BR112012028711B1

BR112012028711B1 - método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água e método para a preparação de um kit de vacina

Info

Publication number: BR112012028711B1
Application number: BR112012028711-7A
Authority: BR
Inventors: Maninder Hora
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2020-12-01
Also published as: SG185419A1; US11077186B2; ZA201208381B; US9199897B2; KR101875894B1; ES2597158T3; SG10201503689TA; TR201905021T4; PL2620423T3; PL3489211T3; EP2569267B1; WO2011141819A1; ES2453316T3; US20160051670A1; ES2717266T3; US20180169225A1; KR20130103668A; EA027142B1; US9545440B2; CN102892734A

Abstract

MÉTODOS PARA A FABRICAÇÃO DE UMA EMULSÃO DE ÓLEO EM ÁGUA, PARA A PREPARAÇÃO DE UM KIT DE VACINA E PARA REDESTILAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO 99% DE ESQUALENO OU MAIS, ASSIM COMO EMULSÃO DE ÓLEO EM ÁGUA E KIT. Um método aperfeiçoado para preparar esqualeno de uma composição contendo esqualeno, o método compreendendo as etapas de: a) uma destilação de purificação realiza da em uma temperatura T1 ; (b) uma destilação de desnaturação realizada em uma temperatura T2 ; em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem; T1 e T2 são suficientes para fazer com que esqualeno entre em ebulição; T2 > T1 ; e T2 (Maior igual) 200°C.

Description

MÉTODO PARA A FABRICAÇÃO DE UMA EMULSÃO DE ÓLEO EM ÁGUA E MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM KIT DE VACINA

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisional US 61/395.448 (depositado em 12 de maio de 2010), cujo teor completo é pelo presente incorporado a título de referência para todas as finalidades.

Campo técnico

[002] A presente invenção está no campo de fabricação de esqualeno tendo uma pureza apropriada para aplicações farmacêuticas.

Técnica antecedente

[003] Óleo de fígado de tubarão contém um terpenoide insaturado, ramificado chamado esqualeno, (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3) ]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23- hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa-hexaeno; CAS RN 768364-9) . Esqualeno é conhecido para uso em emulsões de óleo em água em vacinas humanas, por exemplo, a emulsão MF59 que é utilizada para colocar adjuvantes em vacinas de influenza. Esqualeno é também utilizado em outros produtos farmacêuticos (por exemplo, ungüentos, supositórios) e em cosméticos.

[004] As fontes atuais para esqualeno são principalmente óleos de peixe, e em particular óleos de fígado de tubarão. Pode haver problemas associados ao uso de esqualeno extraído de óleo de fígado de tubarão, particularmente se padrões de fabricação rigorosos (como aqueles utilizados durante a produção de MF59 por Novartis) não forem mantidos. Por exemplo, tubarões podem estar infectados por patógenos que são também infecciosos para seres humanos ou que produzem substâncias que são prejudiciais para seres humanos, e TSE ou agentes de tubarão semelhantes a TSE podem existir [por exemplo, referências 1-3] . Além disso, tubarões podem conter toxinas humanas, como carcatoxina. Além disso, tubarões podem conter proteínas às quais os seres humanos podem ser alérgicos. Uma proteína de peixe comum a qual os seres humanos são alérgicos é parvalbumina que é encontrada em tubarões. Desse modo, fontes do tipo baixo, barato, de esqualeno não são apropriadas para uso farmacêutico humano. O risco de dano a um receptor humano pode ser aumentado em situações onde esqualeno faz parte de um adjuvante imunológico porque, por definição, o adjuvante pode induzir uma resposta imune indesejável forte contra a impureza.

[005] Seria útil encontrar processos adicionais e aperfeiçoados para preparar esqualeno que seja apropriado para uso farmacêutico, isto é, um produto que atenda padrões reguladores e não contenha contaminantes, patógenos, vírus, toxinas humanas ou proteínas que poderiam ser prejudiciais aos seres humanos. O processo da presente invenção é particularmente útil para a purificação de esqualeno derivado de óleo de fígado de tubarão.

Revelação da invenção

[006] A presente invenção provê um método para preparar esqualeno a partir de uma composição que compreende esqualeno de uma fonte de animal, o método compreendendo as etapas de: (a) uma destilação de purificação realizada em uma temperatura T1; (b) uma destilação de desnaturação realizada em uma temperatura T2; em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem; T1 e T2 são suficientes para fazer com que esqualeno entre em ebulição; T2 > T1; e T2 ≥ 200°C. A fonte de animal é tipicamente uma fonte de peixe, como óleo de fígado de tubarão (ou um extrato do mesmo), isto é, a invenção provê um método para preparar esqualeno a partir de óleo de fígado de tubarão ou de um extrato de óleo de fígado de tubarão.

[007] A presente invenção provê ainda um método para preparar esqualeno a partir de uma composição que contém esqualeno, compreendendo as etapas de: (a) uma destilação de purificação realizada em uma temperatura T1; (b) uma destilação de desnaturação realizada em uma temperatura T2; em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem; T1 e T2 são suficientes para fazer com que esqualeno entre em ebulição; T1 < 140°C e T2 ≥ 200°C. A composição contendo esqualeno pode ser utilmente óleo de fígado de tubarão ou de um extrato do mesmo.

[008] A presente invenção provê ainda um método para redestilação de uma composição compreendendo pelo menos 99% de esqualeno, a redestilação sendo uma destilação de desnaturação realizada em uma temperatura T2, em que T2 ≥ 200°C. Essa redestilação pode reduzir o teor de umidade da composição, por exemplo, para ≤ 0,01%.

[009] O método da presente invenção pode ser utilizado para produzir um produto que seja apropriado para aplicações farmacêuticas. Em particular, o método da presente invenção pode ser utilizado para produzir esqualeno purificado que não contém contaminantes, patógenos, vírus, toxinas humanas ou proteínas, em particular a proteína parvalbumina, que poderia ser prejudicial para seres humanos.

[010] A presente invenção provê ainda um método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água, compreendendo preparar uma emulsão utilizando esqualeno preparado de acordo com os métodos descritos acima.

[011] A presente invenção provê ainda um método para preparar uma composição de vacina, compreendendo preparar uma emulsão como descrito acima e combinando a emulsão com um antígeno.

[012] A presente invenção provê ainda um método para preparar um kit de vacina compreendendo preparar uma emulsão como descrito acima e embalar a emulsão em um kit como um componente de kit juntamente com um componente de antígeno.

[013] A presente invenção provê ainda esqualeno preparado de acordo com os métodos da presente invenção.

[014] A presente invenção provê ainda uma emulsão de óleo em água compreendendo esqualeno preparado de acordo com os métodos da presente invenção.

[015] A presente invenção provê ainda uma vacina compreendendo esqualeno preparado de acordo com os métodos da presente invenção.

[016] A presente invenção provê ainda o uso de esqualeno preparado de acordo com os métodos da presente invenção em uma vacina.

Destilação de purificação

[017] A composição compreendendo esqualeno pode ser derivada de qualquer fonte apropriada, por exemplo, escumas de sabão líquido preto; sabão de talóleo; talóleo bruto; piche de talóleo; óleo de cana de açúcar; resíduos de extração, retirada de goma e refino de óleos e gorduras; resíduos de destilação de ácidos graxos e ésteres; destilados de desodorização de óleos vegetais; azeite; óleo de soja; óleo de farelo de arroz; óleo de fígado de tubarão; sebo de carne de boi; óleo de café; óleo de peixe; óleo de fígado de bacalhau; óleo de germe de trigo; óleo de germe de milho; óleos de palma; óleos de andiroba; e óleo de resíduos de tomate. Em particular, a composição compreendendo esqualeno pode ser derivada de óleo de fígado de tubarão.

