DE69331757T2 - Klonieren und Expression von Restriktionsendonukleasen und Modifikationsmethylasen von Karyophanon - Google Patents
Klonieren und Expression von Restriktionsendonukleasen und Modifikationsmethylasen von KaryophanonInfo
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Description
- Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Gentechnologie und Molekularbiologie. Die Erfindung ist auf eine isolierte DNA-Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche ClaI-Restriktionsendonuklease kodiert, gerichtet. Diese Erfindung ist speziell auf rekombinante Wirte und Vektoren gerichtet, die die isolierte DNA, die die Restriktionsendonuklease ClaI und deren entsprechende Methylase kodiert, enthalten. Diese Erfindung ist auch auf die klonierte Modifizierungsmethylase gerichtet.
- Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, die in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen natürlicherweise vorkommen. Wenn Restriktionsendonukleasen von anderen verunreinigenden Zellbestandteilen gereinigt werden, können die Enzyme im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in einer spezifischen und vorhersagbaren Weise zu spalten. Folglich haben sich Restriktionsendonukleasen bei der modernen genetischen Forschung als unverzichtbare Werkzeuge erwiesen.
- Restriktionsendonukleasen spalten DNA, indem sie bestimmte Abfolgen oder Sequenzen von Nukleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls erkennen und daran binden. Die Enzyme spalten beide Stränge des DNA-Moleküls innerhalb oder an einer Seite dieser Erkennungssequenz.
- Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen weisen Affinität für unterschiedliche Erkennungssequenzen auf. Bislang sind ungefähr 100 Arten unterschiedlicher Restriktionsendonukleasen aus vielen Mikroorganismen isoliert worden, wobei jede durch die spezielle Basensequenz, die sie erkennt, und durch das Spaltungsmuster, das sie zeigt, identifiziert wird. Zusätzlich ist eine Anzahl von Restriktionsendonukleasen, die als Restriktionsendonuklease- Isoschizomere bezeichnet werden, aus unterschiedlichen Mikroorganismen isoliert worden, die tatsächlich die gleiche Erkennungssequenz wie jene Restriktionsendonukleasen, die bereits zuvor identifiziert worden sind, erkennen. Diese Isoschizomere können jedoch die gleiche Phosphodiesterbindung wie die zuvor identifizierte Endonuklease spalten oder nicht.
- Modifizierungsmethylasen sind zu deren entsprechenden Restriktionsendonukleasen komplementär, indem sie die gleiche Erkennungssequenz erkennen und daran binden. Im Gegensatz zu den Restriktionsendonukleasen modifizieren die Modifizierungsmethylasen jedoch bestimmte Nukleotide innerhalb der Erkennungssequenz chemisch durch die Hinzufügung einer Methylgruppe. Nach dieser Methylierung wird die Erkennungssequenz durch die Restriktionsendonuklease nicht länger gebunden oder gespalten. Folglich dienen Methylasen in der Natur einer Schutzfunktion, d. h. um die DNA eines Organismus, der sein entsprechendes Restriktionsenzym produziert, zu schützen.
- Restriktionsenzyme und Modifizierungsmethylasen können aus dem Wirtsorganismus gereinigt werden, indem große Mengen von Zellen gezüchtet werden, die Zellwände lysiert werden und das spezielle Enzym von den anderen Wirtsproteinen durch umfängliche Säulenchromatographie gereinigt wird. Jedoch ist die Menge an Reastriktionsenzym bezogen auf jene der anderen Wirtsproteine üblicherweise recht gering. Folglich ist die Aufreinigung von großen Mengen von Restriktionsenzymen oder Methylasen durch dieses Verfahren arbeitsaufwändig, ineffizient und unwirtschaftlich.
- Ein alternatives Verfahren zum Herstellen von großen Mengen von Restriktions- und Modifizierungsenzymen besteht darin, die die gewünschten Enzyme kodierenden Gene zu klonieren und die Enzyme in einem gut untersuchten Organismus, wie Escherichia coli (E. coli) überzuexprimieren. Auf diese Weise kann die Menge von Restriktions- und Modifizierungsenzymen bezogen auf jene der Wirtsproteine substantiell erhöht werden. Die erste Klonierung eines DNA-Endonukleasegens wurde von Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978) beschrieben. Seit damals sind mehr als siebzig DNA- Methylasen und Restriktionsendonukleasen kloniert worden. Bislang ist die Hauptzahl der Restriktionsendonukleasegene eng mit deren entsprechenden Methylasegenen verbunden.
- Das Dokument "Nucleic Acid Research", 1981, 9 (19, S. 4833-4845) offenbart eine rohe Präparation mit ClaI-Aktivität, einer ortsspezifischen Endonukleaseaktivität aus Caryophanon Latum, die frei von jeglicher unspezifischer Nukleaseaktivität ist. Jedoch offenbart dieses Dokument nicht das gereinigte, zum Klonieren geeignete Restriktionsenzym oder das dieses Enzym kodierende klonierte Gen. Darüber hinaus offenbart das Dokument keine Methylierungsaktivität, keine Methylase oder ein die Methylase kodierendes Gen.
- Die Patentanmeldung WO-A-9 118 916 offenbart einen rekombinanten Wirt, der verschiedene Typ II-Restriktionsendonuklease- und/oder Modifizierungsmethylasegene enthält und exprimiert. Das Dokument erwähnt das ClaI-Restriktions-Modifizierungs-System und/oder Verfahren zum Klonieren desselben nicht.
- Restriktions-Modifizierungs-Systeme können durch mehrere Verfahren kloniert werden. Verschiedene Endonuklease- und Methylasegene sind ausgehend von endogenen Plasmiden kloniert worden: Eco- RII (Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717-718 (1980)), EcoRI (Newman et al., J. Biol. Chem. 256: 2131-2139 (1981)), Greene et al., J. Biol. Chem. 256: 2143-2153 (1981)), EcoRV (Bougueleret et al., Nucl. Acids Res. 12: 3659-3676 (1984)), PvuII (Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985)), KpnI (Hammond et al., Gene 97: 97-102 (1990)), und PaeR71 (Gingeras et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983)). Ein alternatives Klonierungsverfahren ist die Phagen-Restriktionsmethode, bei der Bakterienzellen, die klonierte Restriktions- und Modifizierungsgene enthalten, eine Phageninfektion überleben (Mann et al., a.a.O.; Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci: U.S.A. 78: 1503-1507 (1981); Rodicio et al., Mol. Gen. Genet. 213: 346-353 (1988)). Eine andere Vorgehensweise basiert auf dem Methylierungs-Schutz und ist von Mann et al., a.a.O., und Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980), vorgeschlagen worden. Dieses letztgenannte Schema umfasst einen Verdau einer Plasmidbibliothek mit dem zu klonierenden Restriktionsenzym. Nur jene Plasmide mit DNA-Sequenzen, die durch die entsprechende Methylase modifiziert worden sind, werden gegenüber einem Verdau resistent sein und werden in einem geeigneten Wirt Transformanten produzieren. Diese Selektionsmethode ist verwendet worden, um Endonuklease- und Methylasegene zusammen zu klonieren wie auch um Methylasegene allein zu klonieren (Szomolanyi et al., a.a.O.; Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982) Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235- 1241 (1983); Kiss et al., Gene 21: 111-119 (1983) Wilson, Gene 74: 281-289 (1988)). Jedoch liefert diese Technik manchmal nur das Methylasegen, sogar obwohl das Endonukleasegen und das Modifizierungsgen eng verbunden sind.
