ES2453316T5

ES2453316T5 - Procedimientos mejorados para preparar escualeno

Info

Publication number: ES2453316T5
Application number: ES11738802.5T
Authority: ES
Inventors: Maninder Hora
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2031-05-12
Also published as: SG185419A1; US11077186B2; ZA201208381B; US9199897B2; KR101875894B1; BR112012028711B1; ES2597158T3; SG10201503689TA; TR201905021T4; PL2620423T3; PL3489211T3; EP2569267B1; WO2011141819A1; ES2453316T3; US20160051670A1; ES2717266T3; US20180169225A1; KR20130103668A; EA027142B1; US9545440B2

Description

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Procedimientos mejorados para preparar escualeno

DESCRIPCION

CAMPO TECNICO

La presente invencion esta en el campo de la fabricacion de adyuvantes de emulsiones de aceite en agua que comprenden escualeno que tiene una pureza adecuada para aplicaciones farmaceuticas.

TECNICA ANTERIOR

El aceite de hngado de tiburon contiene un terpenoide insaturado ramificado llamado escualeno, (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CHa)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9). El escualeno es conocido para su uso en emulsiones de aceite en agua en vacunas humanas, por ejemplo, la emulsion MF59 que se usa para adyuvantar vacunas contra la gripe. El escualeno tambien se usa en otros productos farmaceuticos (por ejemplo, pomadas, supositorios) y en cosmeticos.

Las actuales fuentes para el escualeno son principalmente aceites de pescado, y en particular aceites de hngado de tiburon. Puede haber problemas asociados al uso de escualeno extrafdo de aceite de tngado de tiburon, particularmente si no se mantienen rigurosos patrones de fabricacion (tales como aquellos usados durante la produccion de MF59 por Novartis). Por ejemplo, los tiburones pueden infectarse por patogenos que tambien son infecciosos para los seres humanos o que producen sustancias que son perjudiciales para los seres humanos, y pueden existir TSE o agentes de tiburon similares a TSE [por ejemplo, referencias 1-3]. Ademas, los tiburones pueden contener toxinas humanas, tales como carchatoxina. Ademas, los tiburones pueden contener protemas a las que los seres humanos pueden ser alergicos. Una protema de pescado a la que los seres humanos son alergicos es parvalbumina que se encuentra en los tiburones. Asf, las fuentes de baja calidad baratas de escualeno no son adecuadas para uso farmaceutico humano. El riesgo de dano a un receptor humano puede ser elevado en situaciones en las que el escualeno sea parte de un adyuvante inmunologico debido a que, por definicion, el adyuvante puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria no deseada contra la impureza.

Sena util encontrar procedimientos adicionales y mejorados para preparar escualeno que fuera adecuado para uso farmaceutico, es decir, un producto que cumpliera normas reguladoras y no contuviera contaminantes, patogenos, virus, toxinas humanas o protemas que pudieran ser perjudiciales para los seres humanos. El procedimiento de la presente invencion es particularmente util para la purificacion de escualeno derivado de aceite de hngado de tiburon.

DIVULGACION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona un procedimiento para la fabricacion de un adyuvante de emulsion de aceite en agua que comprende (i) preparar escualeno a partir de una composicion que comprende escualeno de una fuente animal, mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) una destilacion de purificacion llevada a cabo a una temperatura T1; (b) una destilacion desnaturalizante llevada a cabo a una temperatura T2; en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden; Ti y T2 son suficientes para hacer que hierva el escualeno; T2 > Ti; y T2 ^ 200 °C (ii) preparar una emulsion usando el escualeno preparado en la etapa (i). La fuente animal es normalmente una fuente de pescado, tal como aceite de hngado de tiburon (o un extracto del mismo), es decir, la invencion proporciona un procedimiento para preparar escualeno de aceite de hngado de tiburon o de un extracto de aceite de hngado de tiburon.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la fabricacion de un adyuvante de emulsion de aceite en agua que comprende (i) preparar escualeno a partir de una composicion que contiene escualeno mediante un procedimiento que comprende las etapas de (a) una destilacion de purificacion llevada a cabo a una temperatura Ti; (b) una destilacion desnaturalizante llevada a cabo a una temperatura T2; en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden; Ti y T2 son suficientes para hacer que hierva el escualeno; Ti < 140 °C y T2 ^ 200 °C (ii) preparar una emulsion usando el escualeno preparado en la etapa (i). La composicion que contiene escualeno puede ser utilmente aceite de hngado de tiburon o un extracto del mismo.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la re-destilacion de una composicion que comprende al menos el 99 % de escualeno, siendo dicha re-destilacion una destilacion desnaturalizante llevada a cabo a una temperatura T2, en el que T2 s 200 °C. Esta re-destilacion puede reducir el contenido de humedad de la composicion, por ejemplo, a <0,0i %.

El procedimiento de la presente invencion puede usarse para producir un producto que es adecuado para aplicaciones farmaceuticas. En particular, el procedimiento de la presente invencion puede usarse para producir escualeno purificado que no contiene contaminantes, patogenos, virus, toxinas o protemas humanas, en particular la protema parvalbumina, que podria ser perjudicial para seres humanos.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para preparar una composicion de vacuna, que

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comprende preparar una emulsion como se ha descrito anteriormente y combinar la emulsion con un antigeno.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para preparar un kit de vacuna que comprende preparar una emulsion como se ha descrito anteriormente y envasar la emulsion en un kit como un componente de kit junto con un componente de antigeno.

Tambien se describe escualeno preparado segun los procedimientos de la presente invencion.

La presente invencion proporciona ademas una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno preparado segun los procedimientos de la presente invencion.

Tambien se describe una vacuna que comprende escualeno preparado segun los procedimientos de la presente invencion.

Tambien se describe el uso de escualeno preparado segun los procedimientos de la presente invencion en una vacuna.

Destilacion de purificacion

La composicion que comprende escualeno puede derivarse de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, espumas de jabon de licor negro; jabon de resinas de lejfas celulosicas; resina de lejfas celulosicas en bruto; brea de resinas de lejfas celulosicas; aceite de cana de azucar; residuos de extraccion, desengomado y refinado de aceites y grasas; residuos de destilacion de acidos grasos y esteres; destilados de desodorizacion de aceites vegetales; aceite de oliva; aceite de soja; aceite de salvado de arroz; aceite de hugado de tiburon; sebo de res; aceite de cafe; aceite de pescado; aceite de hugado de bacalao; aceite de germen de trigo; aceite de germen de mafz; aceites de palma; aceites de andiroba; y aceite de residuos de tomate. En particular, la composicion que comprende escualeno puede derivarse de aceite de hugado de tiburon.

La destilacion de purificacion elimina impurezas de una composicion que comprende escualeno para producir una composicion purificada. La composicion que comprende escualeno es generalmente un lfquido. Antes de la destilacion de purificacion, la composicion que comprende escualeno puede contener impurezas tales como escualamina; alquilgliceroles; acidos grasos (por ejemplo, acidos grasos omega-3); vitaminas A y D; pristina; trigliceridos; eteres de glicerol y alcoholes grasos.

La destilacion de purificacion se lleva a cabo a una temperatura T1 en la que T1 puede ser suficiente para hacer que hierva el escualeno, es decir, T1 puede ser superior a o igual al punto de ebullicion del escualeno. El punto de ebullicion del escualeno es 429 - 430 °C a 760 mm de Hg (es decir, 1 atmosfera).

