ES2258214T3 - Sistema y procedimiento para la produccion de proteinas glucosiladas recombinantes en un huesped procariotico. - Google Patents

Abstract

Organismo procariota en el que se introduce un ácido nucleico que codifica para: a)glicosiltransferasas específicas para el ensamblaje de un oligosacárido sobre un vehículo lipídico, b)una o más proteínas diana recombinantes que comprenden una secuencia de consenso Asn-X-Ser (Thr), en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro, y c)una OTasa de C. jejuni que une covalentemente el oligosacárido de a) a la secuencia de consenso de dichas una o más proteínas diana de b).

Description

Sistema y procedimiento para la producción de proteínas glucosiladas recombinantes en un huésped procariótico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de expresión y a un procedimiento para la producción de glicoproteínas recombinantes humanas y/o animales y/o vegetales y/o procariotas y/o fúngicas. Las glicoproteínas de este tipo se pueden utilizar como fármacos de nutrición o médicos para personas o animales o plantas debido a su estructura idéntica a las glicoproteínas producidas normalmente en estos organismos.

Antecedentes de la invención

La glucosilación constituye una de las más importantes de todas las modificaciones postranslacionales de proteínas en células eucarióticas y puede tener numerosos efectos en la función, estructura, propiedades físicas y elección de proteínas particulares. Por lo general, se va a considerar que la mitad carbohidrato posee efectos significativos tanto en la estructura como en las características físicoquímicas de una proteína y que puede afectar su actividad enzimática, antigenicidad o estabilidad térmica. Los azúcares se pueden unir a través del grupo \varepsilon-amino de una asparragina (enlace N-glucosídico) o del grupo hidroxilo de un residuo de serina o treonina (enlace O-glucosídico).

La glucosilación de proteína N-unida es con mucho la modificación de proteína más común encontrada en eucariotas. El procedimiento de glucosilación complejo se inicia en la cara citoplásmica del retículo endoplasmático (ER) con el ensamblaje de un oligosacárido en el vehículo lipídico dolicolpirofosfato [Burda, P. y Aebi, M. (1999). The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim. Biophys. Acta, 1426, 239-257]: 2 residuos de N-acetilglucosamina y 5 residuos de manosa se unen a este lípido de una manera gradual. El oligosacárido unido al lípido (LLO) se suelta a continuación en el lumen del ER, en el que se obtiene la longitud completa de LLO mediante la adición de 4 residuos de manosas y 3 residuos de glucosas. En la reacción central del procedimiento, este oligosacárido se transfiere a los residuos de asparragina seleccionados de entre polipéptidos sintetizados de nuevo. Esta reacción se cataliza mediante la oligosacariltransferasa (OTasa) en el lumen del ER. La OTasa es un complejo de por lo menos 8 subunidades y esta enzima es responsable de la formación del enlace N-glucosídico. Mientras todavía en el ER, se eliminan rápidamente del oligosacárido de la glicoproteína tres residuos de glucosas y un residuo de manosa. Las glicoproteínas se transportan a continuación al aparato de Golgi en el que se recortan adicionalmente y ocurre la adición de mitades de azúcar antes de que se seleccionen para sus destinos finales [Varki, A., Cummings, R., Esko, J., Freeze, H., Hart, G., y Marth, J. (1999) Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York]. Mientras la síntesis de LLO es un procedimiento elevadamente conservativo en células eucariotas, las modificaciones en el Golgi son no sólo especies específicas sino también específicas de tipo celular y llevan a un grado elevado de diversidad con respecto a la estructura de los oligosacáridos N-unidos.

