ES2220835T3 - Metodo para la prevencion o reduccion del enturbiamiento en bebidas. - Google Patents

Abstract

Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida en el que se agrega a la bebida una endoproteasa prolil- específica.

Description

Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en bebidas.

La invención se refiere a un método para la prevención o reducción del enturbiamiento de bebidas mediante la adición de una endoproteasa, así como a las nuevas bebidas obtenidas mediante el método de acuerdo con la invención. Esta invención se refiere igualmente a nuevas endoproteasas.

El enturbiamiento es un fenómeno bien conocido en la industria de las bebidas. El enturbiamiento puede aparecer, por ejemplo, en cervezas, vinos y jugos de frutas. La aparición de tal turbidez puede ocurrir en diferentes estadios durante el proceso de elaboración de cervezas. En "Enzymes in Food Processing", editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3^{era} edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V, páginas 448-449, se propone que el enturbiamiento de la cerveza es el resultado de la interacción entre proteínas y procianidinas polifenólicas de la misma. Esto explica el por qué el enturbiamiento aparece forma frecuentemente durante el enfriamiento de la cerveza.

Frecuentemente, la cerveza fermenta y luego madura bajo enfriamiento. Para darle claridad, la cerveza se suele filtrar manteniendo el frío. A pesar de la filtración, la cerveza frecuentemente aparece turbia, después se embotella y distribuye al usuario, que nuevamente la enfría antes de servirla. A veces dicho enturbiamiento aparece sin enfriamiento, al menos no durante mucho tiempo, y puede aparecer un sedimento. Tales enturbiamientos no son deseados ya que la opacidad debida a la formación de enturbiamiento se asemeja a la producida por los residuos microbianos, los cuales son indeseados, especialmente en el caso de cervezas brillantes.

En "Industrial Enzymology" 2^{da} edición, capítulo 2.6, páginas 124-125, se describe que el enturbiamiento en la cerveza puede ser el resultado de de entrecruzamientos en las fracciones de hordeína de alto peso molecular de la malta, que contiene una alta proporción de aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos que se combinan principalmente con polifenoles que consisten en protoantocianidinas y catequinas (flavonoides). Se ha descrito que pequeñas cantidades de carbohidratos y trazas de iones minerales están también involucradas en la formación del enturbiamiento, y también la oxidación, la cual juega en principio un importante papel en la polimerización de polifenoles que genera el enturbiamiento irreversible. Se ha propuesto que los polifenoles se combinan lentamente con proteínas para formar enturbiamiento cuando se enfrían, pero se redisuelven cuando se inicia el calentamiento. Eventualmente, sin embargo, la polimerización de los polifenoles y el incremento de su tamaño hacen que se conviertan en insolubles a temperatura ambiente, generando un enturbiamiento irreversible o permanente.

En otras publicaciones se ha propuesto que la formación de enturbiamiento, en cervezas, vinos y jugos de frutas, café y té por ejemplo, es resultado de interacciones entre proteínas y polifenoles (K.J. Siebert y col., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 1997-2005 y K.J. Siebert y col., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80-85, K.J. Siebert, J. Agric. Food Chem, 47 (1999) 353-362). También ha sido demostrado que las proteínas involucradas en el enturbiamiento son ricas en prolina (K.J. Siebert y col., J. AM. Soc. Brewing 55, 2(1997) 73-78).

Desde su descubrimiento por L. Wallerstein en 1911 se sabe que un método para la reducción de la formación de turbidez en frío en la cerveza consiste en añadir papaína a la misma. La papaína es un extracto de papaya que tiene actividad proteolítica. En "Enzymes in Food Processing" editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3^{era} edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V páginas 448-449, el efecto de la papaína se describe como superior al de cualquier otra enzima empleada para la prevención del enturbiamiento en frío de la cerveza. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la papaína es más efectiva jamás ha sido determinado ("Enzymes in Food Processing" editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3^{era} edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo V páginas 448-
449).

Una desventaja del uso de la papaína es que ésta tiene un efecto negativo sobre el espumado. Las proteínas son necesarias para generar una espuma estable en la cerveza. Mediante su actividad proteolítica, sin embargo, la papaína afecta de manera negativa a la estabilidad de su espuma.

La formación de turbidez en el vino ha sido discutida, por ejemplo, en "Enzymes in Food Processing" editado por T. Nagodawithana y G. Reed, 3^{era} edición, Academic Press Inc. San Diego, Capítulo 16, página 425, donde se describe que las proteínas de la uva son las responsables de la formación del enturbiamiento durante la conservación del vino. Si aparece precipitación en el vino tras su embotellado, éste se hace menos atractivo al consumidor y las ventas se ven afectadas. Para prevenir la precipitación se utiliza bentonita, por ejemplo. Aunque la bentonita y otros absorbentes son efectivos para eliminar las proteínas, no son selectivos y eliminan otros compuestos que si son deseados en el vino, lo cual frecuentemente afecta a las propiedades organolépticas del vino. Además, el uso de bentonita resulta en una considerable pérdida de vino y la eliminación de los desechos que contienen bentonita presenta dificultades.

Aunque el mecanismo no es bien comprendido, se cree que el agregado de papaína hidroliza las proteínas de la cerveza en tal grado que el enturbiamiento proteína-polifenol no se forma o lo hace en una muy pequeña proporción. Por la misma razón se emplea la bentonita en el vino: mediante la absorción de las proteínas, ésta previene la formación de enturbiamiento proteína-polifenol y de precipitados; sin embargo, en vez de eliminar las proteínas para reducir o prevenir la formación de enturbiamiento se pueden eliminar los polifenoles. Un ejemplo típico de un compuesto utilizado para eliminar los polifenoles de las bebidas es la polivinilpolipirrolidona (PVPP). Últimamente se ha reconocido que los polifenoles son unos importantes antioxidantes. Dada la cantidad de efectos beneficiosos atribuidos a los antioxidantes, la opción de eliminar los polifenoles de las bebidas para prevenir la formación de enturbiamiento no es demasiado atractiva.

A pesar de la cantidad de técnicas que se conocen para prevenir y eliminar el enturbiamiento que se han descrito, existe todavía la necesidad de nuevos métodos para la prevención o reducción del enturbiamiento en las bebidas.

Es un objeto de la presente invención poner a disposición un método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida.

Sorprendentemente, se ha encontrado que este objetivo se alcanza desarrollando un método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida en el cual una endoproteasa prolil-específica se agrega a la bebida.

En el marco de esta invención el término "bebida" incluye las bebidas en todos los estadios de su preparación. Así, una bebida no es solamente una bebida lista para su consumo sino también cualquier composición usada para preparar la misma. Por ejemplo, el mosto, usado en la preparación de cerveza, está dentro del concepto "bebida" tal como se utiliza aquí. También, la adición durante la preparación de una bebida de una endoproteasa prolil-específica a composiciones que son o no enteramente líquidas cae dentro del alcance de los métodos de acuerdo con la invención. Una endoproteasa prolil-específica agregada a una pasta de malta al inicio de la elaboración de la cerveza es un ejemplo de tal composición.

Una endoproteasa prolil-específica se define como una endoproteasa que corta proteínas o péptidos cerca o en el sitio donde la proteína o el péptido contiene, en su cadena, un residuo prolina. Preferentemente, una endoproteasa prolil-específica es una endoproteasa que corta proteínas o péptidos en los sitios donde la proteína o el péptido contiene un residuo prolina. En el método según la invención, una endoproteasa prolil-específica se emplea de forma preferente para cortar residuos prolina en su extremo C-terminal. Una endoproteasa prolil-específica que corta residuos prolina en su extremo NH_{2}-terminal se describe, por ejemplo, en la publicación Nature del 15 de Enero de 1998, Volumen 391, páginas 301-304.

En este texto, los términos endoproteasa prolil-específica, endoproteasa prolina-específica, endopeptidasa prolina-específica y péptido con actividad prolil-específica son expresiones similares y se utilizan indistintamente.

En este texto, las palabras péptido y proteína se emplean indistintamente. En este texto las palabras "enturbiamiento", "nubosidad" y "turbidez" son también utilizadas indistintamente. Para cuantificar la cantidad de enturbiamiento en una bebida se suele emplear un turbidímetro. En un turbidímetro se mide la cantidad de luz que se desvía un cierto ángulo relativo predeterminado con respecto a la dirección del haz de luz incidente. Las medidas de turbidez son también adecuadas para medir el enturbiamiento formado como resultado de las interacciones proteína-polifenol.

Un polifenol se define como un compuesto que tiene una estructura química que contiene al menos dos anillos aromáticos sustituidos con al menos un grupo hidroxilo o que tiene una estructura química que contiene por lo menos un anillo aromático sustituido con por lo menos dos grupos hidroxilo.

Ejemplos de polifenoles son los taninos y flavonoides, entre los cuales se incluyen catequinas, flavonoles, y antocianinas por ejemplo.

Endoproteasas que presentan actividad prolil-específica son bien conocidas (E.C. 3.4.21.26). Sin embargo, el uso de estas endoproteasas prolil-específicas para la prevención o la reducción del enturbiamiento en las bebidas jamás ha sido descrito o sugerido.

Como es típico en la actividad enzimática, la actividad de las endoproteasas prolil-específicas depende del pH. En una realización preferente del método según la invención, a una bebida se le agrega una endoproteasa que tiene una actividad prolil-específica máxima a un pH que corresponde al pH de la bebida a la cual se ha añadido. Las bebidas preferentes son aquellas que contienen proteínas. En otra realización preferente, la bebida contiene proteínas y polifenoles. Preferentemente las bebidas presentan un pH por debajo de 7.

El método de acuerdo con la invención se aplica preferentemente a cervezas, vinos y jugos de frutas. También se puede emplear con otras bebidas alcohólicas diferentes de la cerveza y el vino.

El término "cerveza" tal como se utiliza aquí abarca al menos cerveza preparada a partir de pasta de malta y todas las pastas de maltas preparadas a partir de una mezcla de cereales malteados y no malteados. El término "cerveza" también cubre a las cervezas preparadas con aditamentos, y cervezas con todos los posibles contenidos de alcohol.

Un jugo de fruta puede ser aquel obtenido a partir de, por ejemplo, bayas rojas, fresas, manzanas, peras, tomates, cítricos, vegetales, etc.

La cantidad de endoproteasa prolina-específica que se agrega a la bebida en el método según la invención puede variar dentro de amplios rangos. En una realización preferente del método según la invención se agregan al menos 150 mili-unidades de endoproteasa de actividad prolina-específica por gramo de proteína, donde dicha actividad fue determinada utilizando Z-Gly-Pro-pNA como sustrato.

Con más preferencia, al menos 500 mili-unidades de endoproteasa prolina-específica se agregan a la bebida, y especialmente al menos una unidad de endoproteasa prolina-específica.

La máxima cantidad de endoproteasa prolina-específica a agregar no se puede especificar. La cantidad máxima depende, por ejemplo, de la cantidad en que se desea reducir o prevenir el enturbiamiento, de la composición de la bebida, del pH de la bebida y del pH al cual la endoproteasa tiene su actividad máxima.

La endoproteasa prolil-específica se puede añadir en diferentes estadios durante la preparación de una bebida.

Durante el proceso de preparación de la cerveza, la endoproteasa prolil-específica es agregada a la pasta de malta preferentemente. En otra realización, la endoproteasa prolil-específica se agrega a la cerveza fermentada antes que se forme el enturbiamiento. Sin embargo, es también posible agregar la endoproteasa prolil-específica a una cerveza fermentada después de que se ha formado el enturbiamiento. Durante el proceso de preparación de la cerveza, resulta más ventajoso agregar la endoproteasa prolil-específica en la etapa de empastado o maduración de la malta.

Durante el proceso de producción del vino, presenta más ventajas añadir la endoproteasa prolil-específica al vino fermentado. Durante la preparación del vino puede ser más ventajoso añadirla después de la fermentación alcohólica o después de la fermentación maloláctica.