- Es ist ein Mehrschritt-Ansatz erforderlich gewesen, um bestimmte Restriktions-Modifizierungssysteme in E. coli zu klonieren, einschließlich DdeI (Howard et al., Nucl. Acids Res. 14: 7939-7950 (1989)), BamHI (Brooks et al., Nucl. Acids Res. 17: 979-997 (1989)), KpnI (Hammond et al., a.a.O.) und ClaI (hier offenbart). In jedem Falle war ein Schutz des Wirts mit einer auf einem Plasmid exprimierten Methylase erforderlich, um einen kompatiblen Vektor, der das funktionsfähige Endonukleasegen enthielt, zu stabilisieren. Wilson, a.a.O., hat ein Modell vorgeschlagen, um zu erklären, warum bestimmte Restriktions-Modifizierungssysteme unter Einsatz eines geschützten Wirts kloniert werden müssen. Dieses Modell schlägt vor, dass, um ein Plasmid zu etablieren, das ein Restriktions-Modifizierungs-System enthält, ein Methylase-Schutz mit einer Rate, die größer als die Rate das Endonukleaseverdaus ist, auftreten muss. Andernfalls würden Restriktionsenzyme unmethyliertes Plasmid und/oder unmethylierte genomische DNA spalten und das Plasmid abbauen und/oder den Wirt töten. Obwohl dieses Modell eine plausible Erklärung der Plasmid- Etablierung ist, muss noch ermittelt werden, ob eine fortgesetzte unabhängige Expression von Methylase ausgehend von einem separaten Plasmid erforderlich ist, um das das Restriktions- Modifizierungs-System enthaltende Plasmid während der Zellvermehrung und Replikation aufrechtzuerhalten.
- Der Gegenstand der Erfindung bestand darin, Mittel bereitzustellen, um ClaI-Enzym in hohen Mengen zu erhalten.
- Die Erfindung ist auf eine isolierte DNA-Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche ClaI-Restriktionsendonuklease kodiert, und eine isolierte DNA-Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche ClaI-Modifizierungsmethylase kodiert, gerichtet.
- Die Erfindung ist ferner auf Vektoren, die eine isolierte DNA- Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche ClaI-Restriktionsendonuklease/Modifizierungsmethylase kodiert, umfassen, gerichtet. Die Erfindung ist ferner auf rekombinante Wirtszellen gerichtet, die eine isolierte DNA-Sequenz/einen Vektor, die bzw. der aus Caryophanon erhältliche ClaI-Restriktionsendonuklease/Modifizierungsmethylase kodiert, umfassen, gerichtet.
- Die Erfindung ist ferner auf Verfahren zum Gewinnen von ClaI- Restriktionsendonuklease/Modifizierungsmethylase gerichtet. Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung wird die Restriktionsendonuklease und/oder Modifizierungsmethylase produziert, in dem eine rekombinante Wirtszelle, die eine isolierte DNA-Sequenz, die ClaI-Restriktionsendonuklease/Modifizierungsmethylase kodiert, umfasst, kultiviert wird und aus dem rekombinanten Wirt Enzyme isoliert werden.
- Fig. 1 zeigt schematische Karten der Vektoren pCP13, pBluescript KS, pUC-Kam, pCPClaIM1 und pCPClaIM6. Die Figur zeigt auch die Lage der Plasmidgene, die Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin (Kmr), Ampicillin (Apr) und Tetracyclin (Tcr) vermitteln, wie auch die Lage der kohäsiven Enden (COS) in pCP13. Die Größe jedes Vektors ist in Kilobasen (kb) angegeben.
- Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte von C. latum-DNA in der Region des ClaI-Restriktions-Modifizierungs-Systems und der ausgehend von dieser Region abgeleiteten Klone. Die Figur zeigt auch die Lage von "Sonde A"-DNA-Sequenzen. Schrägstriche (//) zeigen an, dass die DNA-Moleküle nicht in ihrer Gänze gezeigt sind und sich über den Umfang des Diagramms hinaus erstrecken.
- In der folgenden Beschreibung werden verschiedene Begriffe, die im Rahmen der Technik der in vitro-DNA-Rekombination verwendet werden, umfänglich eingesetzt. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des Umfangs, der solchen Begriffen gegeben werden soll, sicherzustellen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
- Klonierungsvektor. Ein Plasmid oder eine Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, sich in einer Wirtszelle autonom zu replizieren, und die durch eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen, an der bzw. an denen solche DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors geschnitten werden können, gekennzeichnet ist und in die ein DNA- Fragment gespleißt werden kann, um dessen Replikation und Klonierung zu ermöglichen. Der Klonierungsvektor kann ferner einen für eine Verwendung bei der Identifizierung von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen geeigneten Marker enthalten.
- Marker stellen beispielsweise Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bereit.
- Expressionsvektor. Ein einem Klonierungsvektor ähnlicher Vektor, der aber in der Lage ist, die Expression eines Gens, das in diesen kloniert worden ist, nach einer Transformation eines Wirts zu verstärken. Das klonierte Gen wird üblicherweise unter die Kontrolle von (d. h. funktionsfähig damit verknüpften) bestimmten Kontrollsequenzen, wie Promotorsequenzen, gestellt.
- Im wesentlichen rein. Bedeutet, wie hier verwendet, dass das gewünschte gereinigte Enzym im wesentlichen frei von verunreinigenden Zellbestandteilen, wobei die Bestandteile in der Natur mit dem gewünschten Enzym assoziiert sind, ist, wie durch eine einzelne Bande nach einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese nachgewiesen wird. Verunreinigende Zellbestandteile können Phosphatasen, Exonukleasen oder andere unerwünschte Endonukleasen umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
- Restriktionsendonuklease-Isoschizomer. Ein Restriktionsendonuklease-Isoschizomer ist ein Begriff, der verwendet wird, um eine Gruppe von Restriktionsendonukleasen zu bezeichnen, die die gleiche Erkennungssequenz erkennen und an diese binden, aber aus unterschiedlichen mikrobiellen Quellen isoliert werden. Restriktionsendonuklease-Isoschizomere können an genau demselben Ort wie die Restriktionsendonuklease, mit der sie verglichen wird, spalten oder nicht.
- Modifizierungsmethylase-Isoschizomer. Ein Modifizierungsmethylase-Isoschizomer ist ein Begriff, der verwendet wird, um eine Gruppe von Modifizierungsmethylasen zu bezeichnen, die die gleiche Erkennungssequenz erkennen, aber aus unterschiedlichen mikrobiellen Quellen isoliert werden. Modifizierungsmethylase- Isoschizomere können die gleichen Nukleotide innerhalb der Erkennungssequenz wie die Restriktionsendonuklease, mit der sie verglichen wird, chemisch modifizieren oder nicht.
- Erkennungssequenz. Erkennungssequenzen sind bestimmte DNA- Abfolgen oder -Sequenzen, die eine Restriktionsendonuklease oder eine Modifizierungsmethylase erkennt und bindet. Erkennungssequenzen sind typischerweise vier bis sechs (und in einigen Fällen acht) Nukleotide lang mit einer zweifachen Symmetrieachse.
- Rekombinanter Wirt. Gemäß der Erfindung kann ein rekombinanter Wirt ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Mikroorganismus sein, der die gewünschten klonierten Gene auf einem Expressionsvektor oder Klonierungsvektor enthält. Dieser Begriff soll auch jene Mikroorganismen umfassen, die gentechnisch modifiziert worden sind, so dass sie das oder die gewünschte(n) Gen(e) in dem Chromosom oder Genom von jenem Organismus enthalten. Der Begriff "rekombinanter Wirt soll nicht den Caryophanon-Wildtypstamm, der ClaI produziert, umfassen.
- Rekombinanter Vektor. Ein jeglicher Klonierungsvektor oder Expressionsvektor, der das oder die gewünschte(n) klonierte(n) Gen(e) enthält.
- Wirt. Ein jeglicher prokaryotischer oder eukaryotischer Mikroorganismus, der der Empfänger eines replizierbaren Expressionsvektors oder Klonierungsvektors ist. Ein "Wirt", wie der Begriff hier verwendet wird, umfasst auch prokaryotische oder eukaryotische Mikroorganismen, die durch wohlbekannte Techniken gentechnisch so modifiziert werden können, dass sie ein oder mehrere gewünschte(s) Gen(e) auf dessen Chromosom oder Genom enthalten. Für Beispiele solcher Wirte siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).
- Promotor. Eine DNA-Sequenz, die im allgemeinen als die 5'-Region eines Gens, die sich in der Nähe des Startcodons befindet, beschrieben wird. Die Transkription eines benachbarten Gens oder mehrerer benachbarter Gene wird an der Promotorregion initiiert. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, nimmt die Transkriptionsrate dann in Reaktion auf ein induzierendes Mittel zu. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsrate nicht durch ein induzierendes Mittel reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
- Gen. Eine DNA-Sequenz, die Information enthält, die für das Exprimieren eines Polypeptids oder Proteins benötigt wird.
