HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die
die ScaI Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase
kodiert, sowie die Herstellung von ScaI
Restriktionsendonuclease von der rekombinanten DNA.
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Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse
von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie
von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können
Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-
Molekülen in präzise Fragmente zur molekularen Klonierung und
Gencharakterisierung verwendet werden.
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Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle
Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang
dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem
Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer
Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche
Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu
unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als
einhundertachtzig Restriktionsendonuclasen mit einzigartigen
Spezifitäten wurden unter den vielen Hunderten von
Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden.
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Bakterien besitzen gewöhnlich höchstens eine geringe
Anzahl von Restriktionsendonucleasen pro Spezies. Die
Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den
Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies
Deinococcus radiophilus synthetisiert beispielsweise drei
verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem Namen DraI,
DraII und DraII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils
die Sequenzen TTTAAA (SEQ ID Nr. 1), PuGGNCCPy (SEQ ID Nr. 2)
und CACNNNGTG (SEQ ID Nr. 3). Escherichia coli RY13
synthetisiert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die
Sequenz GAATTC OSEQ ID Nr. 4) erkennt.
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Man geht davon aus, dass Restriktionsendonucleasen in
der Natur eine schützende Rolle zum Wohle der Bakterienzelle
spielen. Sie machen Bakterien widerstandsfähig gegen
Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide,
die sie sonst zerstören oder befallen würden. Sie übertragen
Widerstandsfähigkeit, indem sie eindringende Fremd-DNA-
Moleküle immer dann spalten, wenn die Erkennungssequenz
auftritt. Durch die stattfindende Spaltung werden viele der
infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird für Einen
weiteren Abbau durch unspezifische Endonucleasen empfänglich
gemacht.
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Eine zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen
sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär
zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das
Bakterien dazu befähigt, ihre DNA selbst zu schützen und sie
von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden.
Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die
gleiche Nucleotiderkennungssequenz wie die entsprechende
Restriktionsendonuclease, aber anstatt die DNA zu spalten,
modifizieren sie chemisch das ein oder andere Nucleotid
innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im
Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz
nicht mehr durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die
DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer
Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert. Sie ist
daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen
Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich
unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert
auf eine Erkennung und Spaltung durch
Restriktionsendonuclease empfindlich.
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Seit Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene
zu klonieren und die Proteine und Enzyme, die sie kodieren,
in größeren Mengen zu produzieren, als dies mit
konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Der
Schlüssel zur Isolierung von Klonen von
Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines
einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung
solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h.
Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren
hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10&supmin;³
bis 10&supmin;&sup4; auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv
sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört
wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
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Immer öfter werden Restriktionsmodifikationssysteme des
Typs II kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine
Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung
oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII:
Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178: 717-719, (1980); HhaII:
Mann et al., Gene 3: 97-112, (1978); PstI: Walder et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503-1507, (1981)). Da die
Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in
Bakterien diese befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen
standzuhalten, können Zellen, die klonierte
Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als
Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die
dem Phage ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt,
dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im
Speziellen wurde gefunden, dass klonierte
Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend
Phagenwiderstand zeigen, um selektives Überleben zu gewähren.
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Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen
von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in
E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al.,
Nucl. Acid. Res. 12: 3659-3676, (1984); PaeR7: Gingeras und
Brooks, Proc. Netl. Acad. Sci. USA 80: 402-406, (1983);
Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal
et al., 3% Bacteriol. 164: 501-509, (1985)).
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Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer steigenden
Zahl von Systemen angewendet wird, werden jetzt durch
Selektion nach einem aktiven Methylasegen kloniert (siehe
unsere EPO Nr.: 193,413, veröffentlicht am 3. September 1986,
und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421,
(1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng
miteinander gekoppelt sind, können beide Gene oft simultan
kloniert werden. Diese Selektion erbringt jedoch nicht immer
ein komplettes Restriktionssystem, sondern stattdessen nur
das Methylasegen (BspRI: Szomolanyl et al., Gene 10: 219-225,
(1980); BcnI: Janulaitis et al. Gene 20: 197-204 (1982);
BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111-119, (1983); und MspI:
Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241, (1983)).
