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CN108290943A - 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白可变结构域 - Google Patents

改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白可变结构域 Download PDF

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CN108290943A
CN108290943A CN201680066246.6A CN201680066246A CN108290943A CN 108290943 A CN108290943 A CN 108290943A CN 201680066246 A CN201680066246 A CN 201680066246A CN 108290943 A CN108290943 A CN 108290943A
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CN
China
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amino acid
present
immunoglobulin
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CN201680066246.6A
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玛丽-安格·比斯
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Ablynx NV
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Abstract

本发明涉及与血清白蛋白结合的氨基酸序列。特别地，本发明涉及改进的免疫球蛋白单可变结构域(在本文中也被称为“ISV”或“ISVD”)，并且更尤其是与血清白蛋白结合的改进的重链免疫球蛋白单可变结构域，并且涉及包含这样的改进的血清白蛋白结合物的蛋白质、多肽和其他构建体、化合物、分子或化学实体。

Description

改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白可变结构域
本发明涉及与血清白蛋白结合的氨基酸序列。
尤其是，本发明涉及改进的免疫球蛋白单可变结构域(在本文中也被称为“ISV”或“ISVD”)，并且更尤其是与血清白蛋白结合的改进的重链免疫球蛋白单可变结构域，并且涉及包含这样的改进的血清白蛋白结合物的蛋白质、多肽和其他构建体、化合物、分子或化学实体。
基于在本文中的公开内容，本发明的其他方面、实施方案、特征、用途和优点对技术人员来说将会是清楚的。
本发明提供的改进的血清白蛋白结合ISVD在本文中也被称为“本发明的血清白蛋白结合物”、“本发明的白蛋白结合物”或“血清白蛋白结合物”或“白蛋白结合物”。此外，包含至少一种本发明的血清白蛋白结合物的蛋白质、多肽和其他构建体、化合物、分子或化学实体在本文中也被称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”。
优选地，本发明的多肽是融合蛋白。
在本申请中，在免疫球蛋白重链可变结构域中的氨基酸残基/位置将会使用根据Kabat的编号表示。为了方便，图1提供了列出将会在本文中具体提及的一些氨基酸位置和它们根据一些备选编号系统(如Aho和IMGT。注意：除非明确地另外指出，对于本说明书和权利要求来说，Kabat编号是决定性的；提供其他编号系统仅用于参考)的编号的表格。
就CDR而言，如在本领域中公知的，存在多种定义并且描述VH或VHH片段的CDR的习惯，如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(其基于结构环区域的位置)。例如，参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/。对于本说明书和权利要求的目的来说，即使也可以提及根据Kabat的CDR，最优选基于Abm定义(其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件)来定义CDR，因为认为这是在Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷。再次参考网站http://www.bioinf.org.uk/abs/)。
可以与血清白蛋白结合的ISVD以及它们的用途是在本领域中公知的，例如根据WO2004/041865、WO 2006/122787、EP 2 139 918、WO 2011/006915、WO 2012/175400和WO2014/111550，它们描述了血清白蛋白结合ISVD以及它们用于延长治疗性化合物、部分和实体的血清半衰期(如在这些申请中定义的)的用途。
本发明旨在提供改进的血清白蛋白结合物，尤其是与在WO 2011/006915和WO2014/111550中公开的血清白蛋白结合物相比。根据这两个PCT申请已知的血清白蛋白结合物的代表性的实例在以下表A中分别作为“参照A”至“参照D”给出。这些参照序列的比对在图2中给出。这些参照化合物的CDR(的组合)(分别根据Kabat和Abm习惯)在表B中列出。
更具体地，本发明旨在提供作为在表A中提及的血清白蛋白结合ISVD的变体并且具有降低的借助可能存在于来自健康人受试者以及来自患者的血清中的干扰因子(通常被称为“事先存在的抗体”)的结合的改进的血清白蛋白结合ISVD。参考WO 12/175741、WO2013/024059，并且还例如参考Holland等(J.Clin.Immunol.2013,33(7):1192-203)，以及参考于2015年5月13日由受让人提交的题目为“改进的免疫球蛋白可变结构域(Improvedimmunoglobulin variable domains)”的共同待审非预公布PCT申请PCT/EP2015/060643(于2015年11月19日作为WO 2015/173325公布)。
表B：参照化合物A至D的CDR(根据Kabat和Abm)
如在本文中进一步描述的，本发明的血清白蛋白结合物优选具有与在参照A、B、C或D中的一种中存在的相同的CDR的组合(即CDR1、CDR2和CDR3)，并且最优选具有与在参照C或参照D(其具有相同的CDR)中存在的相同的CDR的组合。
在表A中列出的血清白蛋白结合物中，与通常的C端序列VTVSS(SEQ ID NO:113，存在于SEQ ID NO:1至3的结合物中)相比，SEQ ID NO:4的结合物具有C端丙氨酸延伸，即在ISVD序列的C端末端的丙氨酸残基(有时也被称为“位置114”)。如在WO 12/175741中(而且还例如在WO 2013/024059中)描述的，这种C端丙氨酸延伸可以防止所谓的“事先存在的抗体”(推测为IgG)与位于ISV的C端区域的推定的表位结合。推测这种表位尤其包括C端序列VTVSS的表面暴露的氨基酸残基以及在位置14的氨基酸残基(和在氨基酸序列中与所述氨基酸残基紧邻/靠近的氨基酸残基，如位置11、13和15)，并且也可以包括在位置83的氨基酸残基(和在氨基酸序列中与所述氨基酸残基紧邻/靠近的氨基酸残基，如位置82、82a、82b和84)和/或这些位置108的氨基酸残基(和在氨基酸序列中与所述氨基酸残基紧邻/靠近的氨基酸残基，如位置107)。
然而，尽管这样的C端丙氨酸(或概括地，C端延伸)的存在可以大幅降低(并且在许多情况中甚至基本上完全防止)可以在来自一系列受试者(健康受试者和患者)的血清中发现的“事先存在的抗体”的结合，已经发现来自一些受试者的血清(如来自患有一些免疫疾病如SLE的患者的血清)可以含有可以与ISV的C端区域结合(当这样的区域被暴露时)的事先存在的抗体，即使ISV含有这样的C端丙氨酸(或者更概括地，这样的C端延伸)。再次参考于2015年5月13日由受让人提交的题目为“改进的免疫球蛋白可变结构域(Improvedimmunoglobulin variable domains)”的共同待审非预公布PCT申请PCT/EP2015/060643。
因此，本发明的一个具体目的是提供作为在表A中列出的血清白蛋白结合ISVD的改进的变体并且具有降低的借助所谓的“事先存在的抗体”的结合的血清白蛋白结合物，并且具体属于在PCT/EP2015/060643中描述的种类(即，即使在C端延伸的存在下也可以与ISV的暴露的C端区域结合的那些事先存在的抗体)。
通常，通过提供作为包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)的SEQ ID NO:1至4的序列的变体(并且尤其是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的变体)的血清白蛋白结合ISV，本发明达到了这个目的：
-89T；或
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；或
-与110K或110Q组合的11V；或
-与112K或112Q组合的11V。
在具体的方面中，在本发明的血清白蛋白结合物中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L、V或K；并且
-在位置89的氨基酸残基优选适宜地选自T、V或L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q；
以使得(i)位置89是T；或(ii)位置110是K或Q；或(iii)位置112是K或Q；或(iv)位置89是L并且位置11是V；或(v)位置89是L并且位置110是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置112是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置11是V并且位置110是K或Q；或(vii)位置89是L并且位置11是V并且位置112是K或Q；或(viii)位置11是V并且位置110是K或Q；或(ix)位置11是V并且位置112是K或Q。
在本发明提供的氨基酸序列中，其中位置89是T或其中位置11是V并且位置89是L(任选与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适合地组合，并且尤其是与110K或110Q突变组合)的氨基酸序列是特别优选的。甚至更优选的是其中位置11是V并且位置89是L、任选具有110K或110Q突变的氨基酸序列。
本发明的氨基酸序列优选与具有比100nM更好、优选比50nM更好的亲和力的(人)血清白蛋白结合。例如，分别作为参照A或参照B的变体的本发明的白蛋白结合物可以具有分别与在WO 2011/006915中针对参照A或参照B描述的大约相同的对(人)血清白蛋白的亲和力；并且类似地，分别作为参照C和/或参照D的变体的本发明的白蛋白结合物可以具有分别与在WO 2014/111550中针对参照C和/或参照D描述的大约相同的对(人)血清白蛋白的亲和力(并且亲和力分别如在WO 2011/006915或WO 2014/111550中描述的进行测量)。
此外，本发明提供的白蛋白结合物以及包括其的化合物和多肽(如在本文中进一步描述的)在人中的半衰期(定义为t1/2β)优选为大于1小时、优选大于2小时、更优选大于6小时，如大于12小时，并且例如约一天、两天、一周、两周和多至血清白蛋白在人中的半衰期(估算为大约19天)，尽管后者可能是较不重要的。
例如，分别作为参照A或参照B的变体的本发明的白蛋白结合物可以具有分别与参照A或参照B相当(并且优选大约相同)的在人中的半衰期(再次参见WO 2011/006915)；并且类似地，分别作为参照C和/或参照D的变体的本发明的白蛋白结合物可以具有分别与参照C和/或参照D相当(并且优选大约相同)的在人中的半衰期(再次参见WO 2014/111550)。
此外，包含分别作为参照A或参照B的变体的白蛋白结合物的本发明的化合物或多肽可以具有与相同的化合物或多肽但是分别具有参照A或参照B代替本发明的白蛋白结合物的半衰期相当(并且优选大约相同)的在人中的半衰期；并且类似地，包含分别作为参照C或参照D的变体的白蛋白结合物的本发明的化合物或多肽可以具有与相同的化合物或多肽但是分别具有参照C或参照D的半衰期相当(并且优选大约相同)的在人中的半衰期。
表C列出了可以在本发明的血清白蛋白结合物中的位置11、89、110和112存在的氨基酸残基的一些非限制性的可能组合。特别优选的组合以粗体表示，并且最优选的组合以粗体/下划线表示。
表C：在位置11、89、110和112的氨基酸的可能组合。
本发明的血清白蛋白结合物如在本文中的说明书、实施例和附图中进一步描述，即它们具有如在本文中所描述的CDR并且具有与如在本文中所公开的SEQ ID NO:1至4的序列(之一)的总体序列同一性程度(如在本文中定义的)和/或可以具有与这些参照序列(之一)的有限数量的“氨基酸差异”(如在本文中所描述的)。