- Strukturgen. Eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wird, die dann in eine Sequenz von Aminosäuren, die für ein spezielles Polypeptid charakteristisch ist, translatiert wird.
- Expression. Expression ist der Prozess, durch welchen ein Polypeptid ausgehend von einem Strukturgen produziert wird. Dar Prozess umfasst eine Transkription des Gens in mRNA und die Translation solcher mRNA in ein oder mehrere Polypeptid(e).
- Die Nomenklatur zum Benennen von Restriktionsendonukleasen stimmt mit dem Vorschlag von Smith et al., J. Mol. Biol. 81: 419- 423 (1973), überein. Kurz zusammengefasst, bezeichnet der erste Buchstabe "C" von ClaI die Gattung "Caryophanon", während die kleinen Buchstaben "la" die Spezies "latum" bezeichnen. Folglich wurde der Originalstamm, von dem gefunden wurde, dass er ClaI produziert, als Caryophanon latum ("BRL 240") bezeichnet.
- Die Erfindung ist auf isolierte DNA-Sequenzen gerichtet, die die Typ-II-Restriktionsendonuklease ClaI kodieren. ClaI erkennt die palindromische Sequenz 5' ATCGAT 3', wobei es ausgehend von dem 5'-Ende zwischen den Resten T und C spaltet, wodurch eine zwei Basen umfassende 5'-Verlängerung erzeugt wird. Die doppelsträngige Erkennungsstelle von ClaI ist folglich, wie folgt, gekennzeichnet:
- 5' AT↓CG AT 3'
- 3' TA GC↓TA 5'
- (worin A für Desoxyadenosin steht, T für Desoxythymidin steht; G für Desoxyguanosin steht und C für Desoxycytidin steht).
- Diese Erfindung ist des weiteren auf isolierte DNA-Sequenzen gerichtet, die die Modifizierungsmethylasegene, die zu der ClaI- Restriktionsendonuklease komplementär sind, kodieren. Diese Methylasen modifizieren bestimmte Nukleotide mit der Erkennungssequenz durch die Hinzufügung einer Methylgruppe chemisch, was die modifizierte Basensequenz folglich gegenüber einer Spaltung durch die komplementäre Restriktionsendonuklease resistent macht.
- Durch diese Erfindung werden auch rekombinante Wirte, die isolierte DNA-Sequenzen enthalten, die die Restriktionsendonuklease und Modifizierungsmethylase der Erfindung kodieren, bereitgestellt. Verfahren zum Herstellen der Enzyme der Erfindung werden ebenfalls offenbart.
- Die Restriktionsendonuklease (ClaI) und deren entsprechende Modifizierungsmethylase können aus einem beliebigen Stamm von C. latum erhalten werden. Isoschizomere dieser Enzyme kodierende Gene können aus einer jeglichen Gattung, einschließlich Arthrobacter, Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Caryophanon, Klebsiella, Micrococcus, Xanthomonas, Nocardia, Pseudomonas, Salmonella und Streptomyces, aber nicht auf diese beschränkt, erhalten werden. Die bevorzugte Gattung, um Isoschizomere der Restriktionsendonuklease der Erfindung zu isolieren, ist Caryophanon.
- Ein jeglicher Stamm von Caryophanon, der in der Lage ist, Restriktionsendonuklease-Isoschizomere von ClaI zu produzieren, kann für den Zweck dieser Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann Caryophanon tenue verwendet werden, um die Gene, die die Restriktionsendonuklease-Isoschizomere von ClaI exprimieren, zu erhalten. Restriktionsendonuklease-Isoschizomere von ClaI können auch aus Bacillus aneurinolyticus (BanIII), Bacillus subtilus (BstI), Achromobacter-Spezies (Asp7071) oder Bacillus- Spezies (BscI) erhalten werden.
- Die bevorzugte Spezies, um das das Enzym der Erfindung kodierende Gen zu erhalten, ist Caryophanon latum, wie in den Beispielen beschrieben wird.
- ClaI und ClaI-Methylase werden vorzugsweise erhalten, indem die die Enzyme kodierenden Gene aus Caryophanon latum isoliert werden und diese dann kloniert und exprimiert werden. Im Rahmen dieser Erfindung versteht sich, dass Isoschizomere der Restriktionsendonukleasen und Modifizierungsmethylasen der Erfindung kodierende Gene aus einem jeglichen Mikroorganismus, einschließlich der Gattung Caryophanon, unter Verwendung der hier beschriebenen Rekombinationstechniken erhalten werden können.
- DNA-Moleküle, die ClaI und ClaI-Methylase oder Isoschizomere davon kodieren, können durch Rekombination in einen Klonierungsvektor eingebracht werden und in eine Wirtszelle eingeschleust werden, um die Expression der Restriktionsendonuklease oder Modifizierungsmethylase durch jene Zelle zu ermöglichen. DNA- Moleküle können durch Rekombination mit Vektor-DNA verknüpft werden gemäß herkömmlichen Techniken, einschließlich Restriktionsverdau, um passende Termini bereitzustellen, Auffüllen von kohäsiven Enden, wie angebracht, alkalische Phosphatase-Behandlung, um unerwünschte Verknüpfungen zu vermeiden, und Ligation mit geeigneten Ligasen.
- Die Erfindung umfasst die Expression der gewünschten Restriktionsendonuklease und Modifizierungsmethylase in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Eukaryotische und prokaryotische Wirte, die zum Klonieren und Exprimieren der Enzyme der Erfindung verwendet werden können, sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Vektoren, die sich in solchen Wirtszellen replizieren, sind ebenfalls wohlbekannt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
- Bevorzugte prokaryotische Wirte umfassen Bakterien der Gattung Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Caryophanon u.s.w. Der am meisten bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse in der Erfindung umfassen E. coli K12 und DH10B (F&supmin;, araD139 Δ (ara, leu) 7697, ΔlacX74, galU, galK, mcrA, Δ(mrr hsd RMS mcrB), rpsL dor, φ 80d lacZ ΔM15, endA1, nupG, recA1).
- Es ist festgestellt worden, dass E. coli über mehrere Mechanismen (Restriktionssysteme) verfügt, um fremde DNA zu identifizieren und diese zu zerstören. Dies kann bei Klonierungsexperimenten ein signifikantes Problem sein, das zu einer verringerten Ausbeute an den gewünschten Sequenzen führt. Insbesondere ist festgestellt worden, dass E. coli Restriktionssysteme enthält, die DNA abbauen, wenn diese entweder an Cytosinresten oder Adeninresten methyliert ist. Speziell umfassen die wohlbekannten Methylcytosin-spezifischen Systeme mcrA (rglA) und mcrB (rglB) (Revel et al., Virology 31: 688-701 (1967); Raleigh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9074 (1986)). Das Methyladeninspezifische Restriktionssystem ist als mrr bezeichnet worden (Heitman et al., J. Bacteriol. 169: 3243-3250 (1987)). Folglich sind der bevorzugte Wirt zum Klonieren und Exprimieren der die Enzyme der Erfindung kodierenden Gene Wirte, in denen diese Typen von Restriktionssystemen durch Mutation oder Verlust inaktiviert worden sind.
- ClaI und ClaI-Methylase oder Isoschizomere davon werden vorzugsweise erhalten, indem die die Enzyme kodierenden Gene isoliert und diese dann kloniert und exprimiert werden. Vier unterschiedliche Techniken zum Isolieren und Klonieren von Restriktionsendonukleasen und Modifizierungsmethylasen sind in einem Übersichtsartikel von Wilson, Gene 74: 281-289 (1988) beschrieben worden. Die vier in dem Übersichtsartikel beschriebenen Methoden umfassen: (1) Subklonieren von natürlichen Plasmiden; (2) auf Phagenrestriktion basierende Selektion; (3) auf Vektormodifizierung, die einen Methylierungsschutz mit umfasst, basierende Selektion; und (4) Mehrschritt-Isolierung.