Durante el proceso de preparación de un jugo de fruta, la endoproteasa prolil-específica se agrega, preferentemente, durante la maceración o la despectinización.

Dado que la formación de enturbiamiento ocurre frecuentemente en bebidas ácidas tales como cerveza, vino y jugos de frutas, se emplean preferentemente endoproteasas prolil-específicas que tienen una actividad prolil-específica a un valor de pH por debajo de 7. Preferentemente, en el método según la invención se emplean las endoproteasas prolil-específicas que tienen una actividad prolil-específica máxima a un valor pH por debajo de 7.

La presente invención proporciona, además, un polipéptido con actividad endoproteasa prolina-específica aislado seleccionado del grupo consistente en:

(a)

un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que posee al menos un 40% de identidad de secuencia de aminoácido total con la SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 o SEQ ID Nº:7 o un fragmento de las mismas;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido híbrido de:

(i)

la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2. SEQ ID Nº:3 o SEQ ID Nº:6 o un fragmento de las mismas, la cual es al menos al 80 ó 90% idéntica sobre 60, preferentemente sobre 100, nucleótidos, especialmente al menos al 90% idénticas sobre 200 nucleótidos, o

(ii)

una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de (i).

También se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica la endoproteasa prolil-específica.

La invención también se refiere a la purificación y aislamiento de los polipéptidos que tienen actividad endoproteasa prolil-específica. Preferentemente se purifican endoproteasas prolil-específicas que tienen una actividad máxima a un pH inferior a 7. La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos según SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5, o SEQ ID Nº:7, una secuencia de aminoácidos que se puede obtener mediante la expresión de la secuencia de polinucleótidos de secuencias SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 en un huésped apropiado. También está dentro del alcance de la presente invención un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos arriba citados. Los polipéptidos citados están agrupados bajo el término "polipéptidos según la invención".

Los términos "péptido" y "oligopéptido" son considerados como sinónimos (como son comúnmente reconocidos) y cada término puede ser utilizado de manera indistinta, según lo requiera el contexto, para indicar una cadena de por lo menos 2 aminoácidos unida mediante enlaces peptídicos. La palabra "polipéptido" es utilizada aquí para cadenas que contienen más de 7 residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas de oligopéptidos y polipéptidos o secuencias citadas aquí están escritas de izquierda a derecha y en la dirección extremo amino-terminal al extremo carboxilo-terminal. En la presente invención se utiliza el código de una letra para los aminoácidos, el cual es comúnmente conocido en la técnica y se puede encontrar en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{da} edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por polipéptido, o proteína, "aislado" o "purificado" se entiende un polipéptido o una proteína que se extrae de su ambiente nativo. Por ejemplo, aquellos polipéptidos y proteínas generados de manera recombinante expresados en células huésped son considerados aislados para los propósitos de la invención, al igual que aquellos polipéptidos nativos o recombinantes que han sido sustancialmente purificados mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación en una única etapa descrito en Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Los polipéptidos según la invención pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos celulares recombinantes por cualquiera de los métodos conocidos, que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lectinas. Preferentemente se emplea la cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) para la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos procedentes de procesos de síntesis química y productos generados por técnicas de recombinación a partir de huéspedes procariotas o eucariotas, que incluyen, por ejemplo, células de bacterias, de levaduras, células de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o no-glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado del proceso mediado por el huésped.

Una realización preferente de la invención es aquella que concierne a una purificación o aislamiento del péptido con actividad endo-proteasa. Tal polipéptido purificado o aislado puede obtenerse a partir del cultivo de un caldo de fermentación de un organismo según la invención, como una cepa A. niger que lleva un polinucleótido según la invención. Una persona experta en la técnica sabrá cómo obtener al menos una enzima parcialmente purificada a partir del sobrenadante de tal cultivo.

Una particular ventaja del método de purificación es la siguiente. Después de cultivar las células en un caldo de fermentación apropiado, éstas se separaron del sobrenadante por centrifugación. El sobrenadante tenía un aspecto turbio. Las partículas de mayor tamaño presentes en el sobrenadante fueron subsecuentemente retiradas mediante filtración con Dicalite 0,5%, preferentemente Dicalite 1,0%, con el fin de prevenir la formación de agregados en el filtrado que se iba a emplear en la siguiente etapa. A continuación, se filtraron los gérmenes para disminuir la cantidad de ellos en la solución. El filtrado todavía no estaba claro. Posteriormente se utilizó un filtro Millipore con un valor de corte de peso molecular de 10kDalton para reducir además agua, sales y azúcares de la solución. El filtrado se sometió a una presión de 1 bar. El rendimiento obtenido fue de entre un 50 y un 92% referido a las unidades presentes en el caldo de fermentación versus las unidades obtenidas en el purificado ultra-filtrado. Normalmente, las concentraciones de enzima con actividad endoproteasa prolil-específica en el ultra-filtrado resultante estaban en el rango de 4 a 10 unidades por ml.

Igualmente, la purificación se puede llevar a cabo con uno cualquiera de los siguientes métodos:

Se realizó una purificación a escala de laboratorio utilizando un Akta Explorer sobre una columna FF 24 ml Q-sefarosa (altura del lecho 12 cm / diámetro 1,6 cm). Se diluyeron 10 ml del concentrado UF 10 veces en un tampón A y se aplicó a la columna. Las proteínas fueron eluídas en un gradiente: 0 a 50% de B en 20 CV. El tampón A era NaAc 20 mM a pH 5,1. El tampón B era NaAc 20 mM + NaCl 1 M a pH 5,1. El flujo fue de 5 ml/min.

La purificación se llevó a cabo utilizando el purificador Akta siguiendo las instrucciones de W-0894.A sobre una columna FF 500 ml Q-sefarosa (altura del lecho 23,5 cm / diámetro 5 cm). Se diluyeron 200 ml del concentrado UF 10 veces en el tampón A y se aplicaron a la columna. Las proteínas fueron eluídas en un gradiente: de 0 a 40% de B en 20 CV. El tampón A era NaAc 20 mM a pH 5,1. El tampón B era NaAc 20 mM + NaCl 1 M a pH 5,1. El flujo fue de 10 ml/min. Las fracciones fueron recogidas manualmente.

El producto obtenido presentaba un único pico en HPSEC y aparecía como una única banda en SDS PAGE e IEF. Se podía así concluir que la endoproteasa prolil-específica puede ser purificada a homogeneidad utilizando FF Q-sefarosa. La pureza estimada fue superior al 90% y la actividad específica en Z-gly-Pro-pNA fue, era de al menos 0,094 U/mg.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en forma aislada. Debe entenderse que el polipéptido puede estar mezclado con vehículos o diluyentes que no interfieran con los propósitos designados del polipéptido y aún así se consideran como aislados. Un polipéptido de la invención puede también estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso éste generalmente comprenderá al polipéptido en una preparación en la cual más del 70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98%, 99% de las proteínas en la preparación constituyen un polipéptido de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden ser provistos en una forma tal que se encuentren fuera de su medio celular natural. Así, pueden estar sustancialmente aislados o purificados, tal como se discute mas arriba, o en una célula en la cual no se encuentran de forma natural, por ejemplo en una célula de otra especie de hongo, de animales, de plantas o bacterias.

Preferentemente, en el método de acuerdo con la invención se emplean las endoproteasas prolil-específicas aisladas o purificadas.

Una endoproteasa prolina-específica aislada o purificada según la invención contiene preferentemente al menos 10 unidades de actividad endoproteasa prolina-específica por gramo de material proteico. Estas unidades deberían medirse utilizando el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37ºC y pH 5, tal como se describe en la sección Métodos.

Las endoproteasas prolina-específicas se encuentran en animales y plantas, pero su presencia en microorganismos parece ser limitada. En la actualidad, se han identificado endoproteasas prolina-específicas en especies de Aspergillus (EP 0 522 428), Flavobacterium (EP 0 967 285) y Aeromonas (J. Biochem. 113, 790-796), Xanthomonas y Bacteroides. Se piensa que las enzimas prolina-específicas de la mayoría de estos organismos están activas a un pH de alrededor de 8, la enzima de Aspergillus es presenta una actividad óptima a un pH de alrededor de 5. La endoproteasa prolina-específica de la invención puede ser aislada de una de las especies de microbios arriba mencionadas, particularmente de una especie de Aspergillus. Preferentemente, la endoproteasa prolina-específica es aislada a partir de una cepa de Aspergillus niger. Especialmente, la endoproteasa prolina-específica es aislada a partir de un huésped Aspergillus niger modificado genéticamente para sobreexpresar un gen que codifica una endoproteasa prolina-específica, aunque otros huéspedes, tales como E. coli, son vectores de expresión adecuados. Por ejemplo, el clonado y la sobreproducción de la endoproteasa prolina-específica de Flavobacterium en, entre otros, E. coli ha hecho que ciertas endoproteasas prolina-específicas estén disponibles en una forma pura. Un ejemplo de tal constructo sobre-productor se describe en World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp: 209-212. Se utiliza preferentemente un huésped Aspergillus niger para producir un auto-constructo no recombinante que utiliza promotores de A. niger para conducir la expresión de un gen que codifica una endoproteasa prolina-específica de A. niger.

En una primera realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que contiene una secuencia de aminoácidos con un grado total de identidad de secuencia con los aminoácidos de las secuencias SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7 (por ejemplo el polipéptido) de al menos alrededor del 40%, preferentemente al menos alrededor del 50%, preferentemente al menos alrededor del 60%, preferentemente al menos alrededor del 65%, preferentemente al menos alrededor del 70%, más preferentemente al menos alrededor del 80%, aún más preferentemente al menos alrededor del 90%, todavía más preferentemente al menos alrededor del 95%, y especialmente al menos alrededor del 97%, y el cual tiene actividad endoproteasa prolina-específica.

Para los propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos está determinado por el programa de búsqueda de bases de datos de proteínas BLAST P (Altschul y col., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) con una matriz Blosum 62 y un umbral esperado de 10.

Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7, o una secuencia sustancialmente homóloga o un fragmento de secuencia que tiene actividad endoproteasa prolina-específica. En general, son preferentes las secuencias de aminoácidos naturales que presentan las secuencias SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7.

El polipéptido de la invención puede también comprender una variante de ocurrencia natural o especies homólogas del polipéptido de la SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7.

Una variante es un polipéptido que ocurre naturalmente en, por ejemplo, células de hongos, bacterias, levaduras o plantas, la variante que tiene la actividad endoproteasa prolina-específica y una secuencia sustancialmente similar a la proteína de SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. El término "variantes" se refiere a polipéptidos que tienen la misma característica esencial o funcionalidad biológica básica de las endoproteasas prolina-específicas de las SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7, e incluyen las variantes alélicas. Preferentemente, una variante del polipéptido tiene al menos el mismo nivel de actividad endoproteasa prolina-específica que el polipéptido de la SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. Las variantes incluyen las variantes alélicas bien a partir de la misma cepa del polipéptido de secuencias SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7 o bien a partir de una cepa diferente del mismo género o especie.

De igual manera, una especie homóloga de la proteína de la invención es una proteína equivalente de secuencia similar que es una endoproteasa prolina-específica y ocurre naturalmente en otras especies de Aspergillus.

Las variantes y especies homólogas pueden ser aisladas utilizando los procedimientos descritos aquí que se emplearon para aislar al polipéptido de SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7 y llevando a cabo tales procedimientos sobre una fuente de células adecuada, por ejemplo células de bacterias, levaduras, hongos o plantas. También es posible utilizar una sonda de la invención para sondear las librerías construidas a partir de células de levaduras, bacterias, hongos o plantas con el fin de obtener clones que expresen variantes o especies homólogas del polipéptido SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. Estos clones pueden ser manipulados mediante técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención, que a partir de ese momento puede ser producido por técnicas recombinantes o sintéticas reconocidas per se.

