereof)”的美国临时申请60/850,774；还参见PCT/EP2007/059475)，和/或是条件粘合剂的氨基酸序列(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年10月11日提交的题目为“以条件方式结合需要的分子的氨基酸序列(Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditionalmanner)”的美国临时申请60/850,775；还参见PCT/EP2007/060850)。
按照另一个方面，所述一个或多个其他氨基酸序列可以包括常规4-链抗体(且特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，尽管通常较不优选，本发明的纳米抗体可以与常规(优选人)VH或VL结构域连接或与VH或VL结构域的天然或合成的类似物连接，同样任选地通过接头序列(包括但不限于其他(单)结构域抗体，如Ward等所述的dAb’s)。
所述至少一个纳米抗体还可以与一个或多个(优选人的)CH1、CH2和/或CH3结构域连接，这任选地通过接头序列连接。例如，与适宜的CH1结构域连接的纳米抗体，可以例如——与适当的轻链一起——用来产生类似于常规Fab片段或F(ab’)2片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者(F(ab’)2片段的情形中)一个或两个常规VH结构域已被本发明的纳米抗体取代。此外，两个纳米抗体可以与CH3结构域(任选通过接头)连接，以提供具有增加的体内半衰期的构建体。
按照本发明的多肽的一个具体方面，一个或多个本发明的纳米抗体可以与一个或多个恒定结构域(例如，2或3个可以用作Fc部分的一部分/形成Fc部分的恒定结构域)、Fc部分和/或一个或多个抗体部分、片段或结构域连接(任选地通过适当的接头或铰链区)，其赋予本发明的多肽一种或多种效应子功能，和/或可以赋予与一个或多个Fc受体结合的能力。例如，为了这一目的，并且不限于此，所述一个或多个其它氨基酸序列可以包括抗体、诸如来自重链抗体(如本文所述)并且更优选来自常规人4-链抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域；和/或可以形成Fc区域的(部分)和Fc区域，例如来自IgG(例如，来自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)，来自IgE或来自另一种人Ig如IgA，IgD或IgM。例如，WO 94/04678描述了包括骆驼科动物VHH结构域或其人源化的衍生物的重链抗体(即，纳米抗体)，其中所述骆驼科动物CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域取代，以提供由2条重链组成的免疫球蛋白，其中每条重链包括纳米抗体和人CH2与CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由所述CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在无需任何轻链的存在下行使功能。熟练的技术人员应该清楚可以适当与本发明的纳米抗体连接以提供效应子功能的其它氨基酸序列，并且可以基于所需要的效应子功能进行选择。例如，参考WO 04/058820，WO 99/42077，WO 02/056910和WO05/017148，以及Holliger和Hudson，同前所述的综述，和参考埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2007年12月4日提交的题目为“Constructscomprising single variable domains and an Fc portion derivedfrom IgE(包括但可变结构域和来源于IgE的Fc部分的构建体)”的未预先公布的美国临时申请。与相对应的本发明的纳米抗体相比，本发明的纳米抗体与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。熟练的技术人员应该清楚包括具有增加的体内半衰期的一个或多个纳米抗体和一个或多个恒定结构域的其它适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域连接的两个纳米抗体，任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
在另一个优选的但非限制性的方面中，为了形成本发明的多肽，一个或多个本发明的氨基酸序列可以与具有减少的(或基本上没有)自我缔合成二聚体的倾向(即，与在常规4-链抗体中天然存在的恒定结构域相比较)的天然存在、合成的或半合成的恒定结构域(或其类似物、变体、突变体、部分或片段)连接(任选地通过适当的接头或铰链区)。所述单体(即，无自我缔合的)Fc链变体，或其片段，是熟练的技术人员所清楚的。例如，Helm等，J Biol Chem(生物化学杂志)1996 271 7494，描述了可以用于本发明的多肽链中的单体Fcε链变体。
此外，所述单体Fc链变体优选是这样的，以致它们仍然能够结合补体或相关的Fc受体(取决于它们所来源的Fc部分)，和/或是这样的，以致它们仍然具有它们所来源的Fc部分的一些或全部的效应子功能(或处于仍然适用于目的用途的减少的水平)。备选地，在这样的本发明的多肽链中，单体Fc链可以用来赋予所述多肽链增加的半衰期，在这种情形中，所述单体Fc链还可以不具有或基本上不具有效应子功能。
本发明的二价/多价、双特异性/多特异性或二互补位/多互补位多肽也可以与Fc部分连接，以提供于2007年12月4日提交的题目为“immunoglobulinconstructs(免疫球蛋白构建体)”的未预先公布的美国临时申请US61/005,331中记述的那种类型的多肽构建体。
所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导本发明的纳米抗体或多肽从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多肽的前体-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表达本发明的多肽的宿主细胞)。
所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述氨基酸序列的适当的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如包括但不限于，上文提及的“Peptrans”载体，Cardinale等描述的序列，以及本身已知的可以用来将本发明的纳米抗体和多肽表达或生产为“细胞内抗体”的氨基酸序列和抗体片段，例如，如在WO 94/02610，WO 95/22618，US-A-7004940，WO 03/014960，WO 99/07414；WO 05/01690；EP 1 512 696；和Cattaneo，A.与Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(Intracellular Antibodies：Development and Applications).Landes和Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170，以及本发明所述的其它参考文献中所述。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与(细胞)毒性蛋白或多肽连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供本发明的细胞毒性多肽的所述毒性蛋白和多肽的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是在WO 03/055527中所述的所谓的ADEPTTM技术。
按照一个优选但非限制性的方面，所述一个或多个其它氨基酸序列包括至少一个其它的纳米抗体，以提供包括至少两个、诸如三个、四个、五个或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中所述纳米抗体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本发明所定义)连接。包括两个或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个是本发明的纳米抗体，在本发明中还将称为本发明的“多价”多肽，并且在所述多肽中存在的纳米抗体还将在本发明中称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括2个纳米抗体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3个纳米抗体，任选地通过两个接头序列连接；等等；其中在所述多肽中存在的至少一个纳米抗体，并且多达在所述多肽中存在的所有纳米抗体，是本发明的纳米抗体。
在本发明的多价多肽中，所述两个或更多个纳米抗体可以是相同的或不同的，并且可以针对同一抗原或抗原决定簇(例如，针对相同部分或表位或者针对不同部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或它们的任何适当的组合。例如，本发明的二价多肽可以包括：(a)2个相同的纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的同一抗原决定簇的第二纳米抗体，所述第二纳米抗体不同于所述第一纳米抗体；(c)针对所述蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二纳米抗体；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一纳米抗体，和针对第二蛋白或抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二纳米抗体。类似地，本发明的三价多肽可以，例如但不限于此，包括(a)3个相同的纳米抗体；(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对同一抗原的不同抗原决定簇的第三纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一纳米抗体，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二抗原的第三抗原的第三纳米抗体。
包含至少两个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个纳米抗体针对第一抗原(即，针对RANK-L)，并且至少一个纳米抗体针对第二抗原(即，不同于RANK-L)，还叫作本发明的“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的纳米抗体还叫作处于“多特异性形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包括至少一个针对第一抗原(即RANK-L)的纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即，不同于RANK-L)的其它纳米抗体的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，即，其包括至少一个针对第一抗原(即RANK-L)的纳米抗体，至少一个针对第二抗原(即，不同于RANK-L)的其它纳米抗体，和至少一个针对第三抗原(即，不同于RANK-L和所述第二抗原二者)的其它纳米抗体；等等。
因此，以其最简单的形式，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多肽(如本文所定义)，其包括针对RANK-L的第一纳米抗体，和针对第二抗原的第二纳米抗体，其中所述第一和第二纳米抗体可以任选地通过接头序列(如本文所定义)而连接；而以其最简单形式存在的本发明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对RANK-L的第一纳米抗体，针对第二抗原的第二纳米抗体，和针对第三抗原的第三纳米抗体，其中所述第一、第二和第三纳米抗体可以任选地通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。
然而，从上文所述应该清楚，本发明并不限于此，在这种意义上，本发明的多特异性多肽可以包括至少一个针对RANK-L的纳米抗体，和任何数目的针对一个或多个不同于RANK-L的抗原的纳米抗体。
此外，尽管所述多个纳米抗体在本发明的多肽中的特定顺序或排列可能对本发明最终的多肽的特性具有一些影响(包括，但不限于针对RANK-L的或针对所述一个或多个其它抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗源性)也包括在本发明的范围内，但是所述顺序或排列通常不是关键的，并且可以由熟练的技术人员适当选择，任选地基于本发明的公开内容在一些有限的常规实验之后选择。因此，当提及本发明的特异性多价或多特异性多肽时，应该注意到，这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列，除非另外明确指明。
最后，本发明的多肽包含两个或更多个纳米抗体以及一个或多个其它氨基酸序列(如本文所提及)也在本发明的范围之内。
对于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还参考Conrath等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，卷276，10.7346-7350，2001；Muyldermans，分子生物技术综述(Reviews in Molecular Biotechnology)74(2001)，277-302；以及例如，WO 96/34103和WO 99/23221。本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其它实例可以在本发明所引用的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的申请中找到。
本发明的多特异性多肽的一个优选而非限制性的实例包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。例如，所述纳米抗体可以是针对血清蛋白、且特别是人血清蛋白的纳米抗体，所述血清蛋白诸如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、凝血因子I、免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM、或WO 04/003019中列出的一种血清蛋白。在这些中，可以结合血清白蛋白(且特别是人血清白蛋白)或结合IgG(且特别是人IgG，例如，参见在Muyldermans，同前所述的综述中记述的纳米抗体VH-1)的纳米抗体是特别优选的(尽管，例如，对于在小鼠或灵长类动物中的实验，可以使用分别针对小鼠血清白蛋白(MSA)或来自所述灵长类动物的血清白蛋白的纳米抗体或与之交叉反应的纳米抗体。然而，对于药物应用，通常优选针对人血清白蛋白或人IgG的纳米抗体。)提供增加的半衰期且可以用在本发明的多肽中的纳米抗体包括针对血清白蛋白的纳米抗体，其记述在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041865，WO06/122787和其他专利申请中，如上文所述的那些。
例如，提供增加的半衰期以用于本发明的所述一些优选的纳米抗体包括可以与(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残基结合的纳米抗体(例如，参见WO 06/0122787)；能够与血清白蛋白上不形成血清白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基结合的纳米抗体(例如，参见WO 06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的纳米抗体(例如，参见本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请60/843,349；还参见PCT/EP2007/059475)；针对与来自至少一个哺乳动物物种、且特别是至少一个灵长类物种(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请60/843,349；还参见PCT/EP2007/059475)的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的纳米抗体；可以以不依赖pH的方式结合血清白蛋白的纳米抗体(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请60/850,774；还参见PCT/EP2007/060849)和/或是条件粘合剂的纳米抗体(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请60/850,775；还参见PCT/EP2007/060850)。
一些特别优选的提供增加的半衰期且可以用于本发明的多肽中的纳米抗体包括WO 06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表II和III)，其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO：62)是特别优选的。
包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体的本发明的多肽的一些优选的但非限制性的实例在SEQ ID NO’s694-729和759-760中给出。
按照本发明的一个具体的但非限制性的方面，除了一个或多个本发明的纳米抗体之外，本发明的多肽还包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米抗体。
一般地，包含一个或多个本发明的纳米抗体的具有增加的半衰期的任何本发明的多肽，和具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体的任何衍生物或所述多肽的任何衍生物，优选地具有是相对应的本发明的纳米抗体本身半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多于20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的纳米抗体本身相比较，所述具有增加的半衰期的衍生物或多肽可以具有增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的一个优选的但非限制性的方面中，所述衍生物或多肽可以在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，所述衍生物或多肽可以具有至少5天(如约5-10天)、优选至少9天(如约9-14天)、更优选至少约10天(如约10-15天)、或至少约11天(如约11-16天)、更优选至少约12天(如约12-18天或更多)、或大于14天(如约14-19天)的半衰期。
按照本发明的一个方面，所述多肽能够与可以增加所述多肽的体内半衰期的一个或多个分子结合。
本发明的多肽在体内是稳定的，并且它们的半衰期通过与抗降解和/或清除或螯合的分子结合来增加。典型地，所述分子是本身具有长久的体内半衰期的天然存在的蛋白。
本发明的多特异性多肽的另一个优选而非限制性的实例包括至少一个本发明的纳米抗体和至少一个这样的纳米抗体，即，所述纳米抗体是本发明的多肽所针对的，和/或允许本发明的多肽透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障。所述的纳米抗体的实例包括针对所需要的器官、组织或细胞的特异性的细胞表面蛋白、标记或表位(例如，与肿瘤细胞相关的细胞表面标记)的纳米抗体，和在WO 02/057445和WO 06/040153中描述的单结构域靶向脑的抗体片段，其中FC44(WO 06/040153中的SEQ ID NO：189)和FC5(WO06/040154中的SEQ ID NO：190)是优选的实例。
在本发明的多肽中，所述一个或多个纳米抗体和所述一个或多个多肽可以直接彼此连接(例如在WO 99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个适宜的间隔体或接头或其任意组合而彼此连接。
用于多价和多特异性多肽的适宜的间隔体或接头应该是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间隔体。优选地，所述接头或间隔体适合用于构建意欲药用的蛋白或多肽。
一些特别优选的间隔体包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔体和接头。这些包括上文所引用的公知背景技术中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面，然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该具有某种长度、某种程度的柔性以及允许相关的VH和VL结构域靠近在一起形成完整的抗原-结合位点的其它特性，但是，由于每一纳米抗体本身形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特别的限制)。
例如，接头可以是适当的氨基酸序列，并且特别是1-50、优选1-30、诸如1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如，(glyxsery)z型的，诸如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如在WO 99/42077中所述，和在本文提及的Ablynx的申请中描述的GS30，GS15、GS9和GS7接头(例如，参见WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链样区域如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序列(如在WO94/04678中所述)。
一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(如AAA)，以及接头GS30(在WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)和GS9(在WO 06/122825中的SEQ IDNO：84)。
其它适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经用来连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。
下列情形也在本发明范围内，所用的接头的长度、柔性程度和/或其他特性(尽管不是关键的，由于它通常是用在ScFv片段中的接头)可以对本发明最终的多肽的特性具有一些影响，包括但不限于针对RANK-L、或针对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗源性。基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
例如，在包括针对多聚体抗原(诸如多聚体受体或其他蛋白)的纳米抗体的本发明的多价多肽中，所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致其允许在所述多肽中存在的每一个本发明的纳米抗体结合在所述多聚体每个亚基上的抗原决定簇。类似地，在包括针对在同一个抗原上的两个或更多个不同抗原决定簇(例如，针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受体、通道或蛋白的不同亚基)的纳米抗体的本发明的多特异性多肽中，所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致其允许每个纳米抗体与其目的抗原决定簇结合。同样地，基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
下列情形也在本发明范围内：所用接头赋予本发明的多肽一种或多种其它有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的纳米抗体的衍生物的描述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表A-2)的接头可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。并且，基于本文的公开内容，熟练的技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头，任选地在一些有限的常规实验之后。
通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽将是线性多肽。然而，本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，当本发明的多肽包括三个或多个纳米抗体时，可以利用具有三个或更多个“臂”的接头连接它们，所述每个“臂”与纳米抗体连接，以提供“星形”的构建体。尽管通常较不优选，但是还可以使用环形的构建体。
本发明还包括本发明多肽的衍生物，其可以基本上类似于本发明纳米抗体的衍生物，即，如本文所述。
本发明还包括“基本上由”本发明的多肽“组成的蛋白或多肽”(其中措辞“基本上由……组成”具有基本如上文所示相同的意思)。
按照本发明的一个方面，本发明的多肽基本上以分离的形式存在，如本文所定义。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，熟练的技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤：
i)在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。特别地，这样的方法可以包括下列步骤：
i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行：
ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子应用的DNA)。
按照本发明的一个方面，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文所定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。
本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，其基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列可以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，熟练的技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至少一种编码纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核酸，还可以以适当的方法连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使用一个或多个“错配”引物的PCR反应的方法引入突变。这些以及其它技术应该是熟练的技术人员所清楚的，并且参考也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的实施例。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是遗传构建体的一部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。本发明的遗传构建体还可以是适于意欲的宿主细胞或宿主生物体的转化的形式，适于结合到要用的宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。
在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括
i)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接
ii)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；
并且任选地还有
iii)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；
其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序列、选择标记、表达标记/报道子基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、要用的宿主细胞或宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如，通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式使用。
优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接，尽管这也可以不是必需的。
优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它们能够在要用的宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。
例如，在要用的宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如，编码序列——的转录和/或表达。
一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。
选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下——已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素)的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因，所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必需的。
前导序列应该是这样的，以致——在要用的宿主细胞或宿主生物体中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达，前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上相似的方式使用。
表达标记或报道子基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物体中——其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部分中。所述报道子基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白融合体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白如GFP。
适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包括可以用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细菌细胞中表达的那些，诸如本文提及的那些和/或在下述实施例中所用的那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子——参考上文提及的通用手册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO 95/07463，WO 96/23810，WO95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO 97/42320，WO 98/06737，WO98/21355，US-A-7,207,410，US-A-5,693,492和EP 1 085 089中给出的实例。其它实例对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考也参见上文引用的公知背景技术和本文引用的其它参考文献。
本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。
通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。适当的宿主或宿主细胞是熟练的技术人员所清楚的，并且例如可以是任何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、原核的或真核的生物体，例如：
-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)菌株；
-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属(Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪壳属(Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉菌(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)；或其它丝状真菌；
-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属(Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；Arxula，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowia lipolytica；
-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；
-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和Kc细胞；
-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或
-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；
以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于熟练的技术人员应该是清楚的。参考还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述；Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden，(2000)，同前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述；Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所引用的其它参考文献。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以被引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照此(例如使用脂质体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于熟练的技术人员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自要治疗的患者的身体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片)可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回到所述患者的身体内。所有这些可以使用熟练的技术人员公知的基因治疗载体、技术和递送系统进行，例如，在下列各项中所述：Culver，K.W.，″基因治疗(Gene Therapy)″，1994，p.xii，Mary Ann Liebert公司，出版，New York，纽约)；Giordano，自然F医学(Nature F Medicine)2(1996)，534-539；Schaper，循环研究(Circ.Res).79(1996)，911-919；Anderson，科学(Science)256(1992)，808-813；Verma，自然(Nature)389(1994)，239；Isner，柳叶刀(Lancet)348(1996)，370-374；Muhlhauser，循环研究(Circ.Res).77(1995)，1077-1086；Onodera，血液学(Blood)91；(1998)，30-36；Verma，基因治疗(Gene Ther).5(1998)，692-699；Nabel，纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)：811(1997)，289-292；Verzeletti，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)9(1998)，2243-51；Wang，自然医学(Nature Medicine)2(1996)，714-716；WO94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,5895466；或Schaper，现代生物技术观点(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)，635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，基因治疗(Gene Ther.)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，免疫学杂志(J.Immunol)，171，1070-1077(2003))的原位表达。
对于纳米抗体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“细胞内抗体”表达，例如在WO 94/02610，WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(Intracellular Antibodies：Development and Applications).Landes和Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170中所述。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在转基因哺乳动物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但不限于它们的叶、花、果实、种子、根或turbers(例如在烟草、玉米、大豆或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中。
此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在不含细胞的表达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是熟练的技术人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中表达。
如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调节元件等对熟练的技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表达。
优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是熟练的技术人员所清楚的。熟练的技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多肽可以使用肽合成技术制备。
