KR20050099536A

KR20050099536A - 글리코실화된 특이성 교환체

Info

Publication number: KR20050099536A
Application number: KR1020057014483A
Authority: KR
Inventors: 마티 살베르그
Original assignee: 트리펩 아베
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-05
Publication date: 2005-10-13
Also published as: AU2012200059A1; EP2230249A2; CN1747970A; US20100183635A1; US20050019333A1; EP2230249A3; AU2012200059B2; AU2004209457A1; EP1594898A2; US8658179B2; US20090305949A1; US8303956B2; US7332166B2; US20140081004A1; US7318926B2; US20060276621A1; JP2007516157A; CA2514270A1; WO2004069873A2; US9079962B2

Abstract

본 발명은 당 또는 당접합체를 포함하는 리간드/수용체 및 항원/항체 특이성 교환체에 관한 것이다. 이들 특이성 교환체의 제조 방법 및 인간 질병을 치료 또는 예방하기 위한 상기 특이성 교환체의 용도가 본 명세서에 개시되어 있다.

Description

글리코실화된 특이성 교환체{GLYCOSYLATED SPECIFICITY EXCHANGERS}

본 발명은 일반적으로 암과 세균, 효모, 기생충, 진균, 바이러스 등과 같은 병원체로부터 발생하는 질병들을 포함하는 인간 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 명세서에 개시된 실시태양들은 환자에게서 존재하는 자연 항체를 병원체쪽으로 전향(redirect)하는 글리코실화된 항원 도메인을 포함하는 특이성 교환체의 제조 및 용도에 관한 것이다.

특이성 교환체는 일반적으로 2개의 도메인, 즉 특이성 도메인과 항원 도메인으로 구성된다. 특이성 도메인의 성질에 따라 구별되는 2가지 일반적인 유형의 특이성 교환체가 존재한다(예를 들어 미국 특허 출원 제 10/372,735 호 참조). 특이성 교환체의 첫 번째 유형은 항원/항체 특이성 교환체이다. 다수의 상이한 유형의 항원/항체 특이성 교환체들이 제조될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 5,869,232; 6,040,137; 6,245,895; 6,417,324; 6,469,143 호; 및 미국 특허 출원 제 09/839,447 및 09/839,666 호; 및 국제 출원 제 PCT/SE95/00468 및 PCT/IB01/00844 호 참조).

항원/항체 특이성 교환체는 항체가 결합하는 아미노산 서열(즉 항원 도메인)에 접합된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 아미노산 서열(즉 특이성 도메인)을 포함한다. 항원/항체 특이성 교환체의 일부 특이성 도메인들은 상보성 결정 부위(CDR)의 아미노산 서열을 포함하고, 적어도 5 내지 35 미만의 아미노산 길이를 가지며, HIV-1 항원에 특이적이거나 간염 바이러스 항원에 특이적이다. 항원/항체 특이성 교환체의 일부 항원 도메인들은 바이러스, 세균 또는 진균 기원의 항체-결합 부위를 갖는 펩티드를 포함하고, 적어도 5 내지 35 미만의 아미노산 길이를 갖거나, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 또는 HIV-1로부터 수득한 펩티드(예를 들어 항원결정기를 포함하는 펩티드)를 포함한다.

특이성 교환체의 두 번째 유형인 리간드/수용체 특이성 교환체도 또한 특이성 도메인과 항원 도메인으로 구성되나, 상기 리간드/수용체 특이성 교환체의 특이성 도메인은 항원에 결합하는 항체의 서열과 상반되게, 병원체 상에 존재하는 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 즉, 리간드/수용체 특이성 교환체는 상기 리간드/수용체 특이성 교환체가 항원에 결합하는 항체의 서열을 포함하지 않지만, 대신에 병원체 상에 존재하는 수용체와 리간드의 상호작용을 통해서 병원체에 부착한다는 점에서 항체/항원 특이성 교환체와 다르다. 여러 가지 다른 유형의 리간드/수용체 특이성 교환체가 제조될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 6,660,842 호; 미국 특허 출원 제 10/372,735 호; 및 국제 출원 제 PCT/IB01/02327 호 참조).

리간드/수용체 특이성 교환체의 일부 특이성 도메인들은 세균 부착 수용체(예를 들어 세포외 피브리노겐 결합 단백질 또는 응집 인자 A 또는 B)에 대한 리간드인 아미노산 서열을 포함하고, 적어도 3 내지 27 미만의 아미노산 길이를 갖거나, 세균, 바이러스 또는 암 세포에 특이적이다. 리간드/수용체 특이성 교환체의 일부 항원 도메인들은 병원체 또는 독소의 항체-결합 부위를 갖는 펩티드를 포함하고, 적어도 5 내지 35 미만의 아미노산 길이를 갖거나, 소아마비 바이러스, TT 바이러스, B형 간염 바이러스 및 단순 포진 바이러스로부터 수득한 펩티드를 포함한다. 의학 분야에서의 이러한 진보에도 불구하고, 개인에게서 존재하는 항체를 표적 분자 쪽으로 전향하는 보다 특이적인 교환체에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

도 1은 당단백질 라이브러리를 인위적으로 합성하는데 사용될 수 있는 방법을 도시한다.

도 2는 환상 당단백질을 인위적으로 합성하는 방법을 도시한다.

도 3은 글리코실화된(gal-α-1,3 gal-β) 또는 글리코실화되지 않은 항원 도메인을 포함하는 CD4 리간드/수용체 특이성 교환체의 4가지 상이한 인간 혈청 샘플에 대한 상이한 반응성을 도시한다. "X" 축은 5 ㎍/㎖로 제공된 특이성 교환체를 나타내고, "Y" 축은 결합된 항체의 검출 후 405/650에서의 OD를 나타낸다.

도 4는 글리코실화된(gal-α-1,3 gal-β) 소 혈청 알부민(BSA) 존재 하에서 글리코실화된(gal-α-1,3 gal-β) 또는 글리코실화되지 않은 항원 도메인을 포함하는 CD4 리간드/수용체 특이성 교환체의 결합 저해를 도시한다. "X"축은 펩티드의 농도를 나타내고, "Y" 축은 결합된 항체의 검출 후 405/650에서의 OD를 나타낸다.

발명의 요약

본 발명의 태양은 적어도 하나의 당에 접합된 200 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 도메인을 포함하는 특이성 교환체에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 당은 Gal 항원, 바람직하게는 Gal α(1,3)Gal β이다. 이들 특이성 교환체는 리간드/수용체 특이성 교환체 또는 항원/항체 특이성 교환체일 수 있다. 상기 당은 항원 도메인이나 링커(linker)가 없는 특이성 도메인에 직접 접합 될 수도 있지만, 일부 실시태양은 상기 당 이외에 항원 도메인 및/또는 링커를 포함한다.

본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 일부 실시태양들은 세균(예를 들어 스타필로코커스), 바이러스(예를 들어 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인플루엔자 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)) 또는 암세포에 결합한다. 바람직한 특이성 교환체는 HIV에 결합하며, 이들 실시태양의 특이성 도메인들은 CD4 또는 CDR 펩티드(예를 들어 SEQ ID. NO: 1, SEQ ID. NO: 2, SEQ ID. NO: 3, SEQ ID. NO: 4, SEQ ID. NO: 5, SEQ ID. NO: 6, SEQ ID. NO: 7, SEQ ID. NO: 8 및 SEQ ID. NO: 9로 이루어진 군에서 선택된 서열)를 포함하고, 상기 적어도 하나의 당은 Gal α(1,3)Gal β이다. 상술한 특이성 교환체들은 150, 100, 50 또는 25 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 도메인을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 특이성 교환체는 세균, 바이러스 또는 암세포 증식의 감소가 필요한 환자에게서 상기 증식을 감소시키는데 사용될 수 있고, 상기와 같은 감소를 목적으로 하는 약제 및 제제를 제조하기 위해서 사용될 수 있다.

발명의 상세한 설명

당 또는 당접합체(예를 들어 혈당)를 포함하는 항체/항원 특이성 교환체 및 리간드/수용체 특이성 교환체("특이성 교환체"라 총칭한다)는 환자에게서 자연적으로 존재하는 항체와 강하게 반응하여 항원에 대한 상기 항체의 전향을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 태양은 당, 바람직하게는 혈액형당 및 보다 바람직하게는 gal-α-1-3 gal β 당을 포함하는 특이성 교환체(예를 들어 항체/항원 특이성 교환체 및 리간드/수용체 특이성 교환체)에 관한 것이다. 실시태양은 또한 병원체에 의한 감염 또는 암 등의 인간 질병을 치료하는데 사용될 수 있는, 상기 특이성 교환체를 포함하는 약제를 포함한다. 따라서, 상기 글리코실화된 특이성 교환체를 제조하는 방법 및 병원체 상에 존재하는 분자로 항체를 전향하기 위해 상기 특이성 교환체들을 사용하는 방법들도 실시태양이다.

특이성 교환체는 특이성 도메인과 항원 도메인을 포함한다. 상기 특이성 교환체의 특이성 도메인의 길이는 적당하게는 적어도 3 내지 200 아미노산, 바람직하게는 적어도 5 내지 100 아미노산, 더욱 바람직하게는 8 내지 50 아미노산, 더더욱 바람직하게는 10 내지 25 아미노산이다. 상기 특이성 교환체의 항원 도메인의 길이는 적당하게는 적어도 3 내지 200 아미노산, 바람직하게는 적어도 5 내지 100 아미노산, 더욱 바람직하게는 8 내지 50 아미노산, 더더욱 바람직하게는 10 내지 25 아미노산이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 특이성 교환체는 오직 글리코실화된 특이성 도메인(예를 들어 병원체에 대한 항체의 일부 또는 병원체 상의 수용체에 대한 리간드)만을 포함하며, 상기 글리코실화 부위 자체가 항원 도메인으로서의 역할을 한다. 즉, 본 명세서에 개시된 본 발명의 일부 태양은, 병원체 또는 암세포 상에 존재하는 항원결정기 또는 수용체를 지향하는 특이성 도메인을 포함하는 특이성 교환체(즉 항원/항체 및 리간드/수용체 특이성 교환체)에 관한 것으로, 이때 상기 특이성 도메인은 자체가 환자에게서 자연적으로 존재하는 항체들과 상호작용하는 항원 도메인인 하나 이상의 당(예를 들어 하나 이상의 gal-α-1-3 gal β 당을 갖는 글리코실화 도메인)에 접합된다.

본 명세서에 개시된 특이성 교환체는 병원체 상의 항원 또는 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함하는데, 이때, 상기 병원체로는 세균, 효모, 기생충, 진균, 암세포 및 병원성 펩티드를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 일부 실시태양들은 예를 들어 세균, 간염 바이러스(예를 들어 HAV, HBV, 또는 HCV), HIV, 인플루엔자 바이러스와 같은 독감 바이러스, 암 세포 항원결정기, 및 인간 질병과 연관된 펩티드(예를 들어 프리온 펩티드, 알츠하이머 펩티드(Aβ) 및 신경펩티드)에 결합하는 항체로부터 수득한 서열을 포함한다. 다른 실시태양은 세포외 기질 단백질의 단편(예를 들어 피브리노겐의 3 내지 5, 8, 9, 10, 12 또는 14의 연속 아미노산과 같은 3 내지 14 아미노산), 바이러스(예를 들어 HAV, HBV, HCV, HIV, 인플루엔자 바이러스) 상의 수용체에 대한 리간드, 또는 암세포 또는 병원성 펩티드 상의 수용체에 대한 리간드를 포함하는 특이성 도메인을 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 예를 들어, 상기 특이성 도메인은 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin), 플라스미노겐, 트롬보스폰딘(thrombospondin) 및 피브로넥틴으로 이루어진 군에서 선택된 세포외 기질 단백질의 단편(예를 들어, 3 내지 5, 8, 9, 10, 12, 14, 17 및 20의 연속 아미노산과 같은 3 내지 20 아미노산)인 리간드를 포함한다. 본 명세서에 개시된 특이성 교환체들 중 다수는 병원체 상에서 발견되는 수용체에 결합한다(항원/항체 상호작용 또는 리간드/수용체 상호작용을 통해서). 일부 실시태양에서, 상기 수용체는 세균 부착 수용체, 예를 들어 세포외 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 응집 인자 A(ClfA), 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 혈장응고효소, 및 세포외 부착 단백질로 이루어진 군에서 선택된 세균 부착 수용체이다. 이하에서는 항원/항체 특이성 교환체의 특이성 도메인에 대하여 더욱 상세히 기술한다.

항원/항체 특이성 교환체의 특이성 도메인

항원/항체 특이성 교환체의 특이성 도메인은 특정 항원, 예를 들어 합텐(hapten)에 특이적으로 결합하는 임의의 항체의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항원/항체 특이성 교환체의 바람직한 특이성 도메인은 특정 항체의 상보성 결정부위(CDR) 또는 골격부위의 아미노산 서열을 포함한다. 항체의 CDR은 그 항체의 특이성의 원인이 된다. X-선 결정학은 중쇄의 가변(V) 부위의 3 개의 CDR 및 경쇄의 V 부위의 3 개의 CDR 모두가 항원-항체 복합체에서 항원결정기와 접촉할 수 있음을 보여주었다.

몇몇 실시태양에서, 다양한 항원에 대한 mAb의 CDR에 상응하고 각 mAb의 인식 능력을 흉내낼 수 있는 단일 펩티드가 상기 항원/항체 특이성 교환체의 특이성 도메인에 포함될 수 있다. 구체적으로, HIV-1 gp160의 V3 영역에 특이적인 mAb의 CDRH3에 상응하는 펩티드 또는 CD4와 상호작용하는 gp120의 부위에 특이적인 항체의 일부가 상기 특이성 도메인에 포함될 수 있다. HIV-1의 V3 부위 지향성 펩티드는 생체 외에서 분석 시 중화 능력을 갖는 것으로 나타났다. 상기 CDRH3은 mAb F58, 및 Ab C1-5 등으로부터 유도될 수 있다. CDRH3처럼, Ab C1-5의 CDRH1 및/또는 CDRH2 도메인을 또한 본 명세서에 개시된 특이성 도메인에 사용할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 특이성 도메인은 B형 간염 바이러스 코어 항원(HBcAg)에 대한 mAb의 CDRH2에 상응하는 펩티드를 포함할 수 있다. CDRH2는 HBcAg를 포획하는 능력을 나타내었다. HBcAg 또는 B형 간염 바이러스 e 항원(HBeAg)과 결합하는 항체로부터 유도된 여러가지 다른 펩티드들이 확인되었다(2002년 7월 9일자로 허여된 미국 특허 제 6,417,324 호; 및 2001년 4월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제 09/839,447 호; 및 2002년 5월 21일자로 출원된 미국 특허 출원 제 10/153,271 호 참조). 이들 펩티드(특이성 도메인)를 환자에게 존재하는 항체가 B형 간염 바이러스로 전향하도록 항원/항체 특이성 교환체에 통합시킬 수 있다. 하기 섹션에서는 리간드/수용체 특이성 교환체에 대한 특이성 도메인에 대하여 보다 상세히 기술한다.

리간드 /수용체 특이성 교환체에 대한 특이성 도메인

리간드/수용체 특이성 교환체의 다양성도 또한 다수의 상이한 병원체 상에서의 다수의 상이한 수용체들과 결합하는 다수의 상이한 리간드들이 리간드/수용체 특이성 교환체로 통합될 수 있기 때문에 똑같이 방대하다. "병원체"란 용어는 일반적으로 동물에서의 임의의 병원체를 말하며, 이와 같은 병원체는 세균, 기생충, 진균, 곰팡이, 바이러스 및 암 세포를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 유사하게, "수용체"란 용어는 "리간드"(대개는 항체에서 발견되는 서열 이외의 펩티드, 또는 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이들의 조합)와 상호작용하는 분자(대개는 항체에서 발견되는 서열 이외의 펩티드이나, 탄수화물, 지질 또는 핵산일 수 있다)를 지칭하는 일반적인 의미로 사용된다. 고려되는 수용체들은 신호전달을 겪을 필요가 없고 다수의 분자간 상호작용에 관여할 수 있으며, 이 때 분자간 상호작용은 부착(예를 들어, 인테그린(integrins)) 및 분자간 신호전달(예를 들어, 성장 인자 수용체)을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 실시태양에서, 바람직한 특이성 도메인들은 세포외 기질 단백질(예를 들어 피브리노겐, 콜라겐, 비트로넥틴, 라미닌, 플라스미노겐, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴)에 존재하는 펩티드 서열을 갖는 리간드를 포함하며, 일부 특이성 도메인들은 세균 부착 수용체(예를 들어, 세포외 피브로넥틴 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 응집 인자 A(ClfA), 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 혈장응고효소, 및 세포외 부착 단백질)와 상호작용하는 리간드를 포함한다.