La secuencia del polipéptido de SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7 y las variantes y especies homólogas pueden también ser modificadas para proporcionar polipéptidos de la invención. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones. También se pueden realizar el mismo número de delecciones e inserciones. Estos cambios pueden ser llevados a cabo fuera de las regiones críticas para la función del polipéptido, con lo que un polipéptido así modificado mantendrá su actividad endoproteasa prolina-específica.

Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos completos arriba mencionados y de variantes de los mismos, incluyendo fragmentos de las secuencias mostradas en SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. Tales fragmentos mantendrá típicamente su actividad como endoproteasa prolina-específica. Los fragmentos pueden ser de al menos 50, 100 ó 200 aminoácidos de longitud o pueden ser una cantidad corta de aminoácidos de la secuencia de longitud total mostrada en SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7.

Los polipéptidos de la invención pueden, si es necesario, ser producidos sintéticamente, si bien normalmente se obtendrán de manera recombinante como se describe posteriormente. Los polipéptidos sintéticos pueden ser modificados, por ejemplo, mediante la adición de residuos de histidina o de una cola T7 para ayudar a su identificación o purificación o mediante la adición de una secuencia señal para promover su secreción desde una célula.

Así, las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus distintas de la cepa desde la cual fueron aislados los polipéptidos de SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. Las variantes pueden ser identificadas a partir de otras cepas de Aspergillus buscando la actividad endoproteasa prolina-específica y clonando y secuenciando tal como se describe aquí. Las variantes pueden incluir la delección, modificación o adición de un único aminoácido o de grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína, siempre que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de endoproteasa prolina-específica de las SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7.

Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos desde 1, 2 ó 3 hasta 10, 20 ó 30 sustituciones. El polipéptido modificado generalmente mantendrá su actividad de endoproteasa prolina-específica. Se pueden hacer sustituciones conservativas, tales sustituciones son bien conocidas en la técnica. Preferentemente las sustituciones no afectan al plegamiento o a la actividad del polipéptido.

Las secuencias de polipéptidos más cortas se encuentran dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud se considera dentro del alcance de la invención en tanto éste demuestre la funcionalidad biológica básica de una endoproteasa prolina-específica de las SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5 ó SEQ ID Nº:7. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención incluye el caso en que la proteína es un fragmento de la secuencia proteica completa.

En una segunda realización, la presente invención proporciona un polipéptido aislado con actividad endoproteasa prolina-específica y que es codificado mediante polinucleótidos que hibridizan o son capaces de hibridizar en condiciones poco exigentes, más preferentemente bajo condiciones medias, y especialmente bajo condiciones rigurosas, con (i) la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 o un fragmento de ácido nucleico que comprende por lo menos la porción c-terminal de la SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6, pero que tiene menos del total o que tiene bases diferentes de las bases de la SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6; o (ii) con una hebra complementaria de ácido nucleico a la SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6.

El término "capaz de hibridizar" significa que el polinucleótido diana de la invención puede hibridarse al ácido nucleico utilizado como una sonda (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos presente en SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 o un fragmento de las mismas o el complemento de la SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6) a un nivel significativamente superior al de base. La invención también incluye a los polinucleótidos que codifican la endoproteasa prolina-específica de la invención y también a sus secuencias de nucleótidos complementarias. Las secuencias de nucleótidos pueden ser de ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos es ADN y especialmente es una secuencia de ADN genómico. Típicamente un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos capaces de hibridarse bajo condiciones selectivas a una secuencia codificante o la complementaria de la secuencia codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6. Tales nucleótidos pueden ser sintetizados siguiendo métodos bien conocidos en la técnica.

Un polinucleótido de la invención puede hibridarse con la secuencia codificante o complementaria de la secuencia codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 a un nivel significativamente superior al base. La hibridización de fondo puede ocurrir, por ejemplo, debido a otro ADNc presente en una librería de ADNc. El nivel de señales generadas por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante o complementaria de la secuencia codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 es, normalmente, al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, especialmente al menos 50 veces y particularmente al menos 100 veces tan intenso como el de las interacciones entre otros polinucleótidos y la región codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6. La intensidad de la interacción puede medirse, por ejemplo, mediante sondas radio-marcadas, por ejemplo con ^{32}P. La hibridización selectiva puede llevarse a cabo utilizando condiciones de baja rigurosidad (cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a unos 40ºC), rigurosidad media (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M de y citrato de sodio 0,03M a unos 50ºC) o de alta rigurosidad (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3M y citrato de sodio 0,03M a unos 60ºC).

Modificaciones

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Ambos de cadena simple o doble. También pueden ser polinucleótidos que incluyen en su interior nucleótidos sintéticos o modificados incluyendo péptidos de ácidos nucleicos. En la técnica se conoce una gran cantidad de diferentes tipos de modificaciones para los polinucleótidos. Éstas incluyen esqueletos de fosfonato y fosforotioato de metilo y el agregado de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, deberá entenderse que los polinucleótidos descritos aquí pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.

Debe entenderse que los expertos en la técnica pueden, mediante técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el cual el polipéptido de la invención es expresado.

La secuencia codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 puede ser modificada por sustituciones de nucleótidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El polinucleótido de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 puede ser alternativamente o adicionalmente modificado por una o mas inserciones y/o delecciones y/o por una extensión tanto en uno como en ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido que tiene actividad endoproteasa prolina-específica. Se pueden realizar sustituciones degenerativas y/o sustituciones que pueden resultar en una sustitución de aminoácido conservativa cuando la secuencia modificada es traducida, por ejemplo tal como se discutirá con respecto a los polipéptidos posteriormente.

Homólogos

Una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridación selectiva con el complemento del ADN que codifica la secuencia SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 está incluida en la invención y podrá generalmente tener al menos un 50 ó 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia codificante SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 sobre una región de por lo menos 60, preferentemente de por lo menos 100, especialmente de por lo menos 200 nucleótidos contiguos o en particular sobre el total de la longitud de las SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6. Asimismo, un nucleótido que codifica una endoproteasa prolina-específica activa y que es capaz hibridación selectiva con un fragmento de un complemento del ADN que codifica la secuencia SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 también está comprendido en la invención. Así mismo, está comprendido dentro de la invención un fragmento C-terminal de la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 que es al menos un 80% o 90% idéntica sobre 60, preferentemente sobre 100 nucleótidos, especialmente al menos un 90% idéntica sobre 200 nucleótidos.

Para definir un polinucleótido de la invención puede emplearse cualquier combinación de los grados de identidad y tamaños mínimos arriba mencionados, siendo preferentes las combinaciones más rigurosas (por ejemplo, alta identidad sobre mayor longitud). Así por ejemplo, un polinucleótido que es al menos un 80% ó 90% idéntico sobre 60, preferentemente sobre 100 nucleótidos, constituye un aspecto de la invención, de la misma manera que un polinucleótido al menos un 90% idéntico sobre 200 nucleótidos.

El paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede ser utilizado para calcular la identidad (por ejemplo utilizándolo en su forma establecida por defecto).

Los algoritmos PILEUP y BLAST N pueden ser utilizados para calcular identidades de secuencia o para alinear secuencias (tal como identificación de equivalentes o secuencias correspondientes, por ejemplo en su forma establecida por defecto).

El software para realizar los análisis BLAST está a disposición del público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica una primera identificación de los pares de secuencias con mayores posibilidades de acierto (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia incógnita que o aparea o satisface algunos de los valores positivos de la puntuación umbral T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere a cómo la palabra vecina apunta el umbral. Esta palabra vecina inicial actúa como una semilla para iniciar la búsqueda y encontrar los HSPs que los contienen. La palabra acertada es extendida en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como los aciertos alineados acumulativos pueden incrementarse. Las extensiones de la palabra aceptada en cada dirección son interrumpidas cuando los aciertos de alineamientos acumulativos caen bajo la cantidad X a partir del máximo valor hallado; el acierto acumulativo a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos negativos al acierto; o cuando se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza una longitud de palabra (E) por defecto de 11, alineamientos de la matriz de acierto BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud realizada por el algoritmo BLAST es la más pequeña probabilidad sum(P.(N)), que da una indicación de la probabilidadde que pueda ocurrir al azar un apareamiento entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Por ejemplo, una secuencia es considerada similar a otra secuencia si la más pequeña probabilidad sum de la primera secuencia en comparación con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferentemente menor de alrededor de 0,1, especialmente menor de alrededor de 0,01 y especialmente menor de alrededor de 0,001.

Cebadores y sondas

Los polinucleótidos de la invención incluyen y pueden ser utilizados como cebadores, por ejemplo como cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como cebadores para reacciones de amplificación alternativas o como sondas marcadas, por ejemplo, con un marcador que puede ser revelado por métodos convencionales utilizando etiquetas radioactivas o no radioactivas, o el polinucleótido puede ser clonado en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos deberán ser al menos de 15, por ejemplo al menos 20, 25, 30 ó 40, nucleótidos de longitud. Podrán ser de hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ó 300 nucleótidos de longitud, o incluso ser de hasta unos pocos nucleótidos (como 5 ó 10 nucleótidos) cortos de la secuencia codificante de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6.

En general, los cebadores pueden ser producidos sintéticamente, implicando un proceso en etapas de a un nucleótido cada vez de la secuencia del ácido nucleico deseada. Las técnicas para llevar a cabo esto en protocolos automatizados están disponibles en la técnica. Los polinucleótidos más largos se suelen producir mediante medios recombinantes, por ejemplo técnicas de clonado por PCR. Esto implica la fabricación de un par de cebadores (normalmente de alrededor de 15-30 nucleótidos) para amplificar la región deseada de la endoproteasa prolina-específica a ser clonada, poniendo en contacto los cebadores con ARNm, ADNc o ADN genómico obtenido de células de levadura, bacterias, plantas, procariotas u hongos, preferentemente de una cepa de Aspergillus, realizando la reacción en cadena de polimerasa bajo las condiciones adecuadas para la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo mediante purificación de la mezcla de reacción en gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden ser diseñados para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de manera tal que el ADN amplificado pueda ser clonado dentro de un vector de clonación adecuado.

Tales técnicas pueden ser utilizadas para obtener todo o parte de los polinucleótidos que codifican las secuencias de endoproteasa prolina-específicas descritas aquí. Los intrones, promotores y regiones remolque están dentro del alcance de la invención y también pueden obtenerse de manera análoga (por ejemplo mediante formas recombinantes, PCR o técnicas de clonación) comenzando con ADN genómico de hongos, levaduras, bacterias, células de plantas o procariotas.

Los polinucleótidos o cebadores pueden portar una etiqueta de revelado. Como etiquetas adecuadas se incluyen radioisótopos como ^{32}P o ^{35}S, enzimas marcadoras, u otras proteínas marcadoras como biotina. Tales marcadores pueden añadirse a los polinucleótidos o cebadores de la invención y ser detectados mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Los polinucleótidos o cebadores (o fragmentos de los mismos) marcados o sin marcar, pueden ser utilizados en ensayos de ácidos nucleicos para detectar o secuenciar una endoproteasa prolina-específica o una variante de la misma en una muestra de hongo. Tales ensayos de detección normalmente comprenden la puesta en contacto de una muestra de hongos sospechosa de contener el ADN de interés con una sonda que comprende un polinucleótido o un cebador de la invención bajo condiciones de hibridización y detectar cualquier dupla formada entre la sonda y la muestra de ácido nucleico. La detección puede llevarse a cabo mediante técnicas tales como PCR o por inmovilización de la sonda sobre un soporte sólido, eliminando de la muestra cualquier ácido nucleico que no ha hibridado con la sonda, y luego detectar cualquier ácido nucleico que sí lo ha hecho. Como alternativa, la muestra de ácido nucleico puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido, la sonda hibridizada y la cantidad de sonda unida a tal soporte es luego eliminada de cualquier sonda no enlazada detectada.