对于工业规模的生产，用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗物的(工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/发酵，并且特别适用于大规模药物(即，GMP级别)表达/生产/发酵。所述菌株的适当的实例是熟练的技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。
备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且，所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。
具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体地是糖基化的需要。生产包含纳米抗体的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，熟练的技术人员应该清楚，获得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有人糖基化模式的蛋白)，或者使用另一种哺乳动物细胞系，其可以提供基本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明，这取决于要获得的理想的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽被糖基化。按照本发明的另一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。
按照本发明的一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。
按照本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞中，诸如上文提及的细胞系中生产。
当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽时，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以在细胞内产生(例如，在细胞溶质中，在周质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的纳米抗体和蛋白的下游处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到周质空间。周质生产相对于细胞溶质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然基因产物相同。此外，在周质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在周质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个优点是，由于周质提供比细胞质更加氧化性的环境，所以可以形成正确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶质中或在周质中；从这些内含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗性蛋白，是从内含体回收的。备选地，熟练的技术人员应该清楚，可以使用细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
因此，按照本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。按照本发明的另一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，
-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)；阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7-噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外来调节操纵基因序列；
-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1(磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1，10，7(半乳糖代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；
-用于在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧化酶I)；
-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet抑制基因调节；单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α)启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动子；
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：
-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；
-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体(Qiagen)；
-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤表达载体(Invitrogen)；
-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病毒载体；
-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-质粒的载体。
与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括：
-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT，StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB等；TAT信号肽，溶血素C-端分泌信号；
-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)，磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；
-用于哺乳动物细胞：在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信号(indigenous signal)；鼠Ig κ-链V-J2-C信号肽；等。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对熟练的技术人员是清楚的，并且可以取决于要用的宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。参考也参见上文提及的手册和专利申请。
转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列/遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。
转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。
优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获得。
为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列、纳米抗体或多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对熟练的技术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参考参见在上文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情形中)；所有这些可以由熟练的技术人员选择。此外，在这样的条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导时表达。
熟练的技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。
然后，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以从宿主细胞/宿主生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术(即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。
通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物，其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药，通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式——其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式——以及制备其所用的方法和载体，对熟练的技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸，至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及任选地一种或多种其它活性物质。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知的任何适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背景技术(并且特别参见WO 04/041862，WO 04/041863，WO 04/041865，WO04/041867和WO 08/020079)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司，美国(1990)或雷明顿，制药科学和实践(Remington，the Science and Practice ofPharmacy)，第21版，Lippincott Williams和Wilkins(2005)；或治疗抗体手册(the Handbook of Therapeutic Antibodies)(S.Dubel，Ed.)，Wiley，Weinheim，2007(例如，参见第252-255页)。
例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以本身已知的用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(及透皮的或皮内)给药的制剂。
例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及它们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以使用递送的基因治疗方法进行施用。参见，例如，美国专利号5,399,346，其完全结合作为参考。使用递送的基因治疗方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特异的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表达的信号和稳定序列进行转染。
因此，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以全身施用，例如，口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者日常饮食的食物组合。对于口服治疗性施用，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、颊含片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。当然，所述组合物和制剂的百分数可以变化，并且可以便利地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂量水平。
所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂、或胶囊可以用胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以结合在持续释放的制剂和装置中。
用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制备物和制剂可以适当地配置成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过输注或注射进行静脉内或腹膜内施用。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽或者它们的盐的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌的水溶液或分散液或者无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。
无菌注射溶液通过将需要量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合，然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前的无菌过滤溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。
对于局部给药，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是固体或液体。
有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺合剂，其中本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以有效水平溶解或分散，任选地在无毒表面活性剂的帮助下。可以添加佐剂诸如香味剂和其它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以通过吸收衬垫应用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾器喷到感染区域。
增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。
可以用于将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽递送到皮肤的有用的皮肤病用组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(美国专利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液中的浓度约0.1-25重量-％，优选地约0.5-10重量-％。在半固体或固体组合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5重量-％，优选地约0.5-2.5重量-％。
需要用于治疗的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的量不但随着所选的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而变化，而且随着施用途径、要治疗的病症的性质以及患者的年龄和病症而变化，并且最终取决于随从医生或临床医生的判断力。此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的剂量变化取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。
理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。
施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并且优选地数周、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。参见雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Martin，E.W.，第4版)，Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以由个别医生进行调整。
在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害以及通常对被治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种与RANK-L、与其生物学或药学活性、和/或与其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导相关的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。特别地，本发明涉及一种用于预防和/或治疗可以通过调节RANK-L、其生物学或药学活性、和/或其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。特别地，所述药用有效量可以是足以调节RANK-L、其生物学或药学活性、和/或其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导的量；和/或在循环中提供足以调节RANK-L、其生物学或药学活性、和/或其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽的水平的量。
本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体或本发明的多肽而预防和/或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和病症组成的组的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。
在上述方法中，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂或组合物。因此，例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/多肽和/或包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其它因素。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物按照治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的疾病或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或病症，要被治疗的疾病的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、综合病况，以及临床医生公知的类似因素。
一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽，或者包含其的一种或多种组合物。施用的具体量或剂量由临床医生确定，同样基于上文引用的因素。
通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治疗的具体疾病或病症，要用的特定的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地，关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的途径通常施用的相当的针对相同施用靶标的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/抗体亲抗源性、功效、生物分布、半衰期以及熟练的技术人员公知的类似因素的不同。
通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。然而，使用组合的两种或更多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽也在本发明范围之内。
本发明的纳米抗体、氨基酸序列和多肽还可以与一种或多种其它药物活性化合物或成分(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可以或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断，临床医生能够选择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。
特别地，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与其它药物活性化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分是或者能够用于预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，结果可以或不可以获得增效效应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组合物是临床医生所清楚的。
特别地，本发明的药物组合物可以包括一个或多个本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽，和至少一个另外的治疗剂，所述治疗剂选自骨形态发生因子，转化生长因子-β(TGF-β)，白介素-1(IL-1)抑制剂，IL-1ra，KineretTM，TNFα抑制剂，可溶的TNFα受体，EnbrelTM，抗-TNFα抗体，RemicadeTM，D2E7抗体，甲状旁腺激素，甲状旁腺激素的类似物，甲状旁腺激素相关蛋白，甲状旁腺激素相关蛋白的类似物，前列腺素，双膦酸酯，阿伦膦酸盐，氟化物，钙，非类固醇抗炎药(NSAID)，COX-2抑制剂，CelebrexTM，VioxxTM，免疫抑制剂，氨甲喋呤，来氟米特，丝氨酸蛋白酶抑制剂，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)，IL-6抑制剂，针对IL-6的抗体或纳米抗体，IL-8抑制剂，针对IL-8的抗体或纳米抗体，IL-18抑制剂，IL-18结合蛋白，针对IL-18的抗体或纳米抗体，白介素-1转化酶(ICE)调控剂，成纤维细胞生长因子(FGF)，FGF调控剂，PAF拮抗剂，角质化细胞生长因子(KGF)，KGF-相关的分子，KGF调控剂，基质金属蛋白酶(MMP)调控剂，氧化氮合酶(NOS)调控剂，糖皮质激素受体调控剂，谷氨酸受体调控剂，脂多糖(LPS)水平的调控剂，去甲肾上腺素，去甲肾上腺素模拟物，和去甲肾上腺素调控剂，如例如在US 2004/00335353中所述。
当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照备选方案)施用。当所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这是熟练的技术人员所清楚的。
此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或可以不引起增效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量，同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。
按照本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的疾病或病症的任何方式进行确定和/或遵循，这是临床医生所清楚的。在适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。
通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要维持所述理想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。
在另一方面中，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的药物组合物中的应用；和/或用于一种或多种本文所提及的治疗方法中的应用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更特别是人类。熟练的技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有危险患有本文提及的疾病和病症的人。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而得到预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的应用。
更特别地，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防和/或治疗骨疾病和病症、且特别是用于预防和治疗本发明列出的一种或多种疾病和病症的药物组合物的应用。
同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽还可以适当地与一种或多种其它活性成分如本发明提及的那些组合。
最后，尽管更优选本发明的纳米抗体(如本文所定义)和本发明的多肽的应用，但是基于本发明内容应该清楚，熟练的技术人员还应该能够以类似的方式设计和/或产生针对RANK-L的其它氨基酸序列、且特别是(单)结构域抗体，以及包括所述(单)结构域抗体的多肽。
例如，熟练的技术人员应该清楚，可以可能地将上文提及的用于本发明的纳米抗体的一个或多个CDR’s“移植”到所述(单)结构域抗体或其它蛋白支架上，所述支架包括但不限于人支架或非-免疫球蛋白支架。用于这种CDR移植的适宜的支架和技术是熟练的技术人员所清楚的，并且是本领域公知的，参见，例如US-A-7,180,370，WO 01/27160，EP 0 605 522，EP 0460 167，US-A-7,054,297，Nicaise等，蛋白质科学(Protein Science)(2004)，13：1882-1891；Ewert等，方法(Methods)，2004年10月；34(2)：184-199；Kettleborough等，蛋白质工程(Protein Eng.)1991年10月；4(7)：773-783；O’Brien和Jones，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)2003：207：81-100；和Skerra，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)2000：13：167-187,和Saerens等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)2005年9月23日；352(3)：597-607，以及本文引用的其它参考文献。例如，可以以相似的方式应用本身已知的关于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术，以提供包括一个或多个本发明的纳米抗体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白。
还应该注意，当本发明的纳米抗体包含除上文提及的优选的CDR序列之外的一个或多个其它CDR序列时，这些CDR序列可以以本身已知的任何方法获得，例如，从纳米抗体(优选)、来自常规抗体(并且特别来自人抗体)的VH结构域、重链抗体、常规4-链抗体(诸如常规的人4-链抗体)或针对RANK-L的其它免疫球蛋白序列获得。针对RANK-L的这种免疫球蛋白序列可以以任何本身已知的方法产生，如熟练的技术人员所清楚的，即，通过用RANK-L免疫或通过用RANK-L筛选免疫球蛋白序列的适宜的文库，或其任何适当的组合进行。任选地，这可以接着进行技术诸如随机或位点定向诱变和/或其它本身已知的用于亲和力成熟的技术。产生这样的免疫球蛋白序列的适宜的技术是熟练的技术人员所清楚的，并且例如包括Hoogenboom，自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)综述的筛选技术。产生针对指定的靶标的免疫球蛋白的其它技术包括，例如，Nanoclone技术(例如，在公布的美国专利申请2006-0211088中所述)，所谓的SLAM技术(例如欧洲专利申请0 542 810中所述)，应用表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或者公知的杂交瘤技术(参见，例如Larrick等，生物技术(Biotechnology)，卷7，1989，第934页)。所有这些技术可以用来产生针对RANK-L的免疫球蛋白，并且这种免疫球蛋白的CDR’s可以用于本发明的纳米抗体，即，如上文列出的。例如，这样的CDR序列可以被确定、合成和/或分离，并且插入到本发明的纳米抗体的序列中(例如，以便取代相对应的天然CDR)，均使用本身已知的技术，诸如本文所述的那些，或者包含所述CDR’s的本发明的纳米抗体(或编码其的核酸)可以从头合成，也应用本文提及的技术。
基于本文的公开内容，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、核酸、遗传构建体以及宿主与宿主细胞的其它应用是熟练的技术人员所清楚的。例如，并且不限于，本发明的氨基酸序列可以连接在适当的载体或固体支持物上，以提供一种可以以本身已知的从包含其的组合物和制备物中纯化RANK-L的方式使用的介质。包括适当的可检测标记的本发明的氨基酸序列的衍生物也可以用作(定性或定量)确定RANK-L在组合物或制备物中存在的标记，或作为选择性检测RANK-L在细胞或组织表面存在的标记(例如，与适当的细胞分选技术结合)。
现在，经通过下述非限制性的优选方面、实施例和附图进一步描述本发明。
优选方面
1.氨基酸序列，其针对和/或可以特异性结合RANK-L。
2.按照方面1的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列针对和/或可以特异性结合RANK-L上的RANK受体结合位点。
3.按照方面1或2任一项的氨基酸序列，其针对和/或可以特异性结合RANK-L三聚体上的亚基间受体结合沟。
4.按照方面1-3中任一项的氨基酸序列，其调节RANKL-L与RNAK的结合。
5.按照方面4的氨基酸序列，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合。
6.按照方面5的氨基酸序列，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合，而不减少和/或抑制RANK-L/OPG相互作用。
7.按照方面1-6中任一项的氨基酸序列，其是RANK-L的拮抗剂。
8.按照方面1的氨基酸序列，其针对和/或可以特异性结合在RANK-L上的OPG结合位点。
9.按照方面1或8的氨基酸序列，其调节RANKL-L与OPG的结合。
10.按照方面9的氨基酸序列，其抑制和/或防止RANK/RANK-L相互作用。
11.按照方面10的氨基酸序列，其是RANK-L的拮抗剂。
12.按照方面8的氨基酸序列，其不减少或抑制RANK/RANK-L相互作用。
13.按照方面12的氨基酸序列，其是RANK-L的激动剂。
14.按照方面1的氨基酸序列，其防止和/或抑制RANK-L三聚体的形成。
15.按照方面1的氨基酸序列，其防止和/或抑制破骨细胞的分化和/或增殖。
16.按照方面1的氨基酸序列，其调节骨重塑。
17.按照方面1-16中任一项的氨基酸序列，其不结合TRAIL。
18.按照方面1-17中任一项的氨基酸序列，其不结合TNF-α。
19.按照方面1-18中任一项的氨基酸序列，其不结合CD40配体。
20.按照方面1-19中任一项的氨基酸序列，其不结合相关的TNF家族成员。
21.按照方面1-20中任一项的氨基酸序列，其以基本上分离的形式存在。
22.按照方面1-21中任一项的氨基酸序列，其用于施用给受试者，其中所述氨基酸序列在所述受试者中不是天然存在的。
23.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
24.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
25.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
26.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其可以以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力特异性结合RANK-L。
27.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的氨基酸序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的氨基酸序列。
28.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白折叠，或其在适当条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
29.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成。
30.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其为免疫球蛋白序列。
31.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
32.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其是人源化的免疫球蛋白序列，骆驼源化的免疫球蛋白序列，或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
33.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
34.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由来源于常规4链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
35.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)组成，由″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH序列)组成。
36.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由纳米抗体组成。
37.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：1-22的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
38.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
39.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的多肽组成，所述多肽
i)与SEQ ID NO’s：622-729，759-762和766-773的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
40.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。
41.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，除了至少一个用于针对RANK-L结合的结合位点之外，其包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的另外的结合位点。
42.针对RANK-L的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的一个或多个氨基酸残基序列：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或它们的任何适当的组合。
43.按照方面42的氨基酸序列，其中至少一个所述氨基酸残基序列形成用于针对RANK-L结合的抗原结合位点的部分。
44.按照方面42的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的两个或更多个氨基酸残基序列：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：439-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以致(i)当第一氨基酸残基序列对应于a)，b)或c)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于g)，h)或i)所述的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述的氨基酸序列之一。
45.按照方面44的氨基酸序列，其中所述至少两个氨基酸残基的序列形成用于针对RANK-L结合的抗原结合位点的部分。
46.按照方面42-44中任一项的氨基酸序列，其包括三个或更多个氨基酸残基序列，其中所述第一氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
所述第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
并且所述第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
47.按照方面46的氨基酸序列，其中所述至少三个氨基酸残基序列形成用于针对RANK-L结合的抗原结合位点的部分。
48.按照方面42-47中任一项的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。
49.针对RANK-L的氨基酸序列，其交叉阻断按照方面42-48中任一项的至少一个氨基酸序列与RANK-L的结合。
50.针对RANK-L的氨基酸序列，其与RANK-L的结合被按照方面42-48中任一项的至少一个氨基酸序列交叉阻断。
51.按照方面49或50任一项的氨基酸序列，其中在Biacore测定法中检测所述氨基酸序列交叉阻断或被交叉阻断的能力。
52.按照方面49或50任一项的氨基酸序列，其中在ELISA测定法中检测所述氨基酸序列交叉阻断或被交叉阻断的能力。
53.按照方面42-52中任一项的氨基酸序列，其以基本上分离的形式存在。
54.按照方面42-53中任一项的氨基酸序列，其用于施用给受试者，其中所述氨基酸序列在所述受试者中不是天然存在的。
55.按照方面42-54中任一项的氨基酸序列，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
56.按照方面42-55中任一项的氨基酸序列，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
57.按照方面42-56中任一项的氨基酸序列，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
58.按照方面42-57中任一项的氨基酸序列，其可以以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力特异性结合RANK-L。
59.按照方面42-58中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的氨基酸序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的氨基酸序列。
