EA018808B1 - Ингибиторы протеинкиназы, фармацевтический состав на их основе и применение в терапии - Google Patents

Abstract

В изобретении предложено соединение формулы (I)или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтический состав на его основе, ингибирующий активность CDK4/6 или Pim-1 киназ, а также применение указанного соединения для лечения заболевания или нарушения, характеризующегося аномальной пролиферацией клеток.

Description

Высокогомологичные циклинзависимые киназы (Сбк) СЭК4 и СЭК6 в комбинации с циклином Ό представляют собой ключевые регуляторы перехода через точку рестрикции Я между фазами Οι (рост) и 8 (репликация ДНК) клеточного цикла. СЭК4/6 осуществляют свое действие за счет фосфорилирования белка ретинобластомы (рЯЬ). В результате фосфорилирования рЯЬ теряет ингибирующее действие на транскрипцию генов, способствуя вхождению в фазу 8.

Напротив, специфическое ингибирование активности СОК4/6-киназы при помощи эндогенного белкового модулятора р1б^ЮК4 или низкомолекулярных ингибиторов приводит к получению гипофосфорилированного рЯЬ и остановке развития клеток в точке рестрикции Ο₁. Как основной механизм регулирования точки рестрикции Ο₁ регулируемый указанными киназами путь подвергается изменению при широком спектре опухолей у человека, и, таким образом, ингибирование ί.ΌΙ<4/ί.ΌΙ<6 в указанных опухолях обладает терапевтическим преимуществом, заключающимся в предотвращении деления клеток. Р1Ш-1 представляет собой серин/треонинкиназу, которая регулирует различные биологические функции, включая прохождение клеточного цикла, пути транскрипционной/сигнальной трансдукции и апоптоз, и функции, экспрессию которых связывают с различными раковыми заболеваниями, включая гематологические опухоли, опухоли простаты и полости рта (Васйтапп, М. апб Т. Могоу, Ιηΐ. 1. Вюсйет. Се11 ΒίοΙ., 2005, 37(4): р. 726-30). Ингибиторы киназ известны в данной области техники. В \УО 98/11095 предложен ряд замещенных 2-пиридинаминов, которые охарактеризованы как ингибиторы киназы, в частности р5б^1ск, ΖΑΡ-70 киназ и протеинкиназы С. В \УО 98/11095 не описано ингибирование Сбк.

В \УО 03/062236 предложен ряд 2-(пиридин-2-иламино)пиридо[2,3-б]пиримидин-7-онов, охарактеризованных как обладающие ингибирующей активностью в отношении СОК4/6. Указанные соединения охарактеризованы как подходящие для лечения нарушений клеточной пролиферации, таких как рак и рестеноз. Однако указанные соединения плохо растворяются в водном растворе и не проявляют заметной ингибирующей активности в отношении других (отличных от Сбк) мишеней-киназ.

По-прежнему существует необходимость в создании ингибиторов ί.ΌΚ4/6. которые можно применять для лечения клеточных пролиферативных нарушений, таких как рак. В настоящем изобретении предложены ингибиторы СЭК4/6. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению являются более сильными ингибиторами СОК4/6 по сравнению с конкретными соединениями, известными в данной области техники.

Дополнительно, существует необходимость в обеспечении ингибиторов СЭК4/6, которые являются селективными для СЭК4/6 по сравнению с другими Сбк и способны, таким образом, вызывать специфическую блокировку О! при их присутствии в фармакологически значимых концентрациях. В настоящем изобретении предложены ингибиторы СЭК4/6, которые способны вызывать специфическую блокировку Οι при их присутствии в фармакологически значимых концентрациях.

Также по-прежнему существует необходимость в обеспечении ингибиторов СОК4/6 с улучшенной растворимостью в водном растворе. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению обладают улучшенной растворимостью в водном растворе по сравнению с конкретными соединениями, известными в данной области техники.

Также существует необходимость в обеспечении ингибиторов СЭК4/6, которые обладают улучшенным распространением в мозговую ткань и которые можно, таким образом, применять для лечения нарушений, протекающих в мозгу, например первичных или метастатических опухолей мозга. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению обладают улучшенным распространением в мозго вую ткань.

Также существует необходимость в обеспечении ингибиторов СЭК4/6 с хорошими фармакокинетическими свойствами, такими как пероральная доступность. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению обладают улучшенной пероральной доступностью по сравнению с конкретными соединениями, известными в данной области техники.

Дополнительно, существует необходимость в обеспечении ингибиторов киназы, которые обладают вторичной ингибирующей активностью в отношении других не-Сбкк киназ, например Р1т-1-киназы. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению обладают двойной ингибирующей активностью в отношении СОК4/6 и Р1т-1 киназ.

(I)

- 1 018808 где Я¹ представляет собой С₃-С₅-алкил, Сз-С5-циклоалкил или циклопропилметил;

Я² и Я³ представляют собой Н или фтор, причем по меньшей мере один из Я² и Я³ представляет собой фтор;

Я⁴ представляет собой Н или СН₃;

Я⁵ представляет собой С1-С6-алкил или -№Я⁶Я⁷, где Я⁶ и Я⁷ представляют собой С1-С₃-алкил;

О представляет собой СН₂, О, 8 или прямую связь;

У и Υ представляют собой С или Ν, причем по меньшей мере один из У или Υ представляет собой N и в случае если О представляет собой О или 8, то У представляет собой С;

или их фармацевтически приемлемые соли.

В настоящем изобретении предложен фармацевтический состав, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

В настоящем изобретении предложено соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.

В настоящем изобретении предложено соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака, в частности, раковых заболеваний, выбранных из группы, состоящей из колоректального рака, рака груди, рака легких, в частности немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака простаты, глиобластомы, лимфомы из клеток мантийной зоны (МСЬ), хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ) и острой миелоидной лейкемии (ОМЛ).

В настоящем изобретении также предложен способ лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака груди, рака легких, в частности немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака простаты, глиобластомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, хронической миелоидной лейкемии и острой миелоидной лейкемии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в подобном лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.

Дополнительно, в настоящем изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака, в частности рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака груди, рака легких, в частности немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака простаты, глиобластомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, хронической миелоидной лейкемии и острой миелоидной лейкемии.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен фармацевтический состав для применения в терапии, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В изобретении также предложен фармацевтический состав для лечения колоректального рака, рака груди, рака легких, в частности немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), рака простаты, глиобластомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, хронической миелоидной лейкемии и острой миелоидной лейкемии, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

Общие химические термины, используемые в формулах выше, имеют свои обычные значения. Например, термин С₃-С₅-алкил относится к линейной или разветвленной одновалентной насыщенной цепи, содержащей от 3 до 5 атомов углерода, и включает, но не ограничивается ими, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил.

Термин С₃-С₅-циклоалкил относится к насыщенной углеродной циклической системе, содержащей от 3 до 5 атомов углерода.

Специалисту в данной области будет понятно, что большинство или все соединения согласно настоящему изобретению способны образовывать соли. Соединения согласно настоящему изобретению представляют собой амины и, соответственно, взаимодействуют с любыми неорганическими или органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Указанные фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и общие способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, Р. 81а111 е! а1., НапбЬоок о£ Рйаттасеийса1 ка11к: РгорсгЦс5. 8е1ес!юп апб ике (УСНААУПеу-УСН. 2002); Й-.Э. ВфЫеу. 8.М. Вегде, Э.С. Моиккоике в Епс1с1ореб1а о£ Рйаттасеийса1 Тескпо1оду, Ебк. 1. 8\\агЬпск апб ТС. Воу1ап, Уо1. 13, Магсе1 Оеккет, 1пс., Ν™ Υо^к, Ваке1, Нопд Копд, 1995, р. 453-499; 8.М. Вегде е! а1., Рйаттасеи!1са1 8а1!к, 1оита1 о£ Рйаттасеи!1са1 8с1епсек, Уо1. 66, №. 1, 1апиагу 1977. Предпочтительными являются гидрохлоридная и мезилатная соли. Мезилатная соль является особенно предпочтительной.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где Я¹ представляет собой изопропил, циклопропил, циклопентил или циклопропилметил. Более предпочтительно Я¹ представляет собой изопропил.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где Я² представляет собой фтор, а Я³ представляет собой водород.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где Я² представляет

- 2 018808 собой водород, а В³ представляет собой фтор. Более предпочтительно оба В² и В³ представляют собой фтор.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где В⁴ представляет собой водород. В качестве альтернативы, В⁴ предпочтительно представляет собой метил. Наиболее предпочтительно В⁴ представляет собой водород.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где В⁵ представляет собой С1-С3-алкил или -ΝΚ.⁶ΚΛ где В⁶ и В⁷ представляют собой С1-С3-алкил. Более предпочтительно В⁶ и В⁷ представляют собой этил. Более предпочтительно В⁵ представляет собой С₁-С₃-алкил. Наиболее предпочтительно В⁵ представляет собой этил.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где О представляет собой СН₂ или прямую связь. Наиболее предпочтительно О представляет собой СН₂.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где Υ представляет собой N.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где представляет собой N.

Предпочтительно настоящее изобретение включает соединения формулы (I), где и Υ представляют собой N.

Предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению включают соединения формулы

(II) где В¹ представляет собой изопропил, циклопропил, циклопентил или циклопропилметил;

В⁴ представляет собой Н или СН₃;

В⁵ представляет собой С₁-С₃-алкил;

О представляет собой СН₂, О или прямую связь;

представляет собой С или Ν, причем если О представляет собой О, то представляет собой С; или их фармацевтически приемлемые соли.

Особенно предпочтительными являются соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, или их фармацевтически приемлемые соли. Конкретно, более предпочтительным является соединение [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин или его фармацевтически приемлемая соль. [5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амин, как альтернатива может быть назван как №[5-[(4-этил-1пиперазинил)метил]-2-пиридинил]-5-фтор-4-[4-фтор-2-метил-1-(1-метилэтил)-1Н-бензимидазол-6-ил]-2пиримидинамин.

Особенно предпочтительной является кристаллическая форма III [5-(4-этилпиперазин-1илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2ил]амина, характеризующаяся порошковой дифракционной рентгенограммой (излучение СиКа, λ=1,54056 А), содержащей пик при 21,29 (26±0,1°) и, необязательно, один или более пиков, выбранных из группы, включающей 11,54, 10,91 и 12,13 (2θ±0,1°). Кристаллическая форма III [5-(4-этилпиперазин-1илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2ил]амина может быть дополнительно охарактеризована спектром ¹³С ЯМР, содержащим пики с химическими сдвигами ν(Ρ1) [ррт] при 112,7, 127,3 и 129,4.

Соединения согласно настоящему изобретению представляют собой специфические ингибиторы С.ПК4 и С.ПК6 и, таким образом, подходят для лечения заболевания или нарушения, характеризующегося аномальной пролиферацией клеток. В частности, соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения рака.

С.ПК4 и С.ПК6 модулируют свое воздействие на клеточный цикл за счет фосфорилирования рВЬ. Полагают, что соединения согласно настоящему изобретению, которые являются сильными ингибиторами активности С.ПК4/6 и, таким образом, фосфорилирования рВЬ, ингибируют пролиферацию клеток (следовательно, и рост опухоли) при любом типе рака, при котором клетки являются пролиферирующими и содержат функциональный интактный ген ВЬ1 (который кодирует рВЬ). Соединения согласно настоящему изобретению, таким образом, подходят для лечения рВЬ⁺ раковых заболеваний, таких как ко

- 3 018808 лоректальный рак, рак груди, рак легких, рак простаты, хроническая миелоидная лейкемия, острая миелоидная лейкемия (Егу, Э.А. е1 а1. Мо1. Сапсег Тйет. (2004), 3(11), 1427), лимфома из клеток мантийной зоны (Магхек. М. е1 а1., В1ооб (2006), 108(5), 1744), рак яичников (К1т, Т.М. е1 а1., Сапсег Векеатсй (1994), 54, 605), рак поджелудочной железы (8сйибе, М. е1 а1., Сапсег Векеатсй (1997), 57, 3126), злокачественная меланома и метастатическая злокачественная меланома (Мае1апбкто, С.М. е1 а1., Βπΐίκΐι 1оитпа1 οί Сапсег (1996), 73, 909) у млекопитающих. Также полагают, что соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения рабдомиосаркомы (8ааЬ, В. е1 а1., Мо1. Сапсег Тйет. (2006), 5(5), 1299) и множественной миеломы (Ваидйп, Ь.В. е1 а1., Сапсег Век. (2006), 66(15), 7661) у млекопитающих. Предпочтительно млекопитающее, нуждающееся в лечении, представляет собой человека.

Дополнительно, предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению обладают преимущественным свойством, заключающимся в том, что указанные соединения обладают улучшенным распространением в мозговую ткань. Например, при введении крысам в модели заболевания на крысах отношение распределения в мозге:плазме соединения согласно примеру 16 (определенное с применением площади под кривой (АИС) или максимальных концентрациях в плазме и мозге (С_тах), см. табл. 6с) составляет примерно 1, что показывает, что соединение согласно примеру 16 хорошо распространяется в мозг. С другой стороны, авторы настоящего изобретения определили, что предпочтительное соединение, представленное в АО 03/062236 (6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2иламино)-8Н-пиридо[2,3-б]пиримидин-7-он), обладает отношением распределения в мозге:плазме, равным 0,17 (АИС) и 0,1 (Стах), что показывает, что соединение сравнительно плохо распространяется в мозговую ткань в данной модели. Предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению, таким образом, способны проникать в мозг и, таким образом, подходят для лечения первичных и метастатических опухолей мозга, в которых клетки являются пролиферирующими и содержат функциональный интактный ген ВЬ1. Примеры указанных рВЬ⁺ опухолей мозга включают глиобластому, а также медуллобластому и астроцитому (Ьее, А.-Н. е1 а1., 8с1епсе (1987), 235, 1394). Темозоломид представляет собой цитотоксический алкилирующий ДНК агент, применяемый для лечения опухолей мозга, включая глиобластому и астроцитому (Егеебтап, Н.8., 2000, С1ш. Сапсег Век. 6(7): 2585-97), включая метастазы в мозг, вызванные меланомой, раком груди и НМРЛ (81епа, 8. е1 а1., 2009 Аппа1к оГ Опсо1оду, бο^:10.1093/аипοпс/тбр343). Темозоломид взаимодействует с ДНК, вызывая химическую модификацию/повреждение (Матсйек1 е1 а1., 2007, Рйаттасо1. Век. 56(4): 275-87). Соединения согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с темозоломидом для лечения первичных и метастатических рВЬ⁺ опухолей мозга, таких как глиобластома и астроцитома, например, в случае, если указанные метастазы вызваны меланомой, раком груди или НМРЛ.

Гемцитабин НС1, аналог нуклеозида, который проявляет противоопухолевую активность, представляет собой моногидрохлорид 2'-дезокси-2',2'-дифторцитидина (β-изомер), также известный как моногидрохлорид 2',2'-дифтор-2'-дезоксицитидина или как 1-(4-амино-2-оксо-1Н-пиримидин-1-ил)-2-дезокси2',2'-дифторрибоза. Гемцитабин НС1 описан в патенте США 5464826. Структурная формула представлена ниже

но.