[018] A destilação de purificação remove impurezas de uma composição compreendendo esqualeno para produzir uma composição purificada. A composição compreendendo esqualeno é genericamente um líquido. Antes da destilação de purificação, a composição compreendendo esqualeno pode conter impurezas como esqualamina; alquil gliceróis; ácidos graxos (por exemplo, ácidos graxos ômega 3); vitaminas A e D; prístina; triglicerídeos; éteres de glicerol e alcoóis graxos.

[019] A destilação de purificação é realizada em uma temperatura T1, em que T1 pode ser suficiente para fazer com que esqualeno entre em ebulição, isto é, T1 pode ser maior ou igual ao ponto de ebulição de esqualeno. O ponto de ebulição de esqualeno é 429 - 430°C a 760 mmHg (isto é, 1 atmosfera (101,325 kPa)).

[020] O ponto de ebulição de um líquido é a temperatura na qual a pressão de vapor da fase de líquido de um composto é igual à pressão externa que atua sobre a superfície do líquido. Portanto, o ponto de ebulição de esqualeno, e conseqüentemente o limite inferior de T1, dependerá da pressão externa atuando sobre a superfície da composição compreendendo esqualeno. Esse fenômeno é bem conhecido na técnica e a pessoa versada seria capaz de calcular o ponto de ebulição observado de esqualeno em uma dada pressão de destilação utilizada. Alternativamente, a pessoa versada seria capaz de calcular a pressão de destilação exigida com base em um ponto de ebulição observado desejado, de esqualeno. Tais cálculos podem ser realizados utilizando um nomógrafo.

[021] Em uma modalidade, a destilação de purificação pode ser realizada em uma temperatura de pelo menos 70°C, por exemplo, pelo menos 75°C, ou pelo menos 80°C. Em outra modalidade, a destilação de purificação pode ser realizada em uma temperatura menor do que 140°C, por exemplo, menor do que 130°C, menor do que 120°C, menor do que 110°C, menor do que 100°C, menor do que 95°C, menor do que 90°C, ou menor do que 85°C.

[022] Em uma modalidade, a destilação de purificação pode ser realizada quase em vácuo. Em particular, a destilação de purificação pode ser realizada em uma pressão de pelo menos 0,5 µmHg (66,6 x 10-3 Pa), por exemplo, pelo menos 0,75 µmHg (99,9 x 10-3 Pa), ou pelo menos 1 µmHg (133,3 x 10-3 Pa) . A destilação de purificação pode ser realizada em uma pressão menor do que 5 µmHg (666,6 x 10-3 Pa), por exemplo, menor do que 2,5 µmHg (333,3 x 10-3 Pa), ou menor do que 2 µmHg (266,6 x 10-3 Pa).

[023] Modalidades adicionais da presente invenção compreendem combinações das temperaturas mínima e máxima e pressões mínima e máxima mencionadas acima.

[024] A destilação de purificação pode resultar em uma composição que compreende pelo menos 95% de esqualeno, por exemplo, pelo menos 96% de esqualeno, pelo menos 95% de esqualeno, pelo menos 98% de esqualeno, pelo menos 99% de esqualeno, pelo menos 99,5% de esqualeno, pelo menos 99,8% de esqualeno, pelo menos 99,9% de esqualeno, ou mesmo 100% de esqualeno.

[025] Todas as percentagens citadas aqui são percentagens em peso e podem ser medidas utilizando cromatografia de gás (GC). Uma técnica GC pode ser conduzida por injetar uma amostra de esqualeno em hexano sobre um cromatografo de gás equipado com um detector de ionização de chama (FID). A análise pode ser realizada em uma coluna capilar de 30 m x 0,32 mm x 0,50 mm mantida a 200°C por 2 minutos e então elevada a 12°C por minuto até 310°C, onde é retida por 9 minutos. O orifício de injeção e o FID são mantidos a 300°C e 320°C respectivamente. A identidade do pico de esqualeno é estabelecida utilizando GC/MS (cromatografia de gás utilizando um detector seletivo de massa) . Pureza é reportada como a área do pico de esqualeno como uma percentagem da soma das áreas de todos os picos no cromatograma.

[026] A destilação de purificação pode ser realizada antes da destilação de desnaturação, resultando em uma composição purificada. Alternativamente, a destilação de purificação pode ser realizada após a destilação de desnaturação, resultando em uma composição purificada, desnaturada.

Destilação de desnaturação

[027] Tubarões, e portanto esqualeno derivado de óleo de fígado de tubarão, podem conter proteínas às quais seres humanos são alérgicos. Uma proteína de peixe comum a qual humanos podem ser alérgicos é parvalbumina, que é encontrada em tubarões. Além disso, proteínas contaminantes ou materiais podem ter sido introduzidos na composição de esqualeno, por exemplo, após a destilação de purificação ou como produtos de degradação do esqualeno. Proteínas contaminantes possíveis ou materiais incluem acetona, acetaldeído, formaldeído e água. Vantajosamente, a etapa de destilação de desnaturação desnatura e/ou remove proteínas, em particular parvalbumina e quaisquer proteínas contaminantes, da composição compreendendo esqualeno, desse modo fornecendo uma composição desnaturada. Uma vantagem adicional do método da presente invenção é que a destilação de desnaturação pode assegurar que quaisquer vírus em potencial presentes na composição compreendendo esqualeno são inativados e/ou removidos da composição purificada. A composição desnaturada é portanto mais segura para uso humano do que uma composição não desnaturada.

[028] Sem desejar ser limitado por teoria, o ponto de ebulição de esqualeno dependerá da pressão externa atuando sobre a superfície da composição compreendendo esqualeno. Entretanto, a temperatura na qual quaisquer proteínas presentes na composição compreendendo esqualeno serão desnaturadas é genericamente independente da pressão externa que atua sobre a superfície da composição compreendendo esqualeno. Portanto, a destilação de desnaturação pode ser realizada em uma temperatura específica, independente da pressão sob a qual a destilação é realizada. Em particular, a destilação de desnaturação pode ser realizada em uma temperatura T2, em que T2 pode ser maior do que ou igual a 200°C, por exemplo, maior do que ou igual a 205°C, maior do que ou igual a 210 °C, maior do que ou igual a 215°C, maior do que ou igual a 220°C, maior do que ou igual a 230°C, maior do que ou igual a 240°C, maior do que ou igual a 250°C, ou maior do que ou igual a 260°C.

[029] A destilação de desnaturação pode ser realizada em uma temperatura menor do que 500°C, por exemplo, menor do que 480°C, menor do que 450°C, menor do que 420°C, menor do que 400°C, menor do que 350°C, ou menor do que 300°C.

[030] A destilação de desnaturação pode ser realizada em quase vácuo. Em particular, a destilação de desnaturação pode ser realizada em uma pressão de pelo menos 0,5 mmHg (66,6 Pa), por exemplo, pelo menos 0,6 mmHg (79,9 Pa), pelo menos 0,7 mmHg (93,3 Pa), ou pelo menos 0,8 mmHg (106,7 Pa). A destilação de desnaturação pode ser realizada em uma pressão menor do que 5 mmHg (666,6 Pa), por exemplo, menor do que 4 mmHg (533,3 Pa), menor do que 3 mmHg (400 Pa), menor do que 2 mmHg (266,6 Pa), menor do que 1,5 mmHg (200 Pa), menor do que 1 mmHg (133,3 Pa) ou menor do que 0,9 mmHg (120 Pa).