60.按照方面42-59中任一项的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白折叠，或其在适当条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
61.按照方面42-60中任一项的氨基酸序列，其是免疫球蛋白序列。
62.按照方面42-61中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
63.按照方面42-62中任一项的氨基酸序列，其是人源化的免疫球蛋白序列，骆驼源化的免疫球蛋白序列，或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
64.按照方面42-63中任一项的氨基酸序列，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
65.按照方面42-64中任一项的氨基酸序列，其基本上由来源于常规4链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
66.按照方面42-65中任一项的氨基酸序列，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)组成，由″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH序列)组成。
67.按照方面42-66中任一项的氨基酸序列，其基本上由纳米抗体组成。
68.按照方面42-67中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：1-22的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
69.按照方面41-63中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
70.按照方面42-69中任一项的氨基酸序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。
71.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，除了至少一个由CDR序列形成的用于结合的结合位点之外，其包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的另外的结合位点。
72.氨基酸序列，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
73.氨基酸序列，其基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
74.按照方面72-73中任一项的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。
75.针对RANK-L的氨基酸序列，其交叉阻断按照方面72-74中任一项的至少一个氨基酸序列与RANK-L的结合。
76.针对RANK-L的氨基酸序列，其与RANK-L的结合被按照方面72-74中任一项的至少一个氨基酸序列交叉阻断。
77.按照方面75或76任一项的氨基酸序列，其中在Biacore测定法中检测所述氨基酸序列交叉阻断或被交叉阻断的能力。
78.按照方面75或76任一项的氨基酸序列，其中在ELISA测定法中检测所述氨基酸序列交叉阻断或被交叉阻断的能力。
79.按照方面72-78中任一项的氨基酸序列，其基本上以分离的形式存在。
80.按照方面72-79中任一项的氨基酸序列，其用于施用给受试者，其中所述氨基酸序列在所述受试者中不是天然存在的。
81.按照方面72-80中任一项的氨基酸序列，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
82.按照方面72-81中任一项的氨基酸序列，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
83.按照方面72-82中任一项的氨基酸序列，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
84.按照方面72-83中任一项的氨基酸序列，其可以以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力特异性结合RANK-L。
85.按照方面72-84中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的氨基酸序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的氨基酸序列。
86.按照方面72-85中任一项的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白折叠，或其在适当条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
87.按照方面72-86中任一项的氨基酸序列，其是免疫球蛋白序列。
88.按照方面72-87中任一项的氨基酸序列，其是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的免疫球蛋白序列。
89.按照方面72-88中任一项的氨基酸序列，其是人源化的免疫球蛋白序列，骆驼源化的免疫球蛋白序列，或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的免疫球蛋白序列。
90.按照方面73-89中任一项的氨基酸序列，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
91.按照方面72-90中任一项的氨基酸序列，其基本上由来源于常规4链抗体的重链可变结构域序列组成，或其基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
92.按照方面72-91中任一项的氨基酸序列，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)组成，由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)组成，由″dAb″(或适合用作dAb的氨基酸序列)组成或由纳米抗体(包括但不限于VHH序列)组成。
93.按照方面72-92中任一项的氨基酸序列，其基本上由纳米抗体组成。
94.按照方面72-93中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：1-22的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
95.按照方面72-94中任一项的氨基酸序列，其基本上由这样的纳米抗体组成，所述纳米抗体
i)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
96.按照方面72-95中任一项的氨基酸序列，其基本上由人源化的纳米抗体组成。
97.按照前述方面中任一项的氨基酸序列，除了至少一个由所述CDR序列形成的用于结合的结合位点之外，其包含一个或多个用于针对其他抗原、蛋白或靶标结合的另外的结合位点。
98.纳米抗体，其针对和/或可以特异性结合RANK-L。
99.按照方面98的纳米抗体，其针对和/或可以特异性结合RANK-L上的RANK受体结合位点。
100.按照方面98或99任一项的纳米抗体，其针对和/或可以特异性结合RANK-L三聚体上的亚基间受体结合沟。
101.按照方面98-100中任一项的纳米抗体，其调节RANKL-L与RNAK的结合。
102.按照方面101的纳米抗体，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合。
103.按照方面102的纳米抗体，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合，而不减少和/或抑制RANK-L/OPG相互作用。
104.按照方面98-103的纳米抗体，其是RANK-L的拮抗剂。
105.按照方面98的纳米抗体，其针对和/或可以特异性结合在RANK-L上的OPG结合位点。
106.按照方面98或105的纳米抗体，其调节RANKL-L与OPG的结合。
107.按照方面106的纳米抗体，其抑制RANK/RANK-L相互作用。
108.按照方面107的纳米抗体，其是RANK-L的拮抗剂。
109.按照方面106的纳米抗体，其不减少和/或抑制RANK/RANK-L相互作用。
110.按照方面109的纳米抗体，其是RANK-L的激动剂。
111.按照方面98的纳米抗体，其防止和/或抑制RANK-L三聚体的形成。
112.按照方面98的纳米抗体，其防止和/或抑制破骨细胞的分化和/或增殖。
113.按照方面98的纳米抗体，其调节骨重塑。
114.按照方面98-113中任一项的纳米抗体，其不结合TRAIL。
115.按照方面98-114中任一项的纳米抗体，其不结合TNF-α。
116.按照方面98-115中任一项的纳米抗体，其不结合CD40配体。
117.按照方面98-116中任一项的纳米抗体，其不结合相关的TNF家族成员。
118.按照方面98-117中任一项的纳米抗体，其基本上以分离的形式存在。
119.按照方面98或118任一项的纳米抗体，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
120.按照方面98-119中任一项的纳米抗体，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
121.按照方面98-120中任一项的纳米抗体，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
122.按照方面98-121中任一项的纳米抗体，其可以以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力特异性结合RANK-L。
123.按照方面98-122中任一项的纳米抗体，其是天然存在的纳米抗体(来自任何适宜的物种)、或者是合成的或半合成的纳米抗体。
124.按照方面98-123中任一项的纳米抗体，其是VHH序列，部分人源化的VHH序列，完全人源化的VHH序列，骆驼源化的重链可变结构域，或是已经通过诸如亲和力成熟的技术获得的纳米抗体。
125.按照方面98-124中任一项的纳米抗体，其
i)与SEQ ID NO’s：1-22的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
126.按照方面98-125中任一项的纳米抗体，其
i)与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基优选选自表A-3中提及的标志残基。
127.按照方面98-126中任一项的纳米抗体，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有3，2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
128.按照方面98-129中任一项的纳米抗体，其中：
-CDR1选自由下列各项组成的组：
a)SEQ ID NO’s：188-249的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO’s：188-249的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自由下列各项组成的组：
d)SEQ ID NO’s：312-373和758的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO’s：312-373和758的至少一个氨基酸序列具有3，2，或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自由下列各项组成的组：
g)SEQ ID NO’s：436-497的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO’s：436-497的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO’s：439-497的至少一个氨基酸序列具有3，2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
129.按照方面98-128中任一项的纳米抗体，其中所述CDR序列与SEQID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一性，诸如95％的氨基酸同一性或更多或者甚至基本上100％的氨基酸同一性。
130.按照方面98-129中任一项的纳米抗体，其是部分人源化的纳米抗体。
131.按照方面98-130中任一项的纳米抗体，其是完全人源化的纳米抗体。
132.按照方面98-131中任一项的纳米抗体，其选自由SEQ ID NO’s：560-621组成的组，或选自由与SEQ ID NO’s：560-621的至少一个氨基酸序列具有大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，诸如99％或更多序列同一性(如本发明所定义)的氨基酸序列组成的组。
133.按照方面98-131中任一项的纳米抗体，其是这样的人源化纳米抗体，所述纳米抗体选自由SEQ ID NO’s：730-757和765组成的组，或选自由与SEQ ID NO’s：730-757和765的至少一个氨基酸序列具有大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，诸如99％或更多序列同一性(如本发明所定义)的氨基酸序列组成的组。
134.按照方面98-133中任一项的纳米抗体，其选自由SEQ ID NO’s：560-621组成的组或选自由SEQ ID NO’s：730-757和765组成的组。
135.针对RANK-L的纳米抗体，其交叉阻断按照方面42-48或72-74中任一项的至少一种氨基酸序列或按照方面127-134中任一项的纳米抗体与RANK-L的结合。
136.针对RANK-L的纳米抗体，其与RANK-L的结合被按照方面42-48或72-74中任一项的至少一种氨基酸序列或按照方面127-143中任一项的纳米抗体交叉阻断。
137.按照方面135或136任一项的纳米抗体，其中在Biacore测定法中检测所述纳米抗体交叉阻断或被交叉阻断的能力。
138.按照方面135或136任一项的纳米抗体，其中在ELISA测定法中检测所述纳米抗体交叉阻断或被交叉阻断的能力。
139.多肽，其包括按照方面1-97中任一项的一个或多个氨基酸序列和/或按照方面98-138中任一项的一个或多个纳米抗体或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个肽接头连接的一个或多个其他氨基酸结合单位。
140.按照方面139的多肽，其中所述一个或多个结合单位是免疫球蛋白序列。
141.按照方面139或140任一项的多肽，其中所述一个或多个其他结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
142.按照方面139-141中任一项的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列是免疫球蛋白序列。
143.按照方面139-142中任一项的多肽，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
144.按照方面139-143中任一项的多肽，其包括按照方面98-138中任一项的一个或多个纳米抗体或基本上由其组成，其中所述一个或多个其他结合单位是纳米抗体。
145.按照方面139-144中任一项的多肽，其是多价构建体。
146.按照方面139-145中任一项的多肽，其是多互补位的构建体。
147.按照方面139-146中任一项的多肽，其是多特异性构建体。
148.按照方面139-147中任一项的多肽，其分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，具有增加的半衰期。
149.按照方面148的多肽，其中分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，所述一个或多个其他结合单位为所述多肽提供增加的半衰期。
150.按照方面149的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段、可以结合血清蛋白的结合单位、Fc部分、和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。
151.按照方面149的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。
152.按照方面149的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由可以结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的结合单位组成的组。
153.按照方面149的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或可以结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的纳米抗体。
154.按照方面149的多肽，其中为所述多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位是可以结合血清白蛋白(如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(如IgG)的纳米抗体。
155.按照方面148-154中任一项的多肽，其具有是相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身的半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或大于20倍的血清半衰期。
156.按照方面148-155中任一项的多肽，分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，其具有增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
157.按照方面148-156中任一项的多肽，其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。
158.化合物或构建体，其包括按照方面1-97中任一项的一个或多个氨基酸序列和/或按照方面98-138中任一项的一个或多个纳米抗体或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位。
159.按照方面158的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
160.按照方面158-159任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个氨基酸序列。
161.按照方面158-160中任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是免疫球蛋白序列。
162.按照方面158-161中任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
163.按照方面158-162中任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列是免疫球蛋白序列。
164.按照方面158-163中任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
165.化合物或构建体，其包括一个或多个按照方面98-138中任一项的纳米抗体或基本上由其组成，并且其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是纳米抗体。
166.按照方面158-165中任一项的化合物或构建体，其是多价构建体。
167.按照方面158-166中任一项的化合物或构建体，其是多互补位的构建体。
168.按照方面158-167中任一项的化合物或构建体，其是多特异性构建体。
169.按照方面158-168中任一项的化合物或构建体，分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或与按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，所述化合物或构建体具有增加的半衰期。
170.按照方面169的化合物或构建体，其中分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或与按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位为所述化合物或构建体提供增加的半衰期。
171.按照方面170的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单位，Fc部分，以及可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。
172.按照方面170的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。
173.按照方面170的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位选自由可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的结合单位组成的组。
174.按照方面170的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”，适合用作dAb的氨基酸序列，或可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的纳米抗体。
175.按照方面170的化合物或构建体，其中为所述化合物或构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的纳米抗体。
176.按照方面169-175中任一项的化合物或构建体，其具有分别是相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的血清半衰期。
177.按照方面169-176中任一项的化合物或构建体，分别与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身相比较，所述化合物或构建体具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
178.按照方面169-177中任一项的化合物或构建体，其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。
179.单价构建体，其包括按照方面1-97中任一项的一个氨基酸序列和/或按照方面98-138中任一项的一个纳米抗体或基本上由其组成。
180.按照方面179的单价构建体，其中所述本发明的氨基酸序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
181.单价构建体，其包括按照方面98-138中任一项的一个纳米抗体或基本上由其组成。
182.核酸或核苷酸序列，其编码下列各项：按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、或按照方面179-181中任一项的单价构建体。
183.按照方面182的核酸或核苷酸序列，其以遗传构建体的形式存在。
184.宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达或其在适当的环境下能够表达下列各项：按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、或按照方面179-181中任一项的单价构建体；和/或所述宿主或宿主细胞包括按照方面182的核酸或核苷酸序列、或按照方面183的遗传构建体。
185.组合物，其包括至少一种下列各项：按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面179-181中任一项的单价构建体、或按照方面182-183的核酸或核苷酸序列。
186.按照方面185的组合物，其是药物组合物。
187.按照方面186的组合物，其是药物组合物，其还包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，且其任选地包括一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。
188.用于生产按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面186或187任一项的药物组合物、或按照方面179-181中任一项的单价构建体的方法，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列获得，所述方法至少包括下列步骤：
-在适当的宿主细胞或宿主生物体内或在另一种适当的表达系统内表达按照方面182的核酸或核苷酸序列、或按照方面183的遗传构建体；
任选地接着：
-分离和/或纯化这样获得的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列，按照方面98-138中任一项的纳米抗体，按照方面139-157中任一项的多肽，按照方面158-178中任一项的化合物或构建体，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得，或按照方面179-181中任一项的单价构建体。
189.用于生产按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面186或187任一项的药物组合物、或按照方面179-181中任一项的单价构建体的方法，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列获得，所述方法至少包括下列步骤：
-在这样的条件下培育和/或维持按照方面184的宿主或宿主细胞，所述条件是这样的，以致所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种按照方面1-97中任一项的氨基酸序列，按照方面98-138中任一项的纳米抗体，按照方面139-157中任一项的多肽，按照方面158-178中任一项的化合物或构建体，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得，或按照方面179-181中任一项的单价构建体，
任选地，然后：
-分离和/或纯化下列各项：按照方面1-97中任一项的氨基酸序列，按照方面98-138中任一项的纳米抗体，按照方面139-157中任一项的多肽，按照方面158-178中任一项的化合物或构建体，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得，或这样获得的按照方面179-181中任一项的单价构建体。
190.用于筛选针对RANK-L的氨基酸序列的方法，所述方法包括至少下述步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合和/或具有针对RANK-L的亲和性且被交叉阻断或交叉阻断本发明的纳米抗体如SEQ IDNO’s：560-621、或本发明的人源化纳米抗体如SEQ ID NO’s：730-757和765、或本发明的多肽或构建体如SEQ ID NO’s：622-729、759-762和766-773的氨基酸序列的核酸序列；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
191.用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面179-181中任一项的单价构建体、或按照方面186或187的组合物。
192.用于预防和/或治疗至少一种疾病或病症的方法，所述疾病或病症与RANK-L、与其生物学或药物活性、和/或与其中涉及RANK-L的生物学途径或信号传导相关，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面179-181中任一项的单价构建体、或按照方面186或187的组合物。
193.用于预防和/或治疗至少一种疾病或病症的方法，所述疾病或病症可以通过给有此需要的受试者施用按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、或按照方面179-181中任一项的单价构建体而得到预防和/或治疗，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面179-181中任一项的单价构建体、或按照方面186或187的组合物。
194.用于免疫治疗的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、按照方面179-181中任一项的单价构建体、或按照方面186或187的组合物。
195.按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、或按照方面179-181中任一项的单价构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的药物组合物中的应用和/或在用于按照方面191-194的一种或多种方法中的应用。
196.按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、按照方面98-138中任一项的纳米抗体、按照方面139-157中任一项的多肽、按照方面158-178中任一项的化合物或构建体、或按照方面179-181中任一项的单价构建体用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的应用。
197.按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、或按照方面98-138中任一项的纳米抗体的部分或片段。
198.按照方面197的部分或片段，其针对和/或可以特异性结合RANK-L上的RANK受体结合位点。
199.按照方面197或198任一项的部分或片段，其针对和/或可以特异性结合RANK-L三聚体上的亚基间受体结合沟。
200.按照方面197-199中任一项的部分或片段，其调节RANKL-L与RNAK的结合。
201.按照方面200的部分或片段，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合。
202.按照方面201的部分或片段，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合，而不减少和/或抑制RANK-L/OPG相互作用。
203.按照方面197-202中任一项的部分或片段，其是RANK-L的拮抗剂。
204.按照方面197的部分或片段，其针对和/或可以特异性结合在RANK-L上的OPG结合位点。
205.按照方面197或204中任一项的部分或片段，其调节RANKL-L与OPG的结合。
206.按照方面205的部分或片段，其抑制RANK/RANK-L相互作用。
207.按照方面206的部分或片段，其是RANK-L的拮抗剂。
208.按照方面205的部分或片段，其不减少或抑制RANK/RANK-L相互作用。
209.按照方面208的部分或片段，其是RANK-L的激动剂。
210.按照方面197的部分或片段，其防止和/或抑制RANK-L三聚体的形成。
211.按照方面197的部分或片段，其防止和/或抑制破骨细胞的分化和/或增殖。
212.按照方面197的部分或片段，其调节骨重塑。
213.按照方面197-212中任一项的部分或片段，其不结合TRAIL。
214.按照方面197-213中任一项的部分或片段，其不结合TNF-α。
215.按照方面197-214中任一项的部分或片段，其不结合CD40配体。
216.按照方面197-215中任一项的部分或片段，其不结合相关的TNF家族成员。
217.按照方面197-216中任一项的部分或片段，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
218.按照方面197-217中任一项的部分或片段，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
219.按照方面197-218中任一项的部分或片段，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
220.化合物或构建体，其包括一个或多个按照方面197-219中任一项的部分或片段或基本上由其组成，且任选还包括任选通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位。
221.按照方面220的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
222.按照方面220或221任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个氨基酸序列。
223.核酸或核苷酸序列，其编码按照方面197-219中任一项的部分或片段、或按照方面222的化合物或构建体。
224.组合物，其包括至少一个按照方面197-219中任一项的部分或片段、按照方面220-222中任一项的化合物或构建体、或按照方面223的核酸或核苷酸序列。
225.按照方面1-97中任一项的氨基酸序列、或按照方面98-138中任一项的纳米抗体的衍生物。
226.按照方面225的衍生物，其可以特异性结合RANK-L。
227.按照方面226的衍生物，其针对和/或可以特异性结合RANK-L上的RANK受体结合位点。
228.按照方面226或227任一项的衍生物，其针对和/或可以特异性结合RANK-L三聚体上的亚基间受体结合沟。
229.按照方面226-228中任一项的衍生物，其调节RANKL-L与RNAK的结合。
230.按照方面229的衍生物，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合。
231.按照方面230的衍生物，其抑制和/或防止RANKL-L与RANK结合，而不减少和/或抑制RANK-L/OPG相互作用。
232.按照方面226-231中任一项的衍生物，其是RANK-L的拮抗剂。
233.按照方面226的衍生物，其针对和/或可以特异性结合在RANK-L上的OPG结合位点。
234.按照方面226或233的衍生物，其调节RANKL-L与OPG的结合。
235.按照方面234的衍生物，其抑制和/或防止RANK/RANK-L相互作用。
236.按照方面235的衍生物，其是RANK-L的拮抗剂。
237.按照方面234的衍生物，其不减少或抑制RANK/RANK-L相互作用。
238.按照方面237的衍生物，其是RANK-L的激动剂。
239.按照方面226的衍生物，其防止和/或抑制RANK-L三聚体的形成。
240.按照方面226的衍生物，其防止和/或抑制破骨细胞的分化和/或增殖。
241.按照方面226的衍生物，其调节骨重塑。
242.按照方面226-241中任一项的衍生物，其不结合TRAIL。
243.按照方面226-242中任一项的衍生物，其不结合TNF-α。
244.按照方面226-243中任一项的衍生物，其不结合CD40配体。
245.按照方面226-244中任一项的衍生物，其不结合相关的TNF家族成员。
246.按照方面226-245中任一项的衍生物，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
247.按照方面226-246中任一项的衍生物，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
248.按照方面226-247中任一项的衍生物，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
249.按照方面158-178中任一项的化合物或构建体的衍生物。
250.按照方面249的衍生物，其可以特异性结合RANK-L。
251.按照方面249-250中任一项的衍生物，其可以以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合RANK-L。
252.按照方面249-251中任一项的衍生物，其可以以102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)特异性结合RANK-L。
253.按照方面249-252中任一项的衍生物，其可以以1s-1-10-6s-1，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koff速率)特异性结合RANK-L。
254.按照方面225-253中任一项的衍生物，其具有是相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身、按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身、按照方面139-157中任一项的多肽、或按照方面158-178中任一项的化合物或构建体本身的半衰期至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或大于20倍的血清半衰期。
255.按照方面225-254中任一项的衍生物，所述衍生物与相对应的按照方面1-97中任一项的氨基酸序列本身、或按照方面98-138中任一项的纳米抗体本身、按照方面139-157中任一项的多肽、或按照方面158-178中任一项的化合物或构建体本身相比较，具有增加超过1小时、优选超过2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
256.按照方面225-255中任一项的衍生物，其在人中具有至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期；例如，至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。
257.按照方面225-256中任一项的衍生物，其是聚乙二醇化的衍生物。
258.化合物或构建体，其包括一个或多个按照方面225-257任一项的衍生物或基本上由其组成，且任选地还包括任选通过一个或多个接头连接的一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位。
259.按照方面258的化合物或构建体，其中所述一个或多个其他基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
260.按照方面258或259任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个接头，如果存在的话，是一个或多个氨基酸序列。
261.编码按照方面225-257中任一项的一个衍生物、或按照方面258-260中任一项的化合物或构建体的核酸。
262.组合物，其包括至少一个按照方面225-257中任一项的衍生物、按照方面258-260中任一项的化合物或构建体，或按照方面261的核酸或核苷酸序列。
附图图例
图1：实施例3.2中所述的使用TNFα，TRAIL，CD40L和RANK-L的竞争ELISA的结果。A：RANKL6纳米抗体的结合；B：RANKL9纳米抗体的结合；C：RANKL13纳米抗体的结合；D：RANKL15纳米抗体的结合；E：RANKL18纳米抗体的结合。
图2：如实施例4.3所述，使用单价和三价抗-RANK-L纳米抗体的基于细胞的竞争性结合测定的结果。A：使用RANKL13和RANKL130纳米抗体的抑制；B：使用RANKL15和RANKL150纳米抗体的抑制；C：使用RANKL18和RANKL180纳米抗体的抑制。实线：单价纳米抗体；长虚线：三价双特异性纳米抗体；短虚线：不相关的纳米抗体.