- Die Methylierungsschutz-Methode zum Klonieren von Restriktionsendonukleasegenen beruht auf der Nähe der Methylase- und Restriktionsenzymgene zueinander und auf der Expression beider Gene in der Wirtszelle, wie E. coli. Zuerst wird eine Bibliothek konstruiert, indem fragmentierte genomische DNA aus dem Herkunftsorganismus in einen Vektor ligiert wird. Für diese Bibliothek wählt man einen Vektor, der eine oder vorzugsweise mehrere Erkennungsstellen des Restriktionsenzyms, das man zu klonieren wünscht, aufweist. Vorzugsweise wird der Vektor pCP13 verwendet, um die Plasmidbibliothek zu konstruieren (Darzins, A. et al., J. Bacteriol. 159: 9-18 (1984)). Im allgemeinen werden Bibliotheksinserts hergestellt, indem die genomische DNA nur partiell verdaut wird, um einen Anteil von DNA-Fragmenten zu erhalten, die das intakte Gen von Interesse enthalten. Zweitens wird diese Bibliothek in einen geeigneten Wirt, wie E. coli, eingeschleust und vermehrt. Vektor-DNA, die nachfolgend aus diesen transformierten und vermehrten Zellen isoliert wird, wird als Plasmid- Bibliothek bezeichnet. Die Plasmid-Bibliothek ist eine Mischung von unterschiedlichen DNA-Molekülen, die praktisch alle möglichen Inserts aufweisen, und ist folglich repräsentativ für die meisten, wenn nicht alle DNA-Sequenzen, die in dem Herkunftsorganismus enthalten sind. Bei den Vektor/Insert-Kombinationen, die ein Methylasegen aufweisen, werden die Erkennungssequenzen innerhalb der Vektor/Insert-DNA und der chromosomalen DNA des Wirts methyliert sein, wenn die Methylase in dem verwendeten Wirt, vorzugsweise E. coli, exprimiert wird.
- Die isolierte Plasmid-Bibliotheks-DNA wird dann mit dem Restriktionsenzym verdaut. Unmethylierte Vektor/Insert-Kombinationen werden abgebaut und methylierte Kombinationen überleben die Endonukleasebehandlung. Die Endonuklease-behandelte DNA wird dann in eine frische Wirtszelle eingeschleust. Abgebaute Vektor/Insert-Kombinationen werden nicht etabliert. Methyl-geschützte Vektor/Insert-Kombinationen, die die Endonukleasebehandlung überlebten, können sich etablieren und in den neuen E. coli- Wirtszellen aufrechterhalten werden, wodurch Klone gebildet werden.
- Zellextrakte dieser Klone werden dann auf Restriktionsendonukleaseaktivität untersucht, um Klone zu identifizieren, die das gewünschte Restriktionsenzym exprimieren. Folglich können Gene für ein Methylase-Restriktions-System auf einem einzelnen rekombinanten DNA-Molekül kloniert werden mit der Maßgabe, dass das Restriktionsendonukleasegen mit dem Methylasegen eng verbunden ist.
- Es gibt eine Anzahl von Gründen, warum die obige Methode bei einem bestimmten Endonuklease-Methylase-System möglicherweise nicht funktioniert. (1) Die zwei Gene (Methylase und Endonuklease) sind möglicherweise nicht eng verbunden. In jenem Fall können beide Gene nicht auf demselben DNA-Fragment-Insert liegen. (2) Das klonierte Fragment könnte zufällig nur das Methylasegen enthalten. Beispielsweise könnte ein eng verbundenes Endonukleasegen inaktiviert sein, indem es durch das Restriktionsenzym, das die DNA-Bibliothek erzeugte, geschnitten worden ist. In ähnlicher Weise könnten die Methylase- und Endonukleasegene durch eine Spaltung an einer dazwischenliegenden Restriktionsstelle voneinander getrennt worden sein. (3) Das Expressionsniveau der Endonuklease könnte bezogen auf das Expressionsniveau der Methylase hoch sein. In dieser Situation zerstört die exprimierte Endonuklease die Vektor/Insert-Kombination und baut auch das oder die Chromosom(e) ab und kann die Wirtszelle möglicherweise töten, bevor die exprimierte Methylase die Wirts-DNA schützen kann. Alternativ könnte(n) eine oder mehrere Deletion(en), die zu dem Verlust eines Teils oder der Gesamtheit des Endonukleasegens aus der Vektor/Insert-Kombination führt bzw. führen, es dem Wirt ermöglichen, zu überleben. (4) Das Methylasegen wird in dem neuen Wirt möglicherweise nicht exprimiert, was zu einem Fehlen von Schutz von DNA vor der Endonuklease führt. (5) Das Endonukleasegen wird in dem neuen Wirt möglicherweise nicht exprimiert. In den Situationen (1) und (3) wird es, wenn die Endonuklease in dem Wirt exprimiert wird, keine Methylaseenzymaktivität geben, um DNA in der Wirtszelle zu schützen, und der Versuch, die Endonuklease zu klonieren, würde fehlschlagen.
- Überraschenderweise waren die üblichen Methoden zum Klonieren von Restriktionssystemgenen für das ClaI-Restriktions/Modifizierungs-System nicht erfolgreich. Hybridisierungsanalysen zeigten, dass die Struktur des aus genomischen Caryophanon latum-Bibliotheken isolierten ClaI-Methylasegens sich von der Struktur des ClaI-Methylasegens in dem C. latum-Chromosom unterschied. Eine Hypothese, die dieses unerwartete Ergebnis erklären könnte, bestand darin, dass das ClaI-Endonukleasegen mit dem ClaI-Methylasegen in dem C. latum-Chromosom eng verbunden war, dass aber die Endonukleasegenexpression für den Wirt toxisch war. In diesem Falle wären die einzigen Klone, die überleben würden, jene, in denen die Verbindung zwischen ClaI und ClaI-Methylase durch eine Umlagerung der DNA unterbrochen worden war. Folglich könnte ein intakter Klon der ClaI-Endonuklease- und -Methylasegene erhalten werden, wenn ClaI-Methylase in dem rekombinanten Wirt vorhanden wäre, bevor die genomische Bibliothek eingeführt wird.
- In der Erfindung wurde genomische DNA aus einem ClaI produzierenden Stamm von Caryophanon latum isoliert. Unter Verwendung von den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannten Standardtechniken wurde eine rekombinante DNA-Bibliothek konstruiert, wurde die Bibliothek in einen bakteriellen Wirt eingeschleust und wurden aus Wirtszellen DNA-Insert/Vektor-Moleküle isoliert.
- Ein Teil der ersten DNA-Bibliothek wurde mit ClaI verdaut und der resultierende DNA-Verdau wurde in frische Wirtszellen eingeschleust. Klone wurden selektiert und DNA-Proben dieser Klone wurden auf eine Resistenz gegen einen Verdau mit ClaI gescreent. Klone, die gegen ClaI resistente DNA enthielten, beherbergten Insert/Vektor-Kombinationen, die die ClaI-Methylase enthielten. Das ClaI-Methylasegen wurde dann in einen unterschiedlichen Vektor, der mindestens eine ClaI-Stelle enthielt, subkloniert und in einen bakteriellen Wirt eingeschleust. Die resultierenden Transformanten exprimieren ClaI-Methylase, aber nicht ClaI- Endonuklease.
- Eine zweite genomische Bibliothek wurde konstruiert, indem genomische C. latum-DNA in den rekombinanten Wirt, der den ClaI- Methylasevektor enthielt, eingeschleust wurde. Um Transformanten, die CiaI-Endonukleasegensequenzen enthielten, von Transformanten, die lediglich den schützenden ClaI-Methylasevektor enthielten, zu unterscheiden, war es notwendig, eine DNA-Sonde zu erzeugen, die DNA-Sequenzen kodiert, die an die ClaI-Methylasegensequenzen angrenzen, sich aber von diesen unterscheiden. Beispielsweise können Oligonukleotidsynthese- oder Polymerasekettenreaktionstechnologie verwendet werden, um Sonden mit Sequenzen, die der Sequenz in dem BamHI/Sau3AI-HindIII-Fragment von pBSClaIM6, die in pBSClaIM4 nicht vorhanden ist, entsprechen, herzustellen (Sonde A; Fig. 2). Eine geeignete DNA-Sonde wurde verwendet, um Transformanten zu identifizieren, die ein das ClaI-Endonukleasegen kodierendes Plasmid beherbergen. Zeilen, die diese Klone beherbergen, wurden dann auf ClaI-Endonukleaseaktivität untersucht.