Las sondas de la invención pueden ser empaquetadas convenientemente como un kit en un contenedor adecuado. En tales kits, la sonda puede estar unida a un soporte sólido donde el formato del ensayo para el cual el kit ha sido diseñado requiere tal unión. El kit puede también contener los reactivos adecuados para tratar la muestra a ser ensayada, hibridizando la sonda a la muestra de ácido nucleico, reactivos control, instrucciones y similares. Las sondas y los polinucleótidos de la invención pueden también ser utilizados en micro-ensayos.

Preferentemente, los polinucleótidos de la invención se obtienen a partir de los mismos organismos que el polipéptido, como hongos, en particular hongos del género Aspergillus.

Los polinucleótidos de la invención incluyen también variantes de las secuencias SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 que codifican para un polipéptido que tiene actividad endoproteasa prolina-específica. Las variantes pueden estar formadas por adiciones, sustituciones y/o delecciones. Tales variantes de las secuencias codificantes de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 pueden también codificar polipéptidos que tienen la capacidad de digerir una cadena polipéptido del lado carboxi-terminal de prolina.

Producción de polinucleótidos

Los polinucleótidos que no tienen un 100% de identidad con las SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 pero que caen dentro del alcance de la presente invención pueden obtenerse de varias maneras. Así, las variantes de secuencia de endoproteasa prolina-específicas descritas aquí pueden ser obtenidas por ejemplo, mediante sondeo de librerías de ADN genómico creadas a partir de un conjunto de organismos tales como los discutidos como fuentes del polipéptido de la invención. Además, se pueden obtener otras proteasas prolina-específicas homólogas de hongos, plantas o procariotas y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general, serán capaces de hibridizar con SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6. Tales secuencias pueden obtenerse mediante sondeo de librerías de ADNc o de ADN genómico de otras especies, y sondeando tales librerías con sondas que comprenden todo o parte de la SEQ ID Nº:1 bajo condiciones de baja, media o alta rigurosidad (como se describió anteriormente). Las sondas de ácidos nucleicos que comprenden la totalidad o parte de la SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6 pueden ser utilizadas como sondas en librerías de ADNc o genómico de otras especies, tales como las descritas como fuentes para los polipéptidos de la invención.

Las especies homólogas también pueden obtenerse utilizando PCR degenerada, que emplea cebadores diseñados para señalar las secuencia diana dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas y podrán ser utilizados en condiciones de baja rigurosidad como aquellas utilizadas para las secuencias clonadas con cebadores de secuencia única contra secuencias conocidas.

Igualmente, tales polinucleótidos se pueden obtener mediante sitios mutaciones dirigidos de mutagénesis de las secuencias endoproteasa prolina-específica o variantes de la misma. Esto puede ser útil donde, por ejemplo, se requieren cambios de codones silenciosos de la secuencia para optimizar a codones preferenciales para una célula huésped particular en la cual las secuencias de polinucleótidos están siendo expresada. Se pueden realizar otros cambios de secuencia con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción o para alterar las propiedades o funciones de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

La invención incluye polinucleótidos de cadena doble que comprenden un polinucleótido de la invención y su complementario.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican a los polipéptidos de la invención descritos más arriba. Dado que tales polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción de polipéptidos recombinantes de la invención, no es necesario que éstos sean capaces de hibridizar con la secuencia de SEQ ID Nº:1, SEQ ID Nº:2, SEQ ID Nº:3 ó SEQ ID Nº:6, aunque esto es generalmente deseable. Por otra parte, tales polinucleótidos pueden ser marcados, utilizados y fabricados tal como se describió mas arriba.

Polinucleótidos recombinantes

La invención también proporciona vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, incluyendo vectores de clonación y expresión, y en otro aspecto, métodos de crecimiento, transformación o transfección de tales vectores dentro de células huésped adecuadas, por ejemplo bajo condiciones en las que ocurre la expresión de un polipéptido de, o codificado por, una secuencia de la invención. También se proporcionan células huésped que comprenden un polinucleótido o un vector de la invención en donde el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula huésped. El término "heterólogo", usualmente referente a la célula huésped, significa que el polinucleótido no es de ocurrencia natural en el genoma de la célula huésped o que el polinucleótido no es producido naturalmente por ésta célula. Preferentemente, la célula huésped es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces o una célula de hongo filamentoso por ejemplo del género Aspergillus.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados dentro de vectores recombinantes replicables, por ejemplo en un vector para clonación o expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Así, en una realización posterior, la invención proporciona un método para generar polinucleótidos de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención dentro de un vector replicable, introduciendo el vector dentro de una célula huésped compatible, y haciendo crecer a la célula huésped bajo condiciones que permitan la replicación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula huésped. Células huésped adecuadas están descritas más abajo en referencia a los vectores de expresión.

Vectores

El vector dentro del cual se inserta el casete de expresión de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sujeto a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la cual éste será introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, tal como un plásmido. Como alternativa, el vector puede ser tal que, cuando es introducido dentro de una célula huésped, se integra dentro del genoma de ésta y se replica junto con el o los cromosomas dentro de los cuales está integrado.

Preferentemente, cuando el polinucleótido de la invención está en un vector, éste está operativamente unido a una secuencia reguladora que es capaz de permitir la expresión de la secuencia codificante mediante la célula huésped; es decir, el vector es un vector de expresión. El término "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una interrelación que les permite funcionar de la manera propuesta. Una secuencia reguladora tal como un promotor, incrementador u otra señal de regulación de la expresión "unido operativamente" a una secuencia codificante está ubicado de manera que la expresión de la secuencia codificante se lleva a cabo bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

Los vectores pueden, por ejemplo en caso de plásmidos, cósmidos, virus o vectores fagos, ser provistos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un incrementador y/o un regulador del promotor. Puede presentar una secuencia de finalización, como puede ser una secuencia de poliadenilación. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un vector de mamífero. Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o pueden ser utilizados para transfectar o transformar una célula huésped.

Las secuencias de ADN que codifican el polipéptido se introducen preferentemente dentro de un huésped adecuado como parte de un constructo de expresión en la cual la secuencia de ADN está unida operativamente a señales de expresión capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en la célula huésped. Para la transformación del huésped adecuado con el constructo de expresión existen procedimientos de transformación bien conocidos por los expertos en la técnica. El constructo de expresión puede ser también utilizado para la transformación del huésped como parte de un vector que lleva un marcador de selección, o el constructo de expresión es co-transformado como una molécula separada junto con el vector que lleva un marcador de selección. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de selección.

Los marcadores de selección preferente incluyen, pero no están limitados, a aquellos que complementan un defecto en la célula huésped o confieren resistencia a una droga. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que pueden ser utilizados para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, tales como genes de acetamidasa o de ADNsc (genes amdS, niaD, facA o ADNsc de A. nidulans, A. oryzae, o A. niger), o genes que proporcionan resistencia a antibióticos como G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, fleomicina o benomil (benA). Igualmente se pueden utilizar marcadores de selección específicos tales como marcadores auxotróficos que requieren las correspondientes cepas huésped mutantes; por ejemplo URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger), argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferente, el marcador de selección es deleccionado de la célula huésped transformada después de la introducción de el constructo de expresión para obtener así células huésped transformadas capaces de producir el polipéptido que están libre de los genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen la sub-unidad 9 de ATP-sintetasa (oliC), orotidina-5'-fosfato-decarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia bacteriano G418 (útil en levaduras pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica para glucuronidasa (GUS). Se pueden utilizar los vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula huésped.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el constructo de expresión se integra, preferentemente, dentro del genoma de la célula huésped para obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras son también adecuados los sistemas de vectores episomales en cuyo interior se incorpora el constructo de expresión para lograr niveles de expresión altos y estables. Ejemplos de éstos incluyen vectores derivados de los plásmidos CEN y pKD1 2 \mum, de Saccharomyces y Kluyveromyces respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus). Cuando los constructos de expresión están integrados en el genoma de la célula huésped, los constructos se integran aleatoriamente bien a los loci en el genoma o bien en los loci diana predeterminados mediante recombinación homóloga, en este caso los loci diana preferentemente comprenden un gen de alta expresión. Un gen de alta expresión es un gen cuyo ARNm puede generar hasta al menos el 0,01% (p/p) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas o, alternativamente, se trata de un gen cuyo producto genético puede generar hasta al menos el 0,2% (p/p) del total de proteínas celulares, o, en caso de un producto genético secretado, éste puede ser secretado hasta un nivel de al menos 0,05 g/l.

Un constructo de expresión para una determinada célula huésped usualmente contendrá los siguientes elementos unidos operativamente unos con otros, en orden consecutivo a partir del extremo 5' al extremo 3' relativo a la cadena codificante de la secuencia que codifica al polipéptido del primer aspecto: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la trascripción de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido en la célula huésped dada, (2) preferentemente, una región 5' no traducida (líder), (3) opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula huésped al medio de cultivo, (4) la secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferentemente activa del polipéptido y preferentemente también (5) una región de finalización de la trascripción (terminador) capaz de finalizar la trascripción río abajo de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido.

Río abajo de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido, el constructo de expresión preferentemente contiene una región 3' no traducible con 1 ó más sitios de finalización de trascripción, también llamados terminadores. El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Sin embargo, preferentemente se utiliza un terminador de levadura en células huésped de levadura y un terminador de hongos filamentosos en células huésped de hongos filamentosos. Más preferentemente, el terminador es endógeno a la célula huésped en la cual se expresa la secuencia de ADN que codifica al polipéptido.

También se puede llevarse a cabo un incremento en la expresión del polinucleótido que codifica al polipéptido de la invención mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, promotor, secuencia señal y regiones de finalización, que sirven para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del huésped de expresión elegido y/o proporcionar un control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.

Para dirigir la expresión del polipéptido de la invención, junto al promotor nativo del gen que codifica al polipéptido de la invención se pueden utilizar otros promotores. El promotor puede ser elegido según su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el huésped de expresión deseado.

Los promotores/incrementadores y otras señales de regulación de la expresión pueden ser seleccionadas de forma que sean compatibles con la célula huésped para la cual se diseña el vector de expresión. Por ejemplo se pueden utilizar promotores procarióticos, en particular aquellos adecuados para las cepas de E. coli. Cuando la expresión del polipéptido de la invención se realiza en células de mamífero, se pueden utilizar promotores de mamífero. Se pueden utilizar promotores específicos de tejido, por ejemplo promotores específicos de hepatocitos. También se pueden utilizar promotores virales, por ejemplo repeticiones terminales de longitud del virus de la leucemia Moloney murina (MMLV LTR), promotores LTR del virus del sarcoma rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), promotores del virus herpes simplex o promotores de adenovirus.

Los promotores de levaduras adecuados incluyen a los promotores de S. cerevisiae GAL4 y ADH y los promotores de S. pombe nmt1 y adh. Los promotores de mamíferos incluyen al promotor de metalotioneína que puede ser inducido en respuesta a metales pesados como cadmio. Promotores virales como el promotor del antígeno T grande SV40 o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Se pueden utilizar promotores de mamíferos, tales como promotores de \beta-actina. Son preferentes los promotores específicos de tejido, en particular los promotores específicos de células neuronales o endoteliales (por ejemplo los promotores de DDAHI y DDAHII). También se pueden utilizar promotores virales, por ejemplo la repetición de terminación larga del virus de la leucemia Moloney murina (MMLV LTR), el promotor LTR del virus de sarcoma rous (RSV), el promotor SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores HSV (tal como los promotores HSV IE), o promotores HPV, particularmente la región reguladora río arriba de HPV (URR). Los promotores virales están fácilmente disponibles en la técnica.