El punto de ebullicion de un lfquido es la temperatura a la que la presion de vapor de la fase lfquida de un compuesto es igual a la presion externa que actua sobre la superficie del lfquido. Por tanto, el punto de ebullicion del escualeno, y de ah el lfmite inferior de Ti, dependera de la presion externa que actue sobre la superficie de la composicion que comprende escualeno. Este fenomeno es muy conocido en la tecnica y el experto podna calcular el punto de ebullicion del escualeno a una presion de destilacion dada usada. Alternativamente, el experto podna calcular la presion de destilacion requerida basandose en un punto de ebullicion observado deseado del escualeno. Tales calculos pueden llevarse a cabo usando un nomografo.

En una realizacion, la destilacion de purificacion puede llevarse a cabo a una temperatura de al menos 70 °C, por ejemplo, al menos 75 °C, o al menos 80 °C. En otra realizacion, la destilacion de purificacion puede llevarse a cabo a una temperatura inferior a 140 °C, por ejemplo, inferior a 130 °C, inferior a 120 °C, inferior a 110 °C, inferior a 100 °C inferior a 95 °C, inferior a 90 °C o inferior a 85 °C.

En una realizacion, la destilacion de purificacion puede llevarse a cabo en un vacfo proximo. En particular, la destilacion de purificacion puede llevarse a cabo a una presion de al menos 0,5 pm de Hg, por ejemplo, al menos 0,75 pm de Hg, o al menos 1 pm de Hg. La destilacion de purificacion puede llevarse a cabo a una presion inferior a 5 pm de Hg, por ejemplo, inferior a 2,5 pm de Hg o inferior a 2 pm de Hg.

Otras realizaciones de la presente invencion comprenden combinaciones de las temperaturas mmimas y maximas y las presiones mmimas y maximas citadas anteriormente.

La destilacion de purificacion puede producir una composicion que comprende al menos el 95 % de escualeno, por ejemplo, al menos el 96 % de escualeno, al menos el 97 % de escualeno, al menos el 98 % de escualeno, al menos el 99 % de escualeno, al menos el 99,5 % de escualeno, al menos el 99,8 % de escualeno, al menos el 99,9 % de escualeno, o incluso el 100 % de escualeno.

Todos los porcentajes citados en el presente documento son porcentajes en peso y pueden medirse usando cromatograffa de gases (CG). Puede realizarse una tecnica de CG inyectando una muestra de escualeno en hexano

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sobre un cromatografo de gases equipado con un detector de ionizacion de llama (FID). El analisis puede realizarse en una columna capilar de 30 m x 0,32 mm x 0,50 mm mantenida a 200 °C durante 2 minutos y luego incrementarse a 12 °C por minuto hasta 310 °C, donde se mantiene durante 9 minutos. El puerto de inyeccion y el FID se mantienen a 300 °C y 320 °C, respectivamente. La identidad del pico de escualeno se establece usando CG/EM (cromatograffa de gases usando un detector selectivo de masa). La pureza se informa como el area del pico de escualeno como porcentaje de la suma de las areas de todos los picos en el cromatograma.

La destilacion de purificacion puede llevarse a cabo antes de la destilacion desnaturalizante, produciendo una composicion purificada. Alternativamente, la destilacion de purificacion puede llevarse a cabo despues de la destilacion desnaturalizante, produciendo una composicion purificada desnaturalizada.

Destilacion desnaturalizante

Los tiburones, y por tanto, el escualeno derivado de aceite de hngado de tiburon, pueden contener protemas a las que los seres humanos son alergicos. Una protema de pescado comun a la que los seres humanos pueden ser alergicos es la parvalbumina, que se encuentra en los tiburones. Ademas, las protemas o materiales contaminantes pueden haberse introducido a la composicion de escualeno, por ejemplo, tras la destilacion de purificacion o como productos de degradacion del escualeno. Las posibles protemas o materiales contaminantes incluyen acetona, acetaldehudo, formaldehudo y agua. Ventajosamente, la etapa de destilacion desnaturalizante desnaturaliza y/o elimina protemas, en particular parvalbumina, y cualquier protema contaminante, de la composicion que comprende escualeno, proporcionando asf una composicion desnaturalizada. Otra ventaja del procedimiento de la presente invencion es que la destilacion desnaturalizante puede garantizar que cualquier posible virus presente en la composicion que comprende escualeno se inactive y/o elimine de la composicion purificada. La composicion desnaturalizada es, por tanto, mas segura para uso humano que una composicion no desnaturalizada.

Sin desear cenirse a teona alguna, el punto de ebullicion del escualeno dependera de la presion externa que actue sobre la superficie de la composicion que comprende escualeno. Sin embargo, la temperatura a la que cualquier protema presente en la composicion que comprende escualeno se desnaturalizara es generalmente independiente de la presion externa que actua sobre la superficie de la composicion que comprende escualeno. Por tanto, la destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a una temperatura espedfica, independientemente de la presion bajo la que se realiza la destilacion. En particular, la destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a una temperatura T2 en la que la T2 puede ser superior a o igual a 200 °C, por ejemplo, superior a o igual a 205 °C, superior a o igual a 210 °C, superior a o igual a 215 °C, superior a o igual a 220 °C, superior a o igual a 230 °C, superior a o igual a 240 °C, superior a o igual a 250 °C, o superior a o igual a 260 °C.

La destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a una temperatura inferior a 500 °C, por ejemplo, inferior a 480 °C, inferior a 450 °C, inferior a 420 °C, inferior a 400 °C, inferior a 350 °C, o inferior a 300 °C.

La destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a un vado proximo. En particular, la destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a una presion de al menos 0,5 mm de Hg, por ejemplo, al menos 0,6 mm de Hg, al menos 0,7 mm de Hg o al menos 0,8 mm de Hg. La destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo a una presion inferior a 5 mm de Hg, por ejemplo, inferior a 4 mm de Hg, inferior a 3 mm de Hg, inferior a 2 mm de Hg, inferior a 1,5 mm de Hg, inferior a 1 mm de Hg, o inferior a 0,9 mm de Hg.

Para llevar a cabo la destilacion desnaturalizante a una alta temperatura tal puede ser ventajoso usar un aparato en el que la composicion que comprende escualeno se pone en contacto con una superficie caliente. La superficie caliente puede mantenerse a la temperatura T2, como se ha definido anteriormente, y la presion que rodea la superficie caliente puede ser las presiones definidas anteriormente para la destilacion desnaturalizante. La presion que rodea la superficie caliente puede seleccionarse para garantizar que el punto de ebullicion observado de escualeno sea T2 o menos. Como la composicion que comprende escualeno se pone en contacto con la superficie caliente, se volatilizaran aquellos componentes de la composicion, que incluyen escualeno, cuyo punto de ebullicion es inferior a T2 a la presion que rodea la superficie caliente. Los componentes no volatiles, por ejemplo, protemas, quedan sobre la superficie caliente y pueden desnaturalizarse y separarse del escualeno.

Antes de la destilacion desnaturalizante, la composicion que comprende escualeno puede comprender del 85 % al 99,9 % de escualeno, por ejemplo, del 90 % al 99,5 % de escualeno, del 95 % al 99,5 % de escualeno, o del 97 % al 99,5 % de escualeno.