图3：纳米抗体对人破骨细胞分化的作用。结果显示为TRACP 5b值。组为：BL＝基线(不加入化合物)；C＝对照(100ng/ml OPG)；A1＝0.05nM；A2＝0.3nM；A3＝1nM；A4＝3nM；A5＝10nM；A6＝50nM；A7＝250nM。使用单向ANOVA，将所有组的结果分别与基线组的结果进行比较。星号表示与基线相比较统计学显著性抑制作用。所有的纳米抗体均剂量依赖性地抑制破骨细胞的分化(***p＜0.001)。3-A：RANKL60；3-B：RANKL130；3-C：RANK-L180。
图4：(A)血清NTx水平表示为在施用纳米抗体时的基线的％变化(不包括低于检测极限的值)。(B)平均血清NTx水平表示为在施用小分子Ibamdronate(IBN)或阴性对照纳米抗体ALB-1时的基线的％变化。
图5：血清BAP水平，表示为在施用纳米抗体时的基线的％变化。
图6：人源化RANKL13hum5(SEQ ID NO：755)与野生型分子RANKL13(SEQ ID NO：572)和与人种系VH3-23(SEQ ID NO：763)前97个氨基酸残基的比对。人源化的aa残基用红色表示，而CDR1，2和3用绿色突出表示。
图7：在AlphaScreen测定法中分析RANKL13，RANKL13hum5和RANKL13hum5_D62E的功效。
图8：RANK-L130NT和RANKL 008a与固定的RANK-L的结合。在白蛋白的存在下，RANK-L 130NT(浅蓝色)和Rank-L 008a(粉色)与固定的Rank-L的结合。
图9：RANKL18hum6结合的叠加的传感图(sensorgrams)。RANKL18hum6：500nM RANKL18hum6结合120秒。混合物：500nMRANKL18hum6结合120秒，然后注射包含500nM RANKL18hum6和RANKL13hum5的混合物。
图10：RANKL13hum5结合的叠加的传感图。RANKL13hum5：500nMRANKL13hum5结合120秒。混合物：500nM RANKL13hum5结合120秒，然后注射包含500nM的RANKL13hum5和RANKL18hum6的混合物。
图11：对RANK-L诱导的RAW264.7细胞分化的抑制。RAW264.7细胞(2000个细胞/孔)用稀释系列的RANKL008a(●)，RANKL003p(■)，或不相关的纳米抗体(▲)温育，且用7.5ng/mL RANK-L诱导分化。4天后，测量上清中酒石酸-抗性酸性磷酸酶活性。显示一式两份测量的平均值±s.e.。阳性对照(即，无纳米抗体)用○表示；阴性对照(即，无RANK-L)用(□)表示。
图12：对RANK-L与RANK相互作用的抑制。稀释系列的RANKL008a(●)，RANKL003p(▲)或护骨蛋白()与7.5ng/mL RANK-L和200ng/mL RANK-Fc一起温育。将混合物转移到用抗-Fc纳米抗体PMP02包被的96-孔板中。检测残留的结合的RANK-L。
图13：RANKL008a与人血清白蛋白的结合。96-孔板用HSA包被。在封闭后，应用稀释系列的RANKL008a。用辣根过氧化物酶标记的二价纳米抗体检测结合的RANKL008a。)
图14：RANKL008a与HSA和RANK-L的双官能性结合。A)微量滴定板用中性链亲和素(neutravidin)包被，之后结合生物素酰化的RANK-L。孔用稀释系列的RANKL008a温育。用辣根过氧化物酶标记的白蛋白检测结合的RANKL008a。一式两份测量的平均值±s.e；B)微量滴定板用HSA包被，之后应用稀释系列的RANKL008a。用生物素酰化的RANK-L然后是辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白检测结合的RANKL008a。
图15：在静脉内或皮下施用(3mg/kg)的RANKL008a(8-A)，RANKL001p(8-B)或RANKL003p(8-C)纳米抗体时的血清NTx水平(不包括低于检测极限的值)。
图16：在施用(0.3mg/kg；0.03mg/kg)的RANKL008a(9-A)，RANKL001p(9-B)或RANKL003p(9-C)纳米抗体时的血清NTx水平(不包括低于检测极限的值)。
图17：纳米抗体与其他TNF家族成员TNFα和TRAIL以及与小鼠RANK-L的交叉反应性。
实施例
实施例1：鉴定阻断RANK-L的纳米抗体
1.1免疫
免疫两头美洲驼(No.115和No.116)，免疫按照标准流程进行，在美洲驼No.116用9次肌内注射(100或50μg/剂量，以每周的时间间隔)交替的人RANK-L(R&D Systems(R&D系统)，Minneapolis，MN，US)和小鼠RANK-L(R&D Systems(R&D系统)，Minneapolis，MN，US)，和在美洲驼No.115中前5次这样注射。在美洲驼115中的后4次注射仅是人RANK-L。将两种抗原配制在Stimune(Cedi-Diagnostics B.V.，Lelystad，荷兰)中。在第3周，收集血清以通过ELISA定义针对人和小鼠RANK-L的抗体滴度。简言之，96-孔Maxisorp板(Nunc，Wiesbaden，德国)用人或小鼠RANK-L包被。在封闭和加入血清样品之后，通过使用HRP(辣根过氧化物酶)缀合的山羊抗-美洲驼免疫球蛋白(Bethyl Laboratories Inc.，Montgomery，Texas USA)和在存在底物TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)的条件下的随后的酶促反应，证实抗-RANK-L抗体的存在。在两头动物中，对于人和小鼠RANK-L的OD450nm超过1。
1.2文库构建
使用Ficoll-Hypaque按照供应商的使用说明由血清样品制备外周血单核细胞。接着，从这些细胞中提取总RNA，且用作RT-PCR的起始原料，以扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆到自制的噬菌粒载体中。按照标准方法(例如，参见本发明引用的现有技术和申请人提交的申请)制备噬菌体，并且在过滤灭菌后保存在4℃备用。
1.3选择
从美洲驼No.115和No.116获得的噬菌体文库用于不同的选择策略。
在第一选择中，将处于1，0.1，0.01μg/ml的生物素酰化的hRANK-L(表达在小鼠骨髓瘤NS0细胞系中)(R&D Systems，Minneapolis，US)捕获在中性链亲和素包被的固相上。在用所述噬菌体文库温育和彻底洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/ml)非特异性洗脱结合的噬菌体。
在第二选择中，可溶的生物素酰化的hRANK-L(R&D Systems，Minneapolis，US)(1nM，100pM，10pM)与所述噬菌体文库温育。在彻底洗涤之后，将生物素酰化的hRANK-L捕获在中性链亲和素包被的固相上。用胰蛋白酶(1mg/ml)非特异性洗脱结合的噬菌体。
在第三选择中，将处于1，0.1，0.01μg/ml的hRANK-L(在大肠杆菌中表达)(Peprotech，London，UK)包被在Maxisorp 96-孔板上(Nunc，Wiesbaden，德国)。在与所述噬菌体文库温育和彻底洗涤之后，用胰蛋白酶(1mg/ml)非特异性洗脱结合的噬菌体。
在所有选择中，观察到富集。将选择的结果作为一个汇合重新克隆到自制的表达载体中。挑取菌落，且生长在96深孔平板(1ml体积)中，且通过加入IPTG诱导纳米抗体表达。按照标准方法(例如，参见本文引用的现有技术和申请人提交的申请)制备周质提取物(体积：～80μl)。
1.4在α筛选(Alphascreen)测定法中筛选阻断RANK-L的纳米抗体
在RANKα筛选测定法中筛选周质提取物，以评估所表达的纳米抗体的阻断能力。该测定依赖于使用可以缀合到生物分子上的供体和接受体珠。当分子间的生物学相互作用使得珠靠近时，激发单态氧分子，其由供体珠中的光敏剂在680nm激光激发时产生，传播以与接受体珠中的化学发光剂反应，其进一步激活随后在520-620nm处发光的荧光团。如果所述纳米抗体抑制RANK-L与RANK的结合，荧光输出将减少，且存在的纳米抗体的量将与荧光的量负相关。
将人RANK-L用生物素(Sigma(西格玛)，St Louis，MO，US)和生物素氨基己酸3-磺-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sigma(西格玛)，St Louis，MO，US)进行生物素酰化。按照供应商(Perkin Elmer，Waltham，MA，US)的使用说明，将RANK-huFc嵌合体(chimera)(Alexis，Biochemicals，Lausen，瑞士)偶联到接受体珠上。为了评估抗-hRANK-L纳米抗体的中和能力，将稀释系列的周质提取物用生物素酰化的人RANK-L预先温育。向该混合物中，加入接受体珠和链霉抗生物素蛋白供体珠，且在室温下继续温育1小时。通过利用激发波长680nm和发射波长520nm在EnVision Multilabel平板读取仪(Perkin Elmer)读取平板而测量荧光。荧光信号的减少表示生物素酰化的RANK-L与RANK受体的结合的受到在周质提取物中表达的纳米抗体的阻断。
从该筛选中，选择并测序抑制性的纳米抗体。测序分析揭示12种独特的纳米抗体和10个纳米抗体家族。相对应的序列显示在表C-1和表B-1中。非抑制性纳米抗体的序列显示在表B-2中。
实施例2：在α筛选测定法和ELISA中表征21种阻断RANK-L的纳米抗体
2.1纳米抗体表达和纯化
进一步纯化和表征在实施例1所述的筛选中选择的20种抑制性纳米抗体。选择的纳米抗体作为c-myc，His6-标记的蛋白表达在50mL的培养体积的大肠杆菌中。通过添加1mM IPTG且允许在37℃继续4小时而诱导表达。在离心细胞培养物后，通过冷冻-解冻沉淀物而制备周质提取物。将这些提取物用作起始材料用于固定的金属亲和层析(IMAC)。用150mM咪唑从该柱上洗脱纳米抗体，且随后用PBS透析。
2.2纳米抗体结合包被在maxisorp 96-孔板上的可溶的hRANK-L。
首先，将生物素酰化的hRANK-L(200ng/ml)捕获在中性链亲和素包被的96-孔板上。因此，2μg/ml中性链亲和素在4℃包被过夜。将板用300μlPBS洗涤5次，然后用300μl 1％酪蛋白/PBS在室温下封闭2小时。在封闭之后，向孔中添加生物素酰化的RANK-L(200ng/ml)，并在室温下温育1小时。在用PBS彻底洗涤后，向孔中加入从500nM起始到160pM的稀释在1％酪蛋白/PBS中的不同浓度的纳米抗体，且将板在室温下温育1小时。通过随后温育一级小鼠抗-myc抗体和二级小鼠-HRP缀合物(DAKO，Glostrup，丹麦)和使用TMB-H2O2(Pierce，Rockford，IL，美国)底物混合物检测结合的纳米抗体。反应用H2SO4终止，且在450nm读取OD。所有纳米抗体均以剂量-依赖性方式结合包被在板上的hRANK-L。计算的ED50值显示在表C-2中。
还在如关于人RANK-L所述的相似的设置中(参见上文)，分析同一组的纳米抗体与鼠源RANK-L的结合。仅有纳米抗体RANKL3可以以剂量-依赖性方式结合鼠源RANK-L，其ED50约为600pM。
2.3在α筛选中，纳米抗体阻断RANK-L与其同源受体RANK的结合。
使用生物素(Sigma(西格玛)，St Louis，MO，US)和生物素氨基己酸3-磺基-N-羟基琥珀酸亚胺酯钠盐(Sigma(西格玛)，St Louis，MO，US)将人RANK-L生物素酰化。按照供应商的使用说明(Perkin Elmer，Waltham，MA，US)将RANK-huFc嵌合体(1nM)(Alexis，Biochemicals，Lausen，瑞士)偶联到接受体珠上。
将从50nM起始至1pM的稀释系列的抗-RANK-L纳米抗体在RT下与100pM生物素酰化的RANK-L预温育30分钟。向该混合物中，加入RANK接受体珠和链霉抗生物素蛋白供体珠，且在室温下继续温育1小时。通过利用激发波长680nm和发射波长520nm在EnVision Multilabel板读取仪(Perkin Elmer)读取所述板而测量荧光。
用生物素酰化的RANK-L预温育所有纳米抗体减少在520nm处的荧光强度，这证明所述纳米抗体可以以剂量-依赖性方式有效抑制RANK-L与RANK的结合。计算的IC50值显示在表C-3中，且从关于RANKL9的137pM至关于RANKL23的3530pM不等。
实施例3：RANKL 6，9，13，15，18的结合特异性
3.1RANKL 6，9，13，15，18特异性结合细胞膜表达的人和食蟹猴RANK-L。
人和食蟹猴的RANK-L在人胚肾细胞(HEK293T；Wullaert等.2007，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)282：81-90)中表达为全长、膜-结合的蛋白。通过按下述对细胞的FACS分析评估纳米抗体与细胞表面表达的RANK-L的结合。
将人胚肾细胞(HEK293T)生长在补充了10％胎牛血清(FBS)，2nM L-谷氨酰胺，0.4mM丙酮酸钠的Dulbecco’s改良的Eagles’s培养基中。使用和Optimem(Roche Molecular Biochemicals(罗氏分子生物医学)，Indianapolis，IN，US)按照供应商的使用说明，用表达全长人或全长食蟹猴RANK-L的质粒瞬时转染HEK293T细胞。48小时后，将转染的细胞进行FACS分析。将转染子以在FACS缓冲液(PBS+10％FBS)中5E+06/ml的终浓度接种在96-孔板中，且在4℃与不同浓度的纳米抗体(对于hRANK-L转染子，2nM，400pM，80pM，16pM，3，2pM；对于食蟹猴RANK-L转染子，2nM，400pM)温育1小时。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤三次。通过随后的一级小鼠抗Myc抗体温育(在4℃30分钟(2μg/ml))和用山羊抗小鼠-藻红蛋白(PE)(Jackson Laboratories)在4℃继续二次温育30分钟来检测结合的纳米抗体。最后，洗涤后，将细胞重悬在PBS+10％FBS+(5nM)(Molecular ，Invitrogen，Merelbeke，比利时)中，且使用流式细胞术测量细胞表面荧光，将其表示为平均PE荧光。在所有检测的浓度中，所有的纳米抗体均表现出与表达在HEK293T细胞上的人RANK-L和食蟹猴RANK-L的剂量-依赖性结合(表C-4)。因为向400pM纳米抗体与HEK293T转染子的温育混合物中加入40nM可溶的人RANK-L消除了各自纳米抗体与细胞的结合(数据未显示)，所以结合是特异性的。
3.2RANKL6，9，13，15，18不与TNF家族成员TNFα，CD40配体(CD40L) 或TRAIL结合。
已经报道人OPG表现出与肿瘤坏死因子相关的诱导细胞程序性死亡的配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的弱结合。RANK-L氨基酸序列表现出与TRAIL的氨基酸序列34％的相似性。
在竞争性ELISA中，已经表明抗-RANK-L纳米抗体不结合TNF家族成员TNFα，TRAIL和CD40L。将RANK-L如实施例2所述包被在96-孔板上。将纳米抗体RANKL 6，9，13，15和18(1nM)在将它们添加到板中之前与不同浓度的RANK-L，TNFα，CD40L或TRAIL(约100nM下降至40pM)预温育。所述纳米抗体与RANK-L包被的板的结合仅受到外源加入的RANK-L的抑制，且不受其他配体的添加的影响(图1)。
实施例4：三价双特异性抗RANKL纳米抗体相对单价负体的中和活性
4.1三价双特异性抗-RANK-L纳米抗体的构建和表达
RANKL3，RANKL6，RANKL9，RANKL13，RANKL15和RANKL18也表达为三价双特异性抗-RANK-L纳米抗体。所述三价分子(例如，RANKL6-ALB1-RANKL6)包括两个对应于抗-RANK-L纳米抗体的结构单元(building block)，在中间是对应于抗人血清白蛋白(HSA)纳米抗体结构单元(ALB-1；SEQ ID NO：790)的第三结构单元。单个的结构单元通过Gly/Ser(GGGGSGGGS；SEQ ID NO：792)接头融合。这些三价双特异性抗-RANK-L纳米抗体的序列显示在表B-3中。这些构建体在大肠杆菌中表达为c-myc，His6-标记的蛋白，且随后通过固定的金属亲和层析(IMAC)和尺寸排阻层析(SEC)从培养基中纯化。
4.2在α-筛选中三价纳米抗体对RANK-L与RANK结合的抑制
在α-筛选测定法中，将5种三价纳米抗体(RANKL30：RANKL3-ALB1-RANKL3；RANKL60：RANKL6-ALB1-RANKL6，RANKL90：RANKL9-ALB1-RANKL9，RANKL130：RANKL13-ALB1-RANKL13，RANKL150：RANKL15-ALB1-RANKL15，RANKL180：RANKL18-ALB1-RANKL18)与它们的单价负体进行比较，以评价它们是否也能够阻断RANK-L与其同源受体的结合。
α-筛选如实施例2中所示进行。如在表C-5中所述，当与相对应的单价分子进行比较时，所有的三价纳米抗体均以剂量依赖性方式阻断RANK-L与RANK受体的结合，具有增加的功效。
4.3抗-RANK-L纳米抗体对RANK-L与表达在HEK293T细胞膜上的
RANK结合的抑制
使用如实施例3所述的Fugene6，用表达全长RANK的质粒瞬时转染HEK293T细胞。24小时后，将60μl的等分试样(7.5x103个细胞)接种到FMAT系统384孔板(PE Biosystems(PE生物系统)，CA，US)中，且允许黏附24小时。过夜黏附后，通过轻轻敲击所述板而去除培养物上清。为了开始竞争性筛选，将稀释在PBS+10％BSA(FMAT缓冲液)中的20μlALEXA647-标记的人RANK-L(200pM终浓度)和20μl稀释系列的(200nM减少至0.075pM)不同的单价和三价纳米抗体添加到包含细胞的FMAT系统384-孔板中(PE Biosystems(PE生物系统)，CA)。温育10小时后，扫描该平板。通过8200细胞检测系统(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，US)测量细胞表面荧光，该系统是能够使用活细胞进行混合-和-读取测定的荧光-宏观-共焦、生物学结合事件分析仪。
表C-6和图2显示纳米抗体以剂量依赖性方式阻断RANK-L与其受体的结合，且三价形式表现出比单价分子增加的功效。
4.4在HEK293T细胞中，抗-RANK-L纳米抗体对RANK-L诱导的NF-KB 活化的抑制
RANK-L刺激的破骨细胞发生与NF-κB活化相关。最可能地，RANK-L激活最常见的二聚体p50/p65(Wei等，2001，Endocrinology(内分泌学)142(3)：1290-1295)。Xing等.(2002，J Bone Miner.Res.(骨骼矿物质研究杂志)17(7)：1200-1210)已经表明了NF-kB p50和p52分子在破骨细胞发生中的重要作用，其报道NF-κB p50和p52对于表达RANK的破骨细胞前体响应RANK-L分化为TRAP+破骨细胞是重要的。此外，据说p50和p52双敲除的小鼠由于不能生成成熟的破骨细胞而发展严重的骨硬化症(Franzoso等.1998，Genes & Development(基因和发育)11：3482-3496)。综上所述，RANK-L诱导的NF-κB活化对于成熟破骨细胞的形成是重要的。
为了评估纳米抗体对RANK-L诱导的NF-κB活化的作用，如实施例3所述用NF-κB报道基因质粒和编码β-半乳糖苷酶的质粒瞬时转染HEK293T细胞，后一种质粒用来校正转染效率。24小时后，将细胞接种在96孔板中。
再过24小时后，细胞保持不处理，或在存在恒定量的人RANK-L(300ng/ml)和不同量的指示抗-RANK-L纳米抗体(200nM减少至约10pM)的条件下温育。6小时后，裂解细胞；使用双光试剂盒(Tropix/Applied Biosystems(Tropix/应用生物系统)，Foster City，CA，US)按照供应商的使用说明，测定荧光素酶(Luc)和β-半乳糖苷酶活性。Luc值关于β-半乳糖苷酶值标准化，以校正转染效率的差异。如在表C-7中所述，所有的抗-RANK-L纳米抗体均以剂量依赖性方式抑制RANK-L诱导的NF-κB活化。计算的IC50值表明三价纳米抗体比相对应的单价分子更有效。
实施例5：纳米抗体对破骨细胞形成的抑制
研究了三种纳米抗体RANKL60，RANKL130和RANKL180对人破骨细胞体外分化的作用。
在骨切片上培养破骨细胞的方法首先由Boyde和同事(1984；Br.DentJ.156：216-220)和由Chambers和Horton(1984；J.Pathol.144：295-6)记述。开始时，通过在显微镜下计算酒石酸-抗性的酸性磷酸酶(TRACP)-阳性多核细胞的数目而确定破骨细胞的数目。后来，证明分泌的TRACP 5b活性反映小鼠破骨细胞培养物中的破骨细胞数目(Alatalo等.，2000；Clin.Chem.(临床化学)46：1751-4)。尽管分泌的TRACP 5b活性与破骨细胞数目强相关，但是TRACP 5b不是由TRACP-阳性单核破骨细胞前体细胞在它们分化为成熟的多核破骨细胞之前分泌的。因此，分泌的TRACP 5b是成熟的多核破骨细胞数目的可靠标记。
设定人破骨细胞分化测定，其中在存在适当的生长因子(包括M-CSF和RANK-配体)的条件下，将来源于人骨髓的CD34+破骨细胞前体细胞培养7天，允许它们分化为成熟的骨重吸收的破骨细胞(Rissanen等，2005；Circulation(循环)112：3937-46)。
将人骨髓来源的CD34+干细胞悬浮在培养基中，且允许附着在96-孔组织培养板中的牛骨切片上。培养基包含适当量的有助于破骨细胞分化的重要生长因子，包括M-CSF和RANK-配体。在37℃，95％空气和5％二氧化碳的湿润气氛下，在CO2培养箱中培养细胞。在第7天，当破骨细胞分化结束时，使用测定法(IDS Ltd，Boldon，UK)和VICTOR2TM多标记计数仪(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)，测量来自培养基的酒石酸抗性的酸性磷酸酶同种型5b活性(TRACP 5b)作为形成的破骨细胞数目的指数。
在本研究中检测七种不同浓度的每种纳米抗体，范围从0.05nM到250nM。在每种细胞培养物中包含无纳米抗体的基线组和具有参照分子的对照组。将护骨蛋白，即破骨细胞发生的抑制剂，用作参照分子来证明所述检测系统可以检测对破骨细胞分化的抑制。
基线TRACP 5b值是高的，且参照抑制剂OPG显著抑制破骨细胞分化，这表明该测定法成功进行且获得的结果是可靠的(图3)。所有三种纳米抗体均剂量依赖性地抑制人破骨细胞分化。所有化合物均以3.0nM和较高浓度表现出统计学显著的抑制。该抑制模式对于所有三种纳米抗体是相似的。
实施例6：鉴定在RANK-L上参与与纳米抗体相互作用的残基。
6.1构建人/小鼠杂合体
为了鉴定纳米抗体在RANK-L分子上的结合位点，研究纳米抗体的人RANK-L-特异性结合。除了纳米抗体RANKL3外，所获得的纳米抗体不与小鼠RANK-L相互作用。为了鉴定参与对人RANK-L的物种-特异性相互作用的残基，设计三种人/小鼠杂合体，其在AA’和CD环中包含人/小鼠取代如下：
AA’环：
人/小鼠杂合体1：T174D175分别用A和S取代。
CD环：
人/小鼠杂合体2：D231L232分别用S和V取代。
人/小鼠杂合体3：A233TE235分别用P和TD取代。
所述人/小鼠杂合体通过使用表C-8所示的引物通过重叠PCR产生。随后将扩增子作为Xho1/Xba1限制性片段克隆到表达载体pCIneo(Promega，Madison，WI)中。
6.2纳米抗体与RANK-L人/小鼠杂合体的结合
用编码hRANK-L或人/小鼠杂合体的表达载体瞬时转染HEK293T细胞。通过如上述对细胞进行FACS分析而评估所述纳米抗体(变化浓度：250nM，50nM，10nM，2nM，0.4nM，0.08nM，16pM)与细胞表面表达的RANK-L的结合。结合结果的总结显示在表C-9中。
人/小鼠交叉反应性RANKL3纳米抗体的结合作为表达的对照，且校正不同杂合体分子的折叠。如在表C-9中所示，RANKL3结合三种不同的杂合体分子。
使用人-特异性纳米抗体的结合结果可以总结如下：
-环AA’不参与与纳米抗体的物种-特异性相互作用。
-环CD对于与纳米抗体的相互作用是关键的。
-基于在它们与CD环相互作用中观察到的不同，纳米抗体可以细分为不同的种类。
○RANKL13，RANKL15：CD-环N端部分和C端部分的突变消除了相互作用。
○RANKL9和RANKL18：CD-环C端部分的突变消除了相互作用。CD-环N端部分不参与相互作用。
○RANKL6：CD-环N端部分的突变消除了相互作用。CD-环C端部分不参与相互作用。
实施例7：食蟹猴中的药物代谢动力学和药效学
将5只雄性和5只雌性食蟹猴分为5组，每组由1只雄性和1只雌性组成。雄性个体年龄在39-42月，而雌性已经达到33-44月的年龄。动物的起始体重为雄性个体2.5-2.7kg，雌性个体2.2-2.6kg。