- Obwohl die oben erläuterten Schritte die bevorzugte Weise zum praktischen Ausführen der Erfindung sind, wird für die Fachleute auf diesem Gebiet ersichtlich sein, dass der oben beschriebene Ansatz gemäß Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, variieren kann. Beispielsweise können diese Gensequenzen oder synthetischen Oligonukleotide von diesen Sequenzen, sind einmal die ClaI-Methylase und/oder -Restriktionsgene basierend auf den hier offenbarten Informationen kloniert, in Hybridisierungsexperimenten mit genetischem Material aus unterschiedlichen Organismen verwendet werden, um Klone zu erhalten, die diese Gene enthalten. Siehe Maniatis et al., a.a.O. Darüber hinaus kann ein Fachmann auf diesem Gebiet diese Sequenzen unter Verwendung von Standardhybridisierungstechniken einsetzen, um Gene zu isolieren, die Isoschizomere der ClaI-Restriktions- und -Modifizierungsenzyme kodieren, indem die Hybridisierungsstringenzen verändert werden.
- Sind einmal die gewünschten Restriktionsendonuklease- und Modifizierungsgene isoliert worden, existieren verschiedene DNA- Rekombinationsstrategien für eine verstärkte Produktion des gewünschten Proteins in eukaryotischen und prokaryotischen Wirten. Diese Strategien, die für die Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein werden, setzen Klonierungsvektoren mit hoher Kopienzahl, Expressionsvektoren, induzierbare Vektoren mit hoher Kopienzahl u.s.w. ein.
- Eine verstärkte Produktion der Restriktionsendonuklease und Modifizierungsmethylase kann beispielsweise erreicht werden, indem das gewünschte Gen funktionsfähig mit einem starken prokaryotischen Promotor verknüpft wird, obwohl der natürliche Restriktions- oder Modifizierungsmethylasegenpromotor verwendet werden kann. Solche wohlbekannten Promotoren können entweder konstitutiv oder induzierbar sein. Beispiele von konstitutiven Promotoren umfassen den int-Promotor des Bakteriophagen λ und den bla- Promotor des β-Lactamasegens von pBR322 u.s.w. Beispiele von induzierbaren prokaryotischen Promotoren umfassen die linken und rechten Hauptpromotoren des Bakteriophagen λ (PL und PR), die trp-, recA-, lacZ-, gal-, trc- und tac-Promotoren von E. coli, den α-Amylase (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162: 176-182 (1985)), die δ²&sup8;-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman, M.Z., et al., Gene 32: 11-20 (1984)), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, T.J., in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) und Streptomyces-Promotoren (Ward, J.M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986)). Prokaryotische Promotoren werden zusammenfassend in Übersichtsartikeln von Glick, B.R. (J. Ind. Microbiol. 1: 277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505-516 (1986)); und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415-442 (1984)) beschrieben.
- Um die Produktion der gewünschten Restriktionsendonuklease in einer prokaryotischen Zelle zu verstärken, ist es wichtig, die Expression des entsprechenden Modifizierungsmethylasegens ausreichend zu halten, um die DNA des rekombinanten Wirts vor einer Spaltung mit der klonierten Restriktionsendonuklease zu schützen. Dementsprechend kann es erforderlich sein, das Niveau der Methylaseexpression in Verbindung mit einer erhöhten Endonukleaseaktivität zu erhöhen.
- Darüber hinaus werden die Fachleute auf diesem Gebiet erkennen, dass verschiedene Kombinationen hinsichtlich des Aufrechterhaltens sowohl der Modifizierungs- als auch Restriktionsgene innerhalb desselben rekombinanten Wirts konstruiert werden können. Das einzige Erfordernis beim Klonen von Restriktionsendonukleasegenen besteht darin, dass der rekombinante Wirt das dem Endonukleasegen, das kloniert wird, entsprechende Methylasegen enthält und exprimiert.
- Die Enzyme dieser Erfindung, ClaI und ClaI-Methylase oder Isoschizomere davon, werden vorzugsweise durch Fermentation des rekombinanten Wirts (prokaryotisch oder eukaryotisch), der die klonierten Restriktionsendonuklease- und/oder Modifizierungsmethylasegene enthält und exprimiert, hergestellt. Der rekombinante Wirt, wie E. coli, der die klonierten Proteine produziert, kann gemäß Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, vermehrt und geerntet werden.
- Nach dem Kultivieren können die rekombinanten Wirtszellen dieser Erfindung von der Kulturflüssigkeit beispielsweise durch Zentrifugation getrennt werden. Die durch diesen Wirt produzierten Modifizierungsmethylase- und/oder Restriktionsenzyme können unter Verwendung von bekannten Proteinaufreinigungstechniken, die für diese Typen von Enzymen gewöhnlich eingesetzt werden, extrahiert und gereinigt werden.
- Im allgemeinen werden die gesammelten mikrobiellen Zellen in einem geeigneten Puffer dispergiert und dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, um eine Extraktion des Enzyms durch die Pufferlösung zu ermöglichen. Nach der Entfernung des Rückstands durch Ultrazentrifugation kann gewünschtes Enzym durch Extraktion, Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie, Affinitätschromatographie und ähnliches gereinigt werden, was die Restriktionsendonuklease dieser Erfindung liefert.
- Gemäß der Erfindung können Assays, um die Anwesenheit der Restriktionsendonukleasen und Modifizierungsmethylasen nachzuweisen, während herkömmlichen biochemischen Reinigungsverfahren verwendet werden, um die Anwesenheit dieser Enzyme zu bestimmen.
- Die Restriktionsendonuklease kann auf der Grundlage der Spaltung von deren Erkennungssequenz identifiziert werden. Beispielsweise kann lambda (λ)-DNA als ein Substrat verwendet werden. Nach dem Verdau mit Endonuklease werden die DNA-Fragmente elektrophoretisch in Agarosegelen in den Puffersystemen, die für das Auftrennen von Fragmenten üblich sind, und in Gegenwart von Ethidiumbromid (EtdBr) aufgetrennt.
- Die Demonstration der Modifizierungsmethylaseaktivität kann ein zweistufiges Identifizierungsverfahren sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Zuerst wird Substrat-DNA (λ-DNA), die die Erkennungssequenz enthält, mit Säulenfraktionen, die auf Methylaseaktivität getestet werden sollen, inkubiert. Zweitens wird diese DNA dann mit der entsprechenden Restriktionsaktivität konfrontiert, um jene Fraktionen zu identifizieren, die Methylaseaktivität enthalten. Während beispielsweise auf ClaI-Methylase untersucht wird, werden die DNA-Proben mit ClaI konfrontiert werden. Folglich enthalten DNA-Proben, die keine Spaltung mit ClaI zeigen, ClaI-Methylaseaktivität.
- Der rekombinante Wirt (E. coli DH10B), der die Gene, die ClaI (pCPClaI402) und ClaI-Methylase (pBSClaIM4) kodieren, enthält, wurde bei der Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, USDA, 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604 USA (NRRL) als Hinterlegungs-Nr. NRRL B-21039 (Hinterlegungsdatum: 23. Dezember 1992) hinterlegt.
- Nachdem die Erfindung jetzt allgemein beschrieben worden ist, wird diese durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung angegeben werden und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung zu beschränken, sofern nicht anders angegeben, leichter verstanden.
- Caryophanon latum BRL 240, das die ClaI-Restriktionsendonuklease produziert, wurde in einem 20 Liter (1)-Fermenter bei 30ºC: bis zur mittleren 10 g-Phase in Nährmedium (pH 7,4), bestehend aus 10 g/l Malzextrakt ND 201 (Premier Malt Extract), 10 g/l Hycase S.F. (Sheffield), 5 g/l Natriumacetat, 5 g/l Natriumbutyrat, 1 g/l dibasisches Kaliumphosphat und 7 g/l Natriumhydroxid vermehrt. Diese Zellen wurden zentrifugiert und vor der Isolierung der gesamten genomischen DNA als ein Zellpellet bei -70ºC gelagert.