La destilacion desnaturalizante puede producir una composicion de escualeno que tiene un mayor porcentaje de escualeno. En particular, la destilacion desnaturalizante puede producir una composicion desnaturalizada que comprende al menos el 95 % de escualeno, por ejemplo, al menos el 99 % de escualeno, al menos el 99,5 % de escualeno, al menos el 99,9 % de escualeno, o incluso el 100 % de escualeno.

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La destilacion desnaturalizante puede producir una composicion desnaturalizada que comprende menos del 0,5 % de protema, por ejemplo, menos del 0,1 % de protema, menos del 0,01 % de protema, o 0 % de protema. Por tanto, la presente invencion proporciona escualeno que comprende menos del 0,5 % de protema, por ejemplo, menos del 0,1 % de protema, menos del 0,01 % de protema, o 0 % de protema.

En una realizacion, la destilacion desnaturalizante puede llevarse a cabo despues de la destilacion de purificacion, produciendo una composicion desnaturalizada purificada.

T2 puede ser superior a T1. En particular, T2 - T1 puede ser de 10 °C a 300 °C, por ejemplo, de 30 °C a 250 °C, de 50 °C a 200 °C, o de 80 °C a 150 °C.

Disolventes

Para evitar la introduccion de impurezas a la composicion que comprende escualeno, que es particularmente importante si la composicion de escualeno esta prevista para su uso en vacunas, las destilaciones de purificacion y desnaturalizantes pueden llevarse a cabo sin la adicion de disolventes.

Saponificacion

La composicion que comprende escualeno puede someterse a saponificacion. La saponificacion se llevara normalmente a cabo antes de las etapas de destilacion (a) y (b), tratadas anteriormente. Alternativamente, la saponificacion puede llevarse a cabo entre las etapas de destilacion (a) y (b), en cualquier orden que se realicen. Alternativamente, pero no normalmente, la saponificacion puede llevarse a cabo despues de las etapas de destilacion (a) y (b). La saponificacion puede destruir protemas presentes en la composicion que comprende escualeno. Sin embargo, la saponificacion puede no eliminar todas las protemas presentes. Cualquier protema residual que quede en la composicion que comprende escualeno despues de la saponificacion puede eliminarse mediante una etapa de destilacion desnaturalizante. La combinacion de saponificacion y destilacion desnaturalizante es ventajosa, ya que mejora la probabilidad de que el escualeno no contenga ninguna protema.

La saponificacion es la hidrolisis de un ester en condiciones basicas para formar un alcohol y la sal de un acido carboxflico. Durante la saponificacion de la composicion que comprende escualeno, una base (por ejemplo, NaOH o KOH) se anade a la composicion que puede producir los esteres de acidos grasos (por ejemplo, los trigliceridos) para convertir en jabon. La saponificacion puede ser ventajosa debido a que puede aumentar la diferencia entre los puntos de ebullicion de los productos saponificados y los puntos de ebullicion de los productos sin saponificar, haciendo mas eficiente la separacion mediante destilacion, por ejemplo, la destilacion de purificacion y/o la desnaturalizante. Alternativamente, los productos saponificados pueden eliminarse por otros medios, por ejemplo, por centrifugacion.

La eliminacion de los esteres de acidos grasos por saponificacion puede producir una composicion saponificada que comprende escualeno, que puede ser de pureza mejorada (es decir, un mayor % de escualeno) en comparacion con la composicion sin saponificar que comprende escualeno.

Caracterizacion del escualeno

El escualeno producido mediante el procedimiento de la presente invencion puede tener un valor de saponificacion de menos de 4 mg/ml, por ejemplo, menos de 3 mg/ml, menos de 2 mg/ml o menos de 1 mg/ml. Esta medicion indica la cantidad de especies saponificables presentes en el escualeno. El valor de saponificacion puede determinarse como los equivalentes de hidrolizacion y neutralizacion de hidroxido sodico como se describe en la Farmacopea estadounidense (USP) <401>. Un valor de saponificacion obtenido usando NaOH puede convertirse en un valor de KOH multiplicandolo por la relacion de los pesos moleculares de KOH y NaOH (1,403).

El escualeno producido mediante el procedimiento de la presente invencion puede tener un valor de acido de menos de o igual a 1 mg de KOH / g, por ejemplo, menos de o igual a 0,8 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,6 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,5 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,4 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,2 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,1 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,05 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,03 mg de KOH / g, menos de o igual a 0,02 mg de KOH / g, o menos de o igual a 0,01 mg de KOH / g. El valor de acido puede determinarse como los equivalentes de neutralizacion de hidroxido potasico consumidos por escualeno como se describe en USP <401>.

Emulsiones de aceite en agua

Una vez la composicion que comprende escualeno ha sido preparada como se ha descrito anteriormente, puede usarse para la preparacion de productos aguas abajo, por ejemplo, medicinas, adyuvantes de emulsiones de aceite en agua, etc.

Para evitar la contaminacion es preferible que el escualeno se mantenga esteril tras el tratamiento por destilacion y

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antes de la preparacion del producto aguas abajo. Por ejemplo, si el producto aguas abajo es una emulsion, los aparatos de destilacion y emulsion podna formar un sistema cerrado para evitar la contaminacion del escualeno antes de la formacion de la emulsion. Alternativamente o ademas, el escualeno podna mantenerse bajo una atmosfera inerte, por ejemplo, nitrogeno, antes de la preparacion del producto aguas abajo.

Se ha encontrado que las emulsiones de aceite en agua son particularmente adecuadas para su uso en adyuvantar vacunas. Las emulsiones preparadas segun la invencion incluyen escualeno y al menos un tensioactivo, ademas de un componente acuoso. Las emulsiones pueden contener aceites adicionales. Idealmente, el (los) aceite(s) y tensioactivo(s) son biodegradable(s) (metabolizable(s)) y biocompatible(s).

Pueden usarse combinaciones de aceite de escualeno y tocoferoles. Si una composicion incluye un tocoferol, puede usarse cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 5, £ o ^, pero se prefieren a-tocoferoles. Puede usarse D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isomeros. Las sales incluyen sales organicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Si se usa una sal de un tocoferol, la sal preferida es el succinato. Es util una combinacion de aceite que comprende escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

Es tfpico un contenido de aceite en el intervalo del 2-20 % (en volumen).

El componente acuoso puede ser agua (por ejemplo, agua para inyeccion) o puede incluir adicionalmente componentes, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampon, por ejemplo, sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Tampones tfpicos incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina; o un tampon citrato. Los tampones normalmente se incluiran en el intervalo 5-20 mM.

El tensioactivo es preferentemente biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Los tensioactivos pueden clasificarse por su 'HLB' (balance hidrofilo/lipofilo), en el que un HLB en el intervalo 1-10 generalmente significa que el tensioactivo es mas soluble en aceite que en agua, y un HLB en el intervalo 10-20 es mas soluble en agua que en aceite. Las emulsiones comprenden preferentemente al menos un tensioactivo que tiene un HLB de al menos 10, por ejemplo, al menos 15, o preferentemente al menos 16.

La invencion puede usarse con tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los esteres de polioxietileno de tensioactivos de sorbitano (comunmente denominados los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolfmeros de oxido de etileno (OE), oxido de propileno (OP) y/u oxido de butileno (OB), comercializados bajo el nombre comercial DOWFAX™, tales como copolfmeros de bloques de OE/OP lineales; octoxinoles, que pueden variar en el numero de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodnlo) de repeticion, siendo octoxinol-9 (Triton X-100, o t- octilfenoxipolietoxietanol) de particular interes; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolfpidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); eteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes lauricos, cetflicos, esteanlicos y oleicos (conocidos como tensioactivos Brij), tales como eter de monolaurilo de trietilenglicol (Brij 30); eter de polioxietilen-9-laurilo; y esteres de sorbitano (comunmente conocidos como SPAN), tales como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsion son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilensorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina y Triton X-100.