Técnica anterior

La producción de proteínas humanas en una variedad de sistemas de expresión heterólogos se ha convertido en una técnica importante para generar proteínas recombinantes para objetivos de investigación así como en aplicaciones farmacéuticas. Se reconoce por lo general que no existe un sistema de expresión universal disponible para la producción. Además, la selección de un tipo de célula para la expresión de proteínas heterólogas depende de muchos factores. Éstos incluyen criterios tales como las características de crecimiento celular, niveles de expresión, expresión intracelular o extracelular y actividad biológica de la proteína de interés así como de su utilización pretendida. Pero uno de los criterios más importantes a considerar es si una proteína necesita glucosilarse para su aplicación. Muchas terapéuticas humanas son glicoproteínas y la importancia de la modificación postranslacional de polipéptidos con oligosacáridos definidos está bien documentada por su implicación en numerosos fenómenos biológicos.

En las glicoproteínas de mamíferos, la mayoría de los N-glicanos son del tipo complejo, es decir, están constituidos por un núcleo de pentasacárido de dos residuos de N-acetilglucosamina y tres residuos de manosa. Este núcleo es la estructura que queda del oligosacárido que se transfirió originalmente a partir de dolicolpirofosfato a proteínas. En el Golgi se modifica además con antenas que comprenden N-acetilglucosamina, galactosa, ácido siálico y a menudo residuos de fucosa adicionales. De este modo es posible una enorme e impresionante diversidad de estructuras de oligosacáridos complejos. La importancia de los N-glicanos complejos y el papel esencial de estas estructuras se muestran en experimentos utilizando ratones mutantes nulos incapaces de sintetizar estos complejos de tipo N-glicano. Estos ratones mueren antes de nacer. Recientemente, se ha descrito en humanos el desorden congénito de la glucosilación (CDG). Esto es un grupo de enfermedades multisistémicas congénitas caracterizado por la deficiencia en la generación de N-glicanos. Estos desórdenes se manifiestan por una amplia variedad de características clínicas, tales como desórdenes del desarrollo del sistema nervioso, retardo psicomotor, características dismórficas, hipotonía, desórdenes de coagulación e inmunodeficiencia. El amplio espectro de características refleja el papel crítico de las N-glicoproteínas durante el desarrollo embrionario, la diferenciación y el mantenimiento de las funciones de la célula y acentúa la importancia de la estructura de oligosacárido correcta.

Ya que la mayoría de proteínas terapéuticamente relevantes se glucosilan en sus formas naturales, se deberían asimismo glucosilar como proteínas recombinantes para conseguir la actividad biológica correcta. De este modo, ha alcanzado cada vez más importancia la monitorización de la estructura de glucosilación en el control de calidad de proteínas recombinantes para asegurar la seguridad, eficacia y consistencia del producto. Se han desarrollado sistemas para la expresión de proteínas glucosiladas. Los más comúnmente utilizados son las líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) [Grabenhorst, E., Schlenke, P., Pohl, S., Nimtz, M. y Conradt, H.S. (1999) Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells. Glycoconjugate Journal, 16, 81-97], células de insecto [Altmann, F., Staudacher, E., Wilson, I.B. y Marz, L. (1999) Insect cells as hosts for the expression system for recombinant glycoproteins. Glycoconjugate Journal, 16, 109-123] o células fúngicas [Malissard, M., Zeng, S. y Berger, E.G. (1999) The yeast expression system for recombinant glycosyltransferases. Glycoconjugate Journal, 16, 125-139, o Maras, M., van Die, I., Contreras, R y van den Hondel, C.A. (1999) Filamentous fungi as production organisms for glycoproteins of bio-medical interest. Glycoconjugate Journal, 16, 99-107]. Todas estas líneas celulares presentan la capacidad para glucosilar proteínas, pero muestran diferencias mayores en la producción de glicoproteínas recombinantes. Según se ha mencionado anteriormente, la síntesis del LLO y la transferencia del oligosacárido a los polipéptidos es un mecanismo elevadamente conservativo en todos los eucariotas, mientras que el procesamiento y recorte adicionales de los N-glicanos en el Golgi varía entre organismos y tipos de célula. Por lo tanto, la estructura final de la glicoproteína recombinante se define mediante la producción celular utilizada. Las células CHO son las líneas celulares de mamífero utilizadas comúnmente para la expresión de glicoproteínas recombinantes. Son capaces de sintetizar los N-glicanos de tipo complejo, pero algunos residuos de azúcar terminales específicos de tejido humano no se sintetizan mediante estas células ya que no expresan las glicosiltransferasas adecuadas. Por lo tanto, las líneas celulares huésped se deben mejorar mediante ingeniería genética con la introducción de estas glicosiltransferasas.