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Ein neueres Verfahren (das "Endo-Blue"-Verfahren) wurde
zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in
E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli
beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et
al., Nucl. Acids Res. 22: 2399-2403 (1994)). Im Rahmen dieses
Verfahrens wird die E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an DNA-
Schäden durch Endonucleasen oder unspezifische Nucleasen
genutzt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler
Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert.
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Ein weiteres Hindernis für das Klonieren dieser Systeme
in E. coli wurde im Verfahren zur Klonierung diverser
Methylasen entdeckt. Viele E. coli Stämme (einschließlich
solcher, die normalerweise zum Klonieren benutzt werden)
haben Systeme, die der Einführung von DNA widerstehen, die
Cytosin-Methylierung beinhaltet. (Raleigh und Wilson, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070-9074, (1986), deren
Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Es
ist daher auch eine sorgfältige Überlegung erforderlich,
welche(r) E. coli Stamme/Stämme zum Klonieren verwendet
werden.
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Wenn fremde Restriktionsmodifikationssysteme kloniert
und in E. coli eingeführt werden, dann sind die Methylase-
und Endonucleaseexpressionen manchmal recht gering im
Vergleich zu den nativen Endonuclease-produzierenden Stämmen,
was wahrscheinlich in der schlechten Transkription oder
Translation der Gene in E. coli begründet ist. Dies trifft
vor allem auf die Klonierung von Streptomyces-Genen in E.
coli aufgrund des unterschiedlichen GC-Gehalts der beiden
Mikroorganismen zu. Es wäre ein Klonierungssystem erwünscht,
bei dem Streptomyces-Gene ausreichend in E. coli exprimiert
und auf der Basis der effizienten Genexpression selektiert
werden können. Die EP-A-0 475 195 offenbart ein Verfahren zur
Herstellung und Klonierung der SacII Restriktionsendonuclease
und Methylase von Streptomyces achromogenes.
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Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in
geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge
zum Charakterisieren von Genen im Labor sind, gibt es einen
kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme durch DNA-
Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme im
Überfluss synthetisieren. Solche Stämme wären von Nutzen, da
sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und auch das
Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen
bereitstellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte DNA, die
die Restriktionsendonuclease ScaI kodiert, sowie ein
Verfahren zur Klonierung von Methylasegenen von Streptomyces
in E. coli durch eine Modifikation des
Methylaseselektionsverfahrens. Zunächst wurde das
standardmäßige Methylasegenselektionsverfahren zum Klonieren
des ScaI Methylasegens unter Verwendung eines pUC19
Klonierungsvektors hoher Kopiezahl während der
Bibliothekenkonstruktion ausprobiert. Das ScaI Methylasegen
widerstand der Klonierung unter Verwendung von pUC19, was
vermutlich in der schlechten Expression des ScaI
Methylasegens in E. coli begründet war. Wenn die ScaI
Methylase nicht wirksam in E. coli exprimiert wird, dann
werden die ScaI Orte auf dem Plasmid durch die Methylase
nicht ausreichend modifiziert. Folglich wird das Plasmid
gespalten und geht in der Plasmidbibliothek nach dem ScaI
Endonuclease-Reiz verloren. Da die standardmäßige
Methylaseselektion nicht funktionierte, wurde das "Endo-Blue-
Verfahren" zum Klonieren des ScaI Endonucleasegens
ausprobiert. Neunzehn blaue Kolonien wurden identifiziert,
aber keine von ihnen erbrachte eine nachweisbare ScaI
Endonucleaseaktivität.
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Zum Erhöhen der ScaI Methylasegenexpression in E. coli
wurde ein Plasmid hoher Kopiezahl verwendet, das einen lacUVS
Promoter mit der Bezeichnung pRRS enthielt (Skoglund et al.