- E. coli-Stämme wurden bei 37ºC in YET-Brühe (5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton und 5 g/l NaCl) mit Antibiotikazusätzen von 100 mg/l Ampicillin, 20 mg/l Tetracyclin oder 50 mg/l Kanamycin, wie angebracht, vermehrt. Die E. coli-Stämme DH10B und DH10B/pBSClaIM4 wurden zum Klonieren der ClaI-Gene verwendet. DH10B ist ein recA1&supmin;, endA&supmin;, φ 80d lacZ ΔM15-Derivat von MC1061 (Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138: 179-207 (1980)). Kompetente und elektrokompetente E. coli-Stämme wurden entweder von Life Technologies, Inc. (LTI; 8717 Grovemont Circle, Gaithersberg, MD 20884-9980) erhalten oder durch ein von Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983) beschriebenes Protokoll hergestellt. Eine Elektroporation wurde bei 2,5 kV in einem 0,15 cm Spalt mit einer Pulslänge von ungefähr 4 Millisekunden hergestellt.
- Da ein Methylaseschutz-Schema verwendet werden sollte, um ClaI- Restriktions- und -Modifizierungsgene zu klonieren, war es notwendig, Vektoren zu verwenden, die eine oder mehrere ClaI-Stelle(n) enthalten. Das Plasmid pBluescript KS, das eine einzelne ClaI-Stelle enthält, wurde von Stratagene (Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) erhalten. Das Cosmid pCP13 hat zwei ClaI-Stellen, von denen eine sich in dem Kanamycinresistenzgen befindet (Darzins et al., J. Bacteriol. 59: 9-18 (1984)). Das Plasmid pUC-Kam ist ein pUC19- Derivat, bei dem das Kanamycinresistenzgen auf einem PstI-Fragment aus pUC4K (Vieira et al., Gene 19: 259-268 (1982)) in die ScaI-Stelle von pUC19 insertiert worden ist (James Hartley, Life Technologies, Inc.).
- Plasmid-DNA-Isolierungen in kleinem Maßstab wurden durch ein alkalisches Lyseverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) ausgeführt. Für Präparationen in großem Maßstab folgte der alkalischen Lyse eine Standard-CsCl (Cäsiumchlorid)-Ethidiumbromid (EtdBr)-Gradientenzentrifugation.
- Genomische Gesamt-DNA von C. latum wurde isoliert, indem 2 g gefrorene C. latum-Zellen in 8 ml TNE-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA) resuspendiert wurden. Eine 10 mg/ml-Lysozymlösung in TNE-Puffer wurde der Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde 10%-ige Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 2% zugesetzt und die Suspension sanft geschüttelt, bis die Lyse vollständig war. Nach der Zelllyse wurde das Lysat einmal mit Phenol und zweimal mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert. DNA wurde unter zwei Volumen kaltem Ethanol mit einem Glasstab aufgewickelt. Die aufgewickelte DNA wurde in TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA) gelöst und durch CsCl-EtdBr-Gradientenzentrifugation gereinigt.
- Plasmide wurden durch die Zyklus-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des "The Double Stranded DNA Cycle Sequencing System" (LTI, Kat.-Nr. 8196SA), das auf der in Krishnan et al., Nucl. Acids. Res. 19: 1153 (1991) beschriebenen Methode beruht, sequenziert. Das Plasmid pBSClaIM6 wurde unter Verwendung des Oligonukleotids Nr. 1648 (SEQ ID NO: 1; 5' GATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGG 3'), das der Sequenz des Kanamycinresistenzgens in pCP13 unmittelbar stromaufwärts von der HindIII-Stelle entspricht (Oka et al., J. Mol. Biol. 147: 217-226 (1981)), sequenziert. Die Lage der Oligonukleotid Nr. 1643-DNA- Sequenz in pBSClaIM6 ist in Fig. 2 als Segment Nr. 1 angegeben. Das Plasmid pBSClaM4 wurde unter Verwendung der in Krishnen et al., a.a.O., beschriebenen M13-Vorwärts- und -Rückwärts-Primer sequenziert.
- Southern-Hybridisierungen wurden unter Verwendung einer biotinylierten Sonde und einer Photo-Gen-Detektion unter Verwendung des "Photo Gene Nucleic Acid Detection System (LTI) ausgeführt. Durch Endonukleaseverdau des passenden Plasmids erzeugte Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und aus Agarosegelscheiben durch die Gene-Clean-Prozedur (Bio101 Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA 92038-2284) isoliert. Fragmente wurden dann mit Biotin durch Octamer-geprimte Synthese in Gegenwart von biotinylierten Nukleotiden unter Verwendung des "BioPrime DNA Labeling System" (LTI) markiert.
- Koloniehybridisierungen wurden unter Verwendung einer radioaktiven Sonde im wesentlichen wie von Maniatis et al., a.a.O., beschrieben ausgeführt mit der Ausnahme, dass ein Phosphorimager (Molecular Dynamics, Inc., 880 E. Arques Ave., Sunnyvale, CA 94086) verwendet wurde, um gebundene Radioaktivität zu detektieren. Die radioaktive Sonde wurde mit [α-³²P]dCTP in einer hier beschriebenen Polymerasekettenreaktion (PCR) markiert. Die 50 ul PCR-Mischung enthielten 50 mM KCl, 25 mM Tris (pH 8,3), 5 mM MgCl&sub2;, 200 uM dATP, 200 uM dGTP, 50 uM dCTP, 200 uM dTTP, 100 ng pBSClaIM6, 1 uM Oligonukleotid Nr. 1718 (SEQ ID NO: 2; 5' TCACAAATTTTGACTTTTACAAAC 3'), 1 uM Oligonukleotid Nr. 1719 (SEQ ID NO: 3; 5' TCCTGAATTTTGGTACTCTACTG 3'), 5 uCi [α-³²P]dCTP und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Perkin Eimer Cetus, 761 Main Ave., Norwalk, CT 06859) in Wasser. Das 0,6 ml-PCR-Röhrchen wurde in einen Techne-Thermocycler (LTI) gesetzt und dem folgenden Schema unterworfen: 5 min bei 94º; 30 Zyklen von 15 s bei 94º, 15 s bei 55º, 15 s bei 72º und 2 min bei 72º.
- Die Positionen der den Oligonukleotiden Nr. 1718 und Nr. 1719 entsprechenden DNA-Sequenzen in pBSClaIM6 sind in Fig. 2 als Segmente Nr. 2 bzw. Nr. 3 angegeben.
- Eine Cosmid-Bibliothek von genomischer C. latum-DNA wurde in pCP13 konstruiert. Plasmid pCP13-DNA wurde mit einem in Tabelle 1 angegebenen Enzym verdaut und unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Genomische DNA von C. latum wurde mit dem in Tabelle 1 angegebenen Enzym partiell verdaut. Ein ug Cosmid-Vektor-DNA wurde mit 6 ug der passenden chromosomalen DNA unter Verwendung von 2 Einheiten T4-DNA-Ligase in 1 · Ligasepuffer (LTI) über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Ein Viertel der ligierten DNA wurde unter Verwendung des "Lambda Packaging System" von LTI verpackt und damit DH10B transfiziert. Ungefähr 109 Tetracyclinresistente (TcR) Kolonien wurden gepoolt und mit einem Aliquot wurden 500 ml Tetracyclin enthaltendes Circlegrow-Medium (Bio101) inokuliert. Nach einer 5-stündigen Vermehrung bei 30ºC wurden die Zellen geerntet und Plasmid-DNA wurde gemäß Beispiel 3 gereinigt. Tabelle 1. Bibliotheken von C. latum-DNA in Cosmid pCP13 und pBluescript
- Beispielsweise wurde die SphI-Bibliothek konstruiert, indem genomische C. latum-DNA mit SphI vollständig verdaut wurde, 8-16 kb-DNA-Fragmente unter Verwendung einer Agarosegelelektrophorese isoliert wurden und die DNA-Fragmente in die dephosphorylierte SphI-Stelle von pUC-Kam insertiert wurden. Ungefähr 109 Kolonien wurden gepoolt und damit 500 ml Circlegrow-Medium, das Kanamycin enthielt, inokuliert. Nach 8 h Vermehrung bei 30ºC wurden die Zellen geerntet und Plasmid-DNA, wie beschrieben, präpariert.