но

Гемцитабин НС1 является эффективным для лечения немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) (8апб1ег, А. апб ЕШпдет, Ό.8., 1999, Тйе Опсо1ощкк 4, 241), рака поджелудочной железы (Ршо, 8.М. е1 а1., 2004, Ситгеп! Сак1тоеп!ето1оду Веройк, 6, 119), рака яичников (Рйк1етет, 1. е1 а1., 2006, 1оитпа1 оГ С11тса1 Опсо1оду, 24(29, 4699)) и метастатического рака груди (Сйап, 8. е1 а1., 2009, 1оитпа1 оГ Сйшса1 Опсо1оду, 27(11, 1753)). Соединения согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с гемцитабином НС1 для лечения НМРЛ, рака поджелудочной железы, рака яичников и метастатического рака груди.

Соединения согласно настоящему изобретению можно применять в способе лечения рака, в частности раковых заболеваний, описанных выше, у млекопитающего, включающем введение млекопитающему, нуждающемуся в подобном лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительному варианту реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять в способе лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, лимфомы из клеток мантийной зоны, рака груди, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких, в частности НМРЛ. Согласно другому предпочтительному варианту реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять в способе лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких. Согласно другому предпочтительному варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению можно применять в способе лечения глиобластомы или астроцитомы у млекопитающего, включающем введение млекопитающему, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективной комбина

- 4 018808 ции соединения согласно настоящему изобретению и темозоломида. Согласно другому предпочтительному варианту реализации соединение согласно настоящему изобретению можно применять в способе лечения НМРЛ, рака поджелудочной железы, рака яичников или метастатического рака груди у млекопитающего, включающем введение млекопитающему, нуждающемуся в подобном лечении, терапевтически эффективной комбинации соединения согласно настоящему изобретению и гемцитабина НС1.

Соединения согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака, в частности раковых заболеваний, описанных выше. Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, лимфомы из клеток мантийной зоны, рака груди, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких, в частности НМРЛ. Согласно другому предпочтительному варианту реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких. Согласно другому предпочтительному варианту реализации в изобретении предложено соединение согласно настоящему изобретению для применения одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с темозоломидом для лечения глиобластомы или астроцитомы. Согласно другому предпочтительному варианту реализации в изобретении предложено соединение согласно настоящему изобретению для применения одновременно, раздельно или последовательно в комбинации с гемцитабином НС1 для лечения НМРЛ, рака поджелудочной железы, рака яичников или метастатического рака груди.

Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению можно применять для получения лекарственного средства для лечения рака, в частности раковых заболеваний, описанных выше. Согласно предпочтительному варианту реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять для получения лекарственных средств для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, лимфомы из клеток мантийной зоны, рака груди, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких, в частности НМРЛ. Согласно другому предпочтительному варианту реализации соединения согласно настоящему изобретению можно применять для получения лекарственного средства для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких. Согласно другому предпочтительному варианту реализации в изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения глиобластомы или астроцитомы, где лекарственное средство также содержит темозоломид или лекарственное средство следует вводить одновременно, раздельно или последовательно с темозоломидом. Согласно другому предпочтительному варианту реализации в настоящем изобретении предложено применение соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения НМРЛ, рака поджелудочной железы, рака яичников или метастатического рака груди, где лекарственное средство также содержит гемцитабин НС1 или лекарственное средство следует вводить одновременно, раздельно или последовательно с гемцитабином НС1.

Также предложен фармацевтический состав для лечения рака, в частности раковых заболеваний, описанных выше, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно предпочтительному варианту реализации также предложен фармацевтический состав для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, лимфомы из клеток мантийной зоны, рака груди, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких, в частности НМРЛ, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно предпочтительному варианту реализации также предложен фармацевтический состав для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, глиобластомы, острой миелоидной лейкемии и рака легких, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно другому варианту реализации в изобретении предложен фармацевтический состав для лечения глиобластомы или астроцитомы, содержащий соединение согласно настоящему изобретению и темозоломид совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно другому предпочтительному варианту реализации в изобретении предложен фармацевтический состав для лечения НМРЛ, рака поджелудочной железы, рака яичников или метастатического рака груди, содержащий соединение согласно настоящему изобретению и гемцитабин НС1 совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

В изобретении также предложен фармацевтический состав, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и темозоломид совместно с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

В изобретении также предложен фармацевтический состав, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и гемцитабин НС1 совместно с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

В изобретении также предложен фармацевтический состав, содержащий соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически при

- 5 018808 емлемым носителем и, необязательно, другими терапевтическими ингредиентами.

Далее, предпочтительны соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, также являющиеся ингибиторами Р1т-1. Как указано выше, Р1т-1 представляет собой серин/треонин киназу, которая участвует в регулировании различных биологических функций, включающих прохождение клеточного цикла, пути транскрипционной/сигнальной трансдукции и апоптоз, и функций, экспрессию которых связывают с некоторыми раковыми заболеваниями. В частности, показано, что ингибирование Р1т-1 низкомолекулярным ингибитором К00135 уменьшает выживаемость и клоногенный рост группы клеток острой лейкемии (Родас1с, V., е! а1., Сапсег Век. (2007), 67(14), р. 6916-24). Дополнительно показано, что Р1т-1 экспрессируется в неоинтимах у крыс с повреждением стенок сонных артерий балонным катетером и человеческих грудных аортах и коронарных артериях с утолщением интимы. Также специфическое ингибирование функции Р1т-1 значительно подавляло образование неоинтимы после повреждения балонным катетером, а также пролиферацию культивированных клеток гладкой мускулатуры сосудов (νδΜί.'). что позволяло сделать предположение о том, что Р1т-1 играет важную роль в пролиферации указанных клеток. Пролиферация V8МС значительно осложнялась при патогенезе окклюзионных сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз и рестеноз, и, таким образом, полагают, что ингибирование Р1т-1 подавляет пролиферацию V8ΜС и, следовательно, подходит для лечения окклюзионных сосудистых заболеваний (Ка!акат1 Ν., е! а1., 1ВС (2004), 279(52), 54742-54749).

Соответственно, предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые соли можно применять в способе лечения окклюзионных сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз или рестеноз, у млекопитающего, включающем введение млекопитающему, нуждающемуся в подобном лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. Предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые соли можно применять для лечения окклюзионного сосудистого заболевания, такого как атеросклероз или рестеноз. Кроме того, предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые соли можно применять для получения лекарственного средства для лечения окклюзионного сосудистого заболевания, такого как атеросклероз или рестеноз. Также предложен фармацевтический состав для лечения окклюзионного сосудистого заболевания, такого как атеросклероз или рестеноз, содержащий предпочтительное соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль.

Используемые в настоящем описании термины обозначают следующее:

ч - час или часы, мин - минута или минуты,

СЭК - циклинзависимая киназа, рВЬ - белок ретинобластомы,

МСЬ - лимфома из клеток мантийной зоны,

ОМЛ - острая миелоидная лейкемия,

Вос - Ν-трет-бутоксикарбонил,

ЭА - этилацетат,

ДХМ - дихлорметан,

ДМСО - диметилсульфоксид,

ДМА - диметилацетамид,

ТГФ - тетрагидрофуран,

МТБЭ - метил-трет-бутиловый эфир,

ТЭА - триэтиламин,

ЭБС - эмбриональная бычья сыворотка,

РВ8 - фосфатный буферный солевой раствор,

БСА - альбумин бычьей сыворотки,

КТ - комнатная температура, мг/кг - миллиграммам на килограмм, ро - пероральный, цй - один раз в день,

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

с.|2б - введение одной дозы каждые 2 дня,

с.|2бх10 - введение одной дозы каждые 2 дня в течение 10 дней, ’У8МС - клетка гладкой мускулатуры сосудов и

ΧΚΌ - дифракционная рентгенограмма.

Соединения формулы (I) могут быть получены специалистом в данной области техники при помощи известных в данной области техники способов и методик. Более конкретно, соединения формулы (I) могут быть получены в соответствии с представленными схемами, способами и примерами, приведенными далее. Для специалиста в данной области техники очевидно, что для получения соединений формулы (I) индивидуальные стадии представленных далее схем могут отличаться. Реагенты и исходные вещества легко доступны специалисту в данной области техники. Все заместители, если не указано иное,

- 6 018808 аналогичны описанным ранее.

Названия соединений в приведенных далее примерах получения и примерах получены с применением СйешОгате® ИИга 5.0.

Схемы

Синтез соединений формулы (I) представлен в примерах получения, примерах и на схемах, где К¹, К², К³, К⁴, К⁵, О. У и Υ определены выше.

Схема 1

Соединения формулы (I) получают при помощи реакций сочетания с применением палладия(0), как показано на схеме 1.

В верхней реакции, представленной на схеме 1, в случае, если Ζ=Η⁵, пиримидинилбензимидазолхлорид (А) взаимодействует с пиридиниламином (В) в реакции сочетания, катализируемой палладием, непосредственно с получением соединений формулы (I).

В нижней реакции, представленной на схеме 1, в случае, если Υ-Ζ представляет собой Ν-третбутоксикарбонил (Вос), пиримидинилгалогенид (А) также подвергают сочетанию с пиридиниламином (В), но Вос-группу удаляют в сильной кислоте с получением свободного амина (С). Наконец, амин (С) алкилируют в восстановительных условиях с получением соединений формулы (I).

Схема 2

Получение пиримидинилбензимидазолов (А)

Пиримидинилбензимидазолы (А) получают в реакциях сочетания, катализируемых палладием(11), коммерчески доступных пиримидинилдихлоридов (Ό) и бензимидазолборанатов (Е).

- 7 018808

Схема 3

Получение бензимидазолборанатов (Е)

Бензимидазолборанаты (Е) получают в результате катализируемого Рб(П) боранилирования бромида бензимидазолов (Н) при помощи бис-(пинаколато)диборана. Бензимидазолы (Н), в свою очередь, получают при помощи циклизации амидинов (Е) с т-бутоксидом калия или конденсации бензолдиаминов (С) с триэтилортоацетатом/уксусной кислотой.

Амидины (Е) получают при помощи известной специалисту в области органического синтеза конденсации 4-бром-2,6-дифторфениламина с моноацетамидным производным аминов Κ'-ΝΗ₂ в присутствии хлорокиси фосфора. Бензолдиамины (С) получают в две стадии при помощи известного специалисту в области органического синтеза замещения брома в положении 2 2,4-дибромнитробензола амином Κ.'-ΝΗ₂ с последующим восстановлением нитрогруппы до аминогруппы.

Схема 4

Получение пиридиниламинов (В), где О представляет собой 8 или О и представляет собой С

Синтез пиридиниламинов (В), где О представляет собой 8 или О и представляет собой С, проводят при помощи замещения 5-галогенида в пиридине (I) при помощи коммерчески доступного тиола или спирта (1). В случае, если необходимо применение нитропиридина (I), продукт замещения дополнительно подвергают стадии восстановления нитрогруппы с получением (В). Следует отметить, что соединения (I) являются универсальными реагентами в указанных схемах, но только некоторые из них коммерчески доступны как пиридиламины, а некоторые как нитропиридины. Коммерчески доступные соединения (I), тем не менее, способны подвергаться химическому превращению в результате реакций окисления амина или восстановления нитрогруппы, известных в данной области техники, для применения в представленных здесь и ниже схемах.

Схема 5

Получение пиридиниламинов (В), где О представляет собой СН₂

- 8 018808

Синтез пиридиниламинов (В), где О представляет собой СН₂, осуществляют двумя способами:

1) коммерчески доступные карбальдегиды (К) подвергают восстановительному аминированию со свободным амином (Ь) с последующим замещением пиридинбромида в результате катализируемого Рб(0) аминирования 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазаном лития или жидким аммиаком и оскидом меди;

2) коммерчески доступный 1,1-диметилэтиловый эфир 4-метиленпиперидин-1-карбоновой кислоты (М) подвергают гидроборированию с последующим сочетанием с пиридиламином (I) в присутствии Рб(П).

Схема 6

Получение пиридиниламинов (В), где О представляет собой прямую связь

Синтез пиридиниламинов (В), где О представляет собой прямую связь, осуществляют двумя способами:

1) коммерчески доступный 1,1-диметилэтиловый эфир 3,6-дигидро-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2диоксаборолан-2-ил)пиридин-1(2Н)-карбоновой кислоты (Ν) подвергают сочетанию с нитропиридином (I) в присутствии палладия(11) с последующим восстановлением нитрогруппы и двойной связи;

2) бромид нитропиридина (I) замещают свободным амином (Ь) с последующим восстановлением нитрогруппы.

Пример получения 1.

трет-Бутиловый эфир 4-(6-аминопиридин-3-илсульфанил)пиперидин-1-карбоновой кислоты.

К смеси 2,9-диметил-1,10-фенантролина (76,52 мг), йодида меди(1) (69,27 мг), трет-бутоксида натрия (475,59 мг), трет-бутилового эфира 4-меркаптопиперидин-1-карбоновой кислоты (583,5 мг), магния (49,10 мг) и 2-амино-5-йодпиридина (550 мг) добавляли осушенный толуол (6,06 мл). Через смесь барботировали азот с применением ультразвука и перемешивали суспензию при 110°С в запаянной трубке в течение 24 ч. Охлаждали и фильтровали через целит. Промывали толуолом и удаляли растворитель в вакууме. Добавляли гексан/ЭА (1/1) и фильтровали через подушку целит/силикагель, дважды промывали гексаном/ЭА (1/1), затем ЭА. Удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесями гексан/ЭА (50-75%), с получением 630 мг указанного в заголовке соединения.

МС (ЕБ⁺): т/ζ 3 10 (М+Н)⁺.

Пример получения 2.

5-Фтор-2-нитропиридин.

К серной кислоте (46 мл) при 0°С на открытом воздухе добавляли 25% пероксид водорода (26,98 мл). Через 5 мин через капельную воронку по каплям добавляли холодный раствор 2-амино-5-фторпиридина (9 г) в концентрированной серной кислоте (46 мл). Перемешивали полученный темный раствор при температуре от 0°С до КТ на бане в течение ночи. Выливали в 200 мл смеси ледвода и экстрагировали ДХМ. Промывали объединенные органические слои 5% водным раствором бисульфита натрия и сушили над безводным сульфатом натрия. Удаляли растворитель в вакууме и очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя ДХМ, с получением 7,5 г указанного в заголовке соединения.

МС (ЕБ⁺): ш^=143 (М+Н)⁺.

Представленное далее соединение получали, по существу, в соответствии с описанием получения 5-фтор-2-нитропиридина с применением соответствующего амина.

Пример получения	Соединение	МС (Е5+) : πι/ζ (М+Н)*
3	3-бром-2-метил-6нитропиридин	218

- 9 018808

Пример получения 4.

-Изопропил-4-(2-метил-6-нитропиридин-3 -ил)пиперазин.

