SU1306127A1 - Способ выделени сайт-специфической эндонуклеазы cLa I - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к получению сайт- специфических эндонуклеаз, предназначенных дл  создани  рекомбинантных молекул ДНК, анализа первичной структуру ДНК, создани  банков генов. Цель изобретени  - увеличение выхода сайт-специфической эндонуклеазы Cla I и повышение степени очистки ее от примесей. Дл  этого готов т носитель с иммобилизованным цибарко- новым синим F3GA. Затем выдел ют эн- донуклеазу Cla I. Бесклеточный экстракт С. latum G, содержащий зндону- клеазу Cla I о( нанос т на колонку, содержащую носитель с иммобилизованным красителем F3GA. Колонку промывают 10 мМ калий-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М NaCl до нулевого оптического поглощени  при 280 им. Затем элюируют белки. Эндонуклеаза Cla I элюирует при. концентрации NaCl 0,5-0,8 М. Фракции, содержащие ферг мент, объедин ют, диализуют 6-10 ч против буфера, содержащего 50% глицерин , хран т при -20°С. Б полученном препарате определ ют активность Cla I содержание белка и нуклеиновых кислот . 1 табл. оо о С5 IsD

Description

Изобретение относитс  к области биотехнологии, в частности к получению сайт-специфических эндонуклеаэ, предназначенных дл  создани  реком- бинантных молекул ДНК, анализа первичной структуры ДНК, создани  банков генов.

Целью изобретени   вл етс  увеличение выхода сайт-специфической эн- донуклеазы С1а I и повьшение степени очистки ее от примесей,

Способ осуществл ют следующим образом .

Приготовление носител  с иммоби- линованным цибакроновым синим F3GA. 20 мл сефарозы CL-4B суспендируют в 30 мл HjO, добавл ют 110 мг красител  ЕЗСА, затем раствор А М NaCl до конечной концентрации 0,4 М, объем при этом довод т до 45 мл, После 20 мин механического перем,етивани  смеси добавл ют 0,2 мл 5 М NaOH и инкубируют при . Провер ют количество иммобилизованного красител  по уменьшению оптического поглощени  надосадочной жидкости при 610 нм.. После завершени  реакции несв завший с  краситель отмывают на стекл нном фильтре дистиллированной водой до не чезновени  синей окраски в промывных водах.

Выделение эндонуклеазы С1а I,

Бёсклеточный экстракт С. latum G, содержащий эндонуклеазу С1а I, L, нанос т на колонку, содержащую носител с иммобилизованным красителем F3GA. Колонку промывают 10 мМ калийфосфат- ным буфером, содержащим О91 М WaCl до нулевого оптического поглощени  при 280 нм и затем элюируют белки ли нейным градиентом 0,1-1 М NaCl в 10 мМ калий-фосфатном буфере, Эндону клеаза С1а I элюирует в области концентрацией NaCl 0,5-0,8 М.Фракции, содержащие фермент, объедин ют, ди- ализируют 6-10 ч против буфера, содержащего 50% глицерина, и хран т

Редактор А.Купр кова

Составитель А.Макаров Техред м.Ходанич

Заказ 739Тираж 520Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, -Москва, , Раушска  наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

при -20 С, В полученном препарате определ ют активность С1а I, содержание белка и нуклеиновых кислот.

Пример, Определение оптимального содержани  иммобилизованного красител .

Бесклеточный экстракт, содержащий С1а I, нанос т на колонки с различным содержанием красител  F3GA и провод т выделение фермента. Зависимость выхода С1а I (на 1 г биомассы ) от количества иммобилизованного красител  дана в таблице.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ вьщелени  сайт-специфической эндонуклеазы С1а I, включающий получение бесклеточного экстракта С. lat, L, хроматографию его с-последующей эгаоцией целевого продукта раствором хлористого натри , о т- личающийс  тем, что, с целью повьшени  степени чистоты и удельной активности делевого продукта , хроматографию экстракта осуществл ют на сорбенте с иммобилизованным лигандом цибакроновым синим F3GA при содержании лиганда 0,9- 2,0 мкмоль/мл, сорбента, а элюцшо провод т в градиенте концентрации хлористого натри .

   Корректор л. Патай