[031] Modalidades adicionais da presente invenção compreendem combinações das temperaturas mínima e máxima e pressões mínima e máxima mencionadas acima.

[032] Para realizar a destilação de desnaturação em tal temperatura elevada, pode ser vantajoso utilizar um aparelho no qual a composição compreendendo esqualeno seja colocada em contato com uma superfície quente. A superfície quente pode ser mantida na temperatura T2, como definido acima, e a pressão em volta da superfície quente pode ser a pressão definida acima para a destilação de desnaturação. A pressão em volta da superfície quente pode ser selecionada para assegurar que o ponto de ebulição observado de esqualeno seja T2 ou menos. À medida que a composição compreendendo esqualeno é contatada com a superfície quente, aqueles componentes da composição, incluindo esqualeno, cujo ponto de ebulição está abaixo T2 na pressão em volta da superfície quente volatilizarão. Componentes não voláteis, por exemplo, proteínas, permanecem na superfície quente e podem ser desnaturadas e separadas do esqualeno.

[033] Antes da destilação de desnaturação, a composição compreendendo esqualeno pode compreender 85% a 99,9% de esqualeno, por exemplo de 90% a 99,5% de esqualeno, de 95% a 99,5% de esqualeno, ou de 97% a 99,5% de esqualeno.

[034] A destilação de desnaturação pode produzir uma composição de esqualeno tendo uma percentagem mais elevada de esqualeno. Em particular, os produtos de destilação de desnaturação podem resultar em uma composição desnaturada que compreende pelo menos 95% de esqualeno, por exemplo, pelo menos 99% de esqualeno, pelo menos 99,5% de esqualeno, pelo menos 99,9% de esqualeno ou mesmo 100% de esqualeno.

[035] A destilação de desnaturação pode resultar em uma composição desnaturada compreendendo menos de 0,5% de proteína, por exemplo, menos de 0,1% de proteína, menos de 0,01% de proteína ou 0% de proteína. Portanto, a presente invenção provê esqualeno compreendendo menos de 0,5% de proteína, por exemplo, menos de 0,1% de proteína, menos de 0,01% de proteína ou 0% de proteína.

[036] Em uma modalidade, a destilação de desnaturação pode ser realizada após a destilação de purificação, resultando em uma composição desnaturada, purificada.

[037] T2 pode ser maior do que T1. Em particular, T2 -T1 pode ser de 10°C a 300°C, por exemplo, de 30°C a 250°C, de 50°C a 200°C, ou de 80°C a 150°C.

Solventes

[038] Para evitar a introdução de impurezas na composição compreendendo esqualeno, que é particularmente importante se a composição de esqualeno for destinada a uso em vacinas, as destilações de purificação e desnaturação podem ser realizadas sem a adição de solventes.

Saponificação

[039] A composição compreendendo esqualeno pode ser submetida à saponificação. Saponificação normalmente será realizada antes das etapas (a) e (b) de destilação, discutidas acima. Alternativamente, a saponificação pode ser realizada entre as etapas (a) e (b) de destilação, em qualquer ordem que sejam realizadas. Alternativamente, porém incomumente, a saponificação pode ser realizada após as etapas de destilação (a) e (b) . A saponificação pode destruir proteínas presentes na composição compreendendo esqualeno. Entretanto, a saponificação não pode remover todas as proteínas presentes. Quaisquer proteínas residuais que permanecem na composição compreendendo esqualeno após saponificação podem ser removidas através de uma etapa de destilação de desnaturação. A combinação de saponificação e destilação de desnaturação é vantajosa visto que melhora as chances de que o esqualeno não contenha nenhuma proteína.

[040] Saponificação é a hidrólise de um éster sob condições básicas para formar um álcool e o sal de um ácido carboxílico. Durante saponificação da composição compreendendo esqualeno, uma base (por exemplo, NaOH ou KOH) é adicionado à composição que pode fazer com que os ésteres de ácido graxo (por exemplo, os triglicerídeos) convertam em sabão. Saponificação pode ser vantajoso porque pode aumentar a diferença entre os pontos de ebulição dos produtos saponificados e os pontos de ebulição dos produtos não saponificados, tornando a separação por destilação, por exemplo, a destilação de purificação e/ou desnaturação, mais eficiente. Alternativamente, os produtos saponificados podem ser removidos por outro meio, por exemplo, por centrifugação.

[041] A remoção dos ésteres de ácido graxo por saponificação pode resultar em uma composição saponificada compreendendo esqualeno, que pode ser de pureza aperfeiçoada (isto é, uma % mais elevada de esqualeno) em comparação com a composição não saponificada compreendendo esqualeno.

Caracterização de esqualeno

[042] O esqualeno produzido pelo método da presente invenção pode ter um valor de saponificação menor do que 4 mg/ml, por exemplo, menor do que 3 mg/ml, menor do que 2 mg/ml, ou menor do que 1 mg/ml. Essa medição indica a quantidade de espécie saponificável presente no esqualeno. O valor de saponificação pode ser determinado como os equivalentes de hidrólise e neutralização de hidróxido de sódio como descrito em US Pharmacopeia (USP) <401>. Um valor de saponificação obtido utilizando NaOH pode ser convertido em valores KOH por multiplicar o mesmo pela razão dos pesos moleculares de KOH e NaOH (1,403).

[043] O esqualeno produzido pelo método da presente invenção pode ter um valor ácido menor ou igual a 1 mg KOH/g, por exemplo menor ou igual a 0,8 mg KOH/g, menor ou igual a 0,6 mg KOH/g, menor ou igual a 0,5 mg KOH/g, menor ou igual a 0,4 mg KOH/g, menor ou igual a 0,2 mg KOH/g, menor ou igual a 0,1 mg KOH/g, menor ou igual a 0,05 mg KOH/g, menor ou igual a 0,03 mg KOH/g, menor ou igual a 0,02 mg KOH/g, menor ou igual a 0,01 mg KOH/g. o valor ácido pode ser determinado como os equivalentes de neutralização de hidróxido de potássio consumido por esqualeno como descrito em USP <401>.

Emulsões de óleo em água

[044] Após a composição compreendendo esqualeno ter sido preparada como descrito acima, pode ser utilizada para preparação de produtos à jusante, por exemplo, remédios, adjuvantes de emulsão de óleo em água, etc.

[045] Para evitar contaminação, é preferível que esqualeno seja mantido estéril após tratamento de destilação e antes da preparação do produto à jusante. Por exemplo, se o produto à jusante for uma emulsão, os aparelhos de emulsão e destilação poderiam formar um sistema fechado para evitar contaminação do esqualeno antes da formação da emulsão. Alternativamente ou além disso, o esqualeno poderia ser mantido sob uma atmosfera inerte, por exemplo, nitrogênio, antes da preparação do produto à jusante.

[046] Verificou-se que emulsões de óleo em água são particularmente apropriadas para uso em colocar adjuvantes em vacinas. Emulsões preparadas de acordo com a invenção incluem esqualeno e pelo menos um tensoativo, além de um componente aquoso. As emulsões podem conter óleos adicionais. Idealmente, o(s) óleo(s) e tensoativo(s) são biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis.