本发明的血清白蛋白结合物优选包含以下CDR(根据Kabat习惯)：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1选自以下序列：TGEMA(SEQ ID NO:5)和TSSML(SEQID NO:10)，并且所述CDR1优选为TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ IDNO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)并且最优选FPSSRMKFDY(SEQ IDNO:15)。
更优选地，CDR如下(再次根据Kabat习惯给出)：CDR1是TSSML(SEQ ID NO:10)；CDR2是VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)并且CDR3是FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。最优选地，CDR1是TSSML(SEQ ID NO:10)；CDR2是VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)并且CDR3是FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
备选地，当CDR根据Abm习惯给出时，本发明的血清白蛋白结合物优选包含以下CDR：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
当根据Abm习惯给出时，优选地，CDR如下：CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，CDR2是VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)并且CDR3是FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。最优选地，CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，CDR2是VIHQSGTPTY(SEQID NO:14)并且CDR3是FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
本发明的血清白蛋白结合物优选还具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；-并且尤其是至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与序列SEQ ID NO:3或4的序列同一性程度(其中同样地，对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；和/或
-不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且尤其是不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个这样的与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的“氨基酸差异”(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)。
就本发明的白蛋白结合物的多个方面和优选的方面而言，当涉及分别并且适用时相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中的一种的序列同一性程度和/或可以存在于这样的本发明的结合物中的“氨基酸差异”的数量和种类(即分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中的一种相比)时，应当指出，当认为(i)本发明的氨基酸序列具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的分别并且适用时与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的序列的序列同一性程度时(其中对于确定序列同一性程度来说，不考虑CDR、可能存在的任何C端延伸、以及所涉及的具体方面所需的在位置11、89、110和/或112的突变)；和/或当认为(ii)本发明的氨基酸序列具有不多于7、优选不多于5、如仅3、2或1个分别并且适用时与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的序列的“氨基酸差异”时(同样地，不考虑可能存在的任何C端延伸并且不考虑所涉及的具体方面所需的在位置11、89、110和/或112的突变)，则还包括除所涉及的具体方面所需的在位置11、89、110和/或112的突变和可能存在的任何C端延伸外不具有分别并且适用时与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的序列的氨基酸差异的序列。
因此，在本发明的一个具体方面中，本发明的白蛋白结合物可以具有分别并且适用时与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的100％序列同一性(包括CDR，但是不考虑在本文中所公开的在位置11、89、110和/或112的一个或多个突变或突变的组合和/或可能存在的任何C端延伸)，和/或可以不具有分别并且适用时与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的氨基酸差异(即除在本文中所公开的在位置11、89、110和/或112的一个或多个突变或突变的组合和可能存在的任何C端延伸外)。
当存在任何氨基酸差异(即除任何C端延伸和所涉及的本发明的具体方面所需的在位置11、89、110和/或112的突变外)时，这些氨基酸差异可以存在于CDR中和/或构架区中，但是它们优选仅存在于构架区中(如由Abm习惯定义的，即不在如根据Abm习惯定义的CDR中)，即，使得本发明的白蛋白结合物具有分别并且适用时与在SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4中的一种中存在的相同的CDR的组合(根据Abm习惯定义)。
当本发明的血清白蛋白结合物存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时(或当它们另外具有在它们所存在的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体中的“暴露的”C端末端时，这意味着ISV的C端末端不与恒定结构域(如CH1结构域)结合或连接；再次参考WO 12/175741和PCT/EP2015/06043)，它们优选还具有式(X)n的C端延伸，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选的方面，其不包含任何半胱氨酸残基)、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基。
根据这样的C端延伸X(n)的一些优选的、但非限制性的实例，X和n可以是如下：
(a)n＝1并且X＝Ala；
(b)n＝2并且每个X＝Ala；
(c)n＝3并且每个X＝Ala；
(d)n＝2并且至少一个X＝Ala(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(e)n＝3并且至少一个X＝Ala(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(f)n＝3并且至少两个X＝Ala(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(g)n＝1并且X＝Gly；
(h)n＝2并且每个X＝Gly；
(i)n＝3并且每个X＝Gly；
(j)n＝2并且至少一个X＝Gly(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(k)n＝3并且至少一个X＝Gly(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(l)n＝3并且至少两个X＝Gly(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
(m)n＝2并且每个X＝Ala或Gly；
(n)n＝3并且每个X＝Ala或Gly；
(o)n＝3并且至少一个X＝Ala或Gly(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；或
(p)n＝3并且至少两个X＝Ala或Gly(并且一个或多个其余氨基酸残基X独立选自任何天然存在的氨基酸，但是优选独立选自Val、Leu和/或Ile)；
并且方面(a)，(b)，(c)、(g)、(h)、(i)，(m)和(n)是特别优选的，并且其中n＝1或2的方面是优选的，并且其中n＝1的方面是特别优选的。
还应当指出，优选地，存在于本发明的血清白蛋白结合物中的任何C端延伸均不含有(游离的)半胱氨酸残基(除非所述半胱氨酸残基使用或预期用于进一步官能化，例如用于聚乙二醇化)。
可用的C端延伸的一些具体的、但非限制性的实例是以下氨基酸序列：A、AA、AAA、g，GG、GGG、AG、GA、AAG、AGG、AGA、GGA、GAA或GAG。
当本发明的血清白蛋白结合物含有在位置110或112的突变(任选与如在本文中所描述的在位置11和/或89的突变组合)时，构架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)可以是如下：(i)如果不存在C端延伸：VTVKS(SEQ ID NO:101)、VTVQS(SEQ ID NO:102)、VKVSS(SEQID NO:103)或VQVSS(SEQ ID NO:104)；或者(ii)如果存在C端延伸：VTVKSX(n)(SEQ ID NO:105)、VTVQSX(n)(SEQ ID NO:106)、VKVSSX(n)(SEQ ID NO:107)或VQVSSX(n)(SEQ ID NO:108)，如VTVKSA(SEQ ID NO:109)、VTVQSA(SEQ ID NO:110)、VKVSSA(SEQ ID NO:111)或VQVSSA(SEQ ID NO:112)。当本发明的血清白蛋白结合物不含有在位置110或112的突变(但是仅有如在本文中所描述的在位置11和/或89的突变)时，构架4的C端氨基酸残基(从位置109开始)通常将会是：(i)当不存在C端延伸时：VTVSS(SEQ ID NO:113)(如在SEQ ID NO:3的序列中)；或者(ii)当存在C端延伸时：VTVSSX(n)(SEQ ID NO:114)如VTVSSA(SEQ ID NO:115)(如在SEQ ID NO:4的序列中)。在这些C端序列中，X和n是如在本文中针对C端延伸所定义的。
此外，当本发明的血清白蛋白结合物存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时，则血清白蛋白结合物优选具有在位置1的D(即与SEQ ID NO:1至4和16至99的给出的序列相比的E1D突变)。
此外，通常，当本发明的化合物或多肽在其C端末端具有重链ISVD(其可以是本发明的血清白蛋白结合物，但是例如也可以是与时治疗靶标结合的ISVD)，则所述C端ISVD(并且甚至本发明的化合物或多肽)优选具有如在本文中所描述的C端延伸X(n)。类似地，当本发明的化合物或多肽在其N端末端具有重链ISVD(其可以是本发明的血清白蛋白结合物，但是例如也可以是与时治疗靶标结合的ISVD)，则所述N端ISVD(并且甚至本发明的化合物或多肽)优选具有在位置1的D。
此外，优选地，当本发明的化合物或多肽除一种或多种本发明的白蛋白结合物外还含有一种或多种其他ISVD(所述一种或多种其他ISVD可以例如是针对治疗靶标的一种或多种ISVD)时，则优选地，存在于所述化合物或多肽中的所有ISVD在它们的序列中含有降低事先存在的抗体的结合的一种或多种构架突变。尤其是，当这些其他ISVD是基本上由VH结构域组成和/或衍生自VH结构域的纳米抗体或(单一)结构域抗体时，它们可以含有如在PCT/EP2015/060643中描述的和/或基本上如在PCT/EP2015/060643中描述的和/或如在本文中针对本发明的白蛋白结合物所描述的在位置11、89、110和/或112的氨基酸残基/突变(的适合组合)。
如提到的，由本发明提供的氨基酸序列是可以与人血清白蛋白结合、并且尤其是可以与人血清白蛋白特异性(如在本文中所描述的)结合的蛋白质。因此，它们可以用作用于与(人)血清白蛋白结合的结合单元或结合结构域，例如为治疗性化合物、部分或实体赋予半衰期(如在本文中定义的)的增加。对于血清白蛋白结合结构域用于增加治疗性化合物、部分或实体的半衰期的用途来说，通常参考WO 2004/041865、WO 2006/122787、EP 2139 918、WO 2011/006915、WO 2012/175400和/或WO 2014/111550。本发明的白蛋白结合物通常可以以与在这些参考文献中描述的血清白蛋白结合物相同的方式和相同的目的使用。