Se puede utilizar una gran variedad de promotores capaces de dirigir la trascripción en las células huésped de la invención. Preferentemente, la secuencia promotora deriva de un gen altamente expresado tal como ha sido previamente definido. Como ejemplos de genes altamente expresados preferentes a partir de los cuales se derivan los promotores preferentes y/o que comprenden los loci diana predeterminados preferidos para la integración del constructo de expresión, se incluyen, pero sin limitarse a ellos, genes que codifican enzimas glicolíticas tales como triosa-fosfato isomerasas (TPI), gliceraldehído-fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato quinasas (PGK), piruvato quinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), y también genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, \beta-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosómicas. Como ejemplos específicos de genes altamente expresados adecuados se incluyen, por ejemplo, gen LAC4 de Kluyveromyces sp., genes metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia respectivamente, genes glucoamilasa (glaA) de A. niger y A. awamori, gen de amilasa TAKA de A. oryzae, gen gpdA de A. nidulans y genes celobiohidrolasa de T. reesei.

Ejemplos de promotores constitutivos y/o inducibles fuertes preferentes para huéspedes de expresión fúngicos son aquellos que se obtienen a partir de genes fúngicos para promotores de xilanasa (xlnA), fitasa, subunidad 9 de ATP-sintetasa (oliC), triosa-fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG- del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de promotores fuertes de levadura a utilizar incluyen aquellos que se obtienen a partir de genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosa-fosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes a ser utilizados son los promotores de amilasa y SPo2 y también promotores de genes de proteasas extracelulares.

Los promotores adecuados para células vegetales a ser utilizados incluyen promotores de nopalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, 35S y 19S del virus mosaico de la coliflor (CVM) y circovirus.

El vector puede además incluir secuencias que flanquean el polinucleótido dando un ARN que comprende secuencias homólogas a aquellas procedentes de secuencias genómicas eucariotas, preferentemente secuencias genómicas de mamíferos, o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención dentro del genoma de células eucariotas o virus mediante recombinación homóloga. En particular, se puede utilizar un vector plásmido que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias virales para preparar un vector viral adecuado para liberar los polinucleótidos de la invención en células de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales adecuados son vectores del virus herpes simplex y de retrovirus, que incluyen lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus HPV (tal como HPV-16 ó HPV-18). Las técnicas de transferencia genética utilizando estos virus son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores de retrovirus para integrar establemente al polinucleótido dado, dando un ARN antisentido dentro del genoma del huésped. En contraste, se pueden utilizar vectores de adenovirus de replicación defectiva que permanecen episomales y además permiten la expresión transitoria.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en la dirección antisentido para producir ARN antisentido. Esto se utiliza, si se desea, para reducir los niveles de expresión del polipéptido.

Células huésped y expresión

Otro aspecto de la invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente, bajo condiciones adecuadas para la expresión mediante el vector de una secuencia que codifica al polipéptido y recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden estar incorporados dentro de un vector recombinante replicable, tal como un vector de expresión. El vector puede ser utilizado para replicar al ácido nucleico en una célula huésped compatible. Así en otra realización, la invención proporciona un método para generar un polinucleótido de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención dentro de un vector replicable, introducción del vector dentro de una célula huésped compatible y hacer crecer la célula huésped bajo condiciones que permitan la replicación de dicho vector. El vector puede ser recuperado de la célula huésped. Células huésped adecuadas incluyen bacterias como E. coli, levaduras, líneas celulares de mamíferos y otras líneas celulares eucariotas, por ejemplo células de insecto como células Sf9 y células fúngicas (por ejemplo filamentosas).

Preferentemente el polipéptido es producido como una proteína de secreción, en este caso la secuencia de ADN que codifica a la forma madura del polipéptido en el constructo de expresión está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal. En caso de que el gen que codifica la proteína secretada tenga una la cepa tipo salvaje, una secuencia señal, preferentemente la secuencia señal utilizada, será nativa (homóloga) a la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. De igual manera, la secuencia señal es extraña (heteróloga) a la secuencia de ADN que codifica al polipéptido, en este caso la secuencia señal es preferentemente endógena a la célula huésped en la que se expresa la secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias señales adecuadas para células huésped de levaduras son las secuencias señal derivadas de genes MFalfa de levaduras. De manera similar, una secuencia señal adecuada para células huéspedes de hongos filamentosos es, por ejemplo, una secuencia señal derivada de un gen amiloglucosidasa (AG) de hongo filamentoso, por ejemplo el gen glaA de A. niger. Se puede utilizar esta secuencia señal en combinación con el mismo promotor de la amiloglucosidasa (también denominado (gluco)amilasa) y también en combinación con otros promotores. En el contexto de la presente invención también se pueden utilizar secuencias señal híbridas.

Las secuencias líder de secreción heterólogas son aquellas que se originan a partir del gen amiloglucosidasa fúngico (AG) (glaA - ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), el gen MFalfa (levadura por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen alfa amilasa (Bacillus).

Los vectores pueden ser transformados o transfectados dentro de células huésped adecuadas como se describe más arriba para dar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión tal como se describe más arriba bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.

En otro aspecto de la invención se proveen células huésped transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferentemente el polinucleótido es llevado en un vector que permite la replicación y la expresión del mismo. Se elegirán aquellas células que son compatibles con dicho vector y pueden, por ejemplo, ser procariotas (por ejemplo bacterianas), u hongos eucariotas, levaduras o células vegetales.

La invención abarca procesos para la producción de un polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito, la secuencia de ADN de la invención puede ser utilizada para amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias señal de secreción, con el fin de permitir una producción económica del polipéptido en células huéspedes heterólogas u homólogas adecuadas. Una célula huésped homóloga se define aquí como una célula huésped que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie de la especie a partir de la cual derivó la secuencia de ADN. Células huésped adecuadas son, preferentemente, los microorganismos procariotas como bacterias, o preferentemente organismos eucariotas, por ejemplo hongos, como levaduras u hongos filamentosos, o células de plantas. En general, se prefieren las células de levadura a las células de hongos filamentosos porque las primeras son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son escasamente secretadas de las levaduras o en algunos casos no son procesadas adecuadamente (hiperglicosilación de las levaduras). En ese caso, se deberá seleccionar un organismo huésped que sea un hongo filamentoso.

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos porque son capaces de secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Las células huésped de levaduras preferentes para la expresión de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia o Schizosaccharomyces. Más preferentemente, las células huésped de levadura son seleccionadas del grupo consistente en las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluveromyces marxianus var lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowla lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.

Sin embargo, más preferentes para la expresión de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido son las células huésped de hongos filamentosos. Las células huésped de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo consistente en el género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia y Talaromyces. Particularmente, la célula huésped de hongos filamentosos es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o pertenece a una especie del grupo Aspergillus niger (como la define Raper y Fennel, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965). Entre éstas se incluyen, pero sin limitación, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum y también las de la especie Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliopthora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thelavia terrestris.

Como ejemplos preferentes de huéspedes de expresión dentro del alcance de la presente invención se citan los hongos, tales como las especies Aspergillus (en particular las descritas en EP-A-184 438 y EP-A-284 603) y especies de Trichoderma; bacterias tales como especies de Bacillus (en particular las descritas en EP-A-134 048 y EP-A-253 455), especialmente Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, especies de Pseudomonas; y levaduras como especies de Kluyeveromyces (en particular las descritas en EP-A-096 430 como Kluyeveromyces lactis y en EP-A-301 670) y especies de Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae.

Las células huésped según la invención incluyen células vegetales y la invención además se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas, o partes de las mismas, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. Las plantas transgénicas (o modificadas genéticamente) pueden además tener insertado (en forma estable) dentro de su genoma una secuencia que codifica los polipéptidos de la invención. La transformación de células vegetales puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, por ejemplo utilizando el plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede así contener las secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

La célula huésped puede sobreexpresar el polipéptido, son bien conocidas las técnicas de ingeniería de sobreexpresión y éstas pueden emplearse en la presente invención. El huésped puede así tener dos o más copias del polinucleótido.

Como alternativa se puede efectuar la infección directa de una parte de la planta tal como una hoja, la raíz o el tallo. En esta técnica, la planta a ser infectada puede ser herida, por ejemplo cortándola con una navaja, punzándola con una aguja o raspándola con un abrasivo. La herida es luego inoculada con Agrobacterium. La planta o las partes de la misma se pueden hacer crecer en un medio de cultivo adecuado y permitir su desarrollo hasta una planta madura. La regeneración de las células transformadas en plantas modificadas genéticamente se puede realizar mediante técnicas conocidas como, por ejemplo, seleccionando los vástagos transformados con un antibiótico y por subcultivo de los vástagos en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas vegetales y similares.

Cultivo de células huésped y producción recombinante

La invención también incluye células que han sido modificadas para expresar endoproteasas prolina-específicas o una variante de las mismas. Tales células incluyen líneas celulares de eucariotas superiores modificadas transitoriamente, o preferentemente establemente, como células de mamífero o de insecto, células de eucariotas inferiores, como levaduras y células de hongos filamentosos o células de procariotas como células bacterianas.

Es también posible la expresión de los polipéptidos de la invención de forma transitoria en una línea celular o en una membrana, por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas están adaptados para expresar la proteína según la invención y también están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede ser realizarse mediante el cultivo de huéspedes de expresión microbianos, que han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación con los nutrientes convencionales.

Las células huésped recombinantes según la invención pueden cultivarse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Para cada combinación de promotor y célula huésped, se disponen condiciones de cultivo que lleven a la expresión de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o de titular el polipéptido, el cultivo cesa su crecimiento y el polipéptido se recupera mediante procedimientos bien conocidos.

Los medios de fermentación comprenden medios de cultivo conocidos que contienen una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, melaza, etc), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato amónico, nitrato amónico, cloruro amónico, etc), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc) y una fuente de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc). Opcionalmente se puede incluir un inductor (dependiendo del constructo de expresión utilizado) o ser éste agregado posteriormente.

La selección de un medio apropiado se basa en la elección del huésped de expresión y/o en los requerimientos de regulación del constructo de expresión. Los medios adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. El medio puede, si se desea, contener otros componentes adicionales que favorecen a los huéspedes de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se puede llevar a cabo durante un período de 0,5 a 30 días. La fermentación puede ser en lotes, continua, o en lotes alimentados, a una temperatura adecuada de entre 0ºC y 45ºC y, por ejemplo a un pH de 2 a 10. Las condiciones de fermentación preferentes implican una temperatura de entre 20ºC y 37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Normalmente, las condiciones apropiadas se seleccionan en base a la elección del huésped de expresión y de la proteína a ser expresada.

Después de la fermentación, si es necesario, las células pueden ser eliminadas del caldo de fermentación mediante centrifugación o filtración. Después de que la fermentación se detiene o tras retirar las células, el polipéptido de la invención puede recuperarse y, si se desea, purificarse y aislarse mediante medios convencionales. La endoproteasa prolina-específica de la invención puede ser purificada a partir de micelio de hongo o a partir del caldo de cultivo dentro del cual se libera la endoproteasa prolina-específica procedente de las células fúngicas en cultivo.

En una realización preferente, el polipéptido se obtiene a partir de hongos, especialmente a partir de Aspergillus, en particular a partir de Aspergillus niger.

Modificaciones

Los polipéptidos de la invención pueden ser modificados químicamente, por ejemplo modificados post-traducción. Pueden, por ejemplo, ser glicosilados (una o más veces) o comprender modificaciones en los residuos de aminoácidos. También pueden modificarse mediante adición de residuos histidina para facilitar su purificación o mediante la adición de una secuencia señal para promover la secreción desde la célula. Los polipéptidos pueden tener extensiones amino- o carboxiterminales, tales como residuos metionina aminoterminales, un pequeño péptido conector de hasta unos 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilite la purificación, como un tramo polihistidina, un epitope antigénico o un dominio de unión.