연구자들은 다수의 수용체들과 상호작용하는 세포외 기질 단백질들의 부위를 지도로 만들었다(예를 들어 McDevvit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424(1997); Flock, Molecular Med. Today, 5:532(1999); and Pei et al., Infect. and Immun. 67:4525(1999) 참조). 일부 수용체들은 세포외 기질 단백질의 동일 부위에 결합하고, 일부는 중복되는 결합 도메인을 가지며, 일부는 전혀 상이한 부위들에 결합한다. 바람직하게는, 상기 특이성 도메인을 구성하는 리간드들은 세포외 기질 단백질에 대한 부착에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 병원체 상의 임의의 수용체에 대한 공지된 리간드들의 무작위 단편들을 사용하여 리간드/수용체 특이성 교환체를 생성시킬 수 있으며 이들 예비 리간드/수용체 특이성 교환체들을 하기 기술된 특성화 분석에서 선별하여 상기 병원체 상의 수용체들과 상호작용하는 분자들을 동정할 수 있음은 물론이다.

일부 특이성 도메인들은 세균 부착 수용체와 상호작용하는 리간드를 갖는데, 이때, 세균 부착 수용체는 세포외 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 응집 인자 A(ClfA), 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 혈장응고효소, 및 세포외 부착 단백질을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 피브리노겐의 감마-쇄의 C-말단 부분에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 리간드들은 스타필로코커스 아우레우스 부착 수용체인 ClfA에 대한 피브리노겐의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 나타났다(McDevvit et al., Eur. J. Biochem., 247:416-424(1997)). 더욱이, 스타필로코커스 미생물은 보다 많은 부착 수용체들, 예를 들어 Efb(상기는 알파 쇄 피브리노겐에 결합한다), ClfB(상기는 피브리노겐의 α 및 β 쇄와 상호작용한다), 및 Fbe(상기는 피브리노겐의 γ 쇄에 결합한다)를 생산한다(Pei et al., Infect. and Immun. 67:4525(1999)). 따라서, 바람직한 특이성 도메인은 세균 부착 수용체에 결합할 수 있는 분자(예를 들어, 피브리노겐)에 존재하는 서열 중 3 내지 30 아미노산, 즉 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 연속적인 아미노산들을 포함한다.

특이성 도메인들은 또한 바이러스 수용체와 상호작용하는 리간드를 포함할 수 있다. 다수의 바이러스 수용체 및 상응하는 리간드들이 공지되어 있으며 이들 리간드 또는 이들의 단편을 리간드/수용체 특이성 교환체로 통합시킬 수 있다. 예를 들어 통(Tong) 등은 오리 B형 간염 바이러스 외피 단백질의 전-S(pre-S) 도메인과 상호작용하는 170 kd 세포 표면 당단백질인 헤파드나바이러스(Hepadnavirus) 수용체를 동정하였으며(미국 특허 제 5,929,220 호), 매든(Maddon) 등은 T 세포 표면 단백질 CD4(또는 T4라 칭하는 가용성 형태)가 HIV의 gp120과 상호작용하는 것으로 확정하였다(미국 특허 제 6,093,539 호). 따라서, 바이러스 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인은 오리 B형 간염 바이러스 외피 단백질의 전-S 도메인의 부위(예를 들어, 아미노산 잔기 80-102 또는 80-104) 또는 HIV의 gp120과 상호작용하는 T 세포 표면 단백질 CD4(또는 T4라 지칭되는 가용성 형태)의 부위(예를 들어 CD4/T4의 세포외 도메인 또는 그의 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, HIV의 CDR(V3 결합 보체) 또는 CD4(gp120 결합 보체) 결합 도메인에 대한 리간드/수용체 특이성 도메인들을 제조하였다(표 1 참조). 바이러스 수용체들에 대한 더욱 많은 리간드들이 존재하며 이들 분자 또는 그의 단편을 특이성 도메인으로서 사용할 수 있다.

특이성 도메인들은 또한 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 리간드를 포함할 수 있다. 원(原)종양 형성 유전자(proto-oncogene) HER-2/neu(C-erbB2)는 티로신 키나제 계열의 표면 성장 인자 수용체인 p185HER2를 암호화한다. 유방암 환자의 20 내지 30 퍼센트는 유전자 증폭을 통해 HER-2/neu(C-erbB2)를 암호화하는 유전자를 과발현한다. 따라서, HER-2/neu(C-erbB2)에 대한 리간드를 암호화하는 특이성 도메인을 포함하는 리간드/수용체 특이성 교환체가 바람직한 실시태양이다. 여러 유형의 암세포들이 또한 인테그린 수용체를 과발현하거나 차별적으로 발현한다. 다수의 바람직한 실시태양들은 인테그린 수용체와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함한다. 인테그린은 세포외 기질 단백질과 주로 상호작용하지만, 이들 수용체가 인바신(invasins), RGD-함유 펩티드(즉 아르기닌-글리신-아스파테이트) 및 화학물질과 같은 다른 리간드들과 상호작용 한다는 것이 공지되어 있다(예를 들어 미국 특허 제 6,090,944 호 및 6,090,388 호; 및 문헌[Brett et al., Eur J Immunol, 23:1608(1993)] 참조). 인테그린 수용체에 대한 리간드에는 비트로넥틴 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴 수용체, 콜라겐 수용체, 피브리노겐 수용체, 인테그린 수용체와 상호작용하는 분자들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 하기 섹션에서는 본 명세서에 개시된 특이성 교환체와 함께 사용될 수 있는 일부 항원 도메인들에 대하여 기술한다.

항원 도메인

상기 리간드/수용체 특이성 교환체 및 항체/항원 특이성 교환체에 사용될 수 있는 항원 도메인들의 다양성은 병원체 또는 독소가 여러가지 다른 항원결정기를 제시할 수 있기 때문에 매우 광범위하다. 바람직하게는, 상기 특이성 교환체와 함께 사용되는 항원 도메인은 세균, 진균, 식물, 곰팡이, 바이러스, 암 세포 및 독소들로부터의 표면 단백질 또는 노출된 단백질로부터 수득한 펩티드이다. 또한, 상기 항원 도메인은 바람직하게는 선천적인 면역성 또는 백신접종에 의한 환자 중의 기존 항체에 의해 비-자기로서 빠르게 인식되는 펩티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 많은 사람들은 아동기 질병에 대해 면역되어 있는데, 이 때 상기 질병으로는 천연두, 홍역, 유행성 이하선염, 풍진 및 소아마비를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 이들 병원체 상의 항원결정기들에 대한 항체는 면역된 사람에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 항원 도메인은 병원체, 예를 들어 천연두, 홍역, 유행성 이하선염, 풍진, 포진, 간염 및 소아마비에 반응하여 환자 중에 존재하는 상기 환자 중의 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 항원결정기를 포함하는 펩티드를 갖는다.

그러나, 일부 실시태양은 상기 환자에게 투여된 항체와 상호작용하는 항원 도메인을 갖는다. 예를 들어, 특이성 교환체 상의 항원 도메인과 상호작용하는 항체를 상기 특이성 교환체와 동시에 투여할 수 있다. 더욱이, 특이성 교환체와 상호작용하는 항체는 통상적으로 환자 중에 존재하는 것이 아니라, 상기 환자가 생물학적 물질 또는 항원(예를 들어 혈청, 혈액 또는 조직)의 도입에 의해 항체를 획득하여 자신의 체내에서 높은 역가의 항체를 생성시킨다. 예를 들어, 수혈을 받은 환자는 다수의 항체들을 획득하며, 이 중 일부는 특이성 교환체의 항원 도메인과 상호작용할 수 있다. 특이성 교환체용으로 사용하기에 바람직한 일부 항원 도메인들은 또한 예를 들어 단순 포진 바이러스, B형 간염 바이러스, TT 바이러스 및 소아마비 바이러스 등의 병원체로부터 수득한 바이러스 항원결정기 또는 펩티드를 포함한다.

바람직하게는, 상기 항원 도메인은 "고-역가 항체"에 의해 인식되는 병원체 또는 독소로부터 수득되는 항원결정기 또는 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "고-역가 항체"란 용어는 항원(예를 들어 항원 도메인 상의 항원결정기)에 대해 높은 친화성을 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 고상 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA)에서, 고 역가 항체는 혈청을 적합한 희석 완충액으로 대략 1:100 내지 1:1000의 범위로 희석한 후에 상기 분석에서 양성으로 남아있는 혈청 샘플 중에 존재하는 항체에 해당한다. 다른 희석 범위로는 1:200 내지 1:1000, 1:200 내지 1:900, 1:300 내지 1:900, 1:300 내지 1:800, 1:400 내지 1:800, 1:400 내지 1:700, 1:400 내지 1:600 등이 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 혈청과 희석 완충액간의 비는 대략 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000이다. 특이성 교환체의 항원 도메인에 포함될 수 있는 병원체의 항원결정기 또는 펩티드는 스웨덴 특허 제 9901601-6 호; 미국 특허 제 5,869,232 호; Mol. Immunol. 28:719-726(1991); 및 J. Med. Virol. 33:248-252(1991))에 개시된 항원결정기 또는 펩티드 서열을 포함한다.

그러나, 본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 항원 도메인은 펩티드일 필요는 없다. 일부 실시태양에서, 당, 다수의 당, 글리코실화 부위 또는 글리코실화 도메인 자체가 항원 도메인이다. 즉, 일부 실시태양은 펩티드 링커로 또는 펩티드 링커 없이 당, 다수의 당, 글리코실화 부위 또는 글리코실화 도메인에 접합된 특이성 도메인을 포함하지만, 병원체 또는 독소로부터 수득한 항원 펩티드 또는 항원결정기가 없는 특이성 교환체(즉 항원/항체 및 리간드/수용체 특이성 교환체)이다. 그와같이, 글리코실화된 특이성 도메인(예를 들어 항원/항체 및 리간드/수용체 특이성 도메인)을 또한 글리코실화된 특이성 교환체라 칭하며, 여기에서 상기 당, 다수의 당, 글리코실화 부위 또는 글리코실화 도메인 자체가 항원 도메인이다. 하기 섹션에서는 글리코실화된 특이성 교환체에 대하여 보다 상세히 기술한다.

당 및 당접합체를 포함하는 특이성 교환체

일반적으로, 글리코실화된 특이성 교환체(즉 항체/항원 특이성 교환체 및 리간드/수용체 특이성 교환체)는 적어도 3 내지 200 이하의 아미노산 길이의 항원 도메인(예를 들어 펩티드 골격) 또는 비 펩티드-계 항원 도메인에 접합된 적어도 3 내지 200 이하의 아미노산 길이의 특이성 도메인을 포함한다(즉 상기 특이성 도메인은 자체가 링커와 또는 링커 없이 글리코실화되지만, 병원체로부터 수득한 항원 펩티드가 없거나 또는 병원체의 항원결정기를 포함한다). 상기 항원 도메인 및/또는 특이성 도메인은 상기 펩티드 골격과 함께 또는 단독으로 인간에게서 자연적으로 존재하는 고 역가 항체와 반응하는 다수의 당을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 글리코실화 도메인 또는 부위는 이종활성 항원인 혈액형 당(예를 들어 이종이식 또는 이식의 초급성 거부반응에 대한 원인인 혈액형 당)을 포함한다.

일부 실시태양에서, 예를 들어 상기 특이성 교환체는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200, 또는 그 사이 및/또는 그 이하의 아미노산 길이의 특이성 도메인을 포함하며, 상기 특이성 도메인은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200, 또는 그 사이 및/또는 그 이하의 아미노산 길이의 항원 도메인(예를 들어 펩티드 골격)에 접합되고, 이때 상기 항원 도메인 또는 특이성 도메인 또는 이들 모두는 다수의 당을 포함한다. 다른 실시태양들은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200, 또는 그 사이 및/또는 그 이하의 아미노산 길이의 특이성 도메인을 포함하며, 상기 특이성 도메인은 다수의 당에(펩티드 링커와 함께 또는 상기 링커 없이, 병원체의 펩티드 또는 항원결정기와 함께 또는 상기 없이, 또는 항원 도메인와 함께 또는 상기 없이) 접합된다. 상기 실시태양에 따라, "다수의 당"은 적어도 2 내지 10,000 또는 그 이상의 당 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4750, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000 또는 그 이상, 또는 그 사이 및/또는 그 이하의 당 단위가 상기 특이성 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어 병원체의 펩티드 또는 항원결정기를 포함하는 항원 도메인 링커의 펩티드 골격과 같은 지지체를 통해) 접합된다.

본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 사용될 수 있는 특이성 도메인의 다양성은 다수의 상이한 항체/항원 및 리간드/수용체 상호작용이 병원체(예를 들어 스타필로코커스와 같은 세균 ) 상에 존재하기 때문에 매우 광범위하다. 바람직한 특이성 도메인은 세균 부착 단백질, 예를 들어 ClfA 및 ClfB 또는 피브리노겐의 단편과 상호작용하는 다른 세균 수용체를 지향하며, 간염, 독감 및 HIV 등의 바이러스를 지향한다. 본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 사용될 수 있는 항원 도메인의 다양성도 또한 다수의 상이한 지지체 및 다수의 상이한 당 또는 당들의 그룹이 사용될 수 있기 때문에 매우 광범위하다. "당"이란 용어는 비 제한적으로 단당류, 이당류, 다당류(글리칸), 올리고당 및 다른 유사 화합물들을 포함하는 넓은 뜻으로 파악될 것이다. "당접합체"란 용어도 또한 넓게 해석되어야 하며, 일반적으로는 지지체에 접합된 하나 이상의 탄수화물 단위(예를 들어 당)로 이루어진 유기 화합물을 지칭한다.

다수의 실시태양에서, 상기 특이성 도메인은 다수의 당 및/또는 당접합체가 접합되어 있는 지지체에 또한 접합된다. "지지체"는 펩티드 골격(예를 들어 상술한 바와 같은 항원 도메인), 단백질, 수지, 또는 당 또는 특이성 도메인을 접합시키거나 고정시키는데 사용될 수 있는 임의의 거대분자 구조물일 수 있다. 상기 당 및 특이성 도메인은 무기 지지체, 예를 들어 산화 규소 물질(예를 들어 실리카겔, 제올라이트, 규조토 또는 아미노화된 유리)에, 예를 들어 상기 지지체 상의 하이드록시기, 카복시기 또는 아미노기 및 반응기를 통해 공유 결합에 의해 접합될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 지지체는 상기 특이성 도메인의 일부 및/또는 당 또는 당 접합체(예를 들어 당지질)와 소수성 비-공유 상호작용에 의해 상호작용하는 소수성 표면을 갖는다. 일부 경우에, 상기 지지체의 소수성 표면은 플라스틱 또는 소수성기들이 결합된 임의의 다른 중합체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌 또는 폴리비닐 등의 중합체이다.

또한, 단백질 및 올리고당/다당류(예를 들어 셀룰로오스, 전분, 글리코겐, 키토산 또는 아미노화된 세파로스(sepharose)) 등의 지지체를, 상기 특이성 도메인 또는 당 상의 반응기, 예를 들어 하이드록시기 또는 아미노기를 이용하여 상기 지지체 상의 반응기에 접합시켜 공유 결합을 생성시킴으로써 사용할 수 있다. 상기 당 및 특이성 도메인을 부착시키기 위해 화학적으로 활성화된 다른 반응기를 함유하는 훨씬 더 많은 지지체들(예를 들어 시아노겐 브로마이드 활성화된 기질, 에폭시 활성화된 기질, 티오(thio) 및 티오프로필 겔(thiopropyl gels), 니트로페닐 클로로포메이트(nitrophenyl chloroformate) 및 N-하이드록시 숙신이미드 클로로포메이트(N-hydroxy succinimide chlorformate) 결합, 또는 옥시란 아크릴 지지체(oxirane crylic supports))을 사용할 수 있다.

상기 특이성 도메인 및/또는 다수의 당과 지지체 사이에 적합한 길이의 링커(예를 들어 λ 파지의 가요성 부위를 닮도록 조작된 "λ 링커")를 삽입하면 보다 큰 가요성을 촉진하게 되어, 겪을 수 있는 임의의 입체 장애를 극복할 수 있으리라 예상된다. 최적의 결합을 허용하는 적합한 길이의 링커의 결정은 부착된 분자를 본 명세서에서 상세히 설명된 특성화 분석에서 가변 링커로 선별함으로써 밝혀낼 수 있다.

바람직한 실시태양은 당접합체, 및 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코펩티드, 펩티도글리칸, 글리코-아미노-산, 글리코실-아미노-산, 당지질 및 관련 화합물로 통상적으로 지칭되는 지지체-결합된 당을 포함하는 특이성 교환체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 실시태양에 사용될 수 있는 당단백질에는 탄수화물 및 단백질을 함유하는 화합물을 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 이당류(들), 올리고당(들), 다당류(들), 이들의 유도체(예를 들어 설포-또는 포스포-치환된), 및 다른 유사 화합물들일 수 있다. 사용될 수 있는 당단백질에는 주요한 2 가지 종류, 즉 O-결합된 글리칸과 N-결합된 글리칸이 있다. N-결합된 당단백질은 상기 단백질 중의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 결합된 N-아세틸글루코사민 잔기를 포함한다. 가장 통상적인 O-결합은 상기 단백질의 세린 또는 트레오닌 잔기에 결합된 올리고당 중의 말단 N-아세틸갈락토사민 잔기를 포함한다. 당단백질을 포함하는 특이성 교환체는 하나, 몇 개 또는 다수의 탄수화물 단위를 포함할 수 있지만, 일부 실시태양은 아미노 당을 함유하는 다당류인 당단백질의 하위그룹인 프로테오글리칸을 포함한다.