Las células de insecto [ver asimismo el documento WO 00/52135] se utilizan asimismo ampliamente para producir proteínas recombinantes, ya que pueden sintetizar grandes cantidades de una proteína de interés cuando están infectadas con vectores de expresión génica basados en baculovirus potentes y pueden proporcionar modificaciones postranslacionales similares a las proporcionadas mediante las células de mamífero. La ruta de N-glucosilación es análoga a la ruta de mamífero hasta la formación del pentasacárido central. Pero normalmente las células de insecto no expresan transferasas adicionales en el Golgi y por lo tanto los N-glicanos producidos están truncados (paucimanosídico) en lugar de un tipo complejo según se ha descubierto en las células de mamífero.

Los hongos, en particular Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, son organismos huésped adecuados para la producción de proteínas heterólogas eucariotas. Estos sistemas combinan técnicas bien conocidas de manipulación molecular y genética, las células crecen fácilmente y poseen la capacidad para las modificaciones postranslacionales complejas tales como la glucosilación de proteínas. En contraste con las células animales, los hongos que no recortan adicionalmente el oligosacárido en el Golgi pero en su lugar lo alargan directamente mediante la adición de residuos de manosa para formar mananos con hasta 200 unidades de manosa. Algunas glicoproteínas escapan de estas modificaciones y su maduración es más limitada, proporcionando oligosacáridos cortos de tipo central con hasta 13 residuos de manosa.

Estos tres ejemplos de N-glucosilación en eucariotas acentúan las diferencias en la estructura de N-glicanos. La implicación de la función revela que el análisis exacto de la estructura es esencial. Se han realizado durante los últimos años avances significativos en los análisis estructurales de carbohidrato. Ha aparecido instrumentación muy sensible para el análisis de la glucosilación especialmente en la espectrometría de masas (ESI-MS en línea, espectrometría de masas tándem de nanopulverización (ESI-MS/MS) y técnicas mejoradas de MALDI/TOF).

Problemas en la técnica anterior

La importancia de una estructura de oligosacárido elevadamente definida en glicoproteínas recombinantes contrasta claramente con la incapacidad de los procesos biotecnológicos utilizados actualmente para generar glicoproteínas. Esto es debido al hecho de que la estructura de un oligosacárido unido a proteína se determina directamente mediante el tipo de célula utilizado y todos los sistemas de producción eucarióticos muestran esta especificidad. Sería posible construir genéticamente líneas celulares eucarióticas de tal forma que se produzca una estructura de oligosacárido definida. Sin embargo, la plétora de las glicosiltransferasas activas en el compartimiento Golgi de eucariotas hace tal enfoque muy difícil. Los problemas adicionales con la utilización de los sistemas de expresión eucariota son los siguientes: en general el sistema de expresión de mamífero posee sus desventajas en la utilización del medio de crecimiento, que contiene suero bovino. Esto aumenta la preocupación por la bioseguridad debido a la posible contaminación con encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Además los cultivos de líneas celulares humanas son mucho más difíciles de mantener estériles, estas células crecen lentamente y requieren controles de procedimientos caros. Según se ha mencionado anteriormente, la glicoproteína específica sintetizada depende directamente de la línea celular o del tipo de célula utilizada. En otras palabras, una glicoproteína recombinante sólo se modifica con su N-glicano original si el sistema heterólogo expresa las mismas enzimas que la ruta de la N-glucosilación en el Golgi (Fig. 1B) y esto representa la mayor desventaja de las líneas celulares humanas en la expresión de glicoproteínas recombinantes.