在SEQ ID NO:16至99中给出了本发明的ISV的一些优选的、但非限制性的实例，并且这些序列中的每一种构成了本发明的另一个方面(正如包含这些序列中的一种的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体那样)。在这些中：
-SEQ ID NO:16至29是SEQ ID NO:1的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ IDNO:5的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQ ID NO:6的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQID NO:7的序列的CDR3(根据Kabat定义)；
-SEQ ID NO:30至43是具有C端丙氨酸(如在本文中所描述的C端延伸的优选的、但非限制性的实例)的SEQ ID NO:1的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ ID NO:5的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQ ID NO:6的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQ ID NO:7的序列的CDR3(根据Kabat定义)；
-SEQ ID NO:44至57是SEQ ID NO:2的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ IDNO:10的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQ ID NO:11的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQ ID NO:12的序列的CDR3(根据Kabat定义)；
-SEQ ID NO:58至71是具有C端丙氨酸(如在本文中所描述的C端延伸的优选的、但非限制性的实例)的SEQ ID NO:2的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ ID NO:10的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQ ID NO:11的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQ ID NO:12的序列的CDR3(根据Kabat定义)；
-SEQ ID NO:72至85是SEQ ID NO:3的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ IDNO:10的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQ ID NO:11的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQ ID NO:15的序列的CDR3(根据Kabat定义)；
-SEQ ID NO:86至99至54是SEQ ID NO:4(其为具有C端丙氨酸延伸的SEQ ID NO:3)的序列的变体的实例。这些序列具有SEQ ID NO:10的序列的CDR1(根据Kabat定义)；SEQID NO:11的序列的CDR2(根据Kabat定义)；和SEQ ID NO:15的序列的CDR3(根据Kabat定义)。
在这些变体中，SEQ ID NO:72至85的序列(当不需要C端延伸时)和SEQ ID NO:86至99的序列(当需要C端延伸时)是最优选的。
因此，在第一方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1选自以下序列：TGEMA(SEQ ID NO:5)和TSSML(SEQID NO:10)，并且所述CDR1优选为TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ IDNO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基优选适宜地选自T、V或L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q；
以使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L并且位置11是V；或(iii)位置89是L并且位置110是K或Q；或(iv)位置89是L并且位置112是K或Q；或(v)位置89是L并且位置11是V并且位置110是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置11是V并且位置112是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置110是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置112是K或Q。
在另外的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1选自以下序列：TGEMA(SEQ ID NO:5)和TSSML(SEQID NO:10)，并且所述CDR1优选为TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ IDNO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)并且最优选FPSSRMKFDY(SEQ IDNO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；-并且尤其是至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与序列SEQ ID NO:3或4的序列同一性程度(其中同样地，对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；和/或
-不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且尤其是不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个这样的与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的“氨基酸差异”(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
所述免疫球蛋白单可变结构域在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-89T；或
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；或
-与110K或110Q组合的11V；或
-与112K或112Q组合的11V。
尤其是，本发明的血清白蛋白结合物优选具有不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且尤其是不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个这样的与SEQID NO:3的序列的“氨基酸差异”(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)。
这样的可能存在的突变/氨基酸差异(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比)的一些具体的、但非限制性的实例是：E1D、P14A；P41A、P41L、P41S或P41T(并且尤其是P41A)；P42E或T87A。突变的其他实例是一种或多种适合的“骆驼源化(camelizing)”置换(的适合组合)；例如，参考Davies and Riechmann,Protein Engineering(蛋白质工程),vol.9,no.6,531-537,1996和Davies和Riechmann，FEBS Letters 399(1004),285-290，以及来自WO 08/020079的表A-3至A-8。
如提到的，在本发明中，其中位置89是T或其中位置11是V并且位置89是L(任选与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适合地组合，并且尤其是与110K或110Q突变组合)的氨基酸序列是特别优选的。甚至更优选的是其中位置11是V并且位置89是L、任选具有110K或110Q突变的氨基酸序列。
因此，在一个优选的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1选自以下序列：TGEMA(SEQ ID NO:5)和TSSML(SEQID NO:10)，并且所述CDR1优选为TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ IDNO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)并且最优选FPSSRMKFDY(SEQ IDNO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基是T；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q(并且优选为T)；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q(并且优选为S)。
在另一个优选的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1选自以下序列：TGEMA(SEQ ID NO:5)和TSSML(SEQID NO:10)，并且所述CDR1优选为TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ IDNO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)并且最优选FPSSRMKFDY(SEQ IDNO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基是V；并且
-在位置89的氨基酸残基是L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q。
在具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物具有：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1是TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2是VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3选自以下序列：FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且更具体地：
-CDR1(根据Kabat)，所述CDR1是TSSML(SEQ ID NO:10)；和
-CDR2(根据Kabat)，所述CDR2是VIHQSGTPTYYADSVKG(SEQ ID NO:11)；和
-CDR3(根据Kabat)，所述CDR3是FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
在一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与89L组合的11V；或
-与110K或110Q组合的11V；
-与112K或112Q组合的11V；
-与89L和110K或110Q组合的11V；或
-与89L和112K或112Q组合的11V；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的110K或110Q；或
-与89L组合的110K或110Q；或
-与11V和89L组合的110K或110Q；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的112K或112Q；或
-与89L组合的112K或112Q；或
-与11V和89L组合的112K或112Q；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物包含在位置89的T并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物包含在位置11的V和在位置89的L并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基优选适宜地选自T、V或L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q；