Pueden incluirse mezclas de tensioactivos en la emulsion, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Tambien es adecuada una combinacion de un ester de polioxietilensorbitano tal como monooleato de polioxietilensorbitano (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinacion util comprende lauril eter-9 mas un ester de polioxietilensorbitano y/o un octoxinol. Mezclas utiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, Tween 80, con un HLB de 15,0) y un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, Span 85, con un HLB de 1,8).

Cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: esteres de polioxietilensorbitano (tales como Tween 80) 0,01 al 2 %; octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (tales como Triton X-100, u otros detergentes de la serie Triton) 0,001 al 0,1 %; eteres de polioxietileno (tales como lauril eter-9) 0,1 al 20 %.

Se prefieren emulsiones de aceite en agua que contienen escualeno que contienen tensioactivo de polisorbato 80.

La emulsion de aceite en agua puede fabricarse usando un procedimiento que comprende las etapas de: (i) preparacion de una primera emulsion que tiene un primer tamano de gotita de aceite promedio, tambien conocida como una emulsion preliminar o una pre-emulsion; (ii) microfluidizacion de la primera emulsion para formar una segunda emulsion que tiene un segundo tamano de gotita de aceite promedio que es menos del primer tamano de gotita de aceite promedio; y (iii) filtracion de la segunda emulsion. La primera emulsion puede prepararse mediante homogenizacion.

Las gotitas de aceite en la emulsion tienen generalmente menos de 5 pm de diametro, y pueden incluso tener diametro submicrometrico, consiguiendose estos pequenos tamanos convenientemente con un microfluidizador para

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proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotitas con un tamano inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilizacion por filtracion.

Adyuvantes espedficos para emulsiones de aceite en agua que pueden prepararse usando escualeno preparado segun la invencion incluyen, pero no se limitan a:

• Una emulsion de escualeno, polisorbato 80 (Tween 80) y trioleato de sorbitano (Span 85). La composicion de la emulsion en volumen puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de Span 85. En terminos de peso, estas relaciones son 4,3 % de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' [4-6], como se describe en mas detalle en el Capftulo 10 de la ref. 7 y el Capftulo 12 de la ref. 8. La emulsion de MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampon citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsion de escualeno, un tocoferol (idealmente DL-a-tocoferol) y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener (en peso) del 2 al 10 % de escualeno, del 2 al 10 % de tocoferol y del 0,3 al 3 % de polisorbato 80, por ejemplo, 4,3 % de escualeno, 4,7 % de tocoferol y 1,9 % de polisorbato 80. La relacion de peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 (por ejemplo, 0,90), ya que este puede proporcionar una emulsion mas estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes a una relacion de volumen de aproximadamente 5:2 o a una relacion de peso de aproximadamente 11:5. Una emulsion tal puede prepararse disolviendo polisorbato 80 en PBS dando una disolucion al 2 %, luego mezclando 90 ml de esta disolucion con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizando la mezcla. La emulsion resultante tiene gotitas de aceite submicrometricas, por ejemplo, con un diametro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente aproximadamente 180 nm. La emulsion tambien puede incluir un monofosforil ftpido A 3-des-O-acilado (3d-MPL). Otra emulsion util de este tipo puede comprender, por dosis humana, 0,5-10 mg de escualeno, 0,5-11 mg de tocoferol y 0,1-4 mg de polisorbato 80 [9].

• Una emulsion de escualeno, un tocoferol y un detergente de Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsion tambien puede incluir un 3d-MPL. La emulsion puede contener un tampon fosfato.

• Una emulsion que comprende escualeno, un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente de Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsion puede incluir estos tres componentes a una relacion masica de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribucion de estos componentes de antfgenos. La emulsion tambien puede incluir un 3d-MPL. La emulsion tambien puede incluir una saponina, tal como QS21. La fase acuosa puede contener un tampon fosfato.

• Una emulsion que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no ionico hidrofilo de eter alqmlico de polioxietileno (por ejemplo, eter cetoesteanlico de polioxietileno (12)) y un tensioactivo no ionico hidrofobo (por ejemplo, un ester de sorbitano o eter de manida, tal como monooleato de sorbitano o 'Span 80'). La emulsion es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de gotitas de aceite (en volumen) con un tamano inferior a 200 nm [10]. La emulsion tambien puede incluir uno o mas de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azucar, tal como dodecilmaltosido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucosido. La emulsion puede incluir un agonista de TLR4 [11]. Tales emulsiones pueden liofilizarse.

• Una emulsion de escualeno, poloxamero 105 y Abil-Care [12]. La concentracion final (peso) de estos componentes en vacunas adyuvantadas son del 5 % de escualeno, 4 % de poloxamero 105 (poliol pluronico) y 2 % de Abil-Care 85 (Bis-pEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerido capnlico/caprico).

Las composiciones de estas emulsiones, expresadas anteriormente en terminos de porcentaje, pueden modificarse por dilucion o concentracion (por ejemplo, por un numero entero tal como 2 o 3 o por una fraccion tal como 2/3 o 3/4), en las que sus relaciones permanecen iguales. Por ejemplo, un MF59 2 veces concentrado tendna aproximadamente 10 % de escualeno, aproximadamente 1 % de polisorbato 80 y aproximadamente 1 % de trioleato de sorbitano. Las formas concentradas pueden diluirse (por ejemplo, con una disolucion de anftgeno) dando una concentracion final deseada de emulsion.

Las emulsiones de la invencion se guardan idealmente a entre 2 °C y 8 °C. No deben congelarse. Deben mantenerse idealmente alejadas de la luz directa. En particular, las emulsiones y vacunas que contienen escualeno de la invencion deben protegerse para evitar la degradacion fotoqmmica del escualeno. Si las emulsiones de la invencion se almacenan, entonces esto es preferentemente en una atmosfera inerte, por ejemplo, N2 o argon.

Vacunas

Aunque es posible administrar adyuvantes para emulsiones de aceite en agua por sf mismas a pacientes (por ejemplo, para proporcionar un efecto adyuvante para un anftgeno que se ha administrado por separado al paciente),

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es mas usual mezclar el adyuvante con un antigeno antes de la administracion, para formar una composicion inmunogenica, por ejemplo, una vacuna. La mezcla de emulsion y antfgeno puede tener lugar extemporaneamente, en el momento de uso, o puede tener lugar durante la fabricacion de la vacuna, antes de envasarla. Los procedimientos de la invencion pueden aplicarse en ambas situaciones.

Asf, un procedimiento de la invencion puede incluir otra etapa de procedimiento de mezcla de una emulsion que comprende escualeno preparada segun la presente invencion con un componente de antfgeno. Como alternativa, puede incluir otra etapa de envasado del adyuvante en un kit como un componente de kit junto con un componente de antigeno.