Gene 88: 1-5 (1990)), um das ScaI Methylasegen zu klonieren,
und die resultierende Bibliothek-DNA wurde zur
Methylaseselektion verwendet. Das ScaI Methylasegen wurde in
vier Schritten erfolgreich in pRRS kloniert: (1) Ligation von
mit Sau3AI teilweise verdauter genomischer DNA und
BamHIgespaltenem und CIP-behandeltem pRRS und Transformation der
ligierten DNA in E. coli RR1 kompetente Zellen, (2)
Herstellung einer gemischten Plasmidbibliothek; (3) ScaI
Verdauung von Plasmid-DNA-Bibliothek und Retransformation der
dem Reiz ausgesetzten DNA in RR1 Zellen; (4) Screenen von
ScaI-resistentem/resistenten Plasmid/Plasmiden unter den
Überlebenden. Nachdem das ScaI Methylasegen kloniert war,
wurden Anstrengungen unternommen, DNA-Fragmente auf beiden
Seiten des Methylasegens zu klonieren. Gewöhnlich liegen das
Methylasegen und Endonucleasegen in einem speziellen
Restriktionsmodifikationssystem nebeneinander. DNA auf der
linken Seite des ScaI Methylasegens wurde durch DNA-
Amplifikation durch inverse PCR kloniert. Die DNA wurde
sequenziert und translatiert in allen sechs Leserastern. Die
translatierten Proteinsequenzen wurden mit der N-Terminus-
Proteinsequenz des teilweise gereinigten ScaI Proteins
verglichen. Eine vorhergesagte Proteinsequenz stimmt eng mit
der N-terminalen Sequenz des ScaI Proteins überein. Das
gesamte ScaI Endonucleasegen wurde durch Amplifizieren des
Gens durch Polymerasekettenreaktion von genomischer DNA
kloniert, mit einem pRRS Vektor ligiert und in einen mit ScaI
Methylase zuvor modifizierten E. coli Stamm transformiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1 ist ein Plan zum Klonieren und Produzieren der
ScaI
Restriktionsendonuclease.
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Fig. 2 ist die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) des scaIM Gens
und seiner kodierten Proteinsequenz (SEQ ID Nr. 5).
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Fig. 3 ist die DNA-Sequenz (SEQ LD Nr. 7) des scaIR Gens
und seiner kodierten Proteinsequenz (SEQ ID Nr. 8).
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Fig. 4 stellt den Aufbau des ScaI
Restriktionsmodifikationssystems dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das ScaI
Methylasegen und Endonucleasegen kloniert und exprimiert
werden, ist in Fig. 1 illustriert und umfasst die folgenden
Schritte:
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1. Die genomische DNA von Streptomyces caespitcsus
wird gereinigt.
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2. Die DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease wie
Sau3AI oder einem ihrer Isoschizomere verdaut, die (ein) DNA-
Fragment(e) erzeugt, das/die das gesamte ScaI Methylasegen
enthält/enthalten. Das/die Fragment(e) sollte außerdem eine
klonierbare Größe von 1-20 kb haben.
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3. Die mit Sau3AI verdaute genomische DNA wird
vorzugsweise mit BamHI-gespaltenen/CIP-behandelten starken
Expressionsvektoren wie pRRS ligiert. Es können auch andere
Vektoren mit Ptac, λPL, λPR Promotoren verwendet werden. Die
resultierenden Gemische werden zum Transformieren eines
geeigneten Wirts, d. h. ein hsdR&supmin;, mcrBC&supmin;, mrr&supmin; Stammm, wie E.
coli Stamm RR1, verwendet. Die DNA-/Zellgemische werden auf
ampicillinselektives Medium für transformierte Zellen
plattiert. Nach einer Inkubation werden die transformierten
Zellen gepoolt um die Primärzellbibliothek zu bilden.
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4. Die rekombinanten Plasmide werden in toto von der
Primärzellbibliothek gereinigt, um eine
Primärplasmidbibliothek herzustellen. Die gereinigte
Plasmidbibliothek wird dann komplett in vitro mit ScaI
Endonuclease oder einem ScaI Isoschizomer verdaut. Die ScaI
Endonucleaseverdauung führt zu einer selektiven Zerstörung
unmodifizierter, nicht methylasehaltiger Klone, was zu einer
Erhöhung der relativen Frequenz von ScaI-methylasehaltigen
Klonen führt.