以使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L并且位置11是V；或(iii)位置89是L并且位置110是K或Q；或(iv)位置89是L并且位置112是K或Q；或(v)位置89是L并且位置11是V并且位置110是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置11是V并且位置112是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置110是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置112是K或Q。
在另一个方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；-并且尤其是至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与序列SEQ ID NO:3或4的序列同一性程度(其中同样地，对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；和/或
-不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且尤其是不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个这样的与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列的“氨基酸差异”(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
所述免疫球蛋白单可变结构域在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-89T；或
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；或
-与110K或110Q组合的11V；或
-与112K或112Q组合的11V。
尤其是，本发明的血清白蛋白结合物优选具有不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1至4的序列中的一种的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；并且尤其是不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个这样的与SEQID NO:3的序列的“氨基酸差异”(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)。
如提到的，在本发明中，其中位置89是T或其中位置11是V并且位置89是L(任选与110K或110Q突变和/或112K或112Q突变适合地组合，并且尤其是与110K或110Q突变组合)的氨基酸序列是特别优选的。甚至更优选的是其中位置11是V并且位置89是L、任选具有110K或110Q突变的氨基酸序列。
因此，在一个优选的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基是T；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q(并且优选为T)；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q(并且优选为S)。
在另一个优选的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基是V；并且
-在位置89的氨基酸残基是L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q。
在具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2是VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
并且更具体地：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2是VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3是FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
在一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与89L组合的11V；或
-与110K或110Q组合的11V；
-与112K或112Q组合的11V；
-与89L和110K或110Q组合的11V；或
-与89L和112K或112Q组合的11V；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的110K或110Q；或
-与89L组合的110K或110Q；或
-与11V和89L组合的110K或110Q；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-与11V组合的112K或112Q；或
-与89L组合的112K或112Q；或
-与11V和89L组合的112K或112Q；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的血清白蛋白结合物在所提及的位置(根据Kabat编号)包含以下氨基酸残基(即与SEQ ID NO:1至4的序列相比的突变)：
-89T；
并且具有CDR并且具有与如在本文中所描述的参照序列的总体序列同一性程度。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有选自SEQ ID NO:16至99的氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有选自SEQ ID NO:44至99的氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有作为以下序列中的一种的氨基酸序列：SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99。
在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明涉及免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有作为以下序列中的一种的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQID NO:64、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:92，并且优选SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:92。
本发明还涉及包含如在本文中所描述的本发明的血清白蛋白结合物(中的一种或多种)或基本上由其组成的蛋白质、多肽和其他构建体、分子或化学实体；涉及用于表达/制备本发明的改进的重链免疫球蛋白可变结构域和/或用于表达/制备包含其的蛋白质、多肽和其他构建体、分子或化学实体的方法；涉及含有本发明的改进的重链免疫球蛋白可变结构域和/或包含其的蛋白质、多肽和其他构建体、分子或化学实体的组合物和产品(如药物组合物和产品)；涉及编码本发明的改进的重链免疫球蛋白可变结构域和/或编码包含其的蛋白质或多肽的核苷酸序列和核酸；并且涉及本发明的改进的重链免疫球蛋白可变结构域和包含其的蛋白质、多肽和其他构建体、分子或化学实体的用途(并且尤其是治疗性、预防性和诊断性用途)。
根据在本文中的进一步描述，本发明的进一步的方面、实施方案、优点、应用和用途将会变得清楚。
在本说明书中：
-术语“免疫球蛋白单可变结构域”(也被称为“ISV”或“ISVD”)通常用于指可以在不与另一可变结构域相互作用的情况下(例如，在没有常规4链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需的VH/VL相互作用的情况下)形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。ISVD的实例对技术人员来说将会是清楚的并且例如包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼源化VH如骆驼源化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单一结构域)抗体(如dAbTM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单一结构域)抗体(如dAbTM)。除非在本文中另外明确提及，基于和/或衍生自重链可变结构域(如VH或VHH结构域)的ISVD通常是优选的。最优选地，除非在本文中另外明确指出，ISVD将会是纳米抗体。
-术语“纳米抗体”通常如在WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义，并且因此在具体方面中通常是指VHH、人源化VHH或骆驼源化VH(如骆驼源化人VH)，或通常是序列优化的VHH(如，例如，针对化学稳定性和/或溶解性、与已知人构架区的最大重叠和最大表达优化的)。要指出的是，术语纳米抗体(Nanobody或Nanobodies)是埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的注册商标并且因此也可以被称为和/或
-通常，除非在本文中另外指出，在本文中提及的ISVD、纳米抗体、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体将会预期用于预防或治疗人中(和/或任选地，还在温血动物、并且尤其是哺乳动物中)的疾病或病症。因此，通常，在本文中所述的ISVD、纳米抗体、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体优选使得它们可以用作、和/或可以适宜地作为(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物的一部分和/或药物产品或组合物的一部分。这样的药物、化合物或产品优选使得其适用于向人施用，例如以预防或治疗需要这样的预防或治疗的受试者，或例如作为临床试验的一部分。如在本文中进一步描述的，出于此目的，这样的药物或化合物可以含有除由本发明提供的ISVD外的其他部分、实体或结合单元(如还在本文中所述的，其可以例如是一种或多种其他另外的治疗性部分和/或影响基于ISVD或基于纳米抗体的生物制品的药代动力学或药效学性质如其半衰期的一种或多种其他部分)。这样的另外的治疗性或其他部分的适合的实例对技术人员来说将会是清楚的，并且例如通常可以包括任何治疗活性的蛋白质、多肽或其他结合结构域或结合单元，以及例如修饰，如在WO 2009/138159的第149至152页中描述的那些。基于ISVD的生物制品或基于纳米抗体的生物制品优选为治疗剂或预期用作治疗剂(其包括预防和诊断)，并且出于此目的优选含有针对治疗相关靶标(如，例如RANK-L、vWF、IgE、RSV、CXCR4、IL-23或其他白介素等)的至少一个ISVD。对于这样的基于ISVD或基于纳米抗体的生物制品的一些具体的、但非限制性的实例来说，参考实施例8至18，并且还例如参考埃博灵克斯股份有限公司的多个申请(如，例如，并且不限于WO2004/062551、WO 2006/122825、WO 2008/020079和WO 2009/068627)，以及例如(并且不限于)申请如WO 2006/038027、WO 2006/059108、WO 2007/063308、WO 2007/063311、WO 2007/066016和WO 2007/085814。此外，如在本文中进一步描述的，另外的部分可以是如在本文中针对(人)血清蛋白如(人)血清白蛋白所描述的ISVD或纳米抗体，并且这样的ISVD或纳米抗体也可以发现治疗用途，尤其是在延长在本文中所述的TNF结合物中和/或用于延长在本文中所述的TNF结合物的半衰期。例如，参考WO 2004/041865、WO 2006/122787和WO 2012/175400，其概括地描述了血清白蛋白结合纳米抗体用于半衰期延长的用途。此外，在本说明书中，除非在本文中另外明确提及，在本文中提及的所有术语具有在WO 2009/138519中(或在WO 2009/138519中引用的现有技术中)或在WO 2008/020079中(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)给出的含义。此外，在方法或技术未在本文中具体描述的情况下，其可以按照在WO 2009/138519中(或在WO 2009/138519中引用的现有技术中)或在WO 2008/020079中(或在WO 2008/020079中引用的现有技术中)描述的进行。此外，如在本文中所描述的，包含本发明的任何ISVD或化合物的任何药物产品或组合物还可以包含本身已知用于药物产品或组合物的一种或多种另外的组分(即取决于预期的药物形式)和/或例如用于治疗用途的一种或多种其他化合物或活性成分(即用于提供组合产品)。