- Da die Selektion auf ClaI-Methylase von der Methylierung der ClaI-Restriktionsstellen abhängig ist, wurden Plasmid-Bibliotheken von C. latum-DNA in pCP13 (Fig. 1) einem ClaI-Verdau unterworfen, um den Hintergrund von Klonen, denen das Gen für ClaI- Methylase fehlte, zu beseitigen ("ClaI-Selektionsverfahren"). In dem ClaI-Selektionsverfahren wurden 3-5 ug genomische DNA über Nacht mit 120 Einheiten ClaI verdaut. Die verdaute DNA wurde dephosphoryliert, mit Phenol : Chloroform, gefolgt von sek.-Butanol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
- Ein Zehntel der verdauten DNA wurde verwendet, um elektrokompetente E. coli DH10B-Zellen zu transformieren. Plasmid-DNA-Proben, die aus Klonen isoliert waren, die auf Tetracyclin oder Ampicillin enthaltenden Platten selektiert worden waren, wurden auf eine Resistenz gegen ClaI getestet. Ein Schutz des darin enthaltenen Plasmids und der chromosomalen DNA des Wirts vor einem Verdau mit ClaI zeigte das Vorliegen von Methylaseaktivität an.
- Ein potentielles Problem bei der Verwendung des ClaI-Selektionsverfahrens besteht darin, dass der Verlust von ClaI-Stellen in dem Vektor aufgrund von Deletionen den Hintergrund von Klonen, die die ClaI-Methylase nicht enthalten, erhöht. Die SphI-Bibliothek in pUC-Kam lieferte keine Klone, die ClaI-Methylase exprimierten, aber viele Klone enthielten Vektor-DNA, in der die ClaI-Stelle deletiert worden war. In ähnlicher Weise lieferten die SalI- und PstI-Bibliotheken in pCP13 keine ClaI-Methylaseklone, obwohl viele der überlebenden Kolonien Plasmide enthielten, die ungefähr von der Größe des Klonierungsvektors pCP13 waren, denen aber ClaI-Stellen fehlten.
- Die pCP13-HindIII-Bibliothek wurde dem ClaI-Selektionsverfahren unterworfen und aus TcR-Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert. Alle 24 getesteten Klone waren identisch und exprimierten Methylaseaktivität, wie durch Resistenz gegen einen ClaI-Restriktionsverdau der Wirts-DNA bestimmt wurde. Ein Klon (pCPClaIM1) wurde für eine weitergehende Untersuchung ausgewählt. Von 24 Klonen aus der pCP13-Sau3AI-Bibliothek, die die ClaI-Selektion überlebten, exprimierten zwei Methylaseaktivität und einer wurde für eine weitergehende Untersuchung ausgewählt (pCPClaIM8).
- Ein Deletionsderivat des Cosmids pCPClaIM1 wurde durch Verdauen von pCPClaIM1 mit BamHI, um ein 6, 5 kb-BamHI-Fragment zu Entfernen, erzeugt. Das BamHI-Fragment lag entfernt von dem in Fig. 2 gezeigten Teil von pCPClaIM1. Nach Zirkularisieren des modifizierten Plasmids (bezeichnet als "pCPClaMB1") mit DNA-Ligase wurde Plasmid-DNA in DH10B-Zellen eingeschleust.
- Ein partieller Verdau von pPCPlaMB1 mit Sau3AI erzeugte 2-4 kb- Fragmente, die in die BamHI-Stelle von pBluescript KS sub kloniert wurden. Die so gebildete Bibliothek wurde hinsichtlich Resistenz gegen ClaI einer Selektion unterzogen und es wurden mehrere ClaI-Methylase-Subklone, einschließlich pBSClaIM4 und pBSClaIM6, erhalten.
- Eine Restriktionskartierung zeigte, dass C. latum-DNA-Inserts in pBSClaIM4 und pBSClaIM6 dem C. latum-DNA-Insert nahe an einer der zwei HindIII-Junktionen mit pCP13 entsprechen (Fig. 2). Die 2 kb-Überlappung zwischen den zwei klonierten Regionen definierte die Lage des ClaI-Methylasegens, das auf zwischen 0,8 und 1,5 kb-Länge geschätzt wurde, eng. Eine weitere Untersuchung enthüllte, dass pBSClaIM6, aber nicht pBSClaIM4 die HindIII-Junktion zwischen C. latum-DNA und pCP13 enthielt. Folglich wurde eine DNA-Sonde aus diesem Segment von pBSClaIM6 konstruiert, die verwendet werden kann, um pCP13-Klone zu detektieren, die DNA- Sequenzen enthalten, die an das Methylasegen angrenzen, und die Sonde würde mit pBSClaIM4 keine Kreuzhybridisierung zeigen. Wie nachfolgend diskutiert, machte diese Entdeckung es möglich, einen neuen rekombinanten Wirt zu gestalten, der das pBSClaIM4- Plasmid enthielt und die schützende Enzymaktivität der ClaI- Methylase produzierte. Die DNA-Sonde wurde konstruiert und als Sonde "A" bezeichnet (Fig. 2).
- Das C. latum-Genom, das an das ClaI-Methylasegen angrenzt, wurde kartiert, um zu identifizieren, welche Regionen in den Cosmid- Klonen pCPClaIM1, pCPClaIM2 und pCPClaIM3 enthalten waren oder fehlten. Eine Restriktionskarte des C. latum-Chromosoms in der Region des ClaI-Methylasegens wurde unter Verwendung einer Southern-Blot-Analyse von mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdauter chromosomaler C. latum-DNA bestimmt (Fig. 2). Keiner der drei ClaI-Methylaseklone enthielt ein DNA-Insert, das ein intaktes Segment von jener Region des Chromosoms repräsentierte. Das Fehlschlagen, diese DNA-Region intakt zu klonieren, legte die Anwesenheit eines funktionsfähigen Gens für ClaI-Endonuklease und/oder eines oder mehrerer anderer letaler Gen(e) nahe. Wenn das Endonukleasegen anwesend war, war es vernünftig, anzunehmen, dass frühere Versuche, beide Gene auf einem gemeinsamen Fragment zu klonieren, zu der Isolierung von Deletionen oder anderen Umlagerungen, die das Endonukleasegen entfernten, führten.
- Um ein Plasmid, das sowohl Restriktions- als auch Modifizierungsgene meinem E. coli-Wirt exprimiert, zu etablieren, muss eine Methylierung der Wirts-DNA dem Endonukleaseverdau vorangehen. Offensichtlich zeigte das in E. coli klonierte ClaI-Restriktions-Modifizierungs-System diese koordinierte Expression nicht. Folglich war die Hypothese aufgestellt worden, dass eine Verwendung eines bereits mit der ClaI-Methylase geschützten Wirts erforderlich sein würde, um dieses Problem zu umgehen.
- Eine Selektion von ClaI-Endonukleaseklonen erforderte die Verwendung eines geschützten Wirts, der ClaI-Methylase exprimiert.
- Eine Cosmid-Bibliothek von genomischer C. latum-DNA wurde in pCP13 unter Verwendung von partiell mit Sau3AI verdauter C. latum-DNA konstruiert. Die pCP13-Cosmid-Bibliothek-Verpackungs- Mischung wurde in DH10B/pBSClaIM4 (d. h. DH10B-Zellen, die das pBSClaIM4-Plasmid enthielten) eingeschleust.
- Die 2000 erhaltenen ApRTcR-Transformanten wurden einer Koloniehybridisierung unter Verwendung der Sonde A, die von der in pBSClaIM6 nur einmal vorkommenden C. latum-DNA abgeleitet worden war (Fig. 2), unterworfen. Wie oben diskutiert, weist diese Sonde keine Homologie zu pBSClaIM4 auf, sondern wurde an der Region von Interesse lokalisiert. Dementsprechend wurde sie verwendet, um Cosmid-Klone mit großen chromosomalen Inserts, die das Endonukleasegen enthalten könnten, zu identifizieren.
- Plasmid-DNA-Proben aus Kolonien, die mit Sonde A hybridisterten, wurden auf die Fähigkeit hin, ausgehend von den Oligonukleotiden Nr. 1 und Nr. 2 ein PCR-Signal zu erzeugen, getestet. Zwei von elf Kulturen taten dies und diese wurden auf ClaI-Endonukleaseaktivität getestet. Beide Klone zeigten ClaI-Restriktionsendonukleaseaktivität. Das aus dem Stamm isolierte, die ClaI-Restriktions- und -Methylasegene enthaltende Cosmid wurde als pCPClaI402B bezeichnet.