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5. Identifizierung des ScaI Methylaseklons: Die
verdaute Plasmidbibliothek-DNA wird zurück in einen Wirt wie
E. coli Stamm RR1 transformiert, und transformierte Kolonien
werden wieder durch Plattieren auf Ampicillinplatten
gewonnen. Die Kolonien werden aufgenommen und ihre Plasmid-
DNA wird präpariert und hinsichtlich der Anwesenheit des ScaI
Methylasegens analysiert, indem gereinigte Plasmid-DNA in
vitro mit ScaI Endonuclease inkubiert wird, um zu bestimmen,
ob sie gegen ScaI Verdauung resistent ist.
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6. Nachdem die Klonierung des Methylasegens
festgestellt wurde, wird der Klon durch
Restriktionskartierung und Deletionskartierung analysiert.
Die Region mit dem scaIM Gen wird sequenziert.
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7. DNA mit insgesamt 623 bp wurde auf der rechten
Seite des ScaI Methylasegens sequenziert. Diese DNA-Sequenz
wurde mit allen bekannten Genen in der Genbank-Datenbank mit
dem Programm "Blastx" verglichen. Dem Sequenzvergleich
zufolge wies ein vorhergesagtes offenes Leseraster (unfertig)
von diesen 623 bp eine gewisse Homologie zum E. coli
Kälteschockprotein auf. Man kam zu dem Schluss, dass die DNA
auf der rechten Seite des ScaI Methylasegens nicht das ScaI
Endonucleasegen sein konnte.
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8. Zum Klonieren der linksseitigen Junction-DNA wird
genomische Streptomyces caespitosus-DNA mit BsawI, BspEI,
NIaIII, PstI, PvuL, Sau3AI und SpeI Restriktionsenzymen oder
anderen Restriktionsenzymen verdaut, die eine Template-DNA
angemessener Größe (weniger als 3 kb) für eine inverse PCR-
Reaktion hervorbringen. Die verdaute DNA wird bei einer
geringen DNA-Konzentration (weniger als 2 ug pro ml)
selbstligiert. Die ligierte kreisförmige DNA wird als
Template zur inversen PCR-Reaktion unter Verwendung eines
Primersatzes verwendet, der sich an das Ende des ScaI
Methylasegens anlagerte. Unter Befolgung des obigen
Protokolls wird ein 1,6 kb inverses PCR-Produkt von PvuI-
gespaltener und selbstligierter genomischer DNA gewonnen. Die
DNA wird mit T4 Polynucleotidkinase und T4 DNA-Polymerase
behandelt und in HincII-gespaltenen/CIP-behandelten pUC19
Vektor kloniert. Das gesamte Insert wird sequenziert, und die
DNA-Sequenzen werden in Aminosäuresequenzen in allen sechs
Leserastern translatiert und dann mit der ScaI N-Terminus-
Proteinsequenz verglichen. Dieser Ansatz bringt ein offenes
Leseraster von 684 bp hervor, das Sechs-Aminosäuren-Identität
mit der tatsächlichen ScaI Proteinsequenz hat.
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9. Das ScaI Methylasegen wird dann in ein kompatibles
Plasmid pACYC184 kloniert, um den E. coli Wirt zuvor zu
modifizieren. Zum Erhöhen der Translationseffizienz in E.
coli werden eine effiziente Ribosomenbindungsstelle und ein
optimaler Abstand vor das Methylasegen eingebaut. Das gesamte
ScaI Endonucleasegen wird durch PCR mit zwei Primern
amplifiziert. Der Vorwärtsprimer enthält die
Ribosomenbindungsstelle und einen 6 bp Abstand vor dem ATG
Startcodon. Das ScaI Endonucleasegen wird in den
Expressionsvektor pRRS kloniert und in ScsI
Methylasevormodifizierte Zellen transformiert.
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10. E. coli Zellen, die pACYC184-ScaIM&spplus; und pRRS-ScaIR&spplus;
enthalten, werden über Nacht bei 30ºC bis zur stationären
Phase heranreifen gelassen. Die Zellen werden geerntet und
durch Beschallung lysiert. Zellextrakte werden in Bezug auf
ScsI Endonucleaseaktivität untersucht. ScaI Endonuclease wird
durch Chromatographie gereinigt.