此外，当在本说明书或权利要求中使用时，以下术语具有与WO 2009/138519的第62-75页中给出的相同的含义，和/或在适用时可以以在WO 2009/138519的第62-75页中描述的方式确定：“激动剂”、“拮抗剂”、“反向激动剂”、“非极性不带电氨基酸残基”、“极性不带电氨基酸残基”、“极性带电氨基酸残基”、“序列同一性”、“完全相同”和“氨基酸差异”(当提及两个氨基酸序列的序列比较时)、“(以)基本上分离的(形式)”、“结构域”、“结合结构域”、“抗原决定簇”、“表位”、“对(against)”或“针对(directed against)”(抗原)、“特异性”和“半衰期”。此外，术语“调节”和“用于调节”、“相互作用位点”、“对......特异性”、“交叉阻断(cross-block)”、“交叉阻断的(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”和“基本上独立于pH”是如在埃博灵克斯股份有限公司的WO 2010/130832的第74-79页中定义的(和/或可以按照在其中描述的确定)。此外，当提及本发明的构建体、化合物、蛋白质或多肽时，术语如“单价”、“二价”(或“多价”)、“双特异性”(或“多特异性”)、和“双互补位”(或“多互补位”)可以具有在WO 2009/138519、WO 2010/130832或WO 2008/020079中给出的含义。
如在这里使用的与在本文中提及的ISVD、纳米抗体、基于ISVD的生物制品、基于纳米抗体的生物制品或任何其他氨基酸序列、化合物或多肽相关的术语“半衰期”可以通常根据在WO 2008/020079的第57页段落o)中所描述的定义，并且如在其中提及的，是指氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间，例如归因于由天然机制引起的序列或化合物的降解和/或序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以任何本身已知的方式确定，如通过药代动力学分析。适合的技术对本领域技术人员来说将会是清楚的，并且可以例如通常是如在WO2008/020079的第57页段落o)中所描述的。如在WO 2008/020079的第57页段落o)中还提到的，半衰期可以使用参数如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。就此而言，应当指出，如在本文中所使用的术语“半衰期”具体是指t1/2-β或终末半衰期(其中可以不考虑t1/2-α和/或AUC或二者)。例如，参考以下实验部分，并且参考标准手册，如Kenneth,A等：ChemicalStability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(药物的化学稳定性：药剂师用手册)和Peters等人，Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(药代动力学分析：实用方法)(1996)。还参考“Pharmacokinetics(药代动力学)”,M Gibaldi&DPerron,由Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。类似地，术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如在WO 2008/020079的第57页段落o)中所定义，并且具体是指t1/2-β的增加，而t1/2-α和/或AUC或二者增加或不增加。
当术语未在本文中具体定义时，其具有其在本领域中的通常含义，这对技术人员来说将会是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等人，“Molecular Cloning:ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”(第2版)，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)；F.Ausubel等编，“Current protocolsin molecular biology(分子生物学中的当前方案)”，Green Publishing and WileyInterscience,纽约(1987)；Lewin，“Genes II(基因II)”，John Wiley&Sons，纽约，N.Y.,(1985)；Old等人，“Principles of Gene Manipulation:An Introduction to GeneticEngineering(基因操作原理：基因工程导言)”，第2版，加州大学出版社，伯克利，CA(1981)；Roitt等人，“Immunology(免疫学)”(第6版)，Mosby/Elsevier,爱丁堡(2001)；Roitt等人，Roitt’s Essential Immunology(Roitt基础免疫学)，第10版，Blackwell Publishing,UK(2001)；和Janeway等人，“Immunobiology(免疫学)”(第6版)，Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及在本文中引用的一般背景技术。
此外，如已经在本文中指出的，纳米抗体的氨基酸残基根据由Kabat等给出的用于VH的通用编号(“Sequence of proteins of immunological interest(免疫学目标蛋白序列)”,美国公众健康服务中心(US Public Health Services),NIH Bethesda,MD,公布号91)进行编号，如在Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000Jun 23；240(1-2):185-195的文章中应用于骆驼科动物的VHH结构域的；或在本文中提及的。根据这种编号，纳米抗体的FR1包含在位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包含在位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包含在位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包含在位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包含在位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且纳米抗体的FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。[就此而言，应当注意——如在本领域中关于VH结构域和关于VHH结构域公知的――在每一个CDR中的氨基酸残基的总数量可以不同，并且可以不与由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数量相对应(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat编号可以或可以不对应于在实际序列中的氨基酸残基的实际编号。然而，通常可以认为，根据Kabat的编号并且在不考虑在CDR中的氨基酸残基的数量的情况下，根据Kabat编号的位置1对应FR1的起点并且反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应FR2的起点并且反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应FR3的起点并且反之亦然，并且根据Kabat编号的位置103对应FR4的起点并且反之亦然。]。
用于对VH结构域的氨基酸残基进行编号的备选方法是由Chothia等(Nature 342,877-883(1989))描述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”，所述方法也可以以类似方式应用于来自骆驼科动物的VHH结构域和应用于纳米抗体。然而，在本说明书、各个方面和附图中，将会遵循Riechmann和Muyldermans应用于VHH结构域的根据Kabat的编号，除非另外指出。
还应当指出，附图、任何序列表和实验部分/实施例仅被提供用于进一步说明本发明并且不应被解释或理解为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非在本文中另外明确指出。
如在本文中进一步描述的，可以有利地使用本发明的血清白蛋白结合物作为部分、结合单元或融合配偶体，从而增加治疗性部分如多肽、蛋白质、化合物(包括、但不限于小分子)或其他治疗性实体的半衰期。
因此，在另一个方面中，本发明提供包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他部分或化学实体或基本上由其组成的多肽、蛋白质、构建体、化合物或其他化学实体。
尤其是，本发明提供包含直接地或通过一种或多种适合的接头或间隔体适宜地彼此连接的本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种(如一种或两种)治疗性部分(其可以是相同的或不同的，并且可以例如针对相同靶标或针对不同靶标，并且当它们针对相同靶标时可以针对所述靶标的相同的或不同的表位、部位、结构域或亚基)的多肽、蛋白质、构建体、化合物或其他化学实体。这样的多肽、蛋白质或构建体可以例如并且不限于是融合蛋白，如在本文中进一步描述。
本发明进一步涉及这样的多肽、蛋白质、构建体或化合物的治疗用途并且涉及包含这样的多肽、蛋白质、构建体或化合物的药物组合物。
在一个方面中，至少一种治疗性部分包含治疗性蛋白质、多肽、化合物、因子或其他实体或基本上由其组成。在优选的实施方案中，治疗性部分针对所需抗原或靶标，能够与所需抗原结合(并且尤其是能够与所需抗原特异性结合)，和/或能够与所需靶标相互作用。在另一个实施方案中，至少一种治疗性部分包含治疗性蛋白质或多肽或基本上由其组成。在另外的实施方案中，至少一种治疗性部分包含结合结构域或结合单元，如免疫球蛋白或免疫球蛋白序列(包括但不限于免疫球蛋白的片段)，如抗体或抗体片段(包括但不限于ScFv片段)，或基本上由其组成，或基本上由另一种适合的蛋白支架组成，如蛋白A结构域(如AffibodiesTM)、淀粉酶抑肽(tendamistat)、纤连蛋白、脂质运载蛋白、CTLA-4、T细胞受体、设计的锚蛋白重复序列、高亲和性多聚体(avimer)和PDZ结构域(Binz等，Nat.Biotech2005,Vol 23:1257)和基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等，Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32)。
在又一个方面中，至少一种治疗性部分包含抗体可变结构域，如重链可变结构域或轻链可变结构域，或基本上由其组成。
在优选的方面中，至少一种治疗性部分包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域，如结构域抗体、单一结构域抗体、“dAb”或纳米抗体(如VHH、人源化VHH或骆驼源化VH)或IgNAR结构域，或基本上由其组成。
在具体的实施方案中，至少一种治疗性部分包含至少一种单价纳米抗体或二价、多价、双特异性或多特异性纳米抗体构建体，或基本上由其组成。
包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种治疗性部分的多肽、(融合)蛋白、构建体或化合物通常可以如在以上引述的现有技术(如WO 04/041865和WO 06/122787)中描述的(制备和使用)，但是使用本发明的血清白蛋白结合物代替在所述现有技术中描述的增加半衰期的部分。
与一种或多种治疗性部分本身相比，包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种治疗性部分的多肽、(融合)蛋白、构建体或化合物将会通常并且优选具有增加的半衰期。
通常，在本文中所述的构建体或融合蛋白优选具有比相应治疗性部分本身的半衰期大至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多于20倍的半衰期(如在人或适合的动物如小鼠或食蟹猴中)。
此外，优选地，与相应治疗性部分本身的半衰期相比，任何这样的融合蛋白或构建体具有增加多于1小时、优选多于2小时、更优选多于6小时如多于12小时的在人中的半衰期。
此外，优选地，任何融合蛋白或构建体在人中的半衰期(定义为t1/2β)为大于1小时、优选大于2小时、更优选大于6小时，如大于12小时，并且例如约一天、两天、一周、两周和多至血清白蛋白在人中的半衰期(估算为大约19天)，尽管后者可能是较不重要的。