除了纳米抗体RANKL131(SEQ ID NO：643)之外，检测纳米抗体RANKL130(SEQ ID NO：715)和RANKL180(SEQ ID NO：729)。RANKL131对应于仅有两个接头-相连的RANKL13结构单元组成的二价纳米抗体。包括RANKL131以充分评估白蛋白-结合形式对PK和PD二者的影响。包括ALB-1(SEQ ID NO：790)作为阴性对照，并将小分子伊班膦酸盐(LKT Laboratories，Inc，St.Paul，MN)作为阳性对照。按照表C-10所述对动物给药。
采集血清样品，用于确定纳米抗体水平，抗体分析，和分析骨更新标记血清N-端肽(血清N-Tx)和BAP(骨特异性碱性磷酸酶)。还收集尿，用于分析N-端肽(尿N-Tx)和肌氨酸酐。
7.1药物代谢动力学
确定血浆中纳米抗体RANKL130，RANKL180和RANKL131的浓度如下：将96孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc，Wiesbaden，德国)用100μL中性链亲和素(2μg/mL，Pierce，Rockford，IL)在4℃包被过夜。抽吸孔，且在RT下用300μLPBS(Pierce，Rockford，IL)封闭30分钟。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤后，通过在RT同时以600rpm摇动的条件下温育100μL 1小时而捕获生物素酰化的RANKL(0.5μg/mL，在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中)。在该温育步骤之后，孔用PBS-0.05％吐温20洗涤3次。在未包被的(聚丙烯)板中在100％食蟹猴血浆中制备标准物，QC和测试样品的预稀释液，且在RT同时以600rpm摇动的条件下温育30分钟。将在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20(食蟹猴血浆的终浓度是10％)中的样品和标准物的1/10稀释液转移到包被的板中，且在RT同时以600rpm摇动的条件下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤后，将板用自制的纯化的兔抗-纳米抗体多克隆抗体(1μg/mL，在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中)在RT同时以600rpm摇动的条件下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤后，在RT同时以600rpm摇动的条件下温育100μl马辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆山羊抗-兔(1/5000，在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中，DakoCytomation，Glostrup，丹麦)1小时。使用1/3稀释在底物缓冲液中的100μL增强的可溶3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(esTMB，SDT，Brussels，比利时)避光10分钟，进行显现。该底物缓冲液为60％Na2HPO2(100mM)和40％柠檬酸(100mM)的组合物。10分钟后，用100μL 1N HCl终止颜色反应。在10秒的摇动后在Tecan ELISA读取仪中确定450nm处的吸光度，且在620nm处校正背景吸光度。基于S型标准曲线确定每种样品的浓度。
RANKL130和RANKL180血浆浓度的模式似乎以三阶段形式下降。在施用后的前2.5天内，存在最初的短倾向阶段(disposition phase)(表观α阶段t1/2≈0.5天)，然后是显著较短的二级相(表观β阶段)，和短的最后阶段(表观γ阶段)，特征在于末期斜率的改变。
在WinNonlin专业软件版本5.1(Pharsight Corporation(Pharsight公司)，Mountain View California，USA)中使用预先编程的模型201对所有注射RANKL130和RANKL180的个体的个体血浆浓度-时间模式进行非区室的药物代谢动力学分析(NCA)。使用预先编程的模型202分析所有注射RANKL131的动物的个体血浆浓度-时间模式。通过线性-上/对数下(linear-up/log down)梯形规则，计算血浆浓度-曲线下面积(AUC)和衍生的PK-参数。将计算的药物代谢动力学参数的总结显示在表C-11和表C-12中。
在来自RANKL130，RANKL131和RANKL180组的6只动物中的4只中检测到针对纳米抗体的显著抗体滴度。由于发展抗体的4只动物来源于三种不同的组(cyno1m，cyno3m，cyno4f，cyno6f)，故发生率不是纳米抗体-依赖性的。
7.2药效学
I型胶原的交叉-连接的N-端肽(NTx)的发现已经提供了人骨再吸收的特异性生物医学标记。NTx分子的产生受到骨上的破骨细胞的调控，且在尿和血清中作为稳定的降解终产物而发现。
通过使用免疫测定按照供应商的使用说明(血清，尿，Wampole实验室(Wampole Laboratories))测定血清NTx和尿NTx来评估由所述纳米抗体诱导的骨再吸收的改变。
RANKL130和RANKL180引起血清NTx水平的快速减少(图4)。在这两个测试组中的最大抑制持续多至至少40天。对于cyno 1m和cyno 6f，血清NTx水平在约第40天开始恢复到基线。在cyno 2f和5m中，该恢复至基线分别在第45天和第52天开始。对于cyno 1m和cyno 6f观察到的较不有利的模式可以由在这些动物中观察到的免疫原性进行解释。
在cyno 3m和cyno 4f中由RANKL131诱导的血清NTx模式的抑制是短暂的，因为到第8天水平恢复到基线。
小分子药物伊班膦酸盐，其每月施用一次，与基线水平相比较，诱导约50％的总体抑制。
对于RANKL130，RANKL131和RANKL180组，直至第16天测量尿NTx水平。尿NTx表现出与血清NTx相似的趋势。
通过使用免疫测定法测定血清中的骨特异性碱性磷酸酶(BAP)活性作为成骨细胞活性的定量测定和指示，而评估骨形成中的变化。按照供应商的使用说明进行该测定。RANKL130和RANKL180诱导BAP活性的抑制(图5)。
实施例8：纳米抗体的人源化
使用PCR重叠延伸方法由寡核苷酸装配野生型纳米抗体的人源化形式。在表B-5中显示RANKL6，9，13，15和18的不同的可能的变体的序列，其在如实施例2、3和4中所述的α筛选和在生物医学和细胞测定法中评估它们的结合能力和中和活性。
RANKL13
使用自制的序列查询/比对工具，在人种系VH序列数据库中搜索(blast)抗-RANKL纳米抗体RANKL13(SEQ ID NO：572)的氨基酸序列(图6)。人种系VH3-23(DP-47；SEQ ID NO：763-764)表现出最接近相关的序列。纳米抗体RANKL 13与人种系VH3-23的前97个氨基酸残基表现出80个相同的和7个另外的保守氨基酸取代。8个氨基酸残基(显示为红色)为人源化目的取代，以制成RANKL13hum5(SEQ ID NO：755)。
在RANKL13的人源化过程中，构建了5种RANKL13形式(RANKL13basic，RANKL 13hum1，RANKL 13hum2，RANL 13hum3和RANKL 13hum4)。RANKL13 basic包含4个取代：A14P，E44G，V78L和Q108L。除了这些改变之外，已在hum1-4形式中引入其他取代：RANKL13hum1：R27F；RANKL13hum2：R30S；RANKL13hum3：A49S；RANKL13hum4：S91Y。在α筛选测定法中检测了所有的形式，且通过表面等离子共振分析与RANK-L的结合。
在α筛选测定法中检测了所有的形式。在α筛选中计算的IC50值表明，当与野生型RANKL13相比较时，所引入的突变不影响人源化RANKL13形式的功效(表C-13)。
还通过表面等离子共振(Biacore 3000)分析纳米抗体RANL13的人源化形式的结合动力学。将人可溶的RANK-L通过胺偶联共价结合到CM5传感器芯片表面上，利用EDC/NHS进行激活和HCl灭活。以一种浓度(100nM)评估纳米抗体结合。每种纳米抗体以45μl/分钟的流速注射4分钟，以允许与芯片-结合的抗原的结合。其次，将无纳米抗体的结合缓冲液以同样的流速传送到芯片上，以允许结合的纳米抗体的自动解离。从所获得的关于不同的纳米抗体的传感图上，计算koff-值(kd)，且显示在表C-13中。当仅有一种浓度的纳米抗体用于拟合结合模型时，缔合速率常数(kon或ka)，且因此也是KD值，是唯一的指示。如在表C-13中所示，与野生型纳米抗体RANKL13相比较，所有的人源化纳米抗体显示出相当的解离速率常数/解离速率。
综上所述，α筛选数据和Biacore分析没有显示所引入的突变在各自的人源化形式中的结合或功效的显著影响。在最后的人源化形式RANKL13hum5中，组合了所有的人源化突变。如在表C-13中所示，RANKL13hum5表现出与野生型RANKL13相似的功效和结合亲和力。
RANKL18
在RANKL18的人源化过程中，构建了6种RANKL18形式(RANKL18basic，RANKL 18hum1，RANKL 18hum2，RANL 18hum3，RANKL 18hum4和RANKL18hum5)。RANKL18 basic包含4个突变：A14P，E44G，V78L和Q108L。除了这些改变之外，在hum1-5形式中引入其他突变：RANKL18hum1：R27F；RANKL18hum2：G49S；RANKL18hum3：G60A；RANKL18hum4：P77T和V78L；RANKL18hum5：G94A。在α筛选和Biacore中检测所有的形式(表C-13)。
在α筛选中计算的IC50值表明，与野生型RANKL18相比较，在RANKL18 basic，RANKL18hum3和RANKL18hum5中所引入的突变不影响这些形式的功效(表C-13)。在RANKL18hum1和RANKL18hum2中的人源化突变中度影响功效，而在RANKL18hum4中的双突变完全消除了纳米抗体的功效。基于这些结果，构建并分析了另外两种突变，即RANKL18hum6和RANKL18hum7。RANKL18hum6组合了在RANKL18basic，RANKL18hum3和RANKL18hum5中的人源化突变。RANKL18hum7包括RANKL18hum6的所有突变以及V78L取代。表C-13显示，RANKL18hum6表现出与野生型RANKL18相似的功效和结合亲和力。RANKL18hum7的功效略微较低，且表现出略微减少的针对RANK-L的结合亲和力。
实施例9：分析RANKL13hum5D62E突变体
对RANKL13hum5一级序列的分析将D62鉴定为异构体化的潜在位点，且因此作为分子的化学不稳定性的潜在来源。为了检测这种可能性，使用RANKL13hum5分子和其中该潜在的异构体化位点被谷氨酸残基(E)替换的突变体RANKL13hum5_D62E(SEQ ID NO：756)进行稳定性测定。
RANKL 13hum5中的D62E突变通过使用包括下述突变的引物进行重叠PCR而引入：RevRANKL13hum5D62(CCTCCCTTTGACGGATTCCGCGTAATACGT；SEQ ID NO：797)和FwRANKL13hum5D62E(ACGTATTACGCGGATTCCGTCAAAGGGAGG；SEQ ID NO：798)。将编码RANKL13hum5或RANKL13hum5_D62E的两种cDNA作为SfiI/BstEII片段克隆在来源于pUC119的表达载体中，所述表达载体包含LacZ启动子，氨苄青霉素或羧苄青霉素的抗性基因，多克隆位点和gen3前导序列。与纳米抗体的编码序列符合阅读框的，该载体编码在纳米抗体的3’端的两个终止密码子。
为了生产，将RANKL13hum5和RANKL13hum5_D62E构建体接种在50ml TB/0.1％葡萄糖/卡那霉素中，且将混悬液在37℃培育过夜。用1/100所获得的过夜预培养物接种5x400ml培养基。将培养物在37℃，250rpm进一步温育至OD600＞5。用1mM IPTG诱导培养物，且在37℃ 250rpm进一步保持温育4小时。将培养物在4500rpm离心20分钟，然后弃掉上清。将沉淀物保存在-20℃。
为了纯化，将沉淀物解冻且重悬在20mL d-PBS中，且在4℃温育1小时。然后，将混悬液以8500rpm离心20分钟，以从周质提取物中清除细胞碎片。通过阳离子交换(Source 30S柱，洗涤缓冲液：10mM柠檬酸pH4.0；洗脱缓冲液：10mM柠檬酸/1M NaCl pH 4.0)然后通过尺寸排阻层析(Superdex 75 Hiload 16/60柱；在d-PBS中)纯化纳米抗体。测量OD 280nm，且计算浓度。样品保存在-20℃。
在如实施例2所述的α筛选中对RANKL13hum5和RANKL13hum5_D62E分析它们的结合能力和中和活性。RANK13的人源化和RANKL13hum5中的D62E突变不干扰纳米抗体的功效。当在α筛选测定中测量时，RANKL13，RANKL13hum5和RANKL13hum5_D62E表现出相似的功效(图7)。
实施例10：确定二价分子中关于最佳功效的接头长度的尺寸
RANKL13
构建一系列包含不同接头长度的二价分子。RANKL131(RANKL13-9GS-RANKL13；SEQ ID NO：643)和RANKL133(RANKL13-30GS-RANKL13；SEQ ID NO：766)分别包含9GS或30GS接头。在α筛选测定法和FMAT测定法中检测两种分子，且与单价RANKL13和三价双特异性RANKL130进行比较。计算的IC50值显示在表C-14中。两种测定法表明，9GS接头足以获得如对于RANKL130确定的相似的功效。
RANKL18
构建一系列包含不同接头长度的二价分子：
RANKL181biv：RANKL18-9GS-RANKL18(SEQ ID NO：657)
RANKL182biv：RANKL18-20GS-RANKL18(SEQ ID NO：693)
RANKL183biv：RANKL18-30GS-RANKL18(SEQ ID NO：767)
RANKL18hum6 Bi_25：RANKL18Hum6-25GS-RANKL18Hum6(SEQ IDNO：768)
RANKL 18hum6Bi_30：RANKL 18Hum6-30GS-RANKL18Hum6(SEQ IDNO：769)
在α筛选测定法和FMAT测定法中检测所有分子，且与单价RANKL18和三价双特异性RANKL180进行比较。计算的IC50值显示在表C-14中。两种测定法表明，30GS接头足以获得如对于RANKL180确定的相似的功效。
RANKL9
构建一系列包含不同接头长度的二价分子：
RANKL91biv：RANKL9-9GS-RANKL9(SEQ ID NO：636)
RANKL92biv：RANKL9-20GS-RANKL9(SEQ ID NO：672)
RANKL93biv：RANKL9-30GS-RANKL9(SEQ ID NO：770)
RANKL94biv：RANKL9-15GS-RANKL9(SEQ ID NO：771)
在α筛选测定法和FMAT测定法中检测所有分子，且与单价RANKL9和三价双特异性RANKL90(SEQ ID NO：708)进行比较(表C-14)。两种测定法表明，15GS接头足以诱导与RANKL90相当的功效转变。
实施例11：构建和生产不同形式的人源化纳米抗体
由RANKL13hum5和RANKL18hum6构建二价和三价双特异性抗-RANKL纳米抗体。具有相对应的纳米抗体ID的不同形式的人源化纳米抗体的总结显示在表C-15中。
11.1三价双特异性纳米抗体
三价双特异性分子(RANKL008a和RANKL010a)具有与人源化抗-RANKL纳米抗体相对应的两个结构单元，在中间是与抗-人血清白蛋白纳米抗体结构单元(ALB-12；SEQ ID NO：791)相对应的第三人源化纳米抗体结构单元。单个结构单元通过Gly/Ser(GGGGSGGGS；SEQ ID NO：792)接头融合。
在大肠杆菌中表达RANKL008a，且从培养基和周质提取物中纯化。将纳米抗体捕获在MabSelect Xtra(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)上。洗脱用缓冲液B(100mM甘氨酸pH2.5)进行。级分用1.5M Tris pH 7.5中和，且针对1/10PBS进行透析。随后使用Source 15 S柱(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)对样品进行阳离子交换。
将RANKL010a克隆在pPICZαA(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，且转化在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中。将菌落稀释在250ml BCGM培养基中，且在30℃生长。在OD600为20-25时，将培养物离心，且将沉淀物重悬在80ml BMCM培养基中。通过添加100％甲醇诱导表达。通过捕获在MabSelect Xtra(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)上而从培养基捕获纳米抗体。在100mM甘氨酸pH2.5缓冲液中的洗脱级分用1.5M Tris pH 7.5中和，且针对1/10PBS透析。样品通过阳离子交换(Source 30S柱)进一步纯化。最后，在Superdex 7526/60柱上进行大小排列步骤。
11.2聚乙二醇化的纳米抗体
构建二价RANKL13hum5和RANKL18hum6。将构建体在大肠杆菌中表达。进行纯化和聚乙二醇化如下：
通过蛋白质A亲和层析(MabSelect XtraTM)纯化二价纳米抗体。在使用100mM甘氨酸pH 2.5洗脱后，将收集的样品立即用1.5M Tris pH7.5中和。在阳离子交换步骤(Source 15S柱)后，通过Vivaspin(5kD)浓缩包含 的级分，加入DTT至10mM的终浓度，且温育过夜。通过SEC去除游离DTT之后，以5摩尔过量的量加入PEG(3-马来酰亚胺丙酰胺(proprionamide)，1，3-二(甲氧基聚(乙二醇)改性的2-甘油)，平均MW40,000；Nektar Therapeutics，San Carlos，CA)，且温育过夜。通过MacroCapSP阳离子交换(缓冲液：25mM乙酸钠pH5+0.5％泊洛沙姆(pluronic))将聚乙二醇化的纳米抗体与未聚乙二醇化的纳米抗体/游离的PEG分离。用线性梯度的缓冲液(1x PBS+0.5％泊洛沙姆)洗脱结合的蛋白。
11.3HSA融合
将HSA融合蛋白，RANKL004h和RANKL006h，分别对应于二价RANKL13hum5-9GS-RANKL13hum5和RANKL18hum6-30GS-RANKL18hum6，其C端与HSA融合。
为了产生RAKL004h，使用下述引物通过PCR扩增RANKL13hum5：
  序列  SEQ ID NO
  GAAGTAGGATGGACGATGACAAACCCGCGAAGACTTTTCTGGTGGCGGGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGA  807
  GTTCTATCGGGAAGACTTAGAACCTCCGCCGCCTGAGGAGACGGTGACCAG  808
  GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG  809
  TCTCTTCTCCTAGGTCTTTGAATCTGTGGGCGACTTCAGATTTATGAGCATCTGAGGAGACGGTGACCAG  810
将随后的扩增子使用适当的限制性酶消化(N-端片段：BbsI/XhoI和C-端片段：BbsI/Avr II)，且克隆在用XhoI/AvrII打开的pPICZalphaA-HSA载体中。该载体包含全长人血清白蛋白的编码序列。
为了生成RANKL006h，使用下述引物通过PCR扩增RANKL18hum6：
  序列  SEQ ID NO
  GGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGTTCAGCTAGTGGAATCA  811
  CACCTCCGGATCCTCCACCTCCGCTACCTCCACCTCCACTGCCACCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCAG  812
  GGTGGAGGATCCGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGTGGAGGCAGTGAGGTTCAGCTAGTGGAA  813
  TCTCTTCTCCTAGGTCTTTGAATCTGTGGGCGACTTCAGATTTATGAGCATCTGAGGAGACGGTGACCAG  814
将扩增子使用适当的限制性酶消化(N-端片段：BamHI/XhoI和C-端片段：BamHI/Avr II)，且克隆在用XhoI/AvrII打开的pPICZαA-HSA载体中。该载体包含全长人血清白蛋白。
将质粒转化至巴斯德毕赤酵母中。将菌落稀释在250ml BCGM培养基中，且在30℃生长。通过加入100％的甲醇诱导表达。通过将纳米抗体捕获在MabSelect Xtra(GE Healthcare，Uppsala，瑞典)上和使用Poros50HQ和Superdex200 XK26/60的进一步净化步骤来从培养基纯化纳米抗体。
实施例12：在α筛选和FMAT测定法中表征格式化的人源化纳米抗体。
12.1基于RANKL13hum5的形式在α筛选和FMAT测定法中的功效
在α筛选测定法和FMAT测定法中检测三价双特异性纳米抗体RANKL008a，聚乙二醇化的纳米抗体RANKL001p和HSA融合蛋白RANKL004h，且与单价RANKL13hum5和野生型三价双特异性RANKL130进行比较。计算的IC50值显示在表C-16中。在两种测定中，RANKL008a，RANKL001p和RANKL004h表现出与RANKL130相当的相似功效。
12.2基于RANKL18hum6的形式在α筛选和FMAT测定法中的功效
在α筛选测定法和FMAT测定法中检测三价双特异性纳米抗体RANKL010a和聚乙二醇化的纳米抗体RANKL003p，且与单价RANKL18hum6和野生型三价双特异性RANKL180进行比较。计算的IC50值显示在表C-16中。在两种测定法中，RANKL010a和RANKL003p表现出与RANKL180相当的功效。
12.3白蛋白对具有抗-人血清白蛋白纳米抗体结构单元的RANKL13的结 合动力学的影响
使用野生型RANKL130NT(RANKL13-ALB-1-RANKL13)和人源化的RANKL008a(RANKL13hum5-ALB-12-RANKL13hum5)进行实验。在该实验中，将100nM溶液通过具有固定的RANK-L的芯片。如在图8中所示，对于两种分子(野生型的和人源化的)，在不存在白蛋白的条件下的传感图是相当的，这表明，两种分子以相似的方式与固定的RANKL相互作用。随后，制备混合物(100nM的纳米抗体和500nM HSA)，且通过芯片。因为对于复合物的信号显著更高，我们推论具有抗-人血清白蛋白纳米抗体结构元件的野生型和人源化变体能够同时结合RANK-L和白蛋白。
12.4RANKL13hum5和RANKL18hum6的表位绘图。
过去，产生了这样的实验数据，其支持RANKL13hum5和RANKL18hum6结合重叠表位的观点。这种观察在Biacore实验中得到证实。在这些表位绘图实验中，将RANKL传感器芯片首先用第一纳米抗体(浓度500nM)饱和。120秒后，允许解离，或将包含相同浓度的第一纳米抗体和500nM待检测的纳米抗体的混合物注射120秒。在图9中显示RANKL18hum6的传感图，在图10中显示RANKL13hum5的传感图。在首先用RANKL13hum5或RANKL18hum将表面饱和后，在注射混合物时仅观察到的信号的略微增加，这表明RANKL13hum5和RANKL18hum6结合重叠的表位。
12.5格式化的人源化纳米抗体对RANK-L诱导的RAW264.7细胞分化的 抑制。
将RAW264.7细胞(ATCC)保持在包含10％FBS的DMEM中。将细胞重悬在包含10％FBS，0.1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸的无酚红的αMEM中，其以2000细胞/孔接种在96-孔板中。向孔中加入稀释系列的格式化的人源化纳米抗体。通过加入7.5ng/mL RANKL(Peprotech，Rocky Hill，NJ)诱导破骨细胞样细胞的分化。在4天后使用对硝基磷酸苯酯作为底物测量上清中的总酒石酸-抗性磷酸酶活性(图11)。
12.6格式化的人源化纳米抗体对RANK-L与RANK相互作用的抑制。