Перемешивали 3-бром-2-метил-6-нитропиридин (2,46 г), 1-изопропилпиперазин (2,74 г), йодид тетра-н-бутиламмония (418,69 мг) и карбонат калия (1,72 г) в диметилсульфоксиде (ДМСО, 20 мл) при 65°С в течение ночи. Добавляли ЭА и воду, разделяли фазы и сушили органический слой над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи сильного катионита, элюируя метанолом, затем 2н. смесью метанол-ИН₃ с получением 2,58 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 265 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения 1-изопропил-4-(2-метил-6-нитропиридин-3-ил)пиперазина с применением соответствующего бромпроизводного.

Пример 1 Соединение получения	МС (Е$+): т/ζ (М+Н) +
1 Трет-бутиловый эфир (2'-метил-6'нитро-3,4,5,6-тетрагидро-2Н11,3']бипиридин-4-ил)карбаминовой кислоты	337
6	Трет-бутиловый эфир (б'-нитро- 3,4,5,6-гетрагидро-2Н- [1,3’]бипиридин-4-ил)карбаминовой кислоты	323

Пример получения 7.

5-(4-Изопропилпиперазин-1-ил)-6-метилпиридин-2-иламин.

Перемешивали 1-изопропил-4-(2-метил-6-нитропиридин-3-ил)пиперазин (2,52 г) и 10% палладий на угле (600 мг) в метаноле (38 мл) и ЭА (38 мл) в атмосфере Н₂ (баллон) в течение ночи. Фильтровали через подушку целита и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/метанол (0-10%) с получением 2,23 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ш^=143 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения 5-(4-изопропилпиперазин-1-ил)-6-метилпиридин-2-иламина с применением соответствующего нитропроизводного.

Пример получения

Соединение	МС (ЕЗ + ) : т/ζ (М+Н) +
Трет-бутиловый эфир (6’-амино-2'метил-3,4,5,6-тетрагидро-2Л[1,3']бипиридин-4-ил)карбаминовой кислоты	307
Трет-бутиловый эфир (6'-амино3,4, 5, 6-тетрагидро-2Н[1,3']бипиридин-4-ил)карбаминовой кислоты	293

Пример получения 10.

трет-Бутиловый эфир 4-(6-нитропиридин-3-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты.

К раствору трет-бутил 4-гидрокси-1-пиперидинкарбоксилата (8,76 г) и диметилацетамида (ДМА, 39 мл) при 0°С в атмосфере азота добавляли трет-бутоксид калия (4,84 г). Перемешивали в течение 1 ч и по каплям добавляли раствор 5-фтор-2-нитропиридина (5 г) в ДМА (78 мл). Оставляли реакционную смесь перемешиваться при КТ на ночь. Добавляли воду и выстаивали в течение 1 ч. Фильтровали, промывали водой. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/ЭА (0-15%) с получением 5,65 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ш^=324 (М+Н)⁺.

- 10 018808

Пример получения 11.

трет-Бутиловый эфир 4-(6-аминопиридин-3-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты.

К суспензии трет-бутилового эфира 4-(6-нитропиридин-3-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (5,65 г) в смеси тетрагидрофуран (ТГФ)/метанол (30/30 мл/мл) добавляли 10% палладий на угле (0,6 г). Г идрировали в аппарате Парра при 2 атм в течение ночи. Фильтровали через подушку целита, промывали ДХМ и метанолом. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/метанол (10%)/аммиак (1%) с получением 5 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 294 (м+Н)⁺.

Пример получения 12.

трет-Бутиловый эфир 6-амино-2-метил-3',6'-дигидро-2'Н-[3,4']бипиридинил-1'-карбоновой кислоты

Барботировали азот через смесь трет-бутилового эфира 4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан2-ил)-3,6-дигидро-2Н-пиридин-1-карбоновой кислоты (2,46 г) и 5-бром-6-метилпиридин-2-иламина (1,49 г) в 1,4-диоксане (31,82 мл) в течение 5 мин, затем добавляли Ν-гидрат трехосновного фосфата калия (5,07 г), ацетат палладия (35,72 мг), дициклогексил-(2',6'-диметоксибифенил-2-ил)фосфан (134,69 мг), воду (7,96 мл) и перемешивали при 90°С в течение 3 ч. Разбавляли ДХМ и промывали водой. Сушили над сульфатом натрия и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/этанола 5%/ΝΗ₃ 0,1%, затем при помощи сильного катионита (8СХ), элюируя метанолом, затем 2 М смесью метанол-Ν^ с получением 2,12 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 292 (М+Н)⁺.

Пример получения 13.

трет-Бутиловый эфир 6-амино-2-метил-3',4',5',6'-тетрагидро-2'Н-[3,4']бипиридинил-1'-карбоновой кислоты.

Перемешивали смесь трет-бутилового эфира 6-амино-2-метил-3',6'-дигидро-2'Н-[3,4']бипиридинил1'-карбоновой кислоты (2,12 г) и 10% влажного палладия на угле (330 мг) в метаноле (29,30 мл) в атмосфере Н₂ (45 ρκΐ) в течение 48 ч. Фильтровали через подушку целита и удаляли растворитель в вакууме с получением 2,07 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 292 (М+Н)⁺.

Пример получения 14.

трет-Бутиловый эфир 6-нитро-3',6'-дигидро-2'Н-[3,4']бипиридинил-1-карбоновой кислоты.

Барботировали азот через смесь трет-бутилового эфира 4-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан2-ил)-3,6-дигидро-2Н-пиридин-1-карбоновой кислоты (19,6 г), 5-бром-2-нитропиридина (12,87 г), 2 М раствора карбоната натрия в воде (63,39 мл) и хлорида бис-(трифенилфосфино)палладия(11) (4,45 г) в 1,4-диоксане (316,94 мл) в течение 5 мин и перемешивали при 80°С в течение 5 ч. Разбавляли ДХМ и промывали водой. Сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/ЭА (0-40%) с получением 8,72 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 306 (М+Н)⁺.

Пример получения 15.

трет-Бутиловый эфир 6-амино-3',4',5',6'-тетрагидро-2'Н-[3,4']бипиридинил-1'-карбоновой кислоты.

Растворяли трет-бутиловый эфир 6-нитро-3',6'-дигидро-2'Н-[3,4']бипиридинил-1-карбоновой кислоты (1,89 г) в этаноле (123,80 мл). Гидрировали при помощи палладия на угле (установка Н-СиЬе, 70 бар, 50°С, 1 мл/мин) с получением 1,72 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 278 (М+Н)⁺.

Пример получения 16.

трет-Бутиловый эфир 4-(6-аминопиридин-3-илметил)пиперидин-1-карбоновой кислоты.

В течение 5 мин перемешивали трет-бутиловый эфир 4-метиленпиперидин-1-карбоновой кислоты (5,10 г) в атмосфере азота и добавляли 0,5 М раствор 9-борабицикло[3.3.1]нонана в ТГФ (77,49 мл). Перемешивали при 75°С в атмосфере азота в течение 1 ч. Охлаждали и добавляли 2-амино-5-бромпиридин (3,8 г), карбонат калия (3,87 г) и хлорид 1,1'-(бис-(дифенилфосфино)ферроцен)палладия(11) (538,10 мг) и дегазированную смесь ДМФ (47,83 мл) и воды (4,78 мл). Перемешивали при 60°С в течение 4 ч, затем при КТ в течение выходных. Добавляли воду и ЭА. Разделяли и экстрагировали водный слой ЭА. Объединяли органические слои и сушили над сульфатом натрия и удаляли растворить в вакууме. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесями от ДХМ/метанол (1%)/аммиак (0,1%) до ДХМ/метанол (3%)/аммиак (0,3%). Растирали остаток с ЭА с получением 1,85 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 292 (М+Н)⁺.

Следующее соединение получали, по существу, в соответствии с описанием получения третбутилового эфира 4-(6-аминопиридин-3-илметил)пиперидин-1-карбоновой кислоты с применением соот- 11 018808 ветствующего бромпроизводного.

Пример

получения

Соединение	МС (ЕЗ+) : т/ζ (М+Н)4·
Трео’-бутиловый эфир 4— (б-амино— 2-метилпиридин-Зилметил)пиперидин-1-карбоновой кислоты	306

Пример получения 18.

-(6-Бромпиридин-3 -илметил)-4-этилпиперазин.

К смеси 6-бромпиридин-3-карбальдегида (300 г) и ДХМ (5000 мл) добавляли чистый 1-этилпиперазин (221,44 мл). Затем по частям добавляли триацетоксиборгидрид натрия (372,09 г) и перемешивали при КТ в течение 12 ч. Добавляли ДХМ (1000 мл) и 2н. водный раствор гидроксида натрия (1500 мл). Разделяли слои и дважды экстрагировали водный слой ДХМ (600 мл). Объединяли органические слои и удаляли растворитель в вакууме, добавляли ЭА и выпаривали с получением 451,3 г указан ного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 285 (М+Н)⁺.

Следующее соединение получали, по существу, в соответствии с описанием получения 1-(6-бромпиридин-3-илметил)-4-этилпиперазина с применением соответствующего амина.

Пример получения	Соединение	МС (ЕЗ+): т/ζ (М+Н)4
19	Трет-бутиловый эфир 4-(6бромпиридин-3-илметил)пиперазин1-карбоновой кислоты	357

Пример получения 20.

5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-иламин.

К дегазированной смеси 1-(6-бромпиридин-3-илметил)-4-этилпиперазина (250 г), (дициклогексилфосфино)бифенила (18,50 г), трис-(дибензилиденацетон)дипалладия (24,17 г) и ТГФ (250 мл) при 50°С медленно добавляли 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазан (1055 мл) лития. Нагревали смесь при 65°С в течение ночи. Охлаждали до 37°С и добавляли воду (500 мл). Удаляли половину растворителя в вакууме и добавляли ДХМ (2,5 л). Фильтровали через подушку целита и удаляли часть растворителя. К смеси добавляли метанол (300 мл) и метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ, 600 мл) и охлаждали на ледяной бане. Затем добавляли 2 М раствор хлороводородной кислоты в диэтиловом эфире (800 мл) и 32% водный раствор хлороводородной кислоты (100 мл). Удаляли органический слой и добавляли 2 М водный раствор гидроксида натрия (2500 мл). Трижды экстрагировали водную фазу ДХМ и удаляли растворитель в вакууме. Растворяли в 90 мл толуола при 50°С до полного растворения и затем добавляли 80 мл МТБЭ. Перемешивали в течение ночи при КТ. Дополнительно добавляли МТБЭ (100 мл) для полного осаждения. Отфильтровывали твердое вещество и сушили с получением 108,24 г указанного в заголовке соеди нения.

МС (Е8⁺): т/ζ 221 (М+Н)⁺.

Следующее соединение получали, по существу, в соответствии с описанием получения 5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-иламина с применением соответствующего 2-бромпиридинового производного.

Пример получения	Соединение	МС (ЕЗ+): т/ζ (М+Н)4
21	Трет-бутиловый эфир 4-(6аминопиридин-3-илметил)пиперазин1-карбоновой кислоты	293

Пример получения 22.

2,4-Дибром-1-нитробензол.

К раствору 1,3-дибромбензола (102,51 мл) в концентрированной серной кислоте (322,79 мл) и воде (62,39 мл) при 0°С по каплям добавляли дымящую азотную кислоту (101,40 мл). Нагревали до КТ и перемешивали в течение 12 ч. Выливали реакционную смесь в смесь лед-вода (1500 мл). Отфильтровывали полученное желтое твердое вещество в вакууме с получением 178,46 г указанного в заголовке соедине ния.

МС (Е8⁺): т/ζ 281 (М+Н)⁺.

- 12 018808

Пример получения 23.

(5-Бром-2-нитрофенил)циклопентиламин.

К раствору 2,4-дибром-1-нитробензола (20 г) в 1-бутаноле (160 мл) добавляли циклопентанамин (32 мл). Нагревали смесь при 100°С в течение ночи. Удаляли растворитель в вакууме, добавляли воду и экстрагировали ЭА. Последовательно промывали органический слой водным раствором бикарбоната натрия, а затем водой. Сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме с получением 22 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 286 (М+Н)⁺.

Пример получения 24.

4-Бром-Ы2-циклопентилбензол-1,2-диамин.

К раствору (5-бром-2-нитрофенил)циклопентиламина (22 г), ТГФ (150 мл), воды (150 мл) и гидроксида аммония (30 мл) добавляли дитионит натрия (107,47 г). Перемешивали смесь при КТ в течение ночи. Дважды экстрагировали ЭА, сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме с получением 14,80 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 256 (М+Н)⁺.

Пример получения 25.

6-Бром-1-циклопентил-2-метил-1Н-бензимидазол.

Нагревали смесь 4-бром-Ы2-циклопентилбензол-1,2-диамина (10,6 г), триэтилортоацетата (9,5 мл) и уксусной кислоты (6,3 мл) при 100°С в течение 2,5 ч. Разбавляли ДХМ и выливали в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия. Сушили над сульфатом натрия и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/этанол-10% ΝΗ₃ (0-3%) с получением 10,67 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 280 (М+Н)⁺.

Пример получения 26.

Ν-Изопропилацетамид.

К раствору 2-пропанамина (10 г) в ДХМ (100 мл) при 0°С добавляли ТЭА (23,58 мл). Затем осторожно по каплям добавляли ангидрид уксусной кислоты (16,15 мл). Перемешивали при КТ в течение ночи. Удаляли растворитель в вакууме, разбавляли диэтиловым эфиром (эфиром) и отфильтровывали твердое вещество. Удаляли растворитель в вакууме. Разбавляли масло эфиром, добавляли карбонат калия и перемешивали в течение ночи при КТ. Отфильтровывали твердое вещество и удаляли растворитель в вакууме с получением 15,62 г указанного в заголовке соединения.

ЯМР (СБС1₃): 4,06 (м, 1Н), 1,94 (с, 3Н), 1,14 (д, 6Н).

Следующие амиды получали, по существу, в соответствии с описанием получения Ν-изопропилацетамида с применением соответствующего амина.

№(4-Бром-2,6-дифторфенил)-Ы'-изопропилацетамидин.

К смеси 4-бром-2,6-дифторфениламина (10,0 г), Ν-изопропилацетамида (9,73 г), хлорокиси фосфора (6,70 мл) в толуоле (150 мл) добавляли ТЭА (10,05 мл). Кипятили смесь с обратным холодильником в течение 3 ч. Охлаждали смесь и удаляли растворитель в вакууме. Растворяли неочищенное вещество в ДХМ, несколько раз промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия для удаления всех следов кислоты. Сушили над сульфатом натрия и удаляли растворитель в вакууме с получением 14 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 292 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения №(4-бром-2,6-дифторфенил)-Ы'-изопропилацетамида с применением соответствующего ацетамида.

- 13 018808

Пример получения	Соединение	МС (ЕЗ+) : т/ζ (М+Н)+
31	Ν-(4-Бром-2г 6-дифторфенил)-Ν'циклопропилацетамидин	290
32	Ν-(4-Бром-2 г 6-дифторфенил)-Ν'- циклопропилметилацетамидин	304
33	Ν-(4-Бром-2 г 6-дифторфенил)-Ν'- циклопентилацетамидин	318

Пример получения 34.