半衰期通常可以被定义为在体内多肽的血清浓度降低50％所花费的时间，例如归因于由天然机制引起的配体的降解和/或配体的清除或螯合。尤其是，半衰期可以是如在WO2009/068627中所定义的。
用于药代动力学分析和确定半衰期的方法对本领域技术人员来说是熟知的。详情可以发现于Kenneth,A等：Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook forPharmacists(药物的化学稳定性：药剂师用手册)和Peters等人，Pharmacokineticanalysis:A Practical Approach(药代动力学分析：实用方法)(1996)。还参考“Pharmacokinetics(药代动力学)”,M Gibaldi&D Perron,由Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。
如提到的，在一个方面中，本发明的血清白蛋白结合物可以用于增加(一种或多种)免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体、单一结构域抗体、“dAb”、VHH或纳米抗体(如VHH、人源化VHH或骆驼源化VH如骆驼源化人VH)的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及包含直接地或任选通过一种或多种适合接头或间隔体适宜地彼此连接的本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种(如一种或两种)免疫球蛋白单可变结构域序列的多肽、构建体或融合蛋白。如在本文中提及的，在这样的多肽、构建体或融合蛋白中存在的每种这样的免疫球蛋白单可变结构域可以独立地是结构域抗体、单一结构域抗体、“dAb”或纳米抗体(如VHH、人源化VHH或骆驼源化VH，如骆驼源化人VH)；并且根据一种具体地、但非限制性的方面，这些免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种(并且多至全部)包含两个或三个二硫键。
如提到的，当多肽、融合蛋白的构建体在其C端末端具有重链ISVD(所述IVSD可以是本发明的血清白蛋白结合物或针对治疗靶标的ISVD，如针对治疗靶标的纳米抗体)时，则多肽、融合蛋白的构建体(的C端末端处存在的ISVD)优选在其C端末端具有C端延伸。同样地，所述C端延伸将会具有式(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选的方面，其不包含任何半胱氨酸残基)、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基。
如提到的，当多肽、融合蛋白的构建体在其N端末端具有重链ISVD(所述IVSD可以是本发明的血清白蛋白结合物或针对治疗靶标的ISVD，如针对治疗靶标的纳米抗体)时，则多肽、融合蛋白的构建体(的C端末端处存在的ISVD)优选具有在位置1的D或E1D突变。
因此，在另一个方面中，本发明涉及蛋白质、多肽或其他化合物，所述蛋白质、多肽或其他化合物：
-包含至少一种(并且优选仅一种)本发明的血清白蛋白结合物和至少一种(如一种、两种或三种)治疗性部分或实体(其中所述血清白蛋白结合物和一种或多种治疗性部分或实体任选通过一种或多种适合接头适宜地连接)；
-在其C端末端具有重链ISVD，其中在C端末端的ISVD具有C端延伸(X)n(如在本文中进一步描述的)；
-所述蛋白质、多肽或其他化合物还可以在其N端末端具有重链ISVD，在这种情况中，所述N端ISVD末端优选具有在位置1的D或E1D。
此外，在优选的方面中，当除本发明的血清白蛋白结合物外还存在一种或多种其他ISVD时(即当所存在的治疗性部分中的一种或多种是ISVD时)，则所述“治疗性”ISVD(中的一种或多种或全部)优选还具有降低事先存在的抗体的结合的氨基酸残基/突变(的组合)。当ISVD是重链ISVD时，则这些突变可以是如在PCT/EP2015/060643中描述的，尤其是可以与在本文中针对本发明的血清白蛋白结合物所描述的基本上相同种类的突变(或突变的组合)的在位置11、89、110和112的一种或多种突变(的适合组合)。优选地，如果在C端末端存在这样的其他ISVD，则至少所述治疗性ISVD包含这样的在位置11、89、110和/或112的突变(即除了如在本文中所描述的C端延伸以外)。
根据一个具体的方面，在构建体、融合蛋白或多肽中存在的所有治疗性部分是ISVD(即针对治疗靶标的ISVD)，并且尤其是重链ISVD，并且更尤其是纳米抗体(即针对治疗靶标的纳米抗体)。
例如并且没有限制地，包含本发明的血清白蛋白结合物的构建体、融合蛋白或多肽可以包含：
-本发明的血清白蛋白结合物和针对治疗靶标的一种ISVD(并且优选纳米抗体)的一个拷贝；或
-本发明的血清白蛋白结合物和针对治疗靶标的两种ISVD(并且优选两种纳米抗体)的一个拷贝(所述ISVD可以是相同的或不同的，并且当不同时可以针对相同靶标、针对相同靶标上的不同表位或针对不同治疗性靶标)；或
-本发明的血清白蛋白结合物和针对治疗靶标的三种ISVD(并且优选三种纳米抗体)的一个拷贝(所述ISVD可以是相同的或不同的，并且当不同时可以针对相同靶标、针对相同靶标上的不同表位或针对不同治疗性靶标)。
本发明的构建体、融合蛋白或多肽的一些非限制性实例可以如下示意性地表示，其中“[Alb]”表示本发明的血清白蛋白结合物，“[治疗性部分1]”和“[治疗性部分2]”表示治疗性部分(如提及的，其可以各自独立地是免疫球蛋白单可变结构域)，“-”表示适合的接头(其是任选的；适合的实例是9GS和35GS接头)，并且N端在左手侧并且C端在右手侧：
[Alb]-[治疗性部分1]
[治疗性部分1]-[Alb]-X(n)
[Alb]-[治疗性部分1]-[治疗性部分1]
[治疗性部分1]-[治疗性部分1]-[Alb]-X(n)
[治疗性部分1]-[Alb]-[治疗性部分1]
[Alb]-[治疗性部分1]-[治疗性部分2]
[治疗性部分1]-[治疗性部分2]-[Alb]-X(n)
[治疗性部分1]-[Alb]-[治疗性部分2]
当治疗性部分是针对治疗靶标的ISVD(并且优选纳米抗体)时，本发明的优选的、但非限制性的构建体、融合蛋白或多肽可以如下示意性地表示，其中“[Alb]”表示本发明的血清白蛋白结合物，“[治疗性ISVD 1]”和“[治疗性ISVD 2]”表示针对治疗靶标的ISVD(所述ISVD可以是相同的或不同的，并且当不同时可以针对相同靶标、针对相同靶标上的不同表位或针对不同治疗性靶标)，“-”表示适合的接头(其是任选的)，X(n)表示如在本文中所描述的C端延伸，并且N端在左手侧并且C端在右手侧：
[Alb]-[治疗性ISVD 1]-X(n)
[治疗性ISVD 1]-[Alb]-X(n)
[Alb]-[治疗性ISVD 1]-[治疗性ISVD 1]-X(n)
[治疗性ISVD 1]-[治疗性ISVD 1]-[Alb]-X(n)
[治疗性ISVD 1]-[Alb]-[治疗性ISVD 1]-X(n)
[Alb]-[治疗性ISVD 1]-[治疗性ISVD 2]-X(n)
[治疗性ISVD 1]-[治疗性ISVD 2]-[Alb]-X(n)
[治疗性ISVD 1]-[Alb]-[治疗性ISVD 2]-X(n)
因此，在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和至少一种其他纳米抗体(如可以相同或不同的一种或两种其他纳米抗体)多特异性(并且尤其是双特异性)纳米抗体构建体，其中所述至少一种其他纳米抗体优选针对所需靶标(其优选为治疗靶标)和/或另一种纳米抗体可用于或适用于治疗性、预防性和/或诊断性目的。同样地，本发明的血清白蛋白结合物和其他纳米抗体可以直接地或任选通过一种或多种适合接头或间隔体适宜地彼此连接。
对于含有一种或多种纳米抗体的多价和多特异性多肽以及它们的制备的概括描述来说，还参考Conrath等，J.Biol.Chem.,Vol.276,10.7346-7350,2001；Muyldermans，Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74(2001),277-302；以及参考例如WO 96/34103、WO 99/23221、WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO2008/142164或WO 2009/068627。
本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以在本文中提及的埃博灵克斯股份有限公司的申请中找到。尤其是，对于包含至少一种针对血清蛋白的纳米抗体的用于增加半衰期的多价和多特异性构建体、编码其的核酸、包含其的组合物、前述各项的制备、和前述各项的用途的概括描述来说，参考上述国际申请WO 04/041865和WO06/122787(在本文中所述的本发明的血清白蛋白结合物可以通常与在其中描述的延长半衰期的纳米抗体如Alb-8类似地使用)，以及参考在例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627中给出的这样的构建体的概括描述和具体实例。
在一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD(例如，包含或衍生自VH结构域的纳米抗体或(单一)结构域抗体)的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基优选适宜地选自T、V或L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q；
以使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L并且位置11是V；或(iii)位置89是L并且位置110是K或Q；或(iv)位置89是L并且位置112是K或Q；或(v)位置89是L并且位置11是V并且位置110是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置11是V并且位置112是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置110是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置112是K或Q。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-89T；或
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L；或
-与110K或110Q组合的11V；或
-与112K或112Q组合的11V。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基是T；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q(并且优选为T)；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q(并且优选为S)。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-在位置11的氨基酸残基是V；并且
-在位置89的氨基酸残基是L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-与89L组合的11V；或
-与110K或110Q组合的11V；
-与112K或112Q组合的11V；
-与89L和110K或110Q组合的11V；或
-与89L和112K或112Q组合的11V。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-与11V组合的110K或110Q；或
-与89L组合的110K或110Q；或
-与11V和89L组合的110K或110Q。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有以下氨基酸残基：
-与11V组合的112K或112Q；或
-与89L组合的112K或112Q；或
-与11V和89L组合的112K或112Q。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有在位置89的T。
在另一个方面中，本发明涉及包含本发明的血清白蛋白结合物和一种或多种另外的重链ISVD的蛋白质、多肽或其他化合物或构建体(并且优选融合蛋白)，其中所述血清白蛋白结合物和所述一种或多种另外的重链ISVD均含有在位置11的V和在位置89的L。
同样地，所有这些多肽优选均含有C端延伸X(n)(如在本文中所描述的)和在位置1的D，并且如在本文中进一步描述的，可以含有血清白蛋白结合ISVD。它们还具有如在本文中进一步描述的半衰期。
本发明还涉及编码本发明的白蛋白结合物、化合物或多肽的核苷酸序列或核酸。本发明还包括包含前述核苷酸序列或核酸和本身已知的用于遗传构建体的一种或多种元件的遗传构建体。遗传构建体可以是质粒或载体的形式。同样地，这样的构建体可以通常是如在埃博灵克斯股份有限公司的公布的专利申请中所描述的，如，例如WO 04/041862、WO2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