将96-孔微量滴定板用抗-Fc纳米抗体PMP02在4℃包被过夜，且用Superblock T20(PBS)封闭缓冲液封闭。将不同浓度的格式化的人源化纳米抗体用200ng/mL RANK-Fc和5ng/mL RANK-L预温育，之后将混合物转移到所包被的孔中。在室温(RT)下使用在包含10％ Superblock T20(PBS)封闭缓冲液的PBS中的1/100稀释的人TRANCE/RANKL/TNFSF11生物素酰化的亲和纯化的多克隆抗体(R&D systems(R&D系统)，Minneapolis，MN)接着用辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(1/5000，在包含10％Superblock T20(PBS)封闭缓冲液的PBS中)温育30分钟而检测结合的RANK-L 1小时。使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢进行显现，之后用1N HCl终止显色反应。确定450nm处的吸光度。格式化的人源化纳米抗体对RANK-L与RANK相互作用的抑制显示在图12中。
12.7RANKL008a与人血清白蛋白的结合
将96-孔微量滴定板用人血清白蛋白(HSA，在PBS中20μg/mL)在4℃包被过夜。抽吸孔，且用Superblock T20(PBS)封闭缓冲液封闭。将孔在RT下用稀释系列的RANKL008a温育1小时。随后，用与辣根过氧化物酶偶联的二价纳米抗体检测结合的RANKL008a。如上述进行显现(图13)。
12.8RANKL008a与HSA和RANK-L的双官能性结合
使用两种不同的ELISA形式来测量RANKL008a与HSA和RANK-L的同时结合。
在第一种形式中，将96-孔微量滴定板用中性链亲和素(2μg/mL，PBS)在4℃包被过夜，且用Superblock T20(PBS)封闭缓冲液封闭。孔用生物素酰化的RANK-L(0.5μg/mL，在PBS中)温育，然后使用稀释系列的RANKL008a。使用辣根过氧化物酶标记的白蛋白(Genetex，San Antonio，TX；1/6000)检测结合的RANKL008a。如上述进行显现(图14-A)。
在第二种形式中，将96-孔微量滴定板用HSA(10μg/mL，PBS)在4℃包被过夜，且用Superblock T20(PBS)封闭缓冲液封闭。然后使用稀释系列的RANKL008a。在RT下温育1小时后，使用生物素酰化的RANK-L(5ng/mL)检测结合的RANKL008a，随后用辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白(1/2000)温育。如上述进行显现(图14-B)。
实施例13：在单次静脉内或皮下施用后格式化的人源化纳米抗体在Balb/c小鼠中的药物代谢动力学。
对雄性Balb/c小鼠(8-12周)(n＝3)施用100μg推注剂量的每种纳米抗体，静脉内施用至尾部或皮下施用。在一系列时间点，收集血液样品。
按下述进行不同纳米抗体的检测：将Maxisorb微量滴定板(Nunc，Wiesbaden，德国)在室温(RT)下用100μl在PBS缓冲液中的5μg/ml中性链亲和素溶液(Pierce，Rockford，IL)包被1小时。包被之后，将平板抽吸4秒，且在RT下用Superblock T20(Thermo Scientific Pierce Protein ResearchProducts(热科学皮尔斯蛋白研究产物)，Rockford，IL)封闭(300μl/孔)30分钟。平板用包含0.05％吐温20的PBS洗涤三次。封闭后，在RT下(600rpm)捕获生物素酰化的人RANKL(0.25μg/ml，100μl/孔)1小时。将稀释系列的纳米抗体标准物(在PBS/0.1％酪蛋白中制备)掺加到100％收集的空白小鼠血清(Harlan，Oxon，英国)中，然后进一步用包含0.1％酪蛋白的PBS 1/10稀释(在单独的未包被的Nunc板中)，这形成由10％收集的小鼠血清组成的终样品基质。以相同的方式处理血清样品。将所有的预稀释液在RT(600rpm)下在未包被的板中温育30分钟。在捕获步骤之后，将包被的平板洗涤三次(包含0.05％吐温20的PBS)，且将每种样品稀释液的整分试样(100μl)转移到包被的板中，并且允许在RT(600rpm)下结合1小时。样品温育后，将板洗涤三次(包含0.05％吐温20的PBS)，且在RT下用100μl自制的多克隆兔抗-纳米抗体的抗体(1μg/ml，在PBS/0.1％酪蛋白中)温育1小时。然后，将所述板洗涤三次(包含0.05％吐温20的PBS)，且用100μl山羊抗-兔HRP(DakoCytomation，Glostrup，丹麦)的1/2000稀释液(在具有0.1％酪蛋白的PBS中))温育。在RT(600rpm)下温育30分钟后，将所述板洗涤三次(包含0.05％吐温20的PBS)，且在暗处用100μl es(HS)TMB(在HRP缓冲液中的1/3稀释液；SDT，Brussels，比利时)温育10分钟。10分钟后，用100μl HCl(1N)终止反应。5分钟后，测量每孔在450nm处的吸光度(Tecan Sunrise分光光度计；瑞士)，且在620nm处校正背景吸光度。基于具有可变斜率的S型标准曲线而确定每份血清样品中的浓度。
在静脉内施用后，使用在WinNonlin专业软件版本5.1(WinNonlinProfessional Software Version 5.1)(Pharsight公司，芒廷维尤加利福尼亚州，USA)内预编程的模数7，对每只小鼠的血清浓度-时间模式进行二区室药物代谢动力学分析。对于单个纳米抗体的计算的参数显示在表C-17中。
在皮下施用后，使用在WinNonlin专业软件版本5.1(WinNonlinProfessional Software Version 5.1)(Pharsight公司，芒廷维尤加利福尼亚州，USA)内预编程的模数3(无延迟时间)或4(有延迟时间)，对每只小鼠的血清浓度-时间模式进行一区室药物代谢动力学分析(具有第一顺序的吸收)。对于单个纳米抗体的计算的参数显示在表C-18中。
实施例14：在食蟹猴中格式化的人源化纳米抗体的药物代谢动力学和药效学
将雌性食蟹猴分为17组，每组由3只约为24月龄的个体组成。
按照表C-19中所述对动物给药。纳米抗体RANKL008a，RANKL001p和RANKL003p以不同的剂量(3mg/kg；0.3mg/kg；0.03mg/kg)施用。将纳米抗体ALB-8作为阴性对照。包括小分子伊班膦酸盐作为阳性对照。采集血清样品，用于确定纳米抗体水平、抗体分析、和分析骨骼更新标记血清N-端肽(血清N-Tx)。
14.1药物代谢动力学
按下述确定血浆中RANKL008a的浓度：
将96-孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc，Wiesbaden，德国)用100μL中性链亲和素(2μg/mL，Pierce，Rockford，IL)在4℃包被过夜。抽吸孔，且在RT下用300μLPBS(Pierce，Rockford，IL)封闭30分钟。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，通过在RT下同时以600rpm摇动下温育100μL 1小时而捕获生物素酰化的RANKL(在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中0.5μg/mL，自制)。在该温育步骤后，将孔用PBS-0.05％吐温20洗涤3次。在未包被的(聚丙烯)板中，在100％食蟹猴血浆中制备标准物QC、和测试样品的预稀释液，且在RT下同时以600rpm摇动下温育30分钟。将在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中的样品的1/10稀释液(食蟹猴血浆的终浓度为10％)转移到包被的板中，且在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，将所述板用纯化的自制兔抗-纳米抗体多克隆抗体(在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中1μg/mL，自制，批号15/05/06)在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，将100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆山羊抗-兔(1/5000，在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中，DakoCytomation，Glostrup，丹麦；货号P0448)在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。显现用100μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(esTMB，SDT，Brussels，比利时)避光10分钟进行。将该底物1/3稀释在底物缓冲液中。所述底物缓冲液是60％Na2HPO2(100mM)和40％柠檬酸(100mM)的组合物。10分钟后，用100μL 1N HCl终止颜色反应。在Tecan ELISA读数仪中摇动10秒后确定450nm处的吸光度，且在620nm处校正背景吸光度。基于S型标准曲线确定每种样品中的浓度。
按下述确定RANKL001p和RANKL003p的浓度：
将96-孔微量滴定板(Maxisorp，Nunc，Wiesbaden，德国；货号430341)用100μL中性链亲和素(2μg/mL，Pierce，Rockford，IL)在4℃包被过夜。抽吸孔，且在RT下用300μLPBS(Pierce，Rockford，IL)封闭30分钟。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，通过在RT下同时以600rpm摇动下温育100μL 1小时而捕获生物素酰化的RANKL(在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中0.5μg/mL，自制)。在该温育步骤后，将孔用PBS-0.05％吐温20洗涤3次。在未包被的(聚丙烯)板中，在100％食蟹猴血浆中制备标准物、QC、和测试样品的预稀释液，且在RT下同时以600rpm摇动下温育30分钟。将在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中的样品的1/10稀释液+10％食蟹猴血浆(食蟹猴血浆的终浓度为10％)转移到包被的板中，且在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，将所述板用纯化的自制兔抗-纳米抗体多克隆抗体(在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中1μg/mL，自制)在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。在用PBS-0.05％吐温20的3次洗涤步骤之后，将100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆山羊抗-兔(1/2000，在PBS-0.1％酪蛋白-0.05％吐温20中，DakoCytomation，Glostrup，丹麦)在RT下同时以600rpm摇动下温育1小时。显现用100μL3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(未稀释的esTMB，SDT，Brussels，比利时)避光10分钟进行。10分钟后，用100μL 1N HCl终止颜色反应。在Tecan ELISA读数仪中摇动10秒后确定450nm处的吸光度，且在620nm处校正背景吸光度。基于S型标准曲线确定每种样品中的浓度。
使用WinNonlin专业软件版本5.1)(Pharsight公司，芒廷维尤加利福尼亚州，USA)对所有猴子的个体血浆浓度-时间模式进行非区室药物代谢动力学分析(NCA)。在皮下和静脉内给药后分别使用预先编程的模型200或201。通过线性-上/对数下梯形法则计算AUC和衍生的PK-参数。计算的药物代谢动力学参数的总结显示在表C-20至C-23中。
14.2药效学
通过按照供应商(血清，Wampole实验室)的使用说明使用免疫测定法测定血清NTx来评估由纳米抗体诱导的骨再吸收的改变。
图15和16显示以不同量静脉内或皮下给药的不同纳米抗体的血清NTx浓度-时间图。
每种纳米抗体的所有血浆浓度-时间模式同时拟合于药物代谢动力学方程，其是提供浓度-时间数据的合理表征所最低限度必需的。在分析中只包括无显著免疫原性的猴子的血浆浓度-时间模式。发现具有自中间区室的线性和非线性清除的二区室药物代谢动力学模型来表征剂量和时间依赖性的药物代谢动力学。这些纳米抗体特异性药物代谢动力学方程又用作药效学模型的输入方程，以评估对血清NTx t更新的体内功效(IC50)和内在的活性(Imax)。
使用间接反应模型描述每种纳米抗体对血清NTx更新的内在活性(Imax)和功效(IC50)。所述间接反应模型用血清NTx(t1/2＝0.693/kout)的半衰期和纳米抗体介导的对零级NTx产生速率(Kin)的抑制(Hill方程)参数化。利用用Imax，IC50和形态因子n参数化的Hill方程，假定纳米抗体抑制Kin。对于每种纳米抗体，评估单一组的PD参数，例外的是RANKL003p，其中允许更新参数(Kin，Kout)因每个剂量水平而不同。
所获得的关于所有纳米抗体的药效学参数显示在表C-24中。尽管所有三种纳米抗体具有相似的内在活性，且介导几乎完全的血清NTx抑制(Imax≈90)，但是它们的功效是显著不同的。发现RANKL008a是血清NTx合成的最有效的抑制剂，其次是RANKL001p和RANKL003p。RANKL003p具有比RANKL008a低10倍的功效。平均血清NTx半衰期约为1.6小时。
实施例15：RANKL 130，RANKL180，RANKL008a，RANKL001p和RANKL003p与TNF家族成员TNFα，CD40配体(CD40L)和TRAIL的交叉反应性
在竞争性ELISA中检测抗-RANK-L纳米抗体与TNF家族成员TNFα，TRAIL或与小鼠RANK-L的交叉反应性。如实施例2中所述，将人RANK-L包被在96-孔板上。在将它们加入到板之前，将纳米抗体(100pM)与不同浓度的人RANK-L，小鼠RANK-L，TNFα或TRAIL(10nM减少至13.7pM)进行预温育。纳米抗体与RANK-L包被的板的结合仅受到外源加入的RANK-L的抑制，且不受加入的其他配体的影响(图17)。
实施例15.在切除卵巢的食蟹猴中施用抗-RANK-L纳米抗体防止骨损失且保持强度和质量。
骨质疏松症的特征在于低骨质和骨组织的显微结构退化，结果是对骨折的脆弱性和易感性增加。雌激素消耗有助于绝经后骨质疏松的低骨质特征。因此，雌激素消耗已经用作骨损失动物模型用于研究骨质疏松症的治疗。
在OVX或假手术(sham surgery)后一个月，用赋形剂或抗-RANK-L纳米抗体治疗卵巢切除(avoriectomized)(OVX)的食蟹猴(cynos)(9-16岁)16个月。假对照用赋形剂治疗。分析使用抗-RANK-L纳米抗体对骨再吸收和对骨矿物质密度(BMD)的影响。
在处死后，对完整的右股骨，L3-L4脊椎体，和L5-L6脊椎5mm多空核心进行离体DXA和pQCT扫描。通过股骨骨干和肱骨皮质束的3-点弯曲，剪去股骨颈，和挤压腰椎样品而进行破坏性的检测。
按下述分析抗-RANK-L纳米抗体对骨骼更新的组织学水平的影响，以及它们与骨强度的关系：在髂骨和肋骨活组织检查(在第6和12个月)之前，和在处死之前，注射双荧光团标记。在这些活组织切片、胫骨骨干、和L2脊椎骨和最接近的股骨中的多孔骨进行组织形态学检查。
实施例16.VHH-Fc融合体的构建和分析
将针对RANK-L的纳米抗体克隆在适当的载体中，以产生与人IgG1或人IgG2的CH1缺失的Fc部分的遗传融合体。连接纳米抗体与Fc的铰链区来自IgG1或IgG2。
将质粒构建体转染在真核细胞系中，且Fc融合体被分泌到培养物上清中。纯化产物并且在考马斯亮蓝染色的凝胶上进行分析。代表性的序列显示在表B-6(SEQ ID NO’s：774-789)中。在FMAT竞争性结合测定法、NF-κB报道子测定法和TRACP 5b破骨细胞分化测定法中检测纳米抗体融合体。
表格
表B-1：优选的针对RANK-L的纳米抗体(RANK/RANK-L相互作用的抑制剂)
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
>RANKL1|051_RANKL1c125|9B1，SEQ ID NO：560；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTFSSSTMAWFRQPPGGERDFVASISTSGTRTLYADSVKGRFTISRDNAKSTGYLQMNSLKPEDTAVYFCAAVNRRGWEFWRLASGYDYWGLGAQVTVSS
>RANKL2|051_RANKL2c15|2B9，SEQ ID NO：561；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYSDGSTTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLNLQMNSLKSEDTAVYYCAKDANSGGLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3|051_RANKL3c11|2G8，SEQ ID NO：562；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL4|051_RANKL4c123|4F12，SEQ ID NO：563；PRT；->KVQLVESGGGLVQTGDSLRLSCAASGRAIGSYAMGWFRQAPGKEREFVAVINYRGSSLKYADRVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPDDTAVYYCAAQTSGADFGTTPQRYTYWGQGTQVTVSS
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>RANKL6|051_RANKL6c18|4H9，SEQ ID NO：565；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
>RANKL7|051_RANKL7c113|7B4，SEQ ID NO：566；PRT；->EVQLVESEGGPVQSGGSLRLSCAASGRTFSVSTIAWFRQAPGEGREFVAAIYPSGRNAYVADSVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAAHQPSGSYYSAEAYAYWGQGTQVTVSS
>RANKL8|051_RANKL8c128|7E，SEQID NO：567；PRT；->EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGGTFSRYAMGWFRQAPGKEREFVSAISVGGTYQYYVDSVKGRFTISRDNAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGDASPYGYLREYTATRFDYWGQGTQVTVSS
>RANKL9|051_RANKL9c132|8A11，SEQ ID NO：568；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSS
>RANKL10|RANKLPMP9B3|9B3，SEQ ID NO：569；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGITFSSRTMGWFRQAPGKEREFVAAITPSSRTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLKPEDTAVYYCAAERTYGSNYTRPTAWNYWGQGTQVTVSS
>RANKL11|051_RANKL11c116|9F10，SEQ ID NO：570；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSKTMGWFRQPPGNEREFVAAITPTSRTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKFEDTAAYYCVAVRRYGSPPHDGSSYEYWGQGTQVTVSS
>RANKL12|051_RANKL12c11|9B6，SEQ ID NO：571；PRT；->EVQLVESGGGWMQAGGSLRLSCAASGRTFTMAWFRQAPGKEREFVAAITGSGRSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMKSLKPEDTAVYYCAGLRGLGLEYDSAKSYSYWGQGTQVTVSS
>RANKL13|051_RANKL13c11|1C7，SEQ ID NO：572；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
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>RANKL15|051_RANKL15c11|7C5，SEQ ID NO：574；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL16|051_RANKL16c11|7G8，SEQ ID NO：575；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASRRTFSSYAMGWFRQVPGKERDFVAAISTGSITIYGDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGKREPYLRQYTASNPYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL17|051_RANKL17c11|9C2，SEQ ID NO：576；PRT；->EVQLVESGGGLVQVGDSLRLSCEASGRSRFSTYVMGWFRQAPGKEREFVAAVSWSSGNAYYIDSAKGRFATSRDTAKNIMYLQMNSLKPEDTAVYTCAAGRGYGLLSEYTQAPRYDYWGQGTQVTVSS
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>RANKL19|051_RANKL19c11|6C8，SEQ ID NO：578；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTVTMGWFRQAPGKEREFVASITGSGSVTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMNSLKPEDTAVYYCAAYLPSPYYSSYYDSTKYEYWGQGTQVTVSS
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>RANKL21|051_RANKL21c11|7C6，SEQ ID NO：580；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASRRTFNSYAVGWFRQVPGEERDFVAAISTGSVTIYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGNREPYLRQYTASNPYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL22|051_RANKL22c12|7D12，SEQ ID NO：581；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASERTSRNYGMGWFRQAPGKEREFVAAITSAGGTTYYGDFVKGRFTISRDSAKYTVYLQMNSLKPEDTAVYWCAAKLQIGGRWHNLNDYGYRGQGTQVTVSS
>RANKL23|051_RANKL23c11|9H5，SEQ ID NO：582；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTTVYTMAWFRQAPGKEREFVAAITRSGKTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNSLKPDDTAVYYCAAKALLGMTNPAGYEYWGQETQVTVSS
>RANKLPMP4B3，SEQ ID NO：584；PRT；->evqlvesgggwmqaggslrlscaasgrtftMAwfrqasgkerefvaAITGSGRSTYYTDSVKGrftisrdnakntaylgmkslkpedtavyycagLRGLGLEYDSAKSYSYwgqgtqvtvss
>RANKLPMP2E11，SEQ ID NO：585；PRT；->EVXLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