Un polipéptido de la invención puede estar marcado con una etiqueta de revelado. La etiqueta reveladora puede ser cualquier marca que permita detectar el polipéptido. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, por ejemplo ^{125}I, ^{35}S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y conectores como biotina.

El polipéptido puede ser modificado para incluir aminoácidos de ocurrencia no natural o para incrementar su estabilidad. Cuando las proteínas o péptidos se producen por medios sintéticos, tales aminoácidos pueden ser introducidos durante la producción. Se pueden también modificar las proteínas o polipéptidos tras su producción sintética o recombinante.

Los polipéptidos de la invención pueden también producirse utilizando D-aminoácidos. En este caso, los aminoácidos deberán estar ligados en una secuencia inversa en orientación C a N. Se trata de un método convencional en la técnica de producción de tales proteínas o polipéptidos.

En la técnica se conocen ciertas modificaciones de cadena lateral y pueden ser realizadas en las cadenas laterales de las proteínas o los péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de los aminoácidos mediante alquilación reductora por reacción con un aldehído seguido de reducción con NaBH_{4}, amidinación con metilacitimidato o acilación con anhídrido acético.

Las secuencias proporcionadas por la presente invención pueden también utilizarse como material inicial para la construcción de enzimas de "segunda generación". Las proteasas prolina-específicas de "segunda generación" son proteasas prolina-específicas alteradas por mutagénesis (por ejemplo mutagénesis sitio-dirigida), que poseen propiedades diferentes de las de la proteasa prolina-específica salvaje, o proteasas prolina-específicas recombinantes como las producidas en la presente invención. Por ejemplo, se puede alterar su temperatura o pH óptimo, su actividad específica, afinidad al sustrato o su estabilidad térmica para adaptarlas a un proceso particular.

Los aminoácidos esenciales para la actividad de la endoproteasa prolina-específica de la invención, y por ello preferentemente sujetos a sustitución, pueden ser identificados siguiendo los procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis de exploración de alanina. En esta última técnica de mutación se introducen todos los residuos en la molécula, y se ensaya la actividad biológica de la molécula mutante resultante (por ejemplo la actividad endoproteasa prolina-específica) para identificar los residuos de aminoácidos críticos para la actividad de la molécula. También se pueden determinar los sitios de interacción enzima-sustrato mediante análisis de la estructura cristalina mediante técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, o marcado de foto-afinidad.

El uso de células huésped de levaduras y hongos filamentosos se supone previsto para tales modificaciones post-traducción (por ejemplo procesamiento protolítico, miristilación, glicosilación, truncado, y fosforilación de tirosina, serina o treonina) tal como sea necesario para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante de la invención.

Preparaciones

Los polipéptidos de la invención pueden estar en forma aislada. Deberá entenderse que los polipéptidos pueden mezclarse con vehículos o diluyentes que no interfieran los propósitos deseados del polipéptido y aún así se considerarán aislados. Un polipéptido de la invención puede también estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso el polipéptido estará comprendido en una preparación en la cual más del 70%, por ejemplo más del 80%, 90%, 95%, 98% ó 99%, de las proteínas en la preparación constituyen un polipéptido de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden proporcionarse en una forma tal que están fuera de su medio celular natural. Así, pueden aislarse sustancialmente o purificarse tal como se discute más arriba o pueden presentarse en una célula en que no se encuentran naturalmente, por ejemplo en una célula de otra especie de hongo, animal, planta o bacteria.

La invención también se relaciona con el uso de una endoproteasa prolil-específica en la preparación de una bebida. Preferentemente esta endoproteasa prolil-específica se usa en la preparación de cerveza, vino o jugo de fruta. Agregando una endoproteasa prolil-específica de acuerdo con el método según la invención, se consigue una reducción o se previene el enturbiamiento. La adición de estas endoproteasas prolil-específicas conlleva obtener nuevas bebidas. Por ello, la invención también se relaciona con aquellas bebidas obtenidas mediante el método según la invención. Estas bebidas incluyen, por ejemplo, cerveza, vino y jugos de fruta obtenidos mediante un método según la invención.

Una ventaja de las bebidas obtenidas por el método según la invención es que éstas poseen un alto contenido de antioxidantes. Los polifenoles son antioxidantes. La cerveza se trata normalmente con un agente que elimina los polifenoles que previenen la formación de enturbiamiento, y, como resultado, la cerveza obtenida tiene una baja actividad antioxidante. Este es el caso de otras bebidas tratadas con agentes que eliminan polifenoles. La cerveza obtenida por el método según la invención tiene una elevada actividad antioxidante endógena. Dado que los antioxidantes son considerados como ingredientes que mejoran la salud, las bebidas obtenidas por el método según la presente invención pueden ser consideradas como bebidas más saludables que aquellas del mismo tipo preparadas con agentes que eliminan polifenoles, tales como PVPP. Es una ventaja del método según la invención que el color de los jugos de fruta que se obtienen por el método no sea menos pálido que el color del jugo de fruta obtenido tras la eliminación de los polifenoles. Los vinos y los jugos de fruta obtenidos por el método según la invención tienen un aroma y un sabor mejorado en comparación con las bebidas obtenidas por los métodos en los que se utilizan compuestos de bentonita o similares, ya que la bentonita no sólo elimina las proteínas sino también los componentes que dan aroma y/o sabor.

Ejemplos y experimentos comparativos Materiales Enzimas endoproteasas prolina-específicas (Endo-Pro's)

Aspergillus niger G306 fue depositada en el CBS (CBS109712) el 10 de Septiembre de 2001. A. Niger G306 contiene un gen que codifica una endoproteasa prolil específica según la invención. El gen o el ADNc obtenido de estos organismos puede clonarse y expresarse en cualquier cepa Aspergillus niger utilizando métodos conocidos.

Se utilizaron las siguientes muestras:

1)

En experimentos con cerveza se empleó "Endo-pro A", una endoproteasa de prolina-específica. La muestra era un concentrado obtenido mediante ultrafiltración obtenido tras ultrafiltración del caldo de fermentación obtenido tras la fermentación de la cepa de Aspergillus niger que contenía un gen que codifica una endoproteasa prolina-específica. La actividad prolil-específica de la muestra Endo-pro A fue de 5,06 U/ml, dato determinado tal como se describe en Métodos posteriormente. La concentración de la proteína fue estimada en 50 g/l, en base a la actividad específica de una muestra de endoproteasa prolil-específica con una pureza superior al 92%.

2)

"Endo-pro B", una endoproteasa prolina específica se empleó en los experimentos con vino. La muestra fue obtenida tras purificación en columna y tenía una actividad de 6,0 U/ml.

Papaína

Collupulin, una preparación líquida de papaína disponible de DSM-Francia se empleó para los experimentos con papaína. La actividad es 5280 NF/mg. Una unidad NF es la cantidad de actividad de papaína que cataliza la hidrólisis de caseína para producir un microgramo equivalente de tirosina soluble por hora a pH de 6,0. La concentración de proteína en la muestra de papaína medida fue de 119 g/l (Lowry).

Polivinilpirrolidona (PVPP)

La PVPP utilizada fue una PVPP no soluble en agua disponible comercialmente bajo el nombre "Polyclar AT".

Cerveza

En todos los experimentos realizados con cerveza se utilizó una cerveza de malta (tipo Pilsener) de "Les Trois Brasseurs", Lille, Francia. El porcentaje de alcohol de esta cerveza era de 5,2% (v/v) y el pH de 4,4. Esta cerveza fue elegida por su relativamente elevada cantidad de turbidez medida en ella bajo enfriamiento en comparación con otras cervezas disponibles comercialmente. La cerveza tenía una concentración proteica de 0,9 g/l, determinada por el método de Lowry.

Vino blanco

Se utilizó un vino blanco preparado de uvas blancas Sauvignon sin ningún tratamiento de eliminación de proteínas. La fermentación alcohólica durante la preparación del vino se llevó a cabo con una levadura VL3 de Lallemand. El análisis enológico del vino dio los siguientes resultados:

Azúcares (g/l)	1,1
Etanol %vol	12,97
Acidez total (gH_{2}SO_{4}/l)	4,14
Acidez volátil (gH_{2}SO_{4}/l)	0,22
pH	3,46
SO_{2} libre (mg/l)	18
SO_{2} total (mg/l)	96
Glicerol (g/l)	3
Ácido tartárico (g/l)	3
Ácido málico (g/l)	2,8
Ácido láctico (g/l)	0,1
Índice Folin	7

Métodos Método espectrofotométrico para determinar la actividad endoproteasa prolil-específica

La solución sustrato es una solución 2 mM de N-carbobenzoxi-glicina-prolina-p-nitroanilida (Z-Gly-Pro-pNA; peso molecular 426,43; Bachem) en un tampón ácido cítrico 0,1 M /fosfato disódico 0,2 M, pH 5,0 que contiene un 40% de dioxano.

Se agregan 250 \mul de la solución sustrato a 1 mL de tampón, pH 5,0 seguido de 100 \mul de la solución de enzima (volúmenes mayores o menores de solución de enzima podrán ser compensados por la solución tampón). La mezcla de reacción se incuba a 37ºC y la liberación de pNA se sigue mediante medida del incremento de la absorbancia a 410 nm.

Definición de actividad: una unidad es la actividad de enzima que libera 1 \mumol de pNA a partir de Z-Gly-Pro-pNA en 1 minuto bajo las condiciones de reacción descritas. Para calcular las concentraciones se utilizó un coeficiente de extinción molar (E) de 8,800 M^{-1}.

Medición del enturbiamiento en frío (ensayo de alcohol/baja temperatura de Lucien Chapon)

La turbidez o enturbiamiento fue medido con un turbidímetro denominado Tannometer de Pfeuffer Gmbh, Kitzingen, Alemania, siguiendo las instrucciones operacionales de Pfeuffer. La cerveza enfriada mostró una gran turbidez reversible causada por la precipitación de complejos polifenol-proteína. La adición de alcohol reduce la solubilidad de los complejos y acelera así la formación de turbidez. Para calibrar el Tannometer se preparó una solución estándar de formacina de la forma descrita por Jean de Clerk, en "Cours de Brasseries" 2^{da} edición, (pp: 595-596), Université de Louvain, Bélgica. El estándar de turbidez estaba en unidades EBC. La cerveza fue decarbonatada mediante filtración en filtro de papel. Justo antes de realizar el ensayo de enturbiamiento por enfriado se agregó etanol a las muestras en cantidad suficiente para incrementar el contenido de alcohol al 6% (v/v). El ensayo de enturbiamiento por enfriado fue realizado enfriando cada muestra a -8ºC durante 30 minutos. El enturbiamiento formado (en unidades EBC) fue rápidamente medido en el turbidímetro cuyas cámaras de medida también se mantenían a -8ºC.

Este ensayo de enturbiamiento por enfriado descrito para la cerveza fue también realizado con mosto o cervezas sin alcohol. En estos casos, también se añadió etanol a las muestras en cantidad suficiente para alcanzar un contenido de alcohol del 10% (v/v). Las unidades de turbidez o enturbiamiento de la cerveza utilizada son las EBC, que son unidades de turbidez nefelométricas tal como recomienda la Convención Europea de Cervecería.

Ensayos de enturbiamiento en caliente

Tal como describe K. J. Siebert (K.J. Siebert y col., J Agric. Food Chem. 44 (1996)), el enturbiamiento en bebidas como vino o jugos de fruta puede ser inducido por un ensayo de calentamiento. La cantidad de turbidez formada es principalmente función de los niveles de proteínas de enturbiamiento activas y de los polifenoles presentes en la bebida. En el ensayo de calentamiento, la turbidez de las muestras (por ejemplo del vino o de los jugos de fruta) se midió con un turbidímetro antes y después de calentarlas a 80ºC durante 30 minutos. Antes de medir la turbidez, la muestra calentada se enfrió bajo agua fría hasta alcanzarse una temperatura de 22-25ºC. En los ensayos con vino (ver Ejemplo III), la calibración del turbidímetro se realizó con soluciones estándar NTU-formacina, para los ensayos con jugos de frutas (ver Ejemplo V), la solución estándar de turbidez NTU se obtuvo de Reagecon, Irlanda. NTU = unidades de turbidez nefelométricas.