- Übernachtkulturen (20 ml) wurden geerntet und in 1 ml Puffer, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM β-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA, resuspendiert. Zellen wurden auf Eis mit einer Mikrospitzensonde dreimal mit 10 s-Bursts beschallt. Lambda-DNA- Substrat (1,0 ug) wurde in 1 X REactTM 1-Puffer (LTI) mit Reihenverdünnungen des Zellextrakts 1 h bei 37ºC verdaut. DNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt und durch EtdBr-Anfärbung sichtbar gemacht. Aktivität wurde durch die Anwesenheit der Banden passender Größe, die mit einem ClaI-Verdau von lambda-DNA verbunden sind, bestimmt.
- Obwohl das Vorangehende sich auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen bezieht, versteht es sich, dass die Erfindung nicht dergestalt beschränkt ist. Für die Fachleute auf diesem Gebiet ergibt sich, dass verschiedene Modifizierungen an den offenbarten Ausführungsformen vorgenommen werden können und dass solche Modifizierungen innerhalb des Umfangs der Erfindung, die durch die folgenden Ansprüche definiert wird, liegen sollen.
- Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt worden sind, zeigen das Niveau der Fachkenntnisse der Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, an. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen in dem gleichen Ausmaße, als wenn für jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und individuell angegeben worden wäre, dass sie in ihrer Gänze unter Bezugnahme aufgenommen werden soll.
- (i) ANMELDER: LIFE TECHNOLOGIES, Inc.
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Klonierung und Expression von Restriktionsendonukleasen und Modifizierungsmethylasen aus Caryophanon
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) ADRESSAT: LIFE TECHNOLOGIES, Inc., SG2-Corp. R&D
- (B) STRASSE: 8717 Grovemont Circle, P.O. Box 6009
- (C) STADT: Gaithersburg
- (D) BUNDESSTAAT: Maryland
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL: 20877
- (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Diskette
- (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
- (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
- (A) ANMELDENUMMER:
- (B) EINREICHUNGSDATUM: hiermit
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (viii) ANGABEN ZUM ANWALT/AGENTEN:
- (A) NAME: Kuhnen, Wacker & Partner
- (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: Association Nr. 5
- (C) REFERENZ/AKTENNUMMER:
- (ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
- (A) TELEFON: 08161-930-0
- (B) TELEFAX: 08161/930-100
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LANGE: 27 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: beide
- (D) TOPOLOGIE: beide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- GATTTTGATG ACGAGCGTAA TGGCTGG 27
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 24 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: beide
- (D) TOPOLOGIE: beide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- TCACAAATTT TGACTTTTAC AAAC 24
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: beide
- (D) TOPOLOGIE: beide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- TCCTOAATTT TGGTACTCTA CTG 23
Claims (23)
1. Isolierte DNA-Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche Cla
I-Restriktionsendonuklease kodiert.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, erhältlich durch Screenen von
genetischem Material von Bakterien, die zu der Gattung
Caryophanon gehören, durch Verwenden
(i) des DNA-Inserts von pCPClaI402, das sich in dem
durch die Aufnahmenummer NRRL B-21039
identifizierten Mikroorganismus befindet, oder
(ii) von synthetischen Oligonukleotiden davon als
Hybridisierungssonde.
3. Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1
oder 2 umfasst.
4. Vektor nach Anspruch 3, wobei das Endonukleasegen unter
der Kontrolle eines Cla I-Endonukleasegenpromotors steht;
und/oder
wobei das Endonukleasegen unter der Kontrolle eines
induzierbaren Promotors steht; und/oder
wobei der Promotor ein lambda-PL-Promotor ist; und/oder
wobei der Promotor ein tac-Promotor ist.
5. Rekombinante Wirtszelle, die eine DNA-Sequenz nach
Anspruch 1 oder 2 umfasst.
6. Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei das Endonukleasegen aus
Caryophanon latum, insbesondere aus Caryophanon latum BRL
240 erhalten wird; und/oder
wobei die Wirtszelle E. coli ist.
7. Verfahren zum Herstellen von Cla
I-Restriktionsendonuklease, umfassend:
(a) Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend
eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2; und
(b) Isolieren der Cla I-Restriktionsendonuklease aus der
Wirtszelle.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die DNA-Sequenz aus
Caryophanon ja tum, insbesondere aus Caryophanon latum BRL 240
erhalten wird; und/oder
wobei die Wirtszelle E. coli ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die DNA-Sequenz in
einem Vektor enthalten ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das
Endonukleasegen unter der Kontrolle eines Cla
I-Endonukleasegenpromotors steht; und/oder
wobei das Endonukleasegen unter der Kontrolle eines
induzierbaren Promotors steht; und/oder
wobei der Promotor ein lambda-PL-Promotor ist; und/oder
wobei der Promotor ein tac-Promotor ist.
11. Verfahren zum Verwenden eines Vektors nach Anspruch 3 oder
4, um Cla I-Restriktionsendonuklease herzustellen, wobei
das Verfahren umfasst
(a) Einschleusen des Vektors in eine Wirtszelle, um eine
rekombinante Wirtszelle herzustellen;
(b) Kultivieren der rekombinanten Wirtszelle; und
(c) Isolieren der Cla I-Restriktionsendonuklease aus der
rekombinanten Wirtszelle.
12. Isolierte DNA-Sequenz, die aus Caryophanon erhältliche Cla
I-Modifizierungsmethylase kodiert.
13. DNA-Sequenz nach Anspruch 12, erhältlich durch Screenen
von genetischem Material von zu der Gattung Caryophanon
gehörenden Bakterien durch Verwenden
(i) des DNA-Inserts von pBSClaIM4, das sich in dem
durch die Aufnahmenummer NRRL B-21039
identifizierten Mikroorganismus befindet, oder
(ii) von synthetischen Oligonukleotiden davon als
Hybridisierungssonde.
14. Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch
12 oder 13 umfasst.
15. Vektor nach Anspruch 14, wobei das
Modifizierungsmethylasegen unter der Kontrolle eines Cla
I-Modifizierungsmethylasegenpromotors steht; und/oder
wobei das Modifizierungsmethylasegen unter der Kontrolle
eines induzierbaren Promotors steht; und/oder
wobei der Promotor ein lambda-PL-Promotor ist; und/oder
wobei der Promotor ein tac-Promotor ist.
16. Rekombinante Wirtszelle, die eine DNA-Sequenz nach
Anspruch 12 oder 13 umfasst.
17. Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei das
Modifizierungsmethylasegen aus Caryophanon latum, insbesondere aus
Caryophanon latum BRL 240 erhalten wird; und/oder
wobei die Wirtszelle E. coli ist.
18. Verfahren zum Herstellen von Cla
I-Modifizierungsmethylase, umfassend:
(a) Kultivieren einer rekombinanten Wirtszelle, die eine
DNA-Sequenz nach Anspruch 12 oder 13 umfasst; und
(b) Isolieren der Cla I-Modifizierungsmethylase aus der
Wirtszelle.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Gen aus Caryophanon
latum, insbesondere aus Caryophanon latum BRL 240 erhalten
wird; und/oder
wobei die Wirtszelle E. coli ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die
DNA-Sequenz in einem Vektor enthalten ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das
Modifizierungsmethylasegen unter der Kontrolle eines Cla
I-Modifizierungsmethylasegenpromotors steht; und/oder
wobei das Modifizierungsmethylasegen unter der Kontrolle
eines induzierbaren Promotors steht; und/oder
wobei der Promotor ein lambda-PL-Promotor ist; und/oder
wobei der Promotor ein tac-Promotor ist.
22. Im wesentlichen reines Enzym, das durch das Verfahren nach
einem der Ansprüche 18 bis 21 erhalten werden kann.
23. Verfahren zum Verwenden eines Vektors nach Anspruch 14
oder 15, um Cla I-Modifizierungsmethylase herzustellen, wo
bei das Verfahren umfasst:
(a) Einschleusen des Vektors in eine Wirtszelle, um eine
rekombinante Wirtszelle herzustellen;
(b) Kultivieren der rekombinanten Wirtszelle; und
(c) Isolieren der Cla I-Modifizierungsmethylase aus der
rekombinanten Wirtszelle.
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|---|---|---|---|
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- 1993-12-23 DE DE69331757T patent/DE69331757T2/de not_active Expired - Lifetime
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