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  >RANKLPMP7B2，SEQ ID NO：589；PRT；->evqlvesggglvqaggslr1scaaaggtfrNYVMGwfrqapgkerefvtAISTGGSWTGYVDSVKDrftisrdntkntvylqmaslkpedtavyycaaTMPATTYLPRSERQYDYwgqgtqvtvss
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  >RANKLPMP2A5，SEQ ID NO：615；PRT；->evqlvesggglvqagdslr1scaasgrtftMGwfrqapgterefvaAISGSGKITNYADSVKGrftisrdhakntvflqmdslkpedtavyycaaYLRSPYYSSYYDSAKYEYwgqgtqvtvss
>RANKLPMP2D7，SEQ ID NO：616；PRT；->evqlvesggglvqagdslrlscaasgrtftMGwfrqapgterefvaAISGSGKITNYADSVKGrftisrdhakntvflqmdslkpedtavyycaaYLRSPYYSSYYDSAKYEYwgqgtqvtvss
>RANKLPMP2G4，SEQ ID NO：617；PRT；->evqlvesggglvqagdslrlscaasgrtftMGwfrqapgterefvaAISGSGKITNYADSVKGrftisrdhakntvflqmdslkpedtavyycaaYLRSPYYSSYYDSAKYEYwgqgtqvtvss
>RANKLPMP7A8，SEQ ID NO：618；PRT；->emqlvesggglvqaggslrlscvaskrtfaSYAMGwfrqvpgkerdfvaAISTHSITVYADSVKGrftisrdnakntvylqmntlkpedtavyycaaGNREPYLRQYTASNPYDYwgqgtqvtvSs
>RANKLPMP7A5，SEQ ID NO：619；PRT；->evqlvesggglvqtggslrlscvasrrtfsSYAVGwfrqvpgkerdfvaAISTGSVTIYADSVKGrftisrdntkntvylcmnslkpedtavyycaaGNREPYLRQYTASNPYDYwgqgtqvtvss
>RANKLPMP7F8，SEQ ID NO：620；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLHMASLKPEDTAVYYCAATTPVTTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKLPMP7F6，SEQ ID NO：621；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAAAGFTFRRYVMGWFRQAPGKEREFVAAISTGGTWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYNCAATTPTTSYLPRSERQYEYWGQGTQVTVSS
表B-2：优选的针对RANK-L的纳米抗体(RANK/RANK-L相互作用的非抑制剂)
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
>RANKL3D4|051_RANKL3D4c12|3D4，SEQ ID NO：583；PRT；->EVQLVEAGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTIRGTMAWFRQAPGKDREFVATVTSSGSTTFYADSVKGRFTISRDNAENTVNLQMDSLKPEDTAVYYCAARIRGKVTPSNYDYAYWGQGTQVTVSS
表B-3：针对RANK-L的二价纳米抗体
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
>RANKL3-9GS-RANKL3，SEQ ID NO：622；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-9GS-RANKL6，SEQ ID NO：623；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
>RANKL3-9GS-RANKL9，SEQ ID NO：624；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-9GS-RANKL13，SEQ ID NO：625；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-9GS-RANKL15，SEQ ID NO：626；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-9GS-RANKL18，SEQ ID NO：627；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSS
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>RANKL6-9GS-RANKL13，SEQ ID NO：631；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL6-9GS-RANKL15，SEQ ID NO：632；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL6-9GS-RANKL18，SEQ ID NO：633；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL9-9GS-RANKL3，SEQ ID NO：634；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL9-9GS-RANKL6，SEQ ID NO：635；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
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>RANKL9-9GS-RANKL13，SEQ ID NO：637；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL9-9GS-RANKL15，SEQ ID NO：638；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL9-9GS-RANKL18，SEQ ID NO：639；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLOMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL13-9GS-RANKL3，SEQ ID NO：640；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLOMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL13-9GS-RANKL6，SEQ ID NO：641；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
>RANKL13-9GS-RANKL9，SEQ ID NO：642；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSS
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RANKL94biv|RANKL9-15GS-RANKL9，SEQ ID NO：771；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSS
表B-4：针对RANK-L的三价双特异性纳米抗体
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
>RANKL30|RANKL3-ALB1-RANKL3，SEQ ID NO：694；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-ALB1-RANKL6，SEQ ID NO：695；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
>RANKL3-ALB1-RANKL9，SEQ ID NO：696；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYS TERAYTYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-ALB1-RANKL13，SEQ ID NO：697；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-ALB1-RANKL15，SEQ ID NO：698；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL3-ALB1-RANKL18，SEQ ID NO：699；PRT；->EVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTHISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL6-ALB1-RANKL3，SEQ ID NO：700；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL60|RANKL6-ALB1-RANKL6，SEQ ID NO：701；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSS
>RANKL6-ALB1-RANKL9，SEQ ID NO：702；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSS
>RANKL6-ALB1-RANKL13，SEQ ID NO：703；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL6-ALB1-RANKL15，SEQ ID NO：704；PRT；->EVQLVESGGGLMQTGGSLRLSCAASGVTYSYYTASWFRQAPGKEREFVAAISPSGNTYYADSVKGRFTISRDNGKHTMYLQMNSLNPEDTAVYFCAIRATDSIYYASSYRHWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
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>RANKL9-ALB1-RANKL3，SEQ ID NO：706；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLTCAASGRTFRSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLEPEDTAVYYCAAGSGYASLSYYSTERAYTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGKLVQAGGSLRLSCAVSGRTSSIYNMAWFRQGPGKGRESVGRIYWSDDNTYYADSVKGRFTISRDNATNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGKTTKWSLEYDYWGQGTQVTVSS
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>RANKL18-ALB1-RANKL13，SEQ ID NO：727；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTHISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKEREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTQVTVS S
>RANKL18-ALB1-RANKL15，SEQ ID NO：728；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTHISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKEREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTVYLQMASLKPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTQVTVSS
>RANKL180|RANKL18-ALB1-RANKL18，SEQ ID NO：729；PRT；->EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTHISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKEREFVGFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLKPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTQVTVSS
表B-5：针对RANK-L的人源化纳米抗体
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
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>RANKL18hum2，SEQ ID NO：742；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKGREFVGFITGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLRPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTLVTVSS
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>RANKL18hum4，SEQ ID NO：744；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKGREFVSFITGSGGTTYYGESVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLRPEDTAVYYCGVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTLVTVSS
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>RANKL15humbasic，SEQ ID NO：746；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKGREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTLYLQMASLRPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL15hum1，SEQ ID NO：747；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFRNYVMGWFRQAPGKGREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTLYLQMASLRPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL15hum2，SEQ ID NO：748；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKGREFVTAISTGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMASLRPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL15hum3，SEQ ID NO：749；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAAGGTFRNYVMGWFRQAPGKGREFVTAI STGGSWTGYVDSVKDRFTISRDNTKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAATTPATTYLPRSERQYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13humbasic，SEQ ID NO：750；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKGREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum1，SEQ ID NO：751；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYPMGWFRQAPGKGREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum1，SEQ ID NO：752；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum2，SEQ ID NO：753；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYSCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum3，SEQ ID NO：754；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFRSYPMGWFRQAPGKGREFVASITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum5，SEQ ID NO：755；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL13hum5_D62E，SEQ ID NO：756；PRT ；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL18hum6，SEQ ID NO：757；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKGREFVGFITGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNAQNPVYLQMNSLRPEDTAVYYCAVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTLVTVSS
>RANKL18hum7，SEQ ID NO：765；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSRSAMGWFRQAPGKGREFVGFITGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNAQNPLYLQMNSLRPEDTAVYYCAVYRRTYISSTYSESSEYDYWGQGTLVTVSS
表B-6：针对RANK-L的人源化纳米抗体的构建体
  <名称，SEQ ID#；PRT(蛋白)；->序列
RANKL001p，SEQ ID NO：761；PRT；->EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGGC
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表B-7：针对人血清白蛋白的纳米抗体
  名称   序列  SEQ ID NO
  ALB-1   EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS  790
  ALB-12   EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS  791
表B-8：用在纳米抗体构建体中的接头
  接头   序列 SEQ ID NO
  9GS接头   GGGGSGGGS 792
  15GS接头   ggggsggggsggggs 793
  20GS接头   GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 794
  25GS接头   ggggsggggsggggsggggsggggs 795
  30GS接头   GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 796
表C-2：在ELISA中使用抗-RANK-L纳米抗体获得的ED50值
纳米抗体   ED50(pM) 纳米抗体   ED50(pM)
  RANKL1RANKL3RANKL4RANKL6RANKL7RANKL8RANKL9RANKL11RANKL12RANKL13   619568380385376652542517399226   RANKL14RANKL15RANKL16RANKL17RANKL18RANKL19RANKL20RANKL21RANKL22RANKL23   574266953453242506306861379679
表C-3：在α筛选测定中使用抗-RANK-L纳米抗体获得的IC50值
纳米抗体   IC50(pM) 纳米抗体   IC50(pM)
  RANKL1RANKL3RANKL4RANKL6RANKL7RANKL8RANKL9RANKL11RANKL12RANKL13   7394975822884597551371170627185   RANKL14RANKL15RANKL16RANKL17RANKL18RANKL19RANKL20RANKL21RANKL22RANKL23   1750283225073714622401360158030203530
表C-5：在α筛选中单价和三价双特异性抗-RANK-L纳米抗体的比较。
纳米抗体   IC50(pM) 纳米抗体   IC50(pM)
  RANKL3RANKL6RANKL9RANKL13RANKL15RANKL18   474777341147572187   RANKL30RANKL60RANKL90RANKL130RANKL150RANKL180   442668299233
表C-6：在基于细胞的竞争性结合测定中单价和三价双特异性抗-RANK-L纳米抗体的比较。
  纳米抗体   IC50(pM)   纳米抗体   IC50(pM)
  RANKL13RANKL15RANKL18   429534552   RANKL130RANKL150RANKL180   55210106
表C-7：在NF-κB报道基因测定中抗-RANK-L纳米抗体的功效。
表C-8：如实施例6所述用于构建人/小鼠杂合体的引物。
  名称   序列5′-3′  SEQ ID NO
  T7-EEV   AAGGCTAGAGTACTTAATACGA   799
  RevpCIneo   CTTATCATGTCTGCTCGAAGC   800
  RevhRANKLM1   GGGAACCAGATGGGATGGAGGCGGCATTAATAGTGAGATGAG   801
  FwhRANKLM1   CTCATCTCACTATTAATGCCGCCTCCATCCCATCTGGTTCCC   802
  RevhRANKLM2   CCATTAGTTGAAGATACTCTGTAGCCACGCTTCCTGAAGTTTCATG   803
  FwhRANKLM2   CATGAAACTTCAGGAAGCGTGGCTACAGAGTATCTTCAACTAATGG   804
  RevhRANKLM3   CCATTAGTTGAAGATAGTCTGTAGGTAGGTCTCC   805
  FwhRANKLM3   GGAGACCTACCTACAGACTATCTTCAACTAATGG   806
表C-9：RANKL纳米抗体对如实施例6所述的RANK-L的人/小鼠杂合体的结合。
针对人RANK-L的单克隆抗体(R&D系统，Minneapolis，MN；Cat No.6262).