본 명세서에 개시된 일부 실시태양에 사용될 수 있는 당단백질은 L- 및/또는 D-아미노산으로 구성된 올리고펩티드에 결합된 탄수화물을 갖는 화합물을 포함한다. 사용될 수 있는 펩티도글리칸은 D-글루코사민과 뮤라믹산(muramic acid) {2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-D-글루코스} 또는 L-탈로사민유론산(L-talosaminuronic acid)(2-아미노-2-데옥시-L-탈유론산)(대개는 N-아세틸화되거나 N-글리코실화된다)의 잔기들이 번갈아 형성된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 포함한다.

본 명세서에 개시된 실시태양에 사용될 수 있는 글리코-아미노산은 단일 아미노산에 부착된 당을 포함하는 반면, 사용될 수 있는 글리코실-아미노산은 글리코실 결합(O-, N- 또는 S-)을 통해 아미노산에 결합된 당을 포함하는 화합물을 포함한다(상기 하이픈은 탄수화물이 반드시 아미노기에 결합된다는 암시를 피하기 위해 사용된다). 일부 실시태양에서, 항원 도메인은 당지질을 포함하는데, 상기는 글리코시드 결합에 의해 소수성 부분, 예를 들어 아실글리세롤(acylglycerol), 스핑고이드(sphingoid), 세라미드(N-아실스핑고이드; N-acylsphingoid) 또는 프레닐 포스페이트(prenyl phosphate)에 결합된 하나 이상의 단당류 잔기를 포함하는 화합물이다. 본 명세서에 개시된 일부 특이성 교환체는 또한 당접합체(예를 들어 렉틴(lectins))를 포함할 수 있다.

그러나, 바람직한 실시태양은 혈액형 항원이라 통상적으로 칭하는 인간 단백질 또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체를 포함한다. 이들 항원은 일반적으로는 적혈구 막의 외부에 위치하는 표면 마커이다. 이들 표면 마커들 중 대부분은 단백질이나, 일부는 지질 또는 단백질에 부착된 탄수화물이다. 구조적으로, 본 명세서에 개시된 실시태양에 사용될 수 있는 혈액형 결정인자는 유형 I 및 유형 II로 공지된 2 개의 기본적인 종류로 분류된다. 유형 I은 N-아세틸 글루코사민에 결합된 갈락토스 1-3 β를 포함하는 골격을 포함하는 반면, 유형 II는 대신에 동일한 구성 요소들(비교. N-아세틸 락토사민) 사이에 1-4 β 결합을 포함한다. 이들 골격 구조의 a-푸코실화(fucosylation)의 위치 및 정도는 루이스-유형과 H-유형 특이성을 생성시킨다. 따라서, N-아세틸 글루코사민의 C₄-하이드록실에서의 모노푸코실화(유형 I 시리즈)는 Le^a 유형을 구성하는 반면, 상기 당의 C₃-하이드록실의 푸코실화(유형 II 시리즈)는 Le^x 결정인자를 구성한다. 갈락토스 부분의 C₂-하이드록실에서의 Le^a 및 Le^x 유형의 추가적인 푸코실화는 각각 Le^b 및 Le^y 유형의 특성을 부여한다.

골격에서 갈락토스 부분 중 오직 C₂-하이드록실에서의 a-모노푸코실 분지의 존재는 H-유형 특이성(유형 I 및 II)을 구성한다. a-결합된 갈락토스 또는 a-결합된 N-아세틸갈락토사민 중의 그의 -하이드록실기에서의 치환에 의한 H-유형의 추가적인 치환은 친숙한 혈청학상 혈액형 분류인 A, B 및 O의 분자 토대를 제공한다(예를 들어 문헌[Lowe, J.B., The Molecular Basis of Blood Diseases, Stamatoyannopoulos, et al., eds., W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pa., 1994, 293] 참조).

먼저 환자의 특정 혈액형 항원 세트를 결정함으로써, 환자의 레퍼토리 밖에 있는 하나 이상의 혈액형 항원을 포함하는 특이성 교환체를 선택하여 상기 환자의 특이성 교환체의 항원 도메인에 대한 강력한 반응을 발생시키고 이에 의해 상기 환자 중에 존재하는 항체를 상기 특이성 교환체의 특이성 도메인에 특이적인 병원체로 전향시킬 수 있다. 따라서, 임의의 특정 개인에게서 강력한 면역 반응을 얻을 수 있도록 혈액형 항원들의 다수의 상이한 조합들을 포함하는 항원 도메인을 갖는 다수의 상이한 병원체들에 특이적인 특이성 교환체를 제조할 수 있다. 하기 섹션에서는 당 및 당접합체, 특히 혈액형 항원을 포함하는 특이성 교환체의 제조에 대하여 보다 상세히 개시한다.

당 및 당접합체를 포함하는 특이성 교환체의 제조

항원/항체 특이성 교환체 및 리간드/수용체 특이성 교환체의 제조는 이전에 개시되었다(예를 들어 미국 특허 제 5,869,232; 6,040,137; 6,245,895; 6,417,324; 6,469,143; 6,660,842 호; 및 미국 특허 출원 제 09/839,447; 09/839,666; 09/664,945; 10/372,735; 및 09/664,025 호; 및 국제 출원 제 PCT/SE95/00468 호 및 PCT/IB01/00844, 및 PCT/IB01/02327 호 참조). 이들 특이성 교환체의 제조를 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 당 및 당접합체를 접합 또는 통합하도록 변형시킬 수 있다.

그러나, 상기와 같은 혈액형 물질 및 그의 네오당접합체들(neoglycoconjugates)의 합성을 고려함에 있어서 여러 가지 쟁점들을 고려할 필요가 있다. 합성의 경제성을 위해서, 전통적인 복합체 분지된 탄수화물의 합성에 공통적인 정교한 보호기 조작의 노고를 더는 것이 도움이 된다. 또 다른 쟁점은 단백질 담체에 결합된 결정인자를 맞추는 것과 관련된다. 상기와 같은 구조물의 조작에서, 탄수화물 결정인자와 담체간에 적합한 스페이서 유닛(spacer units)을 통합시키는 것이 유리할 수 있다(예를 들어 문헌[Stroud, M. R., et al., Biochemistry, 1994, 33, 10672; Yuen, C.-T., et al., J. Biochem., 1994, 269, 1595; 및 Stroud, M. R., et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 8439] 참조).

표 2는 특이성 교환체에 접합 또는 통합될 수 있는 혈액형 항원의 비 제한적인 목록을 제공한다.

	혈액형 담체 또는 효과기 단백질 명명 시스템	유전자 명	SWISS-PROT상호참조	항원 명
ABO	푸코실당단백질 알파-n-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제(EC 2.4.1.40)(조직-혈액형 A 트랜스퍼라제)/푸코실당단백질 3-알파-갈락토실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.37)(조직-혈액형 B 트랜스퍼라제)	유전자: ABO	BGAT_HUMAN(P16442)	항원: A/B
Chido/Rodgers	보체 C4	유전자: C4A 및 C4B	CO4_HUMAN(P01028)	항원: Ch1 내지 Ch6, WH, Rg1, Rg2
Colton	아쿠아포린-CHIP(아쿠아포린 1)	유전자: AQP1; CHIP28	AQP1_HUMAN(P29972)	항원: Co(a/b)
Cromer	보체 쇠퇴-가속 인자(항원 CD55)	유전자: DAF; CD55	DAF_HUMAN(P08174)	항원: Cr(a), Dr(a), Es(a), Tc(a/b/c), Wd(a), WES(a/b), IFC, UMC
Diego	밴드 3 음이온 운반 단백질(음이온 교환 단백질 1)(AE1)	유전자: SLC4A1; AE1; EPB3	B3AT_HUMAN(P02730)	항원: Di(a/b), Wr(a/b), Wd(a), Rb(a), WARR
Dombrock	Dombrock 당단백질	유전자: DO	아직 확인되지 않음	항원: Do(a/b), Gy(a), Hy, Jo(A)
Duffy	Duffy 항원(Fy 당단백질)(당단백질 D)(GpFy)	유전자: FY; GPD; DARC	DUFF_HUMAN(Q16570)	항원: Fy(a/b)
Gerbich	글리코포린 C(PAS-2')(당단백질 베타)(글리코코넥틴)(시알로당단백질 D)(글리코포린 D)(GpD)	유전자: GYPC; GPC	GLPC_HUMAN(P04921)	항원: An(a), Dh(A), Ls(a), Wb
Hh	갈락토시드 2-L-푸코실트랜스퍼라제 1(EC 2.4.1.69)(알파(1,2)Ft 1)(푸코실트랜스퍼라제 1)	유전자: FUT1	FUT1_HUMAN(P19526)
Hh	갈락토시드 2-L-푸코실트랜스퍼라제 2(EC 2.4.1.69)(알파(1,2)Ft 2)(푸코실트랜스퍼라제 2)(분비자 인자(Secretor factor)	유전자: FUT2	FUT2_HUMAN(Q10981)	항원: H/h, Se/se

	혈액 그룹 담체 또는 효과기 단백질 명명 시스템	유전자 명	SWISS-PROT상호참조	항원 명
Indian	CD44 항원(식세포 당단백질 1)(PGP-1)(Hutch-1)(세포외 기질 수용체-III)(ECMR-III)(헤르메스 항원)(히알루로네이트 수용체)(헤파란 설페이트 프로테오글리칸)(에피칸)	유전자: CD44; LHR	CD44_HUMAN(P16070)	항원: In(a/b)
Kell	Kell 혈액형 당단백질(EC 3.4.24.-)	유전자: KEL	KELL_HUMAN(P23276)	항원: K/k, Kp(a/b/c), Js(a/b), UI(a), KEL 11/17, KEL 14/24
Kidd	요소운반체, 적혈구	유전자: SLC14A1; UT1; HUT11; UTE; JK; RACH1	UT1_HUMAN(Q13336)	항원: Jk(a/b)
Knops	보체 수용체 유형 1(C3b/C4b 수용체)(항원 CD35)	유전자: CR1; C3BR	CR1_HUMAN(P17927)	항원: Kn(a/b), McC(a), SI(a), Yk(a)
Kx	막 운반 단백질 XK(Kx 항원)	유전자: XK	XK_HUMAN(P51811)
Landsteiner-Wiener	Landsteiner-Wiener 혈액형 당단백질	유전자: LW	LW_HUMAN(Q14773)	항원: Lw(a/b)
Lewis	갈락토시드 3(4)-L-푸코실트랜스퍼라제(EC 2.4.1.65)(푸코실트랜스퍼라제 3)(FUCT-III)	유전자: FUT3; LE	FUT3_HUMAN(P21217)	항원: Le(a/b)
Lutheran	Lutheran 혈액형 당단백질(B-CAM 세포 표면 당단백질)(Auberger B 항원)(F8/G253 항원)	유전자: LU; BCAM; MSK19	LU_HUMAN(P50895)	항원: Lu(a/b), Au(a/b), LU6 내지 LU20

	혈액 그룹 담체 또는 효과기 단백질 명명 시스템	유전자 명	SWISS-PROT상호참조	항원 명
MNS	글리코포린 A(PAS-2)(시알로당단백질 알파)(MN 시알로당단백질)	유전자: GYPA; GPA	GLPA_HUMAN(P02724)	항원: M/N, S/s, U, He, Mi(a), M(c), Vw, Mur, M(g), Vr, M(e), Mt(a), St(a), Ri(a), Cl(a), Ny(a), Hut, Hil, M(v), Far, Mit, Dantu, Hop, Nob, En(a), ENKT 등
MNS	글리코포린 B(PAS-3)(시알로당단백질 델타)(SS-활성 시알로당단백질)	유전자: GYPB; GPB	GLPB_HUMAN(P06028)
P	아직 정의되지 않은 갈락토일트랜스퍼라제	유전자: P1	아직 확인되지 않음	항원: P1
Rh	혈액형 RH(CE) 폴리펩티드(Rhesus C/E 항원)(RHPI)	유전자: RHCE; RHC; RHE	RHCE_HUMAN(P18577)	항원: C/c, E/e, D, f, C(e), C(w), C(x), V, E(w), G, Tar, VS, D(w), cE 등
Rh	혈액형 RH(D) 폴리펩티드(Rhesus D 항원)(RHPII)	유전자: RHD	RHD_HUMAN(Q02161)
Scianna	Scianna 당단백질	유전자: SA	아직 확인되지 않음	항원: Sc(1/2), Sc3
Xg	Xg 당단백질(단백질 PBDX)	유전자: XG; PBDX	XG_HUMAN(P55808)	항원: Xg(a)
Yt	아세틸콜린에스테라제(EC 3.1.1.7)	유전자: ACHE	ACES_HUMAN(P22303)	항원: Yt(a/b)

추가적인 혈액형들은 루이스^x-BSA, 2'-푸코실락토스-BSA(2'FL-BSA; 2-Fucosyllactosee-BSA), 락토-N-푸코펜타오스(Lacto-N-fucopentaose) II-BSA, 락토-N-푸코펜타오스 III-BSA, 락토-N-푸코펜타오스 I-BSA(LNFPI-BSA), 락토-N-디푸코헥사오스 I-BSA(LNDFHI-BSA), 혈액형 A-BSA, 혈액형 B-BSA, 글로보트리오스-HSA(Globotriose-HSA), Gala1-4Galb1-4Glc-HSA 등을 포함할 수 있다.

혈액형 항원을 상세히 논의하였지만, 임의의 당 또는 당접합체를 본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 항원 도메인에 포함시킬 수 있음을 지적하는 것은 중요하다. 항원 당 및 당접합체는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 상업적인 공급처, 예를 들어 브이-랩스 인코포레이티드(V-Labs, Inc.)(Covington, LA)로부터 쉽게 입수할 수 있다. 당 및 당접합체를 또한 종래 기술(보다 상세히 설명될 것이다)을 사용하여 합성할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 가능한 당 및 당접합체들은 병원체, 예를 들어 세균, 바이러스(예를 들어, HBV로부터의 L, M 및 S 당단백질, 및 HIV로부터의 gp160, gp120 및 gp41), 원생동물, 및 진균, 암세포, 독소, 자가면역 질환, 예를 들어 낭창, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 건선, 그레이브스 병 등에 걸린 세포로부터 유도될 수 있다.

본 명세서에 개시된 항원 도메인에 사용될 수 있는 특정한 코어 구조의 네오당단백질로는 N-아세틸락토사민-BSA(3-원자 스페이서), N-아세틸락토사민-BSA(14-원자 스페이서), α1-3,α1-6 만노트리오스-BSA(Mannotriose-BSA)(14-원자 스페이서) 등이 있다. 본 명세서에 개시된 항원 도메인에 사용될 수 있는 단당류 네오당단백질로는 N-아세틸글루코사민-BSA(14-원자 스페이서), N-아세틸갈락토사민-BSA(14-원자 스페이서) 등이 있다. 본 명세서에 개시된 항원 도메인에 사용될 수 있는 종양 항원 네오당단백질로는 T-항원-HSA Galβ1-3GalNAc-HSA(3-원자 스페이서), Tn-항원-HSA GalNAca1-O-(Ser-N-Ac-CO)-스페이서-NH-HSA 등이 있다. 본 명세서에 개시된 항원 도메인에 사용될 수 있는 시알화된 네오당단백질로는 3'시알릴-N-아세틸락토사민-BSA(3-원자 스페이서), 3'-시알릴-N-아세틸락토사민-BSA(14-원자 스페이서), 3'-시알릴 루이스^x-BSA(3-원자 스페이서), 3'-시알릴 루이스^x-HSA(3-원자 스페이서), 3'-시알릴-3-푸코실-락토오스-BSA(3-원자 스페이서), 3'-시알릴 루이스^x-BSA(14-원자 스페이서) 등이 있다.

몇몇 실시태양에서, 항원 도메인은 탄수화물 항원인 Gal α(1,3) Gal β(gal 항원)을 포함할 수 있다. 상기 gal 항원은 글리코실화 효소인 갈락토실트랜스퍼라제(α(1,3)GT)에 의해 돼지, 마우스 및 신세계 원숭이의 세포 상에서 다량으로 생산된다. 갈락토실트랜스퍼라제는 세포의 골지체에서 활성이며, 갈락토스를 당-공여체인 우리딘 디포스페이트 갈락토스(UDP-갈락토스)로부터 수용체인 당지질 및 당단백질의 탄수화물 쇄 상의 N-아세틸락토사민 잔기로 전달하여 gal 항원을 형성시킨다.