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Mit dem folgenden Beispiel werden Ausgestaltungen der
vorliegenden Erfindung illustriert, die derzeit bevorzugt
umgesetzt werden. Es ist zu verstehen, dass dieses Beispiel
illustrativ ist und dass die Erfindung nicht als darauf
beschränkt anzusehen ist, sondern nur durch die Angaben in
den beiliegenden Ansprüchen.
1. BEISPIEL
KLONIERUNG DES ScaI RESTRIKTIONSMODIFIKATIONSSYSTEMS
1. ScaI Methylaseselektion mit pUC19 als Klonierungsvektor
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Ein ScaI Linker wurde in den SspI Ort von pUC19
eingesetzt. Der modifizierte pUC19 wurde für die
Bibliothekenkonstruktion verwendet. Mit Sau3AI teilweise
verdaute genomische S. caespitosus-DNA wurde mit
BamHIgespaltener/CIP-behandelter pUC19 DNA ligiert. Mit SmaI
teilweise verdaute und vollständig verdaute genomische DNA
wurde mit SmaI-zerschnittener/CIP-behandelter pUC19 DNA
ligiert. Ligierte DNA-Gemische wurden in RR1 kompetente
Zellen transformiert und auf Ampicillinplatten plattiert.
Insgesamt 13.600 und 60.000 Zellen wurden jeweils in SmaI und
Sau3AI Bibliotheken gefunden. Plasmid-DNA wurde von jeder
Primärzellbibliothek präpariert. 5 ug, 2 ug und 1 ug der
Bibliothek-DNA wurden zwei Stunden lang mit 100 Einheiten
ScaI Restriktionsendonuclease bei 37ºC gespalten. Die mit
ScaI gereizte DNA wurde in RR1 kompetente Zellen
retransformiert. Plasmid-DNA wurde wieder von den
überlebenden Transformanten isoliert und mit ScaI
Restriktionsenzym verdaut, um festzustellen, ob die Plasmid-
DNA gegen ScaI Verdauung resistent ist. 144 Plasmidisolate
von der Sau3AI Bibliothek und 58 Plasmidisolate von der SmaI
Bibliothek würden hinsichtlich ScaI Verdauungsresistenz
analysiert. Es wurden fünf resistente Klone gefunden, die
einen oder beide ScaI Ort(e) im Vektor verloren hatten. Es
wurden keine wirklich resistenten Klone (methylasehaltige
Klone) in diesen beiden Bibliotheken gefunden.
2. Versuch zur Klonierung des ScaI Endonucleasegens mit dem
"Endo-Blue"-Verfahren"
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Es wurde argumentiert, dass, wenn das ScaI
Endonucleasegen in der E. coli Zelle schlecht exprimiert ist,
das "Endo-Blue"-Verfahren zum Klonieren des Endonucleasegens
direkt in E. coli ohne den ScaI Methylaseschutz angewendet
werden könnte. Mit Sau3AI teilweise verdaute genomische ScaI
DNA wurde mit BamHI-verdautem/CIP-behandeltem pUC19 ligiert
und in den E. coli Indikatorstamm transformiert, der eine
dinl::lacZ Fusion enthielt, und auf X-gal Indikatorplatten
plattiert. Es wurden neunzehn blaue Kolonien unter 5.000 ApR
Transformanten gefunden. Die einzelne blaue Kolonie wurde in
10 ml LB plus Ap inokuliert und über Nacht bei 30ºC
geschüttelt. Zellen wurden geerntet und in 1 ml
Beschallungspuffer plus Lysozym (100 ug/ml) resuspendiert. 1
ul, 2,5 ul, 5 ul und 10 ul des Zellextrakts wurden zum
Zerschneiden von 1 ug λ DNA bei 37ºC über einen Zeitraum von
einer Stunde verwendet. In den Zellextrakten aller blauen
Isolate wurde keine ScaI Aktivität gefunden. Man gelangte zu
dem Schluss, dass keiner der Klone das ScaI Endonucleasegen
enthielt oder dass das Endonucleasegen für den In-vitro-
Nachweis nicht gut exprimiert war.