表C-10：实施例7所述的药物代谢动力学和药效学研究中的动物给药方案。
  组   动物ID   剂量和施用途径   单次/重复
  RANKL130RANKL131RANKL180ALB1伊班膦酸盐   1m2f3m4f5m6f7m8f9m10f   10mg/kg(IV推注)10mg/kg(IV推注)15mg/kg(输注8hrs)15mg/kg(输注8hrs)10mg/kg(IV推注)10mg/kg(IV推注)10mg/kg(IV推注)10mg/kg(IV推注)0,15mg/kg(IV推注)0,15mg/kg(IV推注)   单次单次单次单次单次单次单次单次重复(每月一次)重复(每月一次)
表C-11：实施例7所述的在食蟹猴研究中获得的关于药物代谢动力学参数的数值。
  参数1   cyno 1m   cyno 2f   cyno 5m   cyno 6f
  Vss_pred(mL/kg)   67.7   71.1   67.1   55.4
  CL_pred(mL/天/kg)   7.71   7.91   5.86   5.08
  MRTinf_pred(天)   8.79   8.98   11.5   10.9
  t1/2 λz1(天)2   6.75   6.81   8.74   9.28
  λz1_低-λz1_高(天)   1-39   2-51   4-51   1-32
  R2t1/2λz1   0.992   0.998   0.993   0.982
  t1/2λz2(天)3   3.10   3.29   2.53   2.21
  λz2_低-λz2_高(天)   39-58   51-72   58-72   36-51
  R2t1/2λz2   0.994   0.985   0.991   0.984
  AUC0-39天   1287   -   1693   -
  AUC0-51天   -   1260   -   1909
  AUC持续(μg·天/mL)   1297   1264   1707   1970
  ％AUCextrap_pred   0.0117   0.0033   0.0046   0.0112
  AUCinf_pred(μg·天/mL)   1297   1264   1708   1970
  AUCinf_pred/D(kg·天/mL)   0.130   0.126   0.171   0.197
1所有参数使用非区室模型计算。
2关于表观βfase计算的半衰期。
3关于表观γfase计算的半衰期。
表C-12：实施例7所述的在食蟹猴研究中获得的关于药物代谢动力学参数的数值。
  参数1   cyno 3m   cyno 4f
  Vss_pred(mL/kg)   488   775
  CL_pred(mL/天/kg)   2433   3355
  MRTinf_pred(天)   0.200   0.231
  t1/2λz(天)   0.787   0.843
  λz1_低-λz1_高(天)   1.0-4.0   1.0-4.0
  R2t1/2wλz   0.970   0.918
  AUC持续(μg·天/mL)   6.14   4.45
  ％AUCextrap_pred   0.380   0.493
  AUCinf_pred(μg·天/mL)   6.16   4.47
  AUCinf_pred/D(kg·天/mL)   0.0004   0.0003
1所有参数使用非区室模型计算。
表C-13：人源化RANKL纳米抗体在α筛选和Biacore 3000中的活性。
表C-14：不同纳米抗体构建体在α筛选和FMAT中的活性。
  纳米抗体   α筛选IC50(pM)   FMATIC50(pM)
  RANKL13RANKL130RANKL131RANKL133   120311926   2644523ND
  RANKL18RANKL180RANKL181bivRANKL182bivRANKL183bivRANKL18hum6Bi_25RANKL18hum6Bi_30   25339113894910050   2535613476523838
  RANKL9RANKL90RANKL91bivRANKL92bivRANKL93bivRANKL94biv   23863153706672   1304990324830
表C-15：由人源化纳米抗体形成的不同的构建体。
  纳米抗体形式   纳米抗体ID   SEQ ID NO
  RANKL13hum5-ALB012-RANKL13hum5RANKL18hum6-ALB012-RANKL 18hum6RANKL13hum5-9GS-RANKL13hum5-PEGRANKL18hum6-30GS-RANKL18hum6-PEGRANKL13hum5-9GS-RANKL13hum5-HSARANKL18hum6-30GS-RANKL18hum6-HSA   RANKL008aRANKL010aRANKL001pRANKL003pRANKL004hRANKL006h   759760761762772773
表C-16：人源化纳米抗体的不同构建体在α筛选和FMAT中的活性。
  纳米抗体   α筛选IC50(pM)   FMATIC50(pM)
  RANKL13hum5RANKL008aRANKL001pRANKL004hRANKL130   18825494817   13736413442
  RANKL18hum6RANKL3pRANKL10aRANKL180   87252830   3803857NA
表C-19：实施例14中所述在动物模型中所用的施用剂量、途径和频率。
  组   检测项目   剂量水平   施用途径/频率   动物数量
  1234567891011121314151617   RANKL008aRANKL008aRANKL008aRANKL008aRANKL001pRANKL001pRANKL001pRANKL001pRANKL003pRANKL003pRANKL003pRANKL003pRANKL130RANKL130伊班膦酸盐ALB8PBS   3.00.30.033.03.00.30.033.03.00.30.033.0103.00.153.0   IV/一次IV/一次IV/一次SC/一次IV/一次IV/一次IV/一次SC/一次IV/一次IV/一次IV/一次SC/一次IV/一次IV/一次IV/每月IV/一次IV/一次   1-34-67-910-1213-1516-1819-2122-2425-2728-3031-3334-3637-3940-4243-4546-4849-51
表C-20：实施例14所述在雌性食蟹猴中单次静脉内推注施用后，RANKL008a的基本药物代谢动力学参数。
1关于表观β阶段计算的半衰期
2关于表观γ阶段计算的半衰期
表C-21：实施例14中所述在雌性食蟹猴中单次静脉内推注施用后，RAMKL001p的基本药物代谢动力学参数。
1关于表观β阶段计算的半衰期
2关于表观γ阶段计算的半衰期
表C-22：实施例14中所述在雌性食蟹猴中单次静脉内推注施用后，RANKL003p的基本药物代谢动力学参数。
1关于表观β阶段计算的半衰期
2关于表观γ阶段计算的半衰期
表C-23：实施例14中所述在雌性食蟹猴中单次皮下施用后，纳米抗体的基本药物代谢动力学参数。
1MRT计算为AUMC/AUC，且因此不对于MAT校正。Vss/F＝MRT·CL
2关于表观b阶段计算的半衰期
3关于表观g阶段计算的半衰期
4对于3mg/kg剂量水平估算F，忽略CL中的免疫原性和非线性。
表24：实施例14所述在雌性食蟹猴中，RANK008a，RANKL001p和RANKL003p的药效学参数(±SE)。
  参数   RANKL008a   RANKL001p   RANKL003p
  Kin(nM/天)   938±194   1201±235   2835±27581
  Kout(1/天)   8.99±1.79   11.7±2.1   25.9±19.81
  Imax   0.878±0.024   0.882±0.017   0.892±0.038
  IC50(μg/mL)   0.049±0.008   0.114±0.025   0.518±0.125
  n   1.38±0.29   1.23±0.21   0.817±0.182
1数值不能以充分的精度估算。

Claims (59)

1.多价多肽，其包括针对和/或可以特异性结合RANK-L的至少两个纳米抗体、或由其组成，其中所述纳米抗体是结构如下所示的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1-FR4分别是指构架区1–4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1–3，
并且其中CDR1是SEQ ID NO:200的氨基酸序列；CDR2是SEQ IDNO:324的氨基酸序列；和CDR3是SEQ ID NO:448的氨基酸序列，
其中所述多价多肽是二价多肽或三价多肽。
2.按照权利要求1的多价多肽，其中所述至少两个纳米抗体调节、抑制和/或防止RANKL-L与RANK的结合。
3.按照权利要求1或2任一项的多价多肽，其中所述至少两个纳米抗体防止和/或抑制破骨细胞的分化和/或增殖。
4.按照权利要求1的多价多肽，其中所述纳米抗体包括但不限于VHH序列。
5.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其中所述至少两个纳米抗体是VHH序列,部分人源化的VHH序列,完全人源化的VHH序列,骆驼源化的重链可变结构域，和/或是已经通过亲和力成熟获得的纳米抗体。
6.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其包括这样的至少两个纳米抗体，当在Biacore测定和/或在ELISA测定中确定时，其交叉阻断RANKL与SEQ ID NO’s:572和SEQ ID NO’s:750-756中的至少一个氨基酸序列的结合，和/或其与RANK-L的结合被SEQ ID NO’s:572和SEQ IDNO’s:750-756中的至少一个氨基酸序列交叉阻断。
7.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其包括选自SEQ ID NO:572的至少两个纳米抗体。
8.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其包括至少两个为人源化纳米抗体的纳米抗体，所述人源化纳米抗体选自由SEQ ID NO’s:750-756组成的组。
9.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其包括选自SEQ ID NO’s:643,679,761,766和772的氨基酸序列或由其组成。
10.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其是多特异性构建体。
11.多价多肽，其由按照权利要求1-2中任一项的多价多肽和任选地通过一个或多个肽接头连接的一个或多个其他部分或结合单位组成，其中所述一个或多个其他部分或结合单位为所述多价多肽提供与按照权利要求1-2中任一项所述的相对应的多价多肽本身相比较增加的半衰期。
12.按照权利要求11的多价多肽，其中为所述多价多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他部分或结合单位选自由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段、可以与血清蛋白结合的结合单位、Fc部分、和可以与血清蛋白结合的小蛋白或肽。
13.按照权利要求11的多价多肽，其中为所述多价多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他部分选自由人血清白蛋白或其片段组成的组。
14.按照权利要求11的多价多肽，其中为所述多价多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由可以与血清白蛋白或血清免疫球蛋白结合的结合单位组成的组。
15.按照权利要求14的多价多肽，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
16.按照权利要求14的多价多肽，其中所述血清免疫球蛋白是IgG。
17.按照权利要求11的多价多肽，其中为所述多价多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自由下列各项组成的组：结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序列,单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列,"dAb"，适合用作dAb的氨基酸序列，或可以与血清白蛋白或血清免疫球蛋白结合的纳米抗体。
18.按照权利要求17的多价多肽，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
19.按照权利要求17的多价多肽，其中所述血清免疫球蛋白是IgG。
20.按照权利要求11的多价多肽，其中为所述多价多肽提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单位选自SEQ ID NO’s:790-791。
21.按照权利要求11-20中任一项的多价多肽，其具有这样的血清半衰期：
·其分别是所述相对应的多价多肽本身的半衰期的至少1.5倍；和/或
·分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，其增加超过1小时。
22.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期是所述相对应的多价多肽本身的半衰期的至少2倍。
23.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期是所述相对应的多价多肽本身的半衰期的至少5倍。
24.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期是所述相对应的多价多肽本身的半衰期的至少10倍。
25.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期是所述相对应的多价多肽本身的半衰期的大于20倍。
26.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过2小时。
27.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过6小时。
28.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过12小时。
29.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过24小时。
30.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过48小时。
31.按照权利要求21的多价多肽，所述多价多肽具有的血清半衰期分别与所述相对应的多价多肽本身的半衰期相比较，增加超过72小时。
32.按照权利要求11-20中任一项的多价多肽，其在人中具有至少12小时的血清半衰期。
33.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少24小时的血清半衰期。
34.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少48小时的血清半衰期。
35.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少72小时的血清半衰期。
36.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少5天的血清半衰期。
37.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有5-10天的血清半衰期。
38.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少9天的血清半衰期。
39.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有9-14天的血清半衰期。
40.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少10天的血清半衰期。
41.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有10-15天的血清半衰期。
42.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少11天的血清半衰期。
43.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有11-16天的血清半衰期。
44.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少12天的血清半衰期。
45.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有12-18天的血清半衰期。
46.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有至少14天的血清半衰期。
47.按照权利要求32的多价多肽，其在人中具有14-19天的血清半衰期。
48.按照权利要求1-2中任一项的多价多肽，其包括选自SEQ IDNO’s:715和759的氨基酸序列或由其组成。
49.核酸或核苷酸序列，其编码按照权利要求1-48中任一项的多价多肽。
50.按照权利要求49的核酸或核苷酸序列，其以遗传构建体的形式存在。
51.宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达或其在适当的环境下能够表达按照权利要求1-48中任一项的多价多肽；和/或其包括按照权利要求49的核酸或核苷酸序列、或按照权利要求50的遗传构建体。
52.用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的药物组合物，其包括至少一种下列各项：按照权利要求1-48中任一项的多价多肽；和/或其包括按照权利要求49-50的核酸或核苷酸序列。
53.按照权利要求52的药物组合物，其还包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂。
54.按照权利要求53的药物组合物，其包括一种或多种其他药物活性化合物。
55.按照权利要求53的药物组合物，其包括一种或多种其他药物活性多肽。
56.用于生产按照权利要求1-48中任一项的多价多肽的方法，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列获得，所述方法至少包括下列步骤：
-在适当的宿主细胞或宿主生物体内或在另一种适当的表达系统内表达按照权利要求49的核酸或核苷酸序列、或按照权利要求50的遗传构建体；或
-在这样的条件下培育和/或维持按照权利要求51的宿主或宿主细胞，所述条件是这样的，以致所述宿主或宿主细胞表达和/或生产至少一种按照权利要求1-48中任一项的多价多肽，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得。
57.按照权利要求56的方法，其中接着：
-分离和/或纯化这样获得的按照权利要求1-48中任一项的多价多肽，其是这样的，以致其可以通过表达编码其的核酸或核苷酸序列而获得。
58.按照权利要求1-48中任一项的多价多肽在制备用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症的药物组合物中的应用。
59.按照权利要求1-48中任一项的多价多肽，其用于预防和/或治疗至少一种骨疾病或病症。
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Date Code Title Description
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EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20100804

Assignee: Eddingpharm (Asia) Macao Commercial Offshore Services Ltd.

Assignor: Ablynx NV

Contract record no.: 2013990000690

Denomination of invention: Amino acid sequences directed against RANK-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders

License type: Exclusive License

Record date: 20131017

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