Las dificultades de la producción de proteínas recombinantes en células de insecto con la ayuda del sistema de expresión de baculovirus son las siguientes: los baculovirus poseen esencialmente un modo de infección lítico, es decir, cuando el producto se cultiva, se lisa una gran proporción de las células huésped y se liberan enzimas degradativas. Además la síntesis de proteínas es máxima cercana a la muerte de las células infectadas y es posible que el procesamiento total de la proteína sea subóptimo en ese momento. Particularmente las proteínas destinadas a la membrana de plasma o a la secreción son afectadas por la depleción de componentes de la maquinaria postranslacional de la ruta secretora. Además, el cultivo de células de insecto a gran escala ofrece retos particulares al biotecnólogo debido al elevado consumo de oxígeno y a la elevada sensibilidad a la cizalladura de las células en comparación con las células de mamífero. Como en las células de mamífero, la mayor desventaja en la expresión heteróloga de glicoproteínas reside en la estructura diferente de N-glicano según se ha descrito anteriormente. Especialmente la falta de residuos de ácido siálico terminal es perjudicial porque estos azúcares juegan papeles importantes en la biología de la glicoproteína.

En resumen, los tres sistemas de expresión eucariótica principales no consiguen mayoritariamente producir glicanos de una estructura deseada. En contraste a los sistemas eucarióticos, la bacteria gramnegativa Escherichia coli ofrece diversas ventajas técnicas para la producción de proteínas heterólogas. Es el sistema productor más antiguo y utilizado. Sin embargo, la incapacidad de las células de E. coli para ejercer modificaciones postranslacionales de proteína sigue siendo la desventaja mayor para su utilización según el huésped preferido para la producción de proteínas humanas.

Szymanski et al. (Molecular Microbiology (1999) 32(5), 1022-1030) describe la caracterización de un locus genético a partir de Campylobacter jejuni 81-176 (O:23, 36), que parece estar implicado en la glucosilación de múltiples proteínas, incluyendo la flagelina. Para dicha caracterización este locus genético se introdujo en E. coli con el resultado de que un liposacárido (LPS) en E. coli tuvo una inmunorreactividad alterada.

Sumario de la invención

Para superar el problema de la producción de glicoproteínas recombinantes en E. coli, se introduce en esta bacteria una maquinaria metabólica capaz de obtener la glucosilación de la proteína. Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar un sistema de expresión con dichas proteínas recombinantes, en particular las proteínas N-glucosiladas que se pueden producir.

Este objetivo de la presente invención se consigue -según un primer aspecto- mediante la combinación de las características de la reivindicación independiente 1, en la que se propone un sistema para la producción de proteínas seleccionadas N-glucosiladas recombinantes humanas, de tipo humano, o animal, o vegetal o fúngica, o bacteriana, comprendiendo el sistema un organismo procariota en el que se introduce una información genética que codifica un aparato metabólico capaz de llevar a cabo la N-glucosilación requerida de la proteína seleccionada. El sistema según la presente invención se caracteriza porque dicho organismo procariótico contiene asimismo la información genética requerida para la expresión de una o más proteínas diana recombinantes.

Este objetivo de la presente invención se consigue -según un segundo aspecto- mediante la combinación de las características de la reivindicación independiente 4, en la que se propone un procedimiento para producir proteínas seleccionadas N-glucosiladas humanas recombinantes, de tipo humano, o animal, o vegetal, o fúngicas o bacterianas, comprendiendo el sistema un organismo procariota en el que se introduce una información genética que codifica para un aparato metabólico capaz de llevar a cabo la N-glucosilación requerida de la proteína diana. El procedimiento según la presente invención se caracteriza porque dicho organismo procariota contiene asimismo la información genética requerida para la expresión de una o más proteínas diana recombinantes.

Las características adicionales y de la invención derivan de las reivindicaciones dependientes.