本发明还涉及含有这样的核苷酸序列或核酸和/或表达(或能够表达)本发明的白蛋白结合物、化合物或多肽的宿主或宿主细胞。同样地，这样的宿主细胞可以通常是如在埃博灵克斯股份有限公司的公布的专利申请中所描述的，如，例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
本发明还涉及用于制备本发明的白蛋白结合物、化合物或多肽的方法，所述方法包括在使得所述宿主细胞产生或表达本发明的白蛋白结合物、化合物或多肽的条件下培养或维持如在本文中所描述的宿主细胞，并且任选还包括将如此产生的本发明的白蛋白结合物、化合物或多肽分离。同样地，这样的方法可以通常根据在埃博灵克斯股份有限公司的公布的专利申请中所描述的进行，如，例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
本发明还涉及包含至少一种本发明的化合物或多肽以及任选至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。这样的制剂、载体、赋形剂和稀释剂可以通常是如在埃博灵克斯股份有限公司的公布的专利申请中所描述的，如，例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
然而，因为本发明的化合物或多肽具有增加的半衰期，它们优选施用于循环。因此，它们可以以允许本发明的化合物或多肽进入循环的任何适合的方式施用，如静脉内、通过注射或输注，或者以任何其他适合的方式施用(包括口服施用、皮下施用、肌内施用、通过皮肤施用、鼻内施用、通过肺施用等)。同样地，例如，还根据埃博灵克斯股份有限公司的公布的专利申请的教导，如，例如WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627，适合的方法和施用途径对技术人员来说将会是清楚的。
因此，在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗可以通过使用本发明的化合物或多肽预防或治疗的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的本发明的化合物或多肽和/或包含其的药物组合物。可以通过使用如在本文中所描述的本发明的化合物或多肽预防或治疗的疾病和病症将会通常与可以通过使用在本发明的化合物或多肽中存在的一种或多种治疗性部分预防或治疗的疾病和病症相同。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且还通常包括预防疾病的发作，延缓或逆转疾病的进展，预防或延缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减轻和/或缓解与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减轻或逆转由疾病导致的任何生理损害，和通常对被治疗的患者有益的任何药理学作用。
要治疗的受试者可以是任何温血动物，但是尤其是哺乳动物，并且更尤其是人。如对技术人员来说将会是清楚的，要治疗的受试者将会尤其是患有在本文中提及的疾病和病症或处于其风险下的人员。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫治疗、并且尤其是用于被动免疫治疗的方法，所述方法包括患有在本文中提及的疾病和病症或处于其风险下的受试者施用药物活性量的本发明的化合物或多肽和/或包含其的药物组合物。
本发明的化合物或多肽和/或包含其的组合物根据适用于预防和/或治疗要预防或治疗的疾病或病症的治疗方案施用。临床医师将会通常能够根据各种因素确定适合的治疗方案，如要预防或治疗的疾病或病症、要治疗的疾病的严重程度和/或其症状的严重程度、要使用的本发明的具体的多肽、要使用的具体施用途径和药物制剂或组合物、年龄、性别、体重、饮食、患者的一般情况、和临床医师众所周知的类似因素。
通常，治疗方案将会包括施用一种或多种药学上有效的量或剂量的一种或多种本发明的化合物或多肽或包含其的一种或多种组合物。要施用的具体的量或剂量可以由临床医师再次基于以上引述的因素确定。
通常，为了预防和/或治疗在本文中提及的疾病和病症并且根据要治疗的具体疾病或病症、要使用的本发明的化合物或多肽的效力和/或半衰期、所使用的具体施用途径和具体药物制剂或组合物，本发明的化合物或多肽将会通常以在1克至0.01微克/kg体重/天之间、优选在0.1克至0.1微克/kg体重/天之间、如约1、10、100或1000微克/kg体重/天的量在一天中连续地(例如，通过输注)、作为单次每日剂量或作为多个分剂量施用。临床医师将会通常能够根据在本文中提及的因素确定适合的每日剂量。还将会清楚的是，在具体的情况中，临床医师可以例如基于以上引述的因素和他的专业判断进行选择以不同于这些量。通常，对要施用的量的一些指导可以根据通过基本上相同的途径对针对所施用的相同靶标的相当的常规抗体或抗体片段通常施用的量得到，但是要考虑在亲和力/抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期和技术人员众所周知的类似因素方面的差异。
此外，因为本发明的化合物含有本发明的延长半衰期的血清白蛋白结合物，它们不需要基本上连续地(例如，通过输注)施用，但是它们可以以适合的间隔(由技术人员确定)施用。例如，它们可以例如通过注射或输注每两天施用(以适合的剂量)一次，每四天施用一次，每周施用一次，每两周施用一次，并且在一些情况下，每四周施用一次，甚至频率更低。
本发明的一个方面涉及包含至少一种本发明的化合物或多肽的药物组合物，其中所述组合物预期用于以在每周一次至每4周一次之间、并且尤其是在每7天一次至每21天一次之间、如每7天或14天一次的间隔施用。
通常，在以上方法中，将会使用本发明的单一多肽。然而，组合使用两种以上本发明的多肽也在本发明的范围内。
本发明的多肽也可以与一种或多种另外的药物活性化合物或成分组合使用，即作为组合治疗方案，其可以引起或可以不引起协同效应。同样地，临床医师将能够基于以上引述的因素和他的专业判断选择这样的另外的化合物或成分，以及适合的组合治疗方案。
尤其是，本发明的多肽可以与用于或可以用于预防和/或治疗可以用本发明的融合蛋白或构建体预防或治疗的疾病和病症的其他药物活性化合物或成分组合使用，并且作为其结果，可以获得或可以不获得协同效应。
如临床医师将会清楚的，可以以对于所涉及的疾病或病症来说本身已知的任何方式确定和/或跟踪根据本发明使用的治疗方案的有效性。临床医师将还能够在适当时和或在个案基础上改变或改进具体的治疗方案，从而实现所需治疗效果，以避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在一方面实现所需治疗效果和在另一方面避免、限制或减轻不希望的副作用之间实现适当的平衡。
通常，将会跟踪治疗方案，直到实现所需治疗效果和/或只要维持所需治疗效果即可。同样地，这可以由临床医师确定。
要治疗的受试者可以是任何温血动物，尤其是哺乳动物，并且更尤其是人。如对技术人员来说将会是清楚的，要治疗的受试者将会尤其是患有在本文中提及的疾病和病症或处于其风险下的人员。
本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将根据在本文中的进一步描述变得清楚。
现在将借助以下非限制性的优选方面、实施例和附图来进一步描述本发明，其中：
-图1是列出将会在本文中具体提及的一些氨基酸位置和它们根据一些备选编号系统(如Aho和IMGT)的编号的表格；
-图2示出了在本文中提及的参照序列的比对。
-图3列出了在本文中提及的氨基酸序列；
-图4示出了当测试来自人健康受试者的96个血清样品的与根据本发明的参照A和参照A的两个代表性变体(即分别为[参照A+L11V+V89L+C端丙氨酸]和[参照A+L11V+V89L+T110K+C端丙氨酸])的结合时在实施例1中得到的数据点的两个相应图表。每个点表示所测试的96个样品中的一个的结合水平。在右图和左图中示出的数据点相同；在右图中，用每个单独样品对三种测试的化合物(即参照A；参照A+L11V+V89L+114A；和参照A+L11V+V89L+T110K+114A)中的每一种测量的数据点借助线连接(作为结果，线的倾斜提供了当引入本发明的突变和C端丙氨酸时事先存在的抗体的结合降低的程度的指示)；
-图5是列出在图4中编制的数据点的结合数据(分别地，3栏提供了归一化的PreAb结合水平(在700时的RU)并且3栏提供了与所使用的参照化合物相比PreAb结合的降低百分比)的表格；
-图6示出了当测试来自人健康受试者的96个血清样品的与根据本发明的参照B和参照B的两个代表性变体(即分别为[参照B+L11V+V89L+C端丙氨酸]和[参照B+L11V+V89L+T110K+C端丙氨酸])的结合时在实施例2中得到的数据点的两个相应图表。每个点表示所测试的96个样品中的一个的结合水平。在右图和左图中示出的数据点相同；在右图中，用每个单独样品对三种测试的化合物(即参照B；参照B+L11V+V89L+114A；和参照B+L11V+V89L+T110K+114A)中的每一种测量的数据点借助线连接(作为结果，线的倾斜提供了当引入本发明的突变和C端丙氨酸时事先存在的抗体的结合降低的程度的指示)；
-图7是列出在图6中编制的数据点的结合数据(分别地，3栏提供了归一化的PreAb结合水平(在700时的RU)并且2栏提供了与所使用的参照化合物相比PreAb结合的降低百分比)的表格；
-图8示出了当测试96个血清样品(66个来自人健康受试者并且30个来自推测含有可以在C端丙氨酸存在下结合的事先存在的抗体的受试者，包括13个来自SLE患者的样品)的与根据本发明的参照C、参照D和参照D的两个代表性变体(即分别为[参照D+L11V+V89L]和[参照D+L11V+V89L+T110K])的结合时在实施例3中得到的数据点的两个相应图表。每个点表示所测试的96个样品中的一个的结合水平。在右图和左图中示出的数据点相同；在右图中，用每个单独样品对四种测试的化合物(即参照C；参照D；参照D+L11V+V89L；和参照D+L11V+V89L+T110K)中的每一种测量的数据点借助线连接(作为结果，线的倾斜提供了当引入本发明的突变和C端丙氨酸时事先存在的抗体的结合降低的程度的指示)；
-图9示出了针对在实施例3测试的SLE样品中的四个得到的数据点的图表。对于单独样品(即分别是“SLE 25”、“SLE 37”、“SLE39”和“SLE41”)测量的数据点借助线连接(作为结果，每条线的倾斜提供了当引入本发明的突变时在每个样品中事先存在的抗体的结合降低的程度的指示)；
-图10是列出在图8中编制的数据点的结合数据(分别地，4栏提供了归一化的PreAb结合水平(在700时的RU)并且3栏提供了与所使用的参照化合物相比PreAb结合的降低百分比)的表格。
实验部分
在以下实验部分中使用的人样品获得自商业来源或获得自人志愿者(在得到所有需要的许可或批准之后)并且根据适用的法律和法规要求(包括但不限于关于医疗秘密和患者隐私的那些)使用。
在以下实施例中，除非另外明确指出，如下使用ProteOn确定在所使用的样品(即，来自健康志愿者，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和SLE患者)中存在的事先存在的抗体与所测试的纳米抗体的结合：
使用单克隆抗FLAG M2将纳米抗体捕获在血清白蛋白上或通过FLAG3标签捕获。
在事先存在的抗体结合在捕获在人血清白蛋白(HSA)上的纳米抗体上的情况中，使用ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行评价。使用PBS/Tween(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4、0.005％Tween20)作为运行缓冲液并且在25℃下进行实验。将ProteOn GLC传感器芯片的配体道用EDC/NHS(流速30μl/min)活化并且在ProteOn醋酸盐缓冲液pH 4.5(流速100μl/min)中以10μg/ml注射HSA以提供大约3200RU的固定水平。在固定之后，将表面用乙醇胺HCl(流速30μl/min)失活。在2分钟内以45μl/min将纳米抗体注射在HSA表面上以提供大约200RU的纳米抗体捕获水平。将含有事先存在的抗体的样品以14,000rpm离心2分钟并且将上清液在PBS-Tween20(0.005％)中1:10稀释，之后在2分钟内以45μl/min注射，接着进行随后的400秒解离步骤。在每次循环之后(即新的纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，将HSA表面以45μl/min用2分钟HCl(100mM)注射进行再生。用ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行传感图处理和数据分析。在通过减去1)纳米抗体-HSA解离和2)与参照配体道的非特异性结合进行双重参比(double referencing)之后，得到显示出事先存在的抗体的结合的传感图。通过在125秒(结合结束之后5秒)设定报告点来确定事先存在的抗体的结合水平。相对于参照纳米抗体在125秒时的结合水平计算事先存在的抗体的结合的百分比降低。