3. ScaI Methylaseselektion mit pRRS als Klonierungsvektor
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Das Methylaseselektionsverfahren setzt voraus, dass das
ScaI Methylasegen in vivo auf ein angemessenes Niveau
exprimiert wird, so dass die Methylase den ScaI Ort auf dem
Vektor modifizieren kann, der das ScaI Methylasegen trägt. Es
ist bekannt, dass Streptomyces-Gene aufgrund des
unterschiedlichen GC-Gehalts der beiden Mikroorganismen in E.
coli schlecht exprimiert werden. Zum Exprimieren des ScaI
Methylasegens auf hohem Niveau wurde ein weiterer Vektor
hoher Kopiezahl, pRRS, als Klonierungsvehikel verwendet. Das
Plasmid pRRS trägt den IacUVS Promoter, der stärker als der
reguläre lac Promoter in pUC19 ist. Gene, die in multiple
Klonierungsstellen kloniert werden, werden von dem lacUV5
Promoter angetrieben. Mit Sau3AI teilweise verdaute
genomische S. caespitosus-DNA wurde mit dem BamHI-
verdauten/CIP-behandelten pRRS-Vektor ligiert, und die
ligierte DNA würde in RR1 kompetente Zellen transformiert.
Insgesamt wurden 18.000 ApR Transformanten als
Primärzellbibliothek gewonnen. Plasmid-DNA wurde von der
Primärzellbibliothek präpariert. Fünf ug der Bibliothek-DNA
wurden mit 100 Einheiten des ScaI Restriktionsenzyms
gespalten und in RR1 kompetente Zellen zurück transformiert.
Die überlebenden Transformanten wurden aufgenommen und
kultiviert. Plasmid-DNA wurde von Kulturen der individuellen
Zellen isoliert. Zur Untersuchung, ob eines dieser Plasmide
das ScaI Methylasegen enthielt, wurden 78 individuelle
Plasmide mit ScaI Endonuclease verdaut. Man stellte feist,
dass die Plasmide Nr. 37, Nr. 38 und Nr. 54 wirklich
resistent gegen ScaI Verdauung waren. Das Plasmid Nr. 54 trug
ein etwa 5000 bp Insert und wurde weiter analysiert. Ein 1,7
kb SacI Fragment Deletionsklon enthält noch immer das aktive
Methylasegen. Die Deletion eines PstI Fragments (etwa 2 kb)
des Inserts inaktiviert das ScaI Methylasegen und macht die
Deletionsklone gegenüber einer ScaI Endonucleasespaltung
empfindlich. Man kam zu dem Schluss, dass sich ein PstI Ort
innerhalb des ScaI Methylasegens befindet. Man bemühte sich,
die den PstI Ort umgebende DNA zu sequenzieren. Drei Subklone
(SacI bis PstI, Hindill bis PstI und PstI bis PstI) wurden
mit dem pUC19 Vektor konstruiert. Die DNA-Sequenz wurde unter
Verwendung universeller Vorwärts- und Rückwärtsprimer von
pUCl9 bestimmt. Die restliche DNA wurde durch Primer-Walking
sequenziert. Es wurde ein offenes Leseraster identifiziert,
das die Methylasemotive SPPY(SEQ ID Nr. 9) und DPFLGSGTT (SEQ
ID Nr. 10) enthielt. Das Methylasegen wurde durch den unteren
Strang kodiert und hatte eine umgekehrte Orientierung.
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Zum Identifizieren des ScaI Endonucleasegens wurden 623
bp DNA auf der rechten Seite des Methylasegens sequenziert.
Dieses Stück DNA wurde mit allen bekannten Genen in der
Genbank verglichen. Es wurde gefunden, dass ein teilweise
offenes Leseraster innerhalb der 623 bp eine gewisse
Homologie zu einer Genkodierung für ein Kälteschockprotein
von E. coli hatte. Folglich konzentrierten sich die
Bemühungen auf die Klonierung und Sequenzierung von DNA auf
der linken Seite des Methylasegens.