Ventajas sobre la técnica anterior

Ya que la E. coli es más fácil de manipular y de utilizar y su genética es muy bien conocida, la producción de glicoproteínas humanas, de tipo humano, o animal o vegetal o fúngicas o bacterianas en E. coli es un avance muy importante en biotecnología.

Como se ha mencionado anteriormente, las glicoproteínas recombinantes se tienen que producir hasta la fecha en eucariotas menos adecuados. Pero aunque las primeras etapas en la síntesis de las N-glicoproteínas son elevadamente conservativas en todos los organismos, el recorte y el procesamiento adicionales difieren bastante significativamente entre eucariotas. Por lo tanto, los N-glicanos de las glicoproteínas recombinantes dependen de los genes de glucosilación presentes en el sistema de expresión utilizado.

Esto podría proporcionar un incremento en la producción de glicoproteínas recombinantes en las que los N-glicanos difieran en su estructura comparada con la original.

En contraste, la introducción de una información genética que codifica para un aparato metabólico capaz de llevar a cabo la glucosilación requerida de la proteína, por ejemplo, un operón, en un organismo que normalmente no glucosila proteínas ofrece la oportunidad de manipular la estructura del N-glicano mediante la introducción específica de glicosiltransferasas.

Breve descripción de los dibujos

Algunos de los problemas conocidos de la técnica anterior así como el procedimiento según la presente invención se explican con mayor detalle haciendo referencia a los dibujos esquemáticos que son formas de realización de la presente invención a título de ejemplos no limitativos del alcance de protección de la presente invención. Esto se muestra en:

la Fig 1: la expresión de las glicoproteínas recombinantes en eucariotas, mientras

la Fig 1A muestra la expresión de una glicoproteína diana, y

la Fig. 1B muestra la construcción genética de las rutas de glucosilación existentes en el Golgi;

la Fig. 2: el sistema de expresión de Escherichia coli, con la expresión de una proteína diana recombinante y la introducción de una ruta de glucosilación específica según la presente invención; y en

la Fig. 3 la leyenda para los signos que representan los elementos individuales de los residuos de oligosacáridos de las glicoproteínas en la Fig. 1 y en la Fig. 2.

Descripción detallada de la invención

La Figura 1 muestra la expresión de glicoproteínas recombinantes en sistemas de expresión eucariotas. La figura 1A muestra la expresión de una glicoproteína diana, en la que el ensamblaje del lípido unido al oligosacárido (LLO; etapa I) y la transferencia del oligosacárido a la proteína por medio de una OTasa (etapa II) es un procedimiento elevadamente conservativo en el retículo endoplásmático (ER). En contraste, las modificaciones en el Golgi son específicas de tipo celular (etapa III).

La figura 1B muestra otra vez la expresión de una glicoproteína diana, mientras que el ensamblaje del lípido unido al oligosacárido (LLO, etapa I) y la transferencia del oligosacárido a la proteína por medio de una OTasa (etapa II) es un procedimiento elevadamente conservativo en el ER. Además, se muestra un intento de llevar a cabo la construcción genética de las rutas de glucosilación existentes en el Golgi. Para producir una proteína recombinante con una estructura específica en células eucariotas, las células huésped tienen que ser adaptadas mediante la construcción genética de esta ruta de glucosilación en el Golgi. El signo "X" marca las deleciones requeridas para excluir las rutas no deseadas. "Asn" indica una asparragina, "PP" un pirofosfato y "SO_{4}" un grupo sulfato.

Tanto la figura 1A como la 1B muestran que la expresión de la proteína recombinante se lleva a cabo fuera del ER (etapa Ib) y que esta proteína diana se importa a continuación dentro del ER (etapa IIb). La explicación de los signos que representan los elementos individuales de los oligosacáridos está basada en la leyenda de la Fig. 3.

Para obtener una glicoproteína recombinante con una estructura de oligosacárido específica en células eucariotas se requiere la adaptación de rutas esenciales, elevadamente complejas y esto podría posiblemente afectar a la viabilidad de la célula de producción. Éste no es el caso en el sistema de E. coli. En la presente memoria, se obtiene la adaptación mediante la introducción de componentes específicos de la maquinaria de glucosilación que llevan a la glicoproteína deseada (Fig. 2).

Ya que todos los componentes básicos (monosacáridos) requeridos para el ensamblaje de oligosacáridos están presentes en las células de E. coli, la solución mencionada anteriormente requiere la introducción:

a)

de glicosiltransferasas específicas para la unión del oligosacárido en un vehículo lipídico, y

b)

de una OTasa que une covalentemente este oligosacárido a residuos específicos de la proteína deseada.

Esta solución ofrece la posibilidad de diseñar una estructura de oligosacárido mediante la expresión de glicosiltransferasas específicas y no afecta las funciones vitales de la célula de producción.

La Figura 2 muestra el sistema de expresión de Escherichia coli según la presente invención con la expresión de una proteína diana recombinante (etapa Ib), que se introduce a continuación en la síntesis de glicoproteína (etapa IIb). Para obtener una glicoproteína específica en E. coli, se introducen en el huésped las glicosiltransferasas específicas para el ensamblaje del oligosacárido unido al lípido (LLO; etapa I). La OTasa une covalentemente este oligosacárido a los residuos específicos de la proteína deseada (etapa II).

En otro intento, el oligosacárido, que se une a la proteína deseada según se describe en la Figura 2, se puede intercambiar utilizando un oligosacárido diferente como un sustrato en una reacción enzimática in vitro. Se mostró que la endo-\beta-N-acetilglucosaminidasa (Endo-A) inmovilizada a partir de la Arthrobacter protophormiae podría transferir un oligosacárido a la ribonucleasa B que contiene una N-acetilglucosamina unida covalentemente [Fujita, K., Tanaka, N., Sano, M., Kato, I., Asada, Y. y Takegawa, K. (2000) Synthesis of neoglycoenzymes with homogeneous N-linked oligosaccharides using immobilized endo-\beta-N-acetylglucosaminidase A. Biochemical and Biophysical

\hbox{Research}

Communications, 267, 134-138]. De este modo, la presente invención proporciona la posibilidad de producir una glicoproteína en E. coli y a continuación, en una segunda etapa, modificar el oligosacárido que se une covalentemente a la proteína intercambiándolo con un oligosacárido diferente de la estructura definida con la inmovilizada Endo-A in vitro.

La presente invención comprende la producción de glicoproteínas glucosiladas. Existen muchos beneficios derivados de la glucosilación de dichas proteínas diana. Tales beneficios incluyen, pero no se limitan a, aumento de la vida media de circulación in vivo de una proteína; rendimientos incrementados de proteínas recombinantes; actividad biológica incrementada de la proteína incluyendo, pero no limitándose a, actividad enzimática, actividad receptora, actividad de unión; antigenicidad alterada; propiedades terapéuticas mejoradas; capacidades incrementadas como una vacuna o una herramienta de diagnóstico, y similares. Ejemplos de glicoproteínas de mamífero que se pueden producir con la presente invención y que se pueden utilizar como medicamentos para humanos, animales o plantas, incluyen pero no se limitan a, eritropoyetina, transferrina, interferones, inmunoglobulinas, interleucinas, plasminógeno y tirotropina. Se pueden producir asimismo glicoproteínas procariotas y/o fúngicas con la presente invención y se pueden utilizar como medicamentos para humanos, animales y plantas, por ejemplo, glicoproteínas de C. jejuni y de hongos. Aplicaciones adicionales para glicoproteínas producidas mediante la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enzimas industriales, alimentos funcionales, cosméticos, materiales para el envasado y textiles.

Ejemplo 1

La presente invención se basa en el descubrimiento, de que Campylobacter jejuni, una bacteria gramnegativa, produce glicoproteínas. Utilizando procedimientos conocidos per se, hemos introducido el gen C. jejuni que codifica AcrA, una glicoproteína, en E. coli. Esto resulta en la expresión de una proteína AcrA no glucosilada (ver Fig. 2, etapa Ib). Posteriormente y utilizando otra vez procedimientos conocidos, un operón de C. jejuni codifica a) glicosiltransferasas específicas y b) se introdujo una OTasa en E. coli. Esto resultó en la producción de la proteína AcrA glucosilada específicamente según la presente invención (ver Fig. 2, etapas I y II), según se ha verificado -utilizando siempre procedimientos conocidos por los expertos en la materia- mediante la unión de una lectina elevadamente específica y anticuerpos específicos glucosilados a la proteína AcrA producida heterólogamente [Michael Wacker et al. (2002) N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli (SCIENCE, vol. 298: 1790-1793]. Además la estructura del oligosacárido unido a AcrA se verificó mediante espectrometría de masas. A continuación se mostró, que el oligosacárido se transfirió sólo al grupo \varepsilon-amino de la asparragina dentro de la secuencia de consenso Asn-X-Ser/Thr en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro [Gavel, Y. y Von Heijne, G. (1990). Sequence differences between glycosylated and non-glycosylated Asn-X-Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering. Protein Eng. 3, 433-442]. Cuando la secuencia de consenso mutó, ya no se transfirió más el oligosacárido a la proteína. Por lo tanto, se verificó -utilizando siempre procedimientos conocidos por los expertos en la materia- que la OTasa de C. jejuni reconoció la misma secuencia de consenso que la OTasa de eucariotas y Archaea y transfirió el oligosacárido a la proteína mediante el mismo mecanismo propuesto [Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, S.M., North, S.J., Panico, M., Morris, H.R., Dell, A., Wren, B.W. y Aebi, M. (2002). N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298: 1790-1793].

Las glicosiltransferasas y las oligosacariltransferasas específicas utilizadas para modificar genéticamente E. coli pueden ser de origen procariota o eucariota ya que las glicosiltransferasas son ubicuas y las oligosacariltransferasas se conocen a partir de Archaea.

Claims (9)

1. Organismo procariota en el que se introduce un ácido nucleico que codifica para:

a)

glicosiltransferasas específicas para el ensamblaje de un oligosacárido sobre un vehículo lipídico,

b)

una o más proteínas diana recombinantes que comprenden una secuencia de consenso Asn-X-Ser (Thr), en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro, y

c)

una OTasa de C. jejuni que une covalentemente el oligosacárido de a) a la secuencia de consenso de dichas una o más proteínas diana de b).

2. Organismo procariota según la reivindicación 1, en el que dicho organismo procariota es Escherichia coli.

3. Organismo procariota según la reivindicación 1 ó 2, en el que el organismo procariota produce N-glicanos con una estructura específica que se define por el tipo de glicosiltransferasas específicas.

4. Procedimiento para la producción de proteínas diana N-glucosiladas recombinantes, comprendiendo dicho procedimiento la introducción de información genética que codifica para:

a)

glicosiltransferasas específicas para el ensamblaje de un oligosacárido sobre un vehículo lipídico,

b)

una o más proteínas diana recombinantes que comprenden una secuencia de consenso Asn-X-Ser(Thr), en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro, y

c)

una OTasa de C. jejuni que une covalentemente el oligosacárido de a) a la secuencia de consenso de dichas una o más proteínas diana de b) en un organismo procariota.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho organismo procariota es Escherichia coli.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 4 ó 5, en el que el organismo procariota produce N-glicanos con una estructura específica que se define por el tipo de glicosiltransferasas específicas.

7. Utilización de un organismo procariota según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la producción de proteínas diana N-glucosiladas recombinantes.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicho organismo procariota es Escherichia coli.

9. Utilización según la reivindicación 7 u 8, en la que el organismo procariota produce N-glicanos con una estructura específica que se define por el tipo de glicosiltransferasas específicas.