在事先存在的抗体在捕获在单克隆抗FLAG M2(Sigma)上的FLAG标记的纳米抗体上结合的情况中，使用ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行评价。使用PBS/Tween(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4、0.005％Tween20)作为运行缓冲液并且在25℃下进行实验。将ProteOn GLC传感器芯片的配体道用EDC/NHS(流速30μl/min)活化并且在ProteOn醋酸盐缓冲液pH4.5(流速100μl/min)中以10μg/ml注射抗FLAG M2mAb以提供大约4000RU的固定水平。在固定之后，将表面用乙醇胺HCl(流速30μl/min)失活。在2分钟内以45μl/min将纳米抗体注射在抗FLAG M2表面上以提供大约100RU的纳米抗体捕获水平。为了降低血液样品与抗FLAG M2表面的非特异性结合，将100nM 3xFLAG肽(Sigma)加入至血液样品中。将含有事先存在的抗体的样品以14,000rpm离心2分钟并且将上清液在PBS-Tween20(0.005％)中1:10稀释，之后在2分钟内以45μl/min注射，接着进行随后的600秒解离步骤。在每次循环之后(即新的纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，将抗FLAG M2表面以150μl/min用10秒甘氨酸pH 1.5(10mM)注射进行再生。用ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行传感图处理和数据分析。在通过减去1)纳米抗体-抗FLAG M2解离和2)与参照配体道的非特异性结合进行双重参比(double referencing)之后，得到显示出事先存在的抗体的结合的传感图。通过在125秒(结合结束之后5秒)设定报告点来确定事先存在的抗体的结合水平。相对于参照纳米抗体在125秒时的结合水平计算事先存在的抗体的结合的百分比降低。
实施例1：在参照A(SEQ ID NO:1)中引入本发明的突变引起事先存在的抗体的结 合的降低。
针对来自健康人志愿者的96个血清样品的样品中存在的事先存在的抗体的结合，测试参照A(SEQ ID NO:1)和携带根据本发明的突变的参照A的改进的变体的两个代表性的实例(SEQ ID NO:37和38，二者均具有丙氨酸延伸并且在具有N端HIS6-FLAG3标签(参见SEQID NO:100)的情况下进行测试)。使用FLAG标签捕获化合物并且使用ProteOn根据在该实验部分的前言中给出的方案对结合进行测量。
结果在图4中示出。图5列出了构成图4中数据点中的一个的每个样品的结果。
可以看出，对于所测试的96个样品中的大多数来说，引入根据本发明的突变引起事先存在的抗体的结合的降低，并且降低的程度通常取决于在每个样品中的事先存在的抗体能够与参照A结合的水平。
实施例2：在参照B(SEQ ID NO:2)中引入本发明的突变引起事先存在的抗体的结 合的降低。
针对来自健康人志愿者的96个血清样品的样品中存在的事先存在的抗体的结合，测试参照B(SEQ ID NO:2)和携带根据本发明的突变的参照B的改进的变体的两个代表性的实例(SEQ ID NO:65和66，二者均具有丙氨酸延伸并且在具有N端HIS6-FLAG3标签(参见SEQID NO:100)的情况下进行测试)。使用FLAG标签捕获化合物并且使用ProteOn根据在该实验部分的前言中给出的方案对结合进行测量。
结果在图6中示出。图7列出了构成图6中数据点中的一个的每个样品的结果。
与实施例1类似，可以看出，对于所测试的96个样品中的大多数来说，引入根据本发明的突变引起事先存在的抗体的结合的降低，并且降低的程度通常取决于在每个样品中的事先存在的抗体能够与参照B结合的水平。
实施例3：在参照C(SEQ ID NO:3)和参照D(SEQ ID NO:4)中引入本发明的突变引 起事先存在的抗体的结合的降低。
针对来自健康人志愿者的66个血清样品和推测含有即使当存在C端丙氨酸时也能够结合的事先存在的抗体的30个样品(其中13个来自SLE患者)的样品中存在的事先存在的抗体的结合，测试参照C(SEQ ID NO:3)、参照D(SEQ ID NO:4)和携带根据本发明的突变的参照C和参照D的改进的变体的两个代表性的实例(SEQ ID NO:93和94，二者均具有如在参照D中存在的丙氨酸延伸并且在具有N端HIS6-FLAG3标签(参见SEQ ID NO:100)的情况下进行测试)。将化合物捕获在人血清白蛋白上并且使用ProteOn根据在该实验部分的前言中给出的方案对结合进行测量。
结果在图8中示出。在图9中，给出了4个代表性SLE样品的详情。图10列出了构成图8中数据点中的一个的每个样品的结果。
与实施例1和2类似，可以看出，对于所测试的96个样品中的大多数来说，引入根据本发明的突变对于样品的绝大多数来说引起事先存在的抗体的结合的降低，并且降低的程度通常取决于在每个样品中的事先存在的抗体能够与参照C或参照D结合的水平。
在整个本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权的专利、公布的专利申请、和共同待审的专利申请)的全部内容通过引用明确地结合，尤其是对于在上文引用的教导。

Claims (13)

1.免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1选自以下序列：GFTFSTGEMA(SEQ ID NO:8)和GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)，并且所述CDR1优选为GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2选自以下序列：SISSSGATTY(SEQ ID NO:9)和VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)，并且所述CDR2优选为VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：PRHPQGGVTFDY(SEQ ID NO:7)、FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)和FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3优选为FPSTHGKFDY(SEQ IDNO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且所述CDR3最优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)；
并且具有：
-至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列同一性程度(其中对于确定序列同一性程度来说不考虑可能存在的任何C端延伸以及所述CDR)；
和/或
-不多于7、如不多于5、优选不多于3、如仅3、2或1个与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如在本文中定义的，并且不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何以上列出的突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)(其中如果存在的话，所述氨基酸差异可以存在于框架和/或CDR中，但是优选仅存在于框架中而不存在于CDR中)；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的C端末端时)：
-C端延伸(X)n，其中n是1至10，优选1至5，如1、2、3、4或5(并且优选1或2，如1)；并且每个X是独立选择、并且优选独立选自由丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)组成的组的(优选天然存在的)氨基酸残基；
并且任选具有(尤其是，当所述ISVD存在于和/或形成本发明的化合物或多肽的N端末端时)在位置1的D和/或E1D突变；
其中：
-在位置11的氨基酸残基优选地选自L或V；并且
-在位置89的氨基酸残基优选适宜地选自T、V或L；并且
-在位置110的氨基酸残基优选适宜地选自T、K或Q；并且
-在位置112的氨基酸残基优选适宜地选自S、K或Q；
以使得(i)位置89是T；或(ii)位置89是L并且位置11是V；或(iii)位置89是L并且位置110是K或Q；或(iv)位置89是L并且位置112是K或Q；或(v)位置89是L并且位置11是V并且位置110是K或Q；或(vi)位置89是L并且位置11是V并且位置112是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置110是K或Q；或(vii)位置11是V并且位置112是K或Q。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2是VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3选自以下序列：FPSTHGKFDY(SEQ ID NO:12)或FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)，并且优选为FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
3.根据权利要求2所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-CDR1(根据Abm)，所述CDR1是GFTFDTSSML(SEQ ID NO:13)；和
-CDR2(根据Abm)，所述CDR2是VIHQSGTPTY(SEQ ID NO:14)；和
-CDR3(根据Abm)，所述CDR3是FPSSRMKFDY(SEQ ID NO:15)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有：
-不多于5个与SEQ ID NO:3的序列的氨基酸差异(不考虑可能存在的在位置11、89、110或112的任何突变并且不考虑可能存在的任何C端延伸)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含以下氨基酸残基：
-与89L组合的11V；或
-与110K或110Q组合的11V；
-与112K或112Q组合的11V；
-与89L和110K或110Q组合的11V；或
-与89L和112K或112Q组合的11V。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含以下氨基酸残基：
-与11V组合的89L；或
-与110K或110Q组合的89L；或
-与112K或112Q组合的89L；或
-与11V和110K或110Q组合的89L；或
-与11V和112K或112Q组合的89L。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含以下氨基酸残基：
-与11V组合的110K或110Q；或
-与89L组合的110K或110Q；或
-与11V和89L组合的110K或110Q。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含以下氨基酸残基：
-与11V组合的112K或112Q；或
-与89L组合的112K或112Q；或
-与11V和89L组合的112K或112Q。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域包含以下氨基酸残基：
-89T。
10.免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有选自SEQ ID NO:16至99的氨基酸序列的氨基酸序列。
11.免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有选自SEQ ID NO:44至99的氨基酸序列的氨基酸序列。
12.免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有以下序列之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99。
13.免疫球蛋白单可变结构域，所述免疫球蛋白单可变结构域具有以下序列之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:92，并且优选SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:92。
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