[047] Combinações de óleo de esqualeno e tocoferois podem ser utilizadas. Onde uma composição inclui um tocoferol, quaisquer dos tocoferois a, β, γ, δ, ε ou ξ podem ser utilizados. Um a-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol. O tocoferol pode assumir várias formas, por exemplo, sais e/ou isômeros diferentes. Sais incluem sais orgânicos, como succinato, acetato, nicotinato, etc. se um sal de um tocoferol for utilizado, o sal preferido é o succinato. Uma combinação de óleo compreendendo esqualeno e um tocoferol (por exemplo, DL-a-tocoferol) é útil.

[048] Um teor de óleo na faixa de 2-20% (em volume) é típico.

[049] O componente aquoso pode ser água pura (por exemplo, w.f.i.) ou pode incluir componentes adicionais, por exemplo, solutos. Por exemplo, pode incluir sais para formar um tampão, por exemplo, sais de citrato ou fosfato, como sais de sódio. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Tampões serão tipicamente incluídos na faixa de 5-20 mM.

[050] O tensoativo é preferivelmente biodegradável (metabolizável) e biocompatível. Tensoativos podem ser classificados por seu 'HLB' (equilíbrio de hidrófilo/liófilo), onde um HLB na faixa de 1-10 significa genericamente que o tensoativo é mais solúvel em óleo do que em água, e um HLB na faixa de 10-20 é mais solúvel em água do que em óleo. Emulsões compreendem, preferivelmente, pelo menos um tensoativo que tem um HLB de pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 15, ou preferivelmente pelo menos 16.

[051] A invenção pode ser utilizada com tensoativos incluindo, porém não limitado a: tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comumente mencionados como Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) , e/ou óxido de butileno (BO) , vendido sob o nome comercial DOWFAX™, como copolímeros de bloco EO/PO; octoxinois, que podem variar no número de grupos de etoxi de repetição (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octil fenoxi polietoxi etanol) sendo de interesse específico; (octilfenoxi) polietoxi etanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídios como fosfatidil colina (lecitina); éteres graxos de polioxietileno derivados de alcoóis de lauril, cetil, estearil e oleíl (conhecidos como tensoativos Brij), como éter de trietileno glicol monolauril (Brij 30); éter de polioxietileno-9-lauril; e ésteres de sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Tensoativos preferidos para inclusão na emulsão são polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.

[052] As misturas de tensoativos podem ser incluídas na emulsão, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85, ou misturas de Tween 80/Triton-X100. Uma combinação de um éster de sorbitano polioxietileno como monooleato de sorbitano polioxietileno (Tween 80) e um octoxinol como t-octil fenoxi-polietoxietanol (Triton X-100) também é apropriado. Misturas úteis podem compreender um tensoativo com um valor HLB na faixa de 10-20 (por exemplo, Tween 80, com um HLB de 1,50) e um tensoativo com um valor de HLB na faixa de 1-10 (por exemplo, Span 85, com um HLB de 1,8).

[053] Quantidades preferidas de tensoativos (% em peso) são: ésteres de polioxietileno sorbitano (como Tween 80) 0,01 a 2%; octil ou nonil fenoxi polioxietanois (como Triton X-100, ou outros detergentes da série Triton) 0,001 a 0,1% de éteres de polioxietileno (como laureth 9) 0,1 a 20%.

[054] Emulsões de óleo em água contendo esqualeno contendo tensoativo polisorbato 80 são preferidas.

[055] A emulsão de óleo em água pode ser fabricada utilizando um método compreendendo as etapas de: (i) preparação de uma primeira emulsão tendo um primeiro tamanho de gotícula de óleo média, também conhecida como emulsão preliminar ou uma pré-emulsão; (ii) microfluidificação da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão tendo um segundo tamanho de gotícula de óleo média que é menor do que o primeiro tamanho de gotícula de óleo média; e (iii) filtração da segunda emulsão. A primeira emulsão pode ser preparada através de homogeneização.

[056] As gotículas de óleo na emulsão são genericamente menores do que 5 µm em diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro de sub-micron, com esses tamanhos pequenos sendo convenientemente obtidos com um microfluidificador para fornecer emulsões estáveis. Gotículas com um tamanho menor do que 220 nm são preferidas pois podem ser submetidas à esterilização de filtro.

[057] Adjuvantes específicas de emulsão de óleo em água que podem ser feitos utilizando esqualeno preparado de acordo com a invenção incluem, porém não são limitados a:

. uma emulsão de esqualeno, polisorbato 80 (Tween 80), e trioleato de sorbitano (Span 85). A composição da emulsão em volume pode ser aproximadamente 5% de esqualeno, aproximadamente 0,5% de polisorbato 80 e aproximadamente 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas razões se tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polisorbato 80 e 0,48% de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como 'MF59' [4-6], como descrito em mais detalhe no capítulo 10 da ref. 7 e capítulo 12 da ref. 8. A emulsão MF59 inclui vantajosamente íons de citrato, por exemplo, tampão de citrato de sódio de 10 mM.
. uma emulsão de esqualeno, um tocoferol (idealmente, DL-a-tocoferol) e polisorbato 80. Essas emulsões podem ter (em peso) de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de polisorbato 80, por exemplo 4,3% de esqualeno, 4,7% de tocoferol e 1,9% de polisorbato 80. A razão em peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente ≤ 1 (por exemplo, 0,90) visto que isso pode fornecer uma emulsão mais estável. Esqualeno e polisorbato 80 podem estar presentes em uma razão de volume de aproximadamente 5:2 ou em uma razão de peso de aproximadamente 11:5. Tal emulsão pode ser feita por dissolver polisorbato 80 em P BS para fornecer uma solução a 2%, a seguir misturando 90 ml dessa solução com uma mistura de 95 g de DL-a-tocoferol e 5 ml de esqualeno), a seguir microfluidificando a mistura. A emulsão resultante tem gotículas de óleo de submicron, por exemplo, com um diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente aproximadamente 180 nm. A emulsão também pode incluir um lipídeo monofosforila 3-de-O-acilado A (3d-MPL) . Outra emulsão útil desse tipo pode compreender, por dose humana, 0,5 - 10 mg de esqualeno, 0,5 - 11 mg de tocoferol, e 0,1 - 4 mg de polisorbato 80 [9].
. uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão também pode incluir um 3d-MPL. A emulsão pode conter um tampão de fosfato.
. uma emulsão compreendendo esqualeno, um polisorbato (por exemplo, polisorbato 80) , um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de a-tocoferol). A emulsão pode incluir esses três componentes em uma razão de massa de aproximadamente 75:11:10 (por exemplo, 750 µg/ml de polisorbato 80, 110µg/ml de Triton X-100 e 100 µg/ml de succinato de a-tocoferol), e essas concentrações devem incluir qualquer contribuição desses componentes a partir de antígenos. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL. A emulsão também pode incluir uma saponina, como QS21. A fase aquosa pode conter um tampão de fosfato.
. um emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um tensoativo não iônico hidrofílico de éter de alquila polioxietileno (por exemplo, polioxietileno (12) éter cetoestearila) e um tensoativo não iônico hidrofóbico (por exemplo, um éster de sorbitano ou éster de amida, como monoleato de sorbitano ou 'Span 80') . A emulsão é preferivelmente termorreversível e/ou tem pelo menos 90% das gotículas de óleo (por volume) com um tamanho menor do que 200 nm [10]. A emulsão pode também incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotetor (por exemplo, um açúcar, como dodecil maltoside e/ou sacarose); e/ou um alquil poliglicosídeo. A emulsão pode incluir um agonista TLR4 [11]. Tais emulsões podem ser liofilizadas.
. uma emulsão de esqualeno, poloxâmero 105 e Abil-Care [12]. A concentração final (peso) desses componentes em vacinas com adjuvante é 5% de esqualeno, 4% de poloxâmero 105 (poliol plurônico) e 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerídeo caprico/caprílico).

[058] As composições dessas emulsões, expressas acima em termos de percentagem, podem ser modificadas por diluição ou concentração (por exemplo, por um número inteiro, como 2 ou 3 ou por uma fração, como 2/3 ou %) em que suas razões permanecem iguais. Por exemplo, um MF59 concentrado 2 vezes teria aproximadamente 10% de esqualeno, aproximadamente 1% de polisorbato 80 e aproximadamente 1% de trioleato de sorbitano. Formas concentradas podem ser diluídas (por exemplo, com uma solução de antígeno) para fornecer uma concentração final desejada de emulsão.

[059] Emulsões da invenção são armazenadas de forma ideal entre 2°C e 8°C. Elas não devem ser congeladas. Devem ser mantidas idealmente fora de luz direta. Em particular, emulsões e vacinas contendo esqualeno da invenção devem ser protegidas para evitar ruptura fotoquímica de esqualeno. Se emulsões da invenção forem armazenadas então isso é preferivelmente em uma atmosfera inerte, por exemplo, N2 ou argônio.

Vacinas

[060] Embora seja possível administrar adjuvantes de emulsão de óleo em água sozinhos em pacientes (por exemplo, para fornecer um efeito adjuvante para um antígeno que foi separadamente administrado ao paciente) , é mais comum misturar o adjuvante com um antígeno antes da administração, para formar uma composição imunogênica, por exemplo, uma vacina. A mistura de emulsão e antígeno pode ocorrer extemporaneamente no momento de uso, ou pode ocorrer durante fabricação da vacina, antes do enchimento. Os métodos da invenção podem ser aplicados nas duas situações.

[061] Desse modo, um método da invenção pode incluir uma etapa de processo adicional de misturar uma emulsão compreendendo esqualeno preparado de acordo com a presente invenção com um componente de antígeno. Como alternativa, pode incluir uma etapa adicional de acondicionar o adjuvante em um kit como um componente de kit juntamente com um componente de antígeno.

[062] No geral, portanto, a invenção pode ser utilizada ao preparar vacinas misturadas ou ao preparar kits incluindo antígenos e adjuvante pronto para mistura. Onde mistura ocorre durante fabricação então os volumes de antígeno a granel e emulsão que são misturados serão tipicamente maiores do que 1 litro, por exemplo, ≥ 5 litros, ≥ 10 litros, ≥ 20 litros, ≥ 50 litros, etc. onde a mistura ocorre no ponto de uso então os volumes que são misturados serão tipicamente menores do que 1 mililitro, por exemplo, ≤ 0,6 ml, ≤ 0,5 ml, ≤0,4 ml, ≤ 0,3 ml, ≤ 0,2 ml, etc. nos dois casos, é comum para volumes substancialmente iguais de emulsão e solução de antígeno serem misturados, isto é, substancialmente, 1:1 (por exemplo, entre 1,1:1 e 1:1,1, preferivelmente entre, 1,06:5 e 1:1,05, e mais preferivelmente entre 1,025:1 e 1:1,025). Em algumas modalidades, entretanto, um excesso de emulsão ou um excesso de antígeno pode ser utilizado [13]. Onde um volume em excesso de um componente é utilizado, o excesso será genericamente pelo menos 1,5:1, por exemplo, ≥ 2:1, ≥2,5:1, ≥3:1, ≥ 4:1, ≥ 5:1, etc.

[063] Onde antígeno e adjuvante são apresentados como componentes separados em um kit, são fisicamente separados entre si no kit, e essa separação pode ser obtida em vários modos. Por exemplo, os componentes podem estar em recipientes separados, como frascos. O conteúdo de dois frascos pode ser então misturado quando necessário, por exemplo, por remover o conteúdo de um frasco e adicionar os mesmos ao outro frasco, ou por separadamente remover o conteúdo dos dois frascos e misturar os mesmos em um terceiro recipiente.

[064] Em outro arranjo, um dos componentes do kit está em uma seringa e o outro está em um recipiente como um frasco. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir seu conteúdo no frasco para misturar, e a mistura pode ser então retirada para dentro da seringa. O conteúdo misturado da seringa pode ser então administrado a um paciente, tipicamente através de uma agulha estéril nova. O acondicionamento de um componente em uma seringa elimina a necessidade de utilizar uma seringa separada para administração no paciente.

[065] Em outro arranjo preferido, os dois componentes do kit são mantidos juntos porém separadamente na mesma seringa, por exemplo, uma seringa de câmara dual, como aquelas reveladas nas referências 14-21, etc. quando a seringa é acionada (por exemplo, durante administração em um paciente), então o conteúdo das duas câmaras é misturado. Esse arranjo evita a necessidade de uma etapa de mistura separada no momento de uso.

[066] O conteúdo dos vários componentes de kit estará genericamente todos em forma líquida. Em alguns arranjos, um componente (tipicamente o componente de antígeno em vez do componente de emulsão) está em forma seca (Por exemplo, em uma forma liofilizada), com o outro componente estando em forma líquida. Os dois componentes podem ser misturados para reativar o componente seco e fornecer uma composição líquida para administração a um paciente. Um componente liofilizado será tipicamente localizado em um frasco em vez de uma seringa. Componentes secos podem incluir estabilizadores como lactose, sacarose ou manitol, bem como misturas dos mesmos, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. um arranjo possível utiliza um componente de emulsão líquido em uma seringa cheia previamente e um componente de antígeno liofilizado em um frasco.

[067] Se vacinas contiverem componentes além de emulsão e antígeno, então esses componentes adicionais podem ser incluídos em um desses componentes de dois kits, ou podem fazer parte de um componente de terceiro kit.

[068] Recipientes apropriados para vacinas misturadas da invenção ou para componentes de kits individuais, incluem frascos e seringas descartáveis. Esses recipientes devem ser estéreis.

[069] Onde uma composição/componente é localizada em um frasco, o frasco é preferivelmente feito de um vidro ou material de plástico. O frasco é preferivelmente esterilizado antes da composição ser adicionada ao mesmo. Para evitar problemas com pacientes sensíveis a látex, os frascos são preferivelmente vedados com uma rolha isenta de látex, e a ausência de látex em todo material de embalagem é preferida. Em uma modalidade, um frasco tem uma rolha de borracha de butila. O frasco pode incluir uma dose única de vacina/componente, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco de 'multidoses'), por exemplo, 10 doses. Em uma modalidade, um frasco inclui 10 x 0,25 ml de doses de emulsão. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

[070] Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, uma trava Luer) adaptado de tal modo que uma seringa cheia previamente possa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode ser expelido para dentro do frasco (por exemplo, para reconstituir material liofilizado no mesmo) e o conteúdo do frasco pode ser removido de volta para dentro da seringa. Após remoção da seringa a partir do frasco, uma agulha pode ser então anexada e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa é preferivelmente localizada dentro de uma vedação ou cobertura, de tal modo que a vedação ou cobertura tenha de ser removida antes que a tampa possa ser acessada.

[071] Onde uma composição/componente é embalada em uma seringa, a seringa não terá normalmente uma agulha anexada à mesma, embora uma agulha separada possa ser fornecida com a seringa para montagem e uso. Agulhas de segurança são preferidas, agulhas de 1 polegada calibre 23, 1 polegada calibre 25 e 5/8 de polegada calibre 25 são típicas. Seringas podem ser dotadas de rótulos de desprender nos quais o número de lote, temporada de influenza e data de validade do conteúdo podem ser impressos, para facilitar manter registro. O êmbolo na seringa tem, preferivelmente, uma rolha para evitar que o êmbolo seja acidentalmente removido durante aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ou êmbolo de borracha de látex. Seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa terá genericamente uma tampa de ponta para vedar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa de ponta é preferivelmente feita de uma borracha de butila. Se a seringa e agulha forem acondicionadas separadamente então a agulha é preferivelmente adaptada com um protetor de borracha de butila.

[072] A emulsão pode ser diluída com um tampão antes do acondicionamento em um frasco ou uma seringa. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Diluição pode reduzir a concentração dos componentes de adjuvante enquanto retém suas proporções relativas, por exemplo, para fornecer um adjuvante de "meia resistência".

[073] Os recipientes podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar fornecimento a crianças. Por exemplo, uma seringa contendo uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostra um volume de 0,25 ml.

[074] Onde um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é utilizado, então se prefere utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal de soda.

[075] Vários antígenos podem ser utilizados com emulsões de óleo em água, incluindo porém não limitado a: antígenos virais, como proteínas de superfície viral; antígenos bacterianos, como antígenos de proteína e/ou sacarídeo; antígenos de fungo; antígenos de parasita; e antígenos de tumor. A invenção é particularmente útil para vacinas contra vírus da influenza, HIV, ancilóstomo duodenal, vírus de hepatite B, vírus de herpes simplex, raiva, vírus sincicial respiratório, citomegalovirus, Staphylococcus aureus, clamídia, coronavirus SARS, vírus de varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus antracis, vírus Epstein Barr, papilomavírus humano, etc. por exemplo:

. antígenos de vírus de influenza. Esses podem ter a forma de um vírus vivo ou um vírus inativado. Onde um vírus inativado é utilizado, a vacina pode compreender virion inteiro, virion dividido, ou antígenos de superfície purificada (incluindo hemaglutinina e normalmente também incluindo neuraminidase). Antígenos de influenza também podem ser apresentados na forma de virossomas. Os antígenos podem ter qualquer subtipo de hemaglutinina, selecionados de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e/ou H16. A vacina pode incluir antígeno(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas de vírus de influenza, incluindo vírus de influenza A e/ou vírus de influenza B, por exemplo, uma vacina A/H5N1 ou A/H1N1 monovalente, ou uma vacina A/H1N1 + A/H3N2 + B trivalente. O vírus de influenza pode ser uma cepa reordenada, e pode ter sido obtida por técnicas de genética inversa [por exemplo, 22-26]. Desse modo, o vírus pode incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de uma cepa de vacina, isto é uma reordenada 6:2). Os vírus utilizados como a fonte dos antígenos podem ser crescidos em ovos (por exemplo, ovos de galinha embrionados) ou em cultura de célula. Onde cultura de célula é utilizada, o substrato de célula será tipicamente uma linhagem de células de mamíferos, como MDCK; CHO; 2 93T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38, etc. linhagens de células de mamíferos preferidas para crescimento de vírus de influenza incluem: células MDCK [27-30] , derivadas de rim canino Madin Darby; células Vero [31-33] derivadas de rim de macaco verde africano; ou células PER.C6 [34], derivadas de retinoblastos embriônicos humanos. Onde vírus foi cultivado em uma linhagem de células de mamífero então a composição será vantajosamente isenta de proteínas de ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucoide) e de DNA de galinha, desse modo reduzindo alergenicidade. Doses unitária de vacina são tipicamente padronizadas por referência a teor de hemaglutinina (HA), tipicamente medido por SRID. Vacinas existentes contêm, tipicamente, aproximadamente 15 µg de HA por cepa, embora doses inferiores possam ser utilizadas, particularmente ao utilizar um adjuvante. Doses fracionais como ½ (isto é, 7,5 μ9 de HA por cepa), ¼ e 1/8 foram utilizadas [35, 36] como também doses mais elevadas (por exemplo, 3x ou 9x doses [37, 38]) . Desse modo, vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 μg de HA por cepa de influenza, preferivelmente entre 0,1 e 50 μg, por exemplo, 0,1 - 20 μg, 0,1 - 15 μg, 0,1-10 μg, 0,1-7,5 μg, 0,5 - 5 μ9, etc. Doses específicas incluem, por exemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,75, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,5 etc., por cepa.
. vírus de imunodeficiência humana incluindo HIV-1 e HIV-2. O antígeno será tipicamente um antígeno de envelope.
. antígenos de superfície de vírus de hepatite B. esse antígeno é preferivelmente obtido por métodos de DNA recombinantes, por exemplo, após expressão em uma levedura de Saccharomyces cerevisiae. Ao contrário de HBsAg viral nativo, o antígeno expresso em levedura recombinante é não glicosilado. Pode estar na forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de aproximadamente 20 nm), incluindo uma matriz de lipídeo que compreende fosfolipídios. Ao contrário de partículas de HBsAg nativas, as partículas expressas em levedura podem incluir fosfatidilinositol. O HBsAg pode ser de quaisquer dos subtipos ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq-e adrq+.
. ancilóstomo duodenal. Particularmente como visto em caninos (Ancylostoma caninum). Esse antígeno pode ser Ac-MTP-1 recombinante (metaloprotease semelhante à astacin) e/ou um hemoglobinase aspártico (Ac-APR-1) que pode ser expresso em um sistema de célula de inseto/baculovirus como uma proteína secretada [39,40] .
. antígenos de vírus de herpes simplex (HSV). Um antígeno de HSV preferido para uso com a invenção é glicoproteína de membrana gD. Prefere-se utilizar gD de uma cepa HSV-2 antígeno 'gD2'). A composição pode utilizar uma forma de gD na qual a região de âncora de membrana terminal-C foi deletada [41], por exemplo, um gD truncado compreendendo aminoácidos 1-306 da proteína natural com a adição de aparagina e glutamina na extremidade C. essa forma da proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para fornecer uma proteína de 283 aminoácidos madura. A deleção da âncora permite que a proteína seja preparada em forma solúvel.
. antígenos de papilomavírus humano (HPV). Antígenos HPV preferidos para uso com a invenção são proteínas de capsídeo L1, que podem montar para formar estruturas conhecidas como partículas semelhantes a vírus (VLPs). Os VLPs podem ser produzidos por expressão recombinante de L1 em células de levedura (por exemplo, em S. cerevisiae) ou em células de insetos (por exemplo, em células Spodoptera, como S. frugiperda ou em células Drosophila). Para células de levedura, vetores de plasmídeo podem carregar o(s) gene(s) L1; para células de insetos, vetores de baculovirus podem carregar o(s) gene(s) L1. Mais preferivelmente, a composição inclui VLPs L1 das cepas tanto HPV-16 e HPV-18. Essa combinação bivalente foi mostrada ser altamente eficaz [42] . Além de cepas HPV-16 e HPV-18, também é possível incluir VLPs L1 de cepas HPV-6 e HPV-11. O uso de cepas HPV oncogênicas também é possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60 µg/ml (por exemplo, aproximadamente 40 µg/ml) de L1 por cepa de HPV.
. antígenos antraz. Antraz é causado por Bacillus antracis. Antígenos de B. anthracis apropriados incluem componentes-A (fator letal (LF) e fator de edema (EF)), os quais podem ambos compartilhar um componente-B comum conhecido como antígeno de proteção (PA) . Os antígenos podem ser opcionalmente desintoxicados. Detalhes adicionais podem ser encontrados nas referências [43 a 45].
. antígenos de S. aureus. Uma variedade de antígenos S. aureus é conhecida. Antígenos apropriados incluem sacarídeos capsulares (por exemplo, de uma cepa do tipo 5 e/ou tipo 8) e proteínas (por exemplo, IsdB, H1a, etc.) . antígenos de sacarídeo capsular são idealmente conjugados com uma proteína portadora.
. antígenos de S. pneumoniae. Uma variedade de antígenos de S. pneumoniae é conhecida. Antígenos apropriados incluem sacarídeos capsulares (por exemplo, de um ou mais dos sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e/ou 23F) e proteínas (por exemplo, pneumolisina, pneumolisina desintoxicada, proteína tríade poliistidina D (PhtD), etc.), antígenos de sacarídeo capsular são idealmente conjugados com uma proteína portadora.
. antígenos de câncer. Uma variedade de antígenos específicos de tumor é conhecida. A invenção pode ser utilizada com antígenos que eliciam uma resposta imunoterapêutica contra câncer de pulmão, melanoma, câncer de mama, câncer de próstata, etc.

[076] Uma solução do antígeno será normalmente misturada com a emulsão contendo esqualeno, por exemplo, em uma razão de volume de 1:1. Essa mistura pode ser realizada por um fabricante de vacina, antes do enchimento, ou pode ser realizada no ponto de uso por um trabalhador da área de saúde.

Composições farmacêuticas

[077] Composições feitas utilizando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem incluir componentes além da emulsão contendo esqualeno e o antígeno opcional.

[078] A composição pode incluir um conservante como tiomersal ou 2-fenoxi etanol. Prefere-se, entretanto, que a vacina deva ser substancialmente isenta de (isto é, menos de 5 µg/ml) de material de mercúrio, por exemplo, isenta de tiomersal [46, 47] . Vacinas e componentes não contendo mercúrio são mais preferidas.

[079] O pH de uma composição estará genericamente entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo, entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode incluir, portanto, uma etapa de ajustar o pH da vacina antes do acondicionamento.

[080] A composição é preferivelmente estéril. A composição é preferivelmente não pirogênica, por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma media padrão) por dose, e preferivelmente <0,1 EU por dose. A composição é preferivelmente isenta de glúten.

[081] A composição pode incluir material para uma imunização única, ou pode incluir material para múltiplas imunizações (isto é, um kit de 'multidoses'). A inclusão de um conservante é preferida em arranjos de multidoses.

[082] Vacinas são tipicamente administradas em um volume de dosagem de aproximadamente 0,5 ml, embora uma meia dose (isto é, aproximadamente 0,25 ml) possa ser administrada em crianças.

Métodos de tratamento e administração da vacina

[083] A invenção provê kits e composições preparadas utilizando os métodos da invenção. As composições preparadas de acordo com os métodos da invenção são apropriadas para administração a pacientes humanos, e a invenção provê um método de originar uma resposta imune em um paciente, compreendendo a etapa de administrar tal composição ao paciente.

[084] A invenção também provê esses kits e composições para uso como medicamentos.

[085] A invenção também provê o uso de: (i) um preparado aquoso de um antígeno; e (ii) uma emulsão de óleo em água compreendendo esqualeno de acordo com a invenção, na fabricação de um medicamento para originar uma resposta imune em um paciente.

[086] A resposta imune originada por esses métodos e usos incluirá genericamente uma resposta de anticorpo, preferivelmente uma resposta de anticorpo de proteção.

[087] As composições podem ser administradas de vários modos. A via de imunização mais preferida é por injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna), porém outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea, intranasal [48-50], oral [51], intradérmica [52,53] transcutânea, transdérmica [54], etc.

[088] Vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser utilizadas para tratar tanto crianças como adultos. O paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade ou pelo menos 55 anos de idade. O paciente pode ser idoso (por exemplo, ≥ 50 anos de idade, preferivelmente ≥ 65 anos) , jovem (por exemplo, ≤ 5 anos de idade) , pacientes hospitalizados, trabalhadores da área de saúde, pessoal militar e de serviço armado, mulheres grávidas, os pacientes imunodeficientes, cronicamente doentes, e pessoas que viajam para o exterior. As vacinas não são adequadas exclusivamente para esses grupos, entretanto, e podem ser utilizados mais genericamente em uma população.

[089] As vacinas da invenção podem ser administradas em pacientes substancialmente ao mesmo tempo em que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional da área de saúde) outras vacinas.

Geral

[090] O termo "compreendendo" abrange "incluindo" bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[091] O termo "aproximadamente" em relação a um valor numérico x é opcional e significa, pro exemplo, x ± 10%.

[092] A palavra "substancialmente" não exclui "totalmente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser totalmente isenta de Y. onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

[093] A menos que especificamente mencionado, um processo compreendendo uma etapa de misturar dois ou mais componentes não exige nenhuma ordem específica de mistura. Desse modo, componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Onde há três componentes então dois componentes podem ser combinados entre si, e então a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc.

[094] As várias etapas dos métodos podem ser realizadas nos mesmos momentos ou momentos diferentes, em locais geográficos iguais ou diferentes, por exemplo, países e pelas pessoas ou entidades iguais ou diferentes.

Modos para realizar a invenção Exemplo 1

[095] A figura 1 mostra um diagrama esquemático de um aparelho de destilação que pode ser utilizado para as etapas de destilação de purificação e/ou desnaturação do método da presente invenção. O processo descrito com referência à figura 1 pode ser realizado sem a adição de qualquer solvente à composição compreendendo esqualeno. Na modalidade mostrada na figura 1, a composição compreendendo esqualeno é colocada em um recipiente de alimentação (1) coberto com nitrogênio. Uma extremidade de uma linha de entrada (3) tem um pré-filtro de polipropileno e é colocada no recipiente de alimentação, enquanto a outra extremidade da linha de entrada tem uma agulha de aço inoxidável (calibre 19) que é inserida no topo de um aparelho de destilação (5) . O aparelho de destilação compreende uma câmara (7) moldada como um tubo com um "dedo quente" cilíndrico (9) que se projeta através do centro. Benzoato de etila, que tem um ponto de ebulição de 212°C, é aquecido abaixo do dedo para fornecer calor para a parede do dedo quente. Embora benzoato de etila seja utilizado nessa modalidade, é evidente que um solvente tendo um ponto de ebulição mais elevado poderia ser utilizado para aumentar a temperatura do dedo quente. Durante destilação, o aparelho de destilação pode ser evacuado. A composição compreendendo esqualeno pode ser puxada para dentro do aparelho de destilação, por exemplo, através do uso de uma pressão inferior no aparelho de destilação, através da agulha de aço inoxidável e gotejada (11) sobre a parede aquecida do dedo quente. À medida que a composição compreendendo esqualeno é aquecida, aqueles componentes cujo ponto de ebulição está abaixo de 212°C na pressão dentro do aparelho de destilação volatilizarão. Para volatilizar esqualeno utilizando o sistema da figura 1, a pressão no aparelho de destilação deve ser selecionada para diminuir o ponto de ebulição de esqualeno para 212°C ou menos (por exemplo, aproximadamente 1,5 mmHg (200 Pa) ou menos). Os componentes volatilizados condensarão na parede externa da câmara (7), que será resfriada pelo ar ambiente, e escorrerão para baixo das paredes para dentro de um frasco de coleta (13), que também pode estar sob vácuo. Componentes não voláteis, por exemplo, proteínas permanecem na parede do dedo quente e fluem para baixo para dentro do frasco de resíduo (15). Componentes extremamente voláteis podem ser retirados através da linha de vácuo, reduzindo seus níveis no condensado de esqualeno.

[096] Esqualeno que já foi submetido à destilação de purificação foi destilado utilizando esse aparelho. Independente de fonte, o esqualeno final tinha regularmente uma pureza de >99,9%, um valor ácido de <0,03 mg KOH/g, e um valor de saponificação <2 mg/g. a destilação de desnaturação reduziu o teor de umidade do esqualeno, por exemplo, de 0,022% para 0,010%, de 0,006 para 0,005% ou de 0,010% para 0,006%.

Exemplo 2 - medição do valor de saponificação

[097] O valor de saponificação é o número de mg de hidróxido de potássio exigido para neutralizar os ácidos livres e saponificar os ésteres contidos em 1,0 g da substância.

[098] Procedimento (USP <401>: colocar 1,5 g a 2 g da substância em um frasco de 250 mL tarado, pesar precisamente, e adicionar ao mesmo 25,0 mL de um hidróxido de potássio alcoólico 0.5 N. aquecer o frasco em um banho de vapor, sob um condensador apropriado para manter refluxo por 30 minutos, girando freqüentemente o conteúdo. A seguir adicional 1 mL de fenol ftaleína TS, e titular o hidróxido de potássio em excesso com 0.5 N de ácido clorídrico VS. Realizar uma determinação modelo sob as mesmas condições. A diferença entre os volumes em mL, de 0.5 N ácido clorídrico consumido no teste efetivo e no teste modelo, multiplicado por 56,1 e a normalidade exata do 0.5N ácido clorídrico VS e dividido pelo peso em g do espécime tirado, é o valor de saponificação.

[099] Dependendo da fonte do esqualeno, um valor de saponificação de <1,4 mg/g poderia ser obtido.

Exemplo 3 - medição do valor ácido.

[100] A acidez de gorduras e óleos fixos pode ser expressa como o número de mL de 0.1 N álcali necessário para neutralizar os ácidos livres em 10,0 g de substância. O Valor ácido é o número de mg de álcali exigido para neutralizar os ácidos livres em 1,0 g da substância.

[101] Procedimento (USP <401>): dissolver aproximadamente 10,0 g da substância precisamente pesada, em 50 mL de uma mistura de volumes iguais de álcool e éter (que foi neutralizada para fenol ftaleína com 0.1 N de hidróxido de sódio) contido em um frasco. Se o espécime de teste não dissolver no solvente frio, conectar o frasco com um condensador apropriado e aquece lentamente, com agitação freqüente, até dissolução do espécime. Adicionar 1 mL de fenolftaleína TS, e titular com 0.1 N de hidróxido de sódio VS até que a solução permaneça fracamente rosa após agitar por 30 segundos. Calcular o Valor ácido. Se o volume de 0.1 N álcali VS necessário para a titulação for menor do que 2 mL, um meio de titulação mais diluído pode ser utilizado, ou o tamanho da amostra pode ser ajustado de acordo. Os resultados podem ser expressos em termos do volume de meio de titulação ou em termos do volume equivalente de 0.1 N de hidróxido de sódio.

[102] Dependendo da fonte do esqualeno, um valor ácido de 0,03 mg KOH/g poderia ser obtido.

Exemplo 4 - estudos de reforço

[103] Diversos estudos de reforço foram realizados para demonstrar a eficácia da destilação de desnaturação.

[104] Para determinar os níveis de impureza removida pela destilação de desnaturação, uma composição de esqualeno foi reforçada com quantidades especificadas de contaminantes (por exemplo, água) bem como possíveis produtos de decomposição do esqualeno (por exemplo, formaldeído, acetaldeído e acetona). As soluções reforçadas foram submetidas à destilação de desnaturação de acordo com a presente invenção e foram analisadas em relação às espécies reforçadas.

[105] 4 kg de uma composição de esqualeno foram reforçados, por exemplo, com 0,3 mL (0,2 g) de acetaldeído (>99,5% de pureza), 0,3 mL (0,2 g) de acetona (>99,9% de pureza), 0,55 mL de 37% em peso de solução aquosa de formaldeído (0,2 g) e 3,65 g de água antes de uma destilação de desnaturação como descrito no exemplo 1. O destilado foi coletado em três frações e analisado em relação às espécies reforçadas ao longo do material de partida reforçado. Os resultados são apresentados na tabela 1 abaixo:

[106] Os resultados na tabela 1 mostram que as concentrações de acetona, acetaldeído e formaldeído diminuíram, todas, após a destilação de desnaturação.

[107] Será entendido que a invenção foi descrita somente como exemplo e modificações podem ser feitas enquanto permanecem compreendidas no escopo e espírito da invenção.

Claims

Método para a fabricação de uma emulsão de óleo em água caracterizado pelo fato de que compreende:
(i) a preparação de esqualeno a partir de uma composição que compreende esqualeno de uma fonte animal por um processo compreendendo as etapas de:
- (a) uma destilação de purificação realizada em uma temperatura T1; e
- (b) uma destilação de desnaturação realizada em uma temperatura T2;
em que as etapas (a) e (b) podem ser realizadas em qualquer ordem;
T1 e T2 são suficientes para fazer com que esqualeno entre em ebulição;
T2 > T1;
T2 ≥ 2 0 0°C; e
T2 - T1 é de 50°C a 200°C;
(ii) a preparação de uma emulsão de óleo em água usando o esqualeno preparado na etapa (i).
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o esqualeno preparado na etapa (i) é mantido estéril após tratamento de destilação e antes da preparação da emulsão na etapa (ii).
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição utilizada na etapa (i) compreende uma ou mais proteínas.
Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a composição compreende parvalbumina.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a destilação de desnaturação é realizada em uma pressão de 0,5 mmHg a 5,0 mmHg (66,7 Pa a 666,6 Pa).
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a destilação de purificação é realizada em uma temperatura de 70 a 100°C.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a destilação de purificação é realizada em uma pressão de 0,5 µmHg a 5 µmHg (66,7 mPa a 666,6 mPa).
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a destilação de purificação é realizada antes da destilação de desnaturação.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição utilizada na etapa (i) é submetida à saponificação.
Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a saponificação compreende a adição de NaOH ou KOH na composição compreendendo esqualeno.
Método para a preparação de um kit de vacina, caracterizado pelo fato de que compreende preparar uma emulsão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e acondicionar a emulsão em um kit como um componente de kit juntamente com um componente de antígeno.