6-Бром-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазол.

К раствору Ы-(4-бром-2,6-дифторфенил)-М'-изопропилацетамидина (2 г) в Ν-метилформамиде (20 мл) добавляли трет-бутоксид калия (811,43 мг). Нагревали смесь при 100°С в течение 2 ч. Охлаждали до КТ, добавляли ДХМ (150 мл), трижды промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (солевой раствор, 300 мл), сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Добавляли гексан и встряхивали с применением ультразвука в течение нескольких минут. Отфильтровывали твердое вещество, дважды повторяли добавление гексана/фильтрование с получением 1,86 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ш/ζ 272 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения 6-бром-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазола с применением соответствующего ацетамидина.

Пример получения	Соединение	МС т/ζ	(ЕЗ + ) : (М+Н)+
35	6-Бром-1-циклопропил-4-фтор-2-	270
метил-1Я-бензимидазол
36	6-Бром-1-циклопропилметил-4-фтор- 2-ме тил-1И- бе нзимидазол	284
37	Б-бром-1-циклолентил-4-фтор-2-	298
метил-1Н-бензимидазол

Пример получения 38.

4-Фтор-1-изопропил-2-метил-6-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-бензимидазол.

Барботировали азот через смесь 6-бром-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазола (30,0 г), бис-(пинаколато)диборана (42,15 г), трициклогексилфосфина (5,43 г), ацетата калия (32,58 г) и ДМСО (200 мл). Добавляли ацетат палладия (2,8 г) и нагревали на предварительно нагретой масляной бане при 90°С в течение 1 ч. Разбавляли ЭА (200 мл) и фильтровали через подушку целита. Промывали смесь солевым раствором (100 мл), сушили над сульфатом натрия и удаляли растворитель в вакууме. Растирали с гексаном и отфильтровывали твердое вещество с получением 27 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ηι/ζ.=319 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения 4-фтор-1-изопропил-2-метил-6-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-бензимидазола с применением соответствующих производных 6-бромбензимидазола.

- 14 018808

Пример получения	Соединение	МС (Е5+): т/ζ (М+Н)+
39	1-Циклопропил-4-фтор-2-метил-δ(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Нбензимидазол	317
40	1-Циклопентил-2-метил-6-¢4,4,5,5- тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан-2- ил)-1Н-бензимидазол	327
41	1-Циклопропилметил-4-фтор-2-метил- 6-(4,4,5,5-тетраметил- [1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-ΙΗбензимидазол	331
42	1-Циклопентил-4-фтор-2-метил-б- (4,4,5,5-тетраметил- [1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-ΙΗбензимидазол	345

Пример получения 43.

6-(2-Хлор-5-фторпиримидин-4-ил)-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазол.

Барботировали азот через смесь 2,4-дихлор-5-фторпиримидина (12,7 г), хлорида бис-(трифенилфосфино)палладия(П) (4,9 г), 2 М раствора карбоната натрия в воде (103,7 мл) и 1,2-диметоксиэтана (120 мл). Нагревали на предварительно нагретой масляной бане при 80°С и по каплям добавляли раствор 4-фтор-1-изопропил-2-метил-6-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Нбензимидазола (22 г) в 1,2-диметоксиэтане (200 мл). Перемешивали смесь при 84°С в течение 1 ч. Охлаждали до КТ, добавляли ЭА (800 мл) и дважды промывали солевым раствором (100 мл). Сушили над сульфатом магния и удаляли растворитель в вакууме. Растирали с ацетонитрилом с получением 14,4 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 323 (Μ+Η)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения 6-(2-хлор-5-фторпиримидин-4-ил)-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазола с применением соответствующих дихлорпиримидиновых и боранатных производных.

Пример получения	Соединение	МС (Е5+) : т/ ζ (М+Н)*
44	6-(2-Хлор-5-фторпиримидин-4-ил)- 1-циклопрспил-4-фтор-2-метил-1Н- бензимидазол	321
45	6- (2-Хлор-5-фторпиримидин-4-ил)- 1-циклопентил-2-метил-ΙΗ- бензимидазол	331
46	6- (2-Хлор-5-фторпиримидин-4-ил)- 1-циклопропилметил-4-фтор-2- ме тил-1 Я- бе нзимида з ол	335
47	6-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-1циклопентил-4-фтор-2-метил-ΙΗбензимидазол	331
48	6-(2-Хлорпиримидин-4-ил)-4-фтор- 1-изопропил-2-метил-ΙΗбензимидазол	305

- 15 018808

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина с применением соответствующих аминовых и хлорпиримидиновых производных.

Пример получения	Соединение	МС (ЕЗ+) : т/г (М+Н)*
49	Трет-бутиловый эфир 4-{6-[5фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2метил-ЗН-бензимидазол-5ил)пиримидин-2-иламино]пиридин3-илметил}пиперазин-1-карбоновой кислоты	579
50	Трет-бутиловый эфир 4-(6-(4-(3- циклопропил-7-фтор-2-метил-ЗЯбензимидазол-5-ил)-5фторпиримидин-2-иламино]пиридин3-илметил}пиперидин-1-карбоновой кислоты	576
51	Трет-бутиловый эфир 4-(6-(5фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2метил-3/7-бензимидазол-5ил)пиримидин-2-иламино]-2метилпиридин-3илметил}пиперидин-1-карбоновой кислоты	592
52	Трет-бутиловый эфир 6-(4-(3циклопентил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)-5фторпиримидин-2-иламино]3',4',5',6'-тетрагидро-2’Н[3,4']бипиридинил-1'-карбоновой кислоты	572
53	Трет-бутиловый эфир 6-[5-фтор-4- (7-фтор-3-изопропил-2-метил-ЗЯбензимидазол~5-ил)пиримидин-2иламино]-2-метил-31,4',5',6’тетрагидро-2'Н- [3,4']бипиридинил-11-карбоновой кислоты	578
54	Трет-бутиловый эфир 4-(6-(5фтор-4-(7-фтор-3-иэопропил-2метил-ЗН-бензимидазол-5ил)пиримидин-2-иламино!пиридин3-илокси}пиперидин-1-карбоновой кислоты	580

- 16 018808

55	;фет-бутиловый эфир (6'-[5-фтор- 4-(7-фтор-3-изопропил-2-метилЗН-бензимидазол-5-ил)пиримидин2-иламино]-2'-метил-3,4,5,6тетрагидро-2Я-[1,3']бипиридин-4ил)карбаминовой кислоты	593
56	Трет-бутиловый эфир {6’-[4-(3~ циклопентил-7-фтор-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2иламино]-3,4,5,6-тетрагидро-2Н- [1,3’1 бипиридин-4- ил)карбаминовой кислоты	537
57	Трет-бутиловый эфир 4-{6-[4-(7фтор-З-иэопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2иламино]пиридин-3илсульфанил}пиперидин-1карбоновой кислоты	578

Пример получения 58.

[5-Фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]-(5-пиперазин-1илметилпиридин-2 -ил)амин

К смеси трет-бутилового эфира 4-{6-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5ил)пиримидин-2-иламино]пиридин-3-илметил}пиперазин-1-карбоновой кислоты (150 мг) в ДХМ (10 мл) и метаноле (10 мл) добавляли 4 М раствор хлороводорода в диоксане (194 мкл). Перемешивали в течение 10 мин и удаляли растворитель в вакууме. Очищали при помощи сильного катионита (8СХ), элюируя метанолом, затем 2 М смесью метанол-NНз, затем при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя 2 М смесью ДХМ/метанол-МН₃ (3%) с получением 120 мг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 479 (М+Н)⁺.

Следующие промежуточные соединения получали, по существу, в соответствии с описанием получения [5-фтор-4-(7-фтор-3 -изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил] -(5 -пиперазин-1 илметилпиридин-2-ил)амина.

- 17 018808

Пример получения	Структура	Название соединения	МС (ЕЗ+): т/ζ (М+Н)+
59	-А А ν®	[4-(З-Циклопропил-7фтор-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)5-фторпиримидин-2- ил]-(5-пиперидин-4илметилпиридин-2ил)амин	476
60	и>	[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗН-бензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил](6-метил-5пиперидин-4илметилпиридин-2- ил)амин	4 92
61	Н_/Ν=\ 1Н /-Г 0 н V ΟΎ	[4- (З-Циклопентил-2метил-ЗНбензимидазол-5-ил)- 5-фторпиримидин-2ил] - (11,2 ', 3 ', 4 ' , 5 ', 6 ’- гексагидро- [3,4']бипиридин-6- ил)амин	472

- 18 018808

62	Η/Ν=\ /Ч /)~р Ν=< Ν-\ Ζτ О’' Р у?	[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗЯ-бензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил](2-метил- 1',2',3’,4’,5',6'гексагидро[3,4']бипиридии-6- ил)амин	478
63		[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗН-бензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил][ 5- (пиперидин-4илокси)пиридин-2- ил]амин	480
64	р РР н/г /	N6 ’ -[5-Фтор-4-(7фтор-З-изопропил-2метил-ЗЯбензимидазол-5ил)пиримидин-2-ил]- 2 ' -метил-3,4,5,6тетрагидро-2Я[1,3']бипиридинил4,6'-диамин	493
65	0% РР и ογ 1	Ν6’-[4-(3- Циклопентил-7-фтор2-метил-ЗНбензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил]- 3,4,5,6-тетрагидро2Н- [1,3']бипиридинил- 4,6'-диамин	487

[4-(7-Фтор-Зизопропил-2-метилЗН-бензимидазол~5ил)пиримидин-2-ил][5- (пиперидин-4илсульфанил)пиридин2-ил]амин

478

Пример 1.

[5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5 -ил)пиримидин-2-ил] амин

Барботировали азот через смесь 6-(2-хлор-5-фторпиримидин-4-ил)-4-фтор-1-изопропил-2-метил- 19 018808

1Н-бензимидазола (15,9 г), 5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-иламина (10,85 г), карбоната цезия (32,10 г), трис-(дибензилиденацетон)дипалладия (1,82 г), 4,5-бис-(дифенилфосфино)-9,9диметилксантена (2,35 г) в 1,4-диоксане (197,06 мл). Нагревали смесь на предварительно нагретой масляной бане при 110°С в течение 2 ч. Охлаждали до КТ, разбавляли ДХМ и фильтровали через подушку целита. Удаляли растворитель в вакууме и очищали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/метанол (2%), затем смесью ДХМ/метанол-NНз 2 М 2% с получением 22,11 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 507 (М+Н)⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с описанием получения [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина с применением соответствующих аминовых и хлорпирими диновых производных.

Пример	Структура	Название соединения	МС (ЕЗ+) : т/ζ (М+Н)+
2	_Ν-/ О νν Ч Гт	[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил]-[5(4-изопропилпиперазин1-ил)-б-метилпиридин2-ил]амин	521
3	Г г ГГ	(4-(3- Циклопропилметил-7фтор-2-метил-ЗЯбензимидазол-5-ил)-5фторпиримидин-2-ил][5- (4изопропилпиперазин-1ил)-6-метилпиридин-2ил]амин	533

Пример 4.

[5-Фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]-[5-(4изопропилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]амин

К смеси [5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]-(5пиперазин-1-илметилпиридин-2-ил)амина (130 мг), ацетона (31,6 мкл), 1,2-дихлорэтана (9 мл) и уксусной кислоты (16,3 мкл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (299,9 мг). Нагревали при 60°С в течение 1 ч. Удаляли растворитель в вакууме. Очищали с применением сильного катионита (8СХ), элюируя метанолом, затем смесью метанол-NНз 2 М, затем при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/метанол-NНз 2 М (3%) с получением 115 мг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 521 (М+Н)⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с описанием получения [5-фтор-4-(7фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]-[5-(4-изопропилпиперазин-1илметил)пиридин-2-ил]амина с применением соответствующих аминов.

- 20 018808

I Пример	Структура	Название соединения	МС (ЕЗ+) ·. ιη/ζ (М+Н)+
5	н /~\_г Ν=( Ν-\ -гуР &	[5-Φτορ-4-(7-φτορ-3иэопропил-2-метил-ЗЯбензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил]-[6метил-5-(1метилпиперидин-4илметил)пиридин-2ил]амин	506
6	Η 7=\ ЧЧг / Ν\-/ \ΝγΝ	[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5ил)пиримидин-2-ил]-[5(1-изопропилпиперидин4-илметил)-6метилпиридин-2-ил]амин	534
Ί	_ρ ο-γ	[4- (З-Циклопентил-2метил-ЗЯ-бензимидазол5-ил)-5-фторпиримидин- 2-ил]-(1'-изопропил1' ,2’ ,3', 4 ',5',6'гексагидро[3,41]бипиридин-6ил)амин	514
8	Η ΖΝ=\ г Υ .η ν ο-> / / 0 у-ΝγΝ	[5-Фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5ил)пиримидин-2-ил]-[5(1-изопропилпиперидин4-илокси)пиридин-2ил]амин	522

Пример 9.

[4-(3 -Циклопропил-7-фтор-2 -метил-3Н-бензимидазол-5 -ил)-5 -фторпиримидин-2-ил] -[5-(1этилпиперидин-4-илметил)пиридин-2-ил]амин

К смеси [4-(3-циклопропил-7-фтор-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)-5-фторпиримидин-2-ил]-(5пиперидин-4-илметилпиридин-2-ил)амина (110 мг), 1,2-дихлорэтана (1,14 мл) и уксусной кислоты (2709 мкл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (720 мг). Нагревали при 60°С в течение 1 ч. Удаляли растворитель в вакууме. Очищали с применением сильного катионита (8СХ), элюируя метанолом, затем смесью метанол-NНз 2 М, а затем при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя смесью ДХМ/метанол-ИНз 2 М (3%) с получением 80 мг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 504 (М+Н)⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с описанием получения [4-(3циклопропил-7-фтор-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)-5-фторпиримидин-2-ил]-[5-(1-этилпиперидин-4илметил)пиридин-2-ил]амина с применением соответствующих аминов.

- 21 018808

Пример	Структура	Название соединения	МС (ΕΞ+) : т/ζ ίМ+Н)+
10	,уу	[5-{1-Этилпиперидин- 4-илметил)-6метилпиридик-2-ил][5-фтор-4~(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗН-бензимидазол-5- ил)пиримидин-2ил)амин	520
11	ТУ р уу	(1 *-Этил-2-метил- 1·,2·,3’ζ4·,5’,6·гексагидро- [3,4 *]бипиридин-6ил) -[5-фтор-4-{7фтор-З-изопропил-2метил-ЗНбен.зимидазол-5ил)пиримидин-2ил]амин	506
12	Л / уу	[ 5-(1-Этилпиперидин4-илокси)пиридин-2- ил]-[5-фтор-4-(7фтор-З-изолропил-2метил-ЗНбензимидазол-5ил)пиримидин-2ил]амин	503

- 22 018808

13	-р σ-	Ν4,Ν^-Диэтил-М 6'-[5фтор-4-(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗЯ-бензимидазοл-5ил)пиримидин-2-ил]2'-метил-3,4,5,бтетрагидро-2Я[1,3']бипиридинил4,6'-диамин	549
14	0%, 0 Ογ /—N 1	N6’-[4-<3- Циклопентил-7-фтор- 2-метил-ЗНбензимидазол-5ил)пиримидин-2-ил]N4,Ы4-диэтил3,4,5,б-тетрагидро2Н[1,3’]бипиридинил4,6’-диамин	543
15	Л	[5-(1-Этилпиперидин- 4илсульфанил)пиридин2-ил]-[4-(7-фтор-Зизопропил-2-метилЗН-бензимидазол-5ил)пиримидин-2ил]амин	506

Пример 16.

Метансульфонат [5-(4-этилпиперазин-1 -илметил)пиридин-2-ил]-[5 -фтор-4-(7-фтор-3 -изопропил-2метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина.

К раствору [5 -(4-этилпиперазин-1 -илметил)пиридин-2-ил] - [5 -фтор-4-(7-фтор-3 -изопропил-2 -метил3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина (17,3 г) в смеси ДХМ (100 мл) и метанола (100 мл) добавляли метансульфокислоту (63,59 мл). Перемешивали раствор в течение 1 ч и удаляли растворитель в вакууме. Растирали с МТБЭ и отфильтровывали твердое вещество с получением 20,4 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 507 (М+Н)⁺.

Следующие примеры получали, по существу, в соответствии с описанием получения метансульфоната [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5 -ил)пиримидин-2-ил] амина.

- 23 018808

Пример	Соединение	МС (ΕΞ+): т/2 (М+Н)*
17	Метансульфонат [5-фтор-4-(7-фтор- З-иэопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил][5-(4-изопропилпиперазин-1-ил)-6метилпиридин-2-ил]амина	521
18	Метансульфонат [4-(3циклопропилметил-7^фтор-2-метилЗЯ-бензимидазол-5-ил)-5фторпиримидин-2-ил]-[5-(4изопропи.ппиперазин-1-ил)-6метилпиридин-2-ил]амина	533
19	Метансульфонат [5“фтор-4-(7-фтор- З-изопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил](5- (4-изопропилпиперазин-1илметил)пиридин-2-ил]амина	521
20	Метансульфонат [5-фтор-4-(7-фторЗ-изопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил][6-метил-5-(1-метилпиперидин-4илметил)пиридин-2-ил]амина	506

- 24 018808

21	Метансульфонат [5-фтор-4-(7-фтор- 3-изопропил-2—метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил][5-(1-изопропилпиперидин-4илметил)-б-метилпиридин-2-ил]амина	534
22	Метансульфонат [4-(3-циклопентил- 2-метил-ЗН-бензимидазол-5-ил)-5фторпиримидин-2-ил]-(1’-изопропил1’,2’,3',4*,5*,6т-гексагидро- [3,41]бипиридин-6-ил)амина	514
23	Метансульфонат [5-фтор-4-(7-фтор- З-изопропил-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил][5-(1-изопропилпиперидин-4илокси)пиридин-2-ил]амина	522
24	Метансульфонат [4-(3-циклопропил- 7-фтор-2-метил-ЗЯ-бенэимидаэол-5ил)-5-фторпиримидин-2-ил]-[5-(1этилпиперидин-4-илметил)пиридин-2ил]амина	504
25	Метансульфонат [5-(1этилпиперидин-4-илметил)-6метилпиридин-2-ил]-[5-фтор-4- (7фтор-З-изолропил-2-метил-ЗНбензимидазод-5-ил)пиримидин-2ил]амина	520
26	Метансульфонат (1т-этил-2-метил1^2^3^41,5',6' -гексагидро[3,4’]бипирицин-6-ил)-[5-фтор-4(7-фтор-3-изопропил-2-метил-ЗЯбензимидазол-5-ил)пиримидин-2ил]амина	506

- 25 018808

27	Метансульфонат этилпиперидин-4-илокси)пиридин-2- ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-З-изопропил- 2-метил-ЗН-бензимидазол-5- ил)пиримидин-2-ил]амина	508
28	Метансульфонат К4,М4-диэтил-М6’[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2метил-ЗН-бензимидазол-5ил)пиримидин-2-ил]-2’-метил3, 4,5,6-тетрагидро-2Н[1,3‘]бипиридинил-4,61-диамина	549
29	Метансульфонат N6*-[4-\3- циклопент?ил-7-фтор-2-метил-ЗНбензимидазол-5-ил)гтиримидин-2-ил]Н4,ГО4-диэтил-3,4,5,6-тетрагидро2Я- [1,3’]бипиридинил-4,61-диамина	543
30	Метансульфонат [5-(1этилпиперидин-4илсульфанил)пиридин-2-ил)-[4-(7фтор-З-изопропид-2-метиЛ-ЗН^ бензимидазол-5-ил)пиримидин-2ил]амина	506

Пример 31.

[5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5 -ил)пиримидин-2-ил] амин.

Кристаллическая форма I.

Смешивали 102,1 мг аморфного [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина с 2 мл ацетона. Выделяли осажденное твердое вещество при помощи вакуумного фильтрования с получением светло-желтого осадка и сушили непосредственно в устройстве для фильтрования в течение 30 мин с получением 72,1 мг твердого вещества. Помещали твердое вещество в вакуумный сушильный шкаф при 100°С на 3 ч.

Типичные пики ΧΒΌ формы I представлены в табл. 1.

Пример 32. [5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5 -ил)пиримидин-2-ил] амин.

Кристаллическая форма III.

Смешивали 208 мг аморфного [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина с 4 мл ацетона. Суспендировали в течение 2 ч при 60°С, перемешивая со скоростью 1000 об/мин, затем выделяли твердое вещество при помощи вакуумного фильтрования с получением светло-желтого осадка. Сушили непосредственно в устройстве для фильтрования в течение 30 мин с получением 112 мг твердого вещества (выход 54%). Помещали в вакуумный сушильный шкаф при 80°С на 3 ч.

Типичные пики ХВЭ формы III представлены в табл. 2. Положения пиков проверяли с применением внешнего стандарта.

Порошковая дифракционная рентгенограмма.

Рентгенограммы ХВЭ кристаллов получали на порошковом дифрактометре Вгикег Ό8 Абуапсе, оборудованном источником излучения СиКа (λ=1,54056 А) и детектором УагИес, с рабочими характеристиками 50 кВ и 40 мА. Каждый образец сканировали в диапазоне от 4 до 40°2θ с шагом 0,02°2θ и скоростью сканирования 9,0 с на шаг, с 1 мм дивергенцией и щелями приемника и 0,1 мм щелью детектора. Сухой порошок помещали в углубленный держатель образца с верхней загрузкой, ровную поверхность получали с применением предметного стекла. Дифракционные рентгенограммы кристаллических форм получали при температуре и относительной влажности окружающей среды. Перед снятием пиков для кристаллов формы III убирали фон, тогда как для формы I фон не убирали.

В области кристаллографии хорошо известно, что для каждой заданной кристаллической формы относительные интенсивности дифракционных пиков могут изменяться в зависимости от предпочтительной ориентации, зависящей от факторов, таких как морфология и форма кристалла. В случае, если присутствуют эффекты предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, но положения характеристических пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, Фармакопея США # 23,

- 26 018808

Национальный формуляр # 18, стр. 1843-1844, 1995. Кроме того, в области кристаллографии хорошо известно, что для каждой заданной кристаллической формы положение угловых пиков может незначительно изменяться. Например, положения пиков могут сместиться в результате изменения температуры или влажности, при которых анализируют образец, замены образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В настоящем случае погрешность ±0,1°2θ положения пиков учитывает указанные потенциальные изменения без помех для точного определения исследуемой формы кристалла.

Подтверждение формы кристалла может быть проведено на основании любой уникальной комбинации различных пиков (в единицах °2θ), как правило, более крупных пиков. Таким образом, полученный образец кристаллической формы I [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина характеризуется рентгенограммой ХВБ, полученной с применением излучения СиКа, содержащим пики дифракции (в единицах 2-тета), представленные в табл. 1, в частности содержащим пики при 4,51 в комбинации с одним или более пиком, выбранным из группы, состоящей из 13,09, 16,31 и 18,82; с погрешностью углов дифракции, равной 0,1°.

Таблица 1

Пики порошковой дифракционной рентгенограммы кристаллической формы I [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина

Угол, ° 2Θ	Значение ά. Ангстрем	Интенсивность, %
4,51	19, 60	100

5, 89	15,00	4
8,98	9,84	1/5
11,20	7,89	2,3
12,57	7,04	1,9
13,09	6,76	7
15, 93	5,56	3
16,31	5,43	4,4
17,01	5,21	1,9
18,58	4,77	3,1
18,82	4,71	3,6
20,86	4,26	1,5
21,90	4,06	2,2
23,12	3,84	2,4
23,53	3,78	3,7
26,71	3,33	2,4
26,85	3,32	2

Полученный образец кристаллической формы III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина характеризуется рентгенограммой ХКБ, полученной с применением излучения СиКа, содержащей дифракционные пики (в единицах 2-тета), описанные в табл. 2, и, в частности, содержащей пики при 21,29 в комбинации с одним или более пиком при 11,54, 10,91 и 12,13; с погрешностью углов дифракции, равной 0,1°.

- 27 018808

Таблица 2

Пики порошковой дифракционной рентгенограммы кристаллической формы III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина

Угол, ’ 2Θ	Значение ά, Ангстрем	Интенсивность, %
7,44	11,87	8
10, 91	8,11	19
11,54	7,66	38
12,13	7,29	18
13,89	6, 37	25
14,91	5,94	20
15,63	5, 67	27
16, 06	5,52	11
18,59	4,77	21
18,94	4,68	26
20, 43	4,34	21
21,29	4,17	100
21, 91	4,05	37
22,13	4,01	12
22,45	3, 96	8
23,12	3, 84	6
23,42	3, 80	9
25, 95	3, 43	17
29,42	3, 03	9

¹³С ЯМР твердого тела.

Спектры ЯМР кросс-поляризации/вращения под магическим углом (СР/МАЗ) (твердофазного ЯМР или 88ΝΜΚ) получали на ЯМР-спектрометре широких линий Вгикег Абуаисе III 400 с рабочими частотами для 'И и ¹³С, равными 400,131 и 100,623 МГц соответственно, с применением 4 мм датчиков двойного резонанса Вгикег. Скорость МАЗ устанавливали на 5 или 10 кГц с применением контролирующего устройства Втикет-МАЗ-П; скорости вращения поддерживали внутри 2 Гц диапазона от установленного значения. Развязку ЗРШАЬ64 при частоте нутации протонов, равной 100 кГц, применяли для гетероядерной развязки. Боковые полосы от вращения удаляли при помощи пятиимпульсной последовательности для полного удаления боковых полос (ТОЗЗ). Контактное время СР для переноса намагниченности с протонов на углерод устанавливали равным 4 мс для увеличения эффективности СР в канале ¹Н применяли постепенное изменение частоты от 93,5 до 46,9 кГц. Устанавливали экспозицию, равную 34 мс, и получали спектры со спектральной шириной, равной 30 кГц, с задержкой перед повторным снятием спектра, равной 5 с. Поддерживали температуру образца, равную 297±1 К для минимизации нагревания за счет трения, вызванного вращением образца. Химические сдвиги ¹³С соотносили с развязанным от протонов пиком ¹³С внешнего стандарта (±0,05 ррш) чистого (жидкого) тетраметилсилана с применением сильнопольного резонанса адамантина (δ=29,5 ррш).

Список химических сдвигов кристаллической формы III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина представлен далее:

¹³С-ЯМР: ν (Е1) (ррш) 11,7; 12,9; 20,5; 48,6; 52,5; 59,4; 108,9; 110,0; 112,7; 127,3; 129,4; 135,5; 136,4; 148,8; 150,1; 152,2; 154,5; 156,3.

- 28 018808

Пример 33.

[5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3-изопропил-2-метил-3Нбензимидазол-5 -ил)пиримидин-2-ил] амина.

Кристаллическая форма III.

Способ получения В

a) 1-(6-Бромпиридин-3-илметил)-4-этилпиперазин.

К смеси 6-бромпиридин-3-карбальдегида (8,3 кг) и ДХМ (186 кг) добавляли чистый 1-этилпиперазин (5,6 кг). Затем по частям добавляли триацетоксиборгидрид натрия (10,9 кг) и перемешивали при 20-30°С в течение 12 ч. Реакцию гасили, выливая реакционную массу в смесь ДХМ (36 кг) и 2н. водного раствора гидроксида натрия (46 кг). Отделяли слои и дважды экстрагировали водный слой ДХМ (24x2 кг). Объединяли органические слои, промывали солевым раствором (50x2 кг) и удаляли растворитель в вакууме с получением 11,5 кг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т/ζ 285 (М+Н)⁺.

b) 5-(4-Этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-иламин.

К дегазированной смеси 1-(6-бромпиридин-3-илметил)-4-этилпиперазина (14,2 кг), оксида меди (200 г) и МеОН (57 кг) при Т<40°С добавляли жидкий аммиак (50,0 кг). Нагревали смесь при 65-75°С в течение ночи. Охлаждали до 20-30°С и фильтровали через подушку целита®. Концентрировали фильтрат и добавляли ДХМ (113 кг) и доводили рН до 12-14 2н. гидроксидом натрия (23 кг), разделяли фазы и промывали органическую фазу ДХМ (58x2 кг) и объединяли органические слои. Фильтровали смесь через целит® и концентрировали. Растворяли остаток в толуоле (9,7 кг) и кристаллизовали при помощи добавления МТБЭ (8,3 кг) с получением 6,0 кг указанного в заголовке соединения. Проводили дополнительную очистку перекристаллизацией из толуола.

МС (Е8⁺): ιη/ζ=221 (М+Н)⁺.

c) Ν-Изопропилацетамид.

К раствору 2-пропанамина (12 кг) в этилацетате (108 кг) при <20°С добавляли карбонат калия (28 кг). Охлаждали смесь примерно до 5-0 °С и добавляли ацетилхлорид (16,7 кг) со скоростью, равной примерно 2-3 кг/ч. Перемешивали до завершения реакции, определяемой с помощью газовой хроматографии. Гасили реакционную смесь водой (0,8 кг) и фильтровали реакционную смесь и концентрировали с получением 13,4 кг указанного в заголовке соединения.

ЯМР (ΟΌΟ1₃) 4,06 (м, 1Н), 1,94 (с, 3Н), 1,14 (д, 6Н).

ά) №(4-Бром-2,6-дифторфенил)-№-изопропилацетамид.

К смеси 4-бром-2,6-дифторфениламина (14,5 кг), Ν-изопропилацетамида (8,5 кг), ТЭА (10,6 кг) в толуоле (115 кг) при <20°С добавляли хлорокись фосфора (16,0 кг). Перемешивали при 10-20°С до завершения реакции, определяемой с помощью ВЭЖХ. Удаляли растворитель в вакууме и добавляли МТБЭ (64 кг). Регулировали рН смеси 10% водным карбонатом натрия (250 кг). Фильтровали смесь и промывали осадок МТБЭ (11x2 кг). Разделяли фазы и промывали водный слой МТБЭ (22x2 кг). Объединяли органические слои и концентрировали, фильтровали и промывали циклогексаном (0,6 кг) и сушили с получением 17,2 кг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ιη/ζ=292 (М+Н)⁺.

е) 6-Бром-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазол.

К раствору №(4-бром-2,6-дифторфенил)-№-изопропилацетамида (16,2 кг) в Ν-метилформамиде (76 кг) добавляли по частям трет-бутоксид калия (6,9 кг), поддерживая температуру <30°С. Нагревали смесь при 70-75°С до завершения реакции, определяемой с помощью ВЭЖХ. Охлаждали до 20-30°С и гасили при помощи добавления в воду (227 кг), затем экстрагировали МТБЭ (37x4 кг). Промывали объединенные органические фазы солевым раствором (49x2 кг) и концентрировали до объема, равного 25-30 л, добавляли н-гексан (64 кг) и фильтровали суспензию с получением 11 кг указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): т^=272 (М+Н)⁺.

Дополнительную очистку проводили при помощи растворения неочищеного соединения в ДХМ и фильтрования через подушку силикагеля и целита® с последующим выделением из смеси МТБЭ/гексан.

Г) 4-Фтор-1-изопропил-2-метил-6-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-бензимидазол.

Барботировали азот через смесь 6-бром-4-фтор-1-изопропил-2-метил-1Н-бензимидазола (600 г), бис-(пинаколато)диборана (843 г), трициклогексилфосфина (106 г), ацетата калия (652 г) и ДМСО (3,6 л). Добавляли ацетат палладия (49 г) и нагревали при 100°С до завершения реакции, определяемой с помощью ВЭЖХ. Охлаждали реакционную смесь и разбавляли водой (18 л), затем фильтровали для выделе

- 29 018808 ния твердого вещества. Растворяли неочищенное вещество в 1,2-диметоксиэтане (450 мл) и фильтровали через целит®. Применяли фильтрат без очистки на стадии д).

д) 6-(2 -Хлор-5 -фторпиримидин-4 -ил) -4 -фтор-1 -изо пропил-2 -метил- 1Н-бе нзимидазо л.

Барботировали азот через смесь 2,4-дихлор-5-фторпиримидина (517 г), карбоната натрия (586 г) в воде (1,7 л) и 1,2-диметоксиэтане (3,4 л). Добавляли хлорид бис-(трифенилфосфино)палладия(П) (4,9 г) и нагревали реакционную смесь при 80±3°С и по каплям добавляли раствор 4-фтор-1-изопропил-2-метил6-(4,4,5,5-тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-1Н-бензимидазола в 1,2-диметоксиэтане, полученном на стадии £ (5,1 л). Перемешивали смесь при 80±3°С до завершения реакции, определяемой с помощью ВЭЖХ. Охлаждали до КТ и разбавляли холодной водой (2,1 л, 5°С). Перемешивали в течение 1 ч, затем выделяли неочищенное твердое вещество при помощи фильтрования. Дополнительную очистку твердого вещества проводили при помощи растирания с ИПС с получением 472 г указанного в заголовке соединения.

МС (Е8⁺): ™/ζ=323 (М+Н)⁺.

11) Кристаллическая форма III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензоимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина

Барботировали азот через смесь 6-(2-хлор-5-фторпиримидин-4-ил)-4-фтор-1-изопропил-2-метил1Н-бензимидазола (465 г), 5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-иламина (321 г), карбоната калия (403 г), 4,5-бис-(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (17 г) в т-амиловом спирте (2,3 л). Нагревали трис-(дибензилиденацетон)дипалладий (13,2 г) и смесь при 100±5°С до завершения реакции, определяемой с помощью ВЭЖХ. Охлаждали до КТ, разбавляли ДХМ (1,2 л) и фильтровали через подушку целита®. Экстрагировали фильтрат 4 М НС1 (2x2,3 л). Объединяли водные слои и перемешивали с активированным углем (32 г). Фильтровали через целит®, добавляли ДХМ (1,7 л) и регулировали рН при помощи №1ОН (28% водный раствор, 1,5 л). Собирали органический слой и промывали водный слой ДХМ (1,7 л). Объединяли органические слои, промывали солевым раствором (1 л) и сушили над сульфатом магния. Обрабатывали 81-ТЫо1 на твердой подложке для удаления остаточного палладия и заменяли растворитель на ацетон. Фильтровали суспензию и сушили с получением 605 г неочищенного продукта в виде формы I. Смешивали 605 г формы I и 4,3 л осушенного ацетона. Суспендировали при 56-57°С (кипячение с обратным холодильником) в течение по меньшей мере 18 ч, затем при температуре окружающей среды в течение 4 ч. Выделяли твердое вещество при помощи вакуумного фильтрования с получением светло-желтого осадка. Сушили твердое вещество в вакуум-сушильном шкафу при 35°С до достижения постоянной массы, равной 570 г. Подтверждали нахождение вещества в форме III указанного в заголовке соединения при помощи ΧΚΡΌ.

МС (Е8⁺): т/ζ 507 (М+Н)⁺.

Результаты представленных далее исследований представляют собой доказательства того, что соединения, которые приведены в настоящем описании, подходят в качестве специфических ингибиторов СБК4/6 и противораковых агентов. Используемый в настоящем описании термин 'Ίθ5ο относится к концентрации агента, которая обеспечивает 50% ингибирующий ответ от максимального ингибирующего ответа, достижимого для указанного агента, термин ЕС₅₀ относится к концентрации агента, которая обеспечивает 50% от максимального ответа, достижимого для указанного агента.

Исследование ингибирования СБК4.

Для иллюстрации того, что соединения, включенные в рамки настоящего изобретения, обладают сродством к СБК4 киназе, проводили исследование СБК4. Функциональные исследования обеспечивают подтверждение того, что соединения согласно настоящему изобретению обладают способностью ингибировать активность СБК4 киназы. Все лиганды, радиоактивные метки, растворители и реагенты, применяемые в представленных далее исследованиях, являются легко доступными из коммерческих источников или могут быть легко синтезированы специалистами в данной области техники.

мкл исследуемого соединения в 20% ДМСО, 20 мкл раствора аденозина 5'-трифосфата (АТФ) и С-терминального фрагмента ретинобластомы (СТЕР) (ир51а1с, кат. # 12-439) и 10 мкл раствора фермента смешивали в 96-луночном планшете. Растворы АТФ и СТЕР получали из смеси 40 мкМ АТФ, 0,16 мк-С1 [³³Р]-АТФ и 1 мкМ СТЕР, разбавленной в киназном буфере, состоящем из 68 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфокислоты (НЕРЕ8), рН 7,4, 6,72 мМ МдС1₂, 6,72 мМ дитиотреитола (БТТ) и 0,013% ТШТОЫ™ Х-100. Раствор фермента получали из 8 нг фермента СБК4 (Ргос.|1па5С кат. # 0142-0373-1), разбавленного в киназном буфере, описанном выше. Исследуемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО с получением кривой из 10 точек с исходной концентрацией, равной 20 мкМ. В качестве контрольного образца применяли 20% ДМСО буфер без добавления исследуемого соединения, для определения фона ³³Р в отсутствие ферментной активности применяли 500 мМ этилендиаминтетрауксусной

- 30 018808 кислоты (ЭДТА). Реагенты смешивали и инкубировали в течение 90 мин при 20°С. Реакцию прекращали при помощи добавления 80 мкл 10% (об./об.) Н3РО4 и осаждения вещества на стекловолоконные фильтрующие планшеты (М1Шроге, МАРС Ν0Β 50). Лунки промывали четыре раза 0,5% Н₃РО₄ и определяли приобретенную радиоактивность при помощи микропланшетного сцинтилляционного счетчика (М1сгоЬе!а ТгПих, \Ма11ас).

Разницу между медианными значениями, полученными для верхнего и нижнего контрольных образцов, принимали за 100%. Для определения значений Κ.'₅₀ применяли четырехпараметровую логистическую аппроксимацию с применением программного обеспечения АсИуПуВаке™ ([ЭВБ, А1атейа СА). Все мезилатные соли соединений, примеры которых приведены в настоящем описании, показали значение IС₅₀<10 нМ в представленном выше исследовании. Соединение примера 25 обладало значением ТС₅₀, равным 3 нМ в представленном выше исследовании, что показывает, что мезилатные соли соединений, примеры которых приведены в настоящем описании, являются сильными ингибиторами СОК4.

Исследование ингибирования СИК6.

мкл исследуемого соединения в 20% ДМСО, 20 мкл раствора АТФ и СТВР (ир§1а1е, кат. # 12-439) и 10 мкл раствора фермента смешивали в 96-луночном планшете. Растворы АТФ и СТВР получали из смеси 100 мкМ АТФ, 0,16 мк-С1 [³³Р]-АТФ и 0,8 мкМ СТВР, разбавленной в киназном буфере, состоящем из 68 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты (НЕРЕ8), рН 7,4, 6,72 мМ МдС12, 2,64 мМ ЭТТ и 0,004% Тгйоп¹™ Х-100. Раствор фермента получали в расчете на конечную концентрацию, равную 1,7 нг/мкл фермента СИК6 (Ргоцтаке кат. # 7533), разбавленного в киназном буфере, описанном выше в исследовании ингибирования СИК4. Исследуемые соединения серийно разбавляли 1:3 в 20% ДМСО с получением кривой из 10 точек с исходной концентрацией, равной 20 мкМ. В качестве контрольного образца применяли 20% ДМСО буфер без добавления исследуемого соединения, для определения фона Р в отсутствие ферментной активности применяли 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Реагенты смешивали и инкубировали в течение 90 мин при 20°С. Реакцию прекращали при помощи добавления 80 мкл 10% (об./об.) Н3РО₄ и осаждения вещества на стекловолоконные фильтрующие планшеты (М1Шроге, МАРС Ν0Β 50). Лунки промывали четыре раза 0,5% Н₃РО₄ и определяли приобретенную радиоактивность при помощи микропланшетного сцинтилляционного счетчика (М1сгоЬе!а ТгПих, \Ма11ас).

Исследовали данные аналогично данным, полученным для ингибирования СИК4. Предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, обладали значением Κ.'₅₀<30 нМ в представленном выше исследовании. Соединение примера 19 обладало значением ТС₅₀, равным 5 нМ, в представленном выше исследовании, что показывает, что предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, являются сильными ингибиторами СИК6.

Исследование ингибирования Р1т-1 киназы.

Р1т-1 (человеческую, конечная концентрация 0,46 нМ) инкубировали с 8 мМ МОРС рН 7,0, 0,2 мМ ЭДТА, 100 мкМ соответствующего субстрата пептида (см. отчет исследования ингибирования Р1т-1 киназы в Скеп, Ь.8. е! а1. (2009), В1оой, ИОВ 10.1181/Ь1оой-2009-03-202852), 10 мМ ацетата Мд и [у-³³Р-АТФ] (специфическая активность равна примерно 500 срт/пкмоль, концентрация в соответствии с требованиями). Реакцию инициировали при помощи добавления смеси Мд АТФ, затем инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали при помощи добавления 3% раствора фосфорной кислоты. Затем помещали пятно 10 мкл реакционной смеси на установку для сушки РШегта! Р30 и трижды в течение 5 мин промывали 75 мМ фосфорной кислотой и однократно метанолом перед сушкой и снятием показаний сцинтилляционного счетчика. Для исследования ингибирующей способности соединений соединения, находящиеся в виде 10 мМ раствора в 100% ДМСО, разбавляли в пропорции 1:10 в 100% ДМСО с получением 50х раствора относительно максимальной концентрации для кривой. 50х раствор затем серийно разбавляли в пропорции 1:3 в 100% ДМСО для получения кривой концентрация-ответ из 10 точек, а также разбавляли в пропорции 1:50 (от 20 мкМ до конечной концентрации 0,001 мкМ в 2% ДМСО) в реакционной смеси для определения активности соединения. Контрольные лунки содержали только ДМСО, причем определяли базисную линию в контрольных лунках, в которых остановку реакции кислотой проводили в 0 момент времени. Процент ингибирования определяли при помощи контрольных образцов каждого из планшетов, данные, полученные для десяти различных концентраций соединения, затем аппроксимировали в четырехпараметровом логистическом уравнении с применением АсЙукуЬаке 4.0.

Предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, показали значение IС₅₀<0,01 мкМ. Соединение примера 25 обладало значением ^₅₀, равным 0,003 мкМ, в представленном выше исследовании, что показывает, что предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, являются сильными ингибиторами Р1т-1 киназы.

Исследование растворимости.

Подходящие количества исследуемого соединения взвешивали в отдельных хроматографических ампулах. Для достижения требуемой концентрации, равной 2,0 мг/мл, в ампулу с образцом добавляли требуемый объем 0,05 М фосфатного буфера, рН 8,0 (растворяли 6,7 г двухосновного фосфата натрия х 7

- 31 018808

Н₂О в 500 мл воды квалификации для ВЭЖХ, доводили до рН 8,0 при помощи 85% фосфорной кислоты). Подходящий стандартный раствор в ДМСО получали при помощи добавления требуемого объема ДМСО к ампуле со стандартом для достижения требуемой концентрации, равной 2,0 мг/мл. Ампулы надежно закрывали и помещали во вращающее устройство. Ампулы вращали на 360° в течение по меньшей мере 16 ч при температуре окружающей среды с угловой скоростью, равной примерно 50 об/мин. После проведения вращения проводили визуальную проверку каждой ампулы. 250 мкл содержимого каждой ампулы фильтровали через 0,7 мкм стеклянный фильтр. Фильтрат образца и фильтрат стандарта собирали в отдельные лунки 96-глубоколуночных планшетов. Получали серии разбавлений (2000, 200, 20, 2,0 мкг/мл и пустой образец ДМСО) при помощи соответствующего серийного разбавления в ДМСО стандартного раствора с концентрацией 2,0 мг/мл.

Растворы с образцом и стандартом анализировали при помощи ВЭЖХ (колонка для ЖХ: ХТегга М3, С18, 2,1x50 мм, 3,5 мкм, при 50°С; подвижные фазы: А - 0,2% муравьиная кислота в воде, В - 0,2% муравьиная кислота в ацетонитриле, градиент: 5-100% В в течение 3 мин, выдержка 100% В в течение 0,5 мин, скорость потока: 750 мкл/мин; объем инъекции: 1 мкл, детектор на диодной матрице, сканирующий длины волн от 200 до 400 нм. Полученные и применяемые для количественного определения длины волн выбирали для обеспечения наиболее точной оценки полученных образцов). Время удерживания, используемое для определения принадлежности пиков исследуемому соединению, получали при помощи хроматограмм 200 мкг/мл стандартных растворов.

Значения растворимости рассчитывали с применением четырехуровневой калибровочной кривой. Применяли линию наибольшего соответствия площади пика калибровочных стандартов, вычисленную при помощи системы данных, полученных в результате проведения хроматографии, с применением линейной или квадратичной аппроксимации на нулевую точку. Результаты растворимости представляли в мг/мл. Предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, показали растворимость, равную по меньшей мере 2 мг/мл в фосфатном буфере, рН 8, в указанном выше исследовании. Соединение примера 16 показало растворимость, равную 2,099 мг/мл в фосфатном буфере, рН 8, в представленном выше исследовании. Представленные данные, таким образом, показывают, что предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, согласно настоящему изобретению хорошо растворяются в водном растворе.

Исследование пероральной биодоступности у крыс.

Приобретали самцов крыс линии Спрег-Доули (масса тела в диапазоне 250-320 г) с постоянным катетером в феморальной артерии в Сйаг1е8 Шуег, Χνίΐιηίπφοπ. МА 01887, ИЗА. Исследуемое соединение вводили внутривенно в виде раствора (2 мл/кг): 10% №метилпирролидон/18% Сарй§о1® в 22,5 мМ фосфатном буфере, рН 3. Конечная концентрация лекарственного средства составляла 0,25 мг/мл (в пересчете на свободное основание). Через 24 ч получали образцы крови с применением постоянного катетера. Затем животным вводили пероральную дозу исследуемого соединения в суспензии (5 мл/кг) в смеси 1% (мас./об.) гидроксиэтилцеллюлозы/0,25% (об./об.) полисорбата 80/0,05% (об./об.) противопенистого средства в очищенной воде. Конечная концентрация лекарственного средства составляла 0,2 мг/мл (в пересчете на свободное основание). Через 24 ч получали дополнительные образцы крови с применением постоянного катетера. Получали образцы плазмы при помощи центрифугирования и хранили в замороженном виде (-20°С) до проведения анализа.

К образцам плазмы для осаждения белка добавляли внутренний стандарт (для нормализации) в смеси ацетонитрил/метанол (1:1 об./об.) и образцы центрифугировали перед проведением анализа. Надосадочные жидкости анализировали при помощи инъекции и быстрого градиентного элюирования в колонке 1ауе1ш Ве1аы1 С18 (20x2,1 мм картридж, мобильная фаза А: вода/1 М раствор бикарбоната аммония, 2000:10 об./об., мобильная фаза В: МеОН/1 М раствор бикарбоната аммония, 2000:10 об./об.). Элюированные определяемые вещества детектировали при помощи ЖХ-МС-МС анализа с применением массспектрометра с тройным квадруполем Зс1ех АРI 4000. Концентрации соединений в плазме определяли при помощи стандартов, полученных в идентичных условиях.

Значение пероральной биодоступности получали при помощи деления площади под кривой концентрации плазмы во времени после орального введения на площадь под кривой после внутривенного введения (после проведения нормализации на введенную дозу). Результаты представлены в виде биодоступной фракции с пересчетом на внутривенную дозу (%Е). Предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, показали значение %Е>20% в представленном выше исследовании. Соединение примера 22 показало значение %Р, равное 48,5% в представленном выше исследовании, что показывает, что предпочтительные соединения, примеры которых приведены в настоящем описании, обладают хорошей пероральной биодоступностью.

Ингибирование фосфорилирования белка ретинобластомы (рКЬ) и исследование содержания ДНК.

Клетки СОЬО 205, приобретенные в Ашепсаи Туре СиЙиге Со11ес1юп (АТСС) помещали в количестве 2000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты Вескшап Иккшкои ВЮСОАТ™ и инкубировали в среде ВРМ! 1640 (например, 6ШСО, кат. # 52400-025) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС, например, СШСО, кат. # 11000-144) и 1% пирувата натрия (61Ьсо, кат. # 11360-070) при 37°С, 5% СО₂ в тече

- 32 018808 ние 24 ч. Клетки обрабатывали при помощи добавления исследуемого соединения к среде, дозируя 10 различными 1:3 разбавлениями в диапазоне от 20 до 0,001 мкМ, с конечной концентрацией ДМСО, равной 0,25%. Через 24 ч выдерживания соединений клетки фиксировали при помощи фиксатора РКЕЕЕК™ (Лпа1се11 ЬТЬ., кат. # 414) в течение 30 мин при КТ, затем делали проницаемыми при помощи 0,1% Ттйои® Х-100 в фосфатном буферном солевом растворе (РВ8) в течение 15 мин при КТ. Дважды промывали клетки РВ8, затем настаивали с 50 мкг/мл ΚΝΆ-азы (рибонуклеаза А, 81дта, кат. # К-6513) в инкубаторе при 37°С в течение 60 мин. Зафиксированные клетки блокировали 1% альбумином бычьей сыворотки (БСА, АтсгеНат, кат. # КРШ12У) в течение 30 мин. Первичное антитело, очищенное мышиное моноклональное антитело анти-фосфо-КВ (ВИ РНагт1деп, кат. # 558385) добавляли разбавленным 1:2000 в РВ8 с 1% БСА к клеткам и инкубировали в течение ночи при 4°С. После проведения трех промываний РВ8 клетки инкубировали со вторичным меченым А1еха488 антителом, козьим антимышиным ЦС А1еха 488 Диуйгодеи, кат. # А11017) в течение 1 ч при КТ. Снова трижды промывали РВ8, затем добавляли 15 мкМ пропидий йодида (1:100 разбавление РВ8 первоначального раствора, [пуйгодеп, кат. # Р3566) для окрашивания ядер клеток. Флуоресцентные планшеты сканировали при помощи ΑΟϋΜΕΝ ЕХРЬОКЕК™ (лазерный сканирующий цитометр флуоресцентных микропланшетов (содержащий аргоновый лазер с длиной волны возбуждения 488 нм и детектор, представляющий собой несколько фотоумножительных трубок), произведенный ТТР ЬАВТЕСН ЬТЬ) для определения фосфорилирования белка КЬ и содержания ДНК. Анализ изображений основывался на сигналах флуоресценции клеток для определения клеток различных подпопуляций. Данные, полученные в результате исследования, представляли собой процентное содержание каждой определенной подпопуляции, % фосфо-КВ положительных, % 2н. и % 4н. Значения КД, и ЕС₅₀ определяли при помощи аппроксимации к четырехпараметровой логистической модели каждого полученного значения с применением АСТГУГГУ ВА8Е™. Все мезилатные соли соединений, примеры которых приведены в настоящем описании, обладали значением ^₅₀<200 нМ в представленном выше исследовании. Соединение примера 25 обладало активностью, равной примерно 100 нМ в представленном выше исследовании, что показывает, что мезилатные соли соединений, примеры которых приведены в настоящем описании, являются сильными ингибиторами активности СОК 4/6 киназы (определенной при низком уровне фосфорилирования рКЬ) в лабораторном исследовании клеток.

Также все мезилатные соли соединений, примеры которых приведены в настоящем описании, способны индуцировать специфическую блокировку фазы С1 клеточного цикла, даже присутствуя в концентрациях, равных по меньшей мере 2 мкМ. Специфическая блокировка С₁ достигается, когда >90% клеток обладает генотипом 2н. Специфическая блокировка С1 даже в физиологически значимых концентрациях активного соединения показывает, что соединения согласно настоящему изобретению являются специфическими ингибиторами СЭК4/6 и неспецифическое ингибирование других СОК минимизировано, что приводит к блокировке клеточного цикла в других фазах.

Модели подкожных человеческих ксенотрансплантатов.

Клетки человеческого колоректального рака (со1о-205), клетки человеческой острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) (МУ4-11), клетки человеческой глиобластомы (И87МС) и клетки человеческого рака легких (ΝΟ Η460 и са1и 6) выращивали в культуре (со1о-205 и ΝΟ Η460 выращивали в среде КРΜI 1640 с Ь-глутамином, 25 мМ НЕРЕ8, 1 мМ пирувата Ыа, 10% ЭБС; МУ4-11 выращивали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, с Ь-глутамином, 25 мМ НЕРЕ8, 10% ЭБС; И87МС и са1и 6 выращивали в Еад1е'§ МЕМ (минимально обогащенная среда) с солями Эрла, Ь-глутамином и заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата №1 и 10% ЭБС), собирали со1о-205, И87МС, са1и 6 и ΝΟ-Η460, гидролизованные трипсином (Iηνй^одеη, кат. # 25200-056), МУ4-11 собирали при помощи центрифугирования) и вводили подкожно (5 миллионов клеток/животное, смешанных в пропорции 1:1 в Матригеле, ВИ Вюкаеисек) в бок мышей без тимуса. Исследуемое соединение приготавливали в соответствующем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза в 25 мМ фосфатном буфере, рН 2) и вводили через желудочный зонд ежедневно (в 25, 50 или 100 мг/кг) в течение 21 дня после развития опухолей (11-29 дней после введения имплантата). Реакцию опухолей определяли при помощи определения размера опухоли дважды в неделю в течение курса лечения.

Статистический способ определения задержки роста опухоли (ТСИ-индивидуальный способ интерполяции) представлен далее. Для каждого животного вычисляли время достижения конкретного размера опухоли (порогового значения) при помощи интерполяции последнего значения до достижения порогового значения и следующего значения. Интерполяция является линейной с применением 1од10 (размер) время. В случае, если животное не достигало пороговое значение, время пересечения порогового значения обозначали как >Т, где Т представляет собой последний день, в который проводили измерения для указанного животного. Указанное время пересечения порогового значения анализировали как данные время-событие с применением правого цензурирования в распределении Вейбулла. Среднее значение и стандартное отклонение определяли для каждой группы. Задержка роста опухоли (ТСИ) представляла собой разницу между средним временем пересечения порогового значения для групп с лекарственными средствами и контрольной группы носителей. Проводили Т-исследования с применением средних значений и стандартных отклонений, полученных в анализе Вейбулла. Массу тела принимали в качестве об

- 33 018808 щей меры токсичности.

В соответствии со способом, по существу, аналогичным описанному выше, соединение примера 16 обладает противоопухолевой активностью в указанных моделях, представленной в табл. 3, что, таким образом, показывает, что соединение примера 16 обладает сильной активностью ίη νίνο в отношении различных КЬ⁺ опухолей.

Также для ксенотрансплантатов ОМЛ МУ4-11 наблюдали уменьшение опухоли в дозировке соединения примера 16, равной 100 мг/кг, что подтверждало ингибирующую активность соединения примера 16 в отношении проапоптотической Р1т-1, см. табл. 4.

Таблица 3

Задержка роста опухоли в различных моделях человеческих ксенотрансплантатов

Ксенотрансплантат	Дозировка	Дни Τ6ϋ (750 м3)	СКО
со1о-205	100 мг/кг	39, 9	4,6
50 мг/кг	17,4	3,2
25 мг/кг	15,3	3,8
№74-11	100 мг/кг	28,8	1,1
50 мг/кг	11,5	4,0
25 мг/кг	10,4	4,7
087 МС	100 мг/кг	21,4	2,7
50 мг/кг	10,0	2,2
25 мг/кг	6,1	3,2
Н46 0	100 мг/кг	6,7	2,7
50 мг/кг	4,0	4,2
25 мг/кг	1,5	1,8

Таблица 4

Противоопухолевая активность соединения примера 16 в модели МУ4-11

Способ лечения	Размер опухоли (мг) перед началом дозирования (28 день)	ско (мг)	Значение Р	Размер опухоли (мг) в конце дозирования (49 день)	СКО (мг)	Значение Р
Носитель, 0, 2 мЛ/ перорально, дозировка ςάχ21/1% ГЗЦ+0,1 % АР в 25 мН фосфатного буфера, рН 2	219, 45	17,42	Контр.	1271,15	100,9	Контр.
Соединение Примера 16, 100 мг/кг, перорально, дозировка ςάχ21	225, 94	29,61	НЗ	116, 68	15,29	4с » 4

Определение размера опухоли.

Значение р представляет собой статистическую значимость по сравнению с контрольной группой носителей (Контр.) в день измерения.

НЗ - незначительно.

***р<0,001.

Модели ортотопических ксенотрансплантатов в мозг.

Модель опухоли мозга ίη νίνο.

Самцов ΝΙΕ-ΗΝΕ крыс, весящих от 225 до 300 г, анестезировали изофлураном и помещали в стереотаксическую рамку (Όανίά Кор£ ЕтЛгитспК Тщипда, СА). Проводили разрез по средней линии и сверлили 1 мм трепанационное отверстие на 2 мм латеральнее средней линии и на 3 мм перед венечным швом черепа. Вводили клеточную суспензию 5х10⁵ И87МС опухолевых клеток человеческой глиобластомы (выращенных в ЕадЕТ МЕМ с солями Эрла, Ь-глутамином и заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата Να и 10% ЭБС) в 10 мкл (5х10⁵ клеток для с.|б дозирования и 1х10⁶ для с.|2б дозирования) на

- 34 018808 глубину 3 мм при помощи 25 или 50 мкл шприца НатШоп в течение примерно 2 мин с применением шприцевого насоса, закрепленного на стереотаксической рамке (№шо-1п|се1ог. модель # 53310 и 8!его!ах1с Абар!ег С1атр, партия # 51681, 81оеШпд Со, Аооб Эа1с. 1Ь), при этом шприц оставляли на месте дополнительно в течение 1 мин для предотвращения обратного потока, после чего шприц медленно извлекали. Трепанационное отверстие заклеивали костным воском, область проведения операции промывали солевым раствором и зашивали разрез швами или хирургическими скрепками.

Исследуемое соединение входило в состав с носителем (1% (мас./об.) гидроксиэтилцеллюлозы/0,25% (об./об.) полисорбата 80/0,05% (об./об.) противопенистого средства в очищенной воде), состав вводили ежедневно в течение 21 дня в дозировке 20, 40 и 80 мг/кг (с.|бх21) и 80 мг/кг с.|2б.х10 начиная с 4 дня после введения имплантата.

Первичная выходная переменная представляет собой выживаемость. Животных наблюдали ежедневно до достижения смерти, консультируясь с ветеринарным персоналом и соблюдая указания по проведению имплантации опухоли, проводили эвтаназию, если животное агонировало. Клетки имплантировали в лобную долю для минимизации возможных дисфункций мозга, таких как дефицит моторики и контроля жизненных функций. Опухоли в лобных долях человеческого мозга называют тихими, их наиболее распространенные симптомы включают головную боль, тошноту, рвоту и когнитивные расстройства. Болезнь, таким образом, наиболее вероятно выражается в вялости и потере массы тела. Данные выживаемости анализировали при помощи способа Каплана-Мейера для анализа медианной выживаемости с применением ДМР ν 6.0.2 (8Л8 1п8!йи!е).

В соответствии со способом, по существу, аналогичным описанному выше, соединение примера 16 приводило к статистически значимому увеличению медианной выживаемости (по сравнению с животными, которым вводили носитель) в следующих дозировках: 40 мг/кг с.|б, 80 мг/кг с.|б и 80 мг/кг с.|2б (см. табл. 5), что, таким образом, подтверждало, что соединение примера 16 способно проникать через гематоэнцефалический барьер и обладает сильной ингибирующей активностью в организме в модели ортотопических ксенотрансплантатов в мозг.

Таблица 5

Средняя и медианная выживаемость (в днях), достигаемая при введении соединения примера 16

Группа лечения	Средняя выживаемость (дни)	СКО (дни)	Значение р Ъодранг	Медианная выживаемость (дни)
Носитель РО ςά	25,1	2,8	-	27
РО 20 мг/кг ςά	29,8	0,7	0,5	31
РО 40 мг/кг сН	34, 3	1,7	0,0316	37
РО 80 мг/кг дс1	36, 9	1,3	0,0006	37
Носитель РО д26	23,0	3, 5	-	24
РО 80 мг/кг д2Н	33, 0	1,2	0,0295	34

В отдельном эксперименте для определения содержания соединения в плазме и мозге самцам крыс линии Спрег-Доули, не носящим опухоль, перорально вводили единичную дозу соединения примера 16, равную 30 мг/кг. Для определения концентраций в плазме и мозге через 48 ч отбирали образцы. Животных умерщвляли и собирали цельную кровь при помощи пункции сердца, выделяли плазму при помощи центрифугирования. Полностью извлекали мозг и замораживали в жидком азоте.

Получали образцы мозга при помощи гомогенизирования в смеси 80% метанол/20% вода. К образцам плазмы и гомогенатов мозга для осаждения белка добавляли внутренний стандарт в смеси ацетонитрил/метанол (1:1, об./об.) и образцы центрифугировали перед проведением анализа. Надосадочные жидкости анализировали при помощи инъекции и быстрого градиентного элюирования на колонке Т-кейп Ве!а811 С18 (20x2,1 мм картридж, подвижная фаза А: вода/1 М ХН₄НСО₃, 2000:10 об./об., подвижная фаза В: МеОН/1 М ЫН₄НСО₃, 2000:10 об./об.). Элюированные определяемые вещества детектировали при помощи ЖХ-МС-МС анализа с применением масс-спектрометра с тройным квадруполем 8с1ех АР1 4000.

- 35 018808

Концентрации соединений в плазме или мозге определяли при помощи стандартов, полученных в идентичных условиях.

В данном исследовании концентрации в плазме и мозге определяли в группах из трех крыс для каждого значения времени (см. табл. 6а и 6Ь) и применяли для вычисления площади под кривой концентрация в плазме/время или концентрация в мозге/время в диапазоне от 0 до 48 ч. Определение отношения содержания в мозге с применением площади под кривой (ЛИС) или максимальных концентраций в плазме и мозге (С_тах), см. табл. 6с, подтверждало, что соединение хорошо распространяется в мозг, причем отношение содержания в мозг/плазма составляет примерно 1. Максимальные концентрации (Т_тах) определяли в точке 4 ч. Указанные эксперименты показывают, что соединение примера 16 способно проникать через гематоэнцефалический барьер и хорошо распространяться в мозг. С другой стороны, авторы настоящего изобретения определили, что предпочтительное соединение, представленное в \νϋ 03/062236 (6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Нпиридо[2,3-б]пиримидин-7-он), обладает значениями отношения содержания в мозге:плазме, равными 0,17 (ЛИС) и 0,1 (С_тах), полученными в аналогичном исследовании, что показывает, что соединение относительно плохо распространяется в мозговую ткань в указанной модели.

Таблица 6а

Концентрации в плазме соединения примера 16 (нг/мл), определенные для самцов крыс линии 8Ό

Время (ч)	2	4	24	48
Среднее значение	1014	1504	1018	972,0
СКО	288,0	134, 8	236,2	666, 0
% СУ	28,4	9,0	23,2	68,5
η	3	3	3	3

Таблица 6Ь

Концентрации в мозге соединения примера 16 (нг/г), определенные для самцов крыс линии 8Ό

Время (ч)	2	4	24	48
Среднее значение	758,5	1500	992,4	718,0
СКО	82,38	268,9	54, 83	232,0
%СТ	10,86	17,93	5,525	32,31
η	3	3	3	3

Таблица 6с

Среднее содержание соединения примера 16 в плазме и мозге, определенное для самцов крыс линии 8Ό

Параметр	Ед. измерения	Плазма	Мозг	Отношение мозг/плазма
АОС	нг*час/мл или нг*час/г	52300	47900	0,92
дис Интервал		(0-48 часов)	(0-48 часов)
Стах	нг/мл или нг/г	1500	1500	1,0
Ттах	часы	4,00	4,00

Комбинированные исследования с темозоломидом.

Выращивали ксенотрансплантаты И87МС для подкожного введения и проводили измерения, аналогичные представленным выше. Соединение примера 16 входило в состав, который вводили в соответствии с представленным выше описанием, перорально один раз в день в течение дней 11-31. Темозоломид (8с11еппд Согрогайои) входил в состав с 1% (мас./об.) гидроксиэтилцеллюлозы/0,25% (об./об.) полисорбата 80 в очищенной воде, состав вводили в виде интраперитонеальной инъекции на 11 и 18 день. Сравнение активности индивидуального темозоломида и комбинированного лечения с соединением примера 16 представлено в табл. 7. Рост опухоли анализировали при помощи двухфакторного анализа взаимодействия; логарифмированные размеры опухолей анализировали при помощи дисперсионного анализа повторяющихся измерений (ΑΝΟνΑ) с применением модели пространственной корреляции 8Α8. версия 9.1 (Сагу, ΝΟ). Для определения эффектов лечения и эффекта взаимодействия между двумя лекарственными средствами применяли 2x2 факторную структуру. Эффект взаимодействия исследовали

- 36 018808 на всем временном интервале (полное исследование) и для каждой временной точки. Увеличенное ингибирование роста опухоли, наблюдаемое в группах с комбинированной терапией, по сравнению с группами, которым вводили индивидуальный темозоломид, показывает, что темозоломид и соединение примера 16 проявляют сильную противоопухолевую активность в организме в модели подкожного ксенотрансплантата опухоли глиобластомы.

Таблица 7

Исследование комбинации соединения примера 16 и темозоломида в модели ксенотрансплантата И87МС

Способ лечения	Размер опухоли (мг) в конце дозирования (день 31)	СКО (мг)	Значение Р
Носитель, 0.2 мл, РО, 40x21/1% ГЭЦ+0,1% АЕ в 25 мМ фосфатного буфера, рН 2	456,54	169,3	Контр.
Темозоломид, 3 мг/кг, ΙΡ, Я7бх2	101,88	44,16	Чг Чг
Соединение Примера 16, 50 мг/кг, РО, Чбх21/темозоломид, 3 мг/кг, ΙΡ, д7<1х2	30,22	7,57	Чс * Ч?

Определение размера опухоли. Значение р представляет собой статистическую значимость по сравнению с контрольной группой носителей (контр.) в день измерения.

**0,001<р<0,01; ***р<0,001.

Выращивали ксенотрансплантаты И87МС для ортотопического введения в мозг и проводили определение выживаемости в соответствии с представленным ранее описанием. Группам животных вводили темозоломид (ТМ2) или комбинацию соединения примера 16 (ежедневно или через день) с темозоломидом. Как показано в табл. 8, увеличение средней выживаемости в группах с комбинированной терапией по сравнению с группами, которым вводили индивидуальный темозоломид, показывает, что темозоломид и соединение примера 16 в комбинации обладают сильной ингибирующей активностью в организме в модели ортотопического введения ксенотрансплантата опухоли глиобластомы. Отсутствие смертности и потери массы тела (см. табл. 9) для комбинированного лечения показывает, что соединение примера 16 и темозоломид являются хорошо переносимыми и не вызывают чрезмерной токсичности.

Таблица 8

Средняя и медианная выживаемость (в днях), достигаемая при введении соединения примера 16 в комбинации с темозоломидом

Способ лечения	Средняя выживаемость (дни)	СКО (ДНИ)	Значение р Ьодранг	Медианная выживаемость (дни)
Носитель РО 1 мл/кг ςάκ20	28,1	1,9		30
Темозоломид (ΤΜΖ) ΙΡ 3 мг/кг (дни би 13)	46, 9	3,3	<0,0001	47
Соединение Примера 16 40 мг/кг ςάχ20+ΤΜΞ ΙΡ 3 мг/кг (Дни 6 и 13)	60,1	3,6	0,0002	61

- 37 018808

Соединение Примера 16 40 мг/кг ц2с1х10 + ТМ2 ΙΡ 3 мг/кг (Дни 6 и 13)

70,5

4,4

0,0032

70

Таблица 9

Смертность и масса тела животных в исследовании темозоломида/соединения примера 16

Способ лечения	Максимальная потеря массы тела (%)	Количество мертвых животных/общее количество животных
Носитель, 0,2 мл, РО, дс1х21/1% ГЭЦ+0,1% ΆΓ в 25 мМ фосфатном буфере, рН 2	0	0/8
Темозоломид, 3 мг/кг, ΙΡ, ς7άχ2	-1	0/8
Соединение Примера 16, 50 мг/кг, РО, дс!х21/темозоломид, 3 мг/кг, ΙΡ, ς7άχ2	“1	0/8

Комбинированные исследования с гемцитабином.

Выращивали ксенотрансплантаты са1и-6 (легкие) для подкожного введения и проводили измерения, аналогично описанным выше. Гемцитабин входил в состав с солевым раствором (0,9% хлорида натрия в очищенной воде), состав вводили при помощи интраперитонеальной инъекции с.|3йх7. Исследуемое соединение вводили с.|йх21. Сравнение активности индивидуального гемцитабина и комбинированной терапии с применением гемцитабина и соединения примера 16 представлено в табл. 10. Рост опухоли анализировали при помощи двухфакторного анализа взаимодействия. Увеличенное ингибирование роста опухоли, наблюдаемое в группах с комбинированной терапией по сравнению с группами, которым вводили индивидуальный гемцитабин, показывает, что лекарственные средства в комбинации проявляли сильную противоопухолевую активность в организме в модели ксенотрансплантата рака легких для подкожного введения. Низкая смертность и количество случаев потери массы тела для комбинированной терапии показывают, что гемцитабин и соединение примера 16 являются хорошо переносимыми и не вызывают чрезмерной токсичности (см. табл. 11).

Таблица 10

Исследование комбинации соединения примера 16 и гемцитабина в модели ксенотрансплантата са1и-6

Способ лечения	Размер опухоли (мг) в конце дозирования (день 38}	ско (мг)	Значение Р
Носитель, 1% ГЭЦ в 25 мМ фосфатном буфере рН 2, 0, 2 мл, РО, дс!х21/солевой раствор, 0,2 мл, ΙΡ, дЗс1х7	949,73	202,66	Контр.
Гемцитабин, 60 мг/кг, ΙΡ, чЗбх7	509,18	64,89	* *
Соединение Примера 16, 50 мг/кг, РО, д<1х21/Гемцитабин, 60 мг/кг, ΙΡ, дЗс!х7	234,94	30,86

Определение размера опухоли.

Значение р представляет собой статистическую значимость по сравнению с контрольной группой носителей (Контр.) в день измерения.

**0,001<р<0,01; ***р<0,001.

- 38 018808

Таблица 11

Смертность и масса тела животных в исследовании гемцитабина/соединения примера 16

Способ лечения	Максимальная потеря массы тела (%)	Количество мертвых животных/общее количество животных
Носитель, 1% ГЭЦ в 25 мМ фосфатном буфере рН 2, 0,2 мл, РО, дс1х21/солевой раствор, 0,2 мл, ΙΡ, дЗбх7	0	0/7
Соединение Примера 16, 50 мг/кг, РО, 4άχ21/Гемцитабин, 60 мг/кг, ΙΡ, дЗйх7	-14	1/7
Гемцитабин, 60 мг/кг, ΙΡ, дЗйх7	-12	0/7

Оральное введение соединений согласно настоящему изобретению является предпочтительным. Внутривенное введение соединений согласно настоящему изобретению также является предпочтительным. В зависимости от условий можно применять другие способы введения, которые даже могут быть предпочтительными. Например, трансдермальное введение может хорошо подходить пациентам, которые являются забывчивыми или недовольны принятием пероральных лекарственных средств. Соединения согласно настоящему изобретению также можно вводить при помощи подкожного, внутримышечного, интраназального или ректального способа введения при конкретных обстоятельствах. Способ введения может быть изменен любым образом, ограниченным физическими свойствами лекарственных средств, удобством для пациента и лица, ухаживающего за пациентом, и другими имеющими значение обстоятельствами (ЯсттдХоп'к РйагтассиБса1 8с1спсс5, 18'¹' Εάίίίοη, Маск РиЫМнпд Со. (1990)).

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы

   К²

   ГО , где Я¹ представляет собой С₃-С₅-алкил, С₃-С₅-циклоалкил или циклопропилметил;

   Я² и Я³ представляют собой Н или фтор, причем по меньшей мере один из Я² или Я³ представляет собой фтор;

   Я⁴ представляет собой Н или СН₃;

   Я⁵ представляет собой С1-С6-алкил или -ЫЯ⁶Я⁷, причем Я⁶ и Я⁷ представляют собой С1-С3-алкил;

   О представляет собой СН₂, О, 8 или прямую связь;

   и Υ представляют собой С или Ν, причем по меньшей мере один из или Υ представляет собой Ν, при этом если О представляет собой О или 8, то представляет собой С, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, в котором Я¹ представляет собой изопропил, циклопропил, циклопентил или циклопропилметил.
3. 3. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, в котором каждый из Я² и Я³ представляет собой фтор.
4. 4. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, в котором Я⁴ представляет собой Н.

   - 39 018808
5. 5. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, в котором К⁵ представляет собой С1-Сэ-алкил.
6. 6. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, в котором р представляет собой СН2.
7. 7. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, в котором У представляет собой Ν.
8. 8. Соединение по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из

   - 40 018808

   - 41 018808 или его фармацевтически приемлемая соль.
9. 10. Соединение по любому из предыдущих пунктов, которое представляет собой мезилатную соль.
10. 11. Кристаллическая форма III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина, характеризующаяся порошковой дифракционной рентгенограммой (излучение СиКа, λ=1,54056 А), содержащей пик при 21,29 (2θ±0,1°) и, необязательно, один или более пиков, выбранных из группы, содержащей 11,54, 10,91 и 12,13 (2θ±0,1°).
11. 12. Кристаллическая форма III [5-(4-этилпиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил]-[5-фтор-4-(7-фтор-3изопропил-2-метил-3Н-бензимидазол-5-ил)пиримидин-2-ил]амина по п.11, которая дополнительно характеризуется спектром ¹³С ЯМР, содержащим пики с химическими сдвигами ν (Р1) [ррт] при 112,7, 127,3 и 129,4.
12. 13. Фармацевтический состав, ингибирующий активность С'1)К4/6 или Р1ш-1 киназ, содержащий соединение по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически при

    - 42 018808 емлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
13. 14. Фармацевтический состав, ингибирующий активность СОК4/6 или Р1т-1 киназ, содержащий соединение по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемую соль совместно с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости, в сочетании с другими терапевтическими ингредиентами.
14. 15. Применение соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения заболевания или нарушения, характеризующегося аномальной пролиферацией клеток.
15. 16. Применение соединения по любому из пп.1-12 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака груди, рака легких, рака простаты, глиобластомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, хронической миелоидной лейкемии и острой миелоидной лейкемии.