상기 gal 항원은 인간, 꼬리 없는 원숭이 및 구세계 원숭이에서는 전혀 존재하지 않는데, 그 이유는 α(1,3) GT를 암호화하는 그들의 유전자가 진화 과정에서 불활성화되었기 때문이다(Xing et al., 01-2-x1 Cell Research 11(2): 116-124(2001)). 인간 및 구세계 영장류는 gal 항원이 결여되어 있기 때문에, 상기에 대해 면역관용상태가 아니며 위장 세균에 의한 항원 자극에 반응하여 일생 동안 항-gal 항원 항체(항-Gal)를 생산한다(상기 동일 문헌). 순환하는 B 세포의 1% 정도가 이들 항체를 생산할 수 있는 것으로 추정되었다(상기 동일 문헌). 공여자 기관 중의 내피 세포 표면 상의 당지질 및 당단백질 상에 노출된 gal 항원에 대한 항-gal의 결합은 보체 연쇄 반응을 활성화시키고 초급성 거부를 일으키며, 또한 보체-독립적인 지연된 이종이식 거부의 발생에 중요한 역할을 한다(상기 동일 문헌). 따라서, 상기 gal 항원은 강력한 면역 반응을 일으키는 능력을 갖는다.

몇몇 실시태양에서, 특이성 교환체에 접합되거나 통합되는 gal 항원을 gal α(1,3) gal 시리즈 네오당단백질로부터 선택하며, 여기에는 Gala1-3Gal-BSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Gal-BSA(14-원자 스페이서), Gala1-3Gal-HSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Gal-HSA(14-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(14-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA(14-원자 스페이서), Galili 오당류-BSA(3-원자 스페이서) 등을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 gal 항원을 gal α(1,3) gal 유사 네오당단백질들, 예를 들어 Gala1-3Galβ1-4Glc-BSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4Glc-HSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-3GlcNAc-HSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4(3-데옥시GlcNAc)-HSA(3-원자 스페이서), Gala1-3Galβ1-4(6-데옥시GlcNAc)-HSA 등으로부터 선택할 수 있다.

다니쉐프스키(Danishefsky) 등은 다수의 항원 당 및 당접합체, 및 상기 화합물들의 합성 방법을 개시한다(예를 들어 미국 특허 제 6,303,120 호 참조). 구체적으로, 상기 특허는 Le^y-관련된 항원뿐만 아니라 상기 올리고당의 인위적인 단백질-접합체의 합성 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 이들 항원은 새로운 특성의 배열, 예를 들어 B와 C 구성요소 사이의 α-결합뿐만 아니라 β-결합된 고리 D gal-NAc 잔기를 포함한다(푸코스(fucose) 잔기가 결여된 관련 구조물(SSEA-3)의 합성에 대해서, 문헌[Nunomura, S.; Ogawa, T., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 5681-5684] 참조). 일반적으로, 미국 특허 제 6,303,120 호에 개시된 방법들을, 특이성 교환체에 본 명세서에 개시된 당 또는 당접합체를 접합 또는 통합시키기 위해 사용하거나 변형할 수 있다.

당생물학 분야의 주요 장애물은 순도가 높고, 화학적으로 잘 규명된 복합당질 및 당접합체로의 접근이다(문헌[Randell, Karla D., et al., High-throughput Chemistry toward Complex Carbohydrates and Carbohydrate-like Compounds, National Research Council of Canada, publication no. 43876, February 13, 2001] 참조). 핵산 및 폴리펩티드와 달리, 이들은 비-선형 분자이며, 이들의 전합성(total synthesis)의 개발에 있어서 상기 탄수화물 부분들은 상당한 과제를 제공한다(상기 동일 문헌). 이들 폴리하이드록실 화합물은 단당류 단위들의 배열을 포함하며 이들 사이에 다양한 글리코시드 결합을 갖는다(상기 동일 문헌). 각각의 글리코시드 결합은 α- 또는 β-아노머 배열로 존재할 수 있다(상기 동일 문헌). 따라서, 탄수화물 합성은 다수의 교차하는 보호-탈보호 계획을 요할 수 있으며 어려운 글리코실 커플링 반응(glycosyl coupling reaction)을 수반할 수 있다(상기 동일 문헌). 최근에, 자동화된 복합당질의 합성을 개발하려는 노력이 수행되었다(상기 동일 문헌).

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 합성 기법보다 대단히 더 복잡한 당 및 당접합체의 합성 기법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이들 기법은 이들이 효소-기반 접근법, 세포-기반 접근법, 및 화학 합성-기반 접근법으로 분류되므로 하기의 섹션에서 논의된다.

효소 합성

본 명세서에 개시된 당 및 당접합체의 상이한 합성 방법들을 니시구치(Nishiguchi) 등에게 허여된(2000) 미국 특허 제 6,046,040 호에서 찾을 수 있다. 구체적으로 상기 특허는 당 및 당접합체의 합성에 효소-촉매 생체 외 반응을 사용함을 개시한다(또한 문헌[Toone et al., Tetrahedron Reports(1990)(45)17:5365-5422] 참조). 효소적 접근법은 부분적으로 당 및 당접합체의 합성에 인기를 얻고 있는데, 그 이유는 효소가 정교한 입체- 및 위치선택성을 특징으로 하고 매우 온화한 조건 하에서 상기 반응을 촉매하기 때문이다. 따라서 광범위한 보호-탈보호 계획이 불필요하며, 아노머 배열의 조절이 단순해진다.

본 명세서에 개시된 일부 특이성 교환체를 제조하기 위해서, 하기의 효소들을 사용할 수 있다: 사카르글리코실트랜스퍼라제(saccarglycosyltransferases), 글리코시다제(glycosidases), 글리코실 하이드롤라제(glycosyl hydrolases) 또는 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltranferases). 글리코실트랜스퍼라제는 세포에서 탄수화물 항원의 생합성을 조절하며 연속적인 방식으로 당지질 및 당단백질 상의 올리고당 쇄에 탄수화물을 첨가하는 역할을 한다. 글리코실트랜스퍼라제는 단계적인 방식으로 단백질 또는 지질에, 또는 성장하는 올리고당의 비-환원 말단에 활성화된 당의 첨가를 촉매한다. 전형적으로는 탄수화물의 합성에 비교적 다수의 글리코실트랜스퍼라제가 사용된다. 각각의 NDP-당 잔기는 별개의 종류의 글리코실트랜스퍼라제를 필요로 하며, 지금까지 확인된 100 종류 이상의 글리코실트랜스퍼라제들은 각각 독특한 글리코시드 결합의 형성을 촉매하는 듯 하다.

하나의 효소-촉매 합성 방법에 따라, 당을 글리칼을 이용하는 고상(solid phase)방법을 사용하여 합성한다(Danishefsky et al., Science, 260, 1307(1993)). 상기 방법은 (i) 글리칼과 3,3-디메틸디옥시란간의 반응을 허용하여 글리칼을 디페닐실릴기를 통해 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체에 결합시켜, 글리칼을 1,2-무수 당으로 전환시키는 단계; (ii) 상기 무수 당을 당 공여체로서 사용하여 적합하게 보호된 상이한 글리칼과 반응시켜 글리코시드 글리칼을 형성하는 단계;를 포함하며, 이들 단계를 반복한다. 상기 방법에 따라, 새로운 글리코시드 결합이 입체선택적으로 형성된다.

당 쇄 합성의 고상 방법을 또한 본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 사용되는 당 또는 당접합체의 제조에 사용할 수 있다. 상기 방법은 글리코시드 결합을 어떠한 보호도 없이 입체선택적으로 형성시킬 수 있는 글리코실트랜스퍼라제를 사용한다. 과거에는, 상기 방법은 이용 가능한 글리코실트랜스퍼라제의 종류가 제한되고 값이 비싸다는 사실로 인해 그 가능성에 이르지 못했다. 그러나, 최근 수년간 다양한 글리코실트랜스퍼라제의 유전자들이 분리되었으며 통상적으로 유전자 기법에 의해 글리코실트랜스퍼라제를 대규모로 생산한다.

체하비(U. Zehavi) 등은 본 명세서에 개시된 일부 특이성 교환체를 제조하는데 사용될 수 있는 고상 합성 방법을 보고하였으며, 이때 글리코실트랜스퍼라제 및 고상 담체 상의 아미노헥실기와 결합된 폴리아크릴아미드 겔이 사용된다(문헌[Carbohydr. Res., 124, 23(1983), Carbohydr . Res., 228, 255(1992)] 참조). 상기 방법은 적합한 단당류를 4-카복시-2-니트로벤질글리코시드로 전환시키고, 상기 글리코시드를 상기 언급한 담체의 아미노기와 축합시키고, 상기 당 쇄를 프라이머로 하여 상기 축합물을 사용하여 글리코실트랜스퍼라제에 의해 신장시키고, 상기 올리고당을 광분해에 의해 방출시키는 단계를 포함한다.

과거에는, 글리코실트랜스퍼라제는 고상 담체에 결합된 당 또는 올리고당과 잘 반응하지 않으며, 당 쇄의 효율적인 신장이 이루어지기 어렵다는 생각이 일반적이었다. 그러나, 보다 최근에 4-카복시-2-니트로벤질글리코시드와 고상 담체간의, 헥사메틸렌 및 옥타메틸렌과 같은 장쇄를 갖는 링커에 의한 결합이 최대 51%까지 당 전달 수율을 개선시킴이 밝혀졌다(React. Polym ., 22, 171(1994), Carbohydr . Res., 265, 161(1994)).

웡(C.H. Wong) 등은 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 아미노화된 실리카에 결합된 당 잔기를 신장시키고, 일단 완료되었으면 상기 신장된 당 쇄를 α-키모트립신을 사용하여 지지체로부터 절단하는 효소적 합성 방법을 보고한다(J. Am. Chem. Soc ., 116, 1136(1994) 참조). 상기 방법에 의하는 경우, 상기 트랜스글리코실화 수율은 55%였다. 유사하게, 멜달(M. Meldal) 등은 글리코실트랜스퍼라제와 프라이머로서 디아미노화된 폴리(에틸렌 글리콜)의 모노- 및 디아크릴로일(diacryloyl) 화합물의 중합체를 사용하여 당 쇄를 신장시키는 또 다른 방법을 보고한다. 상기 당 쇄는 트리플루오로아세트산에 의해 방출되었다(J. Chem . Soc ., Chem . Commun ., 1849(1994)참조). 상기에서 언급한 바와 같이, 당 쇄를 고상 담체 상의 글리코실트랜스퍼라제에 의해 신장시키는 경우, 상기 고상 담체를 상기 당 잔기(초기 트랜스글리코실화의 수용체)에 연결시키는 기(링커)의 종류는 트랜스글리코실화 수율을 변화시킨다. 상기 당 쇄를 상기 담체로부터 유리시키는 경우, 상기 링커 중에 특이적으로 절단 가능한 결합의 존재가 요구된다. 글리코실트랜스퍼라제에 의한 당 쇄 신장에서, 반복적인 사용이 허용되는 고정화된 글리코실트랜스퍼라제의 사용이 또한 요구된다. 바람직하게는, 고정화된 글리코실트랜스퍼라제를 당 쇄 신장에 사용하는 경우, 상기 반응을 수용성 담체 상에서 수행한다.

니시구치 등에 의해 허여된(2000) 미국 특허 제 6,046,040 호에는 고정화된 글리코실트랜스퍼라제 및 수용성 담체를 사용하는 당 쇄 합성이 개시되어 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 당-함유 항원 도메인의 제조를 위한 하나의 접근법에 의해, 하기의 단계들을 사용할 수 있다: (i) 선택적으로 절단 가능한 결합을 갖는 링커를 통해 당 잔기를 수용성 중합체의 측쇄에 결합시켜 프라이머를 제공하고, 상기 프라이머를 당 뉴클레오티드의 존재 하에서 고정화된 글리코실트랜스퍼라제와 접촉시켜 상기 당 뉴클레오티드의 당 잔기를 상기 프라이머의 당 잔기로 전달하는 단계; (ii) 상기 (i)단계를 적어도 1 회 반복하여 다수의 당 잔기들을 전달함으로써 당 쇄를 신장시키는 단계; (iii) 경우에 따라 부산물로 생성된 뉴클레오티드 또는 반응되지 않은 당 뉴클레오티드를 제거하는 단계; 및 (iv) 경우에 따라 상기 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하고, 상기 다수 개의 당 잔기들의 전달에 의해 신장된 당 쇄를 연결시키는 상기 언급된 프라이머로부터 상기 링커 중의 절단 가능한 결합을 선택적으로 절단시킴으로써 상기 당 쇄를 방출시키는 단계. 미국 특허 제 6,046,040 호에 개시된 방법들을 사용하여 임의의 당 쇄 구조를 갖는 당접합체, 예를 들어 올리고당, 당단백질 및 당지질을 또한 합성할 수 있다. 자동화된 당 또는 당접합체 합성 계획안(scheme)에 효소를 적용하는 것도 또한 가능하다. 액상 및 고상 방법 모두 자동화된 합성에 사용될 수 있다.

일부 실시태양에서, 당 및 당접합체의 합성에 효소를 이용하는 방법을 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,583,042 호에는 특정한 당 및 당접합체의 합성에 글리코실트랜스퍼라제들의 조합을 사용하는 방법이 개시되어 있다. 하기 섹션에서는 당 또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체의 제조에 대한 다수의 세포-기반 접근법에 대하여 기술한다.

세포 기반 합성

생체 외 효소 촉매 반응을 사용하는 것 이외에, 임의의 이용 가능한 세포-기반 방법들을 사용하여 본 명세서에 개시된 당 및 당접합체를 합성할 수 있다. 미국 특허 제 6,458,937 호에는 당 및 당접합체의 합성을 위한 다수의 세포 기반 프로토콜들이 개시되어 있다. 본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 합성을 위한 하나의 접근법에 의해, 당 및 당접합체를 우선 (a) 세포를 제 1 단당류와 접촉시키고, (b) 상기 세포가 (i) 상기 제 1 단당류를 내면화시키고, (ii) 상기 제 1 단당류를 제 2 당으로 생화학적으로 가공하고, (iii) 상기 당을 담체에 접합시켜 당접합체를 형성시키고, (iv) 상기 당접합체를 세포외에서 발현시켜 선택적 반응성 작용기를 포함하는 세포외 당접합체를 형성시키는 조건 하에서 상기 세포를 배양시킴으로써 제조한다. 이어서 상기 작용기를 포함하는 당접합체를 반응성 작용기를 포함하는 특이성 교환체와 반응시킴으로써, 상기 당접합체와 특이성 교환체를 결합시킨다. 대상 조성물은 특이성 교환체 상에 존재하는 유사한 기들과 선택적으로 반응성인, 예컨대, 질소 또는 에테르 결합된 작용기를 포함하는 세포-적합성 단당류를 포함할 수 있다.

또 다른 접근법에 의해, 상기 당 및 당접합체를 (a) 세포를 제 1 작용기를 포함하는 제 1 단당류와 접촉시키고, (b) 상기 세포가 (i) 상기 제 1 단당류를 내면화시키고, (ii) 상기 제 1 단당류를 제 2 작용기를 포함하는 제 2 단당류로 생화학적으로 가공하고, (iii) 상기 제 2 단당류를 담체에 접합시켜 제 3 작용기를 포함하는 당접합체를 형성시키고, (iv) 상기 당접합체를 세포외에서 발현시켜 제 4의, 선택적 반응성 작용기를 포함하는 세포외 당접합체를 형성시키는 조건 하에서 상기 세포를 배양시킴으로써 합성할 수 있다.

상기 방법에 의해 합성된 세포외 당접합체들은 다양한 형태, 예를 들어 막-결합된(예를 들어 막 결합된 당지질 또는 당단백질), 세포에 가까운 구조와 결합된(예를 들어 세포외 기질 성분 또는 인접 세포) 형태로, 또는 주변 매질 또는 체액 중에(예를 들어 분비된 당단백질) 존재할 수 있다. 상기 제 4 작용기의 선택적 반응성은 상기 세포에 의해 제시되었을 때 당접합체의 선택적인 표적화를 허용한다. 예를 들어 표면 결합된 당접합체의 제 4 작용기는 세포 표면의 연관 부위와 관련하여 상기 당접합체의 선택적인 표적화를 허용하는 반응성을 제공할 수 있다. 선택적 반응성은 보다 반응적 상황에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 상기 당접합체-결합된 제 4 작용기는 상기 당접합체의 결합 부위에 가깝게 존재하지만 그 당접합체와 결합되지 않은 상기와 같은 작용기들에 비해 보다 큰 접근성, 보다 큰 빈도 또는 향상된 반응성을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 제 4 작용기는 당접합체 제시 부위에 특이한 것이다.

상기 제 4 작용기에 의해 제공된 선택적인 반응성은 붕소 원자의 중성자 반응성과 같은 핵 반응성, 및 공유 및 비공유 결합 반응성을 포함하는 화학적 반응성을 포함하는 다양한 형태들을 지닐 수 있다. 어쨌든, 상기 제 4 작용기는 필요한 선택적 반응성을 위해서는 충분해야 한다. 광범위하게 다양한 화학적 반응성들을 이용하여 제시 상황에 따라 선택성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 세포 표면-결합된 당접합체에 적용될 수 있는 제 4 작용기는 세포 표면에서 통상적으로 접근할 수 없는 공유결합 반응기들, 예를 들어 알켄, 알킨, 디엔, 티올(thiols), 포스핀( phosphines)및 케톤을 포함한다. 적합한 비공유 반응기로는 비오틴(biotin)과 같은 합텐, 및 디니트로페놀(dinitrophenol)과 같은 항원이 있다.

추가의 실시태양에서, 상기 발현된 당접합체의 성질은 제 1 단당류, 세포 유형 및 배양 조건과의 상관관계이다. 이들 실시태양에서, 상기 세포의 고유한 생화학적 경로들은 상기 제 1 단당류를 제 2 단당류로 생화학적으로 가공하고, 상기 제 2 단당류를 세포 내 담체, 예를 들어 올리고당/다당류, 지질 또는 단백질에 접합시키고, 최종적인 당접합체를 세포외적으로 발현시키는 작용을 한다. 한편, 상기 발현된 당접합체들은 또한 추가적인 조작과의 상관관계일 수 있다. 예를 들어, 상기 제 4 작용기는 상기 세포에 의해 초기 발현될 때, 제 3 작용기를 변형하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 제 3 작용기는 제 4 작용기를 생성시키기 위해서, 발현 후 처리, 예를 들어 화학적 절단 또는 활성화를 필요로 하는 잠재적(latent)이거나, 차폐되거나(masked) 또는 블로킹된(blocked) 기를 포함할 수 있다. 상기와 같은 처리는 세포에 대해 내생적인 효소에 의해 또는 외인성 조작에 의해서 수행될 수 있다. 따라서, 상기 제 3 및 제 4 작용기들은 세포 또는 세포 외 처리 과정들(processing events)에 따라 동일하거나 상이할 수 있다.

지적된 바와 같이, 작용기는 차폐되거나, 잠재적이거나, 미완성적이거나 발생기 형태의 또 다른 작용기일 수 있다. 차폐되거나 보호된 작용기 및 이들의 차폐되지 않은 대응물의 예를 표 3에 제공한다. 차폐기를 임의의 편리한 방식으로 유리시킬 수 있다; 예를 들어 케탈 또는 에놀을 낮은 pH로 촉진된 가수분해에 의해 상응하는 케톤으로 전환시킬 수 있다. 한편, 특정한 보호기들을 절단시켜 작용기의 차폐를 제거하는 다수의 특정 효소들이 공지되어 있다.

차폐기	차폐되지 않은 기
디알킬 케탈	케톤
아세탈	알데히드
에놀 에테르	케톤 또는 알데히드
옥심	케톤
히드라존	케톤
티오에스테르	티올
코발트-착물 알킨	알킨

대조적으로, 세포 내 당접합체(제 3 작용기 포함)의 성질은 일반적으로 오직 상기 제 1 단당류, 세포 유형 및 배양 조건과의 상관관계이다. 예를 들어, 상기 제 1 및 제 2 단당류 및 상기 세포 내 당접합체 내로 통합된 당 부분(뿐만 아니라 제 1, 제 2 및 제 3 작용기)는 세포 처리 과정에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 단당류 또는 작용기, 세포 및 조건들은 서로 작용하여 각각 화학적으로 독특한 제 2 단당류 또는 작용기를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 단당류를 상호 전환시키고/시키거나 다양한 작용기들을 화학적으로 변형시키는 다수의 생화학적 경로들이 공지되어 있다. 따라서, 소정의 상호전환은 제 1 단당류, 세포 및 배양 조건의 선택에 의해 제공된다.

상기 제 1 단당류를 세포의 허용되는 생화학적 경로들을 활용하여 세포 외 당접합체를 발현시키기 위해 선택한다. 예를 들어, 광범위하게 다양한 만노오스 및 글루코스 유도체에 허용되는 다수의 시알산(sialic acid) 생합성 경로들이 밝혀졌다. 상기 제 1 작용기를 다양한 방식으로 제 1 단당류에 통합시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 작용기는 결합된 질소 또는 에테르이다.

개시된 방법에 따라 광범위하게 다양한 세포, 예를 들어 진핵, 특히 포유동물 세포(예를 들어 돼지, 마우스 및 신세계 원숭이) 및 원핵 세포를 사용할 수 있다. 상기 세포는 배양물, 예를 들어 불멸화된 또는 1 차 배양물 중에 있거나, 또는 현장에, 예를 들어 미생물 중에 있을 수 있다.

본 발명에 의한 방법은 또한 세포에 부착된 생성물의 제조에 관한 것이다. 일반적으로는, 상기 방법은 상술한 세포외 당접합체의 발현과 관계되며, 여기에서 발현된 당접합체는 예를 들어 세포막 또는 세포외 기질 성분들에 결합됨으로써 세포에 가깝게 유지된다. 이어서 제 4 작용기를 상기 제 4 작용기와 선택적으로 반응하여 생성물을 형성시키는 작용제와 접촉시킨다.

광범위하게 다양한 작용제들을 광범위하게 다양한 생성물의 제조에 사용할 수 있다. 일반적으로는, 작용제의 선택은 상기 제 4 작용기의 성질 및 목적으로 하는 생성물에 의해 결정된다. 예를 들어, 화학적으로 반응성인 제 4 작용기의 경우, 상기 작용제는 상기 제 4 작용기와 선택적으로 화학 반응하는 제 5 작용기를 제공한다. 예를 들어, 상기 제 4 작용기가 케톤인 경우, 적합한 제 5 작용기에는 히드라진(hydrazines), 하이드록실아민(hydroxylamines), 아실 히드라지드(acyl hydrazides), 티오세미카바자이드(thiosemicarbazides) 및 베타-아미노티올(beta-aminothiols)이 포함된다. 다른 실시태양에서, 상기 제 5 작용기는 선택적인 비공유 결합기, 예를 들어 항체 이디오토프(idiotope)이다. 또 다른 실시태양에서, 적합한 작용제로는 방사선 감수성 증강물질, 예를 들어 붕소 원자를 포함하는 제 4 작용기와 선택적으로 반응하는 알파 입자 등의 방사능; 산화제, 예를 들어 표면 금속 착물을 포함하는 제 4 작용기와 반응하여, 예를 들어 세포독성 산화성 종들을 생성시키는 산소 등이 있다. 한편, 세포 표면 상의 작용기는 외부 작용제(예를 들어 전자 현미경에 의한 검출용 표지 역할을 하는 중금속)의 첨가를 필요로 하지 않는 독특한 성질을 가질 수도 있다. 세포 표면 작용기와 작용제의 상호작용에 의해 형성되는 생성물에 대한 추가의 예들을 표 4에서 제공한다.

작용기	작용제	생성물
케톤	히드라지드	히드라존
디엔	디에노필	디엘스-알더 부가물
티올	알파-브로모 아미드	티오에테르
붕소	중성자	방사선
비오틴	아비딘	비오틴-아비딘 복합체
디니트로페놀(DNP)	항-DNP 항체	DNP-항체 복합체
플루오레세인	UV 광	녹색 광
철 착물	산소	퍼옥시 라디칼

흔히, 상기 작용제는 세포에서 목적으로 하는 활성을 제공하는 활성제 부분을 포함한다. 예를 들어 세포 또는 주변 세포의 생리기능을 변경시키거나, 세포를 표지하거나, 세포를 환경적 자극에 민감하게 만들거나, 세포의 병원체 또는 유전자 형질감염에 대한 감수성을 변경시키는 등에 광범위하게 다양한 활성제 부분을 사용할 수 있다. 전형적인 활성제 부분으로는 독소, 약물, 검출 가능한 표지, 유전자 벡터, 분자 수용체 및 킬레이터가 있다.

개시된 방법들에 유용한 광범위하게 다양한 조성물들을 본 명세서에 제공한다. 이들 조성물은 작용기, 바람직하게는 질소 또는 에테르 결합된 작용기를 포함하는 세포-적합성 단당류를 포함하며, 상기 작용기는 세포 표면에서 선택적으로 반응성이다. 상기와 같은 화합물의 대표적인 작용기에는 알킨, 디엔, 티올, 포스핀, 붕소 및 특히 케톤이 있다. 치환되거나 비 치환된 알킬이란 용어는 알콕시, 사이클로알킬, 헤테로알킬 및 유사 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 유사하게, 치환되거나 비 치환된 아릴이란 용어는 아릴옥시, 아릴알킬(아릴알콕시 등을 포함함), 헤테로아릴, 아릴알키닐, 및 유사 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 치환되거나 비 치환된 알케닐이란 용어는 유사하게 사이클로알케닐, 헤테로알케닐 등을 포함하는 것을 의미한다. 생물학적 통합의 허용되는 경로를 갖는 다른 단당류에 의해 유사한 유도체가 제조된다. 상기와 같은 단당류는 편리한 세포 및 단백질 기반 선별, 예를 들어 하기에 개시되는 선별에서 쉽게 식별된다. 예를 들어, 세포 표면 당접합체에 통합된 작용화된 단당류를 상보적인 반응성 작용기를 갖는 형광 표지를 사용하여 검출할 수 있다. 기계화된 고도의 자료처리 광학 판독(mechanized high-throughput optical readings)에 적합한 세포-기반 분석법은 비오틴 히드라지드와의 반응에 이은 FITC-표지된 아비딘과의 배양에 의해 세포 표면상의 케톤-함유 단당류를 검출하고, 이어서 자동화된 유세포 분석에 의해 세포 표면상의 형광 마커의 존재를 정량분석함을 포함한다. 편리한 단백질-기반 선별은 당접합체의 분리(예를 들어, 겔 블랏(gel blots)), 친화성 고정화 및 상보적인 반응성 탐침(예를 들어 비오틴 히드라지드에 의해 검출된 데톤-함유 당접합체)에 의한 검출, 그리고 이에 이은, 아비딘-알칼리성 포스파타제 또는 아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다제와의 배양을 포함한다. 한편, 특이한 작용기를 포함하는 단당류를 또한 당접합체의 가수분해에 이은 상기 단당류의 자동화된 HPLC 분석에 의해 검출할 수 있다. 하기의 섹션에서는 화학 합성 방법을 사용하는 본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 제조를 위한 다수의 접근법들에 대하여 기술한다.

화학 합성

효소 촉매된 방법 및 세포-기반 방법을 사용하는 것 이외에, 당 및 당단백질을 포함하는 특이성 교환체를 화학 합성 지향의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 당 및 당접합체의 합성에 사용되는 방법의 예를 문헌[Pamela Sears et al., Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins, Carbohydrates and Glycobiology 291 Science 2344(March 23, 2001)]에서 찾을 수 있다. 대부분의 화학 합성 방법은 아노머 이탈기를 루이스 산으로 활성화 하는 것과 관계된다. 광범위한 용도를 얻기 위한 첫 번째 기법들 중 하나인 글리코실 할라이드를 커플링하는 쾨니히-크노르법(Koenigs-Knorr method)이 여전히 주로 사용되며, 지금까지 사용되는 대부분의 다른 글리코시드화 시약들이 동일한 기본 기전에 의해 계속 사용된다.

당 및 당접합체의 화학 합성을 또한 자동적으로 수행할 수 있다. 일반적으로 자동화된 합성의 경우, 반응을 고상으로 수행하는 것이 편리하다. 상기 접근법은 반응물들의 신속한 제거, 비교적 용이한 정제를 허용하며, (라이브러리 제작의 경우에) 위치에 의해(2 차원 배열 "칩" 포맷("chip" format)에서와 같이), 또는 "혼합 및 분할"("mix and split") 유형 라이브러리 제작의 경우 보조적인 암호화 반응(여기에서 사슬이 연장될 때 표지가 고체 지지체에 첨가된다)에 의해 또는 무선 주파수-암호화된 조합적인 화학 기술(radio frequency-encoded combinatorial chemistry technology)에 의해 생성물 암호화를 허용한다. 친수성 지지체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜계 수지가, 예를 들어 폴리에틸렌으로 코팅된 폴리스티렌 코어를 갖는 "하이브리드" 수지, 예를 들어 텐타겔(Tentagel)의 경우와 같이 성공적으로 사용되었다. 좀더 적은 정도로, 가용성 지지체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체들이 당 합성에 사용되었다.

당 및 당접합체 합성에 사용될 수 있는 또 다른 접근법은 단일 용기(one-pot) 반응이다. 단일 용기 반응은 합성된 생성물의 확인을 상이한 보호된 당들의 반응성 프로파일에 의존한다. 당의 반응성은 사용되는 보호기 및 아노머 활성기 에 크게 의존한다. 가장 큰 반응성을 지닌 것에서 가장 적은 반응성을 지닌 순서로 기질을 가함으로써, 목적으로 하는 표적 화합물의 우세함을 보장할 수 있다. 이러한 접근법에 대한 열쇠는 상이한 보호된 당들의 상대적인 반응성에 관한 광범위한 정량 데이터를 갖는 것으로, 상기 데이터는 현재 글리코믹스 분야의 당업자들에 의해 생성되고 있다. 상기 반응은 전형적으로는 용액 중에서 수행되지만, 최종적으로 반응물의 제거를 용이하게 하기 위해서 최종 수용체를 고상에 부착시킬 수도 있다.

상기 접근법은 자동화, 예를 들어 컴퓨터 프로그램을 통해 훨씬 더 효율적으로 수행될 수 있다. 단계적 고상 합성에 비해, 단일 용기 접근법은 오직 구성 단위 합성의 단계에서만 보호기 조작을 사용하며, 따라서 자동화 및 올리고당 구조의 보다 큰 다양성에 보다 큰 가능성을 갖는다.

또한, 다수의 다른 방법들을 본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 결합 또는 통합시킬 수 있는 글리코펩티드 및 당단백질의 합성에 사용할 수 있다. 이들 방법 중 다수가 문헌[Pamela Sears et al., Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins, Carbohydrates and Glycobiology 291 Science 2344(March 23, 2001)]에 논의되어 있다. 예를 들어 하나의 접근법에 의해, 본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 대한 당 쇄의 부착을, 비 환원 말단으로부터 시작하여 환원 말단으로 진행하는 단계적인 방식으로 수행한다. 글리칼-기반 합성 계획안 및 상기 개략된 단일 용기 전략의 경우에서와 같이, 최종적인 수용체는 아미노산, 펩티드 또는 당단백질일 수 있다. 하이드록실화된 아미노산, 예를 들어 세린 또는 트레오닌과의 커플링을 위해서, 상기 화학은 글리코시드 결합을 구성하는데 사용되는 것과 매우 동일하다: 즉 활성화된 아노머 위치가 상기 펩티드 상의 탈보호된 하이드록실 그룹에 의해 직접 공격을 받는다. NH₂-결합된 글리코시드의 경우, 상기 환원-말단 당을 전형적으로는 먼저 당 아지드(sugar azide)로서 제조하고, 이어서 상기를 환원시키고 카보디이미드(carbodiimide) 활성화를 통해 유리 아스파테이트에 커플링시킨다. 상기 수용체는 아미노산일 수 있으며, 이 경우 생성물을 고상 펩티드 합성(SPPS) 계획안에 통합시켜 표적 당단백질을 제조하거나, 또는 상기 생성물 자체가 최종 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로 하나 내지 3 개의 당을 갖는 글리코실화된 아미노산이 다수의 당단백질의 고상 합성에 성공적으로 사용되었다.

일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 포함하는 당단백질을 화학적 또는 효소적 방법을 통해 환원 말단으로부터 비 환원 말단으로의 단계적 방식으로 상기 펩티드를 글리코실화함으로써 합성할 수 있다. 전형적으로는, 단일의 글리코실화된 펩티드를 SSPS에 의해 제조하며, 상기 당을 선택적으로 탈보호시키고, 올리고당을 단계적인 방식으로 생성시킨다. 상기 단독으로 글리코실화된 펩티드를 SPPS를 통해 제조할 수 있으며, 상기 당을 완전히 탈보호시켜 3 개의 연속적인 글리코실트랜스퍼라제의 작용을 위한 기질을 제공할 수 있다. 이들 당단백질의 합성을 또한 자동화할 수 있다.

글리코실화된 펩티드의 당단백질로의 신장을 또한 다수의 접근법들에 의해 수행할 수 있다. 연구자들(Allen, P.Z., and Goldstein, I.J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., and Delius, M.M., Carbohydr . Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur . J. Immunol ., 1971, 1, 106; Fielder, R.J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265)은 탄수화물을 예를 들어 단백질 담체에 접합시키기 위해 다수의 기법들을 개발하였다. 이들 기법 중 대부분은 링커 자체에 항원 결정인자를 도입시킴으로써 다클론 항체들이 생성되는 것이 문제가 되었다. 카바트(Kabat)(Arakatsu, Y., et al., J. Immunol ., 1966, 97, 858) 및 그레이(Gray, G. R., Arch. Biochem . Biophys. 1974, 163, 426)는 유리 환원 올리고당의 산화적 또는 환원적 커플링에 각각 의존하는 접합 방법을 개발하였다. 그러나, 상기 기법들의 주요 단점은 상기 올리고당의 환원 말단의 온전함이 손상되었다는 것이다. 1975년에 레미욱스(Lemieux)는 링커 항원성의 문제점을 경감시키고 전체 올리고당를 온전하게 남겨두는 8-카보메톡시-1-옥탄올 링커(Lemieux, R.U., et al., J. Am. Chem. Soc ., 1975, 97, 4076)를 사용함을 개시하였다. 번스타인과 홀(Bernstein, M.A., and Hall, L.D., Carbohydr . Res., 1980, 78, C1.)에 의해 개시된 알릴 글리코시드 방법이 당접합체의 제조에 동등하게 유효하다. 이 기법에서는 비블록화된 당의 알릴 글리코시드를 오존처리한 다음 환원적 후처리를 수행한다. 이어서 생성된 알데히드를 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)에 의해 단백질 담체에 환원적으로 커플링시킨다.

짧은 펩티드들을 또한 "고유 펩티드 연결" 전략에 의해 보다 큰 것에 커플링시킬 수 있다. 그러나 당단백질 합성에 보다 용이한 접근법이 세포에 기초한 방법을 통해 달성될 수 있다. 상기 방법에 의해 생성되는 글리칸은 다수의 인자들, 예를 들어 글리코실화 부위 주변의 국소적인 단백질 구조 및 세포 중에 생성되는 당-가공 효소의 상대적인 양에 의해 결정될 것이다. 이들 인자 중 다수는 또한 세포 주에 따라 변하며, 따라서 하나의 세포 주에서 생산되는 당단백질은 또 다른 세포 주에서 생산되는 동일한 단백질과 상이한 글리코실화물을 가질 수 있다.

그러나 생산되는 생성물을, 당 쇄가 단순한 균질 코어로 분해되고 이어서 효소적으로 재합성되는 다수 계획안의 출발점으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, N-글리코실화된 단백질은 엔도글리코시다제를 사용하여 이종 집단을, 각각의 글리코실화 부위가 오직 단일 당에 부착된 동종 집단으로 전환시킴으로써 가장 안쪽의 N-아세틸글루코사민까지 분해된 글리칸을 가질 수 있다. 이어서 상기 단순 당단백질들을 글리코실트랜스퍼라제 또는 엔도글리코시다제-촉매된 트랜스글리코실화를 사용하여 효소적으로 합성시킴으로써 상기 글리칸의 크기 및 복잡성을 증가시킬 수 있다. 상기 트랜스글리코시다제 접근법은 N₂-결합된 올리고당의 가장 안쪽에 있는 N-아세틸글루코사민 잔기들 사이를 절단하는 효소인 엔도글리코시다제의 기질 특이성에 의해 제한된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 엔도글리코시다제는 광범위한 고-만노오스-, 하이브리드- 및 복합체-유형 글리칸을 수용하는 뮤코르 히에말리스(Mucor hiemalis)로부터의 엔도글리코시다제 M일 수 있다.

또 다른 접근법은 프로테아제를 사용함으로써 글리코실화된 부분을 제거하고, 이어서 그 자리에 짧은, 화학적으로 합성된 당단백질을 재부착하는 것이다. 이러한 연결은 프로테아제, 또는 자신을 번역 후에 단백질로부터 제거시킬 수 있는 셀프-스플라이싱 폴리펩티드인 인테인(intein)의 사용을 통해 효소적으로 수행될 수 있다. 상기 후자의 경우, 대체되는 펩티드 단편은 상기 인테인을 암호화하는 서열에 의해 유전자 수준에서 치환된다.

프로테아제는 열역학적 접근법 또는 동력학적 접근법을 사용하여 펩티드 합성을 촉매할 수 있다. 상기 열역학적 접근법에서, 펩티드들을 전형적으로는 생성물의 침전에 의해서 또는 낮은 수분 활성을 갖는 용매 중에서 반응을 수행함으로써 축합시켜 보다 큰 생성물을 형성시킨다. 효소 활성, 안정성 및 용해도에 관한 한 보다 유용한 접근법은 동력학적 접근법이며, 여기에서 펩티드 에스테르는 가수분해와 아미노 분해 간의 경쟁을 겪는다. 상기 아미노분해 대 가수분해의 비를 유기 공용매(cosolvent)를 가하여 수분 농도를 낮추고 아민 이온화를 억제시키거나, 아민 구핵성(nucleophile)농도를 증가시키거나, 또는 효소 활성 부위를 변경시킴으로써 개선시킬 수 있다. 효소 변형에 대해서, 세린 프로테아제의 활성 부위 세린의 시스테인으로의 전환이 펩티드 리가제의 생성에 매우 유효한 것으로 나타났다. 단백질의 글리코실화는 상기 단백질을 프로테아제 활성에 덜 민감하게 만드는 것으로 오랫동안 공지되어 왔으며, 따라서 당단백질을 프로테아제를 사용하여 커플링시키기가 어려울 것이라는 것을 추측할 수 있다. 그러나, 당단백질의 서브틸리신(subtilisin)-촉매된 합성에 대한 체계적 연구는, 글리코실화 부위가 커플링이 형성되는 결합 부위에 있지 않다면 프로테아제가 당단백질을 성공적으로 커플링시킬 수 있고, 상기 글리코실화 부위가 커플링이 형성되는 결합 부위로부터 멀리 떨어져 위치할 때, 커플링 수율이 개선됨을 밝혔다. 가장 유효하고 실용적인 당단백질 에스테르 이탈기들 중 하나는 변경된 링크(Rink) 아미드 수지로부터 생성되고 트리플루오로아세트산에 의해 절단된 벤질-유형 에스테르이다.

또 다른 접근법은 당단백질의 보다 큰 단백질에 대한 인테인-매개식 커플링을 사용하는 것이다. COOH-말단 엑스테인(extein)을 제거하고, 이어서 상기 반응을 외부적으로 첨가된 구핵(상기는 당단백질일 수 있다)에 의해 완성시킴으로써 자연 연결 반응(natural splicing reaction)에서 나타날 수 있다. 상기 자연 펩티드 연결 전략에서와 같이, 상기 펩티드는 바람직하게는 NH₂-말단에 시스테인을 포함한다.

당단백질 정제 과정은 글리코실화되지 않은 단백질의 정제와 매우 유사할 수 있다. 당단백질 정제의 첫 번째 단계는 대개 상기 당단백질을 용해시키는 것이다. 배지 내로 분비된 당단백질은 혈청 비 함유 배지가 세포의 증식에 사용된 경우 정제시키기가 비교적 용이하다. 소포에 포집된 채로 있는 당단백질(병아리 Thy-1에 서 볼 수 있는 바와 같이)을 용제로 용해시킬 수 있다. 상기 단백질은 일단 용제 중에서 수성 완충제에 대해 투석될 수 있다.

당단백질을 용해시킨 후에, 다양한 크로마토그래피 정제 계획안을 사용하여 상기를 정제시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 렉틴 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 렉틴은 특정한 당 및 당접합체에 고도의 친화성으로 결합하는 비-면역 단백질 또는 당단백질이다. 렉틴은 그의 결합 특이성으로 인해 탄수화물과 당접합체에 대해 일정한 범위의 특이성을 나타낸다. 상기 렉틴을 각종 지지체 상에 쉽게 고정시킬 수 있으며, 친화성 크로마토그래피에 사용할 수 있다. 렉틴은 일단 커플링되면 대부분의 완충제에 대해 안정하다.

아리야(Arya) 등이 수행한 연구는 인위적인 당단백질 라이브러리의 병행 합성을 위한 자동화된 다 단계 고상 전략의 개발을 도출시켰다(Arya, P. et al., 7 Med. Chem . Lett . 1537, 1997). 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 상기 전략을 사용하여 제작한다. 도 1은 상기 접근법을 도시한다.

따라서, 아세테이트로서 보호된, 알데히드 및 카복실산 유도체를 기본으로 하는 상이한 α- 또는 β-탄소 결합된 탄수화물(도 1의 18.1 참조)을 매우 융통성있고 조절된 방식으로 N-말단 부분에 또는 짧은 펩티드/슈도펩티드의 내부 아미드 질소(예를 들어 특이성 도메인 또는 항원 도메인에 결합된 특이성 도메인)에 통합시킬 수 있다. 상기 C-글리코시드의 사슬 길이를 변화시킬 수 있으며 탄수화물 부분을 피라노스(pyranose) 또는 퓨라노스(furanose) 형태로 합성할 수 있다. 단당류 및 그의 유도체는 이용할 수 있는 유일한 탄수화물 구성 단위들이 아니다. 몇몇 실시태양에서, 이당류 및 보다 고급의 올리고당을 또한 탄수화물 구성 단위로서 사용할 수 있다. C-글리코시드는 일반적으로 그의 산소 대응물보다 효소 및 산/염기 가수분해에 더 안정하다. 상기 방법은 아미노산 선택이 제한되는 글리코실화된 아미노산 구성단위보다 더 용도가 다양하다.

상기 접근법을 사용하여, 인위적인 당단백질의 라이브러리를 탄수화물-단백질 상호작용의 엄밀한 조사를 위해 쉽게 합성할 수 있다. 다수의 탄수화물 사본들을 나타내는 여러 "실용 모델"이 개발됨과 동시에(도 1의 18.2, 18.3 및 18.4 참조) 상기 디펩티드 골격은 생물학적 표적과의 2 차적인 상호작용에 기여할 수 있다(Arya, P. et al., 8 Med . Chem . Lett . 1127, 1998; Arya, P. et al., 7 Med . Chem. 2823, 1999).

처음에는, 인위적인 당단백질을 펩티드 합성기에 대한 집중적인 전략에 의해 합성하였다(Kutterer, et al., 1 J. Comb. Chem. 28, 1999). 상기 인위적인 당단백질 라이브러리의 합성은 완전히 자동화된 대량 유기 합성기로 성공적으로 이동되었으며 상기 합성의 각 단계가 최적화되었다(Arya, P. et al., 2 Comb. Chem. 120, 2000). 상기 방법론은 아미노산을 고체-지지체 수지, 예를 들어 링크 아미드 MBHA 수지 또는 텐타겔(TentaGel) 유도체화된 링크 아미드 수지에 커플링시킴을 포함한다. 아미노산 상의 보호기의 제거 후에, 상기 당 알데히드는 수지 결합된 아미노기에 의한 환원적 아미노화(도 1의 18.3 및 18.4 참조)에 이어서 두 번째 아미노산의 아미노산 커플링을 겪는다. 상기 아미노산의 탈보호 후에, 두 번째 환원적 아미노화가 일어나고/일어나거나 당산이 커플링될 수 있다. 이어서 상기 당 부분들은 탈아세틸화되고, 상기 화합물들은 상기 수지로부터 절단된다. 96 화합물 라이브러리의 합성을 단지 24 개의 디펩티드 및 2 개의 당 알데히드로부터 수득할 수 있다(Randell, Karla D., et al., High-throughput Chemistry toward Complex Carbohydrates and Carbohydrate-like Compounds, National Research Council of Canada, publication no. 43876, February 13, 2001 참조).

최근의 논문은 본 명세서에 개시된 특이성 교환체의 제조에 사용될 수 있는 또 다른 접근법을 개시한다. 다가의 환상 네오글리코펩티드의 합성이 완수되었다(Wittmann, V.; Seeberger, et al., 39 Chem . Int . Ed. 4348, 2000 참조). 알록(Alloc) 보호기를 기본으로 하는 새로운 우레탄-유형의 링커가 글리코실화 반응을 위해 개발되었으며, 상기 반응은 사실상 정량적으로 진행된다. 환상 펩티드(예를 들어 특이성 교환체)의 라이브러리를 지버(Sieber) 링커를 통해 결합된 텐타겔 수지 상에서 분할 및 혼합 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 도 2는 이러한 접근법을 도시한다.

도 2에 나타낸 합성 반응을 상기 웰로부터 소량의 수지를 회수하고 전자분사 질량분석법과 병용된 HPLC에 의한 분석에 의해 모니터할 수 있다. 당 부분의 p-니트로페닐 카보네이트 유도체(도 2의 19.2 참조)를 DIPEA의 존재 하에서 5 배 과잉(부착 지점 당)의 당을 사용하여 1 단계로 상기 환상 펩티드의 3 개의 지점에 부착시킨다. 18 개의 환상 네오글리코펩티드의 라이브러리(도 2의 19.3 참조)를 효율적으로 합성할 수 있다. 상기 방법론을 탄수화물 부분들 간의 거리뿐만 아니라 탄수화물 부분 자체를 변화시킴으로써 다수의 상이한 라이브러리의 합성에 적용시킬 수 있다. 하기 섹션에서는 특이성 교환체 및/또는 당 또는 당접합체에의 링커의 통합에 대하여 논의한다.

링커

몇몇 실시태양에서, 상기 당 또는 당접합체를 앞서 논의된 바와 같이 링커를 통해 또는 통상적인 담체 분자와의 회합에 의해 특이성 교환체에 결합시킬 수 있다. 일부 실시태양에서 링커를 사용하여 당을 특이성 교환체 중 적어도 하나의 아미노산에 접합시킨다. 일반적으로 "링커"란 용어는 분자의 가요성을 증진시키거나, 입체 장애를 감소시키거나, 상기 특이성 교환체를 지지체 또는 다른 분자에 부착되도록 하는 인자를 지칭한다. 임의의 적합한 링커를 사용하여 당 및/또는 당접합체를 특이성 교환체에 부착시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다.

특이성 교환체에 통합시킬 수 있는 다른 유형의 링커에는 아비딘 또는 스트렙트아비딘(streptavidin)(또는 이들의 리간드-비오틴)이 있다. 비오틴-아비딘/스트렙트아비딘 결합을 통해, 다수의 특이성 교환체들을 함께 접합시키거나(예를 들어 수지와 같은 지지체를 통해 또는 직접적으로), 또는 개별적인 특이성 도메인들을 당 또는 당접합체에 접합시킬 수 있다.

특이성 교환체에 포함시킬 수 있는 또 다른 링커의 예를 "λ 링커"라 지칭하는데, 그 이유는 상기가 λ 파지 상에서 발견되는 서열을 갖기 때문이다. 바람직한 λ 서열은 상기 파지의 가요성 가지(arm)에 해당하는 것이다. 상기 서열을 특이성 교환체에 포함시켜(예를 들어 특이성 도메인과 당 또는 당접합체 사이, 또는 특이성 및/또는 당 및 당접합체의 다량체들 사이에) 보다 큰 가요성을 제공하고 입체 장애를 감소시킬 수 있다. 하기 실시예에서는 다수의 당을 포함하는 특이성 교환체의 제조에 대하여 개시한다.

실시예 1

피브리노겐 감마-쇄의 단편을 포함하는 동일한 특이성 도메인(대략 20 아미노산 길이)을 갖는 2 개의 상이한 리간드/수용체 특이성 교환체를 펩티드 및 당접합체 합성의 표준 기법을 사용하여 제조한다. 첫 번째 특이성 교환체(특이성 교환체 1)는 소아마비 바이러스로부터 수득한 펩티드를 갖는 항원 도메인을 포함한다. 상기 소아마비 바이러스 펩티드는 소아마비 백신을 접종한 개인으로부터 수득한 인간 혈청 중에 존재하는 항체에 의해 인식된다. 두 번째 특이성 교환체(특이성 교환체 2)는 당 항원(예를 들어 gal-α-1-3 gal)을 상술한 기법들 중 하나 또는 또 다른 통상적으로 사용되는 접근법을 사용하여 특이성 교환체에 첨가한 것을 제외하고 특이성 교환체 1과 동일하다. 상기 gal 항원도 또한 상술한 항-소아마비 펩티드 항체를 갖는 개인으로부터 수득한 인간 혈청 중에 존재하는 항체에 의해 인식된다. 특이성 교환체 1 및 2는 고정화된 ClfA 수용체에 동등하게 잘 결합될 것으로 예상되는 동일한 특이성 도메인을 가지므로, 상기 gal 항원이 결여된 항원 도메인보다 인간 혈청으로부터 보다 많은 항체를 모을 수 있는 당-함유 항원 도메인의 능력을 샌드위치식 플레이트 분석에서 직접 분석할 수 있다.

따라서, 상기 두 리간드/수용체 특이성 교환체의 일련의 희석물을 제조하고 재조합 ClfA를 4℃에서 밤새 50 mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.6) 중의 96 웰 미세적정 플레이트에 10 ㎍/㎖로 부동으로 흡착시킨다. 이어서 상기 희석된 리간드/수용체 특이성 교환체를 서서히 흔들면서 4 ℃에서 60 분 동안 상기 ClfA-결합된 플레이트에 가한다. 일부 웰에서, BSA와 같은 차단제를 상기 특이성 교환체의 첨가 전에 가하여 비-특이적인 결합을 감소시킨다. 이어서, 상기 플레이트를 2 ㎖의 50 mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.6)으로 4 회 세척하여 임의의 결합되지 않은 특이성 교환체를 제거한다. 세척 후에, 상기 소아마비 바이러스 펩티드와 gal 항원 모두에 대한 항체를 갖는 환자로부터 수득한 1 ㎖의 인간 혈청을 1 ㎖의 50 mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.6) 중의 상기 웰에 가하고(즉 1:1 비), 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 서서히 교반한다. 다시 BSA를 포함시켜 비-특이적인 결합을 차단시킬 수 있다. 앞서 수행된 세척 단계를 반복하여 임의의 비-특이적으로 결합된 항체를 제거한다.

이어서 여러 분석 방법들을 사용할 수 있다. 하나의 접근법에 의해, 결합된 항체를 전형적인 항체 용출 완충제(예를 들어 글리신 Cl pH 2.5; Yarmush et al., Biotechnol. Prog. 8:168-178(1992) 참조)를 사용하여 특이성 교환체로부터 용출시키고, 상기 용출물의 흡광도를 분광광도측정법에 의해 검출한다. 일부의 경우에 염료를 사용하여 검출 수준을 개선시킨다. 한편, 상기 용출물을 멤브레인 상에(예를 들어 도트 블럿 사본을 사용하여) 블럿팅할 수 있으며, 상기 용출물 중의 단백질 양을 은 염색, 형광 또는 염료-기초 분석을 사용하여 정량분석할 수 있다. 상기 용출물을 또한 폴리아크릴아미드 겔에 가하고, 전기영동에 의해 분리시킨 다음, 염색하거나 또는 멤브레인으로 옮겨, 인간 면역글로불린 G, A 및 M(시그마 사로부터 입수할 수 있는 퍼옥시다제 표지된 다가 인간 면역글로불린)에 특이적인 퍼옥시다제 표지된 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행한다. 또한, 상기 특이성 교환체에 결합된 인간 혈청으로부터의 항체의 양을 상술한 퍼옥시다제 표지된 다가 항체를 사용하는 전형적인 샌드위치 유형 분석을 사용하여 동일 반응계에서(즉 플레이트로부터 용출시킴 없이) 측정할 수 있다. 이러한 분석 방법에 의해, 상기 플레이트를 디니트로-페닐렌-디아민(Sigma)과 배양시켜 발현시키고 흡광도를 분석한다.

상술한 분석은 인간 혈청으로부터 현저하게 보다 많은 항체가 소아마비 펩티드 단독(즉 특이성 교환체 1)보다는 소아마비 펩티드와 gal 항원으로 구성된 항원 도메인(즉 특이성 교환체 2)에 결합할 것을 확증할 것이다. ClfA 수용체는 스타필로코커스와 같은 병원체 상에 존재하기 때문에, 상기 분석은 또한 gal 항원(예를 들어 gal-α-1-3 gal)을 포함하는 특이성 교환체가 환자에 존재하는 자연 항체의 모집에 보다 유효하고, 따라서 이들 항체를 병원체로 전향시키는데 보다 유효함을 확증할 것이다. 하기 실시예에서는 다수의 글리코실화된 리간드/수용체 특이성 교환체의 합성에 사용되는 접근법에 대하여 개시한다.

실시예 2

HIV-1 당단백질 120(Mizukami T.,Fuerst T.R., Berger E.A. & Moss B., Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9273-7(1988))과 상호작용하는 CD4 수용체 영역에 상응하는 특이성 도메인을 포함하는 다수의 글리코실화된 리간드/수용체 특이성 교환체(표 1 참조)를 고상으로 합성하였다. 펩티드를 Fmoc 화학(Ed. Chan W.C. & White P.D. Fmoc solid phase peptide synthesis-a practical approach(2000) Oxford university press.)을 사용하여 자동화된 합성 로봇으로 제조하였다. 여전히 고체 지지체(수지)에 부착되어 있는 각각의 펩티드를 작은 분획과 큰 분획으로 나누었다. 작은 펩티드 분획들을 TFA 처리에 의해 상기 수지로부터 제거하는 한편, 큰 분획은 상기 수지에 부착된 채로 두어 글리코실화를 기다렸다. 상기 절단된 펩티드를 역상 HPLC(λ=220 ㎚)에 의해 분석하여 순도를 검사하였다. 분석 후, 절단된 펩티드를 동결건조하였다.

당 Gal-α1-3Gal을 포함하는 시약은 인간 항-Gal-α1-3Gal 항체를 흡수하는 것으로 나타났다(Rieben R., von Allmen E., Korchagina E. Yu. Et al. Xenotransplantation. 2, 98-106(1995)). Gal-α1-3Gal-β에 대한 식을 화학식 1로서 하기에 제공한다:

당 시약(Galα1-3Galβ1-O(CH₂)₃NH₂(Lectinity corp., product no. 88))을 아스파트산의 측쇄(화학식 2)에 커플링시켰다:

(Novabiochem, 제품 번호 04-12-1080)

상기 아미노산을 N-말단 및 C-말단 단부 모두에서 보호하였다. 상기 당 아미노 그룹과 아미노 카복실 그룹간에 공유 결합을 형성시켰다(반응식 1 참조).

상기 커플링 반응을, 반응 혼합물의 샘플을 λ=266 ㎚를 사용하여(Fmoc 보호 기가 상기 파장에서 UV 광을 강하게 흡수하므로) 분석함으로써 모니터하였다. 상기 커플링 반응을 대략 4 내지 6 시간 후에 멈추었다. 상기 당-아미노산을 역상 HPLC(λ=266 ㎚)에 의해 정제하였다. 정제된 당-아미노산을 동결건조하였다.

이어서, 상기 당-아미노산의 탈보호를 수행하였다. 상기 당-아미노산을 CD4 펩티드에 커플링시키기 위해서, OtBu-보호기를 상기 당-아미노 C-말단으로부터 TFA 처리에 의해 절단하였다(반응식 2 참조).

상기 탈보호를 역상 HPLC(λ=266 ㎚)에 의해 모니터하였다. 대략 2 시간 후에, 탈보호를 멈추었다. 상기 TFA의 대부분은 질소 기체에 의해 증발되었다. 나머지 용액을 물로 1/10으로 희석하였다. 상기 탈보호된 당-아미노산을 역상 HPLC(λ=266 ㎚)에 의해 정제하였다. 상기 정제되고 탈보호된 당-아미노산을 동결건조하였다.

상기 당-아미노산의 탈보호에 이어서, CD4 및 CDR 특이성 도메인 펩티드에 대한 커플링을 수행하였다. 상기 당-아미노산을 Fmoc 화학반응을 사용하여 상기 수지 결합된 특이성 도메인의 N-말단 단부에 공유 결합시켰다(반응식 3 참조). 상기 커플링 반응을 대략 6 시간 후에 멈추었다.

상기 글리코실화된 특이성 교환체를 탈보호시키고 TFA 처리에 의해 고체 지지체로부터 절단하였다. 상기 절단된 글리코실화된 특이성 교환체를 역상 HPLC(λ=220 ㎚)에 의해 분석하여 상응하는 비-글리코실화된 펩티드와 순도를 비교 검사하였다. 글리코실화-특이적 피크를 역상 HPLC(λ=220 ㎚)에 의해 정제하였다. 상기 정제된 글리코실화된 특이성 교환체를 동결 건조하였다. 동결 건조 후에, 각각의 글리코실화된 특이성 교환체의 분획을 MALDI-MS에 의해 분석하여 그의 정체를 확인하였다. 하기 실시예에서는 리간드/수용체 특이성 교환체가 병원체의 증식을 억제하는지의 여부를 결정하기 위해 수행 가능한 다수의 세포 기반 특성화 분석에 대하여 개시한다.

실시예 3

하나의 유형의 병원체-기반 특성화 분석은 지지체 상에 배치된 세균에 대한 리간드/수용체 특이성 교환체의 결합을 포함한다. 실시예 1에서와 같이, 별도의 분석을 수행하여 특이성 교환체 1과 2의 결합 친화성을 비교한다. ClfA를 생산하는 세균(예를 들어 스타필로코커스 아우레우스 또는 에스케리키아 콜라이)을 배양액 중에서 또는 적합한 증식 배지(예를 들어 LB 브로스, 혈액 브로스, LB 한천 또는 혈액 아가) 중의 다수의 한천 플레이트 상에서 생육시킨다. 상기 세포들을 융합점까지 생육시켜 고체 박테리얼 론(bacterial lawn)을 생성시킨다. 이어서, 특이성 교환체 1 및 특이성 교환체 2의 다수의 희석물들을 별도의 플레이트에 가한다. 예를 들어, 상이한 플레이트에 총 200 ㎕ 부피의 PBS 중의 500 ㎎, 1 ㎎, 5 ㎎, 10 ㎎, 25 ㎎ 및 50 ㎎의 특이성 교환체 1 또는 2를 제공한다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 이상 배양시킨다.

이어서, 결합되지 않은 리간드/수용체 특이성 교환체를 PBS에 의한 연속 세척(예를 들어 세척 당 2 ㎖의 PBS에 의한 3 회 세척)으로 제거한다. 이어서, 실시예 1에 사용된 일련의 인간 혈청 희석물(즉 상기는 소아마비 펩티드 및 gal 항원 모두에 대한 항체를 함유한다)을 상기 플레이트에 가한다(예를 들어 1:100 내지 1:1000의 인간 혈청 희석물을 제공한다). 60 분 배양 후에, 상기 플레이트를 PBS로 세척하여(예를 들어 세척 당 2 ㎖의 PBS에 의한 3 회 세척) 결합되지 않은 주 항체를 제거한다. 이어서 세균 단백질, 특이성 교환체 및 인간 항체를 멤브레인으로 옮긴다. 적합한 대조군은 상기 멤브레인 자체, 리간드/수용체 특이성 교환체는 없지만 인간 혈청으로부터의 항체는 함유하는 상기 멤브레인으로 옮겨진 세균 단백질, 및 리간드/수용체 특이성 교환체는 갖지만 인간 혈청으로부터의 항체는 없는 상기 멤브레인으로 옮겨진 세균 단백질을 포함한다.

이어서 상기 세균으로 전향된 항체의 양을 실시예 1에서 개시한 바와 같은 인간 면역글로불린 G, A 및 M에 특이적인 퍼옥시다제 표지된 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 2 차 항체의 적합한 희석물을 상기 멤브레인과 60 분 동안 접촉시키고, 결합되지 않은 2 차 항체를 PBS에 의해 상기 멤브레인으로부터 세척한다(예를 들어 세척 당 2 ㎖의 PBS에 의한 3 회 세척). 이어서 결합된 2 차 항체를 상기 멤브레인을 디니트로-페닐렌-디아민(Sigma)과 배양시킴으로써 검출한다.

상기 데이터는 gal 항원을 포함하는 특이성 교환체(특이성 교환체 2)가 특이성 교환체 1보다 인간 혈청 중에 존재하는 항체를 세균 병원체로 보다 효율적으로 전향시킴을 보일 것이다. 본 실시예는 또한 다수의 당 또는 당응집체(gal-α-1-3 gal)를 포함하는 특이성 교환체가, 생체 내에서 환자 중에 존재하는 항체의 병원체로의 전향에 보다 유효할 것임을 확증한다. 하기 실시예에서는 HIV와 상호작용하는 글리코실화된 리간드/수용체 특이성 교환체의 능력을 평가하기 위해 수행되는 병원체-기반 특성화 분석에 대하여 개시한다.

실시예 4

HIV에 특이적인 글리코실화된 리간드/수용체 특이성 교환체를 실시예 2에 개시된 접근법에 따라 제조하였다. 인간 Gal-알파1,3-Gal-특이성 항체와 결합하는 글리코실화된 특이성 교환체의 능력을 평가하기 위해서, 동일한 리간드/수용체 특이성 교환체의 글리코실화 및 비-글리코실화 형태를 미세적정 플레이트의 고체 상에 코팅하였다. 4 개의 인간 혈청을 상기 코팅된 펩티드에 결합하였으며, 효소 표지된 항-인간 항체는 결합된 인간 항체를 나타내었다. 결과는 오직 글리코실화된 펩티드만이 인간 항체(인간 혈청 IB72; 도 3)와 결합할 수 있음을 보였다.

병원체에 결합하는 글리코실화된 특이성 교환체의 능력을 추가로 평가하기 위해서, 글리코실화된 펩티드 경쟁 분석을 가장 반응성인 인간 혈청(IB72)을 사용하여 수행하였다. 간단히, Gal-알파1,3-Gal-표지된 소 혈청 알부민(Gal-BSA)을 +4 ℃에서 밤새 탄산 나트륨 완충액(pH: 9.6) 중의 96-웰 미세플레이트 상에 코팅하였다. 인간 혈청의 희석물 및 글리코-펩티드(글리코실화된 HIV-특이적인 리간드/수용체 특이성 교환체 또는 Gal-BSA) 또는 글리코실화되지 않은 펩티드(HIV-특이적인 리간드/수용체 특이성 교환체 또는 BSA)의 희석물을 37 ℃에서 1 시간 동안 1% 소 알부민, 2% 염소 혈청 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 인산염-완충 염수(PBS)에서 예비 배양하였다. 이어서 상기 혼합물을 상기 코팅된 플레이트에 가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양시키고, 이어서 0.05% 트윈 20(pH: 7.4)을 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)로 3 회 세척하였다.

결합된 항체들을 염소 항-인간 다가 Ig로 표시하고, 알칼리성 포스파타제와 접합하였다. 상기 플레이트를 배양시키고 상술한 바와 같이 세척하였다. 플레이트를 실온에서 30 분간 인산염 기질로 전개시키고, 1M NaOH로 정지하였다. 405 ㎚/650 ㎚에서의 광학 밀도(OD)를 측정하여 상기 저해를 정량분석하였다. 결과를 도 4에 제공하며, 상기는 Gal-BSA에 결합하는 인간 항체가 오직 Gal-BSA 또는 글리코실화된 펩티드에 의해 저해될 수 있음을 보인다. 따라서, Gal-알파1,3-Gal-특이적인 항체와 결합하는 특이성 교환체가 생성되었다. 상기 언급한 바와 동일한 조건 하에서 인간 혈청과 혼합된 Gal-BSA를 양성 대조군으로 사용하였으며 100% 저해가 관찰되었다.

하기 실시예는 다수의 당 또는 당접합체(예를 들어 gal-α-1-3 gal)를 포함하는 특이성 교환체가 환자 중에 존재하는 항체를 생체 내에서 병원체로 전향시키는데 보다 유효함을 입증할 것이다.

실시예 5

병원성 감염을 억제하는 리간드/수용체 특이성 교환체의 능력을 평가하는데 적합한 다수의 동물 모델들이 존재한다. 마우스가 키우기 용이하고 세균 감염, 바이러스 감염 및 암에 민감하므로 바람직하다. 침팬지가 또한 바람직한데 그 이유는 이들의 유전자 관계가 인간에 가깝기 때문이다.

마우스에서 세균 감염을 치료하는 리간드/수용체 특이성 교환체의 능력을 시험하기 위해서, 하기의 특성화 분석을 수행할 수 있다. 대략 8 주령의 25 g 체중을 갖는 다수의 암컷 CF-1 무작위 교배된 마우스(Charles Rivers Laboratories)를 스타필로코커스 아우레우스 배양물로 밤새 복강 내 접종한다. 혈액 샘플을 상기 마우스로부터 취하여 스타필로코커스 아우레우스가 상기 환자 중에 존재하는지를 확인하기 위한 시험을 수행한다.

상기 감염된 마우스에게 실시예 1 및 2에 개시된 바와 같은 적합한 양의 특이성 교환체 1 또는 2를 주입한다. 실시예 1 및 2에 사용된 작은 인간 혈청 샘플(예를 들어 0.5 ㎖)을 또한 상기 감염된 마우스에게 주입한다. 2 주 이하 동안 상기 인간 혈청 주입 후 다양한 시점에 대해서, 상기 마우스를 스타필로코커스 아우레우스의 존재 및 만연성에 대해 모니터한다. 스타필로코커스 아우레우스 감염의 발달 또는 쇠퇴를 플롯팅한다.

상기 데이터는 특이성 교환체 2가 특이성 교환체 1보다 스타필로코커스 아우레우스 증식을 더 효율적으로 억제함을 보일 것이며, 이는 gal 항원의 존재가 환자 중에 존재하는 인간 항체를 상기 병원체로 재 배치하는데 보다 효율적임을 입증한다. 하기 섹션에서는 당 및/또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체를 포함하는 다수의 약제들에 대하여 개시한다.

당 및/또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체를 포함하는 약제

본 명세서에 개시된 특이성 교환체는 병원체에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 화합물이 필요한 환자에게 투여하기 위한 약제에 혼입시키기에 적합하다. 이러한 약물학적으로 유효한 화합물들을 통상적인 갈레노스식 약제배합법에 따라 가공하여 인간을 포함한 포유동물에게 투여하기 위한 약제를 제조할 수 있다. 유효 성분들을 변경시켜 또는 변경 없이 약품에 혼입시킬 수 있다. 더욱이, 본 발명의 약물학적으로 활성인 화합물을 다수의 경로에 의해 전달하는 약제 또는 치료제의 제조 방법은 본 발명의 태양이다. 예를 들어, 비 제한적으로 DNA, RNA 및 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 암호화하는 서열을 갖는 바이러스 벡터들을 본 발명의 실시태양에 사용한다. 상기 포함된 특이성 교환체를 암호화하는 핵산을 단독으로 또는 다른 유효 성분들과 함께 투여할 수 있다.

상기 특이성 교환체를 통상적인 부형제를, 즉 본 명세서에 개시된 약물학적으로 활성인 성분들과 유해하게 반응하지 않는 비 경구, 장(예를 들어 경구) 또는 국소 적용에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 사용할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 비 제한적으로 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예를 들어 락토오스, 아밀로오스 또는 전분, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향료 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리쓰리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등이 있다. 사용될 수 있는 다수의 보다 많은 비히클들이 문헌[Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton: Mack Publishing Company, pages 1405-1412 및 1461-1487(1975) and The National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association(1975)]에 개시되어 있다. 상기 약학 제제를 멸균시킬 수 있으며 경우에 따라 보조제, 예를 들어 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향 물질 등을 이들이 상기 특이성 교환체와 유해하게 반응하지 않는 한 혼합시킬 수 있다.

다수의 당 및/또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체를 갖는 특정 약제의 유효 투여 용량 및 투여 방법은 환자 개인의 필요 및 추구하는 치료 또는 예방 수단에 따라 변할 수 있다. 상기와 같은 화합물의 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50(집단의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약물 절차에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이성 교환체의 유효 용량을 상술한 특성화 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 이어서 상기 분석으로부터 수득한 데이터를 인간을 포함한 다른 유기체에 사용하기 위한 용량 범위를 공식화하는데 사용한다. 상기와 같은 화합물의 용량은 바람직하게는 독성 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 특이성 교환체의 유형, 사용되는 투여형, 유기체의 민감성, 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변한다.

특이성 교환체의 통상적인 투여량은 투여 경로에 따라 대략 1 내지 100,000 마이크로그램에서 약 10 g의 총 용량까지 변할 수 있다. 바람직한 용량에는 약 250 ㎎ 내지 1 ㎎, 약 50 ㎎ 내지 200 ㎎ 및 약 250 ㎎ 내지 500 ㎎이 포함된다.

일부 실시태양에서, 특이성 교환체의 상기 용량은 바람직하게는 대략 0.1 μM 내지 500 μM의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 모두를 생성시킨다. 바람직한 용량은 약 1 μM 내지 800 μM의 조직 또는 혈액 농도 또는 이들 모두를 생성시킨다. 바람직한 용량은 약 10 μM 내지 약 500 μM의 조직 또는 혈액 농도를 생성시킨다. 800 μM보다 큰 조직 농도를 생성시키는 용량은 바람직하지는 않지만 사용될 수 있다. 특이성 교환체의 일정한 주입이 또한 혈액 수준에 의해 측정 시 조직 중에서 안정한 농도를 유지시키기 위해 제공될 수 있다.

정확한 용량은 치료하려는 환자의 상태를 고려하여 의사가 개인적으로 선택한다. 용량 및 투여를 조절하여 유효 잔기의 충분한 수준을 제공하거나 또는 목적으로 하는 효과를 유지한다. 고려할 수 있는 추가적인 인자들로는 질병의 중증도, 치료되는 유기체의 연령, 및 유기체의 체중 또는 크기, 식이요법, 투여 시간 및 회수, 약물 조합(들), 반응 감도 및 치료에 대한 허용성/반응이 있다. 짧게 작용하는 약제학적 조성물을 매일 또는 그 이상의 빈도로 투여하는 반면, 오래 작용하는 약제학적 조성물은 매 2 일 이상마다, 1 주일에 1 회, 또는 매 2 주마다 한번 또는 심지어 그보다 적게 투여한다.

상기 약제의 투여 경로로는 비 제한적으로 국소, 경피, 비 경구, 위장, 기관지 경유 및 치조 경유 경로가 있다. 경피 투여는 특이성 교환체를 피부에 침투시킬 수 있는 크림, 린스, 겔 등의 적용에 의해 수행된다. 비 경구 투여 경로에는 비 제한적으로 전기 또는 직접 주입, 예를 들어 중심 정맥 선 내로의 직접 주입, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피 내 또는 피하 주입이 포함된다. 위장 투여 경로로는 비 제한적으로 섭취 및 직장 경로가 있다. 기관지 경유 및 치조 경유 투여 경로로는 비 제한적으로 입을 통한 흡입 또는 비 내에 의한 경로가 있다.

경피 또는 국소 투여에 적합한 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 갖는 조성물은 비 제한적으로 약학적으로 허용 가능한 현탁액, 오일, 크림, 및 피부에 직접 적용되거나 또는 경피 장치("경피 패치")와 같은 보호 담체에 통합되는 연고를 포함한다. 적합한 크림, 연고 등의 예를, 예를 들어 문헌[Physician's Desk Reference]에서 찾을 수 있다. 적합한 경피 장치의 예들이 예를 들어 1989년 4월 4일자로 키넨(Chinen) 등에게 허여된 미국 특허 제 4,818,540 호에 개시되어 있다.

비 경구 투여에 적합한 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 갖는 조성물은 비 제한적으로 약제학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 용액을 포함한다. 상기와 같은 용액으로는 비 제한적으로 중심 정맥 선 내로의 주입, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 경피 또는 피하 주입용의 염수 및 인산염 완충 염수가 있다.

기관지 경유 및 치조 경유 투여에 적합한 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 갖는 조성물은 비 제한적으로 다양한 유형의 흡입용 에어로졸을 포함한다. 이들의 기관지 경유 및 치조 경유 투여에 적합한 장치가 또한 실시태양이다. 상기와 같은 장치로는 비 제한적으로 분무기 및 기화기가 있다. 많은 형태의 현재 이용 가능한 분무기 및 기화기들을 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 갖는 조성물을 전달하기 위해 쉽게 개조시킬 수 있다.

위장 투여에 적합한 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 갖는 조성물은 비 제한적으로 약학적으로 허용 가능한 분말, 섭취용 환제 또는 액체 및 직장 투여용 좌약을 포함한다. 사용의 용이성으로 인해, 위장 투여, 특히 경구 투여가 바람직한 실시태양이다. 일단 상기 특이성 교환체를 포함하는 약제가 수득되었으면, 상기를 병원성 감염의 치료 또는 예방이 필요한 유기체에게 투여할 수 있다.

본 발명의 태양들은 또한 의료 장치, 예를 들어 인공 기구, 임플란트 및 장비의 코팅을 포함한다. 의료 장치 상에 사용하기에 적합한 코팅은 상기 특이성 교환체를 함유하는 겔이나 분말에 의해서 또는 특이성 교환체가 현탁된 중합체성 코팅제에 의해 제공될 수 있다. 장치 코팅용으로 적합한 중합체성 물질은 생리학적으로 허용 가능한 것들이며 이를 통해서 치료 유효량의 특이성 교환체가 확산될 수 있다. 적합한 중합체로는 비 제한적으로 폴리우레탄, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐-클로라이드, 셀룰로오스 아세테이트, 실리콘 탄성중합체, 콜라겐, 실크 등이 있다. 상기와 같은 코팅제들은 예를 들어 미국 특허 제 4,612,337 호에 개시되어 있다. 하기 섹션에서는 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 사용하여 질병을 치료 및 예방하는 방법에 대하여 개시한다.

다수의 당 및/또는 당접합체를 포함하는 특이성 교환체를 사용한 질병의 치료 및 예방

본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 포함하는 약제를 수용체를 갖는 병원체에 의한 감염의 치료 및/또는 예방이 필요한 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 환자에는 병원체와 접촉할 위험이 있는 개인 또는 이미 병원체에 감염된 개인이 포함될 수 있다. 이들 개인을 표준 임상 또는 진단 기법에 의해 식별할 수 있다.

하나의 접근법에 의해, 예를 들어 세균 감염으로 고통받는 환자를 병원체의 증식을 억제하는 약제가 필요한 환자로서 식별한다. 이어서 상기 환자에게 치료 유효량의 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 제공한다. 상기 방법에 사용되는 특이성 교환체는 상기 세균 상에 존재하는 수용체(예를 들어 세포외 피브리노겐 결합 단백질(Efb), 콜라겐 결합 단백질, 비트로넥틴 결합 단백질, 라미닌 결합 단백질, 플라스미노겐 결합 단백질, 트롬보스폰딘 결합 단백질, 응집 인자 A(ClfA), 응집 인자 B(ClfB), 피브로넥틴 결합 단백질, 혈장응고효소 및 세포 외 부착 단백질)와 상호작용하는 특이성 도메인을 포함한다. 상기 특이성 교환체는 또한 상기 필요 환자 중에 존재하는 고 역가 항체에 의해 인식되는 다수의 당 및/또는 당접합체를 갖는 항원 도메인을 포함한다. 또한 상기 환자에게 상기 특이성 교환체를 제공하기 전에 상기 항원 도메인을 인식하는 고 역가 항체의 존재에 대해 상기 필요한 환자를 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 선별은 상술한 바와 같이, 고정화된 항원 도메인 또는 특이성 교환체를 사용하여 EIA 또는 ELISA에 의해 수행될 수 있다.

유사하게, 바이러스 감염을 억제시키는 약제가 필요한 환자에게 특정한 병인 인자 상에 존재하는 수용체를 인식하는 특이성 교환체를 투여할 수 있다. 따라서, 바이러스 감염을 억제시키는 약제가 필요한 환자를 표준 임상 또는 진단 과정에 의해 식별한다. 이어서, 상기 필요한 환자에게 치료 유효량의, 상기 개인을 감염시킨 바이러스 유형 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 특이성 교환체를 제공한다. 상기와 같이, 상기 특이성 교환체를 투여하기에 앞서 상기 환자가 상기 특이성 교환체의 항원 도메인과 상호작용하는 충분한 역가의 항체를 갖는지를 측정하는 것이 바람직할 수 있다.

같은 맥락으로, 암 증식을 억제하는 약제가 필요한 환자에게 상기 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 특이성 교환체를 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 암 증식 억제제가 필요한 환자를 표준 임상 또는 진단 과정에 의해 식별하고; 이어서 상기 필요한 환자에게 치료 유효량의, 상기 환자가 걸린 암 세포 상에 존재하는 수용체와 상호작용하는 특이성 교환체를 제공한다. 상기한 바와 같이, 상기 특이성 교환체를 투여하기에 앞서 상기 환자가 상기 특이성 교환체의 항원 도메인과 상호작용하는 충분한 역가의 항체를 갖는지를 측정하는 것이 바람직할 수 있다.

본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 또한 예방제로서 질병의 개시를 예방하기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 사실상 예방을 목적으로(예를 들어 세균 감염, 바이러스 감염 또는 암을 예방하기 위해서) 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 누구에게나 투여할 수 있다. 그러나, 특정 질병에 걸릴 위험이 높은 환자를 식별하고 특이성 교환체를 제공하는 것이 바람직하다. 질병에 걸릴 위험이 높은 환자에는 질병의 가족력이 있는 개인, 노인 또는 어린이, 또는 병원체와 빈번히 접촉하게 되는 개인(예를 들어 헬스 케어 종사자)이 포함된다. 따라서, 수용체를 갖는 병원체에 의해 감염될 위험이 있는 환자를 식별하고 이어서 예방학적 유효량의 특이성 교환체를 제공한다.

본 명세서에 개시된 특이성 교환체에 대한 하나의 예방학적 용도는 상기 특이성 교환체를 의료 장치 또는 임플란트에 코팅 또는 가교 결합시키는 것에 관한 것이다. 이식 가능한 의료 장치는 다수의 세균 종들에 의한 감염의 병소로서 작용하는 경향이 있다. 상기와 같은 장치 관련된 감염들은 이들 유기체가 상기 장치의 표면에 들러붙어 집락을 형성하는 경향에 의해 촉진된다. 결과적으로, 전형적으로 의료 장치의 이식에 동반되는 해로운 생물 반응들을 덜 촉진시키는 경향이 있는 표면의 개발이 상당히 필요하다.

하나의 접근법에 의해, 상기 의료 장치를 특이성 교환체를 함유하는 용액으로 코팅한다. 이식에 앞서, 예를 들어 의료 장치(예를 들어 인공 판막)를 특이성 교환체의 용액에 보관할 수 있다. 의료 장치를 또한 특이성 교환체를 갖는 분말 또는 겔로 코팅할 수 있다. 예를 들어, 장갑, 콘돔 및 자궁 내 장치를 세균 또는 바이러스 수용체와 상호작용하는 특이성 교환체를 함유하는 분말 또는 겔로 코팅할 수 있다. 일단 체 내에 이식되었으면, 이들 특이성 교환체들은 병원체에 의한 감염에 대해 예방적인 차단층을 제공한다.

일부 실시태양에서, 상기 특이성 교환체를 의료 장치에 고정시킨다. 상술한 바와 같이, 상기 의료 장치는 특이성 교환체가 부착될 수 있는 지지체이다. 고정화는 상기 특이성 교환체와 의료 장치간의 소수성 상호작용에 의해 일어날 수 있지만, 특이성 교환체를 의료 장치에 고정시키는 바람직한 방식은 공유 결합을 포함한다. 예를 들어, 상기 특이성 교환체 상에 존재하는 반응기와 상호작용하는 반응기를 갖는 의료 장치를 제조할 수 있다.

하나의 접근법에 의해, 과요드산염를 2-아미노알콜 잔기를 포함하는 특이성 교환체와 결합시켜 약 4 내지 약 9의 pH 및 약 0 내지 약 50 ℃의 온도를 갖는 수용액 중에 알데히드 작용성 교환체를 형성시킨다. 이어서, 상기 알데히드 작용성 교환체를 상기 1 차 아민 잔기를 포함하는 의료 장치의 생체 적합 물질과 결합시켜 상기 특이성 교환체를 아민 잔기를 통해 상기 지지체 표면상에 고정시킨다. 이어서, 상기 이민 잔기는 환원제와 반응하여 2 차 아민 결합을 통해 상기 생체 적합 물질 상에 고정된 특이성 교환체를 형성시킨다. 유사한 화학반응을 사용하여 당을 지지체 및/또는 특이성 교환체의 특이성 도메인에 또한 부착시킬 수 있다. 분자를 의료 장치에 가교결합시키는 다른 접근법들(예를 들어 미국 특허 제 6017741 호에 개시된 바와 같은)을 변경하여 본 명세서에 개시된 특이성 교환체를 고정시킬 수 있다.

본 발명을 실시태양 및 실시예를 참고로 하여 기술하였지만, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는, 다양한 변형들이 이루어질 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명은 오직 하기 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

<110> TRIPEP AB <120> GLYCOSYLATED SPECIFICITY EXCHANGERS <130> TAP05171KR <150> US 60/446,172 <151> 2003-02-06 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 1 Asp Cys Asp Leu Ile Tyr Tyr Asp Tyr Glu Glu Asp Tyr Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 2 Asp Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 3 Asp Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 4 Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 5 Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 6 Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 7 Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 8 Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 9 Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln 1 5 10 15

Claims

적어도 하나의 당과 접합된 200 미만의 아미노산 길이를 갖는, 특이성 도메인을 포함하는 특이성 교환체.
제 1 항에 있어서,

상기 적어도 하나의 당이 Gal 항원인 특이성 교환체.
제 1 항에 있어서,

상기 적어도 하나의 당이 Galα(1,3)Galβ인 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 교환체가 리간드/수용체 특이성 교환체인 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 교환체가 항원/항체 특이성 교환체인 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인에 접합된 항원 도메인 또는 링커(linker)를 더 포함하는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 세균에 결합하는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 바이러스에 결합하는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 암 세포에 결합하는 특이성 교환체.
제 7 항에 있어서,

상기 세균이 스타필로코커스(Staphylococcus)인 특이성 교환체.
제 8 항에 있어서,

상기 바이러스가 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인플루엔자 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로 이루어진 군에서 선택되는 특이성 교환체.
제 11 항에 있어서,

상기 바이러스가 HIV인 특이성 교환체.
제 11 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 CD4 펩티드를 포함하고, 상기 적어도 하나의 당이 Galα(1,3)Galβ인 특이성 교환체.
제 13 항에 있어서,

상기 CD4 펩티드가 SEQ ID. NO: 2, SEQ ID. NO: 3, SEQ ID. NO: 4, SEQ ID. NO: 5, SEQ ID. NO: 6, SEQ ID. NO: 7, SEQ ID. NO: 8 및 SEQ ID. NO: 9로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 특이성 교환체.
제 11 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 CDR 펩티드를 포함하고, 상기 적어도 하나의 당이 Galα(1,3)Galβ인 특이성 교환체.
제 15 항에 있어서,

상기 CD4 펩티드가 SEQ ID. NO: 1을 포함하는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 150 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 100 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 50 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 교환체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 특이성 도메인이 25 미만의 아미노산 길이를 갖는 특이성 교환체.
세균 또는 바이러스의 증식을 감소시킬 필요가 있는 환자에게서 상기 증식을 감소시키기 위한 약제의 제조에 사용되는 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 의한 특이성 교환체의 용도.
세균 또는 바이러스의 증식을 감소시킬 필요가 있는 환자에게서 상기 증식을 감소시키는데 사용되는 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 의한 특이성 교환체의 용도.
특이성 도메인에 접합된 적어도 하나의 당을 포함하는 개선점을 지닌, 특이성 도메인을 포함하는 개선된 특이성 교환체.
제 23 항에 있어서,

상기 특이성 교환체가 리간드/수용체 특이성 교환체인 개선된 특이성 교환체.
제 23 항에 있어서,

상기 특이성 도메인에 접합된 상기 적어도 하나의 당이 Galα(1,3)Galβ인 개선된 특이성 교환체.