En general, por tanto, la invencion puede usarse cuando se preparan vacunas mixtas o cuando se preparan kits que incluyen antigeno y adyuvante listos para mezclar. Si la mezcla tiene lugar durante la fabricacion, entonces los volumenes de antfgeno y emulsion a granel que se mezclan normalmente seran superiores a 1 litro, por ejemplo, >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, etc. Si la mezcla tiene lugar en el momento de uso, entonces los volumenes que se mezclan normalmente seran inferiores a 1 mililitro, por ejemplo, <0,6 ml, <0,5 ml, <0,4 ml, <0,3ml, <0,2 ml, etc. En ambos casos es usual mezclar volumenes sustancialmente iguales de disolucion de emulsion y antfgeno, es decir, sustancialmente 1:1 (por ejemplo, entre 1,1:1 y 1:1,1, preferentemente entre 1,05:1 y 1:1,05, y mas preferentemente entre 1,025:1 y 1:1,025). En algunas realizaciones, sin embargo, puede usarse un exceso de emulsion o un exceso de antfgeno [13]. Si se usa un volumen en exceso de un componente, el exceso sera generalmente de al menos 1,5:1, por ejemplo, >2:1, >2,5:1, >3:1, >4:1, >5:1, etc.

Si el antfgeno y el adyuvante se presentan como componentes separados dentro de un kit, estan ffsicamente separados entre sf dentro del kit, y esta separacion puede lograrse de diversas formas. Por ejemplo, los componentes pueden estar en recipientes separados, tales como viales. El contenido de dos viales puede entonces mezclarse cuando se necesite, por ejemplo, sacando el contenido de un vial y anadiendolo al otro vial, o sacando por separado el contenido de ambos viales y mezclandolos en un tercer recipiente.

En otra disposicion, uno de los componentes del kit esta en una jeringuilla y el otro esta en un recipiente tal como un vial. La jeringuilla puede usarse (por ejemplo, con una aguja) para insertar su contenido en el vial para la mezcla, y la mezcla puede entonces sacarse en la jeringuilla. Los contenidos mezclados de la jeringuilla pueden entonces administrarse a un paciente, normalmente mediante una nueva aguja esteril. El envasar un componente en una jeringuilla elimina la necesidad de usar una jeringuilla separada para la administracion al paciente.

En otra disposicion preferida, los dos componentes del kit se mantienen juntos, pero por separado en la misma jeringuilla, por ejemplo, una jeringuilla de doble camara, tal como la desvelada en las referencias 14-21, etc. Cuando la jeringuilla se acciona (por ejemplo, durante la administracion a un paciente), entonces el contenido de las dos camaras se mezclan. Este disposicion evita la necesidad de una etapa de mezcla separada en el momento de uso.

Los contenidos de los diversos componentes del kit estaran generalmente todos en forma lfquida. En algunas disposiciones, un componente (normalmente el componente de antfgeno en vez del componente de emulsion) esta en forma seca (por ejemplo, en una forma liofilizada), estando el otro componente en forma lfquida. Los dos componentes pueden mezclarse con el fin de reactivar el componente seco y dar una composicion lfquida para administracion a un paciente. Un componente liofilizado normalmente se localizara dentro de un vial en vez de una jeringuilla. Los componentes secados pueden incluir estabilizadores tales como lactosa, sacarosa o manitol, ademas de mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de lactosa/sacarosa, mezclas de sacarosa/manitol, etc. Una posible disposicion usa un componente de emulsion lfquido en una jeringuilla precargada y un componente de antfgeno liofilizado en un vial.

Si las vacunas contienen componentes, ademas de emulsion y antfgeno, entonces estos componentes pueden incluirse adicionalmente en uno de estos dos componentes del kit, o pueden ser parte de un tercer componente del kit.

Recipientes adecuados para vacunas mezcladas de la invencion, o para componentes del kit individuales, incluyen viales y jeringuillas desechables. Estos recipientes deben ser esteriles.

Si una composicion/componente se localiza en un vial, el vial esta preferentemente hecho de un material de vidrio o plastico. El vial se esteriliza preferentemente antes de anadir la composicion. Para evitar problemas con pacientes sensibles al latex, los viales se sellan preferentemente con un tapon sin latex, y se prefiere la ausencia de latex en todo el material de envasado. En una realizacion, un vial tiene un tapon de caucho butilico. El vial puede incluir una dosis unica de vacuna/componente, o puede incluir mas de una dosis (un vial 'multidosis'), por ejemplo, 10 dosis. En una realizacion, un vial incluye 10 dosis x 0,25 ml de emulsion. Los viales preferidos estan hechos de vidrio incoloro.

Un vial puede tener un tapa (por ejemplo, un cierre roscado de ajuste hermetico) adaptado de forma que una jeringuilla precargada pueda insertarse en la tapa, el contenido de la jeringuilla pueda descargarse en el vial (por ejemplo, para reconstituir material liofilizado en su interior) y el contenido del vial pueda sacarse en la jeringuilla. Despues de sacar la jeringuilla del vial, una aguja pueden entonces unirse y la composicion puede administrarse a

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un paciente. La tapa esta preferentemente localizada dentro de un sello o cubierta, de forma que el sello o cubierta tenga que quitarse antes de poder acceder a la tapa.

Si una composicion/componente esta envasada en una jeringuilla, la jeringuilla normalmente no tendra una aguja unida a ella, aunque puede suministrarse una aguja separada con la jeringuilla para el ensamblaje y uso. Se prefieren agujas de seguridad. Son tipicas agujas de 1 pulgada 23 de calibre, 1 pulgada 25 de calibre y 5/8 de pulgada 25 de calibre Las jeringuillas pueden proveerse de etiquetas desprendibles en las que pueden estar impresas el numero de lote, estacion de la gripe y fecha de caducidad del contenido para facilitar el mantenimiento del registro. El embolo de la jeringuilla tiene preferentemente un tapon para prevenir que el embolo se quite accidentalmente durante la aspiracion. Las jeringuillas pueden tener un tapa de goma de latex y/o embolo. Las jeringuillas desechables contienen una dosis unica de vacuna. La jeringuilla tendra generalmente un protector para sellar la punta antes de la union de una aguja, y el protector esta hecho preferentemente de un caucho butilico. Si la jeringuilla y la aguja estan envasadas por separado, entonces la aguja se ajusta preferentemente con un protector de goma butilica.

La emulsion puede diluirse con un tampon antes de envasarla en un vial o una jeringuilla. Tampones tipicos incluyen: un tampon fosfato; un tampon Tris; un tampon borato; un tampon succinato; un tampon histidina; o un tampon citrato. La dilucion puede reducir la concentracion de componentes del adyuvante mientras que se retienen sus proporciones relativas, por ejemplo, para proporcionar un adyuvante “diluido al 50 %”.

Los recipientes pueden marcarse para mostrar un volumen de media dosis, por ejemplo, para facilitar la administracion a ninos. Por ejemplo, una jeringuilla que contiene una dosis de 0,5 ml puede tener una marca que muestra un volumen de 0,25 ml.

Cuando se usa un recipiente de vidrio (por ejemplo, una jeringuilla o un vial), entonces se prefiere usar un recipiente hecho de un vidrio de borosilicato en vez de un vidrio de cal sodada.