Experimentos control

(i)

Se realizó un experimento blanco en el que no se agregaron proteínas exógenas durante la incubación.

(ii)

Se realizó un experimento en el que la cerveza utilizada había sido tratada con una gran cantidad de PVPP (1000 g/hl) antes de la incubación. Este experimento permitió determinar la cantidad promedio de enturbiamiento inducido por el enturbiamiento por frío debida a los precipitados de polifenol-proteína, porque el PVPP elimina los polifenoles de la cerveza y, de esta manera, interfiere con la formación de turbidez.

(iii)

Se realizaron experimentos en los que se agregaron proteínas exógenas (endoproteasa prolil-específica o papaína respectivamente) a cerveza enfriada a 0ºC después de una incubación a 40ºC durante una hora. La incubación a 0ºC se realizó 15 minutos antes de la medida de enturbiamiento. Dado que la enzima y la papaína no son activas a 0ºC, o apenas lo son a esta temperatura, estos experimentos permiten discriminar entre el efecto de la actividad enzimática y los efectos de proteínas no enzimáticas.

Experimentos y ejemplos comparativos que muestran el efecto sobre el enturbiamiento en varios ensayos Ejemplo I Efectos de la adición de una endoproteasa prolil-específica sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

A una cerveza de malta decarbonatada con un contenido de proteína de 0,9 g/l (Les Trois Brasseurs) se agregaron diversas cantidades de una enzima endoproteasa prolil-específica ("Endo-Pro A", ver Materiales). Se realizaron dos series de mediciones de enturbiamiento. En la primera serie, las composiciones cerveza-Endo-Pro A se incubaron a 40ºC durante una hora antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Después de la incubación a 40ºC, y justo antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento se agregó etanol a la cerveza-Endo-Pro A en cantidad suficiente para incrementar el contenido de alcohol al 6% (v/v). En una segunda serie, cerveza sin Endo-Pro A se incubó a 40ºC durante una hora y luego se enfrió a 0ºC. A 0ºC, se agregó Endo-Pro A y la composición resultante fue incubada a esa temperatura durante 15 minutos. Justo antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento, se agregó etanol a la composición cerveza-Endo-Pro A en cantidad suficiente para incrementar el contenido de alcohol al 6% (v/v).

Las cantidades de Endo-Pro A añadidas y los porcentajes relativos de reducción de enturbiamiento y la medida del enturbiamiento cuando no se agregó Endo-Pro A se muestran en la Tabla 1. Las cantidades de Endo-Pro A añadidas abarcaban un amplio rango, desde menos del 1% de proteína exógena añadida a más del 10%, en relación a la cantidad de proteína presente en la cerveza.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Efecto de la adición de una enzima endoproteasa prolina-específica a la cerveza sobre el enturbiamiento después de incubación a 40ºC durante una hora

1

TABLA 2 Efecto de la enzima endoproteasa prolil-específica sobre la cantidad de enturbiamiento después de incubación a 0ºC durante 15 min en cerveza

2

La Tabla 1 ilustra claramente que se forma menor enturbiamiento bajo enfriamiento cuando se agrega endoproteasa prolil-específica a la cerveza a una temperatura en que la proteasa es activa antes del enfriamiento. La Tabla 2 muestra claramente que existe algún efecto al agregar una endoproteasa prolil-específica a la cerveza a una temperatura más baja en la que la proteasa es poco o nada activa, pero el efecto es muy pequeño en comparación con el efecto observado cuando la proteasa se añade a una temperatura a la que ésta está activa.

Experimento comparativo A

Efectos de la adición de Papaína sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

A una cerveza de malta decarbonatada (Les Trois Brasseur), con un contenido de proteína de 0,9 g/l se agregaron diversas cantidades de papaína (desde 0 a 100 g/hl). Se realizaron dos series de medidas de enturbiamiento bajo enfriamiento. Para la primera serie, las composiciones cerveza-papaína fueron incubadas a 40ºC durante una hora antes del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Anteriormente a la medición del enturbiamiento se agregó etanol a las muestras incubadas hasta alcanzar un 6% de alcohol (v/v). En la segunda serie, las muestras de cerveza se incubaron a 40ºC durante una hora y a continuación se enfriaron a 0ºC. Posteriormente se agregó papaína y las muestras fueron incubadas a 0ºC durante 15 minutos. Las cantidades de papaína agregada y el porcentaje de reducción relativa del enturbiamiento con respecto a la medida sin adición de papaína se muestran el la
Tabla 3.

TABLA 3 Efecto de la papaína sobre el enturbiamiento formado en la cerveza después de incubación a 40ºC durante una hora

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3

TABLA 4 Efecto de la papaína sobre el enturbiamiento después de incubación a 0ºC durante 15 min

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4

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Los resultados de la Tabla 3 ilustran el efecto de la papaína sobre la cantidad de enturbiamiento formado en la cerveza después de enfriamiento. Se aprecia claramente que el efecto de la papaína sobre el enturbiamiento está fuera de nivel cuando se agregan 3 g/hl o más papaína. Aparentemente, no es posible conseguir la misma proporción de reducción de enturbiamiento con papaína que con la endoproteasa prolil-específica.

Experimento comparativo B

Efectos de la adición de PVPP sobre la formación de enturbiamiento en la cerveza

Tanto en los experimentos de cerveza con endoproteasas prolil-específicas como con papaína, se realizaron experimentos control mediante la adición de una gran cantidad de PVPP (1000g/hl) a la cerveza antes de la incubación. Después de 15 min de mezclado, se eliminó la PVPP mediante filtración (no se agregaron enzimas endoproteasas prolil-específicas ni papaína). En ambos controles apenas si se formó enturbiamiento durante el ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. Es sabido que la PVPP elimina los polifenoles de las bebidas, este experimento control indica que los polifenoles tienen relación con la formación de enturbiamiento en la cerveza. Para medir el efecto de PVPP sobre la estabilidad del enturbiamiento de la cerveza, se agregaron diferentes cantidades de PVPP a una cerveza decarbonatada y se eliminaron luego por filtración después de 15 min de mezclado. Antes de agregar PVPP, la cerveza fue incubada durante 1 h a 40ºC.

La Tabla 5 muestra el efecto de la adición de diversas cantidades de PVPP sobre el enturbiamiento presente en la cerveza enfriada. No se agregó Endo-Pro A ni papaína.

TABLA 5 Efecto de PVPP sobre el enturbiamiento presente en la cerveza bajo enfriamiento

5

En la Tabla 3 se muestra que la adición de 3 g de papaína/hl a la cerveza (que es la dosis máxima recomendada en la industria cervecera) después de incubación a 40ºC durante una hora induce una disminución del enturbiamiento de casi el 36%. En el caso de la adición de endoproteasa prolil-específica, el agregado de un 1% (en relación a la cantidad de proteínas en la cerveza) de endoproteasa prolil-específica después de incubación a 40ºC durante una hora induce una disminución del enturbiamiento de la cerveza por enfriamiento del 38% (ver Tabla 1). En cervecería, la PVPP se suele agregar en una cantidad que no excede los 30 g/hl. Dado que la PVPP reduce el enturbiamiento en alrededor del 20% cuando se agrega en tal cantidad, esto permite concluir que tanto las papaínas como las enzimas endoproteasa prolil-específicas son mejores inhibidores del enturbiamiento que la PVPP.

Ejemplo II Adición de Endo-Pro sobre un 100% de pasta de malta y reducción del enturbiamiento en un 100% en mosto de malta

El objetivo era determinar si la adición de endoproteasa prolil-específica a un 100% de pasta de malta podía resultar en una reducción del enturbiamiento en el mosto de malta final.

Cada ensayo de empastado comienza con la mezcla de 25 g de malta molida con 100 ml de agua. Después, la pasta se calienta a 50ºC y, tras añadir una cantidad de "Endo-Pro A", la pasta es tratada siguiendo un procedimiento de calentamiento por etapas a cuatro temperaturas cada vez más altas. La Tabla 6 muestra el perfil de temperaturas de la pasta. Durante todo el proceso, la pasta se mantuvo con agitación a 200 rpm. Al final del proceso, la pasta se mantiene a temperatura ambiente y se le agrega agua para compensar la evaporación. A continuación, la pasta se filtra en papel para separar el mosto (líquido) del sólido.

TABLA 6 Perfil de temperatura de la pasta

6

Se añadieron a los empastados 0,200 y 500 \mul respectivamente de Endo-Pro A a los empastados. Se realizó un experimento control en el que se utilizaron 500 \mul de Endo-Pro A desactivada por calentamiento a 90ºC durante 15 min. La turbidez o el enturbiamiento del mosto se midió a temperatura ambiente y después se hizo un ensayo de enturbiamiento por enfriamiento. El ensayo de enturbiamiento por enfriamiento del mosto se llevó a cabo tal como se describe en el ensayo alcohol/temperatura-baja de Chapon (Chill Haze test-Pfeuffer Operating Instructions) agregando etanol hasta alcanzar un 10% (v/v) en las muestras como recomienda Chapon para cervezas libres de alcohol.

TABLA 7 Efecto de la adición de endoproteasa prolil-específica a un 100% de pasta de malta sobre el enturbiamiento formado en el 100% de mosto de malta resultante (después del ensayo de enturbiamiento por enfriamiento)

7

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Los resultados de la Tabla 7 indican claramente que, cuando se agrega una endoproteasa prolil-específica a una pasta de malta, el mosto resultante es mucho menos turbio cuando al enfriarse que el mosto preparado sin adición de endoproteasa prolil-específica.

Para estudiar el efecto de la Endo-Pro A, se llevó a cabo un ensayo de enturbiamiento por enfriamiento sobre el mosto de malta. Se observó que la adición de una endoproteasa prolil-específica disminuye el enturbiamiento por enfriamiento del mismo. Se observó disminución del enturbiamiento formado en el ensayo del enturbiamiento por enfriamiento aún con pequeñas cantidades de enzima endoproteasa prolil-específica. Cuando la enzima estaba desactivada antes de agregarse a la pasta de malta, el efecto de estabilización desapareció completamente, es decir, la cantidad de enturbiamiento formado no sigue disminuyendo. La disminución del enturbiamiento inducida por la adición de una enzima prolil-específica es muy importante. En el ejemplo se encontró una reducción del enturbiamiento de hasta el 82%.

Con el fin de comparar los efectos de la adición de una enzima endoproteasa prolil-específica en el mosto de malta y en el mosto de cebada, se llevaron a cabo experimentos en los que se agregaron diferentes cantidades de Endo-Pro A a pasta de cebada. El pH era 5,6 para el mosto de malta y 6,1 para el mosto de cebada. Los resultados obtenidos con el mosto de cebada en los ensayos de enturbiamiento por enfriamiento mostraron que, tal como se observaba previamente para los mostos de malta, el tratamiento de la pasta de cebada con una endoproteasa prolil-específica induce una importante reducción del enturbiamiento por enfriamiento del mosto de cebada. Tanto las pastas de malta como de cebada tratadas con una endoproteasa prolil-específica resultaron en mostos más estabilizados, pero el efecto era más acusado en los mostos de malta que en los de cebada. Efectivamente, la adición en la pasta de 200 \mul de Endo-Pro A induce una reducción del enturbiamiento de alrededor del 59% en mostos de cebada y de más del 70% en los de malta. Los ensayos realizados con 50 \mul de Endo-Pro A incrementan la reducción del enturbiamiento hasta el 82% en los mostos de malta y no la mejora en los mostos de cebada en comparación con los experimentos con 200 \mul de Endo-Pro A. Sorprendentemente, la adición de Endo-Pro A a la pasta de cebada resultó en un mosto filtrado claro, mientras que los mostos no tratados con Endo-Pro resultaron en filtrados nubosos (la filtración de la pasta de cebada se realizó a temperatura ambiente y la turbidez de los mostos fue medida a temperatura ambiente sin agregado de etanol). Este efecto es observado con cualquiera de las cantidades de endoproteasa prolil-específica agregadas a la pasta de
cebada.

Ejemplo III Reducción del enturbiamiento en vino

Se agregaron diferentes dosis (0, 30, 60, 150 \mul) de una endoproteasa prolil-específica (Endo-Pro B) con una actividad específica de 6,0 U/ml a matraces que contenían 500 ml de vino blanco (vino tal como se describe en Materiales) y se incubó a temperatura ambiente (22-25ºC) durante 19 días bajo atmósfera de nitrógeno. Se midió la estabilidad del enturbiamiento del vino después de 0,6, 8, 12 y 19 días utilizando un ensayo por calentamiento tal como se describe en Métodos.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 8.

En la Tabla 8, la turbidez del vino es expresada en unidades de turbidez nefelométricas (NTU), \DeltaNTU = turbidez medida en NTU de las muestras de vino después de calentamiento menos turbidez medida en NTU de las muestras de vino previamente calentadas. La cantidad de bentonita requerida para estabilizar las proteínas del vino fue calculada según la fórmula:

(1,48 x \Delta NTU) + 2

Como es sabido, es necesaria una menor cantidad de bentonita para prevenir la formación de enturbiamiento en el vino cuando éste es menos susceptible a la formación de enturbiamiento.

TABLA 8 Efecto de la adición de enzima endoproteasa prolil-específica en vino blanco sobre la cantidad de enturbiamiento formado después de calentamiento

8

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Los resultados de la Tabla 8 muestran que la adición de una endoproteasa prolil-específica al vino blanco antes de calentamiento reduce la formación de enturbiamiento en el vino después de calentamiento. El efecto se observó después de 6 días de incubación a temperatura ambiente. Efectivamente, la disminución del enturbiamiento alcanzó un 39% con 150 \mul de Endo-Pro B y alrededor del 12% con 30 \mul o 60 \mul de Endo-Pro B. Después de 12 días y con cualquier cantidad de endoproteasa prolil-específica añadida, la reducción del enturbiamiento alcanzó el 46% y superó el 70% después de 19 días. Por todo ello, es claro que la endoproteasa prolil-específica puede ser utilizada para evitar o reducir en gran medida la cantidad de bentonita requerida para estabilizar el vino contra la formación de enturbiamiento.

Ejemplo IV Reducción del enturbiamiento en jugo de fresas

Se preparó un jugo de fresas de la forma siguiente: las fresas fueron descongeladas y comprimidas y posteriormente blanqueadas (calentadas) a 90ºC para destruir todas las enzimas endógenas como las polifenol oxidasas, y para desnaturalizar las proteínas. Las fresas comprimidas se enfriaron luego a 50ºC, se maceraron durante 30 minutos a 50ºC con 600 g/l de Rapidase BE sùper (un producto enzimático comercial de DSM, Francia) y prensadas en una prensa neumática. Con el fin de eliminar las proteínas desnaturalizadas, la mezcla resultante fue centrifugada a una velocidad de 8000 rpm y filtrada. El jugo de fresa obtenido fue recogido. El ensayo de alcohol acidificado fue negativo, lo que confirma que el jugo estaba libre de pectina. El pH del jugo fue de 3,3.

Incubación del jugo Endo-Pro A / fresas: Se agregaron diferentes volúmenes (0, 5, 10, 20 \mul) de Endo-Pro A (5,06 U/ml) a 100 ml del jugo de fresas y se incubó a 50ºC durante 60 min. Se realizaron dos experimentos control, (i) en el primero se añadieron 20 \mul de Endo-Pro A desactivada (incubada 30 min a 80ºC) y (ii) un segundo control con adición de 200 mg de PVPP a 20 ml de jugo de fresas previamente incubado 1 hora a 50ºC. Después de haber sido mezclado durante 15 min a temperatura ambiente, la PVPP fue eliminada por centrifugación.

Ensayo de calentamiento del jugo: se midió la turbidez del jugo antes y después de calentar las muestras de jugo de fruta a 80ºC durante 30 min. Antes de medir la turbidez, los jugos calientes se enfriaron bajo agua fría.

Las mediciones de turbidez se realizaron en un turbidímetro previamente calibrado con estándares de turbidez NTU de Reagecon (Irlanda).

TABLA 9 Efecto de la adición de endoproteasa prolil-específica sobre el enturbiamiento del jugo de fruta

9

Los resultados de la Tabla 9 muestran que la adición de 50 \mul de Endo-Pro A a 100ml de jugo de fresa disminuye el enturbiamiento formado después del ensayo de calentamiento del jugo en un 25,7%. La adición de 100 \mul de Endo-Pro A a 100ml de jugo de fruta no mejoró la reducción del efecto de enturbiamiento comparado con el ensayo de 5 \mul. Posiblemente, la acción de la enzima es máxima con 5 \mul y con una mayor cantidad de enzima se obtiene una mayor precipitación de proteínas.

Incluso la enzima desactivada reduce la cantidad de enturbiamiento formado, sin embargo el efecto es mucho menos pronunciado. Después de agregar PVPP, apenas se observó enturbiamiento, pero el color de la muestra también desapareció. El hecho de que agregar PVPP disminuya la formación de turbidez indica que también el enturbiamiento del jugo de fresa es resultado, probablemente, de la interacción polifenol-proteína.

<110> DSM NV

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<120> Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en bebidas.

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<130> Secuencias de depósitos extranjeros de endopro

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<140>

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<141>

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<150> 01200706.8

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<151> 2001-02-26

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<150> 00204404.8

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<151> 2000-12-07

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<150> 01204464.0

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<151> 2001-11-15

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1581

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 1

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10

100

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<210> 2

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<211> 3290

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 2

11

12

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<210> 3

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<211> 1581

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 3

13

130

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<210> 4

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<211> 526

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 4

14

15

16

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<210> 5

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<211> 526

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 5

17

18

19

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<210> 6

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<211> 1551

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<212> DNA

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<213> Aspergillus niger

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<400> 6

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20

200

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<210> 7

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<211> 516

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<212> PRT

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<213> Aspergillus niger

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<400> 7

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22

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Claims (37)

1. Método para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida en el que se agrega a la bebida una endoproteasa prolil-específica.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la endoproteasa agregada tiene una actividad prolil-específica máxima a un pH que se corresponde con el pH de la bebida a la cual se agrega.

3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la bebida contiene proteínas.

4. Método según la reivindicación 3, en donde la bebida contiene polifenoles.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la bebida tiene un valor de pH por debajo de 7.

6. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde al menos 150 mili-unidades de actividad endoproteasa prolina-específica por gramo de proteína de la bebida, actividad determinada mediante medida de actividad con Z-Gly-Pro-pNA como sustrato, se agregan a la bebida.

7. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde al menos 500 mili-unidades de actividad endoproteasa prolina-específica por gramo de proteína de la bebida, actividad determinada mediante medida de actividad con Z-Gly-Pro-pNA como sustrato, se agregan a la bebida.

8. Método según cualesquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde al menos una unidad de actividad endoproteasa prolina-específica por gramo de proteína en la bebida, actividad determinada mediante medida de actividad con Z-Gly-Pro-pNA como sustrato, se agregan a la bebida.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la bebida es cerveza.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la bebida es vino.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la bebida es jugo de fruta.

12. Método según la reivindicación 9, donde la endoproteasa prolil-específica se agrega a una pasta de malta.

13. Método según la reivindicación 9, en donde la endoproteasa prolil-específica se agrega a una cerveza antes que se forme el enturbiamiento.

14. Método según la reivindicación 9, en donde la endoproteasa prolil-específica se agrega a una cerveza fermentada después de que se ha formado enturbiamiento.

15. Método según la reivindicación 10, en donde la endoproteasa prolil-específica se agrega a un vino fermentado.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la endoproteasa prolil-específica es una endoproteasa prolil-específica aislada o purificada.

17. Un polipéptido aislado que tiene actividad endoproteasa prolina-específica, seleccionado del grupo consistente en:

(a)

un polipéptido con una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 40% de identidad total con las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nº4, SEQ ID Nº5 ó SEQ ID Nº7 o un fragmento de las mismas;

(b)

un polipéptido que es codificado por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad con (i) la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3 ó SEQ ID Nº6 o un fragmento de las mismas que es al menos de un 80 a un 90% idéntico sobre 60, preferentemente sobre 100 nucleótidos, especialmente al menos un 90% idéntico sobre 200 nucleótidos o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a las secuencias de ácido nucleico de (i).

18. Polipéptido de la reivindicación 17, que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 50%, preferentemente al menos un 60%, preferentemente al menos un 65%, preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, aún más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 95% y aún más preferentemente al menos un 97% de identidad con SEQ ID Nº4, SEQ ID Nº5 ó SEQ ID Nº7.

19. Polipéptido de las reivindicaciones 17 ó 18, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº4, SEQ ID Nº5 ó SEQ ID Nº7.

20. Polipéptido de las reivindicaciones 17 ó 18, que está codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, más preferentemente bajo condiciones de rigurosidad media y especialmente bajo condiciones de rigurosidad alta, con (i) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3 ó SEQ ID Nº6 o un fragmento de las mismas, o (ii) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3 ó SEQ ID Nº6.

21. Polipéptido de las reivindicaciones 17 a 20, el cual se obtiene a partir de un hongo, preferentemente de un Aspergillus, especialmente de Aspergillus niger.

22. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido de las reivindicaciones 17-21, o que hibridiza con la SEQ ID Nº1, SEQ ID Nº2, SEQ ID Nº3 ó SEQ ID Nº6 bajo condiciones de baja rigurosidad, más preferentemente bajo condiciones de rigurosidad media y especialmente bajo condiciones de alta rigurosidad.

23. Un constructo de ácido nucleico que comprende al polinucleótido de la reivindicación 22 unido operativamente a una o más secuencias control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

24. Un vector de expresión recombinante que comprende al constructo de ácido nucleico de la reivindicación 23.

25. Una célula huésped recombinante que comprende al constructo de ácido nucleico de la reivindicación 23 o al vector de la reivindicación 24.

26. Método para producir el polipéptido según cualesquiera de las reivindicaciones 17-21 que comprende el cultivo de una cepa/célula huésped recombinante según con la reivindicación 25, para producir un sobrenadante y/o células que comprenden el polipéptido; y recuperar tal polipéptido.

27. Polipéptido producido por el método de la reivindicación 26.

28. Método para producir el polipéptido de las reivindicaciones 17-21, que comprende el cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácido nucleico que contiene un polinucleótido que codifica al polipéptido bajo las condiciones adecuadas para la producción del polipéptido; y recuperación del polipéptido.

29. Polipéptido producido por el método de la reivindicación 28.

30. Molécula de ADN que codifica una endoproteasa según las reivindicaciones 17-21.

31. Utilización de un filtrado obtenido a partir de un caldo de fermentación obtenido por el método de la reivindicación 28 para la prevención o reducción del enturbiamiento en una bebida.

32. Utilización de una endoproteasa prolil-específica según cualquiera de las reivindicaciones 17-21 en la preparación de una bebida.

33. Utilización de endoproteasas prolil-específicas purificadas en la preparación de cerveza, vino o jugo de fruta.

34. Bebida que se obtiene por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-16.

35. Cerveza que se obtiene por un método según la reivindicación 9.

36. Vino que se obtiene por el método según la reivindicación 10.

37. Jugo de fruta que se obtiene por el método según la reivindicación 11.