4. Klonierung des ScaI Endonucleasegens
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Klonierung des ScaI Endonucleasegens durch inverse PCR:
Inverse PCR ist eine effiziente Art und Weise der Klonierung
von DNA, die an die bekannte DNA-Sequenz angrenzt. Genomische
S. caespitosus-DNA wurde mit BsaWI, BspEI, NiaIII, PstI,
PvuI, Sau3AI und SpeI Restriktionsenzymen für die inverse
PCR-Reaktion verdaut. Nach der Restriktionsverdauung wurde
die DNA einmal mit Phenol-CHCl&sub3; und einmal mit CHCl&sub3;
extrahiert, mit 95%igem Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer
resuspendiert. Jede verdaute DNA wurde bei einer geringen
DNA-Konzentration (2 ug/ml in 500 ul Gesamtvolumen) zu einem
Kreis selbstligiert. Die ligierte DNA wurde einmal mit.
Phenol-CHCl&sub3; und einmal mit CHCl&sub3; extrahiert und mit 95%igem
Ethanol präzipiert. Die DNA wurde als Template zur inversen
PCR-Reaktion verwendet (95ºC 1 Min., 60ºC 1 Min., 72ºC 2
Min., 30 Zyklen). Ein Satz Primer, der sich an das Ende des
Methylasegens anlagerte, war wie folgt gestaltet:
Vorwärtsprimer, 5'CACCGCGATGTCG AGGTAGTCTTC3' (SEQ ID Nr.
11); Rückwärtsprimer, 5'GCCTGGAGGCG GAGGCGCAATCCC3' (SEQ ID
Nr. 12). Ein 1,6 kb inverses PCR-Produkt wurde in der
inversen PCR-Reaktion der selbstligierten genomischen PvuI-
DNA gefunden. Das inverse PCR-Produkt wurde mit T4
Polynucleotidkinase und T4 DNA-Polymerase in einem 50-ul-
Reaktionsvolumen behandelt (2 ug DNA, 5 ul 10x Kinasepuffer,
1 ul Polynucleotidkinase; 2 ul 0,1 M ATP, 1 ul T4 DNA
Polymerase, 41 ul TE, 37ºC, 1 Stunde). Die DNA wurde in pUCIS
kloniert. Zum Sequenzieren des Inserts wurden mehrere
Deletionsklone konstruiert (NgoMI & SmaI Deletion, BamHI &
BstEII Deletion, BssHII & BssHII Deletion und AatII & AatII
Deletion). Die DNA-Sequenz wurde mit pUC19 Vorwärts- und
Rückwärtsprimern und maßgeschneiderten Primern bestimmt.
Insgesamt wurden 956 sequenzierte Basenpaare bestimmt und in
allen sechs Leserastern translatiert. Es wurde ein offenes
Leseraster von 684 bp mit den vorhergesagten
Aminosäuresequenzen MINDQLPRWVR EARVGTRTG (SEQ ID Nr. 13)
gefunden. 684 bp an DNA verfügen über eine
Kodierungskapazität zum Kodieren eines Proteins mit einer
relativen Molekülmasse von 26 kD. Die N-terminale
Proteinsequenz der teilweise gereinigten ScaI
Restriktionsendonuclease ist QLPXXV XXXXXGXXXG (SEQ ID Nr.
14) (X = nicht identifizierte Reste).... Sechs Reste
(fettgedruckt dargestellt) sind zwischen der tatsächlichen
Proteinsequenz und der vorhergesagten Proteinsequenz
identisch, obwohl in der tatsächlichen Proteinsequenz die
ersten vier Reste fehlen. Die ersten vier Reste des Teilweise
gereinigten ScaI Proteins könnten durch Protease während der
Proteinreinigung abgebaut werden. Die relative Molekülmasse
des teilweise gereinigten ScaI Proteins liegt zwischen 25 und
26 kD. Man kam zu dem Schluss, dass dieses 684 bp offene
Leseraster das ScaI Endonucleasegen ist.
5. Expression der ScaI Endonuclease in E. coli
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Das ScaI Methylasegen wurde durch PCR mit dem
Vorwärtsprimer
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5'CTCGGATCCGGAGGTAAATAAATGTCCGGGCGGGACTTTGGATAT3 (SEQ ID Nr.