Pueden usarse diversos antigenos con emulsiones de aceite en agua, que incluyen, pero no se limitan a: antigenos virales tales como protemas de la superficie viral; antigenos bacterianos tales como antigenos de protema y/o sacarido; antigenos fungicos; antigenos parastiicos; y antigenos de tumor. La invencion es particularmente util para vacunas contra el virus de la gripe, VIH, anquilostoma, virus de la hepatitis B, virus del herpes simple, rabia, virus respiratorio sincitial, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamidia, coronavirus de SARs, virus de la varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, virus de Epstein Barr, virus del papiloma humano, etc. Por ejemplo:

• Antigenos del virus de la gripe. Estos pueden tomar la forma de un virus vivo o un virus inactivado. Si se usa un virus inactivado, la vacuna puede comprender virion completo, virion fraccionado o antigenos de superficie purificados (incluyendo hemaglutinina y, normalmente, incluyendo tambien neuraminidasa). Los antigenos de la gripe tambien pueden presentarse en forma de virosomas. Los antigenos pueden tener cualquier subtipo de hemaglutinina, seleccionada de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. La vacuna puede incluir antigeno(s) de una o mas cepas del virus de la gripe (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o mas), que incluyen virus de la gripe A y/o virus de la gripe B, por ejemplo, una vacuna para A/H5N1 o A/H1N1 monovalente, o una vacuna para A/H1N1 + A/H3N2 + B trivalente. Los virus de la gripe pueden ser una cepa reagrupada, y pueden haber sido obtenidos por tecnicas de genetica inversa [por ejemplo, 22-26]. Asf, el virus puede incluir uno o mas segmentos de ARN de un virus A/PR/8/34 (normalmente 6 segmentos de A/PR/8/34, siendo los segmentos HA y N de una cepa de vacuna, es decir, un reagrupamiento 6:2). Los virus usados como fuente de los antigenos pueden cultivarse tanto en huevos (por ejemplo, huevos de gallina embrionados) como en cultivo celular. Si se usa cultivo celular, el sustrato celular normalmente sera una lmea celular de mairtifero, tal como MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. Las lmeas celulares de mai^ero preferidas para el cultivo del virus de la gripe incluyen: celulas MDCK [27-30], derivadas de rinon canino de Madin Darby; celulas Vero [31-33], derivadas de rinon de mono verde africano; o celulas PER.C6 [34], derivadas de retinoblastos embrionarios humanos. Si el virus se ha cultivado en una lmea celular de mai^ero, entonces la composicion estara ventajosamente libre de protemas del huevo (por ejemplo, albumina de huevo y ovomucoide) y de ADN de pollo, reduciendo asf la alergenicidad. Las dosis unitarias de vacuna se normalizan normalmente por referencia al contenido de hemaglutinina (HA), normalmente medido por SRID. Las vacunas existentes normalmente contienen aproximadamente 15 pg de HA por cepa, aunque pueden usarse menores dosis, particularmente si se usa un adyuvante. Se han usado dosis fraccionarias tales como A (es decir, 7,5 pg de HA por cepa), % y % [35, 36], ya que tienen mayor dosis (por ejemplo, 3x o 9x dosis [37, 38]). Asf, las vacunas pueden incluir entre 0,1 y 150 pg de HA por cepa de la gripe, preferentemente entre 0,1 y 50 pg, por ejemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg, etc. Dosis particulares incluyen, por ejemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,75, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5, etc., por cepa.

• Virus de la inmunodeficiencia humana, que incluye VIH-1 y VIH-2. El antigeno normalmente sera un antigeno de la envuelta.

• Antigenos de superficie del virus de la hepatitis B. Este antigeno se obtiene preferentemente mediante

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procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, despues de la expresion en una levadura de Saccharomyces cerevisiae. A diferencia de HBsAg viral nativo, el antigeno expresado en levadura recombinante no esta glucosilado. Puede estar en forma de particulas sustancialmente esfericas (diametro promedio de aproximadamente 20 nm), que incluye una matriz lip^dica que comprende fosfoKpidos. A diferencia de las particulas de HBsAg nativas, las particulas expresadas en levadura pueden incluir fosfatidilinositol. El HBsAg puede ser de cualquiera de los subtipos aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- y adrq+.

• Anquilostoma, particularmente como se observa en caninos (Ancylostoma caninum). Este antigeno puede ser Ac-MTP-1 recombinante (metaloproteasa similar a astacina) y/o una hemoglobinasa aspartica (Ac-APR-1), que puede expresarse en un sistema de baculovirus/celulas de insecto como una protema secretada [39, 40].

• Antigenos del virus del herpes simple (VHS). Un antigeno del VHS preferido para su uso con la invencion es gD de glucoprotema de membrana. Se prefiere usar gD de una cepa de VHS-2 (antigeno 'gD2'). La composicion puede usar una forma de gD en la que la region de ancla de la membrana del extremo C se ha delecionado [41], por ejemplo, un gD truncado que comprende los aminoacidos 1-306 de la protema natural con la adicion de asparagina y glutamina en el extremo C. Esta forma de la protema incluye el peptido senal que se escinde dando una protema de 283 aminoacidos madura. La delecion del anclaje permite preparar la protema en forma soluble.

• Antigenos del virus del papiloma humano (VPH). Los antigenos del VPH preferidos para su uso con la invencion son protemas de la capside L1, que pueden ensamblarse para formar estructuras conocidas como particulas similares a virus (VLP). Las VLP pueden producirse por expresion recombinante de L1 en celulas de levadura (por ejemplo, en S. cerevisiae) o en celulas de insecto (por ejemplo, en celulas de Spodoptera, tales como S. frugiperda, o en celulas de Drosophila). Para celulas de levadura, los vectores de plasmido pueden llevar el (los) gen(es) L1; para celulas de insecto, los vectores de baculovirus pueden llevar el (los) gen(es) L1. Mas preferentemente, la composicion incluye VLP de L1 de tanto cepas de VPH-16 como de VPH-18. Se ha mostrado que 3sta combinacion bivalente es altamente eficaz [42]. Ademas de cepas de VPH-16 y VPH-18, tambien es posible incluir VLP de L1 de cepas de VPH-6 y VPH-11. Tambien es posible el uso de cepas de VPH oncogenicas. Una vacuna puede incluir entre 20-60 pg/ml (por ejemplo, aproximadamente 40 pg/ml) de L1 por cepa de VPH.

• Antigeno del carbunco. El carbunco se produce por Bacillus anthracis. Antigenos de B. anthracis adecuados incluyen componentes A (factor letal (LF) y factor de edema (EF)), ambos de los cuales pueden compartir un componente B comun conocido como antigeno protector (PA). Los antigenos pueden desintoxicarse opcionalmente. Pueden encontrarse mas detalles en las referencias [43 a 45].

• Antigenos de S. aureus. Se conoce una variedad de antigenos de S. aureus. Antigenos adecuados incluyen sacaridos capsulares (por ejemplo, de una cepa de tipo 5 y/o tipo 8) y protemas (por ejemplo, IsdB, Hla, etc.). Los antigenos de sacarido capsular estan idealmente conjugados con una protema transportadora.

• Antigenos de S. pneumoniae. Se conoce una variedad de antigenos de S. pneumoniae. Antigenos adecuados incluyen sacaridos capsulares (por ejemplo, de uno o mas de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y/o 23F) y protemas (por ejemplo, neumolisina, neumolisina desintoxicada, protema D de la triada de polihistidina (PhtD), etc.). Los antigenos de sacaridos capsular se conjugan idealmente con una protema transportadora.

• Antigenos del cancer. Se conocen una variedad de antigenos espedficos de tumor. La invencion puede usarse con antigenos que provocan una respuesta inmunoterapeutica contra el cancer de pulmon, melanoma, cancer de mama, cancer de prostata, etc.

Una disolucion del antigeno se mezclara normalmente con la emulsion que contiene escualeno, por ejemplo, en una relacion de volumen 1:1. Esta mezcla puede tanto realizarse por un fabricante de vacunas, antes de envasarlas, como puede realizarse en el momento de uso, por un trabajador sanitario.

Composiciones farmaceuticas

Las composiciones preparadas usando los procedimientos de la invencion son farmaceuticamente aceptables. Pueden incluir componentes, ademas de la emulsion que contiene escualeno, y el antigeno opcional.

La composicion puede incluir un conservante tal como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna deba estar sustancialmente libre de material mercurial (es decir, menos de 5 pg/ml), por ejemplo, libre de tiomersal [46, 47]. Son mas preferidas las vacunas y componentes que no contienen mercurio.

El pH de una composicion sera generalmente entre 5,0 y 8,1, y mas normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5. Un procedimiento de la invencion puede, por tanto, incluir una etapa de ajuste del pH de la vacuna antes del envasado.

La composicion es preferentemente esteril. La composicion es preferentemente no pirogena, por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composicion esta preferentemente libre de gluten.

La composicion puede incluir material para una unica inmunizacion, o puede incluir material para multiples inmunizaciones (es decir, un kit 'multidosis'). La inclusion de un conservante se prefiere en disposiciones multidosis.

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Las vacunas se administran normalmente en un volumen de dosificacion de aproximadamente 0,5 ml, aunque puede administrarse la mitad de dosis (es dedr, aproximadamente 0,25 ml) a ninos.

Procedimientos de tratamiento y administracion de la vacuna

Tambien se describen kits y composiciones preparadas usando los procedimientos de la invencion. Las composiciones preparadas segun los procedimientos de la invencion son adecuadas para administracion a pacientes humanos, y tambien se describe un procedimiento de elevar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende la etapa de administrar una composicion tal al paciente.

La invencion tambien proporciona estos kits y composiciones para su uso como medicamentos.

Tambien se describe el uso de: (i) una preparacion acuosa de un antigeno; y (ii) una emulsion de aceite en agua que comprende escualeno preparado segun la invencion, en la fabricacion de un medicamento para elevar una respuesta inmunitaria en un paciente.

La respuesta inmunitaria elevada por estos procedimientos y usos incluira generalmente una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta protectora de anticuerpos.

Las composiciones pueden administrarse de diversas formas. La via de inmunizacion mas preferida es por inyeccion intramuscular (por ejemplo, en el brazo o pierna), pero otras vfas disponibles incluyen inyeccion subcutanea, intranasal [48-50], oral [51], intradermica [52,53], transcutanea, transdermica [54], etc.

Las vacunas preparadas segun la invencion pueden usarse para tratar tanto ninos como adultos. El paciente puede tener menos de 1 ano de edad, 1-5 anos de edad, 5-15 anos de edad, 15-55 anos de edad o 55 anos de edad. El paciente puede ser anciano (por ejemplo, >50 anos de edad, preferentemente >65 anos), jovenes (por ejemplo, <5 anos de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, los pacientes inmunodeficientes cronicamente enfermos y personas que viajan al extranjero. Sin embargo, las vacunas no son unicamente adecuadas para estos grupos, y pueden usarse mas generalmente en una poblacion.

Las vacunas de la invencion pueden administrarse a pacientes en sustancialmente el mismo momento que (por ejemplo, durante la misma consulta o visita medica a un profesional sanitario) otras vacunas.

General

El termino “que comprende” engloba “que incluye” ademas de “que consiste”, por ejemplo, una composicion “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

El termino “aproximadamente” en relacion con un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composicion que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Si es necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definicion de la invencion.

A menos que se establezca espedficamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclar dos o mas componentes no requiere ningun orden espedfico de mezcla. Por tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Si hay tres componentes, entonces dos componentes pueden combinarse entre sf, y luego la combinacion puede combinarse con el tercer componente, etc.

Las diversas etapas de los procedimientos pueden llevarse a cabo en el mismo momento o en momentos diferentes, en la misma localizacion geografica o localizaciones geograficas diferentes, por ejemplo, pafses, y por la misma persona o entidades diferentes.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

Ejemplo 1

La Figura 1 muestra un esquema de un aparato de destilacion que puede usarse para la etapas de destilacion de purificacion y/o desnaturalizante del procedimiento de la presente invencion. El procedimiento descrito con referencia a la Figura 1 puede llevarse a cabo sin la adicion de ningun disolvente a la composicion que comprende escualeno. En la realizacion mostrada en la Figura 1, la composicion que comprende escualeno se coloca en un recipiente de alimentacion (1) cubierto con nitrogeno. Un extremo de una lmea de entrada (3) tiene un prefiltro de polipropileno y se coloca en el recipiente de alimentacion, mientras que el otro extremo de la lmea de entrada tiene una aguja de acero inoxidable (calibre 19) que se inserta en la parte superior de un aparato de destilacion (5). El aparato de

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destilacion comprende una camara (7) formada como un tubo con un “dedo caliente” cilmdrico (9) que sobresale por el centro. Se calienta benzoato de etilo, que tiene un punto de ebullicion de 212 °C, por debajo del dedo para proporcionar calor a la pared del dedo caliente. Aunque el benzoato de etilo se usa en esta realizacion, es evidente que un disolvente que tiene un mayor punto de ebullicion podna usarse para aumentar la temperature del dedo caliente. Durante la destilacion, el aparato de destilacion puede evacuarse. La composicion que comprende escualeno puede entrarse en el aparato de destilacion, por ejemplo, mediante el uso de una menor presion dentro del aparato de destilacion, a traves de la aguja de acero inoxidable y anadirse gota a gota (11) sobre la pared calentada del dedo caliente. A medida que se calienta la composicion que comprende escualeno, aquellos componentes cuyo punto de ebullicion esta por debajo de 212 °C a la presion dentro del aparato de destilacion se volatilizaran. Con el fin de volatilizar el escualeno usando el sistema de la Figura 1, la presion dentro del aparato de destilacion debe seleccionarse para reducir el punto de ebullicion del escualeno a 212 °C o menos (por ejemplo, aproximadamente 1,5 mm de Hg o menos). Los componentes volatilizados se condensaran sobre la pared externa de la camara (7), que se enfriara por el aire ambiente, y recorreran las paredes a un matraz de recogida (13), que tambien puede estar a vado. Los componentes no volatiles, por ejemplo, protemas, quedan sobre la pared del dedo caliente y fluyen en el matraz de residuos (15). Los componentes extremadamente volatiles pueden extraerse a traves de la lrnea de vado, reduciendo sus niveles en el condensado de escualeno.

El escualeno que ya se ha sometido a destilacion de purificacion se destilo usando este aparato. Independientemente de la fuente, el escualeno final tuvo regularmente una pureza de >99,9 %, un valor de acido de <0,03 mg de KOH/g y un valor de saponificacion <2 mg/g. La destilacion desnaturalizante redujo el contenido de humedad del escualeno, por ejemplo, del 0,022 % al 0,010 %, del 0,006 al 0,005 %, o del 0,010 % al 0,006 %.

Ejemplo 2 - Medicion del valor de saponificacion.

El valor de saponificacion es el numero de mg de hidroxido potasico requeridos para neutralizar los acidos libres y saponificar los esteres contenidos en 1,0 g de la sustancia.

Procedimiento (USP <401>): disponer 1,5 g a 2 g de la sustancia en un matraz de 250 ml tarado, pesar con exactitud y anadirlo a 25,0 ml de un hidroxido potasico alcoholico 0,5 N. Calentar el matraz sobre un bano de vapor, bajo un condensador adecuado para mantener el reflujo durante 30 minutos, frecuentemente rotando el contenido. Entonces anadir 1 ml de fenolftalema TS, y valorar el exceso de hidroxido potasico con acido clorhudrico VS 0,5 N. Realizar una determinacion del blanco bajo las mismas condiciones. La diferencia entre los volumenes, en ml, de acido clorhudrico 0,5 N consumido en la prueba actual y en la prueba del blanco, multiplicada por 56,1 y la normalidad exacta del acido clorhfdrico VS 0,5 N, y dividida entre el peso en g de la muestra tomada, es el valor de saponificacion.

Dependiendo de la fuente de escualeno podna obtenerse un valor de saponificacion de <1,4 mg/g.

Ejemplo 3 - Medicion del valor acido.

La acidez de grasas y aceites no volatiles puede expresarse como el numero de ml de alcali 0,1 N requerido para neutralizar los acidos libres en 10,0 g de sustancia. El valor de acido es el numero de mg de alcali requeridos para neutralizar los acidos libres en 1,0 g de la sustancia.

Procedimiento (USP <401>): disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesada con exactitud, en 50 ml de una mezcla de volumen igual de alcohol y eter (que se habfa neutralizado a fenolftalema con hidroxido sodico 0,1 N) contenida en un matraz. Si el especimen de prueba no se disuelve en el disolvente frio, conectar el matraz con un condensador adecuado y calentar lentamente, con agitacion frecuente, hasta que se disuelva el especimen. Anadir 1 ml de fenolftalema TS y valorar con hidroxido sodico VS 0,1 N hasta que la disolucion siga debilmente rosa despues de agitar durante 30 segundos. Calcular cualquier valor de acido. Si el volumen de alcali VS 0,1 N requerido para la valoracion es menos de 2 ml, puede usarse un valorante mas diluido, o el tamano de muestra puede ajustarse por consiguiente. Los resultados pueden expresarse en terminos del volumen de valorante o en terminos del volumen equivalente de hidroxido sodico 0,1 N.

Dependiendo de la fuente de escualeno podna obtenerse un valor de acido de 0,03 mg de KOH/g.

Ejemplo 4 - Estudios de enriquecimiento

Se llevaron a cabo varios estudios de enriquecimiento para demostrar la eficacia de la destilacion desnaturalizante.

Para determinar los niveles de impureza eliminada por la destilacion desnaturalizante, una composicion de escualeno se enriquecio con cantidades especificadas de contaminantes (por ejemplo, agua), ademas de posibles productos de descomposicion del escualeno (por ejemplo, formaldehudo, acetaldehfdo y acetona). Las disoluciones enriquecidas se sometieron a una destilacion desnaturalizante segun la presente invencion y se analizaron para las sustancias enriquecidas.

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4 kg de una composicion de escualeno se enriquecieron, por ejemplo, con 0,3 ml (0,2 g) de acetaldetndo (>99,5 % pureza), 0,3 ml (0,2 g) de acetona (>99,9 % pureza), 0,55 ml de disolucion acuosa al 37 % en peso de formaldel'ndo (0,2 g) y 3,65 g de agua antes de una destilacion desnaturalizante como se describe en el Ejemplo 1. El destilado se recogio en tres fracciones y se analizo para las especies enriquecidas junto al material de partida enriquecido. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla I:

TABLA 1

Test / Metodo: Material de partida enququecido Fracciones de destilacion desnaturalizante Residuo

Primera fraccion: Segunda fraccion Tercera fraccion Residuo no volatil

Contenido de humedad (%): 0.02 0.03 0.02 0.02 N/A

Acetona (mg/Kg o ppm): 50.9 5.0 5.7 1.1 N/A

Acetaldehido (mg/Kg o ppm): 12.4 0.9 1.9 0.9 N/A

Formaldehido (mg/Kg o ppm): 2.2 0.7 0.9 No detectado N/A

Los resultados en la Tabla 1 muestran que las concentraciones de acetona, acetaldetndo y formaldel'ndo disminuyeron todas tras la destilacion desnaturalizante.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la fabricacion de un adyuvante de emulsion de aceite en agua, que comprende:

(i) preparar escualeno a partir de una composicion que comprende escualeno de una fuente animal mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) una destilacion de purificacion llevada a cabo a una temperature T1; y (b) una destilacion desnaturalizante Nevada a cabo a una temperature T2; en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden; Ti y T2 son suficientes para hacer que hierva el escualeno; Ti <140°C; y T2 s 200 °C.

(ii) preparar una emulsion usando el escualeno preparado en la etapa (i).
2. Un procedimiento para la fabricacion de un adyuvante de emulsion de aceite en agua, que comprende:

(i) preparar escualeno a partir de composicion que contiene escualeno mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) una destilacion de purificacion llevada a cabo a una temperatura Ti; y (b) una destilacion desnaturalizante llevada a cabo a una temperatura T2; en el que las etapas (a) y (b) pueden realizarse en cualquier orden; Ti y T2 son suficientes para hacer que hierva el escualeno; Ti < 140 °C y T2 s 200 °C.

(ii) preparar una emulsion usando el escualeno preparado en la etapa (i).
3. El procedimiento de cualquier reivindicacion precedente, en el que el escualeno preparado en la etapa (i) se mantiene esteril tras el tratamiento de destilacion y antes de la preparacion de la emulsion en la etapa (ii).
4. El procedimiento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la composicion usada en la etapa (i) comprende una o mas proternas.
5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que la composicion comprende parvalbumina.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la destilacion desnaturalizante se lleva a cabo a una presion de 0,5 mm de Hg (66,7 Pa) a 5,0 mm de Hg (666,6 Pa).
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la destilacion de purificacion se lleva a cabo a una temperatura de 70 a 100 °C.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la destilacion de purificacion se lleva a cabo a una presion de 0,5 pm de Hg (66,7 mPa) a 5 pm de Hg (666,6 mPa).
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la destilacion de purificacion se lleva a cabo antes de la destilacion desnaturalizante.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composicion usada en la etapa (i) se somete a saponificacion.
11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la saponificacion comprende la adicion de NaOH o KOH a la composicion que comprende escualeno.
12. Un procedimiento para preparar una composicion de vacuna, que comprende preparar una emulsion segun cualquier reivindicacion precedente y combinar la emulsion con un antigeno.
13. Un procedimiento para preparar un kit de vacuna, que comprende preparar una emulsion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y envasar la emulsion en un kit como un componente de kit junto con un componente de antfgeno.
14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que los componentes del kit estan en viales separados.
15. El procedimiento de la reivindicacion 14, en el que los viales estan hechos de vidrio de borosilicato.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el antfgeno es un antfgeno del virus de la gripe.
17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que la combinacion de la emulsion y el antfgeno forma una composicion de vacuna y en el que la composicion de vacuna incluye 15 pg, 10 pg, 7,5 pg, 5 pg, 3,8 pg, 3,75 pg, 1,9 pg o 1,5 pg de hemaglutinina por cepa del virus de la gripe.
18. El procedimiento de la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17, en el que la combinacion de la emulsion y el antfgeno forma una composicion de vacuna y en el que la composicion de vacuna incluye un conservante de

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tiomersal o 2-fenoxietanol.