15) und Rückwärtsprimer
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5'CGCGGATCCTTAACACTCAACTCCTCGCCATCCATA3' (SEQ ID Nr. 16)
amplifiziert (der Rückwärtsprimer befindet sich 85 bp
stromabwärts vom Methylase-Stoppcodon). Die PCR-DNA wurde mit
BamHI gespalten und in den BamHI Ort von pACYC184 kloniert,
um den E. coli Wirt zuvor zu modifizieren. Das gesamte ScaI
Endonucleasegen wurde durch PCR mit zwei Primern
amplifiziert. Der Vorwärtsprimer enthält die
Ribosomenbindungsstelle und einen 6 bp Abstand vor dem ATG
Startcodon (Vorwärtsprimer,
5'TTAGCATGCGGAGGTTTAAAAATGATCAACGATCAGCTTCCCCGGTGG3' (SEQ ID
Nr. 17); Rückwärtsprimer, 5'GGCGCATGCGTTCAGCACCGGGGTTT
GCGCTTACCT3' (SEQ ID Nr. 18)). Das durch SphI Orte flankierte
ScaI Endonucleasegen wurde in den SphI Ort des
Expressionsvektors pRRS kloniert und in ScaI
Methylasevormodifizierte Zellen transformiert. 500 ml Zellen, die
pRRS-ScaIR&spplus; und pACYC-ScaIM&spplus; trugen, wurden über Nacht bei
30ºC in LB plus Ap (100 ug/ml) und Cm (30 ug/ml) heranreifen
gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in 30 ml
Beschallungspuffer resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch
Zugabe von Lysozym zu 100 ug/ml und Beschallen abgeschlossen.
Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der
Zellextrakt wurde 10-, 100-, 1000- und 10000fach in TE-Püffer
verdünnt. 5 ul des verdünnten Extraktes wurden zum Verdauen
von 1 ug λ DNA für 1 Stunde bei 37ºC verwendet. Die verdaute
DNA wurde in einem 0,8%igen Agarosegel aufgelöst. Es wurde
gefunden, dass der E. coli Stamm mit pRRS-ScaIR&spplus; und p.ACYC-
ScaIM&spplus; 10&sup6; Einheiten von ScaI Endonuclease/Gramm nasser E.
coli Zellen erbringt.
6. Reinigung der rekombinanten ScaI
Restriktionsendonuclease
-
Die rekombinante ScaI Restriktionsendonuclease wurde
durch Chromatographie mit Heparin-Sepharose-, DEAE-Cellulose-
und Q-Sepharose-Säulen auf Homogenität gereinigt.
-
Eine Probe von E. coli mit pRRS-ScaIR+ und pACYC-ScaIM+
(NEB991) wurde am 8. Dezember 1995 unter den Bedingungen des
Budapester Vertrags mit der Beitritts-Nr. 69966 bei der
Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.
SEQUENZAUFLISTUNG
-
(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
-
(i) ANMELDERIN:
-
(A) NAME: NEW ENGLAND BIOLABS, INC.
-
(B) STRASSE: 32, TOZER ROAD
-
(C) STADT: BEVERLY
-
(D) STAAT: MASSACHUSETTS
-
(E) LAND: USA
-
(F) POSTLEITZAHL: 01915
-
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR KLONIERUNG UND
HERSTELLUNG DER ScaI RESTRIKTIONSENDONUCLEASE IN E. COLI
-
(iii)ANZAHL SEQUENZEN: 18
-
(v) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
-
(A) MEDIENTYP: Diskette
-
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
-
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
-
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 1:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 6 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 2:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 7 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 3:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 9 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 4:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 6 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 5:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 915 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
-
(B) ORT: 1..915
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 6:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 304 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 7:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LANGE: 684 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
-
(B) ORT: 1..684
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 8:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 227 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 8:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 9:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 9:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 10:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 10:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 11:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 11:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 12:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 12:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 13:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 13:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 14:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
-
(B) TYP: Aminosäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 14:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 15:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 15:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 16:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 16:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 17:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 48 Basenpaare ·
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 17:
-
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 18:
-
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
-
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
-
(B) TYP: Nucleinsäure
-
(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
-
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
-
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 18: